WO2002077223A1 - Nouvelle aminopeptidase et son gene - Google Patents

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WO2002077223A1
WO2002077223A1 PCT/JP2002/002476 JP0202476W WO02077223A1 WO 2002077223 A1 WO2002077223 A1 WO 2002077223A1 JP 0202476 W JP0202476 W JP 0202476W WO 02077223 A1 WO02077223 A1 WO 02077223A1
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WO
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amino acid
activity
seq
protein
sequence
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PCT/JP2002/002476
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French (fr)
Inventor
Kyoko Koibuchi
Daiki Ninomiya
Mari Kojima
Yoichi Ueda
Jun-Ichi Maruyama
Katsuhiko Kitamoto
Original Assignee
Ajinomoto Co.,Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE60209467T priority patent/DE60209467T2/de
Priority to BR0207889-9A priority patent/BR0207889A/pt
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Priority to US10/664,958 priority patent/US7087422B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus

Definitions

  • the present invention relates to aminopeptidase and a gene encoding the same.
  • soy sauce is produced in two stages: koji making and fermentation. Mainly, in the koji-making stage, the raw materials are decomposed by enzymes produced by koji mold (Aspergillus spp.). At that time, it is important to increase the amount of free amino acids in the moromi in order to improve the taste in soy sauce.
  • Amino acids are produced from raw protein in two steps. The first is the release of peptides from proteins by proteases, and the second is the production of amino acids by peptide hydrolysis catalyzed by peptides.
  • Aspergillus peptidase has been reported from Aspergillus oryzae or Aspergillus soja (JP-A-11-346777, DE95-1952648, W09851163, W09628542 W09615504, W09851803 W09814599). Among them, the importance of leucine aminopeptidase in soy sauce production has been shown. However, there is no report that the known leucine aminopeptidase is salt-tolerant. In addition, the gene for Aspergillus leucine aminopeptidase is reported by Aspergillus' Soya by Kaizuki et al. (Japanese Patent Publication No. 11-346777), but no report is made on the salt tolerance of the enzyme.
  • soybean aminopeptidase GX is a novel aminopeptidase that has not been reported so far, and its existence is not known other than germinated soybeans. Soy aminopeptidase GX has the activity of efficiently releasing N-terminal acidic amino acids from peptides having acidic amino acids such as glumic acid at the N-terminal. Therefore, by the action of this enzyme, it is possible to produce soy sauce having a high release rate of glutamic acid and excellent taste.
  • the present invention provides an aminopeptidase derived from Aspergillus oryzae, which is effective for producing soy sauce or a degraded protein of soy sauce having a high free amino acid content and excellent taste, and a gene encoding the aminopeptidase.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors conducted intensive research to solve the above-mentioned problems, and used Aspergillus' A. nidulans (EST), which is homologous to the soybean-derived aminopeptidase GX gene, as a probe.
  • EST Aspergillus' A. nidulans
  • the present invention provides a protein represented by any one of the following 3 (A) to (D): (A) having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 519 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; Protein
  • a protein consisting of an acid sequence and having an activity of catalyzing a reaction for releasing an amino acid from the N-terminal of a peptide;
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding any one of the above (A) to (D), a recombinant nucleic acid molecule containing the nucleic acid molecule, a transformed microorganism host, and an amino acid using the transformed microorganism host.
  • This is a method for producing peptidase.
  • the present invention includes transformed filamentous fungi, especially transformed koji molds, as transformed microorganism hosts.
  • the present invention is an aminopeptidase with the following properties of 1) to 8) c
  • the optimal temperature is about 37-45 ° C.
  • FIG. 1 is a graph showing the temperature dependence of PepE activity.
  • the horizontal axis represents temperature, and the vertical axis represents the relative value of leucine aminopeptidase activity when the activity value at 37 ° C is 100.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the salt concentration in the reaction solution on PepE.
  • the horizontal axis is the NaCl concentration (M), and the vertical axis is the relative value of leucine aminopeptidase activity at the NaCl concentration when the activity value without NaCl was 100.
  • FIG. 3 is a graph showing the pH dependence of PepE activity.
  • the horizontal axis is pH, and the vertical axis is the relative value of leucine aminopeptidase activity when the activity value in potassium phosphate buffer (PH7.5) is 100.
  • the present invention relates to a koji mold-derived aminopeptidase, a nucleic acid molecule encoding the same, a host of a transformed microorganism containing a recombinant DNA containing the nucleic acid molecule, and culturing the transformed microorganism host.
  • a process for producing aminopeptidase in the present specification, the aminopeptidase protein derived from Aspergillus oryzae of the present invention may be referred to as PepE, and the gene encoding PepE may be referred to as pepE.
  • aminopeptidase refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction of sequentially releasing amino acids from the N-terminal of a peptide.
  • the nucleic acid molecule encoding the aminopeptidase of the present invention may be Aspergillus nizi Can be obtained from the chromosomal DNA or cDNA of Urans. Specifically, it can be obtained from a chromosomal DNA library of Aspergillus nidulans, for example, Aspergillus nidulans A26 strain. Based on the gene sequence of aminopeptidase GX derived from germinated soybean (Japanese Patent Laid-Open No.
  • a primer containing a nucleic acid molecule of the present invention can be obtained by PCR using Aspergillus nidulans chromosome DNA library type I as a type I primer.
  • Examples of the primer for PCR include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 6.
  • nucleic acid molecule of the present invention can be obtained from a cDNA library prepared from Aspergillus nidulans poly (A) RNA by PCR using, for example, oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 8 and 9 as primers, It can be obtained by 5′-RACE using the oligonucleotides shown in 10 and 11 as primers.
  • the nucleotide sequence of the genomic DNA containing the gene encoding PepE derived from Aspergillus nidulans A26 obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of cMA are shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence alone is shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence alone is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be any as long as it encodes the aminopeptidase of the present invention.
  • DNA having a base sequence consisting of base numbers 72 to 1628 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 ′ Those excluding unnecessary parts on the terminal side are also included.
  • "Nucleic acid molecule” also includes DNA, RNA and analogs thereof. Depending on the purpose for which it is used, it may encode only the mature protein.
  • the nucleic acid molecule of the present invention also includes those in which the codon encoding each amino acid in the coding region is replaced with another equivalent codon encoding the same amino acid.
  • nucleic acid molecules of the present invention Aminopeptidase containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions at one or more positions, as long as the activity of the aminopeptidase is not impaired. It may be a code.
  • the term “plurality” varies depending on the position and the type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the peptidase protein, but usually 2 to 300, preferably 2 to 170, The number is more preferably 2 to 50, and most preferably 2 to 10.
  • a nucleic acid molecule encoding a protein substantially the same as the aminopeptidase described above is prepared by, for example, site-directed mutagenesis so that amino acids at specific sites are substituted, deleted, inserted, or added. It is obtained by modifying the nucleotide sequence of pepE.
  • the modified nucleic acid molecule as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Examples of the mutation treatment include a method in which DNA encoding PepE is treated with hydroxyamine or the like, and a method in which a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying DNA encoding PepE is exposed to ultraviolet light or N-methyl-N, A method of treating with a mutagen commonly used for artificial mutation, such as Nitrow N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrite, may be used.
  • NTG Nitrow N-nitrosoguanidine
  • substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of the base as described above also includes a naturally occurring mutation such as a difference depending on the species or strain of Aspergillus oryzae.
  • a nucleic acid molecule having the above mutation in an appropriate cell and examining the PepE activity of the expression product, a nucleic acid molecule encoding a protein substantially identical to PepE can be obtained.
  • nucleic acid molecule encoding PepE having a mutation or a cell carrying the same for example, a nucleic acid molecule having a base sequence consisting of base numbers 72 to 1628 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing and a string
  • stringent conditions refers to the formation of so-called specific hybrids. The condition that is performed.
  • nucleic acids having high homology such as 65% or more
  • Conditions under which nucleic acid molecules having homology hybridize and nucleic acids having lower homology do not hybridize with each other, or under normal washing conditions for Southern hybridization at 60 ° C, lx SSC, 0.1% SDS ⁇ Preferred conditions include hybridization at a salt concentration corresponding to 0.1% SDS.
  • Some of the genes that hybridize under these conditions may have a stop codon in the middle or have lost their activity due to mutations in the active center. It can be easily removed by connecting to a vector and measuring PepE activity by the method described later.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can also be obtained from a microorganism belonging to another species of the genus Aspergillus, for example, chromosomal DNA of Aspergillus oryzae or cDNA. Specifically, it can be obtained by PCR from Aspergillus oryzae, for example, a cDNA library of Aspergillus oryzae RIB40 (ATC C42149). Oligonucleotide primers for PCR were synthesized based on the nucleotide sequence of P.sup.E. It can be prepared by performing PCR.
  • oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 12 and 13 for 5,1 RACE and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 for 3, -RACE Pide As primers for PCR, oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 12 and 13 for 5,1 RACE and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 for 3, -RACE Pide.
  • the nucleotide sequence and the amino acid sequence of the gene cDNA corresponding to pepE of Aspergillus oryzae MB40 obtained as described above are shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence alone is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of PaspE of Aspergillus nidulans shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of the corresponding aminopeptidase of Aspergillus oryzae shown in SEQ ID NO: 4 have a homology of about 77%. Then about 12 0 amino acid residues are different.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises An amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 510 of SEQ ID NO: 4 comprising amino acids containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions; and A nucleic acid molecule encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction for releasing a nucleic acid.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a base sequence consisting of base numbers 73 to 1602 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing under stringent conditions. And a nucleic acid molecule encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction of releasing an amino acid from a peptide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is DNA obtained as described above. Since the nucleotide sequence was clarified, the genomic DNA of Aspergillus nidulans A26 or Aspergillus oryzae RIB40, or other strains of Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae, was obtained from these strains by PCR or hybridization. Nucleic acid molecules encoding the corresponding aminopeptidase can be readily cloned. Accordingly, such nucleic acid molecules are also within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used for producing the aminopeptidase of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used for breeding filamentous fungi such as Aspergillus or producing aminopeptidase PepE.
  • the DNA encoding the aminopeptidase of the present invention is introduced into a filamentous fungal (eg, Aspergillus oryzae) cell, preferably in multiple copies, to reduce PepE activity. Can be increased.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is expressed in a suitable host. Thereby, PepE can be manufactured.
  • the filamentous fungi such as Aspergillus or the like obtained therefrom or PepE obtained therefrom can be used for producing soy sauce, miso, and other seasonings containing protein hydrolysates.
  • filamentous fungi into which the nucleic acid molecule of the present invention is introduced examples include Aspergillus oryzae, Aspergillus niger (A. niger), Aspergillus genus such as Aspergillus nidulans, and neurospora such as Neurospora crassa. And filamentous fungi belonging to the genus Rhizomucor such as Rhizomucor miehei. Aspergillus filamentous fungi are particularly preferred.
  • the vector for introducing the nucleic acid molecule of the present invention into the filamentous fungus as described above is not particularly limited, and those usually used for breeding the filamentous fungus and the like can be used.
  • vectors used for Aspergillus oryzae include pUNG (Le e, BR et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 44, 425-431 (1995)), pMAB, G (Tsuchiya, K. et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 40, 327-332 (1993)), pUSC (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem. 51, Z549-Z555 (1987)) and the like.
  • pUNG is a marker that complements niaD— (nitrate utilization deficiency) of Aspernogillus oryzae niaD300 (Minetoki, T. et al., Curr. Genet. 30, 432-438 (1996)), and pMAUG is Aspergillus. Olize M2- 3 (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem., 51 (9), 2549-2555 (1987)), a marker complementary to argB— (arginine requirement), pUSC Aspergillus' oryzae NS4 (YajDada, 0. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61 (8), 1367-1369 (1997)) You have it.
  • pUNG and pMARG have the promoter for the glucoamylase gene (glaA) and the promoter for the amylase (amyB), and Downstream of the DNA of the present invention (for example, base number 7 in SEQ ID NO: 2)
  • PepE can be expressed under control.
  • pUSC does not contain a promoter overnight, when this is used, the host filamentous fungus is obtained by co-transformation of a plasmid such as pUC19 into which DM of the present invention has been inserted and pUSC. By introduction, PepE can be expressed.
  • Aspergillus oryzae can be transformed as follows.
  • DPY medium 2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, ⁇ 5.0
  • the culture solution is filtered with Miracloth (Myracloth. Manufactured by CALBIO CHEM) or sterilized gauze, etc., and the cells are collected, washed with sterilized water, and drained well.
  • This cell is placed in a test tube, and an enzyme solution (1.0% Yatalase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) or 0.5% Novozyme (NovoZye, manufactured by Novo Nordisk) and 0.5% cellulase (for example, Cellulase 0Nozuka, manufactured by Yakult Co.), 0.6M (NH 4) 2 S0 4 50IDM malic acid, pH 5.5) is added and shaken for about 3 hours gentle Ya or at 30 ° C. Observe the degree of protoplast formation under a microscope, and store it on ice if good.
  • an enzyme solution (1.0% Yatalase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Novozyme Novozyme
  • cellulase for example, Cellulase 0Nozuka, manufactured by Yakult Co.
  • 0.6M (NH 4) 2 S0 4 50IDM malic acid, pH 5.5) is added and shaken for about 3 hours gentle Ya or at 30 °
  • the enzyme reaction mixture was filtered through Miracloth to remove cell debris, and an equal volume of buffer A (1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH 7.5) was added to the filtrate containing protoplasts. And place on ice. After centrifugation at 0 ° C; 15.00-2,500 rpm for 5-10 minutes, stop gently, wash the pellet with buffer A, and suspend in an appropriate amount of buffer A. To a 100-200 / 1 protoplast suspension, add 20/1 or less DNA solution (5-: LO zg) and place on ice for 20-30 minutes.
  • buffer A 1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH 7.5
  • buffer B (60% polyethylene glycol 6000, 50 mM CaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH 7.5) and mix gently.Add buffer 250 once and mix gently. Add 850 ⁇ 1 of buffer B, mix gently, and leave at room temperature for 20 minutes. Then, add 10 ml of buffer A, invert the test tube, and centrifuge at 0 ° C, l, 500-2,500 rpm for 5-10 minutes, and suspend the pellet in 500 l of buffer A.
  • buffer B 60% polyethylene glycol 6000, 50 mM CaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH 7.5
  • PepE a crude enzyme extract containing PepE can be obtained by diluting the culture with distilled water or the like and treating it with Stoma matsuri or the like. PepE can be further purified from the obtained crude extract by using gel filtration, various types of chromatography and the like.
  • the obtained PepE can be further purified by salting out, isoelectric point precipitation, gel filtration, ion chromatography, reverse phase chromatography, etc., and used for protein degradation.
  • the culture of the transformed microorganism having the PepE activity improved by introducing the nucleic acid molecule of the present invention is directly mixed with the protein material together with the protease to act on the protein or a mixture thereof, so that the free amino acid content is high, Strongly tasty protein hydrolyzate can also be obtained.
  • the protein raw material to be acted on include soybean, wheat, wheat gluten and the like, and further, various proteins processed such as defatted soybean or puffed ⁇ soluble, or separated proteins from these various raw materials. You may.
  • PepE activity was measured by adding 0.02 ml of crude enzyme extract and 0.015 ml of lOOmM zinc chloride to 0.75 ml of 1 mM Leu-pNA (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5), and reacting at 37 ° C for 10 minutes. The reaction can be stopped by adding 0.25 ml of 40% acetic acid, and then measuring the absorbance at 405 nm of the reaction solution. The activity in the various preparations can be compared to the enzyme activity producing 1 mol of paranitroanilide per minute as 1 unit (U).
  • the culture of the transformed microorganism may be mixed with a protein material having a concentration of 0.2 to 50% in the presence of a protease, and the mixture may be reacted at 5 to 60 ° C. for 4 hours to 10 days.
  • Example 1 Cloning of pepE genomic DNA of Aspergillus nidulans Based on the sequence of aminopeptidase GX derived from germinated soybean, the EST database of Aspergillus nidulans (http: ⁇ ww. Genome.ou.edu/ Using fungal. html), a homology search was performed, and EST obd03al.fl with high homology was found.
  • Aspergillus nidulans pepE was cloned from the Aspergillus nidulans genomic library as follows.
  • Aspergillus nidulans genomic library was purchased from Fungal Genetics Stock Center (Kansas City, USA). In this library 1, Aspergillus nidulans genomic DM was cut with a restriction enzyme, ligated to a cosmid vector, and introduced into Escherichia coli. The screening of the library was performed as follows. That is, the target gene was obtained by PCR using Escherichia coli containing the cosmid drug Yuichi as a type I DNA source and using, as a primer, an oligonucleotide having the following sequence synthesized based on the base sequence of EST obd03al.fl. E. coli clones included were screened.
  • SEQ ID NOs: 6 and 7 PCR primers
  • Aspergillus nidulans A26 was cultured in YG medium (yeast extract 0.5%, glucose 2.5%, trace elements * 0.1%, pH 6.5) at 50 ° C with shaking at 30 ° C for 48 hours (trace elements *: FeS04 4 '73 ⁇ 40 0.1 %, ZnS0 4 -7H 2 0 0.88 %, CuS0 4 -53 ⁇ 40 0.04%, MnS0 4 - 43 ⁇ 40 0.015%, Na 2 B 4 0 7 -10H 2 0 0.01%, ( ⁇ 4) 6 ⁇ 0 24 ⁇ 43 ⁇ 40 0.005%).
  • YG medium yeast extract 0.5%, glucose 2.5%, trace elements * 0.1%, pH 6.5
  • pepE cDNA was cloned by PCR and 5'-RACE using oligonucleotides having the following sequences designed from Aspergillus' nidulans genomic DNA sequence as primers.
  • CAC CAC CAT GAG TCT AAC TTG G (SEQ ID NO: 8)
  • SEQ ID NOS: 8-11 PCR primers
  • the PCR reaction conditions were: heat denaturation at 94 ° C for 9 minutes, 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, followed by a reaction at 72 ° C for 5 minutes. Was done.
  • an approximately 1800 bp DNA fragment was obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOS: 8 and 9, and an approximately 250 bp amplified fragment was obtained by 5′-RACE using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11. .
  • the nucleotide sequence of these DNA fragments and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NO: 2.
  • Aspergillus oryzae RIB40 (ATCC42149) was cultured in 50 ml of DPY ⁇ 30 ml at 30 ° C. for 64 hours. The cells were collected by filtration, and 1 g was recovered. The cells were immediately frozen with liquid nitrogen and ground in a mortar, and then total RNA was obtained using the RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). MRNA was purified from the MA using the mA Purification Kit (Pharmacia), and the cDNA library was purified using the cDNA PGR library kit (TaKa) or 3, -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (GIBC0 BRL). It was constructed.
  • CDNA homologous to pepE of Aspergillus oryzae was cloned by 5'-RACE using the oligonucleotides shown in 12 and 13 as primers and 3'-RACE using SEQ ID NOs: 14 and 15 as primers.
  • SEQ ID NO: 1 2-15 PCR primer
  • the RACE PGR reaction is performed after heat denaturation at 95 ° C for 9 minutes, then at 94 ° C for 30 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C.
  • nucleotide sequence of the above gene fragment revealed that it contained a full-length pepE homologous sequence.
  • This nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NO: 4. In addition, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the Escherichia coli DH5 strain transformed with the plasmid obtained by inserting this gene sequence into the plasmid pBluescript was attached with a private nanno AJ13858, and was researched on March 19, 2001 by the Ministry of Economy, Trade and Industry. Deposited at Tokoro Biotechnology Industrial Technology Research Institute (currently, Japan Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Sen-ichi Patent Patent Depositary, Tsukuba Ibaraki, Japan 1-1-1 Central No. 6, Postal Code 305-8566) Accession No. ⁇ P-1 8265 has been assigned and transferred to the International Depositary on March 11, 2002 as Accession No. FERM B P-7951 at Senichi Yuichi.
  • Plasmid pBSAopepE was prepared by ligating Aspergillus oryzae pepE cDNA obtained in Example 3 to pBluescript Smal site. Convert pepE cDNA from this plasmid into Ec Cut out with oRI and Xbal, ligate the vector containing the marker gene niaD downstream of the glucoamylase promoter of pUNGl (Lee, BR et al., Applied Microbiology Biotechnology, 44, 425-431 (1995)) and transform it. A plasmid pNGAPE was prepared. Transformation was performed with this plasmid DNA zg.
  • a conidia of Aspergillus oryzae niaD300 strain was inoculated in the DPY place, and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the culture was filtered through sterilized gauze, and the cells were collected and washed with sterilized water.
  • the cells were placed in a test tube, 20 ml of an enzyme solution (1.0 atalase (Yatalase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)) was added, and the mixture was gently shaken at 30 ° C. for 3 hours.
  • the degree of protoplast formation was observed under a microscope and stored on ice.
  • the enzyme reaction mixture was filtered with Miracloth to remove cell debris, and an equal amount of buffer A (1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCk PH7.5) was added to the filtrate containing protoplasts. And placed on ice. This was centrifuged at 0 ° C, 500 rpm for 5 minutes, gently stopped, and the pellet was washed twice with 10 ml of buffer A and suspended in 1 ml of buffer A.
  • buffer A 1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCk PH7.5
  • the transformant obtained as described above was cultured in wheat bran, and the aminopeptidase activity of the extract was measured.
  • the aminopeptidase activity in the crude enzyme extract prepared as described above was measured as follows. That is, 0.02 ml of crude enzyme extract and 0.015 ml of lOOmM zinc chloride were added to 0.75 ml of ImM Leu-pNA (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7,5), and reacted at 37 ° C for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 0.25 ml of acetic acid. The activity was measured by measuring the absorbance at 405 nm of the reaction solution. The activity was defined as one unit (U) of the enzyme activity that produces 1 mol of paranitroanilide per minute. As a control, a crude enzyme extract was similarly prepared for a transformant obtained by transformation with vector DNA containing only a marker gene, and aminopeptidase activity was measured by the method described above.
  • a medium was prepared by placing 20 g of wheat bran culture medium in a 300 ml flask and autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes.
  • a spore suspension of the PepE-high-expressing transformation prepared in Example 4 was prepared and inoculated into the medium.
  • the medium inoculated with the spores was mixed well and cultured at 30 ° C for 5 days. On the way, 48 hours later, the medium was stirred to perform care.
  • the bran koji produced as described above was immersed in 10 volumes (w / w) of 20 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.4), lmM EDTA 3 lm PMSF (phenyl methanesulfonyl fluoride). After standing at 16 ° C for 16 hours, the supernatant obtained by gauze filtration and centrifugation (4 ° C, 10 minutes, 7,500 rpm) was used as a crude enzyme extract.
  • Ammonium sulfate was added to the crude enzyme extract to obtain a 403 ⁇ 4-60 ammonium sulfate precipitation fraction.
  • This precipitate was dissolved in a 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4). This was filtered through a filter having a pore size of 0.445111. Beforehand, 20 mM potassium phosphate buffer ( ⁇ 7 4) The filtrate was applied to a desalting column (HiTrap Desalting (25 ml) manufactured by Amersham Pharmacia) equilibrated with 150 m NaCl, and eluted with the same buffer. The obtained active fraction was concentrated by ultrafiltration.
  • the sample obtained above was adsorbed on an anion exchange column (HiTrap Q-sepharose HP (25 ml) manufactured by Amersham Pharmacia) previously equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4).
  • the column was washed with 3 times the column volume of the same buffer. After washing, elution was performed by linearly increasing the NaCl concentration of the buffer solution from 0 M to 1 M in 20 times the column volume.
  • the active fraction collected in the eluate was concentrated by ultrafiltration.
  • the obtained sample was fractionated by gel filtration chromatography using HiLoad 26/60 Superdex 200pg (manufactured by Amersham Pharmacia). A sample was applied to this column which had been equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) and 150 mM NaCl in advance, and eluted with the same buffer to collect an active fraction. Through the above operations, purified PepE was obtained.
  • the aminopeptidase activity of this enzyme solution was measured as follows. That is, 0.02 ml of the crude enzyme extract was added to 0.73 ml of the substrate solution (ImM Leu-pNA, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 2 mM cobalt chloride) and reacted at 37 ° C for 10 minutes. Thereafter, the reaction was stopped by adding 0.25 ml of 40% acetic acid. The absorbance value of this reaction solution at 405 nm was measured, and the activity value was calculated. The activity was defined as one unit of the enzymatic activity for producing 1 mol of para-nitro-alilide per minute.
  • Fig. 1 shows the relative activities when the activity value at 37 ° C is 100.
  • Fig. 2 shows the relative activities when the activity value of the group without NaCl added was set to 100. This enzyme was found to have sufficient activity even under high concentrations of dietary salt.
  • the purified enzyme was stored in 0-4 M NaCl, 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) at 0 ° C for 24 hours, and the activity was measured in a reaction solution having the same salt concentration as the stored salt. The results are shown in Table 5. c Table 5. Stability of PepE in saline solution
  • the present invention provides a means for obtaining a protein hydrolyzate having a high free amino acid content and a strong taste.
  • aminopeptidase and a nucleic acid molecule encoding the same are provided which efficiently degrade peptides under the brewing of soy sauce containing a large amount of salt, thereby improving the taste of soy sauce or protein hydrolyzate. It is possible to further increase.
  • the host introduced in a form capable of expressing the nucleic acid molecule of the present invention can be used to produce the protein of the present invention.

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Description

明細書
新規アミノぺプチダ一ゼおよびその遺伝子 発明の背景
本発明は、 ァミノべプチダ一ゼ及びそれをコ一ドする遺伝子に関する。
醤油、 味噌、 その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造に、 麹菌 が利用されている。 たとえば、 醤油は、 製麹および発酵の 2段階を経て製造され る。主として、 製麹段階において、麹菌（ァスペルギルス （Aspergillus)属糸状 菌） が生産する酵素によって原料が分解される。 その際、 醤油中の呈味性をよく するためには、 諸味中の遊離アミノ酸の量を增加させることが重要である。
アミノ酸は、 原料タンパク質から 2つの段階を経て生成される。 第一は、 プロ テアーゼによるタンパク質からのぺプチドの放出であり、 第二はぺプチダ一ゼに よつて触媒されるぺプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
麹菌のぺプチダ一ゼについては、 ァスペルギルス ·オリゼゃァスペルギルス · ソーャ由来のもの （特開平 11- 346777号、 DE95-1952648, W09851163、 W09628542 W09615504, W09851803 W09814599) について報告されている。そのなかでも、醤 油製造においてはロイシンアミノぺプチダーゼの重要性が示されている。 しかし ながら、 これまで知られているロイシンアミノぺプチダーゼにつ tヽて耐塩性があ るという報告はない。 また、 ァスペルギルス属のロイシンアミノぺプチダーゼの 遺伝子については海附ら （特閧平 11- 346777号）のァスペルギルス 'ソーャの報告 があるが、 該酵素の耐塩性についての報告はない。
また、 バチルス属では耐塩性をもつロイシンアミノぺプチダーゼの報告がある (Lee, G.D.ら、 J. Appl. Microbiol. (1988), 85 (3))。
一方、 浅野らはダイズが、 その発芽過程において、 種子中の貯蔵タンパク質を 非常に短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、 ダイズ子葉中よりぺプチダ —ゼ類 （酸性アミノ酸含有べプチドを効率的に分解するアミノぺプチダーゼ G X、 及びロイシンアミノぺプチダーゼ群） を見出し、 ダイズタンパク質の効率的な加 水分解を行うことに成功した （特開平 9-294583号） 。
ダイズのアミノぺプチダーゼ GXはその酵素学的諸性質から、 これまでに報告 されていない新規なアミノぺプチダーゼであり、 発芽大豆以外にはその存在は知 られていない。 ダイズのアミノぺプチダ一ゼ GXは N末端にグル夕ミン酸などの 酸性アミノ酸を有するぺプチドから、 効率的に N末端の酸性アミノ酸を遊離する 活性を有する。 従って、 本酵素の作用により、 グルタミン酸の遊離率が高く呈味 性の優れた醤油の製造が可能である。
二宮らはダイズのァミノぺプチダーゼ GXを遺伝子組換え技術を用いて大量生 産することに成功した（特開 2000-325090)が、 この方法により生産したダイズの アミノぺプチダ一ゼ GXを醤油醸造に利用することは、 GM O問題、 コスト面等 で困難である。 発明の開示
本発明は遊離ァミノ酸含量が高く、 呈味性の優れた醤油または夕ンパク質分解 物の製造に効果のある麹菌由来のアミノぺプチダ一ゼおよび該アミノぺプチダ一 ゼをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
本研究者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、 ダイズ由来アミノぺ プチダ一ゼ GX遺伝子と相同性のある、 ァスペルギルス 'ニジュランス （A. nid ulans) E S Tをプローブに用いることにより、 ァスペルギルス 'ニジュランスの ゲノム DNAライブラリ一をスクリ一ニングし、ァスペルギルス'ニジュランス由来 新規アミノぺプチダーゼをコードする DNAを取得することに成功し、本発明を完成 するに至った。
すなわち、 本発明は下言 3 (A) ~ (D) のいずれかに示すタンパク質である ： (A)配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1〜519で表されるァミノ酸配列を有す るタンパク質、
(B )配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1〜510で表されるアミノ酸配列を有す るタンパク質、
( C )配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1〜519で表されるァミノ酸配列におい て、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付カロ、 又は逆位を含むァ ミノ酸配列からなり、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反応を触 媒する活性を有するタンパク質、
(D )配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1 ~510で表されるアミノ酸配列におい て、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むァ ミノ酸配列からなり、 かつ、 ぺプチドの N-末端からァミノ酸を遊離する反応を触 媒する活性を有するタンパク質。
また本発明は、 上記の （A) 〜 （D ) のいずれかをコードする核酸分子、 該核 酸分子を含む組換え核酸分子、 形質転換微生物宿主、 および該形質転換微生物宿 主を用いたアミノぺプチダーゼの製造法である。 特に本発明は、 形質転換微生物 宿主として形質転換糸状菌、 とりわけ形質転換麹菌を含む。
また、 本発明は、 以下の 1 ) 〜8 ) の性質を有するアミノぺプチダーゼである c
1 )ロイシン、メチォニンを N末端に含むペプチド又はタンパク質を分解して ロイシンあるいはメチォニンを遊離する。
2 ) 至適 pHが約 7.0~7.5である。
3 ) 至適温度が約 37〜45°Cである。
4 )食塩非存在下での活性を 100%としたとき、 3Mの食塩濃度下でも 80%以上 の残存活性を示す。
5 ) 0°C、食塩非存在下、 24時間保存の条件での活性を 100%としたとき、 0° 3M食塩存在下、 24時間保存の条件で 80%以上の残存活性を示す。
6 ) pH7.5、 0°C；、 24時間保存の条件での活性を 100%としたとき、 ρΗ5.8〜9· 5の範囲で 0°C、 24時間保存の条件で 60%以上の残存活性を示す。
7 ) 未変性- PAGEにより約 550kD、 還元、 加熱 SDS- PAGEにより 22、 33kDの分子量を
8 ) 活性ィ匕にコバルトイオン、 或いは亜鉛イオンを必要とする。 図面の簡単な説明
図 1は、 PepE活性の温度依存性を示したグラフである。横軸は温度、縦軸は 37°C における活性値を 100としたときのロイシンアミノぺプチダーゼ活性の相対値で める。
図 2は、 PepEに対する反応液中の食塩濃度の影響を示すグラフである。横軸は N aCl濃度 (M)、縦軸は NaCl無添加の場合の活性値を 100としたときの NaCl濃度におけ るロイシンアミノぺプチダーゼ活性の相対値である。
図 3は、 PepE活性の pH依存性を示したグラフである。横軸は pH、 縦軸はリン酸 カリウム緩衝液 （PH7.5) 中における活性値を 100としたときのロイシンアミノぺ プチダーゼ活性の相対値である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 上述したとおり、 麹菌由来のアミノぺプチダーゼおよび、 それをコ ードする核酸分子、および前記核酸分子を含む組換え DNAを含む形質転換微生物宿 主、 その形質転換微生物宿主を培養することを特徴とするァミノぺプチダ一ゼの 製造方法である。 本明細書においては、 本発明の麹菌由来アミノぺプチダーゼ夕 ンパク質を PepEと記載し、 PepEをコードする遺伝子を pepEと記載することがある。 また、 本明細書において、 「アミノぺプチダーゼ」 とは、 ペプチドの N-末端から 順次アミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。
本発明のアミノぺプチダーゼをコードする核酸分子は、 ァスペルギルス ·ニジ ュランスの染色体 DNA又は c DNAから取得することができる。 具体的には、 ァスぺ ルギルス ·ニジュランス、 例えばァスペルギルス ·ニジュランス A26株の染色体 D NAライブラリーから取得することができる。発芽大豆由来のアミノぺプチダーゼ G X (特開 2000-325090)の遺伝子配列とァスペルギルス 'ニジュランス ESTデータべ —ス中の相同性の高い EST断片の塩基配列を参考に、 PCR (ポリメラ一ゼ ·チエイ ン。 リアクション） プライマーを作製し、 ァスペルギルス 'ニジュランス染色体 D NAライブラリ一を錶型とした PCR法により本発明の核酸分子を含むクローンを取 得することができる。 PCR用プライマーの例としては、配列番号 6及び Ίに示す塩 基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
また、 本発明の核酸分子は、 ァスペルギルス 'ニジュランスのポリ （A) RNA から調製した c DNAライブラリーから、例えば配列番号 8及び 9に示す塩基配列を 有するオリゴヌクレオチドをプライマーとする PCR、さらに配列番号 1 0及び 1 1 に示すォリゴヌクレオチドをプライマ一とする 5 '-RACEによって、 取得すること ができる。 上記のようにして得られるァスペルギルス '二ジュランス A26由来の P epEをコ一ドする遺伝子を含むゲノム DNAの塩基配列を配列番号 1に示す。また、 c MAの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号 2に、アミノ酸配列のみを配列番号 3 を示す。 ゲノム DNAと cDNAの塩基配列を比較した結果、 ゲノム DNA中にはイントロ ンは見出されなかった。
本発明の核酸分子は、 本発明のアミノぺプチダーゼをコードするものであれば よく、 配列番号 2に示す塩基配列のうち塩基番号 72〜； 1628からなる塩基配列を有 する DNAの他、 5 '末端側の不要な部分を除いたものも含まれる。 「核酸分子」 に は DNA、 RNAおよびこれらのアナログも含まれる。 使用する目的によっては、 成熟 タンパク質のみをコードするものであってもよい。 また、 コード領域において各 アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置 換したものも本発明の核酸分子に含まれる。 さらに、 本発明の核酸分子は、 コー ドされるァミノぺプチダ一ゼの活性が損なわれない限り、 1若しくは複数の位置 での 1若しくは複数のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミ ノぺプチダ一ゼをコードするものであってもよい。 ここで、 「複数」 とは、 ぺプ チダーゼ夕ンパク質の立体構造におけるァミノ酸残基の位置や種類によっても異 なるが、 通常 2〜3 0 0個、 好ましくは 2〜1 7 0個、 さらに好ましくは 2 ~ 5 0個、 最も好ましくは 2〜1 0個である。
上記のようなアミノぺプチダーゼと実質的に同一のタンパク質をコードする核 酸分子は、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の部位のアミノ酸が置換、 欠 失、 挿入、 付カ卩されるように pepEの塩基配列を改変することによって得られる。 また、 上記のような改変された核酸分子は、 従来知られている突然変異処理によ つても取得され得る。突然変異処理としては、 PepEをコ一ドする DNAをヒドロキシ ルァミン等でィンビト口処理する方法、及び PepEをコードする DNAを保持するェシ エリヒァ属細菌を、 紫外線照射または N—メチル一N，一二トロー N—ニトロソグァ 二ジン（NTG)もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によ つて処理する方法が挙げられる。
また、 上記のような塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位等には、 麹菌の 種あるいは菌株による差等、 天然に生じる変異も含まれる。 上記のような変異を 有する核酸分子を、 適当な細胞で発現させ、 発現産物の PepE活性を調べることに より、 PepEと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。 また、 変異を有する PepEをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、 例えば 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列のうち、塩基番号 72〜； 1628からなる塩基配列 を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、 PepE 活½£を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することによつても、 PepE タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。 ここ でいう 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成 される条件をいう。 この条件は個々の配列の G C含量や繰り返し配列の有無など に依存するため明確に数値ィ匕することは困難であるが、 一例を示せば、 相同性が 高い核酸分子同士、 例えば 65%以上の相同性を有する核酸分子同士がハイプリダ ィズし、 それより相同性が低い核酸分子同士がハイブリダィズしない条件、 ある いは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗滌条件である 60°C、 l x SSC、 0. 1%SDSヽ 好ましくは、 O. l SSCs 0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズす る条件が挙げられる。 このような条件でハイプリダイズする遺伝子の中には途中 にストップコドンが発生したものや、 活性中心の変異により活性を失ったものも 含まれる可能性があるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ P epE活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。 また、 本発明の核酸分子は、 ァスペルギルス属の他の種に属する微生物、 例え ばァスペルギルス■ォリゼの染色体 DNA又は c DMから取得することもできる。 具 体的には、 ァスペルギルス 'ォリゼ、 例えばァスペルギルス 'ォリゼ RIB40 (ATC C42149) の c DNAライブラリーから PCR法により取得することができる。 上記ァス ペルギルス ·ニジユランスの PepEの塩基配列をもとに、 PCR用のォリゴヌクレオチ ドプライマ一を合成し、 ァスペルギルス ·ォリゼ、 例えばァスペルギルス ·ォリ ゼ RIB40の菌体より調製した cDNAライブラリ一を錶型とする PCRを行うことにより 調製することができる。 PCR用プライマ一としては、 5，一 RACE用には配列番号 1 2及び 1 3に示す塩基配列、 3，-RACE用には配列番号 1 4及び 1 5に示す塩基配 列を有するオリゴヌクレォチドが挙げられる。
上記のようにして得られるァスペルギルス 'ォリゼ MB40の pepEに対応する遺伝 子 cDNAの塩基配列及びァミノ酸配列を配列番号 4に、 ァミノ酸配列のみを配列番 号 5に示す。 配列番号 2に示すァスペルギルス ·ニジュランスの PepEのアミノ酸 配列と配列番号 4に示すァスペルギルス ·ォリゼの対応するァミノぺプチダ一ゼ のアミノ酸配列は、 約 77%の相同性を有しており、 成熟タンパク質部分では約 12 0アミノ酸残基が異なっている。ァスペルギルス 'ォリゼの pepE対応遺伝子とァス ペルギルス ·ニジュランスの pepEとの相同性は、 コード領域では約 71%であった c 本発明の一つの実施態様において、 本発明の核酸分子は、 配列表の配列番号 4 のアミノ酸番号 1〜510で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァ ミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸からなり、 かつ、 ぺ プチドからアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコード する核酸分子を含む。 また、 本発明の別の実施態様では、 本発明の核酸分子は、 配列表の配列番号 4に示す塩基配列のうち、 塩基番号 73〜： 1602からなる塩基配列 を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ、ぺプチドか らアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする核酸 分子を含む。
以下に示す実施例においては、本発明の核酸分子は上記のようにして得られた D NAである。その塩基配列が明らかとなったので、 ァスペルギルス ·ニジュランス A26もしくはァスペルギルス ·ォリゼ RIB40、 又はァスペルギルス ·ニジュランス もしくはァスペルギルス ·ォリゼの他の菌株のゲノム DNAから、 PCR又はハイプリ ダイゼ一シヨン等により、 これらの菌株から対応するアミノぺプチダーゼをコー ドする核酸分子を容易にクローニングすることができる。 従って、 そのような核 酸分子も本発明の範囲である。
本発明の核酸分子は本発明のアミノぺプチダ一ゼを製造するために使用するこ とができる。
本発明の核酸分子は、 麹菌等の糸状菌の育種、 あるいはアミノぺプチダーゼ Pe pEの製造に利用することができる。 例えば、 本発明の一つの実施態様において、 本発明のアミノぺプチダ一ゼをコードする DNAを、 糸状菌 （例えばァスペルギル ス 'ォリゼ） 細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、 PepE活性 を増大させることができる。 また、 本発明の核酸分子を適当な宿主で発現させる ことにより、 PepEを製造することができる。 このようにして得られる麹菌等の糸 状菌又はそれらより得られる PepEを、 醤油、 味噌、 その他のタンパク質加水分解 物を含む調味料等の製造に利用することができる。
本発明の核酸分子を導入する糸状菌としては、 ァスペルギルス 'ォリゼ、 ァス ペルギルス ·ニガ一 （A. niger) 、 ァスペルギルス ·ニジュランス等のァスペル ギルス属、 ニューロスポラ 'クラッサ (Neurospora crassa)等のニューロスポラ 属、 リゾムコール'ミーヘイ （Rhizomucor miehei)等のリゾムコール属に属する 糸状菌が挙げられる。 ァスペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に本発明の核酸分子を導入するためのベクターとしては特 に制限されず、 糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができ る。 例えば、 ァスペルギルス ·ォリゼに用いられるベクターとしては、 pUNG (Le e, B.R. et al. , Appl. Microbiol. BiotechnoL , 44, 425-431 (1995)) 、 pMAB, G(Tsuchiya, K. et al. , Appl . Microbiol. BiotechnoL , 40, 327-332 (1993))、 pUSC (Gomi, K. et al. , Agric. Biol. Chem. 51, Z549-Z555 (1987)) 等が挙げ られる。 pUNGはァスぺノレギルス 'オリゼ niaD300 (Minetoki, T. et al. , Curr. Genet. 30, 432-438 (1996)) の niaD— (硝酸資化能欠損) を相補するマーカー を、 pMAUGはァスペルギルス 'ォリゼ M2- 3 (Gomi, K. et al.， Agric. Biol . Ch em. , 51(9), 2549-2555 (1987)) の argB— (アルギニン要求) を相補するマーカ —を、 pUSCはァスペルギルス 'ォリゼ NS4 (YajDada, 0. et al . , Biosci. Biote ch. Biochem. , 61(8), 1367-1369 ( 1997)) の sC— (ATPスルフリラーゼ欠損) を 相補するマ一カーを、 それそれ有している。
これらのベクターのうち、 pUNG及び pMARGは、 グルコアミラーゼ遺伝子 （glaA) のプロモ一夕一及びひ一アミラーゼ遺伝子 （amyBの夕一ミネ一夕一） を有してお り、 該プロモ一夕一の下流に本発明の DNA (例えば配列番号 2において塩基番号 7
2〜1628を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモ一夕一 制御下で PepEを発現させることができる。 また、 pUSCはプロモ一夕一を含んでい ないので、 これを用いる場合は、本発明の DMを挿入した pUC19等のプラスミドと p USCとの共形質転換 （co-transformation) により宿主糸状菌に導入することによ つて PepEを発現させることができる。
また、 以下の表 1中に示した文献に記載されているぺク夕一、 プロモー夕一及 びマーカ一も宿主糸状菌に応じて使用することができる。 表 1中、 プロモー夕一 は天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名で示してある。
0 表 1 文献 プロモー夕- マ-カ- 宿主糸状菌 特表平 4-503450号 中性ひ-アミラ-セ、' ァスへ。ルキ、、ルス'二力、、 - argB ァスへ。ルキ、、ルス'二力、、- argB ァスへ。ルキ、、ルス'ニシ、、ュランス trpC ァス ルキ、、ルス ·ニシ、、ュランス ajndS ァス ルキ、、ルス ·ニシ、、ュランス pyr4 ニューロスホ °ラ ·クラッサ
DHFR ニュ-ロスホ°ラ ·クラッサ
、、， 、、 特開 HQb - Ζ (Δυοο タカ/ フー 1! /スへ ルキ ル ·オリで
アス^ラキ、、ン酸フ °Dテア-セ、、 リソ、、ム: ί-ル'ミ- Μ リ八 °一セ、、 リソ、、ム： I-ル'ミ- Μ ク、、ルコアミラ-セ、、、 リ八。-セ、、 ァス ルキ、、ルス ·；：力、、 - ァミラ-セ、、、 ルコアミラ-セ、、、 セルラ- セ、、
フ°口テア -セ、、、 解糖系酵素
特開平 7- 51067 夕カァミラ-セ、、 ァスへ。ルキ、、ルス属 特開平 7- 115976 新規; 7°Πΐ-タ-配列が記載 ァス ルキ、、ルス'ォリセ、、 特開平 7-59571 新規; 7°ϋΐ-タ-配列が記載 ァス ルキ、、ルス'ォリセ、、 口太 ムき士 ο:—ァミラ一セ、、 (anyB) ァスへ。ルキ、、ルス'ォリセ、、
Vol.71,No.10(1997) ク、、ルコアミラ-セ、、（glaA) ァス ルキ ス'ォリセ、、 1018-1023 グ、ルコシタ、、 -セ、、（agdA) ァスへ。ルキ、、ルス'ォリセ、、
糸状菌の形質転換は、 上記文献に記載されている方法の他、 任意の公知の方法 を採用することができる。 例えばァスペルギルス 'ォリゼは以下のようにして形 質転換することができる。
DPY培地（グルコース 2 %、 ペプトン 1 %、酵母エキス 0.5%、 ρΗ5.0)に菌体（分 生子） を植菌し、 30°Cで 24時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス （M yracloth. CALBIO CHEM社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、 菌体を回収し、滅 菌水で洗浄し、 水分をよく切る。 この菌体を、 試験管に入れ、 酵素液（1.0%ャ夕 ラ一ゼ （Yatalase、 宝酒造 （株） 製）、 または 0.5%ノボザィム （NovoZy e、 ノボ ノルディスク社製） 及び 0.5%セルラーゼ （例えば Cellulase 0nozuka、 ヤクルト 社製） 、 0.6M (NH4 ) 2S04 50IDMリンゴ酸、 pH5.5) を加え、 30°Cで 3時間程度穏 やかに振盪する。 顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、 良好であれば氷中 に保存する。
上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、 プロトプラストを 含む濾液に等量の緩衝液 A (1.2Mソルビトール、 50mM CaCl 2、 35mM NaCl2、 lOmM Tris - HC1、 pH7.5) を加えて氷中に置く。 これを 0 °C；、 15.00〜2, 500rpmで 5〜； 10 分間遠心した後、 緩やかに停止させ、 ペレットを緩衝液 Aで洗浄し、 適量の緩衝 液 Aに懸濁する。 100〜200 /1のプロトプラスト懸濁液に 20 / 1以下の DNA溶液（5 〜： LO zg) を加え、 20~30分氷中に置く。緩衝液 B (60%ポリエチレングリコール 6000、 50mM CaCl2, lOmM Tris- HC1、 pH7.5) を 250 z l加えて穏やかに混合し、 再 び緩衝液 Bを 250 1加えて穏やかに混合した後、 さらに緩衝液 Bを 850〃1加えて 穏やかに混合し、 20分室温で静置する。 その後、 10mlの緩衝液 Aを加えて試験管 を反転させ、 0 °C、 l，500〜2，500rpmで 5分間〜 10分間遠心し、ペレヅトを 500 l の緩衝液 Aに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、 予め分注し保温しておいた 5 mlのトップアガーに加えて、 下層培地 （1.2Mソルビトールを含有し、 マ一カーに応じて調製した選択培地） に 重層し、 30°Cで培養する。 生育した菌体を選択培地に植え継いで、 形質転換体で あることを確認する。さらに、菌体から組換え DNAを調製し、制限酵素解析又はサ ザン解析等によって、本発明の DNAが導入されていることを確認しておくことが好 ましい。 上記のようにして得られる形質転換体を、 使用するプロモ一夕一に適した条件 で培養することによって pepEが発現し、 PepEが得られる。 例えば、 ァスペルギル ス 'ォリゼを宿主に用い、 プロモー夕一としてグルコアミラーゼプロモ一夕一を 使用する場合には、 小麦フスマ、 リン酸カリウム等を含む培地に形質転換ァスべ ルギルス 'ォリゼの胞子を懸濁し、 約 30°Cにて約 3日間培養することにより PepE を産生させることができる。 必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、 ストマツ 力一等で処理することによって PepEを含む酵素粗抽出液を得ることができる。 得 られた粗抽出液はゲル濾過、 種々のクロマトグラフィー等を用いることによって 更に PepEを精製することもできる。 得られた PepEは更に塩析、 等電点沈殿、 ゲル 濾過、 イオンクロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー等によって精製して、 タンパク質の分解のために使用することができる。 しかしながら、 本発明の核酸 分子を導入し PepE活性の向上した形質転換微生物の培養物をタンパク質分解酵素 とともにタンパク質原料と直接混合してタンパク質またはその混合物に作用させ ることにより、 遊離アミノ酸含量が高く、 呈味の強いタンパク質加水分解物を得 ることもできる。 作用させるタンパク質原料としては、 例えば大豆、 小麦、 小麦 グルテン等が挙げられ、 さらに脱脂大豆あるいは膨化ゃ可溶ィ匕等の加工をされた 種々のタンパク質あるいはこれらの種々の原料からの分離タンパク質であっても よい。
PepE活性は、 例えば l mM Leu-pNA (50mMリン酸ナトリゥムバッファ一、 pH7.5) 0.75mlに酵素粗抽出液 0.02ml、 lOOmM塩化亜鉛 0.015mlを加え、 37°Cで 10分間反 応させた、 40% 酢酸を 0.25ml添加して反応を停止させた後、 反応液の 405nmの吸 光度を測定することにより測定することができる。種々の調製物中の活性は 1分間 あたりに l〃molのパラニトロァニリドを生成する酵素活性を 1ュニヅト（U)と して比較することができる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条 件としては、たとえば 0.2〜50%濃度のタンパク質原料に形質転換微生物の培養物 をタンパク質分解酵素存在下で混合し、 5〜60°Cにて 4時間〜 10日間反応させれ ばよい。
反応終了後、 未反応のタンパク質原料、 菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、 従来の分離法を用いて除去すればよい。 また、 必要に応じて減圧濃縮、 逆浸透法 などにより濃縮を行い、 濃縮物は、 凍結乾燥、 減圧乾燥、 噴霧乾燥等の乾燥処理 により粉末化または顆粒化することもできる。 かくして遊離アミノ酸含有量が高 く、 呈味性の強いタンパク質加水分解物を得ることができる。 実施例
実施例 1 . ァスペルギルス '二ジュランスの pepEゲノム DNAのクロ一ニング 発芽大豆由来のアミノぺプチダーゼ GXの配列をもとに、 ァスペルギルス '二 ジュランスの ESTデータベース（http：〃 ww. genome.ou.edu/fungal. html) を用い て、 ホモロジ一検索したところ、 相同性の高い EST obd03al.flを見出した。
この情報を下に、 ァスペルギルス ·ニジュランス ゲノムライブラリーからァ スペルギルス ·ニジュランス pepEのクロ一ニングを以下のように行なった。
ァスペルギルス '二ジュランス ゲノムライブラリ一は Fungal Genetics Stoc k Center ( Kansas City, USA)より購入した。 本ライブラリ一はァスペルギル ス 'ニジュランスのゲノム DMを制限酵素で切断した後、コスミ ドベクタ一に連結 させ、 ェシエリヒア ·コリに導入したものである。 ライブラリ一のスクリ一ニン グは以下のようにおこなった。 即ち、 コスミ ドぺク夕一を含む大腸菌を鎵型 DNA 源として、 EST obd03al. flの塩基配列に基づいて合成した下記の配列を有するォ リゴヌクレオチドをプライマ一に用いた PCRにより、目的遺伝子が含まれる大腸菌 クローンをスクリーニングした。
( 5， 末端用プライマー） CTC AAA CGG CCA CAT GAC TAC (配列番号 6 )
( 3， 末端用プライマー）
GTC T GT TCA AGT GCA TAG CCT G (配列番号 7 )
<配列表フリ一テキスト >
配列番号 6， 7 ： PCRプライマー
PCR反応は、 94°C 3分間の熱変性後、 94°C 30秒、 52°C 10秒、 72°C 30秒の反応 を 25サイクルで行なった。 その結果、 4個のクローンに目的遺伝子が含まれるこ とが明らかとなった。 これらのクローンよりコスミ ドベクタ一を回収し、 塩基酉己 列を決定した。 本塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配 列を配列番号 2に、 ァミノ酸配列のみを配列番号 3に示す。
本遺伝子をプラスミド PUC19に挿入して得られたプラスミ ドで形質転換されたェ シエリヒア ·コリ JM109株は、プライペートナンバー AJ13856が付され 2001年 3月 1 9日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一、 曰本国茨城県つくば巿東 1— 1— 1中央第 6、 郵便番号 305-8566) に寄託され、 受託番号 FERM P- 18263が付与され、 平成 14年 3月 11日付けで同センタ一において受託番号 FEEM BP- 7949として国際寄 託へ移管されている。 実施例 2 . ァスペルギルス 'ニジュランスの pepE cDNAのクロ一ニング
ァスペルギルス ·ニジュランス A26を YG培地 （酵母エキストラクト 0.5%, グル コース 2.5%, 微量元素 * 0.1%、 pH 6.5) 50mlで 30°C、 48時間振とう培養した (微量元素 * :FeS04'7¾0 0.1%, ZnS04-7H20 0.88%, CuS04-5¾0 0.04%, MnS04- 4¾0 0.015%, Na2B407-10H20 0.01%, (ΝΗ4)6Μο024·4¾0 0.005%)。
菌体を回収し、 液体窒素にて凍結後、 乳鉢を用いて粉砕した。 粉砕物より、 RN easy Plant Mini Kit (QIAGEN社）を用いて全 RNAの調製を行ない、 Micro FAST T rack Kit ( Invitorogen社） を用いて m£NAの調製を行なった。 この m Aから、 cD NA synthesis kit(Promega社）を用い cDNAを合成し、 cDNA PGR Library Kit(TaKa 社）を用いて、 cDNAライブラリーの作製を行った。
cDNAライブラリーを鐯型として、ァスペルギルス 'ニジュランスゲノム DNA配列 よりデザインした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた PC Rおよび 5'- RACEにより、 pepE cDNAのクロ一ニングを行った。
( 5， 末端用プライマー）
CAC CAC CAT GAG TCT AAC TTG G (配列番号 8 )
( 3， 末端用プライマ一）
GTC TGT TCA AGT GCA TAG CCT G (配列番号 9 )
(5' - RACE用 5 ' 末端用 プライマ一）
CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (配列番号 1 0 )
(5， - RACE用 3， 末端用プライマ一）
AAT CGC AGT AAG CCT GCG AG (配列番号 1 1 )
<配列表フリ一テキスト >
配列番号 8〜 1 1 ： PCRプライマー
PCRの反応条件は、 94°C 9分間の熱変性の後、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 3 0秒の反応を 30サイクル行い、 さらに 72°C 5分の反応を行った。その結果、配列番 号 8及び 9のブラィマーを用いた PCRにより約 1800bpの DNA断片が、 配列番号 1 0 及び 1 1のプライマ一を用いた 5 '-RACEにより約 250bpの増幅断片が得られた。こ れらの DNA断片の塩基配列および塩基配列から予想されるァミノ酸配列を配列番 号 2に示す。
上記ァスペルギルス '二ジュランス pepE cDNA断片を、 pBluescriptに揷入して 得られたブラスミドで形質転換されたェシエリヒア'コリ JM109株は、ブラィベ一 トナンバー AJ13857が付され、 2001年 3月 19日に経済産業省産業技術総合研究所生 命工学工業技術研究所 （現、 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託セ ン夕一、 日本国茨城県つくば巿東 1— 1— 1 中央第 6、 郵便番号 305-8566) に 寄託され、 受託番号 FE P-18264が付与され、 平成 14年 3月 1 1日付けで同セン 夕—において受託番号 FERM BP- 7950として国際寄託に移管されている。 実施例 3 . ァスペルギルス 'ォリゼの pepE相同 cDNAのクローニング
( 1 ) ァスペルギルス .ォリゼ cDNAライブラリ一の構築
ァスペルギルス 'ォリゼ RIB40 (ATCC42149) を、 DPY± ±也 50mlで 30°C；、 64時間培養 した。 菌体をろ過により集め、 l gを回収した。 この菌体を直ちに液体窒素で凍 結し、 乳鉢で粉碎した後、 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社） にて全 RNAを得た。 この MAから m A Purification Kit(Pharmacia社）を用いて mRNAを精製し、 cDNA PGR library kit(TaK a社）または 3，- RACE System for Rapid Amplification o f cDNA Ends(GIBC0 BRL)により、 cDNAライブラリ一を構築した。
( 2 ) ァスペルギルス ·ォリゼ cDNAラィブラリ一のスクリ一ニング
実施例 2で得たァスペルギルス '二ジュランスの PepE配列を参考に、 配列番号
1 2及び 1 3で示したォリゴヌクレオチドをプライマーに用いた 5'-RACEおよび 配列番号 1 4及び 1 5を用いた 3'- RACEによって、 ァスペルギルス 'ォリゼの pepE に相同な cDNAのクローニングを行った。
( 5， -RACE用 5'末端プライマー）
CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (配列番号 1 2 )
( 5 ' -RACE用 3， 末端用ブラィマ一）
CAT GGG CCC AAT GGT TCC GC (配列番号 1 3 )
(3'-RACE用 5'末端ブラィマ一） CCA GAT TCG TAA TGA CTC CCG (配列番号 1 4 )
(3'-RACE用 3，末端プライマ一）
CTA CTA CTA CTA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC (配列番号 1 5 )
<配列表フリーテキスト >
配列番 1 2 - 1 5 ： PCRブラィマ一
5， RACEの PGR反応は、 95°Cで 9分熱変性した後、 94°C 30秒、 53°C 30秒、 72°C
1分の反応を 35サイクル行った。 これにより約 1400bpのァスペルギルス 'オリ ゼ pepE断片を得た。 3， RACEの PCR反応は、 95°Cで 9分熱変性した後、 94°C 30秒、 60°C 30#\ 72°C 1分の反応を 35サイクル行った。 これにより約 300bのァスペル ギルス ·ォリゼの pepE相同遺伝子断片を得た。
上記遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、 全長 pepE相同配列を含むことが 明らかとなった。 この塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるァミノ 酸配列を配列番号 4に示す。 また、 アミノ酸配列のみを配列番号 5に示す。
本遺伝子配列をプラスミド pBluescriptに挿入して得られたプラスミドで形質 転換されたェシエリヒア 'コリ DH5ひ株は、 プライベートナンノ 一 AJ13858が付さ れ、 2001年 3月 19日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所 (現、 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一、 日本国茨城県つくば 巿東 1— 1— 1 中央第 6、 郵便番号 305-8566) に寄託され、 受託番号 ΙΈ P-1 8265が付与されて、 平成 14年 3月 11日付けで同セン夕一において受託番号 FERM B P-7951として国際寄託に移管されている。 実施例 4 · ァスペルギルス ·ォリゼにおける pepEの発現
( 1 )形質転換ァスペルギルス ·ォリゼの作製
実施例 3で得たァスペルギルス ·ォリゼの pepE cDNAを pBluescriptの Smalサイ トに連結してプラスミド pBSAopepEを作成した。 本プラスミドから pepE cDNAを Ec oRI、 Xbalで切り出し、 マーカー遺伝子 niaDを含むベクタ一 pUNGl (Lee, B. R. et al. , Applied Microbiology Biotechnology, 44, 425-431 (1995)) のグルコ アミラーゼプロモ一夕一の下流に連結し、 形質転換用のプラスミ ド pNGAPEを作成 した。 本プラスミド DNA ΙΟ zgにより形質転換を行った。
DPY± 地にァスペルギルス.ォリゼ niaD300株の分生子を植菌し、 30°Cで 24時間 振とう培養した。 培養液を滅菌したガーゼでろ過し、 菌体を回収し、 滅菌水で洗 浄した。 この菌体を試験管に入れ、酵素液 20ml (1.0 ャ夕ラ一ゼ（Yatalase, 宝酒 造（株）製） ）を加え、 30°Cで 3時間穏やかに振とうした。顕微鏡でプロトプラス ト化の程度を観察し、 氷中に保存した。
上記酵素反応液をミラクロスでろ過して菌体残さを除去し、 プロトプラストを 含むろ液に等量の緩衝液 A (1.2Mソルビトール、 50mM CaCl2、 35m NaCl、 lOmM T ris-HCk PH7.5) を加えて氷中に置いた。 これを 0 °C、 l, 500rpmで 5分間遠心し たのち、 穏やかに停止させ、 ペレットを 10mlの緩衝液 Aで 2回洗浄し、 1mlの緩衝 液 Aに懸濁した。
100〃1のプロトプラスト懸濁液に 10 zlの DNA溶液 (10 /g)を加え、 30分間氷中 に置いた。 緩衝液 B (60% PEG (ポリエチレングリコール） 6000、 50mM CaCl2、 1 OmM Tris- HC1、 pH7.5) を 250 /1加えて穏やかに混合し、 再び緩衝液 Bを 250〃1カロ えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液 Bを 850 1加えて穏やかに混合し、 20分間 室温で静置した。 その後、 10mlの緩衝液 Aを加えて、 試験管を反転させ、 0°C、 1, 500rpmで 5分間遠心し、 ペレットを 500〃 1の緩衝液 Aに懸濁した。
上記懸濁液をあらかじめ分注し保温しておいた 5mlのトヅプアガー培地に加え、 ヅァペックドックス培地 (1.2Mソルビトール、 0.3%硝酸ナトリウム、 0.2%塩化力 リウム、 0.1%リン酸カリウム、 0.05%硫酸マグネシウム七水和物、 0.002%硫酸 第一鉄七水和物、 2%グルコース、 pH5.5)に重層し、 30°Cで培養した。 生育した 菌体 10株をヅァペックドックス培地に植え継いで、 安定した形質転換体を得た。 ( 2 ) pepEの産生
上述のようにして得られた形質転換体を小麦フスマで培養し、 その抽出液につ いてアミノぺプチダーゼ活性を測定した。
小麦フスマ 20 g、 リン酸カリウム 0.3g、 蒸留水 Wmlをよく攪拌した後、 三角フ ラスコに入れ、 120°Cで 30分間ォートクレーブすることによつて培地を作成した。 胞子を十分形成させたシャーレに滅菌水 8inlを注ぎ、攪拌して胞子懸濁液を調製し、 これを前記培地に散布した。胞子を接種した培地を良く混和し、 30°Cで 3日間培 養した。 上記のようにして作成したフスマ麹に 10倍量の蒸留水を添加してストマ ヅカーで 5分間処理することで、 酵素粗抽出液を得た。
上述のように調製した酵素粗抽出液中のアミノぺプチダーゼ活性を以下のよう に測定した。即ち、 ImM Leu-pNA (50mMリン酸ナトリウムバッファ一、 pH7,5) 0. 75mlに酵素粗抽出液 0.02ml、 lOOmM塩化亜鉛 0.015mlを加え、 37°Cで 10分間反応 させた後、 40% 酢酸を 0.25ml添加して反応を停止した。 反応液の 405nmの吸光度 を測定し、 活性を測定した。 活性は 1分間あたりに 1 molのパラニトロァニリド を生成する酵素活性を 1ユニット （U) とした。対照としてマーカー遺伝子のみ を含むべク夕一 DNAで形質転換して得られた形質転換体についても同様に酵素粗 抽出液を調製し、 前述した方法でアミノぺプチダーゼ活性を測定した。
その結果、 本発明の遺伝子を導入した株において顕著なアミノぺプチダ一ゼ活 性の上昇が認められた （表 2 ) 。従って、 導入したアミノぺプチダーゼ遺伝子が 実際に発現し、 アミノぺプチダーゼが産生されたことが示された。 表 2 . 酵素粗抽出液中のァミノべプチダーゼ活性
Figure imgf000023_0001
実施例 5 . PepEの特性角军析
( 1 ) pepEの精製
小麦フスマ培地 20gを 300mlフラスコに入れ、 120°C：、 20分間ォ一トクレ一ブするこ とによって培地を作製した。
実施例 4で作成した PepE高発現形質転 の胞子懸濁液を調製し、 これを前記 培地に接種した。胞子を接種した培地をよく混和し、 30°Cで 5日間培養した。途中 48時間後に培地を撹拌して手入れを行った。
上記のようにして作製したフスマ麹を 10倍量（w/w)の 20mMリン酸カリゥム緩 衝液 (pH7.4)，lmM EDTA3 lm PMSF (フエニルメタンスルフォニルフルオリド）に浸 漬し、 4°Cで 16時間静置後、 ガーゼ濾過及び遠心分離 (4°C、 10分間、 7, 500rpm)に より得られた上清を酵素粗抽出液とした。
この酵素粗抽出液に硫酸ァンモニゥムを添加し、 40¾ - 60硫安沈殿画分を取得 した。この沈殿を 20mMリン酸カリゥム緩衝液（pH7.4)に溶解した。これを孔径 0. 45 111のフィル夕一で濾過した。 あらかじめ、 20mMリン酸カリゥム緩衝液 (ρΗ7· 4)、 150m NaClで平衡化した脱塩用カラム （アマシャムフアルマシア製 HiTrap Desalting (25ml) ) に前述の濾液を供し、 同緩衝液で溶出した。 得られた活性 画分を限外濾過することにより、 濃縮した。
次に、 あらかじめ、 20mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7.4)で平衡化した陰イオン 交換カラム（アマシャムフアルマシア製 HiTrap Q - sepharose HP (25ml))に、上 記で得た試料を吸着させ、 カラム体積の 3倍量の同緩衝液で洗浄した。洗浄後、緩 衝液の NaCl濃度を 0Mから 1 Mにカラム体積の 20倍量で直線的に増加させて溶出し た。 溶出液中に回収された活性画分を、 限外濾過にて濃縮した。
得られた試料を、 HiLoad 26/60 Superdex 200pg (アマシャムフアルマシア製） を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。あらかじめ、 20mMリン酸 力リゥム緩衝液 (pH7.4)、 150mM NaClで平衡化したこのカラムに試料を供し、同緩 衝液で溶出して活性画分を回収した。 以上の操作により、 精製 PepEを得た。
( 2 ) PepEの活性測定
本酵素液のアミノぺプチダ一ゼ活性の測定は以下のように行った。即ち、 基質 液 (ImM Leu-pNA, 50mM リン酸ナトリゥムバッファ一 （pH7.5) ，2mM塩化コバル ト） 0.73mlに酵素粗抽出液 0.02mlを加え、 37°Cで 10分間反応させた後、 40%酢酸 を 0.25ml添加して反応を停止した。 本反応液の 405nmの吸光値を測定し、 活性値 を算出した。 なお、 活性は 1分間あたりに l〃molのパラ二トロア二リドを生成す る酵素活性を 1ユニットとした。
以下に本酵素の酵素学的諸性質を示す。
( i ) 基質特異性
前記活性測定法において、 Leu-pNAの代わりに X- pNAを用い、各種 X- pNAの分解活 性を測定した。 Leu- pNAの分解活性を 100とした時の相対活性を下表 （表 3 ) に示 す。 本酵素は N末端に Leuを含むぺプチドを効率よく分解することがわかった。 表 3 . PepEの基質特異性
Figure imgf000025_0001
(ii) 至適温度
前記活性測定法において、 各種温度で LAP活性を測定した。 37°Cでの活性値を 100 とした時の、 相対活性を図 1に示す。
(iii) 反応液中食塩濃度の影響
前記活性測定法において、 NaClを各濃度添加した際の LAP活性を測定した。 NaCl 無添加区の活性値を 100とした時の、相対活性を図 2に示す。本酵素は高濃度の食 塩下でも、 十分にその活性を保持していることがわかった。
(iv) 至適 pH
前記活性測定法において、 50mM リン酸ナトリゥムノ ツファ一（pH7.5)の代わ りに、終濃度 50mMとなるよう、各種 pH緩衝液を反応液に加えた。 リン酸カリウム 緩衝液 (PH7.5)中における LAP活性を 100とした。 各 pHにおける活性を図 3に示す。
(V) pH安定性
精製酵素を 50mM 各種 pH緩衝液中、 0°Cで 24時間保存した後、 前記活性測定方 法（pH7. 5)で LAP活性を測定した。 pH7. 5リン酸緩衝液で保存した際の活性値を 100とした時の相対活性値を表 4に示す。 表 4 . PpEの pH安定性
Figure imgf000026_0001
(vi) 食塩溶液中での安定性
精製酵素を 0— 4M NaCl, 20mMリン酸緩衝液 （pH7.5) 中、 0°Cで 24時間保存した後、 保存塩濃度と同じ塩濃度の反応液中での活性を測定した。 その結果を表 5に示す c 表 5 . PepEの食塩溶液中での安定性
Figure imgf000026_0002
(vii) 金属イオンの影響
前記活性測定法において、塩化コバルトの代わりに各種 2価金属塩を用い、各種 X - pNAの分解活性を測定した。 塩化コバルトを加えた際の Leu-pNAの分解活性を 10 0とした時の相対活性を表 6に示す。 表 6 . 金属イオンが PepE活性に与える影響
Figure imgf000027_0001
本発明により、 遊離アミノ酸含有量が高く、 呈味の強いタンパク質加水分解物を 得る手段が提供される。 特に、 多量の食塩を含む醤油醸造下でペプチドを効率よ く分解するアミノぺプチダ一ゼおよびこれをコードする核酸分子が提供され、 こ れによって醤油または夕ンパク質加水分解物の呈味性を更に高めることが可能と なる。
本発明の核酸分子を発現可能な形態で導入された宿主は、 本発明の夕ンパク質 を産生するために利用することが可能となる。

Claims

請求の範囲 . 下記 （A) 〜 （D ) のいずれかに示すタンパク質：
(A)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1〜519で表されるアミノ酸配列を有 するタンパク質、
(B )配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1〜510で表されるアミノ酸配列を有 するタンパク質、
( C )配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1 ~519で表されるァミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列からなり、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反 応を触媒する活性を有するタンパク質、
( D ) 配列表の配列番号 4のァミノ酸番号 1〜510で表されるァミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列からなり、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反 応を触媒する活性を有するタンパク質。
. 下記 （A) 〜 （D ) のいずれかに示すタンパク質をコードする核酸分子：
( A )配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1 ~519で表されるァミノ酸配列を有 するタンパク質、
( B )配列表の配列番号 4のァミノ酸番号 1 ~510で表されるァミノ酸配列を有 するタンパク質、
( C )配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1 ~519で表されるァミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列からなり、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反 応を触媒する活性を有するタンパク質、
(D )配列表の配列番号 4のァミノ酸番号 1 ~510で表されるァミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列からなり、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反 応を触媒する活性を有するタンパク質、
3 . 下記（a )〜（d )のいずれかに示す DNAである請求項 2記載の核酸分子：
( a ) 配列表の配列番号 2に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 72〜1628からな る塩基配列を含む DNA、
( b ) 配列表の配列番号 4に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 73〜1602からな る塩基配列を含む DNA、
( c )前記（ a )の DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、 ペプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパ ク質をコードする DNA、
( d )前記 ( b )の DMとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 ぺプチドの N-末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパ ク質をコードする DNA。
4 . 配列番号 2又は配列番号 4に示す塩基配列を有する請求項 3記載の核酸分 子。
5 . 請求項 2記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
6 . 請求項 2記載の核酸分子が発現可能な形態で導入された形質転換微生物宿 主。
7 . 糸状菌又は酵母又はェシェリヒア属細菌である請求項 6記載の形質転換微 生物宿主。
8 . 請求項 7記載の形質転換微生物宿主を培養し、 前記形質転換微生物宿主に 導入された核酸分子を発現させ、 産生されたタンパク質を回収することを特徴 とするアミノぺプチダーゼの製造法。
9 . 以下の 1 ) 〜8 ) の性質を有するアミノぺプチダ一ゼ 1 )ロイシン、メチォニンを N末端に含むペプチド又はタンパク質を分解し てロイシンあるいはメチォニンを遊離する；
2 ) 至適 pHが 7.0〜7.5である、
3 )至適温度が 37〜45°Cである；
4 )食塩非存在下での活性を 100%としたとき、 3Mの食塩濃度下でも 80%以 上の残存活性を示す；
5 ) 0°C；、食塩非存在下、 24時間保存の条件での活性を 100%としたとき、 0°C、 3M食塩存在下、 24時間保存の条件で 80%以上の残存活性を示す；
6 ) pH7.5, 0°C、 24時間保存の条件での活性を 100%としたとき、 pH5.8 〜9.5の範囲で 0°C、 24時間保存の条件で 60%以上の残存活性を示す；
7 )未変性ポリアクリルアミドゲル上で 550H)の分子量を示し、変性ポリア クリルアミドゲル上で 22、 33kDの分子量を示す；
8 )活†生化にコノ レトイオン、 または亜ま Sイオンを必要とする。
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