Beschreibung
Verfahren zum Nachweis einer Substanz und Mikrotiterplatte
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten sowie eine dazu geeignete Mikrotiterplatte.
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Suche und des Nachweises von pharmakologisehen Wirkstoffen. Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, z.B. in einer Mikrotiterplatte, eine Testsubstanz bzw. Substanz mit einer Vielzahl verschiedener potentieller Reaktionspartner in Kontakt zu bringen. Falls die Substanz eine Affinität zu einem potentiellen Reaktionspartner besitzt, kommt es zur Reaktion zwischen der Sub- stanz und dem Reaktionspartner. Die Reaktion kann beispielsweise eine chemische Umsetzung oder eine Bindung sein. Die Reaktion wird anhand einer Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Lösung nachgewiesen.
Zum Nachweis dienen Verfahren wie die Fluoreszenzpolarisation, der Fluorenszenz-Resonanz-Energie-Transfer, die Fluorens- zenz-Kollerations-Spektroskopie und radioaktive Markierungsverfahren. Die bekannten Nachweisverfahren sind aufwendig. Sie erfordern z.T. den Einsatz giftiger Substanzen.
Weiterhin sind nach dem Stand der Technik Verfahren bekannt, welche eine elektrophoretische Trennung einer Vielzahl von Substanzgemischen parallel ermöglichen. Es bietet z.B. die Firma Advanced Biotechnologies unter dem Kennzeichen "MIDGE" eine Vorrichtung an, mit der bis zu 100 DNA-Proben parallel elektrophor'etiseh getrennt werden können. Dazu wird jede DNA- Probe in eine Tasche eines Gels eingefühlt. Anschließend wird über das Gel ein elektrisches Feld angelegt, so daß die Pro-
ben in das Gel transportiert und dort aufgetrennt werden. Die Auswertung erfolgt über die Laufstrecke der Bestandteile der DNA-Probe im Gel. - Das bekannte Verfahren ist zeitaufwendig.
Aus der DE 199 52 160 AI ist ein Verfahren zum Nachweis eines ersten Moleküls in einer Lösung bekannt, bei dem ein Farbstoff gekoppeltes zweites Molekül an das erste Molekül binden kann. Die elektrische Nettoladung des zweiten Moleküls ist dabei dem Betrag nach kleiner als und von entgegengesetztem Vorzeichen wie die elektrische Nettoladung des ersten Moleküls. In der Lösung befindet sich eine Anode und eine Kathode, zwischen denen ein elektrisches Feld angelegt wird. Der Farbstoff wird, falls die elektrische Nettoladung des ersten Moleküls negativ ist, an der Anode und falls die elektrische Nettoladung des ersten Moleküls positiv ist, an der Kathode optisch nachgewiesen. Das Verfahren erfordert eine aufwendige Meßvorrichtung, bei der ein Lichtstrahl exakt auf die Elektrode fokusiert werden muß, um die optische Änderung an der Elektrode erfassen zu können.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfahren und eine Mikrotiterplatte angegeben werden, mit denen universell und ohne großen Aufwand gleichzeitig das Reakti- onsverhalten einer Vielzahl von Substanzen untersucht werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 14 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 13 und 15 bis 25.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Substanz mit folgenden Schritten vorgesehen:
a) Bereitstellen einer ein Nachweisreagenz enthaltenden Lösung in einem Behälter,
b) Zugabe des Analyten zur Lösung,
c) Anlegen eines auf die Lösung wirkenden elektrischen Feldes mittels sich außerhalb des Behälters befindenden Elektroden, so daß sich die Konzentration eines für die Anwesenheit des Analyten spezifischen Stoffs in einem Bereich des Behälters ändert und
d) optisches Erfassen der Konzentrationsänderung.
Das vorgeschlagene Verfahren ist universell. Es läßt sich einfach durchführen. Der Einsatz gefährlicher oder giftiger Nachweisreagenzien ist nicht erforderlich. Es kann insbesondere gleichzeitig die Wirkung einer großen Anzahl von Nachweisreagenzien auf einen Analyten untersucht werden. Das Nachweisreagenz ist spezifisch für den Analyten. Es reagiert oder bindet mit dem Analyten, so daß dessen elektrophoreti- sche Beweglichkeit sich ändert. Besonders vorteilhaft ist, daß außer der Zugabe des Analyten in Schritt lit. b keine weitere Zugabe zu oder Entnahme aus dem Behälter erfolgen muß. Dadurch können Pipettierfehler vermieden werden, und es wird ein hoher Probendurchsatz ermöglicht. Dadurch, daß sich die Elektroden außerhalb des Behälters befinden, können elektrolytische Reaktionen an den Elektroden vermieden werden. Weiterhin ist es vorteilhaft, daß es zur Erfassung der Kon- zentrationsänderung nicht erforderlich ist, einen Lichtstrahl exakt auf eine vorgegebene Stelle des Behälters zu fokusie- ren. Die Vorrichtung zum optischen Erfassen der Konzentrationsänderung kann daher einfacher konstruiert sein, als eine
Vorrichtung zum Erfassen optischer Änderungen an einer Elektrode .
Die Lösung kann nach dem Schritt lit. b inkubiert werden. Bevorzugt besteht der Behälter, insbesondere dessen Wand oder dessen Boden, zumindest abschnittsweise aus einem ionenleitenden Material und das elektrische Feld (eF) in Schritt lit. c wird so angelegt, daß dadurch eine Wanderung von Ionen in dem Material bewirkt wird. Dadurch kann eine für den Analyten spezifische Konzentrationsänderung erreicht werden, welche optisch erfassbar ist. Die Ionen können dabei aus der Flüssigkeit in das Material, aus dem Material in die Flüssigkeit oder durch das Material hindurch wandern. Zum optischen Erfassen der Konzentrationsänderung in Schritt lit. d ist keine Entnahme von Flüssigkeit aus dem Behälter notwendig. Die optische Erfassung erfolgt zweckmäßigerweise durch die Öffnung und/oder den Boden des Behälters.
Vorteilhafterweise ist der Stoff ein Nachweisreagenz, ein aus dem Nachweisreagenz und der Substanz gebildetes Reaktionsprodukt oder ein Kompetitor. Das Nachweisreagenz kann ferner einen Rezeptor, einen Kompetitor oder ein Vorprodukt des Reaktionsprodukts enthalten. Der Rezeptor ist zweckmäßigerweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Peptid, Protein, Nu- kleinsäure, Zucker, Antikörper, Lektin, Avidin, Streptavidin, PNA (Peptide Nucleic Acid) oder LNA (Locked Nucleic Acid) .
Der Stoff kann mit einer Fluorophor markiert sein. Es kann sich z.B. um ein Molecular Beacon handeln. Der Stoff kann an den und/oder im Boden des Behälters gebunden werden.
Zur optischen Erfassung der Konzentrationsänderung wird zumindest der Bereich mit einem Lichtstrahl durchstrahlt und
dessen durch den Stoff bewirkte Änderung gemessen. Bei dem Lichtstrahl kann es sich um einen Laserstrahl handeln. Es kann Durch- oder Auflicht genutzt werden. Bei der bewirkten Änderung des Lichtstrahls kann es sich um eine Intensitätsän- derung, um eine Änderung der Polarisationsebene, um einen Streuwinkel oder dgl . handeln. Zweckmäßigerweise wird der Lichtstrahl so geführt, daß er im wesentlichen senkrecht aus dem Boden oder der Öffnung des Behälters ein oder austritt. Das vereinfacht die Messung. Das Verfahren ist somit für Standard-Mikrotiterplatten-Reader geeignet.
Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird das elektrische Feld gleichzeitig über einer Vielzahl von Behältern angelegt. Das optische Erfassen der Konzentrationsände- rung in der Vielzahl der Behälter kann ebenfalls gleichzeitig erfolgen. Bei den Behältern handelt es sich zweckmäßigerweise um Behälter, die nach Art einer Mikrotiterplatte auf einem gemeinsamen Träger angeordnet sind.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist zur Durchführung des Verfahrens eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl an Behältern vorgesehen, welche zumindest abschnittsweise aus einem ionenleitenden Material gebildet sind. - Die Verwendung eines ionenleitenden Materials ermöglicht es, durch eine im elek- trischen Feld hervorgerufene Wanderung von Ionen eine für den Analyten spezifische Konzentrationsänderung zu bewirken, welche optisch erfaßbar ist.
Zweckmäßigerweise sind die Wände und/oder der Boden der Be- hälter aus den ionenleitenden Material hergestellt. Der Boden kann aus einem elektrischen Isolator hergestellt sein. Er kann ferner für die Bindung eines Liganden, Rezeptors oder Substrats aktiviert sein. Es ist aber auch möglich, daß auf
dem Boden ein Rezeptor oder Substrat immobilisiert ist. Nach einer weiteren Ausgestaltung können auf vorgegebenen Abschnitten des Bodens unterschiedliche Rezeptoren immobilisiert sein. Der Boden kann aus Glas, Quarz oder Kunststoff hergestellt sein.
Die Wände können aus einem porösem Material bestehen. Sie können für die Bindung eines Liganden aktiviert sein. Ferner ist es möglich, daß die Wände Hilfsstoffe, z.B. Quencher oder Protein- oder Nukleinsäure-bindende Stoffe enthalten.
Die Behälter können nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal einen im wesentlichen rechteckigen Querschnitt aufweisen. Dabei sind zwei Wände des Behälters parallel zu den Elektroden angeordnet. Das elektrische Feld ist bei einer solchen Anordnung homogen über das Volumen des Behälters ausgebildet.
Das ionenleitende Material kann aus einem Material hergestellt sein, das vorzugsweise aus der folgenden Gruppe ausge- wählt ist: Agarose, Polyacrylamid, Zellulose, Papier, Pappe, poröses Silikat, Polystyrol, Polyvenylchlorid, Polycarbonat, Nylon, Polyethylen. Selbstverständlich sind auch andere Materialien mit ionenleitenden Eigenschaften geeignet. Die vorgenannten Materialien sind zweckmäßigerweise porös ausgebildet.
Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung sind die Behälter in Form von Ausnehmungen in einer aus dem ionenleitenden Material hergestellten ersten Platte ausgebildet. Der begriff "Platte" ist hier weit zu interpretieren. Es kann sich dabei auch um eine Folie oder um eine auf einen Träger aufgebrachte Schicht handeln. Die erste Platte kann auf einer, den Boden bildenden zweiten Platte aufgebracht sein, und die erste Platte kann die Wände der Behälter aufweisen. Die Wände
können z.B. durch die Innenwand von in der ersten Platte gebildeten Durchbrüchen gebildet sein. Die zweite Platte kann z.B. aus Glas oder einem durchsichtigen Kunststoff hergestellt sein. Auf die erste Platte ist nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal eine hydrophobe Deckschicht aufgebracht. Das erleichtert das Befüllen der Behälter. Das hydrophobe Material kann aus einer Folie gebildet sein, die zweckmäßigerweise aus einem lichtundurchlässigen Material gebildet ist.
Das ionenleitende Material kann zwischen zwei Elektroden vorgesehen sein. Die Elektroden können getrennt von den Behältern vorgesehen sein. Die Elektroden können aus gängigem Material, wie z.B. Silber, Gold, Platin, Kupfer, Aluminium oder elektrisch leitfähigem Kunststoff und dgl. hergestellt sein. Sie können z.B. an dem ionenleitenden Material angebracht oder damit über eine das ionenleitende Material durchdringende wäßrige Lösung in ionenleitendem Kontakt sein.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Schnittansicht einer ersten
Mikrotiterplatte,
Fig. 2 eine schematische Schnittansicht einer zweiten
Mikrotiterplatte,
Fig. 3 eine schematische Schnittansicht einer dritten Mikrotiterplatte
Fig. 4 eine schematische Schnittansicht einer vierten Mikrotiterplatte,
Fig. 5 eine schematische Schnittansicht einer fünften Mikrotiterplatte,
Fig. 6 eine Draufsicht auf die Mikrotiterplatte gemäß
Fig. 4,
Fig. 7a bis c eine erste Verfahrensvariante,
Fig. 7d bis f eine Modifikation der ersten Verfahrensvariante,
Fig. 8a bis c eine zweite Verfahrensvariante,
Fig. 9a bis c eine dritte Verfahrensvariante,
Fig. 10a bis c eine vierte Verfahrensvariante,
Fig. 11a bis c eine fünfte Verfahrensvariante,
Fig. 12a bis c eine sechste Verfahrensvariante,
Fig. 13 eine fluorimetrische Auswertung unter Verwendung einer Polyacrylamid-Mikrotiterplatte und
Fig. 14 eine fluorimetrische Auswertung unter Verwendung einer Agarose-Mikrotiterplatte .
In Fig. 1 ist eine schematische Schnittansicht einer ersten besonders einfach aufgebauten Mikrotiterplatte gezeigt. Es handelt sich dabei um eine erste Platte 1, welche an ihrer einen Seite eine Vielzahl von Ausnehmungen 2 aufweist. Jede der Ausnehmungen 2 bildet einen Behälter B zur Aufnahme einer
einen Analyten einhaltenden Lösung. Die erste Platte 1 kann z.B. aus einem Agarose- oder Polyacrylamid-Gel bestehen. Solche Gele können z.B. in Form herkömmlicher Mikrotiterplatten gegossen werden. Es ist auch möglich, die erste Platte 1 aus ionenleitendem Material, wie Zellulose oder deren Derivaten herzustellen. Die Formgebung kann hier mittels Pressen erfolgen. Ferner kann die erste Platte 1 aus porösem Polystyrol, Polyvenylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polymethylmeta- crylat, Polypropylen und dgl. hergestellt werden. In diesem Fall kann die Mikrotiterplatte nach dem Spritzgußverfahren hergestellt werden. Mit dem Bezugszeichen 3 sind an den Querseiten der ersten Platte 1 angebrachte Elektroden bezeichnet. Die Elektroden 3 können aus dafür geeigneten Metallen, wie Platin, Gold, Silber, einem elektrisch leitfähigen Kunststoff und dgl. hergestellt sein.
Bei der in Fig. 2 gezeigten zweiten Mikrotiterplatte ist die aus ionenleitendem Material hergestellte erste Platte 1 auf einer zweiten Platte 4 aufgebracht. Die erste Platte 1 weist in diesem Fall ein Vielzahl von Durchbrüchen 5 auf. Die Innenwände der Durchbrüche 5 bilden die Wände der Behälter B. Deren Boden Bo wird durch die der ersten Platte 1 zugewandte Seite der zweiten Platte 4 gebildet. Die zweite Platte 4 kann z.B. aus Glas, Quarz oder Polystyrol hergestellt sein. Sie ist zweckmäßigerweise durchsichtig ausgebildet. Die zweite Mikrotiterplatte kann auf einfache Weise hergestellt werden, indem z.B. auf eine Glasplatte eine Agarose-Gel aufgegossen wird. Die Durchbrüche im Agarose-Gel können durch auf die Glasplatte zuvor aufgebrachte, geeignete Kunststoffkerne er- zeugt werden, die nach dem Erstarren des Agarose- oder Poly- acrylamid-Gels wieder entfernt werden.
Am Boden Bo können z.B. Nachweisstoffe, wie Peptite, Proteine, Nukleinsäuren und dgl. immobilisiert sein. Es ist auch möglich, daß der Boden Bo durch dort vorhandene chemische Gruppen, wie Aldehyd-, Epoxid-, Aminogruppen oder Biotin ak- tiviert ist. Der Boden Bo kann aber auch aus einem ionenleitenden Material hergestellt sein.
Bei den in den Fig. 3 bis 5 gezeigten dritten, vierten und fünften Mikrotiterplatten ist auf der ersten Platte 1 jeweils eine hydrophobe Deckschicht 7 aufgebracht. Die hydrophobe
Deckschicht 7 weist zweite Durchbrüche 8 auf, welche zu den ersten Durchbrüchen 5 korrespondieren. Bei der in Fig. 4 gezeigten vierten Mikrotiterplatte weist die erste Platte 1 weder erste Ausnehmungen 2 noch erste Durchbrüche 5 auf. Die erste Platte 1 bildet hier den Boden Bo der Behälter B. Bei dem in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiel sind erste Ausnehmungen 2 in der ersten Platte 1 vorgesehen, welche mit den zweiten Durchbrüchen 8 in der Deckschicht 7 korrespondieren. Die ersten Durchbrüche 5 korrespondieren mit den zweiten Aus- nehmungen 6, so daß die Ausnehmungen 6 den unteren Teil, d.h. einen unteren Wandabschnitt und den Boden Bo, der Behälter B bilden.
In Fig. 6 ist der in den Fig. 3 bis 5 im Querschnitt gezeigte dreischichtige Aufbau der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte nochmals in Draufsicht gezeigt. Die Ausnehmungen 2 bzw. ersten 5 und zweiten Durchbrüche 8 können selbstverständlich auch rechteckig oder quadratisch ausgebildet sein.
In den Fig. 7 bis 12 ist ein Teilbereich des Behälters B gezeigt. Der Behälter hat oben eine Öffnung Öf und ist begrenzt durch Wand W und Boden Bo. Die Wände W und/oder der Boden Bo bestehen aus einem ionendurchlässigen Material. Dieses Ma-
terial hat die Eigenschaft, bei Kontakt mit einem Elektrolyten und dem Anlegen einer Spannung, einen elektrophoretischen Ionenfluß in das Material zu erlauben. Mit M ist der Bereich des Behälters B bezeichnet, der bei einer optischen Messung erfaßt wird. Der Bereich M kann den Boden einschließen. Beim Bereich M kann es sich z.B. um einen mittigen Bereich des Behälters B handeln.
Bei der in Fig. 7a bis c gezeigten ersten Verf hrensvariante ist an den Boden Bo ein Nachweisstoff N gebunden. Dabei kann es sich z.B. um ein Substrat für Proteasen oder andere lytische Proteine handeln. Der Nachweisstoff N kann z.B. mittels Fluorophors markiert sein. Ein Analyt ist mit dem Bezugszeichen A bezeichnet. Dabei kann es sich z.B. um eine Protease oder andere lytische Proteine handeln. Bei Zugabe des Analyten A spaltet der Analyt den Nachweisstoff N und setzt dadurch ein Fragment Fr frei. Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (Fig. 7c) wirkt eine elektrophoretische Kraft auf das Fragment Fr und das Fragment Fr wandert in oder an die Wand W des Behälters B. Die Konzentration des Fragments Fr in dem Behälter B nimmt ab. Das Fragment Fr trägt eine Markierung z.B. ein Fluorophor oder ist aufgrund anderer Eigenschaften optisch nachweisbar. Die Konzentration des Fragments kann anhand einer Fluoreszenzmessung im Bereich M bestimmt werden. In dieser Anordnung zeigt die Abnahme der Fluoreszenz, das
Vorhandensein des nachzuweisenden Analyten A an.
In den Fig. 7d bis 7f ist eine homogene Verfahrensvariante des in Fig. 7a bis c beschriebenen Verfahrens dargestellt. In einem Behälter B befindet sich ein geladener und frei-beweglicher Nachweisstoff N. Der Nachweisstoff N ist geladen und kann z.B. mittels Fluorophors markiert sein. Bei dem Nachweisstoff kann es sich z.B. um ein Substrat für Proteasen
oder andere lytische Proteine handeln. Ein Analyt A wird mit dem Nachweisstoff N in Kontakt gebracht. Dabei kann es sich z.B. um eine Protease oder andere lytische Proteine handeln. Bei Zugabe des Analyten A spaltet der Analyt A den Nachweis- stoff N in zwei Fragmente Frl und Fr2. Frl ist ungeladen und ist optisch z.B. durch ein Fluorophor nachweisbar. Fr2 ist geladen. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes (Fig. 7f) wirkt eine elektrophoretische Kraft auf den Nachweisstoff N und das geladene Fragment Fr2. Nachweisstoff N und Fragment Fr2 wandern in oder an die Wand W des Behälters B. Das ungeladene Fragment Frl bleibt im Behälter B. Die Konzentration des Fragments Frl in dem Behälter ist ein Indikator für die Anwesenheit des Analyten A. Die Konzentration des Fragments Fr kann anhand einer optischen Messung z.B. einer Fluores- zenzmessung im Bereich M bestimmt werden.
Bei der in Fig. 8a bis c gezeigten zweiten Verfahrensvariante ist ein Nachweisstoff N am Boden Bo des Behälters B gebunden. Dabei handelt es sich z.B. um einen Liganden, ein Antigen, einen Rezeptor, einen Antikörper oder eine Nukleinsäure. Ein Analyt A wird mit dem Nachweisstoff N in einer Lösung in Kontakt gebracht. Beim Analyten A kann es sich z.B. um einen Rezeptor, einen Antikörper, einen Liganden, ein Antigen oder eine komplementäre Nukleinsäure handeln. Der Analyt A bindet an den Nachweisstoff N. Der Analyt A ist z.B. mittels eines Fluorogens F markiert. Bei Anlegen eines elektrischen Felds wandert der Analyt A in die ionenleitende Wand W. Sofern der Nachweisstoff N spezifisch für den Analyten A ist, bindet ein Teil des Analyten A an den Nachweisstoff N. Die Bindung des Analyten A an den zweiten Nachweisstoff N ist mittels eines durch das Fluorophor F Fluoreszenzsignals nachweisbar.
Bei der in Fig. 9a bis c gezeigten dritten Verfahrensvariante verdrängt ein Analyt A einen Nachweisstoff N aus dessen Bindung an einen definierten Bindungsort. Die Bindung des Analyten A und die Bindung des Nachweisstoffs N ist jeweils spezi- fisch. Bei dem Bindungsort kann es sich beispielsweise um einen am Boden Bo immobilisierten Antikörper oder eine immobilisierte Nukleinsäure handeln. Bei dem Nachweisstoff N kann es sich um ein spezifisches Antigen oder eine komplementäre Nukleinsäure handeln. Durch die Verdrängung des Nachweis- Stoffs N durch den Analyten A ist der zuvor immobilisierte
Nachweisstoff N freibeweglich. Der Nachweisstoff N ist geladen. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wird der Nachweisstoff N in oder an die ionendurchlässige Wand W bewegt. Die Konzentration des Nachweisstoffs N wird durch eine opti- sehe Messung im Bereich M ermittelt. Die in diesem Fall beobachtbare Abnahme eines zuvor vorhandenen Fluoreszenzsignals ist spezifisch für das Vorliegen des Analyten A in der Lösung.
Bei der in Fig. 10a bis c gezeigten vierten Verfahrensvariante befindet sich ein Analyt A und ein geladener und freibeweglicher Nachweisstoff N in dem Behälter B. Der Analyt A ist z.B. mittels eines Fluorophors markiert. Bei Zugabe des Analyten A kommt es zu einer für den Analyten A spezifischen Bindung mit dem Nachweisstoff N. Durch Anlegen eines elektrischen Felds wird der geladene Nachweisstoff N und der daran gebundene Analyt A in oder an die ionendurchlässige Wand W außerhalb des Bereichs M bewegt. Die Abnahme der Konzentration des fluoreszierenden Analyten A im Behälter B kann fluori- metrisch im Bereich M nachgewiesen werden.
Bei der in Fig. 11a bis c gezeigten fünften Verfahrensvariante befindet sich ein positiv geladener Analyt A und ein nega-
tiv geladener Nachweisstoff N in der Lösung. Der Analyt A ist z.B. mittels eines Fluorophors markiert. Bei Zugabe des Analyten A kommt es zu einer für den Analyten A spezifischen Bindung mit dem Nachweisstoff N. Durch die Bindung des Analy- ten A an den Nachweisstoff N wird die Gesamtladung des Komplexes null. Bei einem Anlegen eines elektrischen Felds eF bleibt der ungeladene Komplex aus Nachweisstoff N und dem daran gebundene Analyten A im Behälter B. Ungebundener Analyt A wird in oder an die ionendurchlässige Wand W bewegt. Die verringerte Abnahme der Konzentration des fluoreszierenden Analyten A im Behälter B im Vergleich zu einer Probe ohne Nachweisstoff N kann fluorimetrisch im Bereich M nachgewiesen werden. Die verringerte Abnahme zeigt die Anwesenheit des Analyten A an .
Bei der in Fig. 12a bis c gezeigten sechsten Verfahrensvariante ist der Boden Bo der Behälters B ionendurchlässig. Weiterhin ist ein erster Nachweisstoff N in dem Boden Bo gebunden. Der Boden Bo kann z.B. aus aktivierter Agarose oder Po- lyacrylamid bestehen, an das Antikörper oder Nukleinsäuren als Nachweisstoff N gebunden wurden. Ein geladener Analyt A wird in den Behälter B eingeführt. Der Analyt A kann z.B. mittels Fluorophors markiert sein. Der Analyt A kommt durch Diffusion oder durch das Anlegen eines elektrischen Felds eF in Kontakt mit dem Nachweisstoff N. Durch den Kontakt kommt es zu einer spezifischen Bindung zwischen Analyt A und Nachweisstoff N. Durch das Anlegen eines elektrischen Felds eF wird ungebundener Analyt A aus den Bereich M, der bei einer optischen Messung erfaßt wird, herausbewegt. Bei einer opti- sehen Messung des Bereichs M wird nur der gebundene Analyt A erfaßt. Die Fluoreszenz im Bereich M ist ein Indikator für die Anwesenheit des nachzuweisenden Analyten A.
Fig. 13 zeigt eine fluorimetrische Auswertung unter Verwendung einer erfindungsgemäßen aus Polyacrylamid hergestellten Mikrotiterplatte. Zur Auswertung ist ein Mikrotiterplatten- Fluoreszenzreader verwendet worden. In sämtlichen Proben 1 bis 12 ist immobilisiertes Oligonukleotid A der Sequenz 5 - TAA CAC AAC TGG TGT GCT CCT GGA-3V (SEQ ID NO:l) vorhanden gewesen. Die Proben 1 bis 4 sind mit TAMRA-markiertem Oligonukleotid A der Sequenz 5X-TAMRA-GAG CTA GGA CCT CTT CTG TCC AGG AGC ACA CCA GTT GTG TTA-3' (TAMRA-SEQ ID NO : 2 ) , welche an ihrem 3 "-Ende zum immobilisierten Oligonukleotid A komplementär ist, in Kontakt. Die Proben Ziff. 5 bis 8 sind mit TAMRA- markiertem Oligonukleotid K der Sequenz 5" -TAMRA- TAG GGT CAA TGC CAC CCT TTT AAC CTA TCC GGA TTT ACG-3' (5 N -TAMRA-SEQ ID NO : 3 ) , welches nicht komplementär zu dem Oligonukleotid A ist, in Kontakt. Die Proben Ziff. 9 bis 12 haben lediglich Puffer enthalten. Die Fluoreszenz ist hier in willkürlichen Einheiten wiedergegeben.
Fig. 14 zeigt die Ergebnisse einer fluorimetrisehen Auswer- tung unter Verwendung einer aus Agarose hergestellten erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte. In sämtlichen Proben ist TAMRA-markiertes Oligonukleotid AN vorhanden gewesen. Die Proben Ziff. 1 bis 4 sind mit RecA-Protein in Kontakt. Die Proben Ziff. 9 bis 12 haben nur Puffer enthalten. Die Fluo- reszenz ist in willkürlichen Einheiten wiedergegeben.
Durch das Anlegen eines elektrischen Felds kann der Nachweis erheblich schneller durchgeführt werden. Die Fluoreszenz kann sofort in dem vorgegebenen Bereich des Behälters erfaßt wer- den. Bei dem Bereich kann es sich um einen zentralen Bereich des Behälters, um einen Bereich in der Nähe einer Wand oder um den Boden des Behälters handeln.
Beispiele:
1. Herstellung einer trägergestützten, ionenleitfähigen Mikrotiterplatte auf Polyacrylamid-Basis mit Nachweisstoffen.
Eine Kassette bestehend aus zwei Glasplatten und 1 mm Teflon- Spacern mit dem Innenvolumen 1 mm x 80 mm x 120 mm wurde auf den Innenseiten der Glasplatten mit jeweils einem Kunststoff- träger (Gelbond PAG Film, Pharmacia-Amersham) versehen, die zur kovalenten Kopplung an Acrylamid geeignet sind. Ein
Kunststoffträger war mit Reihen und Spalten von quadratischen Aussparungen versehen, die jeweils 2 mm x 2 mm groß waren und einen Abstand von jeweils 9 mm hatten. Die Aussparungen wurden mit Hilfe eine Schneideblotters (Graphtec) hergestellt. Es wurde eine Lösung von 20% Acrylamid mit einem Monomer zu Crosslinker Verhältnis von 29 : 1 in IxTBE Puffer hergestellt. Als Nachweisstoff wurden Acrydite-Oligo- nukleotide A (Eurogentec, Belgien) in einer Konzentration von 10 μmol/1 vor der Polymerisation zugesetzt. Zum Start der Po- lymerisation wurde 70 μl 10% (w/v) frischem Ammoniumpersulfat und 20 μl TEMED zugefügt und die Lösung in die Kassette gegossen. Nach einer Stunde wurden die Glasplatten entfernt und die Mikrotiterplatte mit dem Kunststoffträger, der die Aussparung trug, nach oben in eine Flachbett- Elektrophoresekammer gelegt. Zur Entfernung ungebundener geladener Bestandteile wurde die Mikrotiterplatte in IxTBE eine Stunde mit 100 V einer Elektrophorese unterzogen.
2. Durchführung eines DNA-Hybridisierungstests mit der Mikro- titerplatte auf Polyacrylamid-Basis.
In die Aussparung der Mikrotiterplatte wurden je 2 μl Probenlösung in IxTBE-Puffer gegeben. Jeweils vier Probenlösungen enthielten:
a) 10 pmol des TAMRA-markierten Oligonukleotids A , hergestellt von TibMolbiol, Berlin, mit der zum Oligonukleotide A komplementären Sequenz .
b) 10 pmol des TAMRA-markierten Oligonukleotids K, herge- stellt von TibMolbiol, Berlin, und
c) kein Oligonukleotid
Oligonukleotid A und K waren am 5V Ende mit einem Fluorophor (TAMRA) markiert. Die Mikrotiterplatten wurden an den Elektroden zugewandten Seiten mit TBE-Puffer in Kontakt gebracht und die Mikrotiterplatte bei 50 V 10 Minuten einer Elektrophorese unterzogen.
3. Fluorimetrische Auswertung des DNA-Hybridisierungstests
Die Mikrotiterplatte wurde in einem Mikrotiterplattenreader (Lambda 320, MWG-Biotech) eingesetzt und die Fluoreszenz der Aussparung gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 540 mm und einer Emission von 590 nm im Auflichtmodus bestimmt. Die Fluoreszenz in den Proben mit Oligonukleotid A war im Vergleich zu der Fluoreszenz der Proben mit Oligonukleotid B und der reinen TBE-Probe deutlich erhöht. Die erhöhte Fluoreszenz der Probe mit Oligonukleotid Ax zeigt die spezifische Bindung des Oligonukleotid A an das Acrydite- Oligonukleotid A an.
4. Herstellung einer trägergestützten, ionenleitfähigen Mikrotiterplatte auf Agarose-Basis
In eine Kammer, bestehend aus einer Glasplatte mit dicht um- schlossenen Rändern der Dimension 80 mm x 40 mm wurden im Abstand von 9 mm zwei Kämme mit je vier Formkerne aus Teflon 1 mm über den Boden eingehangen. Die Kantenlänge der quadratischen Formkerne betrug jeweils 2 mm x 2 mm. Der Abstand der Formkerne betrug 9 mm. Eine 2% Agarose-Suspension in TBE- Puffer wurde in einer Mikrowelle bis zur vollständigen Quellung der Agarose erhitzt und ca. 12 ml der Suspension in die Kammer gegossen. Nach Erstarrung der Agarose wurden die Formkerne entfernt. Mittels der Formkerne ist eine Anordnung von 2 X 4 Aussparungen mit einer quadratischen Öffnung von 2 mm x 2 mm und einer Tiefe von ca. 3 mm in der hergestellten Mikrotiterplatte erzeugt worden. Auf die erstarrte Agarose wurde eine lichtundurchlässige Kunststoffolie mit Aussparungen gelegt, so daß die Aussparung der Folie mit den Aussparungen in der Agarose zur Deckung kamen.
5. Durchführung eines DNA-Protein-Bindungstests mit der Mikrotiterplatte auf Agarose-Basis .
In die acht Aussparungen der Mikrotiterplatte wurden jeweils 8 μl einer Lösung aus TBE, 10 mmol/1 MgCl2 und, als Nachweisstoff, 10 μmol/1 Oligonukleotid K gefüllt. Oligonukleotid K war zur Markierung mit einem Fluorophor (TAMRA) am 5N Ende versehen. In vier Aussparungen wurde als Probe jeweils 4 μl RecA-Protein (Röche) einer Konzentration von 1 μg/μl in RecA- Puffer (10 mmol/1 TrisCl, 10 mmol/1 MgCl2, 1 mmol/1 DTT, pH8) zugefügt. In die verbliebenen vier Aussparungen wurde das gleich Volumen RecA-Puffer ohne RecA-Protein als Negativ- Kontrolle eingeführt. Die Mikrotiterplatte wurde bei 37° C 30
min inkubiert und anschließend 10 min einer Elektrophorese bei 50 V ausgesetzt.
6. Fluorimetrische Auswertung des Protein-DNA-Bindungstests
Die Mikrotiterplatte wurde in einen Mikrotiterplattenreader (Lambda 320, MWG-Biotech) eingesetzt und die Fluoreszenz im Bereich der Aussparung gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 540 mm und einer Emission von 590 nm im Auflichtmodus bestimmt. Die Fluoreszenz in den Proben mit Re- cA-Protein war im Vergleich zu der Fluoreszenz der Proben ohne RecA-Protein deutlich erhöht. Die erhöhte Fluoreszenz der Probe mit RecA-Protein zeigt die Veränderung der elektropho- retischen Beweglichkeit von Bindung von Oligonukleotid K auf- grund der Bindung von RecA-Protein an das Oligonukleotid K an.
Bezugszeichenliste
1 erste Platte
2 erste Ausnehmung 3 Elektrode
4 zweite Platte
5 erster Durchbruch
6 zweite Ausnehmung
7 hydrophobe Deckschicht 8 zweiter Durchbruch
B Behälter
Bo Boden
A Analyt
N Nachweisstoff eF elektrisches Feld
M Bereich des Behälters, dessen optische Änderung erfaßt wird
W Wand