WO2002057443A1 - Process for producing zaq ligand - Google Patents

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WO2002057443A1
WO2002057443A1 PCT/JP2002/000378 JP0200378W WO02057443A1 WO 2002057443 A1 WO2002057443 A1 WO 2002057443A1 JP 0200378 W JP0200378 W JP 0200378W WO 02057443 A1 WO02057443 A1 WO 02057443A1
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WO
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leu
cys
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amino acid
gly
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/000378
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French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Takao Yamada
Masato Suenaga
Osamu Nishimura
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries, Ltd. filed Critical Takeda Chemical Industries, Ltd.
Publication of WO2002057443A1 publication Critical patent/WO2002057443A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention has an ability to bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof. Or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as “ZAQ ligand”.
  • the “peptide capable of binding to the salt or activating the protein or the salt thereof” is sometimes simply referred to as “ZAQ ligand.”) Is expressed in prokaryotic cells using genetic engineering technology.
  • the present invention relates to a method for producing a pharmacologically active ZAQ ligand by performing a refolding operation on the extracted ZAQ ligand. Background art
  • Proteins or peptides containing a large number of cysteine residues in the molecule and having disulfide bonds can be converted into Chinese hamster cells (eg, CHO), monkey cells (eg, COS-7), etc. by known genetic engineering techniques. Expression of a nuclear cell as a host yields a pharmacologically active protein or peptide.
  • the method of expressing the protein or peptide in eukaryotic cells generally has a lower expression level of the protein or peptide of interest than the method of expressing the protein or peptide in prokaryotic cells, and furthermore, the method for eukaryotic cells.
  • the medium is expensive and therefore not suitable for industrial scale production of the protein or peptide.
  • the ZAQ ligand has ligand activity for the orphan receptor ZAQ receptor (a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof). Digestion with peptides It is a useful peptide that has preventive and therapeutic effects on organ diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • the peptide can be produced by using known eukaryotic cells by a known genetic engineering technique.
  • pharmacologically active ZAQ ligands can be obtained by expressing ZAQ ligands in eukaryotic cells such as Chinese hamster cells (eg, CHO) and monkey cells (eg, COS-7).
  • eukaryotic cells such as Chinese hamster cells (eg, CHO) and monkey cells (eg, COS-7).
  • Chinese hamster cells eg, CHO
  • monkey cells eg, COS-7
  • the medium is expensive, and the expression level of the protein is low, so that production on an industrial scale is not suitable.
  • the present invention relates to a method for producing an active ZAQ ligand, comprising refolding a ZAQ ligand expressed in a prokaryotic host by genetic engineering in a redox buffer.
  • An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A peptide or a salt thereof capable of binding to, or activating a protein or a salt thereof containing, a nucleic acid sequence or a salt thereof is genetically engineered and expressed in a prokaryotic cell host; Binds to a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the protein or a salt thereof, wherein For producing an active peptide or a salt thereof having the ability to activate
  • (6) binds to, or binds to, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof;
  • the peptide capable of activating the salt thereof or the salt thereof is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 or a salt thereof,
  • a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering. Refolding in a redox buffer, a method for producing the active form of the peptide or a salt thereof,
  • a peptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically engineered in a prokaryotic host, and is expressed in a redox buffer.
  • a peptide having the ability to activate a salt thereof or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host, and the cells are solubilized and then refolded in a redox buffer.
  • a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host, Is solubilized, and then refolded in a redox buffer, according to the above (7),
  • the salt is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, the cells are solubilized with a denaturing agent, and then a redox buffer (pH 7 to 9) further containing an amino acid having no mercapto group is used as a denaturing agent. Is diluted to an inactive concentration, the method according to the above (1),
  • a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by the sequence number: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host.
  • the cells are solubilized with a denaturing agent, and the denaturing agent is diluted to an inactive concentration with a redox buffer of ⁇ 7 to 9 further containing an amino acid having no mercapto group.
  • a redox buffer of ⁇ 7 to 9 further containing an amino acid having no mercapto group.
  • a prokaryotic host which has genetically expressed a peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30,
  • the present invention relates to a method for producing an active peptide or a salt thereof, which is reacted with a buffer solution containing an amino acid having no mercapto group, reduced daltathione and oxidized daltathione, which is soluble with a denaturing agent.
  • the method of the present invention is a method for producing an active form of a ZAQ ligand, comprising expressing a ZAQ ligand by genetic engineering in a prokaryotic host and refolding it in a redox buffer.
  • the ZAQ ligand is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, and the ZAQ ligand inactivated by solubilizing the cell is refolded in a redox buffer to form an active form of the ZAQ ligand.
  • Produce ZAQ ligand comprising expressing a ZAQ ligand by genetic engineering in a prokaryotic host and refolding it in a redox buffer.
  • the ZAQ ligand used in the present invention includes a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as “ZAQ receptor”). Or a salt thereof, or a peptide or a salt thereof capable of activating the ZAQ receptor.
  • the ZAQ ligand comprises (1) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, and having an ability to bind to the ZAQ receptor or to activate the ZAQ receptor.
  • the ability of a ZAQ ligand to bind to or activate a ZAQ receptor can be determined by a method for measuring a known ligand 'receptor binding activity or a method analogous thereto, or a known cell stimulating activity (intracellular Ca ion concentration). Change (eg, the method described in Example 1-6 below), cAMP synthesis inhibitory activity, etc.) or a method analogous thereto.
  • the ZAQ ligand produced by the method of the present invention is a peptide capable of binding to the ZAQ receptor or a peptide capable of activating the ZAQ receptor (hereinafter abbreviated as “active peptide”). Can be) or its salts. Specifically, (1) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by the active form SEQ ID NO: 21 or a salt thereof, (2) an active form SEQ ID NO: 30 Or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by
  • the ZAQ receptor (G protein-coupled receptor protein) is a receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (WO 01/16309).
  • ZAQ ligands and ZAQ receptors include, for example, human and non-human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, sheep, monkeys, monkeys, etc.), and all cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells) 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B Cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, Hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc., or blood cells (eg, MEL, Ml, CTLL
  • Bone marrow adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, testicle, testis, ovary, placenta, uterus It may be a peptide / protein derived from bones, joints, skeletal muscle, etc. (particularly, brain or various parts of the brain), or may be a synthetic peptide'synthetic protein.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 includes, for example, about 60 ° / 0 or more (preferably about 70% or more, Further preferred are amino acid sequences having a homology of about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21; Peptides having substantially the same properties as the peptide containing the amino acid sequence represented by 21 are preferred.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is, for example, about 60% or more (preferably An amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. .
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19; Peptides having substantially the same properties as peptides containing the amino acid sequence represented by 19 are preferred.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 is, for example, about 60 ° / 0 or more (preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30).
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30; Peptides having substantially the same properties as peptides containing the amino acid sequence represented by No. 30 are preferred.
  • ZAQ ligand examples include a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 30 And peptides containing an amino acid sequence.
  • Substantially the same activity includes, for example, a binding activity to a ZAQ receptor, a signal transduction activity via a ZAQ receptor, and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the binding activity to the ZAQ receptor and the signal transduction via the ZAQ receptor are equivalent (for example, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as molecular weight may be different.
  • the activity can be measured by a known method or a method analogous thereto (specifically, a method described in Example 11 to be described later or a method analogous thereto).
  • ZAQ ligand examples include: (1) one or two or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21; Amino acid sequence in which amino acid has been deleted, (2) 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 40 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21; More preferably about 1 to 30 amino acids, particularly preferably about 1 to 20 amino acids), and 3 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21.
  • amino acid sequence in which about 30 (more preferably about 1 to 20) amino acids have been substituted with another amino acid, or a peptide containing an amino acid sequence obtained by combining them, or the like can also be used.
  • amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30 and more preferably about 1 to 20) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 have been deleted (2) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 30 (preferably about 1 to 40, more preferably about 1 to 30, particularly preferably 1 to 20) Amino acid sequence to which an amino acid sequence of about 30 or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (About one amino acid) are substituted with another amino acid, or a peptide containing an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the ZAQ receptor include, for example, about 90% or more, preferably about 95%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Above, more preferably, an amino acid sequence having about 98% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; A protein having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by No. 1 is preferred.
  • Examples of the protein (ZAQ receptor) having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Preferred are proteins which contain the same amino acid sequence and have substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. You may.
  • the activities such as ligand binding activity and signal information transduction can be measured according to known methods.
  • the ZAQ receptor includes: (1) one or more or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several ( Amino acid sequence in which 1 or 2 amino acids have been deleted, 2) 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 1) An amino acid sequence obtained by adding about 0 amino acids, more preferably several (1 or 2) amino acids; and 3 one or more (preferably, one or more) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, still more preferably several (one or two) amino acids substituted with another amino acid, or amino acids obtained by combining them.
  • peptides and proteins have N-terminus (amino terminus) at the left end and C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation.
  • the peptides and proteins of the present invention including ZAQ ligands and ZAQ receptors have carboxyl groups (one COOH), carboxylate (—COO-1), amides (one CONH 2 ) or esters (one COOR ).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , C such as a one-naphthyl 6 - 12 Ariru group, e.g., benzyl, full Eniru d_ 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc. ⁇ - naphthyl one C ⁇ 2 Flip such as an alkyl group 7 _ 14 Ararukiru group such as phenethyl A piva mouth yloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
  • the peptides and proteins in the present specification have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the peptides and proteins in the present specification. It is.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the peptides and proteins in this specification the peptides • proteins described above, Amino group of the N-terminal amino acid protecting groups (e.g., formyl group, etc.
  • Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • coercive Mamorumoto e.g., formyl group, C 2 such Asechiru group - C, such as 6 Arukanoiru groups - those are protected by like 6 Ashiru group
  • complex peptides such as so-called glycopeptides and glycoproteins to which sugar chains are bonded, and complex proteins.
  • ZAQ ligand examples include, for example, a peptide derived from human (more preferably from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 Is raised.
  • ZAQ receptor examples include, for example, human-derived (more preferably, human brain-derived) protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and salts and hydrates are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • the prokaryotic cells used in the present invention include Escherichia coli and other Escherichia bacteria, Bacillus subtilis and other Bacillus bacteria, and Serratia marcescens and other Serratia species. Among them, Escherichia coli and the like are preferable. Transformation and culture of these prokaryotic cells can be carried out by a conventional method (such as the method described in JP-A-3-204879) or a method analogous thereto, in addition to the following methods. it can.
  • the DNA encoding the ZAQ ligand may be any DNA as long as it contains the DNA encoding the ZAQ ligand described above. Also, It may be any of nome DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cDNA derived from cells and tissues, the above-mentioned cDNA library derived from cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of batteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cells.
  • the DNA encoding the ZAQ ligand includes, for example, (1) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 It contains DNA that hybridizes under high stringent conditions and has substantially the same activity as a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (eg, binding activity to ZAQ receptor, ZAQ receptor (2) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 Which has DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA that binds to the DNA and has substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (eg, ZAQ (3) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, or DNA represented by SEQ ID NO: 31 Containing DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the base sequence, and having substantially the same activity as a peptide
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 31 under stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 20, DNA containing a nucleotide sequence having about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 31 Are used.
  • DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 specifically, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, Or a DNA containing the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 and a DNA that hybridizes under high stringency conditions, and is substantially the same as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (Eg, binding activity to ZAQ receptor, signal transduction via ZAQ receptor, etc.), and DNA encoding a peptide.
  • DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 specifically, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 Or a DNA comprising the DNA having the base sequence S sequence represented by SEQ ID NO: 39 and DNA hybridizing under high stringency conditions, and a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • DNA encoding a peptide having substantially the same activity eg, binding activity to ZAQ receptor, signal transduction via ZAQ receptor, etc.
  • DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 is mentioned.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by the sequence number: 22 or SEQ ID NO: 38;
  • DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 includes SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 39.
  • the DNA encoding the ZAQ ligand may be (1) chemically synthesized by a known method or a method analogous thereto, or (2) DNA of the DNA encoding the ZAQ ligand.
  • the DNA may be amplified and obtained by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) with reference to the sequence and the like.
  • Examples of plasmids for introducing DNA encoding the ZAQ ligand include, for example, PBR 322 derived from Escherichia coli (Gene, Vol. 2, p. 95 (1977)) and pBR 325 [Gene, Vol. 4, p. 121 (1978) )], PUC12 [Gene, 19, 259 (1982)], pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], pUB1 10 derived from Bacillus subtilis [Biochemical biophysical ⁇ Resate Communications (Biochemical ana Biophysical Research Communications), Vol. 112, p. 678 (1983)], etc., as long as they can be replicated and propagated in the host. , Can be used.
  • phage vectors incorporating DNA include: Lgt11 (Young, R. and Davis, R.), Proceedings of the National 'Academy of Ob', Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), Vol. 80, p. 1194 (1983)], etc. Any substance that can proliferate can be used.
  • Escherichia bacteria examples include Escherichia coli K12DH1 [Proceding 'ob the national' academy ' ob science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA) 60 vol. JM103 [Nucleic Acids Research], Vol. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology], JA221 [Journal of Molecular Biology] ), 120, 517 (1978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology 1, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], MM 294 [Nature, 217, 111 (1968)], and the like.
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, Vol. 24, p. 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry. 95, 87 (1984)].
  • Methods for transforming a host with a plasmid include, for example, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Co.;, 'Spring', "Cold Spring”. Harbor Laboratory), p. 249 (1982), calcium chloride method or calcium chloride Z rubidium chloride method.
  • a phage 'vector When a phage 'vector is used, it can be introduced into, for example, grown Escherichia coli using an in vitro packaging method.
  • the cloned ZAQ ligand co one de to DNA is plasmid if necessary, for example, p BR 322, pUC 12, pUC 13, pUC 18, UC 1 9 N pUC 1 18, pUC 1 1 9 Can be used after subcloning.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the ZAQ ligand obtained in this manner was used, for example, by the Maxam-Gilbert method (Maxam, AM and Gilbert, W., Proceedings of the National Institute of Technology). Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74 560 (1977)] or the dideoxy method (Messing, J. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)). The comparison of shows that DNA encoding the ZAQ ligand is present.
  • the DNA encoding the ZAQ ligand cloned as described above can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme exonuclease, if desired.
  • a region to be expressed is cut out from the DNA encoding the cloned ZAQ ligand, and ligated downstream of a promoter in a vehicle (vector) suitable for expression to obtain an expression type vector.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • a promoter is connected upstream thereof.
  • Examples of the vector include the above-described plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), and Bacillus subtilis-derived plasmid (eg, pUB110, TP5, pC194).
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for DNA expression.
  • the T7 promoter, trp promoter, lac promoter, recA promoter, promoter, 1 pp promoter, etc. are used when the host used for the transformation is Escherichia, and SP is used when the host is Bacillus. Ol promoter, SPO2 promoter, pen P promoter and the like are preferable. In particular, it is preferable that the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia and the promoter is a T7 promoter, a trp promoter, or a LPL promoter.
  • a prokaryotic cell transformant is produced. Transformation of the above-mentioned Escherichia bacterium can be performed, for example, by the following procedure: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972). And Gene, vol. 17, p. 107 (1982).
  • a prokaryotic cell transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the ZAQ ligand is obtained.
  • the genus Escherichia is used as a host and the T7 promoter is used as a promoter
  • a ⁇ 7 lysozyme expression plasmid is used in addition to an expression vector containing DNA encoding ZAQ ligand to improve the expression efficiency of the T7 promoter. May be.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • examples of the organic substance and the inorganic substance include calcium salt, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins and growth promoting factors may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal 'Ob'Experiment'in'Molecuffe 1 —Journal of Experiments in Molecular Geometry netics), pp. 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972], LB medium and the like.
  • a drug such as isopropynole j3-D-thiogalatatopyranoside (IPTG) or 3 / 3-indolyl ataryl acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
  • cultivation is usually at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours. If necessary, ventilation and agitation can be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the ZAQ ligand forms an insoluble component (inclusion body) in the host prokaryotic cells
  • collect cells by centrifugation or other methods, disrupt the cells, and allow the inclusion body to be denatured using a denaturant.
  • the ZAQ ligand can be extracted.
  • Cell framing can be carried out in a conventional manner, for example by sonication. It is preferable to use a suitable buffer (for example, a phosphate buffer or the like) adjusted to a neutral pH value (pH 6.5 to 7.5) as a suspension medium. At this time, EDTA may be added to promote cell disruption.
  • a suitable buffer for example, a phosphate buffer or the like
  • EDTA may be added to promote cell disruption.
  • the insoluble components are separated by centrifugation or filtration by any method.
  • washing with, for example, water or a phosphate buffer is preferable. In some cases, washing with about 4 M urea may be used.
  • a denaturing agent for solubilizing the obtained precipitate (pellet) using a denaturing agent a known denaturing agent, in particular, guanidine or urea can be used.
  • the denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol Z liter, preferably about 6 to 7 mol Z liter for guanidine, and 5 to 9 mol / liter for urea, preferably about 8 mol / l.
  • Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
  • the cells are lysed with a denaturing agent after culturing, harvested by centrifugation, etc.
  • the ZAQ ligand can be extracted by crushing and solubilizing with a mutagenic agent.
  • denaturing agents used for solubilizing the collected cells include guanidine and urea.
  • the denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is usually 4 to 8 mol / l, preferably about 6 to 7 mol / l for guanidine.
  • Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
  • Cell disruption can be performed in a conventional manner, for example, by sonication or by French press. Wear.
  • a denaturant used for solubilization of the disrupted cells a known denaturant may be used, and guanidine or urea is preferably used.
  • the denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol Z liter for guanidine, preferably about 6 to 7 mol Z liter, and 5 to 9 mol / liter for urea, preferably. Is about 8 mol / l.
  • Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
  • the inclusion body is solubilized as described above, the cells are directly solubilized with a denaturing agent, or the cells are crushed and then solubilized with a denaturing agent. If necessary, subject the supernatant to a purification step, and then refold (activate and regenerate) the ZAQ ligand.
  • Reforno-reding is performed by adding a redox buffer to the purified ZAQ ligand or diluting the supernatant containing the ZAQ ligand with the redox buffer.
  • the redox buffer examples include a buffer containing oxidized daltathione (GSSG) and reduced daltathione (GSH), a buffer containing cysteine and cystine, and a buffer containing cysteamine and cystamine.
  • GSSG oxidized daltathione
  • GSH reduced daltathione
  • the buffer examples include a Tris buffer, a phosphate buffer, an acetate buffer, a citrate buffer and the like, and among them, a Tris buffer and the like are preferable.
  • the concentrations of the oxidizing agent (oxidized substance) and the reducing agent (reduced substance) in the redox buffer are, for example, 0.01 to 100 mmol Z liter and 0.01 to: L 00 mmol Z liter, respectively. . More specifically, when using 0330 chips & 311, the concentration of GS SG in the redox buffer is 0.01 to 100 millimoles, preferably 0.1 to 10 millimoles / liter, and preferably 0.1 to 10 millimoles / liter. 1-1.0 millimoles are used, the concentration of GSH is 0.01-: 100 millimoles Z liter, preferably 0.1-10 millimoles Z liter, preferably
  • an amino acid having no mercapto group is further contained in the redox buffer.
  • Supernatant containing AQ ligand When diluting with a redox buffer, it is preferable to dilute the denaturant to a non-active concentration at a neutral pH suitable for activation.
  • the concentration of guanidine in the diluent is 0 to 2.0 monoliters, preferably about 1 mol / liter or less.
  • urea is used as a denaturant, the diluent is used. It is desirable to dilute the concentration of urea in the solution to 0 to 4.0 mol / l, preferably to about 2 mol liter or less.
  • any amino acid having no mercapto group may be used as long as the object of the present invention is achieved, and arginine, aspartic acid, palin, lysine, and alanine And citrulline. Arginine and the like are preferred in terms of yield in refolding of ZAQ ligands.
  • the concentration of the amino acid added to the redox buffer is 0.1 to 1.0 mol / liter, preferably 0.2 to 0.8 mol / liter.
  • the temperature for the above reforming is 0 to 30 ° C, preferably 4 to 15 ° C.
  • the pH is 7-9, preferably ⁇ 7.5-8.5.
  • the time required for the refolding is usually 0.5 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 1 to 2 days.
  • solubilization and before refolding known and commonly used purification steps such as extraction, salting-out, dialysis, distribution, crystallization, recrystallization, gel filtration, and chromatography can be introduced.
  • it can be purified, for example, by applying to Sephadex G-25 (Amersham Pharmacy Biotech) in a 0.1 mol / liter phosphate buffer solution. Separation of the denaturing agent can also be performed by dialyzing against a 0.1 mol Z liter phosphate buffer in some cases.
  • the purification step can also be performed following refolding.
  • such purification includes, for example, extraction, salting-out, dialysis, partitioning, crystallization, recrystallization, gel filtration, chromatography, and the like.
  • Preferred examples include dialysis and, for example, SP-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech)).
  • CM-5PW Tosoh Corporation
  • DEAE-5PW Tosoh Corporation
  • C4P-50 Showa Denko Corporation
  • the ZAQ ligand (active ZAQ ligand) obtained in the present invention has the same action as the ZAQ ligand obtained from eukaryotic cells, and is used in the same manner as the method of using the ZAQ ligand obtained from eukaryotic cells. Can be used.
  • ZAQ ligand has an activity of controlling intestinal contraction and the like, and when DNA encoding ZAQ ligand is deficient or expression level is abnormally decreased, for example, gastrointestinal diseases ( For example, various diseases such as enteritis, diarrhea, constipation, and malabsorption syndrome occur.
  • gastrointestinal diseases For example, various diseases such as enteritis, diarrhea, constipation, and malabsorption syndrome occur.
  • the ZAQ ligand obtained by the production method of the present invention is useful for treating various diseases such as digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • digestive diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • ZAQ ligand is administered to the patient.
  • the role of the ZAQ ligand in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the ZAQ ligand When used as a therapeutic or prophylactic agent as described above, it should be purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more. Is preferred.
  • ZAQ ligands can be used, for example, as orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally in sugar coating, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections such as solutions or suspensions. For example, mixing ZAQ ligand with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in the unit dosage form generally required for the practice of the formulation It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives examples include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and gum arabic; Excipients such as sesame, leavening agents such as corn starch, gelatin, alginic acid, etc., lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, peppermint, cocoa oil or tea. Flavoring agents are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing pudose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • auxiliaries for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) Is also good.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents for example, Shiridani benzalkonium, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.). ) Can be administered.
  • mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the ZAQ ligand varies depending on the target disease, the administration target, the administration route, and the like.
  • the ZAQ ligand when orally administered for the purpose of treating digestive diseases, it is generally required for an adult (60 kg).
  • the single dose of the ZAQ ligand peptide varies depending on the administration target, target disease, etc.
  • ZAQ ligand is administered to adults ( Weighing 60 kg)
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • optical isomer for an amino acid the L-isomer is indicated unless otherwise specified.
  • DNA complementary deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • H is (H): histidine
  • a s x A s + A s n
  • G 1x G 1 u + G 1 n
  • sequence numbers in the rooster s column table in the present specification indicate the following sequences.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the ZAQ receptor is shown (ZAQC).
  • [SEQ ID NO: 8] 7 shows the nucleotide sequence of primer ZF2 used in Reference Example 3.
  • [SEQ ID NO: 34] 3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 3 used in Example 2-1.
  • the nucleotide sequence of a synthetic DNA encoding the human ZAQ ligand represented by SEQ ID NO: 21 is shown.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the human BV8 precursor peptide is shown.
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ CR2.1—ZAQC obtained in Reference Example 1 described below was obtained from Tsukuba, Ibaraki, Japan, on August 23, 1999 by Riki et al. Higashi 1-chome No. 1 1 Chuo No.
  • the transformant Escherichia coli TOP10 / pHMITA obtained in Reference Example 3 described below has been used since July 13, 2000, 1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) Patent, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited with the Depositary No. FERM BP-7219 at the Organisms Depositary Center and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16440 since May 26, 2000.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli TOP 10 / pHMI TG obtained in Reference Example 3 described below has been used since July 13, 2000, 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) Patent, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited with the Depositary No. FERM BP-7220 under the deposit number IFO 16441 on May 26, 2000, at the Institute of Fermentation (IFO).
  • Escherichia coli MM 2 94 (DE 3) Zp TC h 1 ZAQ obtained in Example 1 described below was obtained from Tsukuba East 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan from April 27, 2001.
  • No. 1 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-856 6) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NI BH)) It has been deposited with the Institute of Fermentation Research (IFO) under the deposit number F ERM BP-7571 as the deposit number IFO 16527 since January 16, 2001 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • IFO Institute of Fermentation Research
  • Escherichia coli MM 294 (DE 3) / pTCh 2 ZAQ obtained in Example 2 described below was obtained from April 27, 2001 at 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited with the Institute for Fermentation of Japan (IFO) under the deposit number FERM BP-7572 as the deposit number IFO 16587 on March 15, 2001 as the deposit number IFO 16587.
  • IFO Institute for Fermentation of Japan
  • the human pituitary gland cDNA (CLONTECH) was designated as type II, and two primers, primer 1 (5, one GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G-3 '; SEQ ID NO: 4) and primer 2 (5 PGR reaction was performed using '-ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC-3;; SEQ ID NO: 5).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was 1/10 of the above cDNA as type III, 1/50 amount of Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH), primer 1 and primer 2 were each 0.2 ⁇ l, dNTPs 200
  • the attached buffer was added to ⁇ and the enzyme to make a liquid volume of 25 ⁇ l.
  • the PCR reaction is performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by three cycles of 94 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 100 seconds, and three cycles of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 100 seconds.
  • the cycle of 94 ° C for 20 seconds, 64 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 100 seconds was repeated 38 times, and the extension reaction was finally performed at 68 ° C for 7 minutes.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the procedure of a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the obtained solution I to solution IV were freeze-dried using a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • a TSKgel ODS-80Ts reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi Co., Ltd., 4.6 mm x 25 cm) was applied at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min to solution A (0.1% trifluoroacetic acid / Distilled water) Volume 81.7% / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) 8.3% volume was flowed and equilibrated.
  • the freeze-dried product of Solution I to Solution IV obtained in (2-3) above was dissolved in 4 ml of 1 M acetic acid, respectively, and subjected to chromatography.
  • the volume of solution A was increased to 67% / the volume of solution B to 33% over 1 minute at a flow rate of 1 ml / min, and then the solution A over 40 minutes.
  • Solution B concentration was increased in a linear gradient from 33% volume of 33% ZB solution to 100% of solution A volume of 0% ZB solution.
  • the eluate was fractionated by assigning a fraction number to each 1 ml, and 2 ⁇ l of each fraction was mixed with 150 ⁇ of 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) / distilled water and freeze-dried. The dried product was used as a sample for assay for measuring the activity of increasing the intracellular Ca ion concentration described in (2-5) below.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the ZAQ stable expression cell line was prepared as follows. That is, one clone of DH5a / pCR2.1-ZAQC obtained in Reference Example 1 was shake-cultured in an LB medium containing ampicillin to obtain a plasmid pCR2.1-ZAQC. This was treated with the restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert coding for ZAQC. Similarly, pAKK0_l.11H treated with restriction enzymes Sal I and Spe I and the insert were ligated using a Ligation Express Kit (CL ONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA)) and electroporated into E. coli DH10B. Introduced by law. The structure of the plasmid contained in the obtained clone was confirmed by restriction enzyme treatment and sequence analysis, and a correctly constructed plasmid was used as a plasmid pAK-ZAQC for CH0 cell expression.
  • This plasmid pAK- ZAQC obtained by introducing transformed Te Rere for CH0 / dhfr _ cells (American Type Culture Collect ion) ⁇ This CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). First, add 120 ⁇ of Buffer A (attached to CellPhect Transfection Kit) to plasmid DNA 4 dissolved in distilled water 1201, stir and let stand for 10 minutes, then Buffer B (attached to CellPhect Transfection Kit) 240 ⁇ l was added, and the mixture was vigorously stirred to form a DNA-calcium phosphate complex containing the DNA.
  • Buffer A attached to CellPhect Transfection Kit
  • Buffer B attached to CellPhect Transfection Kit
  • the cells were dispersed by trypsin treatment, collected from a Petri dish, and 2 ⁇ 10 4 cells were inoculated in a 6-well plate, dialyzed 10% fetal bovine serum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM non-essential amino acid solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 100 units / ml Penicillin ⁇ 100 ⁇ g / m 1 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) medium containing Streptomycin (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° C, 5% carbon dioxide Culture was started in gas.
  • JRH BIOSCIENCES 10% fetal bovine serum
  • 1 mM MEM non-essential amino acid solution Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • ETA24 cell As a control, ETA (endothelin A receptor) -expressing CH0 cell clone 24 (hereinafter abbreviated as ETA24 cell; see Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 279, pp. 675-685, 1996) was used.
  • ZAQC-B1 cells and ETA 24 cells were measured using the FLIPR (Molecular Devices) with respect to the samples for atsey obtained in the above (2-4).
  • FLIPR Molecular Devices
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • ZAQC-B1 cells and ETA24 cells are each suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at a concentration of 15 ⁇ 10 4 cells / ml and dispensed into a 96-well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Coster).
  • H / HBSS Nasy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9., sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, pH 7.4 with sodium hydroxide solution, then filter sterilization) 20 ml, 250 mM Probenecid 200 ⁇ l, and 200 f / l fetal serum (FBS) were mixed.
  • sample plate For the atssay sample obtained in (2-4) above, dilute each fraction with 150 ⁇ H of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA, and use it in a 96-well plate for FLI PR. (V-Bottom plate, Coster) (hereinafter referred to as sample plate). After dye loading on the cell plate, wash the cell plate 4 times with a washing buffer containing 2.5 mM Proben ecid in 3 ⁇ 4 ⁇ 33 using a plate washer (Molecular Devices), and wash 100 ⁇ after washing. The buffer was left. The cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and assayed (50 samples were transferred from the sample plate to the cell plate by the FLIPR). As a result, the above (2-3) IV solution was transferred to the (2) — 4) Fraction No. 53 obtained by reversed-phase high-performance liquid chromatography showed an activity to increase intracellular Ca ion concentration specific to ZAQC-B1 cells.
  • TSKgel Super-Phenyl Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography column (0.46 cm X 10 era, Tosoichi Co., Ltd.) .
  • Chromatography was performed on the fraction No. 53 obtained in the above (3-4).
  • the volume of solution A was increased to 75% / the volume of solution B at 25% over 1 minute at a flow rate of 1 ml / min, and then over 75 minutes. hand
  • the solution concentration was increased in a linear gradient to a solution volume of 33%.
  • the eluate was fractionated with a fraction number of 500 1 each. From the fractionated fractions, each 25 1 was mixed with 0.2% BSA1501 and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). To this dried product, 150 ⁇ l of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA was added and dissolved, and 50 / l of this solution was used according to the test method of (2-5) above. By measuring the intracellular Ca ion concentration increasing activity, ZAQC-B1 cells Receptor activity was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ-active component was mainly eluted in fraction No. 103-105. (2-7) 3 ⁇ 4 3 (2/83 > 14.6 / 100 Reversed-phase high-performance liquid chromatography)
  • AiRPC C2 / C18 ST 4.6 / 100 Reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Amersham Pharmacia Biotech, 0.46 cm x 10 cm) was applied at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min to liquid A (heptafluorobutyric acid / distilled). (Water) 95% volume / B solution (0.1% heptafluorobutyric acid / 100% acetonitrile) 5% volume was flowed to equilibrate.
  • the eluate was fractionated by assigning a fraction number of 500 ⁇ , and each 10 ⁇ 1 of each fraction was mixed with 150 ⁇ % of 0.2% BSA and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • H / HBS S 150 / zl containing 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added to the dried product to dissolve the ZAQC-B1 cells using this solution 501 according to the test method described in (3-5) above.
  • the receptor activating effect on was measured.
  • the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells that is, the ZAQ activating component, was eluted in fraction Nos. 82-84.
  • This activity peak completely coincided with the ultraviolet absorption peak at 210 nm, and it was determined that the peptide had been purified to a single peptide.
  • a Blast search of the database using the N-terminal amino acid sequence of the peptide that activates ZAQ purified from the milk obtained in Reference Example 2 (SEQ ID NO: 6) as a query shows that it is SEQ ID NO: 6.
  • Human EST 0W0467 containing a sequence equivalent to the nucleotide sequence of DNA encoding a peptide having an amino acid sequence was found. Since this sequence did not have a full-length open reading frame, the sequence of the undetermined portion was determined by the RACE method, and a cDNA clone having the full-length open reading frame was obtained. did.
  • ZF1 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • ZF2 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • ZF3 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • the reaction solution was 1 ⁇ l of 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-K0H, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.5 ⁇ g / ml 5 ⁇ l of BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40), 4 ⁇ l of dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo), 10 primer ZF2 1 ⁇ 1, 10 ⁇ ⁇ primer ⁇ 2 (primer ⁇ 2 1 jl of type III DNA (attached to Marathon-Ready cDNA Kit from CL0NTECH), 5 ⁇ l of type I DNA (50-fold dilution of the PCR reaction solution), and 33 / l of distilled water were prepared.
  • CL0NTECH X Advantage 2 Polymerase Mix
  • 10 x Advantage 2 PCR buffer 400 mM Tricine-K0H, 150 mM K
  • the reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° C for 60 seconds, a cycle reaction of 94 ° C for 30 seconds to 72 ° C for 4 minutes was performed 5 times, and a cycle reaction for 94 ° C for 30 seconds to 70 ° C for 4 minutes Were repeated 5 times, and a cycle reaction of 94 ° 030 seconds-68 ° 044 minutes was performed 25 times.
  • a second nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type II.
  • the reaction solution was 1 / xl of 50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH), and the attached 10 ⁇ Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine—KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 // g / ral 5 ⁇ l of BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40), 4 ⁇ l of dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo), 10 ⁇ m of primer ZF3 1 ⁇ l, 10 ⁇ m of primer ⁇ 2 (primer ⁇ 2 is CL0NTECH 1 ⁇ l), 5 ⁇ l of type I DNA (50-fold dilution of the PCR reaction solution), and 33 of distilled water were prepared.
  • CL0NTECH Advantage 2 Polymerase Mix
  • the reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° 060 seconds, 5 cycles of 94 ° C-30 seconds-72 ° C'4 minutes, 5 cycles of 94 ° ⁇ 30 seconds-70 ° C'4 minutes, A cycle reaction of 94 ° C. for 30 seconds—68 ° C. for 44 minutes was performed 25 times.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the nucleotide sequence of the cloned DNA was decoded using ABI377 DNA sequencer to obtain a 3′-end sequence (SEQ ID NO: 10).
  • primers ZAQL-CF SEQ ID NO: 11
  • ZAQL-XR1 SEQ ID NO: 12
  • ZAQL-CF 5 '-CCACCATGAGAGGTGCCACG- 3' (SEQ ID NO: 1 1)
  • ZAQL-XR1 5, -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • PCR reaction solution 1 ⁇ l of PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 5 ⁇ l of attached 10x PCR buffer, 4 ⁇ l of 2.5 mM dNTP mixture, 10 zM primer ZAQL-CF and ZAQL-XR1 Were prepared by mixing 2.5 ⁇ each, 5 ⁇ 1 of type I DNA, and 30 of distilled water.
  • the reaction conditions were: 95 ° C for 1 minute initial denaturation, 95 ° C for 1 minute-60 ° C, 1 minute to 72 ° C, 1 minute cycle 40 times, and final extension at 72 ° 010 minutes
  • the obtained DNA fragment was cloned using the TOPO ⁇ A Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 was named pHMITA
  • the plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 was named pHMITG.
  • Escherichia coli was transformed with plasmids pHMITA and pHMITG, and named Escherichia coli ⁇ / ⁇ and Escherichia coli TOPlO / pHMITG, respectively.
  • the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 13 was converted to the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 15 (A type, 105 amino acid residues).
  • the DNA fragment containing the coding DNA (SEQ ID NO: 16), the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 14 is a human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 17 (G type, 105 amino acid residues) (SEQ ID NO: 18).
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 has a typical signal sequence
  • the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is represented by SEQ ID NO: 19
  • the DNA having the sequence is represented by SEQ ID NO: 21. It was found that the DNA contained 258 base pairs of DNA (SEQ ID NO: 22) encoding the human-type ZAQ ligand mature peptide (G type, 86 amino acid residues).
  • Reference Example 4 Production of human ZAQ ligand peptide in mammalian cells
  • Plasmid pHMITG was digested with EcoRI and XhoI, and the resulting DNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. Cut out. DNA fragments were recovered from the gel pieces using a Gene Clean spin DNA extraction kit (BIO 101). The obtained DNA fragment was cloned in accordance with a standard method at a cleavage site for EcoRI and XhoI restriction enzymes with respect to a mammalian cell expression vector PCAN618 using CMV-IE enhancer and chicken beta-actin promoter as expression promoters.
  • the mammalian cell expression vector having the DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide was named pCANZAQLg2.
  • C0S7 cells used were purchased from ATCC and subcultured using DMEM medium (supplemented with 10% FBS).
  • Human type ZAQ ligand precursor peptide expression plasmid (pCANZAQLg2) 2 ⁇ (2 ⁇ l of ⁇ Noffer t ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) ⁇ N ⁇ offer EC (Effectene transfection reagent, Q IAGEN) 298 ⁇ was added, and Enhancer 16 was added.
  • the culture supernatant of the C0S7 cell expressing human ZAQ ligand precursor peptide was collected, and the following operation was performed to prepare an extract.
  • 1.1 ml of acetic acid was added dropwise to the cell culture supernatant (about 18.5 ml) to a final concentration of 1 M, followed by stirring for 1 hour. Further Aseto down twice that capacity addition, 4 ° C at stirring for 30 min, then a high-speed centrifugal separator (CR26H, 23 type rotor: Hitachi, Ltd.) using a 15, 000 r centrifugal P m, 30 minutes Then, a supernatant was obtained. The resulting supernatant was applied to an evaporator to remove acetone, and then lyophilized with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • a freeze dryer (12EL; VirTis
  • Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel Super ODS reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 0.46 cm x 10 cm) at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min. ) And allowed to equilibrate. After applying the SepPak C18-5 g force fraction obtained in (4-3-2) to the servant, the mixture was applied to Super ODS reversed-phase high-performance liquid chromatography, and the solution A (0.1%) was applied at a flow rate of 1 ml / min for 60 minutes.
  • the eluate was fractionated by adding fraction No. to each 1 ml, and the entire fraction fraction was freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). H / HBSS plus 2.5mM Probenecid and 0.2% BSA ⁇ ⁇ 1 was added to the dried product and dissolved. Using this solution, ZAQC-B1 cells were tested by the following test method (4-1-3-4). The receptor activating effect was measured.
  • F LIPR was used to measure the intracellular Ca ion concentration increasing activity of the ZAQ-expressing cells (ZAQC-B1) obtained in Reference Example 2 (2-5). It was performed using.
  • h0T7T175-expressing cells h0T7T175-16; described in WO 00/24890.
  • ZAQC-B1 cells and h0T7T175-16 cells that had been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS) were used.
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • ZAQC-B1 cells and MT7T175-16 cells were each suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at a concentration of 15 ⁇ 10 4 cells / ml, and distributed in a 96-well plate for FLIPK (Black plate clear bottom. Coster).
  • a device seeded by 200 ⁇ 1 each Ueru using (3.0 ⁇ 10 4 ⁇ 113 / 200 / ⁇ 1 / Uweru), and 5% C0 2 was incubated in a coater 37 ° C De ⁇ culture, using the (hereafter cell plates ).
  • H / HBSSCHAN KS '9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, pH with sodium hydroxide After adjusting to 7.4, filter sterilization treatment) 21 ml, 210 mM Probenecid 210 ⁇ l, and 210 ⁇ l of mouse fetal serum (FBS) were mixed.
  • each fraction was dissolved by adding 150 ⁇ l of H / HBSS to which 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA were added, and dissolving in a 96-well plate for FLIPR ( (V-Bottom plate, Coster) (hereinafter referred to as sample plate).
  • sample plate 96-well plate for FLIPR ( (V-Bottom plate, Coster)
  • the cell plate was washed four times with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid added to H / HBSS using a plate washer (Molecular Devices), and after washing, 100 washing buffers were left.
  • the DNA7 fragment obtained in (b) above was combined with # 1 and # 6 above to give 1 201.
  • the mixture was kept at 90 ° C. for 10 minutes, gradually cooled to room temperature, annealed, and subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • the II solution 301 included in the kit was added and mixed well, and then 60 ⁇ l of the I solution included in the kit was added.
  • the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour to perform ligation.
  • pTCII As an expression vector, pTCII (described in JP-A-2000-178297) was digested with NdeI and BamHI (Takara Shuzo) at 37 ° C for 2 hours, and then 4.3 kb by 1% agarose gel electrophoresis. was extracted using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 ju1 of TE buffer. The ligation reaction was carried out using the Ndel and BamHI fragments of pTCII and the structural gene (SEQ ID NO: 38) of the ZAQ ligand prepared as described above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli JM109 Combinant Cell was transformed with 101 of this reaction solution, seeded on LB agar medium containing 10 ⁇ g / m1 of tetracycline, and cultured at 37 ° C for 1 ⁇ . Tetracycline resistant colonies The transformant was over ⁇ cultured in LB medium, plasmids were prepared ptch 1 ZAQ using QIA P rep8 Miniprep Kit (Qiagen). The base sequence of this ZAQ ligand DNA was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer.
  • the plasmid pTCh1ZAQ was transformed into Escherichia coli MM294 (DE3) to obtain a ZAQ ligand expression strain Escherichia coli MM294 (DE3) / pTChlZAQ.
  • Example 1-2 Production of ZAQ ligand
  • the above Escherichia coli MM294 (DE3) / pTChlZAQ was added to LB medium containing 5.Omg / L tetracycline ⁇ 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium salt).
  • the culture was shake-cultured at 37 ° (: 8 hours in a 2 L flask.
  • the obtained culture was mixed with 19 L of the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% phosphoric acid 2%).
  • Potassium hydrogen, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride sodium, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% defoamer, 0.00025% ferrous sulfate, 0.0005% hydrochloric acid Thiamine, 1.5% budou sugar, 1.5% high-case amino) were introduced into a 5 L fermenter, and aeration and stirring were started at 30 ° C.
  • isopropyl-1- ⁇ -D —Tiogalactopyranoside was added to a final concentration of 12 mg / L, and the cells were further cultured for 4 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged to obtain about 200 g of wet cells and stored at 180 ° C.
  • Example 1-3 The regenerating solution after the completion of the activation in Example 1-3 was adjusted to pH 6.0, and the SP-Sepharose column (11.3 cm ⁇ 15 cm) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) was used. ), And eluted with 600 mM NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the fractions containing the ZAQ ligand were pooled.
  • Example 14 The ZAQ ligand obtained in 1-4 was suspended in Sam1 ebuffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] supplemented with 100 mM DTT, heated at 95 ° C for 1 minute, and then multi-gel Electrophoresis was performed with 15 25 (Daiichi Kagaku). The gel after electrophoresis was stained with Coomassie 'Brilliant' Benolay (Coomassie brillian t blue), and the same position as the recombinant ZAQ ligand sample derived from COS 7 cells obtained in Reference Example (4-3-3) was obtained. A single protein band was observed. From this, the recombinant ZAQ ligand preparation derived from E. coli obtained in Examples 14 to 14 is extremely high in purity and has the same molecular weight as the recombinant ZAQ ligand prepared from COS 7 cells. I found it.
  • the amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-1 8500A Amino Acid Analyzer). As a result, the amino acid composition was consistent with the amino acid composition deduced from the DNA base sequence of the ZAQ ligand (peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21) (Table 1).
  • Tr_09 acid hydrolysis (6 N HC 1-1% phenol, 110. C, average of 24 and 48 hours hydrolysis)
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of the ZAQ ligand deduced from the nucleotide sequence of the DNA of the obtained ZAQ ligand (Table 2).
  • the C-terminal amino acid was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). The obtained ZAQ ligand was in agreement with the C-terminal amino acid deduced from the DNA base sequence (Table 3).
  • Mass spectrometry was performed using an LCQ ion trap mass spectrometer (manufactured by ThermoQuest) equipped with a nanoESI ion source. As a result, a molecular weight% of 57.55 ⁇ 0.89 was obtained, and the theoretical molecular weight of the ZAQ ligand of SEQ ID NO: 21 and 10 residues of Cys of SEQ ID NO: 21 in which 5 pairs of disulfide bonds were formed (9657 , 3).
  • Example 11 Measurement of Activity of 6 Z AQ Ligand Measurement of Cell-Caion Concentration Elevation Activity Using FLIPR
  • Example 14 Using the purified recombinant E. coli-derived ZAQ ligand sample obtained in 1-4, the method of Reference Example (4-1-3-4) was used to measure the activity (intracellular Ca ion using FLIPR). Measurement of concentration increasing activity). As a result, it had an activity equivalent to that of the C0S7 cell-derived recombinant sample (purified ZAQ ligand) obtained in Reference Example (4-1-3-3).
  • a human Bv8 structural gene was prepared using the following six DNA fragments # 1 to # 6.
  • Each of the four DNA oligomers (# 2 to # 5) excluding # 1 and # 6 above, which should be on the 5 'side, was added to 25 ⁇ l of phosphorylation reaction solution (DNA oligomer 10 ⁇ g, 50 mM Tris-HCl , pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , ImM spermidine, 10 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT), 0.1 mg / m 1 ⁇ serum album Min (hereinafter abbreviated as BSA), ImM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end of each oligomer. After the phenol treatment, 2 volumes of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and DNA was precipitated by centrifugation.
  • the DNA fragment obtained in (b) above was combined with # 1 and # 6 to give 120 ⁇ l.
  • the mixture was kept at 90 ° C. for 10 minutes, cooled slowly to room temperature, annealed, and subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • 3 ⁇ m of the II solution attached to the kit was added, and the mixture was thoroughly mixed.
  • the solution of 601 included in the kit was added, and reacted at 37 ° C for 1 hour to perform ligation.
  • pTCII As an expression vector, pTCII (described in JP-A-2000-178297) was digested with NdeI and BamHI (Takara Shuzo) at 37 ° C for 2 hours, and then subjected to 1% agarose gel electrophoresis. The 4.3 kb DNA fragment was extracted using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 ⁇ l of TE buffer. A ligation reaction was carried out between the Ndel and BamHI fragments of pTC II and the human Bv8 structural gene (SEQ ID NO: 39) prepared above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with 10 1 of this reaction solution, seeded on LB agar medium containing 10 ⁇ g Zm 1 of tetracycline, cultured at 37 ° C for 1 ⁇ , and the resulting tetracycline-resistant colonies were selected. It is.
  • This transformant was cultured once in an LB medium, and plasmid pTCh2ZAQ was prepared using QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen). The nucleotide sequence of this human Bv8 DNA was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer.
  • the plasmid pTCh2ZAQ was transformed into Escherichia coli MM294 (DE3), and the human Bv8 expression strain Escherichia coli was transformed. Obtained 294 (DE3) I pTCh2ZAQ.
  • Example 2-2 Production of Human Bv8
  • Escherichia coli MM294 (DE3) / pTCh2ZAQ was added to LB medium containing 5.0 mg / L tetracycline in 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride). The cells were shake-cultured at 37 ° C for 8 hours in an L-volume flask. The obtained culture solution was added to a 19 L main fermentation medium (1.6% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride).
  • Example 2-4 Purification of human Bv8
  • a type Bv8 fraction (elution time: about 40 minutes) was obtained.
  • the fraction was further passed through C4P-50 (21.5 mm IDX, 300 mL, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, and adsorbed and washed.
  • B Elution was performed with a step gradient (60 minutes) of 80% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid.
  • lyophilization was performed. Approximately 25 m of lyophilized BV8 lyophilized powder was obtained.
  • Human BV8 obtained in Example 2-4 was suspended in Sampiebuffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] supplemented with 10 OmM DTT, and heated at 95 ° C for 1 minute. Electrophoresis was performed on 15/25 (Daiichi Pure Chemicals). Genole after electrophoresis was stained with Coomassie brilliant blue, and as a result, a single protein band was observed at 9 kDa. From this, it was found that the recombinant human BV8 preparation derived from Escherichia coli obtained in Examples 2 to 4 was extremely high in purity.
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). As a result, it was consistent with the amino acid composition deduced from the DNA base sequence of human Bv8 (a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30) (Table 4). .
  • Trp09.1 Acid hydrolysis (6 N HC 1-4% thioglycolic acid, average value of hydrolysis at 110 ° C, 24 and 48 hours)
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of human BV8 deduced from the nucleotide sequence of the obtained human BV8 DNA (Table 5).
  • Th r Th r
  • the C-terminal amino acid was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
  • the obtained human BV8 coincided with the C-terminal amino acid deduced from the nucleotide sequence of the DNA (Table 6).
  • the production method of the present invention is useful for industrially producing a pharmacologically active ZAQ ligand in a large amount and efficiently as compared with the conventional production method.

Abstract

A process for obtaining a protein having the same activity as that of a ZAQ ligand isolated from eucaryotic cells which comprises efficiently restoring an inactive ZAQ ligand produced in procaryotic cells by using a gene manipulation technique. Namely, a process for producing an active ZAQ ligand characterized by comprising genetic engineeringly expressing a ZAQ ligand in a procaryotic host and then refolding it in a redox buffer.

Description

ZAQリガンドの製造方法 技術分野  Manufacturing method of ZAQ ligand
本発明は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパ ク質またはその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩 （以下、 単に 「ZAQリガンド」 と称する場合がある。 また、 「配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質また はその塩と結合する、 または該タンパク質またはその塩を活性化する能力を有す るペプチド」 を単に 「ZAQリガンド」 と称する場合もある。 ） を、 遺伝子操作 技術を用いて原核細胞中で発現させ、 抽出した ZAQリガンドにリフォールディ ング操作を行い、 薬理的に活性な Z AQリガンドを製造する方法などに関する。 背景技術  The present invention has an ability to bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof. Or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as “ZAQ ligand”. “A protein or a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) The “peptide capable of binding to the salt or activating the protein or the salt thereof” is sometimes simply referred to as “ZAQ ligand.”) Is expressed in prokaryotic cells using genetic engineering technology. The present invention relates to a method for producing a pharmacologically active ZAQ ligand by performing a refolding operation on the extracted ZAQ ligand. Background art
分子内に多くのシスティン残基を含み、 ジスルフィド結合を有するタンパク質 またはペプチドを、 公知の遺伝子工学的手法により、 チャイニーズハムスター細 胞 （例、 CHO) 、 サル細胞 （例、 COS— 7) 等の真核細胞を宿主として発現 すると薬理的に活性なタンパク質またはペプチドが得られる。 しかし、 該タンパ ク質またはペプチドを真核細胞により発現させる方法は、 原核細胞により発現さ せる方法に比べ、 一般的に、 目的とするタンパク質またはペプチドの発現量が低 く、 さらに真核細胞用の培地が高価であるため、 該タンパク質またはペプチドの 工業的規模での製造には適していない。  Proteins or peptides containing a large number of cysteine residues in the molecule and having disulfide bonds can be converted into Chinese hamster cells (eg, CHO), monkey cells (eg, COS-7), etc. by known genetic engineering techniques. Expression of a nuclear cell as a host yields a pharmacologically active protein or peptide. However, the method of expressing the protein or peptide in eukaryotic cells generally has a lower expression level of the protein or peptide of interest than the method of expressing the protein or peptide in prokaryotic cells, and furthermore, the method for eukaryotic cells. The medium is expensive and therefore not suitable for industrial scale production of the protein or peptide.
一方、 レドックスバッファーを用いて目的のタンパク質を製造する方法として は、 特表開 62— 502895、 特開平 10— 191989公報などで報告され ている。  On the other hand, methods for producing a target protein using a redox buffer are reported in, for example, JP-T-62-502895 and JP-A-10-191989.
Z A Qリガンドはォ一ファンレセプターであった ZAQレセプター （配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有 するタンパク質またはその塩） に対してリガンド活性を有するペプチドで、 消化 器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） などの予防 ·治療作 用を有する有用なペプチドである。 該ペプチドは、 公知の遺伝子工学的手法によ り、 真核細胞を用いて製造することができる。 The ZAQ ligand has ligand activity for the orphan receptor ZAQ receptor (a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof). Digestion with peptides It is a useful peptide that has preventive and therapeutic effects on organ diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.). The peptide can be produced by using known eukaryotic cells by a known genetic engineering technique.
しかし、 ZAQリガンドをチャイニーズハムスター細胞 （例、 CHO) 、 サル 細胞 （例、 COS— 7) 等の真核細胞を宿主として発現すると薬理的に活性な Z AQリガンドが得られるものの、 真核細胞用の培地は高価であり、 さらにタンパ ク質の発現量が低く、 工業的規模での製造は適当とはいえなレ、。  However, pharmacologically active ZAQ ligands can be obtained by expressing ZAQ ligands in eukaryotic cells such as Chinese hamster cells (eg, CHO) and monkey cells (eg, COS-7). The medium is expensive, and the expression level of the protein is low, so that production on an industrial scale is not suitable.
一方、 原核細胞を用いると大量のタンパク質を発現させることができるが、 薬 理的に活性が不十分な封入体を形成してしまう。 Z AQリガンドの一例である配 列番号： 21で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、 分子内に 10個のシ スティン残基を含み、 5組のジスルフイド結合を有している。 従って、 原核細胞 を用いて ZAQリガンドを生産すると、 封入体が形成されてしまい、 該封入体に 存在する Z AQリガンドを効率よく活性型 Z AQリガンドに変換することは従来 の方法では困難であった。 そこで、 薬理的に活性な ZAQリガンドの工業的に有 利な製造方法 （大量製造方法等） が求められていた。 発明の開示  On the other hand, the use of prokaryotic cells allows the expression of large amounts of proteins, but forms inclusion bodies with insufficient pharmacological activity. A peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, which is an example of a ZAQ ligand, contains 10 cysteine residues in the molecule and has 5 pairs of disulfide bonds. Therefore, when ZAQ ligands are produced using prokaryotic cells, inclusion bodies are formed, and it is difficult to convert ZAQ ligands present in the inclusion bodies into active ZAQ ligands efficiently by conventional methods. Was. Therefore, there has been a demand for an industrially advantageous method of producing a pharmacologically active ZAQ ligand (such as a mass production method). Disclosure of the invention
本発明者らは、 これらの課題を解決すべく、 原核細胞の高生産性を利用するこ とにより、 効率的な ZAQリガンドの活性ィ匕方法 （再生方法） を提供すべく鋭意 研究を重ねた結果、 遺伝子操作技術を用いて ZAQリガンドを原核細胞において 発現後、 活性化する工程において、 レドックスバッファ一中でリフオールディン グすることを初めて試みた。 その結果、 予想外にも Z AQリガンドの活性化がェ 業的に効率よく行うことができることを見出し、 更に研究を行った結果、 本発明 を完成したものである。  In order to solve these problems, the present inventors have made intensive studies to provide an efficient ZAQ ligand activation method (regeneration method) by utilizing the high productivity of prokaryotic cells. As a result, we tried for the first time to refold in a redox buffer in the step of activating and then expressing ZAQ ligand in prokaryotic cells using genetic engineering techniques. As a result, they unexpectedly found that the activation of ZAQ ligand can be performed industrially efficiently, and as a result of further research, the present invention has been completed.
即ち、 本発明は、 遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させた ZAQリガンド をレドックスバッファ一中でリフォールディングすることを特徴とする活性型 Z A Qリガンドの製造方法に関するものである。  That is, the present invention relates to a method for producing an active ZAQ ligand, comprising refolding a ZAQ ligand expressed in a prokaryotic host by genetic engineering in a redox buffer.
具体的には、 本発明は、  Specifically, the present invention
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原 核細胞宿主中で発現させ、 レドックスバッファ一中でリフォールディングするこ とを特徴とする配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 —のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タン パク質またはその塩を活性化する能力を有する活性型のペプチドまたはその塩の 製造方法、 (1) An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A peptide or a salt thereof capable of binding to, or activating a protein or a salt thereof containing, a nucleic acid sequence or a salt thereof is genetically engineered and expressed in a prokaryotic cell host; Binds to a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the protein or a salt thereof, wherein For producing an active peptide or a salt thereof having the ability to activate
( 2 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 2 1 で表わされるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有する ペプチドまたはその塩である上記 （1 ) 記載の製造方法、  (2) has the ability to bind to or activate a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 The production method according to the above (1), wherein the peptide or a salt thereof is a peptide or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21;
( 3 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性化する能力を有するぺプチドまたはその塩が、 配列番号： 2 1 で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩である上記 （1 ) 記 載の製造方法、  (3) has the ability to bind to or activate a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 The method according to the above (1), wherein the peptide or a salt thereof is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a salt thereof.
( 4 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 1 9 で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩である上記 （1 ) 記 載の製造方法、  (4) an ability to bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof; The method according to the above (1), wherein the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or a salt thereof has a peptide or a salt thereof.
( 5 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 3 0 で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する ペプチドまたはその塩である上記 （1 ) 記載の製造方法、  (5) an ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof; The method according to (1), wherein the peptide or the salt thereof is a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 or a salt thereof,
( 6 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性ィヒする能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 30 で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩である上記 （1) 記 載の製造方法、 (6) binds to, or binds to, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof; Or the peptide capable of activating the salt thereof or the salt thereof is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 or a salt thereof,
(7) 配列番号： 21または配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその塩を遺伝子工学 的に原核細胞宿主中で発現させ、 レドックスバッファ一中でリフォールデイング することを特徴とする活性型の該ぺプチドまたはその塩の製造方法、  (7) A peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering. Refolding in a redox buffer, a method for producing the active form of the peptide or a salt thereof,
(8) 配列番号： 21、 配列番号： 19または配列番号： 30で表わされるアミ ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発 現させ、 レドックスパッファー中でリフォールデイングすることを特徴とする活 性型のぺプチドまたはその塩の製造方法、  (8) A peptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically engineered in a prokaryotic host, and is expressed in a redox buffer. A method for producing an active peptide or a salt thereof, which is characterized by refolding;
(9) レドックスバッファーが還元型ダルタチオンおよび酸ィヒ型グルタチオンを 含有する緩衝液である上記 （1) 記載の製造方法、  (9) The method according to the above (1), wherein the redox buffer is a buffer containing reduced daltathione and acid-rich glutathione.
(10) レドックスバッファ一中の還元型ダルタチオンおょぴ酸ィヒ型ダルタチォ ンの濃度が、 それぞれ約 0. 01〜100ミリモル/リッ トルである上記 （9) 記載の製造方法、  (10) The production method according to the above (9), wherein the concentration of reduced daltathione oxalate daltathione in the redox buffer is about 0.01 to 100 mmol / liter, respectively.
(11) 緩衝液がトリス緩衝液である上記 （8) 記載の製造方法、  (11) The production method according to the above (8), wherein the buffer is a Tris buffer,
(12) レドックスバッファーの： Hが 7から 9の範囲である上記 （1) 記載の 製造方法、  (12) The production method according to the above (1), wherein H of the redox buffer is in the range of 7 to 9.
(13) レドックスバッファーの pHが約 8である上記 （1) 記載の製造方法、 (13) The production method according to the above (1), wherein the pH of the redox buffer is about 8,
(14) レドックスバッファーが、 メルカプト基を有さないアミノ酸を、 さらに 含有する上記 （1) 記載の製造方法、 (14) The production method according to (1), wherein the redox buffer further contains an amino acid having no mercapto group.
(15) メルカプト基を有さないアミノ酸がアルギニンである上記 （14) 記載 の製造方法、  (15) The production method according to the above (14), wherein the amino acid having no mercapto group is arginine,
(16) メルカプト基を有さないアミノ酸のレドックスバッファ一中の濃度が約 0. ：!〜 1モル/リットルである上記 （14) 記載の製造方法、  (16) The production method according to the above (14), wherein the concentration of the amino acid having no mercapto group in the redox buffer is about 0:! To 1 mol / L,
(17) 0〜 30°C下でリフオールデイングする上記 （1) 記載の製造方法、 (17) The production method according to the above (1), wherein the reflowing is performed at 0 to 30 ° C.
(18) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質 またはその塩を活性ィヒする能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に 原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を可溶ィヒし、 ついでレドックスバッファ一中 でリフォールデイングする上記 （ 1 ) 記載の製造方法、 (18) binds to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or the protein Alternatively, a peptide having the ability to activate a salt thereof or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host, and the cells are solubilized and then refolded in a redox buffer. ) Described manufacturing method,
(19) 配列番号： 21または配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩を遺伝子ェ 学的に原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を可溶化し、 ついでレドックスバッフ ァ一中でリフォールデイングする上記 （7) 記載の製造方法、  (19) A peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host, Is solubilized, and then refolded in a redox buffer, according to the above (7),
(20) 還元剤非存在下で可溶化する上記 （18) または （1 9) 記載の製造方 法、  (20) The production method according to the above (18) or (19), which is solubilized in the absence of a reducing agent,
(21) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質 またはその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に 原核細胞宿主中で発現させ、 細胞を変性剤で可溶ィ匕し、 ついでメルカプト基を有 さないァミノ酸をさらに含有する pH7〜9のレドックスバッファ一で、 変性剤 を不作用濃度まで希釈することを特徴とする上記 （1) 記載の製造方法、  (21) a peptide having the ability to bind to a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or to activate the protein or a salt thereof; The salt is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, the cells are solubilized with a denaturing agent, and then a redox buffer (pH 7 to 9) further containing an amino acid having no mercapto group is used as a denaturing agent. Is diluted to an inactive concentration, the method according to the above (1),
(22) 酉己列番号： 21または配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドまたはその塩を遺伝子ェ 学的に原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を変性剤で可溶ィヒし、 ついでメルカプ ト基を有さないアミノ酸をさらに含有する ρΗ7〜 9のレドックスバッファーで 、 変性剤を不作用濃度まで希釈することを特徴とする上記 （7) 記載の製造方法  (22) A peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by the sequence number: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically expressed in a prokaryotic host. The cells are solubilized with a denaturing agent, and the denaturing agent is diluted to an inactive concentration with a redox buffer of ρΗ7 to 9 further containing an amino acid having no mercapto group. 7) The manufacturing method described
(23) 変生^ ¾がグァニジンまたは尿素である上記 （21) または （22) 記載 の製造方法、 (23) The production method according to the above (21) or (22), wherein the metamorphosis ^ is guanidine or urea;
(24) 希釈液中の変性剤の濃度が、 約 0〜2モル/リットルになるまで、 レド ックスバッファーで希釈する上記 （21) または （22) 記載の製造方法、 (24) The method according to (21) or (22), wherein the denaturant in the diluent is diluted with a redox buffer until the concentration of the denaturant is about 0 to 2 mol / l,
(25) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質 またはその塩を活性ィヒする能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に 原核細胞宿主中で発現させ、 形成された封入体に存在する該ぺプチドまたはその 塩を、 レドックスバッファ一中でリフォールデイングする上記 （1) 記載の製造 方法、 (25) a peptide capable of binding to, or activating a protein or a salt thereof containing, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or expressing the salt thereof in a prokaryotic host by genetic engineering, and the peptide or its The method according to the above (1), wherein the salt is refolded in a redox buffer,
(26) ぺプチドが、 配列番号： 21または配列番号： 30で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記 (25) 記載の製造方法、  (26) The method according to the above (25), wherein the peptide is a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30;
(27) 配列番号： 21または配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するべプチドまたはその塩を遺伝子ェ 学的に発現させた原核細胞宿主を、 変性剤で可溶ィヒし、 ついでメルカプト基を有 さないアミノ酸、 還元型ダルタチオンおよび酸化型ダルタチオンを含有する緩衝 液と反応させる活性型の該ペプチドまたはその塩の製造方法などに関するもので ある。 発明を実施するための最良の形態  (27) A prokaryotic host which has genetically expressed a peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30, The present invention relates to a method for producing an active peptide or a salt thereof, which is reacted with a buffer solution containing an amino acid having no mercapto group, reduced daltathione and oxidized daltathione, which is soluble with a denaturing agent. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明の方法は、 Z A Qリガンドを遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ 、 レドックスバッファ一中でリフオールデイングすることを特徴とする活性型の ZAQリガンドの製造方法である。 好ましくは、 ZAQリガンドを遺伝子工学的 に原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を可溶化することにより不活性化された Z AQリガンドを、 レドックスバッファ一中でリフォールディングすることにより 、 活性型の ZAQリガンドを製造する。  The method of the present invention is a method for producing an active form of a ZAQ ligand, comprising expressing a ZAQ ligand by genetic engineering in a prokaryotic host and refolding it in a redox buffer. Preferably, the ZAQ ligand is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, and the ZAQ ligand inactivated by solubilizing the cell is refolded in a redox buffer to form an active form of the ZAQ ligand. Produce ZAQ ligand.
本発明で用いられる ZAQリガンドとしては、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩 （以下、 「ZAQレセプター」 と略記することがある） と結合する能力を 有するぺプチドまたはその塩、 または ZAQレセプターを活性化する能力を有す るぺプチドまたはその塩である。  The ZAQ ligand used in the present invention includes a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as “ZAQ receptor”). Or a salt thereof, or a peptide or a salt thereof capable of activating the ZAQ receptor.
ZAQリガンドとして好ましくは、 （1) 配列番号： 21で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 ZAQレセプターと 結合するまたは ZAQレセプターを活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその 塩、 （2) 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有し、 ZAQレセプターと結合するまたは ZAQレセプター を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩、 （2) 配列番号： 30で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 ZAQ レセプターと結合するまたは ZAQレセプターを活性ィヒする能力を有するぺプチ ドまたはその塩などである。 Preferably, the ZAQ ligand comprises (1) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, and having an ability to bind to the ZAQ receptor or to activate the ZAQ receptor. A peptide or a salt thereof, (2) containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and binding to or binding to a ZAQ receptor (2) a peptide or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and binds to or binds to the ZAQ receptor. Examples thereof include a peptide having the ability to activate and a salt thereof.
ZAQリガンドの Z AQレセプターと結合するまたは Z AQレセプターを活性 化する能力は、 公知のリガンド'レセプター結合活性を測定する方法またはそれ に準じた方法や公知の細胞刺激活性 （細胞内 C aイオン濃度変化 （例、 後述の実 施例 1_ 6に記載の方法など） 、 c AMP合成抑制活性など） またはそれに準じ た方法により測定することができる。  The ability of a ZAQ ligand to bind to or activate a ZAQ receptor can be determined by a method for measuring a known ligand 'receptor binding activity or a method analogous thereto, or a known cell stimulating activity (intracellular Ca ion concentration). Change (eg, the method described in Example 1-6 below), cAMP synthesis inhibitory activity, etc.) or a method analogous thereto.
本発明の方法で製造される ZAQリガンドは、 ZAQレセプターと結合する能 力を有するぺプチドもしくは Z AQレセプターを活性化する能力を有するぺプチ ド （以下、 「活性型のペプチド」 と略記することができる） またはその塩である 。 具体的には、 （ 1 ) 活性型の配列番号： 21で表わされるァミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、 （2) 活 性型の配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその塩である。  The ZAQ ligand produced by the method of the present invention is a peptide capable of binding to the ZAQ receptor or a peptide capable of activating the ZAQ receptor (hereinafter abbreviated as “active peptide”). Can be) or its salts. Specifically, (1) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by the active form SEQ ID NO: 21 or a salt thereof, (2) an active form SEQ ID NO: 30 Or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by
ZAQレセプター （Gタンパク質共役型レセプタータンパク質） は、 配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有するレセプタータンパク質である （WO 01/16309) 。  The ZAQ receptor (G protein-coupled receptor protein) is a receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (WO 01/16309).
ZAQリガンドおよび ZAQレセプターは、 例えば、 ヒトゃ非ヒト哺乳動物 （ 例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど ) のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓) 3細胞、 骨髄 細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞 、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球 、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細 胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガ ン細胞など） や血球系の細胞 （例えば、 MEL, Ml, CTLL-2, HT— 2 , WEH 1 -3, HL- 60, 】OSK— 1， K562, ML— 1， MOLT- 3， MOLT— 4， MOLT- 10, CCRF— CEM, TALL- 1, J u r k a t, CCRT-HSB- 2, KE— 37， S KW— 3， HUT- 78, HU T- 102, H 9, U 937, THP- 1 , HE L, J K- 1 , CMK, KO- 812， MEG— 01など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例 えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部 、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脖臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のうZAQ ligands and ZAQ receptors include, for example, human and non-human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, sheep, monkeys, monkeys, etc.), and all cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells) 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B Cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, Hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc., or blood cells (eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEH 1-3, HL-6) 0,] OSK-1, K562, ML-1, MOLT- 3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF- CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, S KW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937 , THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01) or any tissue where those cells are present, eg, the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, Head nucleus, basal cerebral sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, Pituitary, stomach, kidney, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder
、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺 、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） に由来するペプチド ·タンパク 質であってもよく、 また合成べプチド '合成タンパク質であってもよい。 , Bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, testicle, testis, ovary, placenta, uterus It may be a peptide / protein derived from bones, joints, skeletal muscle, etc. (particularly, brain or various parts of the brain), or may be a synthetic peptide'synthetic protein.
配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 21で表されるアミノ酸配列と約 60°/0以上 （好まし くは約 70 %以上、 さらに好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 85 %以 上、 特に好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上） の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。 The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 includes, for example, about 60 ° / 0 or more (preferably about 70% or more, Further preferred are amino acid sequences having a homology of about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列 を含有するペプチドと実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好ましい。 配列番号： 1 9で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列とし ては、 例えば、 酉 3列番号： 19で表されるアミノ酸酉己列と約 60%以上 （好まし くは約 70 %以上、 さらに好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 85 %以 上、 特に好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上） の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。  Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21; Peptides having substantially the same properties as the peptide containing the amino acid sequence represented by 21 are preferred. The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is, for example, about 60% or more (preferably An amino acid sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. .
配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 19で表わされるアミノ酸配列 を含有するべプチドと実質的に同質の性質を有するぺプチドなどが好ましい。 配列番号： 3 0で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 3 0で表されるアミノ酸配列と約 6 0 °/0以上 （好まし くは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以 上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。 Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19; Peptides having substantially the same properties as peptides containing the amino acid sequence represented by 19 are preferred. The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 is, for example, about 60 ° / 0 or more (preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30). Amino acids having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. And the like.
配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列 を含有するぺプチドと実質的に同質の性質を有するぺプチドなどが好ましい。  Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30; Peptides having substantially the same properties as peptides containing the amino acid sequence represented by No. 30 are preferred.
Z AQリガンドの好ましい具体例は、 配列番号： 1 9で表わされるァミノ酸配 列を含有するペプチド、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有するぺ プチド、 配列番号： 3 0で表わされるァミノ酸配列を含有するぺプチドなどであ る。  Preferred specific examples of the ZAQ ligand include a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 30 And peptides containing an amino acid sequence.
実質的に同質の活性としては、 例えば、 Z AQレセプターに対する結合活性、 Z AQレセプターを介するシグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同 質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示す。 したがって、 Z AQレ セプターに対する結合活性、 Z AQレセプターを介するシグナル情報伝達作用な どの活性が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度やペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。  Substantially the same activity includes, for example, a binding activity to a ZAQ receptor, a signal transduction activity via a ZAQ receptor, and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the binding activity to the ZAQ receptor and the signal transduction via the ZAQ receptor are equivalent (for example, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as molecular weight may be different.
これらの活性の測定は、 公知の方法またはそれに準じた方法によって行なうこ とができる （具体的には、 後述の実施例 1一 6に記載の方法またはそれに準じた 方法等） 。  The activity can be measured by a known method or a method analogous thereto (specifically, a method described in Example 11 to be described later or a method analogous thereto).
また、 Z A Qリガンドとしては、 ①配列番号： 1 9または配列番号： 2 1で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1 ~ 3 0個程度、 より 好ましくは 1〜 2 0個程度） のァミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1 9または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜4 0個程度、 より好ましくは 1〜3 0個程度、 なかでも好ましくは 1 〜2 0個程度） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1 9または配 列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換 されたァミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有するぺ プチドなども用いられる。 さらに、 ①配列番号： 3 0で表されるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個 程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 3 0で表されるァミノ 酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜4 0個程度、 より好ましくは 1〜 3 0個程度、 なかでも好ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が付加したァミノ 酸配列、 ③配列番号： 3 0で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ま しくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が他のァ ミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァミノ酸配列 を含有するペプチドなども用いられる。 Examples of the ZAQ ligand include: (1) one or two or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21; Amino acid sequence in which amino acid has been deleted, (2) 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 40 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21; More preferably about 1 to 30 amino acids, particularly preferably about 1 to 20 amino acids), and ③ an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21. 1 or 2 or more of them (preferably 1 to An amino acid sequence in which about 30 (more preferably about 1 to 20) amino acids have been substituted with another amino acid, or a peptide containing an amino acid sequence obtained by combining them, or the like can also be used. Further, (1) an amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30 and more preferably about 1 to 20) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 have been deleted (2) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 30 (preferably about 1 to 40, more preferably about 1 to 30, particularly preferably 1 to 20) Amino acid sequence to which an amino acid sequence of about 30 or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (About one amino acid) are substituted with another amino acid, or a peptide containing an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
Z AQレセプターをコードする配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の 相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。  Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the ZAQ receptor include, for example, about 90% or more, preferably about 95%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Above, more preferably, an amino acid sequence having about 98% or more homology.
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を 有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質 （Z AQレセプター） としては、 例えば、 配 列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有す るタンパク質などが好ましい。  Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; A protein having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by No. 1 is preferred. Examples of the protein (ZAQ receptor) having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Preferred are proteins which contain the same amino acid sequence and have substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができる。 Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. You may. The activities such as ligand binding activity and signal information transduction can be measured according to known methods.
また、 ZAQレセプターとしては、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したァミノ 酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 (1または 2個） ) のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のァミノ 酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有するタンパク質などもその具体例としてあげることができる。 本明細書におけるぺプチドおよぴタンパク質は、 ぺプチド標記の慣例に従って 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 ZA Qリガンド、 ZAQレセプターをはじめとする本発明のペプチドおよびタンパク 質は、 C末端がカルボキシル基 （一COOH) 、 カルボキシレート（—CO O一） 、 アミ ド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であってもよい。 The ZAQ receptor includes: (1) one or more or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several ( Amino acid sequence in which 1 or 2 amino acids have been deleted, 2) 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 1) An amino acid sequence obtained by adding about 0 amino acids, more preferably several (1 or 2) amino acids; and ③ one or more (preferably, one or more) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, still more preferably several (one or two) amino acids substituted with another amino acid, or amino acids obtained by combining them. Proteins containing acid sequences, etc. It can be mentioned as a specific example. In the present specification, peptides and proteins have N-terminus (amino terminus) at the left end and C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation. The peptides and proteins of the present invention including ZAQ ligands and ZAQ receptors have carboxyl groups (one COOH), carboxylate (—COO-1), amides (one CONH 2 ) or esters (one COOR ).
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 a 一ナフチルなどの C 6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー d_2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル一 C ^ 2アルキル基などのじ7_14ァラルキル基のほ力、 経口用エステルとして汎用 されるピバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。 Here, as R in the ester, e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , C such as a one-naphthyl 6 - 12 Ariru group, e.g., benzyl, full Eniru d_ 2 alkyl or α- naphthylmethyl etc. α- naphthyl one C ^ 2 Flip such as an alkyl group 7 _ 14 Ararukiru group such as phenethyl A piva mouth yloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
本明細書におけるべプチドおよびタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 ( またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化または エステルイ匕されているものも本明細書におけるペプチドおよびタンパク質に含ま れる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用 いられる。 さらに、 本明細書におけるペプチドおよびタンパク質には、 上記したペプチド •タンパク質において、 N末端アミノ酸のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル 基、 ァセチル基などの C 2_ 6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護 されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタ ミン酸ィ匕したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一O H、 - S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保 護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 2— 6アルカノィル基などの C - 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺ プチド ·糖タンパク質などの複合べプチド ·複合タンパク質なども含まれる。 When the peptides and proteins in the present specification have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the peptides and proteins in the present specification. It is. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Furthermore, the peptides and proteins in this specification, the peptides • proteins described above, Amino group of the N-terminal amino acid protecting groups (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group) , The daltamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamic acid ligated, substituents on the side chains of amino acids in the molecule (for example, mono-OH, -SH, amino groups , imidazole group, indole group, etc. Guanijino group) appropriate coercive Mamorumoto (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru group - C, such as 6 Arukanoiru groups - those are protected by like 6 Ashiru group), or Also included are complex peptides such as so-called glycopeptides and glycoproteins to which sugar chains are bonded, and complex proteins.
Z A Qリガンドの好ましい具体例としては、 例えば、 配列番号： 1 9、 配列番 号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト由来 （ より好ましくはヒト脳由来） のペプチドなどがあげられる。  Preferred specific examples of the ZAQ ligand include, for example, a peptide derived from human (more preferably from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 Is raised.
Z A Qレセプターの好ましい具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） のタンパク 質などがあげられる。  Preferred specific examples of the ZAQ receptor include, for example, human-derived (more preferably, human brain-derived) protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Z A Qリガンドまたは Z A Qレセプターの塩としては、 とりわけ生理学的に許 容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸 、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩や水和物 などが用いられる。  As the salt of the ZAQ ligand or the ZAQ receptor, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and salts and hydrates are used.
本発明で用いられる原核細胞としては、 Escherichia coli (大腸菌） 等のェシ エリヒァ属菌、 Bacillus subtilis (枯草菌） 等のバチルス属菌、 Serratia marc escens (セラチア） 等のセラチア属菌等が挙げられ、 中でも Escherichia coli等 が好ましい。 これらの原核細胞の形質転換、 培養等は次に示す方法のほか、 常法 (特開平 3— 2 0 4 8 9 7号に記載の方法など） またはそれに準じた方法によつ て行うこともできる。  The prokaryotic cells used in the present invention include Escherichia coli and other Escherichia bacteria, Bacillus subtilis and other Bacillus bacteria, and Serratia marcescens and other Serratia species. Among them, Escherichia coli and the like are preferable. Transformation and culture of these prokaryotic cells can be carried out by a conventional method (such as the method described in JP-A-3-204879) or a method analogous thereto, in addition to the following methods. it can.
Z A Qリガンドをコ一ドする D NAとしては、 前述した Z A Qリガンドをコ一 ドする D N Aを含有する D N Aであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい 。 ライプラリーに使用するベクターは、 バタテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞'糸且織より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcrip tase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P C R法と略称する） によって 増幅することもできる。 The DNA encoding the ZAQ ligand may be any DNA as long as it contains the DNA encoding the ZAQ ligand described above. Also, It may be any of nome DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cDNA derived from cells and tissues, the above-mentioned cDNA library derived from cells and tissues, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of batteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cells.
具体的には、 ZAQリガンドをコードする DNAとしては、 例えば、 （1) 配 列番号： 20で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 20で 表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイブ リダイズする D N Aを含有し、配列番号： 19で表されるァミノ酸配列を含有す るペプチドと実質的に同質の活性 （例、 ZAQレセプターに対する結合活性、 Z AQレセプターを介するシグナル情報伝達作用など） を有するぺプチドをコ一ド する DNA、 (2) 配列番号： 22で表わされる塩基配列を含有する DNA、 ま たは配列番号： 22で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 21で表されるァ ミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 ZAQレセプターに 対する結合活性、 ZAQレセプターを介するシグナル情報伝達作用など） を有す るペプチドをコードする DNA、 (3) 配列番号： 31で表わされる塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 31で表わされる塩基配列を含有する DN A とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aを含有し、 配列番 号： 30で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例 、 ZAQレセプターに対する結合活性、 ZAQレセプターを介するシグナル情報 伝達作用など） を有するぺプチドをコードする D N Aであれば何れのものでもよ い。  Specifically, the DNA encoding the ZAQ ligand includes, for example, (1) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 It contains DNA that hybridizes under high stringent conditions and has substantially the same activity as a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (eg, binding activity to ZAQ receptor, ZAQ receptor (2) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 Which has DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA that binds to the DNA and has substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (eg, ZAQ (3) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, or DNA represented by SEQ ID NO: 31 Containing DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the base sequence, and having substantially the same activity as a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (eg, ZAQ Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a receptor binding activity, a ZAQ receptor-mediated signal transduction action, and the like.
配列番号： 20で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 16で表わされる塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。  Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
配列番号： 22で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。 配列番号： 3 1で表わされる塩基配列を含有する D NAとしては、 配列番号： 4 1で表わされる塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2または配列番号： 3 1で表わされる塩基配列を有する D N Aとハ イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配 列番号： 2 0、 配列番号： 2 2または配列番号： 3 1で表わされる塩基配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 Examples of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18. Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41. Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 31 under stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 20, DNA containing a nucleotide sequence having about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 31 Are used.
配列番号： 2 2で表わされる塩基配列を含有する D N Aとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする D NAとして、 具体的には、 配列番号： 3 8で 表わされる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 8で表わされる塩基 配列を有する D N Aとハイス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aを含有し、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドと実 質的に同質の活性 （例、 Z A Qレセプターに対する結合活性、 Z A Qレセプター を介するシグナル情報伝達作用など） を有するぺプチドをコードする D N A等が 挙げられる。  As a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, specifically, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, Or a DNA containing the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 and a DNA that hybridizes under high stringency conditions, and is substantially the same as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (Eg, binding activity to ZAQ receptor, signal transduction via ZAQ receptor, etc.), and DNA encoding a peptide.
配列番号： 3 1で表わされる塩基配列を含有する D NAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする D NAとして、 具体的には、 配列番号： 3 9で 表わされる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 9で表わされる塩基 酉 S列を有する D N Aとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N Aを含有し、 配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドと実 質的に同質の活性 （例、 Z AQレセプターに対する結合活性、 Z AQレセプター を介するシグナル情報伝達作用など） を有するぺプチドをコ一ドする D NA等が 挙げられる。  As a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 31, specifically, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 Or a DNA comprising the DNA having the base sequence S sequence represented by SEQ ID NO: 39 and DNA hybridizing under high stringency conditions, and a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 And DNA encoding a peptide having substantially the same activity (eg, binding activity to ZAQ receptor, signal transduction via ZAQ receptor, etc.).
具体的には、 （1 ) 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列を含有するべプチ ドをコードする D NAとしては、 配列番号： 2 0で表される塩基配列を含有する D NAが、 （2 ) 配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする D N Aとしては、 酉己列番号： 2 2または配列番号 3 8で表される塩基 配列を含有する D N Aが、 （ 3 ) 配列番号： 3 0で表されるァミノ酸配列を含有 するぺプチドをコ一ドする D NAとしては、 配列番号： 3 1または配列番号 3 9 で表される塩基配列を含有する D N Aがそれぞれ挙げられる。 Specifically, (1) As the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 is mentioned. (2) The DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by the sequence number: 22 or SEQ ID NO: 38; (3) DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 includes SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 39. And DNAs containing the base sequence represented by
上記の Z A Qリガンドをコードする D N Aは、 （ 1 )全塩基配列を公知の方法ま たはそれに準じた方法により化学的に合成してもよいし、 （2) ZAQリガンド をコードする DN Aの塩基配列などを参考にして、 ポリメラーゼ 'チェーン - リ アクション （Polymerase Chain Reaction：以下、 PCRと略称する） 法によって増 幅し取得してもよい。  The DNA encoding the ZAQ ligand may be (1) chemically synthesized by a known method or a method analogous thereto, or (2) DNA of the DNA encoding the ZAQ ligand. The DNA may be amplified and obtained by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) with reference to the sequence and the like.
ZAQリガンドをコードする DNAを導入するプラスミドとしては、 たとえば 大腸菌由来の PBR 322 〔ジーン （Gene) 、 2卷、 95頁 （1977年） 〕 、 p BR 325 〔ジーン、 4卷、 121頁 （1978年） 〕 、 pUC 12 〔ジーン 、 19卷、 259頁 （1982年） 〕 、 pUC 13 〔ジーン、 19卷、 259頁 (1 982年） 〕 、 枯草菌由来の pUB 1 10 〔バイオケミカル ·バイオフイジ カル · リサーテ ·コ ュニケ一ションズ (Biochemical ana Biophysical Resear ch Communications) 、 1 12卷、 678頁 （1983年） 〕 などが挙げられる 力 その他のものであっても、 宿主内で複製増殖されるものであれば、 いずれを 用いることもできる。 また DNAを組み込むファージベクターとしては、 たとえ ば; L g t 1 1 〔ヤング及びデーヴイス （Young, R. and Davis, R. ) 、 プロシー ディングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ 'サイエンス ·ォブ ·ザ 'ユー 'エス .エー （Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A.) 、 80卷、 1 194頁 (1 983年） 〕 などが挙げられるが、 その他のものであっても宿主内で増殖で きるものであれば用いることができる。  Examples of plasmids for introducing DNA encoding the ZAQ ligand include, for example, PBR 322 derived from Escherichia coli (Gene, Vol. 2, p. 95 (1977)) and pBR 325 [Gene, Vol. 4, p. 121 (1978) )], PUC12 [Gene, 19, 259 (1982)], pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], pUB1 10 derived from Bacillus subtilis [Biochemical biophysical · Resate Communications (Biochemical ana Biophysical Research Communications), Vol. 112, p. 678 (1983)], etc., as long as they can be replicated and propagated in the host. , Can be used. Examples of phage vectors incorporating DNA include: Lgt11 (Young, R. and Davis, R.), Proceedings of the National 'Academy of Ob', Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), Vol. 80, p. 1194 (1983)], etc. Any substance that can proliferate can be used.
プラスミドに組み込む方法としては、 たとえば、 ティー'マニアテイス （T.Man iatis) ら、 モレキュラー ' クローユング (Molecular Cloning コールド 'ス プリング 'ハーバー 'ラボラトリー （Cold Spring Harbor Laboratory) 、 23 9頁 （1 982年） に記載の方法などが挙げられる。 またファージベクターに D NAを組み込む方法としては、 たとえばヒューン （Hyunh，T.V.) らの方法 〔ディ 一.ェヌ.エー .クローニング、 ァ ·プラクティカル 'アプローチ （DNA Cloning, A Practical Approach) 1卷、 49頁 （1985年） ] などが挙げられる。 このようにして得られたプラスミドは、 適当な宿主たとえばェシエリヒア （Es cherichia) 属菌， バチルス (Bacillus) 属菌などに導入される。 上記ェシェリヒア属菌の例としては、 ェシェリヒア ' コリ （Escherichia coli ) K12DH1 〔プロシージング 'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ · サイエンス （proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 60卷、 160頁 （1968年 ) 〕 、 JM103 〔ヌクレイック 'ァシッズ'リサーチ （Nucleic Acids Research ) 、 9卷、 309頁 （1981年） 〕 、 JA221 〔ジャーナノレ'ォブ'モレキ ユラ一.ノ ィォロジ一 (Journal of Molecular Biology) 、 1 20卷、 517頁 (1978年） 〕 、 HB 101 〔ジャーナル ·ォブ'モレキュラー 'バイオロジ 一、 41卷、 459頁 （1969年） 〕 、 C 600 〔ジエネティックス （Geneti cs) 、 39卷、 440頁 （1 954年） 〕 、 MM 294 〔ネイチヤー （Nature) 、 217卷、 1 1 10頁 （1968年） 〕 などが挙げられる。 For example, T. Maniatis et al., Molecular Cloning Cold “Spring” Harbor “Laboratory” (Cold Spring Harbor Laboratory), p. 239 (1998) Examples of the method of incorporating DNA into a phage vector include, for example, the method of Hyunh (TV) et al. [DNA Cloning, a Practical 'Approach (DNA Cloning). , A Practical Approach) Vol. 1, p. 49 (1985)], etc. The plasmid obtained in this way can be used in suitable hosts such as Es cherichia sp., Bacillus sp. be introduced. Examples of the above-mentioned Escherichia bacteria include Escherichia coli K12DH1 [Proceding 'ob the national' academy ' ob science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA) 60 vol. JM103 [Nucleic Acids Research], Vol. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology], JA221 [Journal of Molecular Biology] ), 120, 517 (1978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology 1, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], MM 294 [Nature, 217, 111 (1968)], and the like.
上記バチルス属菌としては、 たとえばバチルス 'サチリス （Bacillus subtili s) MI 1 14 〔ジーン、 24卷、 255頁 （1983年） 〕 、 207— 21 〔 ジャーナル ·ォブ ·バイオケミス卜リー (Journal of Biochemistry) 95卷、 87頁 （1984年） 〕 などが挙げられる。  Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtilis MI114 (Gene, Vol. 24, p. 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry). 95, 87 (1984)].
プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、 たとえばティー'マニアティ ス (T. Maniatis) ら， モレキュラー -クローニング (Molecular Cloning) 、 コ —； ド、' スプリング 'ノヽ^ "ノ一 ·ラポラトリー (Cold Spring Harbor Laborator y) 、 249頁 （1982年） に記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシ ゥムクロライド Zルビジウムクロライド法などが挙げられる。  Methods for transforming a host with a plasmid include, for example, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Co.;, 'Spring', "Cold Spring". Harbor Laboratory), p. 249 (1982), calcium chloride method or calcium chloride Z rubidium chloride method.
またファージ 'ベクターを用いる場合には、 たとえば増殖させた大腸菌にイン ビトロパッケージング法を用いて導入することができる。  When a phage 'vector is used, it can be introduced into, for example, grown Escherichia coli using an in vitro packaging method.
このようにしてクローン化された ZAQリガンドをコ一ドする DNAは必要が あればプラスミ ド、 例えば p BR 322、 pUC 12、 pUC 13、 pUC 18 、 UC 1 9N pUC 1 18、 pUC 1 1 9などにサプクローニングして用いる ことができる。 In this way, the cloned ZAQ ligand co one de to DNA is plasmid if necessary, for example, p BR 322, pUC 12, pUC 13, pUC 18, UC 1 9 N pUC 1 18, pUC 1 1 9 Can be used after subcloning.
このようにして得られた ZAQリガンドをコードする DNAの塩基配列を、 た とえばマキサム ·ギルパート （Maxam- Gilbert) 法 〔Maxam， A. M. and Gilbert, W.、 プロシーディングズ ·ォプ 'ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエ ンス ·ォブ 'ザ ·ユー ·エス ·エー （Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) 、 74 卷、 560頁 （1977年） 〕 あるいはジデォキシ法 〔Messing， J.ら、 ヌクレ イツク ·ァシッズ' リサーチ （Nucleic Acids Research) 9卷、 309頁 （19 81年） 〕 によって決定し、 既知のアミノ酸配列との比較から ZAQリガンドを コードする DN Aの存在を確認できる。 The nucleotide sequence of the DNA encoding the ZAQ ligand obtained in this manner was used, for example, by the Maxam-Gilbert method (Maxam, AM and Gilbert, W., Proceedings of the National Institute of Technology). Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74 560 (1977)] or the dideoxy method (Messing, J. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)). The comparison of shows that DNA encoding the ZAQ ligand is present.
上記のようにしてクローン化された ZAQリガンドをコ一ドする DNAは目的 によりそのまま、 または所望により制限酵素ゃェキソヌクレアーゼで消化して使 用することが出来る。  The DNA encoding the ZAQ ligand cloned as described above can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme exonuclease, if desired.
次に、 クローン化された ZAQリガンドをコ一ドする DNAから発現させたい 領域を切り出し、 発現に適したビークル （ベクター） 中のプロモーターの下流に 連結して発現型ベクターを得ることができる。  Next, a region to be expressed is cut out from the DNA encoding the cloned ZAQ ligand, and ligated downstream of a promoter in a vehicle (vector) suitable for expression to obtain an expression type vector.
該 DNAはその 5， 末端に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3， 末 端には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい 。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを 用いて付加することもできる。 さらに該 DN Aを発現させるにはその上流にプロ モーターを接続する。  The DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter. To express the DNA, a promoter is connected upstream thereof.
ベクターとしては、 上記の大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， p B R 325, pUC 12, pUC 13) , 枯草菌由来プラスミ ド （例、 pUB 11 0， TP 5, p C 194) などが挙げられる。  Examples of the vector include the above-described plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), and Bacillus subtilis-derived plasmid (eg, pUB110, TP5, pC194).
本発明で用いられるプロモーターとしては、 DNAの発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。  The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for DNA expression.
形質転換する際の宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 T 7プロモータ一， t r pプロモーター， l a cプロモーター， r e cAプロモーター， プロ モーター， 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP Olプロモーター， SPO 2プロモーター， p e n Pプロモーターなどが好まし い。 とりわけ宿主がェシエリヒア属菌でプロモーターが T 7プロモーター， t r pプロモーターまたは; L P Lプロモーターであることが好ましい。  The T7 promoter, trp promoter, lac promoter, recA promoter, promoter, 1 pp promoter, etc. are used when the host used for the transformation is Escherichia, and SP is used when the host is Bacillus. Ol promoter, SPO2 promoter, pen P promoter and the like are preferable. In particular, it is preferable that the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia and the promoter is a T7 promoter, a trp promoter, or a LPL promoter.
なお、 発現にェンハンサ一の利用も効果的である。  It is effective to use Enhansa for expression.
このようにして構築された ZAQリガンドをコ一ドする DNAを含有するべク ターを用いて、 原核細胞の形質転換体を製造する。 上記ェシェリヒァ属菌を形質転換するには、 たとえばプロシージング 'ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォプ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA ) 、 69卷、 21 10頁 （1972年） やジーン （Gene) 、 17卷、 107頁 （ 1982年） などに記載の方法に従って行なわれる。 Using the vector containing the DNA encoding the ZAQ ligand thus constructed, a prokaryotic cell transformant is produced. Transformation of the above-mentioned Escherichia bacterium can be performed, for example, by the following procedure: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972). And Gene, vol. 17, p. 107 (1982).
バチルス属菌を形質転換するには、 たとえばモレキュラー 'アンド 'ジエネラ ル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) 、 168卷、 1 1 1頁 (1 979年） などに記載の方法に従って行われる。  Transformation of Bacillus spp. Is performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, pp. 11 (1979).
このようにして、 Z AQリガンドをコ一ドする DNAを含有する発現ベクター で形質転換された原核細胞の形質転換体が得られる。 宿主としてェシエリヒア属 菌を、 プロモーターとして T 7プロモーターを用いる場合、 T 7プロモーターの 発現効率の向上を目的として、 ZAQリガンドをコードする DNAを含有する発 現ベクターに加え、 τ 7リゾチーム発現プラスミドを共存させてもよい。  In this way, a prokaryotic cell transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the ZAQ ligand is obtained. When the genus Escherichia is used as a host and the T7 promoter is used as a promoter, a τ7 lysozyme expression plasmid is used in addition to an expression vector containing DNA encoding ZAQ ligand to improve the expression efficiency of the T7 promoter. May be.
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 たとえばアンモユウム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としてはたとえば塩ィ匕カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネ シゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを 添加してもよレ、。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。  When culturing a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein. , Nitrogen sources, inorganic substances and others. Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.Nitrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, cornchip 'liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc. Alternatively, examples of the organic substance and the inorganic substance include calcium salt, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. Also, yeast extract, vitamins and growth promoting factors may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M9培地 〔ミラー （Miller) 、 ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンッ 'ィ ン'モレキュフ1—ジェ不アイツクス (Journal of Experiments in Molecular Ge netics) 、 431— 433頁、 Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 〕 、 LB培地等が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働力せる ために、 たとえばイソプロピノレー j3— D—チォガラタトピラノシド （I PTG) 、 3 /3—インドリルアタリル酸のような薬剤を加えることができる。 As a medium for culturing Escherichia sp., For example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal 'Ob'Experiment'in'Molecuffe 1 —Journal of Experiments in Molecular Geometry netics), pp. 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972], LB medium and the like. Here, if necessary, a drug such as isopropynole j3-D-thiogalatatopyranoside (IPTG) or 3 / 3-indolyl ataryl acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行い、 必要により、 通気や攪拌を加えることもできる。 When the host is Escherichia, cultivation is usually at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours. If necessary, ventilation and agitation can be added.
宿主がバチノレス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や攪拌を加えることもできる。  When the host is a bacterium of the genus Batinoles, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
Z AQリガンドが宿主原核細胞中で不溶成分 （封入体） を形成する場合には、 培養後、 遠心分離等の方法により集菌した後、 細胞を破砕し、 封入体を変性剤を 用いて可溶化することによって、 Z AQリガンドを抽出することができる。 細胞の破枠は、 常法で、 たとえば超音波処理により実施できる。 懸濁媒体とし て中性付近の p H値 （p H 6 . 5〜7 . 5 ) に調整した好適な緩衝液 （例えばリ ン酸緩衝液等） を用いることが好ましい。 この際、 細胞の破砕を促進させるため E D T Aを添加してもよい。 このようにして細胞を破砕した後に、 不溶成分 （封 入体） を任意の方法で、 遠心分離するか、 濾過することにより分取する。 原核細 胞由来のタンパク質をできる限り除去するため、 たとえば水、 リン酸緩衝液を用 いて洗浄することが好ましいが、 場合により 4 M程度の尿素で洗浄してもよい。 得られた沈殿 （ペレッ ト） を変性剤を用いて可溶化する際の変性剤としては、 公知の変性剤、 特にグァニジンまたは尿素等を使用することができる。 変性剤は 通常水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤の濃度は、 グァニジンでは 4〜 8 モル Zリットル、 好ましくは約 6〜 7モル Zリットル、 尿素では 5〜 9モル/リ ットル、 好ましくは約 8モル/リットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩 酸塩等のグァニジンの酸付加塩として用いられる。  If the ZAQ ligand forms an insoluble component (inclusion body) in the host prokaryotic cells, after culturing, collect cells by centrifugation or other methods, disrupt the cells, and allow the inclusion body to be denatured using a denaturant. Upon solubilization, the ZAQ ligand can be extracted. Cell framing can be carried out in a conventional manner, for example by sonication. It is preferable to use a suitable buffer (for example, a phosphate buffer or the like) adjusted to a neutral pH value (pH 6.5 to 7.5) as a suspension medium. At this time, EDTA may be added to promote cell disruption. After crushing the cells in this way, the insoluble components (encapsulated body) are separated by centrifugation or filtration by any method. In order to remove prokaryotic cell-derived proteins as much as possible, washing with, for example, water or a phosphate buffer is preferable. In some cases, washing with about 4 M urea may be used. As a denaturing agent for solubilizing the obtained precipitate (pellet) using a denaturing agent, a known denaturing agent, in particular, guanidine or urea can be used. The denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol Z liter, preferably about 6 to 7 mol Z liter for guanidine, and 5 to 9 mol / liter for urea, preferably about 8 mol / l. Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
Z AQリガンドが宿主原核細胞中で封入体を形成しない場合には、 培養後、 遠 心分離等の方法により集菌した後、 細胞を変性剤を用いて可溶ィヒするカ あるい は細胞を破砕後変'性剤で可溶化することによって Z AQリガンドを抽出すること ができる。  If the ZAQ ligand does not form an inclusion body in the prokaryotic host cells, the cells are lysed with a denaturing agent after culturing, harvested by centrifugation, etc. The ZAQ ligand can be extracted by crushing and solubilizing with a mutagenic agent.
集菌した細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、 例えばグァニジンまたは 尿素などが挙げられる。 変性剤は通常水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤 の濃度は、 グァニジンでは通常 4〜8モル/リットル、 好ましくは約 6〜7モル /リットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩酸塩等のグァニジンの酸付加 塩として用いられる。  Examples of denaturing agents used for solubilizing the collected cells include guanidine and urea. The denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is usually 4 to 8 mol / l, preferably about 6 to 7 mol / l for guanidine. Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
細胞の破碎は、 常法で、 たとえば超音波処理、 フレンチ 'プレスにより実施で きる。 破碎された細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、 公知の変性剤を使 用してよく、 好ましくは、 グァニジンまたは尿素などを使用する。 変性剤は通常 、 水溶液として用いられ、 水溶液中の変性剤の濃度は、 グァニジンでは 4〜8モ ル Zリットル、 好ましくは約 6〜 7モル Zリットル、 尿素では 5〜 9モル/リッ トル、 好ましくは約 8モル/リットルである。 グァニジンは通常グァニジン塩酸 塩等のグァニジンの酸付加塩として用いられる。 Cell disruption can be performed in a conventional manner, for example, by sonication or by French press. Wear. As a denaturant used for solubilization of the disrupted cells, a known denaturant may be used, and guanidine or urea is preferably used. The denaturant is usually used as an aqueous solution, and the concentration of the denaturant in the aqueous solution is 4 to 8 mol Z liter for guanidine, preferably about 6 to 7 mol Z liter, and 5 to 9 mol / liter for urea, preferably. Is about 8 mol / l. Guanidine is usually used as an acid addition salt of guanidine such as guanidine hydrochloride.
上記のようにして封入体の可溶化を行うか、 菌体を変性剤で直接可溶化するか 、 または細胞を破砕後変性剤で可溶化した後、 遠心分離等で不純物を除去し、 得 られた上澄液を必要により精製工程に付した後、 Z AQリガンドのリフォールデ イング （活性化、 再生化） を行う。  The inclusion body is solubilized as described above, the cells are directly solubilized with a denaturing agent, or the cells are crushed and then solubilized with a denaturing agent. If necessary, subject the supernatant to a purification step, and then refold (activate and regenerate) the ZAQ ligand.
リフォーノレデイングは、 精製した ZAQリガンドにレドックスバッファーを添 加するか、 または Z A Qリガンドを含有する上澄液をレドックスバッファーで希 釈することにより行われる。  Reforno-reding is performed by adding a redox buffer to the purified ZAQ ligand or diluting the supernatant containing the ZAQ ligand with the redox buffer.
レドックスバッファ一としては、 酸化型ダルタチオン （GS SG) および還元 型ダルタチオン （GSH) を含有する緩衝液、 システィンおよびシスチンを含有 する緩衝液、 システアミンおよびシスタミンを含有する緩衝液などが挙げられる 。 中でも GS SGおよび GSHを含有する緩衝液が好まし 、。 上記緩衝液として は、 例えば、 トリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 クェン酸緩衝液等が挙 げられ、 中でもトリス緩衝液等が好ましい。  Examples of the redox buffer include a buffer containing oxidized daltathione (GSSG) and reduced daltathione (GSH), a buffer containing cysteine and cystine, and a buffer containing cysteamine and cystamine. Among them, buffers containing GS SG and GSH are preferred. Examples of the buffer include a Tris buffer, a phosphate buffer, an acetate buffer, a citrate buffer and the like, and among them, a Tris buffer and the like are preferable.
レドックスバッファ一中の酸化剤 （酸化型物質） および還元剤 （還元型物質） の濃度は、 例えば、 それぞれ 0. 01〜100ミリモル Zリッ トルおよび 0. 0 1〜： L 00ミリモル Zリットルである。 より具体的には、 0330ぉょぴ&311 を用いる場合、 レドックスバッファ一中の GS SGの濃度は 0. 01〜100ミ リモル Zリットル、 好ましくは 0. 1〜10ミリモル/リットル、 好ましくは 0 . 1〜1. 0ミリモル リットルが用いられ、 GSHの濃度は 0. 01〜： 100 ミリモル Zリ ットル、 好ましくは 0. 1〜 10ミリモル Zリットル、 好ましくは The concentrations of the oxidizing agent (oxidized substance) and the reducing agent (reduced substance) in the redox buffer are, for example, 0.01 to 100 mmol Z liter and 0.01 to: L 00 mmol Z liter, respectively. . More specifically, when using 0330 chips & 311, the concentration of GS SG in the redox buffer is 0.01 to 100 millimoles, preferably 0.1 to 10 millimoles / liter, and preferably 0.1 to 10 millimoles / liter. 1-1.0 millimoles are used, the concentration of GSH is 0.01-: 100 millimoles Z liter, preferably 0.1-10 millimoles Z liter, preferably
0. 2〜2. 0ミリモル/リットルが用いられる。 0.2-2.0 mmol / l are used.
この際、 たとえばメルカプト基を有さないァミノ酸などをレドックスバッファ 一にさらに含有させておくことが好ましい。 Z AQリガンドを含有する上澄液を レドックスバッファーで希釈する場合、 変性剤の濃度を活性ィ匕に適した中性 pH において不作用濃度まで希釈することが好ましい。 たとえば変性剤としてグアジ ニンを使用する場合、 希釈液中のグァニジンの濃度を 0〜2. 0モノレ Zリッ トル 、 好ましくは約 1モル /リットル以下まで、 変性剤として尿素を使用する場合、 希釈液中の尿素の濃度を 0〜 4. 0モル/リットル、 好ましくは約 2モル リッ トル以下まで希釈することが望ましい。 In this case, it is preferable that, for example, an amino acid having no mercapto group is further contained in the redox buffer. Supernatant containing AQ ligand When diluting with a redox buffer, it is preferable to dilute the denaturant to a non-active concentration at a neutral pH suitable for activation. For example, when guanidine is used as a denaturant, the concentration of guanidine in the diluent is 0 to 2.0 monoliters, preferably about 1 mol / liter or less.When urea is used as a denaturant, the diluent is used. It is desirable to dilute the concentration of urea in the solution to 0 to 4.0 mol / l, preferably to about 2 mol liter or less.
上記メルカプト基を有さないアミノ酸としては、 本発明の目的が達成される限 り、 メルカプト基を有さないアミノ酸であればいずれのものでもよいが、 アルギ ニン、 ァスパラギン酸、 パリン、 リジン、 ァラニン、 シトルリン等が挙げられる 。 アルギニン等が Z AQリガンド類のリフォールディングにおける収率の点で好 ましい。 レドックスバッファ一中の該アミノ酸の添加濃度は、 0. 1〜1. 0モ ル Zリットル、 好ましくは 0. 2〜0. 8モル/リットルである。  As the amino acid having no mercapto group, any amino acid having no mercapto group may be used as long as the object of the present invention is achieved, and arginine, aspartic acid, palin, lysine, and alanine And citrulline. Arginine and the like are preferred in terms of yield in refolding of ZAQ ligands. The concentration of the amino acid added to the redox buffer is 0.1 to 1.0 mol / liter, preferably 0.2 to 0.8 mol / liter.
上記リフォーノレデイングに当っての温度は 0〜 30°C、 好ましくは 4〜15°C である。 pHは 7〜9、 好ましくは ρΗ7· 5〜8. 5である。 リフォールディ ングに要する時間は通常 0. 5〜7日間、 好ましくは 1〜3日間、 さらに好まし くは 1〜2日間である。  The temperature for the above reforming is 0 to 30 ° C, preferably 4 to 15 ° C. The pH is 7-9, preferably ρΗ7.5-8.5. The time required for the refolding is usually 0.5 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 1 to 2 days.
なお、 可溶化後かつリフォールデイングの前に、 例えば抽出、 塩析、 透析、 分 配、 結晶化、 再結晶、 ゲルろ過、 クロマトグラフィー等の公知で常用の精製工程 を導入することができ、 好ましくは、 たとえば 0. 1モル/リットル リン酸緩 衝液中セフアデックス （S e p h a d e x) G- 25 (アマシャム フアルマシ 了 バイオテク （株） ） にかけることにより精製することができる。 変性剤の分 離は場合により 0. 1モル Zリットル リン酸緩衝液に対して透析することによ つても可能である。  Note that, after solubilization and before refolding, known and commonly used purification steps such as extraction, salting-out, dialysis, distribution, crystallization, recrystallization, gel filtration, and chromatography can be introduced. Preferably, it can be purified, for example, by applying to Sephadex G-25 (Amersham Pharmacy Biotech) in a 0.1 mol / liter phosphate buffer solution. Separation of the denaturing agent can also be performed by dialyzing against a 0.1 mol Z liter phosphate buffer in some cases.
精製工程はリフォールディングに続いて行うこともできる。 一般にそのような 精製としては例えば抽出、 塩析、 透析、 分配、 結晶化、 再結晶、 ゲルろ過、 クロ マトグラフィ一等が挙げられ、 好ましい例として透析や、 たとえば SP—セファ ロース （アマシャム フアルマシア バイオテク （株） ） 、 CM—5PW (トー ソー （株） ) あるいは、 DEAE— 5PW (トーソー （株） ) を介したイオン交 換クロマトグラフィー、 たとえば C 4 P— 50 (昭和電工 （株） ） を用いた逆相 クロマトグラフィ一等による精製法が挙げられる。 The purification step can also be performed following refolding. Generally, such purification includes, for example, extraction, salting-out, dialysis, partitioning, crystallization, recrystallization, gel filtration, chromatography, and the like. Preferred examples include dialysis and, for example, SP-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech)). Ion exchange chromatography via CM-5PW (Tosoh Corporation) or DEAE-5PW (Tosoh Corporation), for example, C4P-50 (Showa Denko Corporation) Reversed phase A purification method by chromatography or the like can be mentioned.
本発明で得られる Z AQリガンド （活性型 Z AQリガンド） は、 真核細胞から 得られる Z A Qリガンドと同様の作用を有しており、 真核細胞から得られる Z A Qリガンドの使用方法と同様にして用いることができる。  The ZAQ ligand (active ZAQ ligand) obtained in the present invention has the same action as the ZAQ ligand obtained from eukaryotic cells, and is used in the same manner as the method of using the ZAQ ligand obtained from eukaryotic cells. Can be used.
即ち、 Z A Qリガンドは腸管の収縮などを制御する活性を有し、 Z AQリガン ドをコードする D N A等が欠損している場合あるいは発現量が異常に減少してい る場合、 例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など ) 等、 種々の疾病が発症する。  That is, ZAQ ligand has an activity of controlling intestinal contraction and the like, and when DNA encoding ZAQ ligand is deficient or expression level is abnormally decreased, for example, gastrointestinal diseases ( For example, various diseases such as enteritis, diarrhea, constipation, and malabsorption syndrome occur.
したがって、 本発明の製造方法で得られる Z A Qリガンドは、 例えば、 消化器 疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） 等、 種々の疾病の治療 Therefore, the ZAQ ligand obtained by the production method of the present invention is useful for treating various diseases such as digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
•予防剤等の医薬として使用することができる。 • Can be used as a medicine such as a prophylactic agent.
例えば、 生体内において Z A Qリガンドが減少あるいは欠損しているために、 Z A Qレセプターが発現している細胞における情報伝達が十分に、 あるいは正常 に発揮されない患者がいる場合に、 Z A Qリガンドを該患者に投与すること等に よって、 該患者における Z A Qリガンドの役割を十分に、 あるいは正常に発揮さ せることができる。  For example, when there is a patient in whom ZAQ receptor expression is insufficient or normal in cells where ZAQ receptor is expressed due to decreased or defective ZAQ ligand in vivo, ZAQ ligand is administered to the patient. By doing so, the role of the ZAQ ligand in the patient can be sufficiently or normally exerted.
Z A Qリガンドを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。  When the ZAQ ligand is used as a therapeutic or prophylactic agent as described above, it should be purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more. Is preferred.
Z A Qリガンドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 ェ リキシル剤、 マイクロカプセル剤等として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤等の注射剤の形で非 経口的に使用できる。 例えば、 Z A Qリガンドを生理学的に認められる担体、 香 味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤等とともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。  ZAQ ligands can be used, for example, as orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally in sugar coating, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections such as solutions or suspensions. For example, mixing ZAQ ligand with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in the unit dosage form generally required for the practice of the formulation It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸等のような膨化剤 、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンの ような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリーのような香味剤等が用 いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに 油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射 用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油等のような天然産出植物油 等を溶解または懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウム等 ) 等が挙げられ、 適当な溶解捕助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール 等） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコー ル等） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 80™、 HCO-50 等） 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が挙げら れ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等と併用してもよ レヽ。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液等） 、 無痛 化剤 （例えば、 塩ィ匕ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力イン等） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコール等） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノール等） 、 酸ィ匕防止剤等と配合してもよい。 調製された注射 液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and gum arabic; Excipients such as sesame, leavening agents such as corn starch, gelatin, alginic acid, etc., lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, peppermint, cocoa oil or tea. Flavoring agents are used. When the unit dosage form is a capsule, the above type of material may further contain a liquid carrier such as oil and fat. A sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil. Examples of aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing pudose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). In combination with auxiliaries, for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 ™, HCO-50, etc.) Is also good. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent. In addition, buffers (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (for example, Shiridani benzalkonium, proforce hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.) ), A preservative (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), an antioxidant, and the like. The prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えばヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥ マ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して投与することができる。  The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys, etc.). ) Can be administered.
ZAQリガンドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルート等により差異は あるが、 例えば、 消化器疾患の治療目的で ZAQリガンドを経口投与する場合、 一般的に成人 （60 k gとして） においては、 一日につき ZAQリガンドを約 1 mg〜1000nig、 好ましくは約 10〜500mg、 より好ましくは約 10〜 200m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 ZAQリガンドのペプチドの 1回投与量は投与対象、 対象疾患等によっても異なるが、 例えば、 消化器疾患の 治療目的で Z AQリガンドを注射剤の形で成人 （体重 60 k gとして） に投与す る場合、 一日につき ZAQリガンドを約 1〜： L 00 Omg程度、 好ましくは約 1 〜20 Omg程度、 より好ましくは約 10〜10 Omg程度を患部に注射するこ とにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算 した量を投与することができる。 The dosage of the ZAQ ligand varies depending on the target disease, the administration target, the administration route, and the like. For example, when the ZAQ ligand is orally administered for the purpose of treating digestive diseases, it is generally required for an adult (60 kg). About 1 mg to 1000 nig, preferably about 10 to 500 mg, more preferably about 10 to 200 mg of ZAQ ligand is administered per day. In the case of parenteral administration, the single dose of the ZAQ ligand peptide varies depending on the administration target, target disease, etc. For example, for the purpose of treating gastrointestinal diseases, ZAQ ligand is administered to adults ( Weighing 60 kg) In this case, it is convenient to administer the ZAQ ligand per day by injecting about 1 to about L00 Omg, preferably about 1 to 20 Omg, more preferably about 10 to 10 Omg to the affected area. is there. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
本発明明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合 、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該 分野における' 用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 また、 アミノ酸 に関し光学異性体がありうる場合は、 特に明示しなければ L—体を示すものとす る。  In the drawings of the present specification, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When there is an optical isomer for an amino acid, the L-isomer is indicated unless otherwise specified.
DNA ：相補的デォキシリボ核酸  DNA: complementary deoxyribonucleic acid
A ：アデニン  A: Adenine
T ：チミン  T: Thymine
G ：グァニン  G: Guanin
C ： シトシン  C: Cytosine
RNA ： リボ核酸  RNA: ribonucleic acid
mRNA ：伝令リポ核酸 mRNA: messenger liponucleic acid
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸  EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SD S ： ドデシル硫酸ナトリウム  SD S: Sodium dodecyl sulfate
DTT ：ジチオスレィトール  DTT: Dithiothreitol
G 1 y (G) ： グリシン  G 1 y (G): glycine
A 1 a (A) ：ァラニン  A 1 a (A): Aranine
V a 1 (V) ： ノくジン  V a 1 (V):
L e u (L) ： ロイシン  Leu (L): Leucine
I 1 e (I) ：イソロイシン  I 1 e (I): Isoleucine
S e r (s) ：セリン  S e r (s): Serine
Th r (T) ： スレオニン  Th r (T): Threonine
C y s (C) ： システィン  Cys (C): Sistine
Me t (M) ：メチォニン  Me t (M): Methionin
G 1 u (E) ：グノレタミン酸 As (D) ： ァスパラギン酸 G 1 u (E): gnoretamic acid As (D): Aspartic acid
L y s (K) ： リジン  L y s (K): lysine
A r g (R) ： ァノレギニン  A r g (R): Anoreginin
H i s (H) ： ヒスチジン  H is (H): histidine
P h e (F) ： フエ二ルァラニン  P he (F): feniralanin
T y r (Y) ： チロシン  T y r (Y): Tyrosine
T r p (w) ： トリブトファン  T r p (w): Tribute fan
P r o (P) ： プロリン  Pro (P): Proline
A s n (N) ： ァスパラギン  A s n (N): Asparagine
G 1 n (Q) ： グルタミン  G 1 n (Q): Glutamine
A s x ： A s +A s n  A s x: A s + A s n
G 1 x ： G 1 u+G 1 n 本明細書の酉 s列表の配列番号は、 以下の配列を示す。  G 1x: G 1 u + G 1 n The sequence numbers in the rooster s column table in the present specification indicate the following sequences.
〔配列番号： 1〕  [SEQ ID NO: 1]
ZAQレセプターのアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of the ZAQ receptor.
〔配列番号： 2〕  [SEQ ID NO: 2]
ZAQレセプターをコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQC) 。  The nucleotide sequence of the DNA encoding the ZAQ receptor is shown (ZAQC).
〔配列番号： 3〕  [SEQ ID NO: 3]
ZAQレセプターをコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQT) 。  Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the ZAQ receptor (ZAQT).
〔配列番号： 4〕  [SEQ ID NO: 4]
参考例 1で用いられたプライマ— ZAQC S a 1の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of the primer ZAQC Sa1 used in Reference Example 1.
〔配列番号： 5〕  [SEQ ID NO: 5]
参考例 1で用いられたプライマ— ZAQC S p eの塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of the primer ZAQC Spe used in Reference Example 1.
〔配列番号： 6〕  [SEQ ID NO: 6]
参考例 2で精製された Z A Q活性化ぺプチドの N末端のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 7〕  3 shows the amino acid sequence of the N-terminal of the ZAQ-activated peptide purified in Reference Example 2. [SEQ ID NO: 7]
参考例 3で用いられたプライマ一 Z F 1の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of primer ZF1 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 8〕 参考例 3で用いられたプライマー ZF 2の塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 8] 7 shows the nucleotide sequence of primer ZF2 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 9〕  [SEQ ID NO: 9]
参考例 3で用いられたプライマー ZF 3の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of primer ZF3 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 10〕  [SEQ ID NO: 10]
参考例 3で得られたヒト型 ZAQリガンドペプチドをコードする DNAの 3， 端塩基配列を示す。  3 shows the base sequence at the 3 'end of DNA encoding the human ZAQ ligand peptide obtained in Reference Example 3.
〔配列番号： 11〕  [SEQ ID NO: 11]
参考例 3で用いられたプライマー ZAQL— CFの塩基配列を示す。  The base sequence of primer ZAQL-CF used in Reference Example 3 is shown.
〔配列番号： 12〕  [SEQ ID NO: 12]
参考例 3で用いられたプライマー ZAQL— XR 1の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of primer ZAQL—XR1 used in Reference Example 3.
〔配列番号： 13〕  [SEQ ID NO: 13]
参考 4で得られた D N A断片の塩基配列を示す。  The base sequence of the DNA fragment obtained in Reference 4 is shown.
〔配列番号： 14〕  [SEQ ID NO: 14]
参考例 4で得られた D N A断片の塩基配列を示す。  7 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in Reference Example 4.
〔配列番号： 15〕  [SEQ ID NO: 15]
ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand precursor peptide.
〔配列番号： 16〕  [SEQ ID NO: 16]
配列番号： 15で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードす る D N Aの塩基配列を示す。  This shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 15.
〔配列番号： 17〕  [SEQ ID NO: 17]
ヒト型 Z AQリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand precursor peptide.
〔配列番号： 18〕  [SEQ ID NO: 18]
配列番号： 17で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードす る D N Aの塩基配列を示す。  This shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 17.
〔配列番号： 19〕  [SEQ ID NO: 19]
ヒト型 ZAQリガンドのァミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand.
〔配列番号： 20〕  [SEQ ID NO: 20]
配列番号： 19で表わされるヒト型 ZAQリガンドをコードする cDNAの塩 基配列を示す。 〔配列番号： 21〕 This shows the base sequence of cDNA encoding the human ZAQ ligand represented by SEQ ID NO: 19. [SEQ ID NO: 21]
ヒト型 ZAQリガンドのアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand.
〔配列番号： 22〕  [SEQ ID NO: 22]
配列番号： 21で表わされるヒト型 Z AQリガンドをコードする c DNAの塩 基配列を示す。  This shows the base sequence of cDNA encoding the human ZAQ ligand represented by SEQ ID NO: 21.
〔配列番号： 23〕  [SEQ ID NO: 23]
参考例 4 (4- 1) で用いられた DN A断片の塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of the DNA fragment used in Reference Example 4 (4-1) is shown.
〔配列番号： 24〕  [SEQ ID NO: 24]
実施例 1で用いられた DN A断片 # 1の塩基配列を示す。  1 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 1 used in Example 1.
〔配列番号： 25〕  [SEQ ID NO: 25]
実施例 1で用いられた D N A断片 # 2の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 2 used in Example 1.
〔配列番号： 26〕  [SEQ ID NO: 26]
実施例 1で用いられた DN A断片 # 3の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 3 used in Example 1.
〔配列番号： 27〕  [SEQ ID NO: 27]
実施例 1で用いられた D N A断片 # 4の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 4 used in Example 1.
〔配列番号： 28〕  [SEQ ID NO: 28]
実施例 1で用いられた DN A断片 # 5の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 5 used in Example 1.
〔配列番号： 29〕  [SEQ ID NO: 29]
実施例 1で用いられた DNA断片 # 6の塩基配列を示す。  2 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 6 used in Example 1.
〔配列番号： 30〕  [SEQ ID NO: 30]
ヒト型 B V 8のアミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human BV8.
〔配列番号： 31〕  [SEQ ID NO: 31]
配列番号： 30で表わされるヒト型 B V 8をコードする c DNAの塩基配列を 示す。  This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human BV8 represented by SEQ ID NO: 30.
〔配列番号： 32〕  [SEQ ID NO: 32]
実施例 2— 1で用いられた DNA断片 # 1の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 1 used in Example 2-1.
〔配列番号： 33〕  [SEQ ID NO: 33]
実施例 2― 1で用いられた D N A断片 # 2の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 2 used in Example 2-1.
〔配列番号： 34〕 実施例 2— 1で用いられた DN A断片 # 3の塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 34] 3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 3 used in Example 2-1.
〔配列番号： 35〕  [SEQ ID NO: 35]
実施例 2— 1で用いられた D N A断片 # 4の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 4 used in Example 2-1.
〔配列番号： 36〕  [SEQ ID NO: 36]
実施例 2— 1で用いられた D N A断片 # 5の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 5 used in Example 2-1.
〔配列番号： 37〕  [SEQ ID NO: 37]
実施例 2— 1で用いられた D N A断片 # 6の塩基配列を示す。  3 shows the nucleotide sequence of DNA fragment # 6 used in Example 2-1.
〔配列番号： 38〕  [SEQ ID NO: 38]
配列番号： 21で表わされるヒト型 ZAQリガンドをコードする合成 DN Aの 塩基配列を示す。  The nucleotide sequence of a synthetic DNA encoding the human ZAQ ligand represented by SEQ ID NO: 21 is shown.
〔配列番号： 39〕  [SEQ ID NO: 39]
配列番号： 30で表わされるヒト型 B V 8をコードする合成 DNAの塩基配列 を示す。  This shows the base sequence of a synthetic DNA encoding human BV8 represented by SEQ ID NO: 30.
〔配列番号： 40〕  [SEQ ID NO: 40]
ヒト型 B V 8前駆体ぺプチドのァミノ酸配列を示す。  2 shows the amino acid sequence of human BV8 precursor peptide.
〔配列番号： 41〕  [SEQ ID NO: 41]
ヒト型 B V 8前駆体ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。 後述の参考例 1で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia coli ) DH5 α/ρ CR 2. 1— ZAQCは、 平成 1 1 (1999) 年 8月 23日力 ら、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 85 66) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産 業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) に寄託番号 FERM BP— 6855として、 平成 11 (1999) 年 8月 4日力、ら、 日本国大阪府 大阪市淀川区十三本町 2— 17-85 財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託 番号 I FO 16301として寄託されている。  The nucleotide sequence of the DNA encoding the human BV8 precursor peptide is shown. The transformant Escherichia coli DH5α / ρCR2.1—ZAQC obtained in Reference Example 1 described below was obtained from Tsukuba, Ibaraki, Japan, on August 23, 1999 by Riki et al. Higashi 1-chome No. 1 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-85 66) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) Deposit number FERM BP-6855, August 4, 1999 Riki, et al., 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan Deposit number with Fermentation Research Institute (IFO) Deposited as IFO 16301.
後述の参考例 1で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia coli ) DH5 α/ CR 2. 1— ZAQTは、 平成 1 1 (1999) 年 8月 23日 から日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 85 66) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産 業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) 独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM BP— 6856とし て、 平成 1 1 (1 999) 年 8月 4日から財団法人 '発酵研究所 （I FO) に寄 託番号 I FO 16302として寄託されている。 The transformant Escherichia coli DH5α / CR2.1—ZAQT obtained in Reference Example 1 described below has been used since August 23, 1999, at 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan Address 1 Central No. 6 (Postal code 305—85 66) Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (formerly Ministry of International Trade and Industry) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) Deposited with Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited with the 'Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO 16302 as F ERM BP-6856 since August 4, 1999.
後述の参考例 3で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia coli ) TOP 10/pHMI TAは、 平成 12 ( 2000 ) 年 7月 13日から日本 国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省 ェ 業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) 独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 721 9として、 平成 12 (2000) 年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番号 I FO 16440として寄託されている。  The transformant Escherichia coli TOP10 / pHMITA obtained in Reference Example 3 described below has been used since July 13, 2000, 1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) Patent, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited with the Depositary No. FERM BP-7219 at the Organisms Depositary Center and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO 16440 since May 26, 2000.
後述の参考例 3で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia coli ) TOP 10/pHMI TGは、 平成 12 (2000) 年 7月 13日から日本 国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省 ェ 業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) 独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 7220として、 平成 12 (2000) 年 5月 26日から財団法人 ·発酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16441として寄託されている。  The transformant Escherichia coli TOP 10 / pHMI TG obtained in Reference Example 3 described below has been used since July 13, 2000, 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) Patent, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited with the Depositary No. FERM BP-7220 under the deposit number IFO 16441 on May 26, 2000, at the Institute of Fermentation (IFO).
後述の実施例 1で取得されたェシェリヒア コリ （Escherichia coli) MM 2 94 (DE 3) Zp TC h 1 ZAQは、 平成 13 ( 2001 ) 年 4月 27日から 、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856 6) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業 省 工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) 独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 F ERM BP— 7571として 、 平成 13 (2001) 年 1月 16日から受託番号 I FO 16527として財 団法人発酵研究所 （I FO) に寄託されている。 後述の実施例 2で取得されたェシェリヒア コリ （Escherichia coli) MM 2 94 (DE 3) /pTCh 2 ZAQは、 平成 13 (2001) 年 4月 27日から 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566 ) 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに寄託番号 FERM BP— 7572として、 平成 13 (2001) 年 3月 15日から受託番号 I FO 16587として財団 法人発酵研究所 (I FO) に寄託されている。 実施例 Escherichia coli MM 2 94 (DE 3) Zp TC h 1 ZAQ obtained in Example 1 described below was obtained from Tsukuba East 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan from April 27, 2001. No. 1 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-856 6) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NI BH)) It has been deposited with the Institute of Fermentation Research (IFO) under the deposit number F ERM BP-7571 as the deposit number IFO 16527 since January 16, 2001 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Escherichia coli MM 294 (DE 3) / pTCh 2 ZAQ obtained in Example 2 described below was obtained from April 27, 2001 at 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-8566) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited with the Institute for Fermentation of Japan (IFO) under the deposit number FERM BP-7572 as the deposit number IFO 16587 on March 15, 2001 as the deposit number IFO 16587. Example
以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的に説明するが、 本発 明はこれらに制限されるものではない。  The present invention will be described more specifically with reference to the following Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.
ZAQレセプターをコードする cDNAのクローユングと塩基配列の 決定 Cloning of cDNA encoding ZAQ receptor and determination of nucleotide sequence
ヒト脳下垂体 cDNA (CLONTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー 、 プライマー 1 (5，一 GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3' ；配列番号： 4) 及びプライマー 2 (5'- ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC -3， ；配列番号： 5) を用いて PGR反応を 行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAの 10分の 1量を铸型とし て使用し、 Advantage2 Polymerase Mix ( C L O N T E C H社） 1 / 50量、 プライマー 1及ぴプライマー 2を各 0.2μΜ， dNTPs 200 μΜ、 及ぴ酵素に添付の バッファーを加え、 25μ1の液量とした。 PCR反応は、 94°C ' 2分の後、 9 4°C ' 20秒、 72°C · 100秒のサイクルを 3回、 94°C · 20秒、 68°C · 100秒のサイクルを 3回、 94 °C · 20秒、 64 °C · 20秒、 68 °C · 100 秒のサイクルを 38回繰り返し、 最後に 68°C * 7分の伸長反応を行った。 該 P CR反応後の反応産物を TAクローニングキット （Invitrogen社） の処方に従い プラスミドベクター pCR2.1 (Invitrogen社） へサブクローニングした。 これを大 腸菌 DH5 αに導入し、 cDNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天 培地中で選択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 Gタンパク質 共役型レセプタータンパク質をコードする 2種類の c DNA配列ZAQC (配列 番号： 2) 及び ZAQT (配列番号： 3) を得た。 この cDNAより導き出され るアミノ酸配列を有するタンパク質はいずれも同一配列 （配列番号： 1) を有し たため ZAQと命名し、 配列番号： 2で表される DNAを含有する形質転換体を 大腸菌 （Escherichia coli) DH5 o;/pCR2.1- ZAQCならびに配列番号： 3で表され る DNAを含有する形質転換体を大腸菌 DH5 a/pCR2.1- ZAQTと命名した。 参考例 2 ZAQレセプターを活性化するペプチドの単離 The human pituitary gland cDNA (CLONTECH) was designated as type II, and two primers, primer 1 (5, one GTC GAC ATG GAG ACC ACC ATG GGG TTC ATG G-3 '; SEQ ID NO: 4) and primer 2 (5 PGR reaction was performed using '-ACT AGT TTA TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC-3;; SEQ ID NO: 5). The composition of the reaction solution used in the reaction was 1/10 of the above cDNA as type III, 1/50 amount of Advantage2 Polymerase Mix (CLONTECH), primer 1 and primer 2 were each 0.2 μl, dNTPs 200 The attached buffer was added to μΜ and the enzyme to make a liquid volume of 25 μl. The PCR reaction is performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by three cycles of 94 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 100 seconds, and three cycles of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 100 seconds. The cycle of 94 ° C for 20 seconds, 64 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 100 seconds was repeated 38 times, and the extension reaction was finally performed at 68 ° C for 7 minutes. The reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the procedure of a TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5α, and a clone containing cDNA was transformed into LB agar containing ampicillin. After selection in the medium, the sequences of the individual clones were analyzed and two cDNA sequences, ZAQC (SEQ ID NO: 2) and ZAQT (SEQ ID NO: 3), encoding a novel G protein-coupled receptor protein were obtained. Was. Since all the proteins having the amino acid sequence derived from this cDNA had the same sequence (SEQ ID NO: 1), they were named ZAQ, and the transformant containing the DNA represented by SEQ ID NO: 2 was transformed into Escherichia coli (Escherichia). coli) DH5 o; /pCR2.1- ZAQC and SEQ ID NO: transformants containing been Ru DNA that represented by 3 was designated E. coli DH5 a /pCR2.1- ZAQT. Reference Example 2 Isolation of peptide that activates ZAQ receptor
(2-1) 牛乳抽出液の調製  (2-1) Preparation of milk extract
市販の低温殺菌牛乳を用いて、 以下の操作を行い抽出液を調製した。 牛乳 2 li terを高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立株式会社） を用いて、 10， 000 r pm、 15分間、 4°Cで遠心し、 得られた上清をガーゼでろ過し、 脂質片を取り除い た。 上清に最終濃度 1 Mになるように酢酸を加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで 高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立株式会社） を用いて 10， 000 rpm、 15 分間遠心し上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 上清に撹拌しながら 2倍容 のアセトンを加え 4°Cにて 3時間攪拌した。 次いで高速遠心機 （CR26H、 R10A型口 一ター： 日立株式会社） を用いて 10, 000 rpm、 15分間遠心後、 得られた上清をガ ーゼでろ過し不溶物を除去した。 得られた上清を口一タリーェパポレーターにか け、 アセトンを除去し、 最終的に 1350 mlまで濃縮した。 得られた濃縮液を、 675 mlごとに 338 mlのジェチルエーテルと混合し、 分液ロート中にて激しく混和し 、 2相分離後、 水相を得た。 得られた水相について同じ操作をさらに 1回繰り返 し、 清澄な水相を得た。 得られた水相を、 ロータリーエバポレーターを用いて 80 0 mlまで濃縮し、 最終的な抽出液を得た。  Using commercially available pasteurized milk, the following operation was performed to prepare an extract. The milk 2 liters were centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C using a high-speed centrifuge (CR26H, R10A rotor: Hitachi, Ltd.), and the resulting supernatant was filtered with gauze. The lipid pieces were removed. Acetic acid is added to the supernatant to a final concentration of 1 M, and the mixture is stirred at 4 ° C for 30 minutes. Then, using a high-speed centrifuge (CR26H, R10A rotor: Hitachi, Ltd.), 10,000 rpm, 15 minutes After centrifugation, the supernatant was filtered with gauze to remove insolubles. To the supernatant was added 2 volumes of acetone while stirring, and the mixture was stirred at 4 ° C for 3 hours. Next, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes using a high-speed centrifuge (CR26H, R10A type: Hitachi, Ltd.), and the obtained supernatant was filtered with a gauze to remove insolubles. The obtained supernatant was applied to an orchid tarpaulin evaporator to remove acetone, and finally concentrated to 1350 ml. The obtained concentrate was mixed with 338 ml of getyl ether for every 675 ml, and mixed vigorously in a separating funnel to obtain a water phase after separation of two phases. The same operation was repeated once more for the obtained aqueous phase to obtain a clear aqueous phase. The obtained aqueous phase was concentrated to 800 ml using a rotary evaporator to obtain a final extract.
(2-2) 牛乳抽出液の C18逆相ク口マトグラフィ一による粗分画 (2-2) Crude fractionation of milk extract by C18 reversed-phase mouth chromatography
ォクタデシル基を固定したシリカゲルを充填したカラム Sep- Pak C18 (Waters 社） 10 gをメタノールで膨潤後、 1 M酢酸で平衡ィ匕した。 このカラムに、 （2— 1) で調製した抽出液 （牛乳 2 liter分） を添着した。 続いて、 このカラムに、 1 00 mlの 1 M酢酸を流しゲルを洗浄した。 次に、 このカラムに 200 mlの 60% ァセ トニトリル /0.1% トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗ペプチド成分を溶出し た。 得られた溶出液を、 エバポレーターを用いて濃縮した後、 凍結乾燥機 (12EL ； VirTis社） にて凍結乾燥した。 10 g of Sep-Pak C18 (Waters) column packed with silica gel having octadecyl groups immobilized thereon was swollen with methanol and then equilibrated with 1 M acetic acid. The extract (2 liters of milk) prepared in (2-1) was attached to this column. Then, in this column, 1 The gel was washed by flowing 00 ml of 1 M acetic acid. Next, 200 ml of 60% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid was passed through the column to elute the crude peptide component of interest. The obtained eluate was concentrated using an evaporator, and then freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
(2-3) 牛乳抽出液のスルホプロピルイオン交換クロマトグラフィ一による 粗分画 (2-3) Crude fraction of milk extract by sulfopropyl ion exchange chromatography
ポリプロピレン製のカラムに 100 mM塩酸中で膨潤させた SP Sephadex C-25 (Am ersham Pharmacia Biotech社） を、 容量が 2 mlになるよう充填し、 蒸留水及び 2 Mギ酸アンモニゥム（pH 4.0)で洗浄した後、 I液 （2 M ギ酸アンモユウム ： ァ セトュトリル：水 = 1:25:74) で平衡化した。 上記 （2— 2) で得られた凍結乾 燥物を I液 20 mlに溶解し、 SP Sephadex C - 252 mlにロードした。 I液 10 mlで 洗浄後、 II液 （2 M ギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:2.5:6.5) 、 III 液 （2 Mギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 = 1:1:2) 、 IV液 (2 M ギ酸ァ ンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:0.5:0.5) 各 10 mlで順次溶出した。 得られ た I液から IV液を、 それぞれ凍結乾燥機 (12EL； VirTis社） にて凍結乾燥した  A polypropylene column was packed with SP Sephadex C-25 (Amersham Pharmacia Biotech) swollen in 100 mM hydrochloric acid to a volume of 2 ml, and washed with distilled water and 2 M ammonium formate (pH 4.0). After that, the mixture was equilibrated with solution I (2 M ammonium formate: acetate: water = 1: 25: 74). The freeze-dried product obtained in the above (2-2) was dissolved in 20 ml of Solution I, and loaded on 252 ml of SP Sephadex C. After washing with 10 ml of solution I, solution II (2 M ammonium formate: acetonitrile: water = 1: 2.5: 6.5), solution III (2 M ammonium formate: acetonitrile: water = 1: 1: 2), solution IV (2 (Ammonium formate: acetonitrile: water = 1: 0.5: 0.5) Elution was performed at 10 ml each. The obtained solution I to solution IV were freeze-dried using a freeze dryer (12EL; VirTis).
(2-4) 牛乳抽出液の TSKgel 0DS80Ts逆相高速液体ク口マトグラフィ一による 分画 (2-4) Fractionation of milk extract by TSKgel 0DS80Ts reversed-phase high-performance liquid chromatography
TSKgel ODS- 80Ts逆相高速液体ク口マトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社 、 4.6 mm X 25 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢 酸/蒸留水） 容量 81.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し、 平衡ィヒした。 上記 （2— 3) で得られた I液から IV液の凍結乾燥 物を、 それぞれ 1 M酢酸 4 mlに溶解しクロマトグラフィー操作に処した。 即ち、 凍結乾燥物の溶液 4 mlを該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 67%/ B液容量 33% まで上昇させ、 次いで 40分間かけて A液容量 67%Z B液容量 33%から A液容量 0%ZB液容量 100%まで、 B液濃度を直線的グラジェ ントで上昇させた。 溶出液を、 1 mlずつフラクション番号をつけて分取し、 各フラクション 2 μ \ を 150 β ΐ の 0. 2% Bovine Serum Albumin (BSA) /蒸留水と混合し凍結乾燥した 。 この乾燥物を後述の （2— 5 ) に記した細胞内 Caイオン濃度上昇活性測定用の アツセィ用サンプルとした。 A TSKgel ODS-80Ts reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi Co., Ltd., 4.6 mm x 25 cm) was applied at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min to solution A (0.1% trifluoroacetic acid / Distilled water) Volume 81.7% / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) 8.3% volume was flowed and equilibrated. The freeze-dried product of Solution I to Solution IV obtained in (2-3) above was dissolved in 4 ml of 1 M acetic acid, respectively, and subjected to chromatography. That is, after 4 ml of the lyophilized solution was applied to the column, the volume of solution A was increased to 67% / the volume of solution B to 33% over 1 minute at a flow rate of 1 ml / min, and then the solution A over 40 minutes. Solution B concentration was increased in a linear gradient from 33% volume of 33% ZB solution to 100% of solution A volume of 0% ZB solution. The eluate was fractionated by assigning a fraction number to each 1 ml, and 2 μl of each fraction was mixed with 150 βΐ of 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) / distilled water and freeze-dried. The dried product was used as a sample for assay for measuring the activity of increasing the intracellular Ca ion concentration described in (2-5) below.
( 2 - 5 ) FLIPRを用いた細胞内 Caィオン濃度上昇活性の測定 (2-5) Measurement of intracellular Ca ion concentration increasing activity using FLIPR
ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。 すなわち、 参考例 1で得た D H5 a /pCR2. 1― ZAQCの 1クローンを、 アンピシリンを含む LB培地で振とう培養し 、 プラスミド pCR2. 1— ZAQCを得た。 これを制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理し、 ZAQCをコードするインサート部分を切り出した。 同様に制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで処理した pAKK0_ l. 11Hと、 該インサート部分を Ligation Express Kit ( CL ONTECH Laboratories, Inc. ( CA, USA ) ) を用いて連結し、 大腸菌 DH10B にエレクトロポーレーシヨン法にて導入した。 得られたクローンの有するプラス ミドの構造を、 制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、 正しい構築のものを CH 0細胞発現用プラスミ ド pAK— ZAQCとして使用した。  The ZAQ stable expression cell line was prepared as follows. That is, one clone of DH5a / pCR2.1-ZAQC obtained in Reference Example 1 was shake-cultured in an LB medium containing ampicillin to obtain a plasmid pCR2.1-ZAQC. This was treated with the restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert coding for ZAQC. Similarly, pAKK0_l.11H treated with restriction enzymes Sal I and Spe I and the insert were ligated using a Ligation Express Kit (CL ONTECH Laboratories, Inc. (CA, USA)) and electroporated into E. coli DH10B. Introduced by law. The structure of the plasmid contained in the obtained clone was confirmed by restriction enzyme treatment and sequence analysis, and a correctly constructed plasmid was used as a plasmid pAK-ZAQC for CH0 cell expression.
このプラスミド pAK— ZAQCを CH0/dhfr_細胞 （American Type Culture Collect ion) ίこ CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech社) 用レヽ て形質導入することにより取得した。 まず、 蒸留水 120 1に溶解したプラスミ ド DNA 4 に対して Buffer A (CellPhect Transfection Kitに添付） 120 μ ΐを 添加し、 撹拌し、 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect Transfection Kitに添付 ) 240 μ ΐを添加し、 激しく撹拌し該 DNAを含有する D N A—リン酸カルシウム複 合体を形成させた。 5 X 105個の CH0/ dhfr— 細胞を 60 mmシャーレに播き、 10% のゥシ胎児血清 （BIO WHITTAKER社） を含む Ham' s F- 12培地 （日水製薬株式会 社） 中で 37°C、 5%炭酸ガス中で 1 S間培養した後、 該 D N A—リン酸カルシゥ ム複合体の懸濁液 480 / lをシャーレの該細胞上に滴下させた。 これを、 37°C、 5 %炭酸ガス中にて 6時間培養した後、 血清を含まない Ham' s F- 12培地で 2回細 胞を洗浄し、 シャーレの該細胞上に 15%グリセロールを含む緩衝液（140 mM NaCl , 25 mM HEPES, 1. mM Na2P04, pH7. 1) 1. 2mlを添加し 2分間処理した。 これを 、 再度、 血清を含まない Ham' s F-12培地で 2回洗浄した後、 10%のゥシ胎児血清 を含む Ham' s F- 12培地中で 37°C、 5%炭酸ガス中でー晚培養した。 該細胞をトリ プシン処理により分散させてシャーレから回収し、 2 X 104個ずつ 6- well plate に植え込み、 透析済み 10%ゥシ胎児血清 (JRH BIOSCIENCES社） 、 1 mM MEM非必 須アミノ酸溶液 （大日本製薬株式会社） 、 100 units/ml Penicillinゝ 100 μ g/m 1 Streptomycinを含む Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) 培地 (日水 製薬株式会社） 中にて 37°C、 5%炭酸ガス中にて培養を開始した。 プラスミ ドの 導入された形質転換 CH0細胞は該培地中で生育するが、 非導入細胞は次第に死滅 していくので、 培養開始 1日目、 および 2日目に培地を交換して死滅細胞を除去し た。 培養開始 8 - 1 0日後に生育してきた形質転換 CH0細胞のコロニーを約 21個選 んだ。 それぞれ選択された細胞から RNAを市販の RNA単離用キットを用いて回収 し、 以降公知の RT- PCR法により ZAQを高発現する ZAQ発現 CH0細胞 B- 1番クローン（ 以後 ZAQC - B1細胞と略称する）を選別した。 This plasmid pAK- ZAQC obtained by introducing transformed Te Rere for CH0 / dhfr _ cells (American Type Culture Collect ion) ί This CellPhect Transfection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). First, add 120 μΐ of Buffer A (attached to CellPhect Transfection Kit) to plasmid DNA 4 dissolved in distilled water 1201, stir and let stand for 10 minutes, then Buffer B (attached to CellPhect Transfection Kit) 240 μl was added, and the mixture was vigorously stirred to form a DNA-calcium phosphate complex containing the DNA. 5 x 10 5 CH0 / dhfr- cells were seeded on a 60 mm Petri dish and placed in Ham's F-12 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal calf serum (BIO WHITTAKER). After culturing for 1 S in 5% carbon dioxide gas at 5 ° C., 480/1 of the suspension of the DNA-calcium phosphate complex was dropped on the cells in a petri dish. After culturing the cells at 37 ° C in 5% carbon dioxide for 6 hours, the cells were washed twice with serum-free Ham's F-12 medium, and 15% glycerol was added to the cells in a petri dish. buffer (140 mM NaCl, 25 mM HEPES , 1. mM Na 2 P0 4, pH7. 1) comprising 1. the addition of 2ml were treated for 2 minutes. This was again washed twice with serum-free Ham's F-12 medium, then 10% fetal serum Was cultured in Ham's F-12 medium containing 5% CO 2 at 37 ° C. The cells were dispersed by trypsin treatment, collected from a Petri dish, and 2 × 10 4 cells were inoculated in a 6-well plate, dialyzed 10% fetal bovine serum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM non-essential amino acid solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 100 units / ml Penicillin ゝ 100 μg / m 1 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) medium containing Streptomycin (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° C, 5% carbon dioxide Culture was started in gas. Transformed CH0 cells into which the plasmid has been introduced grow in the medium, but non-transfected cells gradually die, so the medium is replaced on the first and second days of culture to remove dead cells. did. Approximately 21 colonies of transformed CH0 cells that had grown 8 to 10 days after the start of culture were selected. RNA is recovered from the selected cells using a commercially available RNA isolation kit, and ZAQ is highly expressed by the known RT-PCR method. ZAQ-expressing CH0 cell B-1 clone (hereinafter ZAQC-B1 cell) Abbreviated).
また、 対照として ETA (エンドセリン Aレセプター) 発現 CH0細胞 2 4番クロー ン （以後 ETA24細胞と略称する。 Journal of Pharmacology and Experimental Th erapeutics, 279卷、 675- 685頁、 1996年参照） を用いた。  As a control, ETA (endothelin A receptor) -expressing CH0 cell clone 24 (hereinafter abbreviated as ETA24 cell; see Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 279, pp. 675-685, 1996) was used.
上記 （2— 4 ) で得られたアツセィ用サンプルについて、 ZAQC- B1細胞及ぴ ETA 24細胞における細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定を FLIPR (Molecular Devices 社）を用いて行った。 ZAQC- B1細胞、 ETA24細胞共に 10%透析処理済ゥシ胎児血清 (以後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC - B1細胞 、 ETA24細胞をそれぞれ 15 X 104cells/mlとなるように培地（10% d FBS - DMEM)に 懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社）に分注器 を用いて各ゥエルに 200 ずつ植え込み（3. 0 X 104cells/200 i l/ゥエル）、 5% 〇02ィンキュベータ一中にて 37°Cで一晩培養した後用いた（以後細胞プレートとす る）。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9. 、 炭酸水素ナトリ ゥム 0. 35g、 HEPES 4. 77 g、 水酸化ナトリゥム溶液で pH7. 4に合わせた後、 フ ィルター滅菌処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 μ 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 2 00 / lを混合した。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2バイアル (50 μ g)を ジメチノレスノレフォキサイド 40 μ 1、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 /z lに溶角 し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピ ペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 ずつ分注し、 5 % C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートした（色素ローディン グ）。 上記 （2— 4 ) で得られたアツセィ用サンプルについて、 各フラクション に、 2. 5 mM Probenecid, 0. 2% BSAを含む H/HBSS 150 μ ΐを加えて希釈し、 FLI PR用 96穴プレート（V- Bottomプレート、 Coster社）へ移した（以後、 サンプルプレ 一トとする）。 細胞プレートの色素ローディング終了後、 ¾ ^33に2. 5 mM Proben ecidをカ卩えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Devices社）を 用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 μ ΐの洗浄バッファーを残した。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットしアツセィを行った（FLIP Rにより、 サンプノレプレートから 50 のサンプルが細胞プレートへと移される） その結果、 上記 （2— 3 ) IV液を上記 （2— 4 ) 逆相高速液体クロマトグラフ ィー分離して得られたフラクション No. 53に ZAQC-B1細胞に特異的な細胞内 Caィォ ン濃度上昇活性が見られた。 The activity of increasing the intracellular Ca ion concentration in ZAQC-B1 cells and ETA 24 cells was measured using the FLIPR (Molecular Devices) with respect to the samples for atsey obtained in the above (2-4). For both ZAQC-B1 cells and ETA24 cells, those that had been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS) were used. ZAQC-B1 cells and ETA24 cells are each suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at a concentration of 15 × 10 4 cells / ml and dispensed into a 96-well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Coster). implantation by 200 to each Ueru with vessels (3. 0 X 10 4 cells / 200 il / Ueru) were used after overnight culture at 37 ° C for a 5% Rei_0 2 Inkyubeta in one (hereinafter the cell plates ). H / HBSS (Nissy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9., sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, pH 7.4 with sodium hydroxide solution, then filter sterilization) 20 ml, 250 mM Probenecid 200 μl, and 200 f / l fetal serum (FBS) were mixed. Also, 2 vials (50 μg) of Fluo 3-AM (Dojindo Laboratories) were dissolved in 40 μl of dimethinoresolefoxide, 20% Pluronic acid (Molecular Probes) 40 / zl. In addition to the above H / HBSS—Probenecid—FBS, mix and mix Dispensed at each Ueru 100 the cell plate except the culture solution using a pet and incubated for 1 hour at 37 ° C for at 5% C0 2 incubator in one (dye Rodin grayed). For the atssay sample obtained in (2-4) above, dilute each fraction with 150 μH of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA, and use it in a 96-well plate for FLI PR. (V-Bottom plate, Coster) (hereinafter referred to as sample plate). After dye loading on the cell plate, wash the cell plate 4 times with a washing buffer containing 2.5 mM Proben ecid in ¾ ^ 33 using a plate washer (Molecular Devices), and wash 100 μΐ after washing. The buffer was left. The cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and assayed (50 samples were transferred from the sample plate to the cell plate by the FLIPR). As a result, the above (2-3) IV solution was transferred to the (2) — 4) Fraction No. 53 obtained by reversed-phase high-performance liquid chromatography showed an activity to increase intracellular Ca ion concentration specific to ZAQC-B1 cells.
( 2 - 6 ) TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製（1) TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式 会社、 0. 46 cm X 10 era) を、 40。Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0. 1% トリフル ォロ酢酸/蒸留水） 容量 81. 7%/B液 （0. 1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリ ル） 容量 8. 3%を流し平衡ィヒした。 上記 （3— 4 ) で得られたフラクション No. 53 についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション No. 53の溶液 1 m 1を該カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液容 量 25% まで上昇させ、 次いで 75分間かけて
Figure imgf000036_0001
液容量 33%まで、 Β 液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。 (2-6) Purification by TSKgel Super-Phenyl Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (1) A TSKgel Super-Phenyl Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography column (0.46 cm X 10 era, Tosoichi Co., Ltd.) . At C, at a flow rate of 1 ml / min, solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) capacity 81.7% / solution B (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) capacity 8.3 % To equilibrate. Chromatography was performed on the fraction No. 53 obtained in the above (3-4). That is, after applying 1 ml of the solution of fraction No. 53 to the column, the volume of solution A was increased to 75% / the volume of solution B at 25% over 1 minute at a flow rate of 1 ml / min, and then over 75 minutes. hand
Figure imgf000036_0001
The solution concentration was increased in a linear gradient to a solution volume of 33%.
溶出液を、 500 1ずつフラクション No.をつけて分取した。 分取フラクション より各 25 1づっ 0. 2% BSA 150 1と混合し凍結乾燥機 (12EL； VirTis社） で 凍結乾燥させた。 この乾燥物に、 2. 5 mM Probenecid, 0. 2% BSAを含む H/HBSS 150 μ \ を加えて溶解し、 この溶液 50 / lを用いて上記 （2—5 ) の試験法によ り、 細胞内 Caイオン濃度上昇活性を測定することにより、 ZAQC- B1細胞に対する レセプター活性ィヒ作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC - B1細胞に対する レセプター活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性ィヒ成分は、 主としてフ ラクシヨン No.103-105に溶出されていることが判明した。 (2-7) ¾3( 2/ 83>14.6/100逆相高速液体クロマトグラフィーにょる精 製 The eluate was fractionated with a fraction number of 500 1 each. From the fractionated fractions, each 25 1 was mixed with 0.2% BSA1501 and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). To this dried product, 150 μl of H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA was added and dissolved, and 50 / l of this solution was used according to the test method of (2-5) above. By measuring the intracellular Ca ion concentration increasing activity, ZAQC-B1 cells Receptor activity was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ-active component was mainly eluted in fraction No. 103-105. (2-7) ¾ 3 (2/83 > 14.6 / 100 Reversed-phase high-performance liquid chromatography)
AiRPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （Amersha m Pharmacia Biotech社、 0.46 cm x 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A 液 （ヘプタフルォロ酪酸/蒸留水） 容量 95%/B液 （0.1%ヘプタフルォロ酪酸/ 100% ァセトニトリル） 容量 5%を流し平衡化した。  AiRPC C2 / C18 ST 4.6 / 100 Reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Amersham Pharmacia Biotech, 0.46 cm x 10 cm) was applied at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min to liquid A (heptafluorobutyric acid / distilled). (Water) 95% volume / B solution (0.1% heptafluorobutyric acid / 100% acetonitrile) 5% volume was flowed to equilibrate.
上記 （ 2— 6 ) で得られた TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体ク口マトグラフ ィ一分取フラクションのうちフラクション No.103- 105をそのまま/ RPC C2/C18 S T 4.6/100逆相カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで 1分間で A液 （0.1% へ プタフルォロ酪酸/蒸留水） 容量 95%/B液 （0.1%ヘプタフルォロ酪酸/ 100% 了 セトニトリル） 容量 5%から A液容量 65%/B液容量 35%まで急速に上昇させ、 こ れを次に、 流速 1 ml/minで、 60分間かけて A液容量 50%/ B液容量 50% まで直 線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液は、 210 nmの紫外吸収で は単一なピークとして検出された。  Fraction No.103-105 of the TSKgel Super-Phenyl reversed-phase high-performance liquid chromatography fraction obtained from (2-6) above was directly applied to the RPC C2 / C18 ST 4.6 / 100 reversed-phase column. Solution A (0.1% heptafluorobutyric acid / distilled water) volume 95% / B (0.1% heptafluorobutyric acid / 100% cetonitrile) Volume 5% to 65% A volume at 1 ml / min flow rate for 1 minute / B volume rapidly increased to 35%, then eluted at a flow rate of 1 ml / min with a linear gradient to 50% A volume / 50% B volume over 60 min. The liquid was collected. The eluate was detected as a single peak at 210 nm UV absorption.
溶出液を、 500 μΐずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクション より各 10 μ1づっを 0.2% BSA 150 μΐと混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に、 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSAを含む H/HBS S 150 /zlを加えて溶解し、 この溶液 50 1を用いて上記 （3— 5) の試験法に より、 ZAQC-B1細胞に対するレセプター活性化作用を測定した。 その結果、 目的 とする ZAQC-B1細胞に対するレセプター活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ 活性化成分は、 フラクション No.82- 84に溶出されていることが判明した。 この活 性ピークは、 210 nmの紫外吸収ピークに完全に一致し、 単一ペプチドにまで精製 されたものと判断した。 The eluate was fractionated by assigning a fraction number of 500 μΐ, and each 10 μ 1 of each fraction was mixed with 150 μ % of 0.2% BSA and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). H / HBS S 150 / zl containing 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA was added to the dried product to dissolve the ZAQC-B1 cells using this solution 501 according to the test method described in (3-5) above. The receptor activating effect on was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fraction Nos. 82-84. This activity peak completely coincided with the ultraviolet absorption peak at 210 nm, and it was determined that the peptide had been purified to a single peptide.
(2-8) 精製された ZAQ活性化べプチドの構造解析 上記 （2— 7 ) で得られた ZAQ活性ィヒ成分について以下の方法で構造決定を実 施した。 ZAQ活性化成分精製標品中の溶媒を真空濃縮機 (サーバント) を用いて 除去し、 得られた乾固物を溶媒 DMS0 (ジメチルサルフォキシド）に溶解した。 この 溶液の一部をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems P rocise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N 末端のアミノ酸残基から 1 6番目のアミノ酸残基のうち、 1 4残基を同定するこ とができた （Ala Val lie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly (配列番号： 6 ； Xaaは未同定残基） ) 。 参考例 3 ヒト型 Z A Qリガンドぺプチドの cDNAのクローユング (2-8) Structural analysis of purified ZAQ-activated peptide The structure of the ZAQ active ingredient obtained in (2-7) above was determined by the following method. The solvent in the purified sample of the ZAQ activating component was removed using a vacuum concentrator (servant), and the obtained dried product was dissolved in the solvent DMS0 (dimethyl sulfoxide). A part of this solution was subjected to amino acid sequence analysis from the N-terminus using a protein sequencer (Perkin Elmer, PE Biosystems Procise 491cLC). As a result, 14 out of 16 amino acid residues from the N-terminal amino acid residue could be identified (Ala Vallie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly ( SEQ ID NO: 6; Xaa is an unidentified residue))). Reference Example 3 Cloning of cDNA for human ZAQ ligand peptide
参考例 2で得られた牛乳から精製された ZAQを活性化するべプチドの N末端ァ ミノ酸配列 （配列番号： 6 ) をクエリーとしてデータベースを Blast検索したとこ ろ、 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする D N Aの塩基配列と同等な配列を含むヒト EST 0W0467)を見出した。 本配列は完全長 のオープンリーディング ' フレームを有していなかつたので、 以下に RACE法によ り未確定部分の配列を明らかにし、 引き続いて完全長のオープンリーディング · フレームを有す cDNAクローンを取得した。  A Blast search of the database using the N-terminal amino acid sequence of the peptide that activates ZAQ purified from the milk obtained in Reference Example 2 (SEQ ID NO: 6) as a query shows that it is SEQ ID NO: 6. Human EST 0W0467) containing a sequence equivalent to the nucleotide sequence of DNA encoding a peptide having an amino acid sequence was found. Since this sequence did not have a full-length open reading frame, the sequence of the undetermined portion was determined by the RACE method, and a cDNA clone having the full-length open reading frame was obtained. did.
EST (X40467) の情報よりプライマー ZF1 (配列番号： 7 )、 ZF2 (配列番号： 8 ) と ZF3 (配列番号： 9 )を作成し、 ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA (CLONTECH社）を 鍚型として以下に記した 3' RACE実験を実施した。  Based on the information of EST (X40467), primers ZF1 (SEQ ID NO: 7), ZF2 (SEQ ID NO: 8) and ZF3 (SEQ ID NO: 9) were prepared, and human testis Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) was used as type III. The 3 'RACE experiment described in Section 2 was performed.
ZF1： 5' -GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (配列番号： 7 )  ZF1: 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
ZF2 : 5' -GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (配列番号： 8 )  ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 8)
ZF3 : 5' -CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3' (配列番号： 9 )  ZF3: 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3 '(SEQ ID NO: 9)
3， RACEの PCR反応液は 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 1 μ ΐ 、 添付の 10 χ Advantage 2 PCR buffer (400 raM Tricine- K0H, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37. 5 μ g/ml BSA, 0. 05%Tween— 20， 0. 05% Nonidet - P40)を 5 μ 1、 dNTP mixture (2. 5 mM each, 宝酒造）を 4 μ 1、 10 μ Μプライマー ZF1を 1 μ 1、 10 ju Mプライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA K itに添付のもの） を 1 μ 1、 鍚型 cDNA (CLONTECH社、 ヒト精巣 Marathon- Ready cD NA) を 5 μ1、 -及ぴ蒸留水を 33 を混合して作製した。 反応条件は 94DO60秒の 初期変性後、 94°C'30秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°〇'30秒-70°04分の サイクル反応を 5回、 94で'30秒-68°0'44分のサィクル反応を 25回行った。 3. 1 μl of 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH) was used for the PCR reaction solution of RACE, and the attached 10 χ Advantage 2 PCR buffer (400 raM Tricine-K0H, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.5 μg / ml BSA, 0.05% Tween—20, 0.05% Nonidet-P40) at 5 μl, dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) at 4 μl, 10 μΜ primer 1 μl of ZF1 and 10 juM Primer API (primer API attached to CLONTECH Marathon-Ready cDNA Kit) 1 μl, 、 type cDNA (CLONTECH, human testis Marathon-Ready cD) NA) was mixed with 5 µl of-and distilled water of 33. After initial denaturation reaction conditions 94 D O 60 seconds, 94 ° C'30 seconds - 72 ° C'4 minute cycle reaction 5 times, 94 ° Rei'30 seconds -70 ° 04 minutes of cycling reactions 5 times, Cycle reactions were performed 25 times at 94 for '30 seconds -68 ° 0'44 minutes.
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 μ 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine - K0H， 150 mM KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2, 37.5 μ g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet— P40)を 5 μ 1、 dNTP mixture (2.5 mM e ach, 宝酒造）を 4 μ1、 10 プライマー ZF2を 1 ^ 1、 10 μΜプライマー ΑΡ2 ( プライマー ΑΡ2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの） を 1 j l 、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 μ1、 及び蒸留水を 33 / lを混合して 作製した。 反応条件は 94°C'60秒の初期変性後、 94°C'30秒- 72°C'4分のサイクル 反応を 5回、 94°C'30秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°030秒-68°044分の サイクル反応を 25回行った。 Subsequently, a nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type III. The reaction solution was 1 μl of 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-K0H, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.5 μg / ml 5 μl of BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40), 4 μl of dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo), 10 primer ZF2 1 ^ 1, 10 μ Μ primer ΑΡ2 (primer ΑΡ2 1 jl of type III DNA (attached to Marathon-Ready cDNA Kit from CL0NTECH), 5 μl of type I DNA (50-fold dilution of the PCR reaction solution), and 33 / l of distilled water were prepared. The reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° C for 60 seconds, a cycle reaction of 94 ° C for 30 seconds to 72 ° C for 4 minutes was performed 5 times, and a cycle reaction for 94 ° C for 30 seconds to 70 ° C for 4 minutes Were repeated 5 times, and a cycle reaction of 94 ° 030 seconds-68 ° 044 minutes was performed 25 times.
さらに続いて、 該 PCR反応の反応液を錡型として 2回目の nested PCRを実施した 。 反応液は 50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 1 /xl、 添付の 10 χ Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine— KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc) 2， 37.5//g/ral BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet—P40)を 5 μ1、 dNTP mix ture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 μ 1、 10 プライマー ZF3を 1 μ1、 10 μΜプ ライマー ΑΡ2 (プライマー ΑΡ2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付の ものを用いた。 ） を 1 μ1、 錄型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 μ1、 及び蒸 留水を 33 を混合して作製した。 反応条件は 94°060秒の初期変性後、 94°C-30 秒 - 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°Ο30秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 9 4°O30秒- 68°C'44分のサイクル反応を 25回行った。 得られた DNA断片を T0P0 TA C loning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従つ てクローニングした。 クローニングされた DNAの塩基配列を ABI377DNA sequencer を用いて解読し、 3'端配列 （配列番号： 1 0) を得た。 Subsequently, a second nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type II. The reaction solution was 1 / xl of 50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH), and the attached 10 χ Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine—KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 // g / ral 5 μl of BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40), 4 μl of dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo), 10 μm of primer ZF3 1 μl, 10 μm of primer ΑΡ2 (primer ΑΡ2 is CL0NTECH 1 μl), 5 μl of type I DNA (50-fold dilution of the PCR reaction solution), and 33 of distilled water were prepared. The reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° 060 seconds, 5 cycles of 94 ° C-30 seconds-72 ° C'4 minutes, 5 cycles of 94 ° Ο30 seconds-70 ° C'4 minutes, A cycle reaction of 94 ° C. for 30 seconds—68 ° C. for 44 minutes was performed 25 times. The obtained DNA fragment was cloned using a T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual. The nucleotide sequence of the cloned DNA was decoded using ABI377 DNA sequencer to obtain a 3′-end sequence (SEQ ID NO: 10).
配列番号： 1 0で表わされる塩基配列及ぴ EST (X40467) の情報によりプライマ 一 ZAQL-CF (配列番号： 1 1)及ぴ ZAQL - XR1 (配列番号： 1 2)を作成した。 ヒト 精巣 Marathon - Ready cDNA (CL0NTECH社）を铸型としてプライマー ZAQL - CF と ZAQ L-XR1を用いて PCRを実施した。 Based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and the information of EST (X40467), primers ZAQL-CF (SEQ ID NO: 11) and ZAQL-XR1 (SEQ ID NO: 12) were prepared. Using human testis Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH) as primer type ZAQL-CF and ZAQ PCR was performed using L-XR1.
ZAQL-CF: 5' - CCACCATGAGAGGTGCCACG- 3' (配列番号： 1 1 )  ZAQL-CF: 5 '-CCACCATGAGAGGTGCCACG- 3' (SEQ ID NO: 1 1)
ZAQL-XR1： 5， -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (配列番号： 1 2 )  ZAQL-XR1: 5, -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 μ 1、 添付の 10 x PC R bufferを 5 μ 1、 2. 5 mM dNTP mixtureを 4 μ 1、 10 z Mプライマー ZAQL- CF及び ZAQL- XR1を各 2. 5 μ ΐ 、 铸型 DNAを 5 μ 1、 及び蒸留水を 30 を混合して作製し た。 反応条件は 95°C · 1分の初期変性後、 95°C · 1分- 60°C · 1分- 72°C · 1分のサイクル 反応を 40回、 および 72°010分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片を TOPO Τ A Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従 つてクローニングした。 クローユングされた DNA断片の塩基配列を ABI377DNA seq uencerを用いて解読した結果、 371bpの、 それぞれ配列番号： 1 3および配列番 号： 1 4で表わされる塩基配列を有していることが明らかとなった。 配列番号： 1 3で表わされる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを pHMITAと、 配 列番号： 1 4で表わされる塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを pHMIT Gと命名した。  PCR reaction solution: 1 μl of PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 5 μl of attached 10x PCR buffer, 4 μl of 2.5 mM dNTP mixture, 10 zM primer ZAQL-CF and ZAQL-XR1 Were prepared by mixing 2.5 μΐ each, 5 μ 1 of type I DNA, and 30 of distilled water. The reaction conditions were: 95 ° C for 1 minute initial denaturation, 95 ° C for 1 minute-60 ° C, 1 minute to 72 ° C, 1 minute cycle 40 times, and final extension at 72 ° 010 minutes And The obtained DNA fragment was cloned using the TOPOΤA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual. As a result of decoding the nucleotide sequence of the cleaved DNA fragment using the ABI377 DNA sequencer, it was revealed that the DNA fragment had the nucleotide sequence of 371 bp represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, respectively. Was. The plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 was named pHMITA, and the plasmid having the DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 was named pHMITG.
プラスミド pHMITA及ぴ pHMITGにより大腸菌 （Escherichia coli) をトランスフ オームさせ、 それぞれェシエリヒア コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΜΙΤΑお よびェシエリヒア コリ （Escherichia coli) TOPlO/pHMITGと命名した。  Escherichia coli was transformed with plasmids pHMITA and pHMITG, and named Escherichia coli ΤΟΡΙΟ / ρΗΜΙΤΑ and Escherichia coli TOPlO / pHMITG, respectively.
これらの DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 1 3で表わされる DNA 断片は、 配列番号： 1 5で表わされるヒト型 Z A Qリガンド前駆体ペプチド (Aタ イブ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列番号： 1 6 ) を含んでおり、 配 列番号： 1 4で表わされる DNA断片は、 配列番号： 1 7で表わされるヒト型 Z A Qリガンド前駆体ペプチド (Gタイプ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列 番号： 1 8 ) を含んでいることが明らかとなった。  As a result of analyzing the base sequences of these DNA fragments, the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 13 was converted to the human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 15 (A type, 105 amino acid residues). The DNA fragment containing the coding DNA (SEQ ID NO: 16), the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 14 is a human ZAQ ligand precursor peptide represented by SEQ ID NO: 17 (G type, 105 amino acid residues) (SEQ ID NO: 18).
また、 配列番号： 1 6および配列番号： 1 7で表わされる塩基配列は典型的な シグナル配列を有しており、 配列番号： 1 6で表わされる塩基配列を有する DNA は、 配列番号： 1 9で表わされるヒト型 Z A Qリガンドペプチド (Aタイプ、 86ァ ミノ酸残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 2 0 ) を含んでお り、 配列番号： 1 7で表わされる塩基配列を有する DNAは、 配列番号： 2 1で表 わされるヒト型 Z A Qリガンド成熟体ペプチド (Gタイプ、 86アミノ酸残基）をコ ードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 2 2 ) を含んでいることが明らかと なった。 参考例 4 ヒト型 ZAQリガンドぺプチドの哺乳動物細胞での産生 The base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 has a typical signal sequence, and the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is represented by SEQ ID NO: 19 Contains 258 base pairs of DNA (SEQ ID NO: 20) encoding a human ZAQ ligand peptide (A type, 86 amino acid residues) represented by the following: SEQ ID NO: 17 The DNA having the sequence is represented by SEQ ID NO: 21. It was found that the DNA contained 258 base pairs of DNA (SEQ ID NO: 22) encoding the human-type ZAQ ligand mature peptide (G type, 86 amino acid residues). Reference Example 4 Production of human ZAQ ligand peptide in mammalian cells
( 4 - 1 ) ヒ ト型 ZAQリガンド前駆体ぺプチド哺乳動物細胞発現べクタ一の構築 参考例 3において取得したプラスミド pHMITGから Eco RI、 Xho I制限酵素消化 によってヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコ一ドする cDNAを含む 382bpの DNA 断片 （配列番号： 2 3 ) を切出した。  (4-1) Construction of human ZAQ ligand precursor peptide mammalian cell expression vector The human ZAQ ligand precursor peptide was digested from plasmid pHMITG obtained in Reference Example 3 by digestion with EcoRI and XhoI restriction enzymes. A 382 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 23) containing the coding cDNA was cut out.
すなわち、 プラスミド pHMITGを Eco RIおよび Xho Iで酵素消化し、 得られた DNA を 1. 5 %ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 サイバーグリーン染色される約 38 2 bpのバンドを含むゲル片を剃刀で切り取った。 該ゲル片より Gene Clean spin DNA抽出キット （BIO 101社） を用いて DNA断片を回収した。 得られた DNA断片を CMV - IEェンハンサーおよび chicken beta— actin promoterを発現プロモーターと する哺乳動物細胞発現ベクター PCAN618に対して Eco RI、 Xho I制限酵素切断部位 に定法に従ってクローユングした。 クローニングされた DNA断片の塩基配列を前 述の方法により解読した結果、 配列番号： 2 3で表わされる塩基配列を有してい ることが確認された。 このヒ ト型 ZAQリガンド前駆体ぺプチドをコードする DNAを 有する哺乳動物細胞発現べクタ一を pCANZAQLg2と命名した。  Plasmid pHMITG was digested with EcoRI and XhoI, and the resulting DNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. Cut out. DNA fragments were recovered from the gel pieces using a Gene Clean spin DNA extraction kit (BIO 101). The obtained DNA fragment was cloned in accordance with a standard method at a cleavage site for EcoRI and XhoI restriction enzymes with respect to a mammalian cell expression vector PCAN618 using CMV-IE enhancer and chicken beta-actin promoter as expression promoters. As a result of decoding the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment by the method described above, it was confirmed that the DNA fragment had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23. The mammalian cell expression vector having the DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide was named pCANZAQLg2.
( 4 - 2 ) C0S7細胞への発現ベクターの導入 (4-2) Introduction of expression vector into C0S7 cells
C0S7細胞は ATCCより購入し、 DMEM培地 （10% FBSを加えたもの） を用いて継代 培養しているものを用いた。 DMEM培地を用いて C0S7細胞を 1. 5 X 106cells/dishと なるよう 10cmシャーレにまき、 37°C、 5% C02インキュベータ一中でー晚培養し た。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現プラスミド （pCANZAQLg2) 2 μ (2 μ 1の ΤΕノ ッファー tこ溶角旱） ίこノ ッファー EC (Effectene transfection reagent, Q IAGEN) 298 μ ΐを加え、 さらに Enhancer 16 μ 1を加え、 1秒間混和後室温で 3分間 放置した。 さらに Effectene Transfection Reagent 60 μ ΐをカ卩え、 10秒間混和後 室温で 10分間放置した。 前日にまいた細胞の上清を除き、 DMEM培地 10 mlで 1回 洗浄し、 DMEM培地を 9 mlを加えた。 プラスミド溶液に DMEM培地 lmlを加えて混和 後細胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37°C、 5% C02インキュベータ一中で一晩培養 した。 DMEM培地 10 mlで 2回洗浄し、 DMEM培地 10mlを加え、 37°C、 5% C02イン キュベータ一中で一晩培養した。 2日後、 培養上清を回収した。 C0S7 cells used were purchased from ATCC and subcultured using DMEM medium (supplemented with 10% FBS). The C0S7 cells 1. seeded in 10cm Petri dish so as to be 5 X 10 6 cells / dish using DMEM medium and over晚cultured in 37 ° C, 5% C0 2 incubator scratch. Human type ZAQ ligand precursor peptide expression plasmid (pCANZAQLg2) 2 μ (2 μl of ΤΕNoffer t 溶 α 角 旱 旱 ί) ノ N ノ offer EC (Effectene transfection reagent, Q IAGEN) 298 μΐ was added, and Enhancer 16 was added. μ1 was added, mixed for 1 second, and left at room temperature for 3 minutes. Further, 60 μl of Effectene Transfection Reagent was mixed, mixed for 10 seconds, and left at room temperature for 10 minutes. Remove the cell supernatant from the previous day and once with 10 ml of DMEM medium After washing, 9 ml of DMEM medium was added. The plasmid solution was added to DMEM medium lml dropwise to mix after cell were cultured overnight in 37 ° C, 5% C0 2 incubator one was mixed whole. Washed twice with DMEM medium 10 ml, added DMEM medium 10 ml, and cultured overnight in 37 ° C, 5% C0 2 in Kyubeta scratch. Two days later, the culture supernatant was collected.
(4-3) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清からの ZAQを 活性化するぺプチドの部分精製 (4-3) Human ZAQ ligand precursor peptide expression Partial purification of ZAQ-activating peptide from C0S7 cell culture supernatant
(4-3-1) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清抽出液 の調製  (4-3-1) Preparation of C0S7 cell culture supernatant extract expressing human ZAQ ligand precursor peptide
ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 C0S7細胞培養上清を回収し、 以下の操 作を行い抽出液を調製した。 先ず、 細胞培養上清 （約 18.5ml) に終濃度が 1 Mに なるように酢酸 1.1 mlを滴下し、 一時間攪拌した。 さらにその 2倍容量のァセト ンを加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心機 (CR26H, 23型ローター： 日 立株式会社） を用いて 15， 000 rPm， 30分間遠心し上清を得た。 得られた上清をェ バポレーターにかけ、 アセトンを除去した後、 凍結乾燥機 （1 2EL ； VirTis 社） にて凍結乾燥した。 The culture supernatant of the C0S7 cell expressing human ZAQ ligand precursor peptide was collected, and the following operation was performed to prepare an extract. First, 1.1 ml of acetic acid was added dropwise to the cell culture supernatant (about 18.5 ml) to a final concentration of 1 M, followed by stirring for 1 hour. Further Aseto down twice that capacity addition, 4 ° C at stirring for 30 min, then a high-speed centrifugal separator (CR26H, 23 type rotor: Hitachi, Ltd.) using a 15, 000 r centrifugal P m, 30 minutes Then, a supernatant was obtained. The resulting supernatant was applied to an evaporator to remove acetone, and then lyophilized with a freeze dryer (12EL; VirTis).
(4-3-2) ヒ ト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C0S7細胞培養上清の Sepha dex G50ゲルろ過クロマトグラフィー及ぴ SepPakカラムク口マトグラフィー 上記 （4— 3— 1) で得られた凍結乾燥粉末を 1M酢酸 2mlに溶解後、 1 M酢酸で 平衡化した Sephadex G15 (直径 3 cm、 35ml, Pharmacia Biotech社）カラムに吸 着させた後、 1 M酢酸をカラムに流し、 溶出液を 5 mlづっフラクション No.をつけ て分取し、 凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。 (4-3-2) Expression of human ZAQ ligand precursor peptide Sephadex G50 gel filtration chromatography of C0S7 cell culture supernatant and SepPak column mouth chromatography Freezing obtained in (4-3-1) above After dissolving the dried powder in 2 ml of 1 M acetic acid, the mixture was absorbed on a Sephadex G15 (diameter 3 cm, 35 ml, Pharmacia Biotech) column equilibrated with 1 M acetic acid, and then 1 M acetic acid was passed through the column. Each fraction was numbered in ml and fractionated, and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
SepPak C18 - 5gカラム （10ml) を、 メタノールにて膨潤後、 0.1% トリフルォ 口酢酸/蒸留水を流し、 平衡化した。 Sephadex G50ゲルろ過クロマトグラフィー 分取フラクションのうちフラクション No.1 - 16の凍結乾燥品をまとめて 0.1%トリ フルォロ酢酸/蒸留水 3mlに溶解し、 S印 Pak C18- 5gカラムに添着した後、 0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水 24mlで洗浄後、 0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニ トリル 20mlで溶出した。 得られた溶出液をサーバントにかけた。 (4-3-3) Super ODS逆相高速液体ク口マトグラフィ一による精製 The SepPak C18-5 g column (10 ml) was swollen with methanol and then equilibrated by flowing 0.1% trifluoroacetic acid / distilled water. Sephadex G50 gel filtration chromatography Among the fractionated fractions, freeze-dried fractions No. 1-16 were combined and dissolved in 3 ml of 0.1% trifluoroacetic acid / distilled water, and applied to an S-mark Pak C18-5 g column. After washing with 24 ml of% trifluoroacetic acid / distilled water, elution was carried out with 20 ml of 0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile. The obtained eluate was applied to a servant. (4-3-3) Purification by Super ODS reversed-phase high-performance liquid chromatography
TSKgel Super ODS逆相高速液体ク口マトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社 、 0.46 cm X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ 酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 （4— 3— 2) で得られた SepPak C18- 5g力 ラムフラクションをサーバントにかけた後、 Super ODS逆相高速液体クロマトグ ラフィ一に添着し、 流速 1 ml/minで 60分間で A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 蒸留水） 容量 100%ZB液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容量 0%から A液容量 0% B液容量 100%まで直線的グラジェントで上昇させ、 溶出 液を回収した。  Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel Super ODS reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 0.46 cm x 10 cm) at 40 ° C at a flow rate of 1 ml / min. ) And allowed to equilibrate. After applying the SepPak C18-5 g force fraction obtained in (4-3-2) to the servant, the mixture was applied to Super ODS reversed-phase high-performance liquid chromatography, and the solution A (0.1%) was applied at a flow rate of 1 ml / min for 60 minutes. % Trifluoroacetic acid / distilled water) Volume 100% ZB solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) Volume was increased from 0% to 0% solution A volume and 100% solution B volume was increased in a linear gradient, and the eluate was collected. .
溶出液を、 1 mlずつフラクション No,をつけて分取し、 分取フラクション全量 を凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に H/HBSS に 2.5mM Probenecid、 0.2% BSAを加えたもの Ιδθμ 1を加えて溶解し、 この溶液 を用いて下記 （4一 3— 4) の試験法により、 ZAQC-B1細胞に対するレセプター 活性化作用を測定した。  The eluate was fractionated by adding fraction No. to each 1 ml, and the entire fraction fraction was freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). H / HBSS plus 2.5mM Probenecid and 0.2% BSA に δθμ1 was added to the dried product and dissolved. Using this solution, ZAQC-B1 cells were tested by the following test method (4-1-3-4). The receptor activating effect was measured.
(4— 3— 4) ZAQリガンドの活性測定 （FLIPRを用いた細胞内 Caィオン濃度 上昇活性の測定） (4-3-4) Measurement of ZAQ ligand activity (measurement of intracellular Ca ion concentration increasing activity using FLIPR)
上記 （4一 3— 3) で得られたサンプルについて、 参考例 2 (2-5) で得ら れた ZAQ発現細胞 （ZAQC- B1) における細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定を F LIPRを用いて行った。 また、 対照として h0T7T175発現細胞（h0T7T175- 16； WO 0 0/24890に記載）を用いた。  Using the sample obtained in (4-1-3-3) above, F LIPR was used to measure the intracellular Ca ion concentration increasing activity of the ZAQ-expressing cells (ZAQC-B1) obtained in Reference Example 2 (2-5). It was performed using. As a control, h0T7T175-expressing cells (h0T7T175-16; described in WO 00/24890) were used.
ZAQC- B1細胞、 h0T7T175- 16細胞共に 10%透析処理済ゥシ胎児血清（以後 d FBSと する）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC-B1細胞、 MT7T175 - 1 6細胞をそれぞれ 15Xl04cells/mlとなるように培地（10%dFBS- DMEM)に懸濁し、 F LIPK用 96穴プレート（Black plate clear bottom. Coster社）に分注器を用いて各 ゥエルに 200μ1ずつ播き（3.0Χ104ΟΘ113/200/Ζ1/ゥヱル）、 5% C02インキュベー ター中で 37°Cでー晚培養した後、 用いた（以後細胞プレートとする）。 H/HBSSCHAN KS' 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリウムで pH 7.4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） 21ml、 250mM Probenecid 210μ1、 ゥシ 胎児血清 (FBS) 210 μ 1を混合した。 また、 Fluo3-AM 2パイアル（50 μ g)をジメチ ルスノレフォキサイド 42μ1、 20% Pluronic acid 42 1に溶解し、 これを上記 H/H BSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細 胞プレートに各ゥエル ΙΟΟμΙずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中で 37°Cで 1時間インキュベートした（色素ローデイング)。 上記 （4一 3— 3) で得られた アツセィ用サンプルについて、 各フラクションに H/HBSSに 2.5mM Probenecid、 0 .2% BSAを加えたもの 150μ1を加えて溶解し、 FLIPR用96穴プレート（V- Bottomプ レート、 Coster社)へ移した（以後、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの 色素ローディング終了後、 H/HBSSに 2.5mM Probenecidを加えた洗浄バッファーで プレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄 し、 洗浄後 100 の洗浄バッファーを残した。 この細胞プレートとサンプルプレ ートを FLIPRにセットし、 アツセィを行った（FLIPRにより、 サンプルプレートか ら 0.05mlのサンプルが細胞プレートへと移される）。 フラクション ^.48-68に2八0 C-B1細胞特異的な細胞内 Caイオン濃度上昇活性が見られた。 このことから、 目的 とする ZAQC - B1細胞に対するレセプター活性ィ匕作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ 活性化成分は、 フラクション No.48-68に溶出されていることが判明した。 実施例 1 大腸菌でのヒ ト ZAQリガン.ド （配列番号： 21) の製造 Both ZAQC-B1 cells and h0T7T175-16 cells that had been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS) were used. ZAQC-B1 cells and MT7T175-16 cells were each suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at a concentration of 15 × 10 4 cells / ml, and distributed in a 96-well plate for FLIPK (Black plate clear bottom. Coster). a device seeded by 200μ1 each Ueru using (3.0Χ10 4 ΟΘ113 / 200 / Ζ1 / Uweru), and 5% C0 2 was incubated in a coater 37 ° C De晚culture, using the (hereafter cell plates ). H / HBSSCHAN KS '9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, pH with sodium hydroxide After adjusting to 7.4, filter sterilization treatment) 21 ml, 210 mM Probenecid 210 μl, and 210 μl of mouse fetal serum (FBS) were mixed. In addition, dissolve 2 µl of Fluo3-AM (50 µg) in 42 µl of dimethylsnorreoxide and 20% Pluronic acid 421, add this to the above H / H BSS-Probenecid-FBS, mix, and mix dispensed at each Ueru ΙΟΟμΙ the cells plates except the culture solution with a pipette and incubated for 1 h in 5% C0 2 incubator one 37 ° C (dye the loading). With respect to the sample for Atsushi obtained in (4-1-3-3) above, each fraction was dissolved by adding 150 μl of H / HBSS to which 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA were added, and dissolving in a 96-well plate for FLIPR ( (V-Bottom plate, Coster) (hereinafter referred to as sample plate). After dye loading of the cell plate was completed, the cell plate was washed four times with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid added to H / HBSS using a plate washer (Molecular Devices), and after washing, 100 washing buffers were left. The cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and assayed (the FLIPR transfers 0.05 ml of sample from the sample plate to the cell plate). Fractions ^ .48-68 showed 280 C-B1 cell-specific activity to increase intracellular Ca ion concentration. From this, it was found that the target component having a receptor-activating effect on ZAQC-B1 cells, ie, the ZAQ-activating component, was eluted in fractions Nos. 48-68. Example 1 Production of human ZAQ ligand (SEQ ID NO: 21) in E. coli
実施例 1― 1 大腸菌でのヒ ト Z AQリガンド発現プラスミ ドの構築 Example 1-1 Construction of human Z AQ ligand expression plasmid in E. coli
(a) 以下に示す 6種の DNA断片 # 1〜# 6を用いて、 ZAQリガンドの構造 DNAを調製した。  (a) The structural DNA of the ZAQ ligand was prepared using the following six types of DNA fragments # 1 to # 6.
#1 ： # 1:
5'- TATGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGMCGTGATGTGCAGTGCGGTGCGGGTACCTGCTGCGCGATTAG CCTGTGGCTGCGTGGTCTG-3' (配列番号： 24) 、  5'-TATGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGMCGTGATGTGCAGTGCGGTGCGGGTACCTGCTGCGCGATTAG CCTGTGGCTGCGTGGTCTG-3 '(SEQ ID NO: 24),
#2: # 2:
5' -CGTATGTGCACCCCGCTGGGTCGTGAAGGTGAAGAATGCCATCCGGGTAGCCATAAAGTGCCGTTCTTC 5 '-CGTATGTGCACCCCGCTGGGTCGTGAAGGTGAAGAATGCCATCCGGGTAGCCATAAAGTGCCGTTCTTC
CGTAAACGTAAACATCATACCTG-3' (配列番号： 25) 、 CGTAAACGTAAACATCATACCTG-3 '(SEQ ID NO: 25),
#3: 5， -CCCGTGCCTGCCGAACCTGCTGTGCAGCCGTTTCCCGGATGGTCGTTATCGTTGCAGCATGGATCTGAA# 3: 5, -CCCGTGCCTGCCGAACCTGCTGTGCAGCCGTTTCCCGGATGGTCGTTATCGTTGCAGCATGGATCTGAA
AAACATTAACTTTTAGG-3' (配列番号： 26) 、 AAACATTAACTTTTAGG-3 '(SEQ ID NO: 26),
#4:  #Four:
5' -CACATACGCAGACCACGCAGCCACAGGCTAATCGCGCAGCAGGTACCCGCACCGCACTGCACATCACGT TCGCACGCACCGGTMTCACCGCCA-3' (配列番号： 27) 、  5'-CACATACGCAGACCACGCAGCCACAGGCTAATCGCGCAGCAGGTACCCGCACCGCACTGCACATCACGT TCGCACGCACCGGTMTCACCGCCA-3 '(SEQ ID NO: 27),
#5: #Five:
5'-AGGCACGGGCAGGTATGATGTTTACGTTTACGGAAGAACGGCACTTTATGGCTACCCGGATGGCATTCT 5'-AGGCACGGGCAGGTATGATGTTTACGTTTACGGAAGAACGGCACTTTATGGCTACCCGGATGGCATTCT
TCACCTTCACGACCCAGCGGGGTG-3' (配列番号： 28) 、 TCACCTTCACGACCCAGCGGGGTG-3 '(SEQ ID NO: 28),
#6:  # 6:
5'-GATCCCTAAMGTTMTGTTTTTCAGATCCATGCTGCAACGATAACGACCATCCGGGAAACGGCTGCAC AGCAGGTTCGGC-3' (配列番号： 29) 。 5'-GATCCCTAAMGTTMTGTTTTTCAGATCCATGCTGCAACGATAACGACCATCCGGGAAACGGCTGCAC AGCAGGTTCGGC-3 '(SEQ ID NO: 29).
(b) DNAオリゴマーのリン酸化 (b) Phosphorylation of DNA oligomer
5 ' 側になるべき上記 # 1および # 6を除いた 4種の DNAオリゴマー （# 2 〜# 5) 各々を、 25 のリン酸ィヒ反応液 〔DNAオリゴマー 10 /zg, 50m M Tris-HCl, H 7.6, 1 OmM MgCl2， ImMスペルミジン， 1 OmM ジチオスレィ トール （以後 DTTと略記） ， 0. lmg/mlゥシ血清アルブミン （ 以後 BS Aと略記） ， ImM ATP, 10ユニット T 4ポリヌクレオチドキナー ゼ （宝酒造） 〕 中で 37°C ' 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5' 末端をリン酸 ィ匕した。 フエノール処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷 却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。 Each of the four DNA oligomers (# 2 to # 5) except for # 1 and # 6 above, which should be on the 5 'side, was added to 25 phosphate reactions (DNA oligomer 10 / zg, 50 mM Tris-HCl , H 7.6, 1 OmM MgCl 2 , ImM spermidine, 1 OmM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT), 0.1 mg / ml ゥ cyserum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), ImM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)] at 37 ° C for 1 hour, and the 5 'end of each oligomer was phosphorylated. After phenol treatment, 2 volumes of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and DNA was precipitated by centrifugation.
(c)DNAフラグメントの連結  (c) Ligation of DNA fragments
上記 （b) で得られた DNA7ラグメントと上記 #1および # 6を合わせ、 1 20 1とした。 この混合液を 90°Cで 10分間保持した後、 室温まで徐冷しァ ニーリングを行った後、 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてラ ィゲーション反応を行った。 ァニーリング液 30 /X 1にキットに付属の I I液 3 0 1を加え、 よく混合した後、 キットに付属の I液 60 μ 1を加え、 37°C ' 1時間反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 その後、 フエノール処理を行ない、 水層を回収して 2倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。 この様にして得られた DNAフラグメントを T 4ポリヌクレオ チドキナーゼ （宝酒造） によるリン酸ィ匕を行った後、 以下の工程（d)に供した。 The DNA7 fragment obtained in (b) above was combined with # 1 and # 6 above to give 1 201. The mixture was kept at 90 ° C. for 10 minutes, gradually cooled to room temperature, annealed, and subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). To the annealing solution 30 / X1, the II solution 301 included in the kit was added and mixed well, and then 60 μl of the I solution included in the kit was added. The mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour to perform ligation. After that, phenol treatment was carried out, the aqueous layer was collected, twice the volume of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and then centrifuged. A was precipitated. The thus obtained DNA fragment was subjected to phosphorylation using T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) and then subjected to the following step (d).
(d) ZAQリガンド発現べクタ一の構築  (d) Construction of ZAQ ligand expression vector
発現用ベクターとしては p TC I I (特開 2000- 178297号に記載） を N d e I および B amH I (宝酒造） で 37 °C · 2時間消化した後、 1 %ァガロースゲル 電気泳動により 4. 3 k bの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キア ゲン社） を用いて抽出し、 2 5 ju 1の TE緩衝液に溶解した。 この p TC I Iの Nd e l、 B amH I断片と上記により調製した ZAQリガンドの構造遺伝子 （ 配列番号： 3 8) を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲ ーシヨン反応を行った。 この反応液を 1 0 1用いて大腸菌 JM109コンビテ ントセル （東洋紡） を形質転換し、 10 μ g/m 1のテトラサイクリンを含む L B寒天培地上に播き、 3 7 °Cで 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニ 一選んだ。 この形質転換体を LB培地でー晚培養し、 QIAPrep8 Miniprep Kit ( キアゲン社） を用いてプラスミド pTCh 1 ZAQを調製した。 この ZAQリガ ンド D N Aの塩基配列をアプライドバイォシステムズ社モデル 377 D N Aシー ケンサ一を用いて確認した。 プラスミド pTCh 1 ZAQを大腸菌 （Escherichia coli) MM 294 (DE 3) に形質転換し、 Z AQリガンド発現株 Escherichia coli MM294(DE3)/ pTChlZAQを得た。 実施例 1— 2 ZAQリガンドの製造 As an expression vector, pTCII (described in JP-A-2000-178297) was digested with NdeI and BamHI (Takara Shuzo) at 37 ° C for 2 hours, and then 4.3 kb by 1% agarose gel electrophoresis. Was extracted using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 ju1 of TE buffer. The ligation reaction was carried out using the Ndel and BamHI fragments of pTCII and the structural gene (SEQ ID NO: 38) of the ZAQ ligand prepared as described above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). Escherichia coli JM109 Combinant Cell (Toyobo) was transformed with 101 of this reaction solution, seeded on LB agar medium containing 10 μg / m1 of tetracycline, and cultured at 37 ° C for 1 晚. Tetracycline resistant colonies The transformant was over晚cultured in LB medium, plasmids were prepared ptch 1 ZAQ using QIA P rep8 Miniprep Kit (Qiagen). The base sequence of this ZAQ ligand DNA was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer. The plasmid pTCh1ZAQ was transformed into Escherichia coli MM294 (DE3) to obtain a ZAQ ligand expression strain Escherichia coli MM294 (DE3) / pTChlZAQ. Example 1-2 Production of ZAQ ligand
上記の Escherichia coli MM294(DE3)/ pTChlZAQを 5. Omg/Lのテトラサ イクリンを含む LB培地 · 1 L (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% 塩ィ匕ナトリウム） を用いて 2 L容フラスコ中で 3 7° (：、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 1 9 Lの主発酵培地 （1. 68%リン酸 1水素ナトリウム、 0 . 3%リン酸 2水素カリウム、 0. 1%塩化アンモニゥム、 0. 05%塩ィ匕ナト リウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 00025%硫 酸第 1鉄、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5 %ブドゥ糖、 1. 5 %ハイケー スァミノ） を仕込んだ 5◦ L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気攪拌を開始した 。 培養液の濁度が 500クレット単位になったところで、 イソプロピル一 β— D —チォガラクトピラノシドの最終濃度が 12mg/Lになるように添加し、 さら に 4時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 200 gの湿菌体 を取得し、 一 80 °Cで保存した。 The above Escherichia coli MM294 (DE3) / pTChlZAQ was added to LB medium containing 5.Omg / L tetracycline · 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium salt). The culture was shake-cultured at 37 ° (: 8 hours in a 2 L flask. The obtained culture was mixed with 19 L of the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% phosphoric acid 2%). Potassium hydrogen, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride sodium, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% defoamer, 0.00025% ferrous sulfate, 0.0005% hydrochloric acid Thiamine, 1.5% budou sugar, 1.5% high-case amino) were introduced into a 5 L fermenter, and aeration and stirring were started at 30 ° C. When it came to, isopropyl-1-β-D —Tiogalactopyranoside was added to a final concentration of 12 mg / L, and the cells were further cultured for 4 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged to obtain about 200 g of wet cells and stored at 180 ° C.
この形質転換大腸菌 MM294 (DE 3) /pTCh l ZAQは、 受託番号 I FO 16527として財団法人発酵研究所 （I FO) に寄託されている。 実施例 1—3 ZAQリガンドの活性化  The transformed E. coli MM294 (DE3) / pTChlZAQ has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO16527. Example 1-3 Activation of ZAQ ligand
実施例 1— 2で得られた菌体 200 gに、 20 OmMトリス ZHC 1、 7Mグ ァニジン塩酸塩 （pH 8. 0) 40 Om 1を加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (l O O O O r m, 1時間） を行った。 上澄液に 0. 4 Mアルギニン、 50m Mトリス ZHC 1、 0. 2mM GSSG、 1 mM GSH (pH8. 0) 10 リットルを加えて、 4 °Cでー晚活性化を行った。 実施例 1—4 Z AQリガンドの精製  To 200 g of the cells obtained in Examples 1-2, 20 OmM Tris ZHC 1, 7 M guanidine hydrochloride (pH 8.0) 40 Om 1 was added to dissolve the cells, and then centrifuged (l OOOO rm, 1 hour). 10 liters of 0.4 M arginine, 50 mM Tris ZHC 1, 0.2 mM GSSG, 1 mM GSH (pH 8.0) was added to the supernatant, and activated at 4 ° C. Example 1-4 Purification of Z AQ Ligand
実施例 1— 3で活性ィ匕の終了した再生液を p H 6. 0に調整し、 50mMリン 酸緩衝液 (pH6. 0) で平衡化した S P—セファロースカラム （11. 3 cm X 15 c m) に吸着させた後、 600 mM Na C 1 /50 mMリン酸緩衝液 ( pH6. 0) で溶出し、 ZAQリガンドを含むフラクションをプールした。 この 画分を 50 mM リン酸緩衝液 (pH6. 0 ) で平衡化した CM— 5 P W (21. 5mmX 15 OmmL) に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 100%B (B= 5 Om M リン酸緩衝液 + 1M NaCl、 pH6. 05) の段階勾配 （60分） で溶出を 行い ZAQリガンド画分 （溶出時間約 40分） を得た。 この画分を、 さらに 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P— 50 (21. 5mml DX 30 OmmL 、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 25— 50%B (B： 80%ァセト 二トリル/ 0. 1%トリフルォロ酢酸） の段階勾配 （60分） で溶出を行い、 Z AQリガンド画分 （溶出時間約 40分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ZA Qリガンド凍結乾燥粉末約 8 Oragを得た。 実施例 1—5 Z AQリガンドの特徴決定 (a) S D Sポリアクリルァミドゲル電気泳動を用レ、た分析 The regenerating solution after the completion of the activation in Example 1-3 was adjusted to pH 6.0, and the SP-Sepharose column (11.3 cm × 15 cm) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) was used. ), And eluted with 600 mM NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the fractions containing the ZAQ ligand were pooled. This fraction was passed through CM-5 PW (21.5 mm × 15 OmmL) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), adsorbed and washed, and then 0-100% B (B = 5 Elution was performed with a step gradient (60 minutes) of OmM phosphate buffer + 1M NaCl, pH 6.05) to obtain a ZAQ ligand fraction (elution time: about 40 minutes). The fraction was further passed through C 4 P-50 (21.5 mml DX30 OmmL, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, and after adsorption and washing, 25-50% B (B : 80% acetate nitrile / 0.1% trifluoroacetic acid) eluted with a step gradient (60 min), pooled Z AQ ligand fraction (elution time approx. 40 min), freeze-dried, About 8 Orag of the lyophilized ligand powder was obtained. Example 1-5 Characterization of Z AQ ligand (a) Analysis using SDS polyacrylamide gel electrophoresis
実施例 1一 4で得られた Z AQリガンドを 100 mM DTTを添加した S a m 1 e b u f f e r [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95 °Cで 1分間加熱した後、 マルチゲル 15 25 (第一化学薬品） で電気泳動を行 つた。 泳動後のゲルをクーマシー 'ブリリアント 'ブノレー (Coomassie brillian t blue) で染色した結果、 参考例 （4— 3— 3) で得られた COS 7細胞由来の 組換え型 Z AQリガンド標品と同じ位置に、 単一の蛋白バンドが認められた。 こ のことから、 実施例 1一 4で得られた大腸菌由来の組換え型 Z A Qリガンド標品 は極めて高純度であり、 COS 7細胞から調製した組換え型 ZAQリガンドと分 子量的に同一であることが分かった。  Example 14 The ZAQ ligand obtained in 1-4 was suspended in Sam1 ebuffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] supplemented with 100 mM DTT, heated at 95 ° C for 1 minute, and then multi-gel Electrophoresis was performed with 15 25 (Daiichi Kagaku). The gel after electrophoresis was stained with Coomassie 'Brilliant' Benolay (Coomassie brillian t blue), and the same position as the recombinant ZAQ ligand sample derived from COS 7 cells obtained in Reference Example (4-3-3) was obtained. A single protein band was observed. From this, the recombinant ZAQ ligand preparation derived from E. coli obtained in Examples 14 to 14 is extremely high in purity and has the same molecular weight as the recombinant ZAQ ligand prepared from COS 7 cells. I found it.
(b) アミノ酸組成分析  (b) Amino acid composition analysis
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L一 8500A Amino Acid Analyzer ) を用いて決定した。 その結果、 ZAQリガンド （配列番号： 21で表されるァ ミノ酸配列からなるペプチド） の D N Aの塩基配列から推定されるァミノ酸組成 と一致した （表 1) 。 The amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-1 8500A Amino Acid Analyzer). As a result, the amino acid composition was consistent with the amino acid composition deduced from the DNA base sequence of the ZAQ ligand (peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21) (Table 1).
表 1 table 1
1モル当たりの Z AQリガンドの塩基配列 アミノ酸一 残 基 数 から予測される値 Base sequence of Z AQ ligand per mole Value predicted from amino acid residues
A s 5. 7 6 A s 5. 7 6
Th r υ 3. 3 4 Th r υ 3. 3 4
S e r 1} 3. 4 4 S er 1} 3. 4 4
G 1 x 5. 0 5  G 1 x 5.05
P r o 5. 6 6  P r o 5.66
G 1 y 7. 7 8  G 1 y 7. 7 8
A 1 a 3. 9 4  A 1 a 3.94
Cy s 2) N. D. 0 Cy s 2) ND 0
V a 1 2. 9 3  V a 1 2. 9 3
Me t 1 9 2  Me t 1 9 2
I 1 e 2 6 3  I 1 e 2 6 3
L e u 8 8  L e u 8 8
T y r 0  T y r 0
P h e 3 7 4  P he 3 7 4
H i s 3 8 4  H is 3 8 4
L y s 3 8 4  L y s 3 8 4
A r g 8 5 9  A r g 8 5 9
T r _ 0 9 酸加水分解 （6 N HC 1— 1%フエノール、 1 10。C、 24及ぴ 48時間加水 分解の平均値）  Tr_09 acid hydrolysis (6 N HC 1-1% phenol, 110. C, average of 24 and 48 hours hydrolysis)
1) 0時間に外揷した値  1) Value excluded from 0 hours
2) 未検出 (c) N末端アミノ酸配列分析 2) Not detected (c) N-terminal amino acid sequence analysis
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （PEアプライドバイオシ ステムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 得られた ZAQリガン ドの DN Aの塩基配列から推定された ZAQリガンドの N末端アミノ酸配列と一 致した （表 2) 。 The N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of the ZAQ ligand deduced from the nucleotide sequence of the DNA of the obtained ZAQ ligand (Table 2).
表 2 検出された Z AQリガンドの塩基配列 残基 No PTH—アミノ酸1) から予測される Table 2 Base sequence of detected Z AQ ligand. Predicted from residue No PTH—amino acid 1 )
_ (pmol) アミノ酸  _ (pmol) amino acid
1 A 1 a (99) A 1 a  1 A 1 a (99) A 1 a
2 V a 1 (100) V a 1  2 V a 1 (100) V a 1
3 I 1 e (91) I 1 e  3 I 1 e (91) I 1 e
4 T r (57) Th r  4 T r (57) Th r
5 G 1 y (70) G 1 y  5 G 1 y (70) G 1 y
6 A 1 a (89) A 1 a  6 A 1 a (89) A 1 a
7 N. D. C y s  7 N.D.C y s
8 G 1 u (60) G 1 u  8 G 1 u (60) G 1 u
9 A r g (49) A r g  9 A r g (49) A r g
10 As p (54) As p  10 As p (54) As p
1 1 V a 1 (79) V a 1  1 1 V a 1 (79) V a 1
12 G 1 n (67) G 1 n  12 G 1 n (67) G 1 n
13 N. D. C y s  13 N.D.C ys
14 G 1 y (54) G 1 y  14 G 1 y (54) G 1 y
15 A 1 a (65) A 1 a  15 A 1 a (65) A 1 a
16 G 1 y (47) G 1 y  16 G 1 y (47) G 1 y
1 7 Th r (32) Th r  1 7 Th r (32) Th r
18 N. D. Cy s  18 N. D. Cy s
19 N. D. C y s  19 N.D.Cys
20 A 1 a (36) A 1 a  20 A 1 a (36) A 1 a
1) フェニーレチォヒダントイン 150 pmo lを用いて分析を行った c N.D. は未検出を示す。 (d) C末端アミノ酸分析 1) c ND of analysis using a phenylene Moltrasio Chio hydantoin 0.99 pmo l denotes the undetected. (d) C-terminal amino acid analysis
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyze r) を用いて決定した。 得られた ZAQリガンドは DNAの塩基配列から推定さ れた C末端アミノ酸と -一致した （表 3) 。  The C-terminal amino acid was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). The obtained ZAQ ligand was in agreement with the C-terminal amino acid deduced from the DNA base sequence (Table 3).
C末端アミノ酸 回収率 （％) P h e 49. 8 気相ヒ ドラジン分解法 （100°C， 3. 5時間） (e) 質量分析 C-terminal amino acid recovery (%) Phe 49.8 Gas phase hydrazine decomposition method (100 ° C, 3.5 hours) (e) Mass spectrometry
質量分析を nanoESIィオン源を装着した LCQィオントラップ質量分析計 （サーモ クェスト社製） を用いて行った。 その結果、 分子量％57.55±0.89が得られ、 配 列番号： 21の、 しかも配列番号： 21が有する 10残基の C y sが 5対のジス ルフィド結合を形成した Z AQリガンドの理論分子量 (9657, 3)と良く一致してい た。 実施例 1一 6 Z AQリガンドの活性測定 （FLIPRを用いた細胞內 Caィオン濃度 上昇活性の測定）  Mass spectrometry was performed using an LCQ ion trap mass spectrometer (manufactured by ThermoQuest) equipped with a nanoESI ion source. As a result, a molecular weight% of 57.55 ± 0.89 was obtained, and the theoretical molecular weight of the ZAQ ligand of SEQ ID NO: 21 and 10 residues of Cys of SEQ ID NO: 21 in which 5 pairs of disulfide bonds were formed (9657 , 3). Example 11 Measurement of Activity of 6 Z AQ Ligand (Measurement of Cell-Caion Concentration Elevation Activity Using FLIPR)
実施例 1一 4で得られた純化された大腸菌由来の組換え型 ZAQリガンド標品 を参考例 （4一 3— 4) の方法を用いて、 活性測定 （FLIPRを用いた細胞内 Caィ オン濃度上昇活性の測定） を行った。 その結果、 参考例 （4一 3— 3) で得られ た C0S7細胞由来の組換え型標品 （Z AQリガンドの精製品） と同等の活性を有し ていた。 実施例 2 大腸菌でのヒト Z AQリガンド （配列番号： 30, ヒト型 Bv 8) の 実施例 2— 1 大腸菌でのヒト ZAQリガンド （ヒ ト型 Bv 8) 発現プラスミ ド Example 14 Using the purified recombinant E. coli-derived ZAQ ligand sample obtained in 1-4, the method of Reference Example (4-1-3-4) was used to measure the activity (intracellular Ca ion using FLIPR). Measurement of concentration increasing activity). As a result, it had an activity equivalent to that of the C0S7 cell-derived recombinant sample (purified ZAQ ligand) obtained in Reference Example (4-1-3-3). Example 2 of human Z AQ ligand (SEQ ID NO: 30, human Bv 8) in E. coli Example 2-1 Human ZAQ ligand (human Bv8) expression plasmid in E. coli
(a) 以下に示す 6種の DNA断片 # 1〜# 6を用いて、 ヒト型 Bv 8の構造遺 伝子を調製した。 (a) A human Bv8 structural gene was prepared using the following six DNA fragments # 1 to # 6.
#1 ： # 1:
5， - TATGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGATAAAGATAGCCAGTGCGGTGGCGGTATGTGCTGTGCGGTGA 5,-TATGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGATAAAGATAGCCAGTGCGGTGGCGGTATGTGCTGTGCGGTGA
GCATTTGGGTGAAA -3' (配列番号： 32) 、 GCATTTGGGTGAAA -3 '(SEQ ID NO: 32),
#2:  # 2:
5' - AGCATTCGTATTTGCACCCCGATGGGCAAACTGGGCGATAGCTGCCATCCGCTGACCCGTAAAGTGCC GTTTTTTGGCCGCC -3， （配列番号： 33) 、 5'-AGCATTCGTATTTGCACCCCGATGGGCAAACTGGGCGATAGCTGCCATCCGCTGACCCGTAAAGTGCC GTTTTTTGGCCGCC-3, (SEQ ID NO: 33),
#3: # 3:
5，- GTATGCATCATACCTGCCCGTGCCTGCCGGGCCTGGCGTGCCTGCGCACCAGCTTTAACCGCTTTATT TGCCTGGCGCAGAAATAGG -3' (配列番号： 34) 、  5,-GTATGCATCATACCTGCCCGTGCCTGCCGGGCCTGGCGTGCCTGCGCACCAGCTTTAACCGCTTTATT TGCCTGGCGCAGAAATAGG -3 '(SEQ ID NO: 34),
#4: #Four:
5， - CGAATGCTTTTCACCCAAATGCTCACCGCACAGCACATACCGCCACCGCACTGGCTATCTTTATCGCA 5,-CGAATGCTTTTCACCCAAATGCTCACCGCACAGCACATACCGCCACCGCACTGGCTATCTTTATCGCA
CGCACCGGTAATCACCGCCA -3， （配列番号： 35) 、 CGCACCGGTAATCACCGCCA-3, (SEQ ID NO: 35),
#5:  #Five:
5' - ATGATGCATACGGCGGCCAAAAAACGGCACTTTACGGGTCAGCGGATGGCAGCTATCGCCCAGTTTGC CCATCGGGGTGCAAATA -3' (配列番号： 36) 、  5'-ATGATGCATACGGCGGCCAAAAAACGGCACTTTACGGGTCAGCGGATGGCAGCTATCGCCCAGTTTGC CCATCGGGGTGCAAATA -3 '(SEQ ID NO: 36),
#6: # 6:
5， - GATCCCTATTTCTGCGCCAGGCAAATAAAGCGGTTAAAGCTGGTGCGCAGGCACGCCAGGCCCGGCAG GCACGGGCAGGT -3' (配列番号： 37) 。 (b)DNAオリゴマーのリン酸化  5,-GATCCCTATTTCTGCGCCAGGCAAATAAAGCGGTTAAAGCTGGTGCGCAGGCACGCCAGGCCCGGCAG GCACGGGCAGGT -3 '(SEQ ID NO: 37). (b) Phosphorylation of DNA oligomer
5 ' 側になるべき上記 # 1および # 6を除いた 4種の DNAオリゴマー （# 2 〜# 5) 各々を、 25 μ 1のリン酸化反応液 〔DNAオリゴマー 10 μ g, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, ImMスペルミジン， 10m M ジチオスレィ トール （以後 DTTと略記） ， 0. lmg/m 1ゥシ血清アルブ ミン （以後 B S Aと略記） ， ImM ATP, 10ユニット T 4ポリヌクレオチ ドキナーゼ （宝酒造） 〕 中で 37°C ' 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5' 末端 をリン酸化した。 フエノール処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 一 7 0°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。 Each of the four DNA oligomers (# 2 to # 5) excluding # 1 and # 6 above, which should be on the 5 'side, was added to 25 μl of phosphorylation reaction solution (DNA oligomer 10 μg, 50 mM Tris-HCl , pH 7.6, 10 mM MgCl 2 , ImM spermidine, 10 mM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT), 0.1 mg / m 1 ゥ serum album Min (hereinafter abbreviated as BSA), ImM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end of each oligomer. After the phenol treatment, 2 volumes of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and DNA was precipitated by centrifugation.
(c)DN Aフラグメントの連結 (c) Concatenation of DNA fragments
上記 (b) で得られた DNAフラグメントと上記 #1および #6を合わせ、 1 20 μ 1とした。 この混合液を 90°Cで 10分間保持した後、 室温まで徐冷しァ ニーリングを行った後、 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてラ ィゲーシヨン反応を行った。 アニーリング液 30 μ 1にキットに付属の I I液 3 Ομ ΐを加え、 よく混合した後、 キットに付属の I液 60 1を加え、 37°C ' 1時間反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 その後、 フエノール処理を行ない、 水層を回収して 2倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。 この様にして得られた DNAフラグメントを T4ポリヌクレオ チドキナーゼ （宝酒造） によるリン酸化を行った後、 以下の工程（d)に供した。 (d) ヒト型 B V 8発現ベクターの構築  The DNA fragment obtained in (b) above was combined with # 1 and # 6 to give 120 μl. The mixture was kept at 90 ° C. for 10 minutes, cooled slowly to room temperature, annealed, and subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). To 30 µl of the annealing solution, 3 µm of the II solution attached to the kit was added, and the mixture was thoroughly mixed. Then, the solution of 601 included in the kit was added, and reacted at 37 ° C for 1 hour to perform ligation. After that, phenol treatment was performed, the aqueous layer was recovered, twice the amount of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and DNA was precipitated by centrifugation. The thus obtained DNA fragment was subjected to phosphorylation with T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) and then subjected to the following step (d). (d) Construction of human BV8 expression vector
発現用べクタ としては p TC I I (特開 2000-178297号公報に記載） を Nd e Iおよび B a mH I (宝酒造） で 37°C · 2時間消化した後、 1 %ァガロース ゲル電気泳動により 4.3 kbの DN A断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キア ゲン社） を用いて抽出し、 25 μ 1の TE緩衝液に溶解した。 この pTC I Iの Nd e l、 B amHI断片と上記により調製したヒト型 Bv 8の構造遺伝子 （配 列番号： 39) を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲー シヨン反応を行った。 この反応液を 10 1用いて大腸菌 JM109コンビテン トセル （東洋紡） を形質転換し、 10 μ gZm 1のテトラサイクリンを含む LB 寒天培地上に播き、 37°Cで 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニー 選んだ。 この形質転換体を LB培地で一晚培養し、 QIAprep8 Miniprep Kit (キ ァゲン社） を用いてプラスミド pTCh 2 ZAQを調製した。 このヒト型 Bv 8 DNAの塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル 377 DN Aシーケン サーを用いて確認した。 プラスミド pTCh 2 ZAQを大腸菌 （Escherichia col i) MM 294 (DE 3) に形質転換し、 ヒト型 B v 8発現株 Escherichia coli 匿 294 (DE3) I pTCh2ZAQを得た。 実施例 2— 2 ヒ ト型 B v 8の製造 As an expression vector, pTCII (described in JP-A-2000-178297) was digested with NdeI and BamHI (Takara Shuzo) at 37 ° C for 2 hours, and then subjected to 1% agarose gel electrophoresis. The 4.3 kb DNA fragment was extracted using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 μl of TE buffer. A ligation reaction was carried out between the Ndel and BamHI fragments of pTC II and the human Bv8 structural gene (SEQ ID NO: 39) prepared above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with 10 1 of this reaction solution, seeded on LB agar medium containing 10 μg Zm 1 of tetracycline, cultured at 37 ° C for 1 晚, and the resulting tetracycline-resistant colonies were selected. It is. This transformant was cultured once in an LB medium, and plasmid pTCh2ZAQ was prepared using QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen). The nucleotide sequence of this human Bv8 DNA was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer. The plasmid pTCh2ZAQ was transformed into Escherichia coli MM294 (DE3), and the human Bv8 expression strain Escherichia coli was transformed. Obtained 294 (DE3) I pTCh2ZAQ. Example 2-2 Production of Human Bv8
上記の Escherichia coli MM294(DE3)/ pTCh2ZAQを 5. 0 m g/Lのテトラサ イクリンを含む LB培地 · 1 L (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） を用いて 2 L容フラスコ中で 3 7°C、 8時間振とう培養した。 得られた培養液を 1 9 Lの主発酵培地 （1. 68%リン酸 1水素ナトリウム、 0 . 3%リン酸 2水素カリウム、 0. 1%塩化アンモニゥム、 0. 0 5%塩ィ匕ナト リウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 0002 5%硫 酸第 1鉄、 0. 0005 %塩酸チアミン、 1. 5 %ブドゥ糖、 1. 50 /。ハイケー スァミノ） を仕込んだ 50 L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気攪拌を開始した 。 培養液の濁度が 500クレット単位になったところで、 イソプロピル一 β—D 一チォガラタトピラノシドの最終濃度が 1 2mg/Lになるように添加し、 さら に 4時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 500 gの湿菌体 を取得し、 一 80°Cで保存した。 実施例 2— 3 ヒト型 B v 8の活性化 Escherichia coli MM294 (DE3) / pTCh2ZAQ was added to LB medium containing 5.0 mg / L tetracycline in 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride). The cells were shake-cultured at 37 ° C for 8 hours in an L-volume flask. The obtained culture solution was added to a 19 L main fermentation medium (1.6% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride). potassium, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% antifoaming agent, 0.0002 5% sulfuric acid ferrous, 0.0005% thiamine hydrochloride, 1.5% Budu sugar, 1.5 0 /. Haike Suamino ) Was transferred to a 50-L fermenter equipped with, and aerated stirring was started at 30 ° C. When the turbidity of the culture broth reached 500 klet units, isopropyl-1-β-D-thiogalatatopyranoside was added so that the final concentration became 12 mg / L, and culturing was further performed for 4 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged to obtain about 500 g of wet cells and stored at 180 ° C. Example 2-3 Activation of human type Bv8
実施例 2— 2で得られた菌体 400 gに、 20 OmMトリス ZHC 1、 7Mグ ァニジン塩酸塩 (pH8. 0) 800m lを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (l O O O O r m, 1時間） を行った。 上澄液に 0. 4 Mアルギニン、 50m Mトリス/ HC 1、 0. 2mM GS SG、 1 mM GSH (pH8. 0) 20 リットルを加えて、 4 °Cでー晚活性化を行った。 実施例 2— 4 ヒト型 B v 8の精製  To 400 g of the cells obtained in Example 2-2, 800 ml of 20 OmM Tris ZHC 1, 7 M guanidine hydrochloride (pH 8.0) was added to dissolve the cells, followed by centrifugation (l OOOO rm, 1 hour). 20 liters of 0.4 M arginine, 50 mM Tris / HC1, 0.2 mM GS SG, and 1 mM GSH (pH 8.0) were added to the supernatant, and activated at 4 ° C. Example 2-4 Purification of human Bv8
実施例 2— 3で活性化の終了した再生液を p H 6. 0に調整し、 50 mMリン 酸緩衝液 (pH6. 0) で平衡ィ匕した S P—セファロースカラム （1 1. 3 cm X I 5 cm) に吸着させた後、 6 0 OmM Na C 1ノ5 OmMリン酸緩衝液 （ pH6. 0) で溶出し、 ヒト型 B v 8を含むフラクションをプールした。 この画 分を 50mM リン酸緩衝液 (pH6. 0) で平衡ィ匕した S P— 5 PW (2 1. 5mmX 15 OmmL) に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 100%B (B = 5 OmM リン酸緩衝液 + 1M NaCl、 pH6. 05) の段階勾配 （60分） で溶 出を行いヒト型 B v 8画分 （溶出時間約 40分） を得た。 この画分を、 さらに 0 . 1 %トリフルォロ酢酸で平衡ィヒした C4P— 50 (21. 5 mm I D X 300 m mL、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 25— 50%B (B ： 80%ァ セトニトリル/ 0. 1 %トリフルォロ酢酸） の段階勾配 （60分） で溶出を行い 、 ヒト型 Bv 8画分 （溶出時間約 30分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ヒ ト型 B V 8凍結乾燥粉末約 25m を得た。 実施例 2— 5 ヒト型 Bv 8の特徴決定 The regenerated solution that had been activated in Example 2-3 was adjusted to pH 6.0, and SP-Sepharose column (11.3 cm XI) was equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0). After elution with 60 OmM NaCl-5 OmM phosphate buffer (pH 6.0), the fractions containing human Bv8 were pooled. This fraction was equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) and SP-5 PW (21. 5mmX 15 OmmL), adsorbed and washed, and eluted with a step gradient (60 minutes) of 0-100% B (B = 5 OmM phosphate buffer + 1 M NaCl, pH 6.05). A type Bv8 fraction (elution time: about 40 minutes) was obtained. The fraction was further passed through C4P-50 (21.5 mm IDX, 300 mL, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, and adsorbed and washed. B: Elution was performed with a step gradient (60 minutes) of 80% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid. After pooling the eight human Bv fractions (elution time: about 30 minutes), lyophilization was performed. Approximately 25 m of lyophilized BV8 lyophilized powder was obtained. Example 2-5 Characterization of human Bv8
(a) S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析  (a) Analysis using SDS polyacrylamide gel electrophoresis
実施例 2— 4で得られたヒト型 B V 8を 10 OmM DTTを添加した S am p i e b u f f e r [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95°C で 1分間加熱した後、 マルチゲル 15/ 25 (第一化学薬品） で電気泳動を行つ た。 泳動後のゲノレをクーマシー ·プリリアント ·ブルー (Coomassie brilliant blue) で染色した結果、 9 kD aの位置に単一の蛋白パンドが認められた。 この ことから、 実施例 2— 4で得られた大腸菌由来の組換え型ヒト型 B V 8の標品は 極めて高純度であることが分かった。  Human BV8 obtained in Example 2-4 was suspended in Sampiebuffer [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] supplemented with 10 OmM DTT, and heated at 95 ° C for 1 minute. Electrophoresis was performed on 15/25 (Daiichi Pure Chemicals). Genole after electrophoresis was stained with Coomassie brilliant blue, and as a result, a single protein band was observed at 9 kDa. From this, it was found that the recombinant human BV8 preparation derived from Escherichia coli obtained in Examples 2 to 4 was extremely high in purity.
(b) アミノ酸組成分析  (b) Amino acid composition analysis
ァミノ酸組成をァミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyzer ) を用いて決定した。 その結果、 ヒト型 Bv 8 (配列番号： 30で表されるアミ ノ酸配列からなるペプチド） の DNAの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と 一致した （表 4) 。 . Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). As a result, it was consistent with the amino acid composition deduced from the DNA base sequence of human Bv8 (a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30) (Table 4). .
表 4 モノレ当たりの ヒト型 B V 8の塩基配列 アミノ酸 残 基 数— から予測される値 Table 4 Nucleotide sequence of human BV8 per monole Number predicted from amino acid residue number
A s 4. 0 4 A s 4.04 4
Th r D 4. 6 5  Th r D 4.65
S e r x) 4 3 5 Ser x) 4 3 5
G 1 2 3 2  G 1 2 3 2
P r o 5 2 5  Pro 5 2 5
G 1 y 7 8 8  G 1 y 7 8 8
A 1 a 5 0 5  A 1 a 5 0 5
Cy s 2) N. D. 0 Cy s 2) ND 0
V a 1 3. 8 4  V a 1 3. 8 4
Me t 2 8 3  Me t 2 8 3
I 1 e 4 2 5  I 1 e 4 2 5
L e u 6 6  L e u 6 6
T y r 0 0  T y r 0 0
P h e 3 7 4  P he 3 7 4
H i s 2 9 3  H is 2 9 3
L y s 4 9 5  L y s 4 9 5
A r g 5 8 6  A r g 5 8 6
T r p 0 9. 1 酸加水分解 （6 N HC 1—4%チォグリコール酸、 1 10°C、 24及ぴ 48時 間加水分解の平均値）  Trp09.1 Acid hydrolysis (6 N HC 1-4% thioglycolic acid, average value of hydrolysis at 110 ° C, 24 and 48 hours)
1) 0時間に外挿した値  1) Extrapolated to 0 hours
2) 未検出 (c) N末端アミノ酸配列分析 2) Not detected (c) N-terminal amino acid sequence analysis
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （PEアプライドバイオシ ステムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒ ト型 B V 8 の DNAの塩基配列から推定されたヒト型 B V 8の N末端アミノ酸配列と一致し た （表 5) 。 The N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of human BV8 deduced from the nucleotide sequence of the obtained human BV8 DNA (Table 5).
表 5 検出された ヒ ト型 B V 8の塩基配列 Table 5 Detected nucleotide sequence of human BV8
残基 No PTH -アミノ酸1) から予測される Predicted from residue No PTH-amino acid 1 )
(pmol) アミノ酸 ―  (pmol) Amino acid ―
A 1 a (103) A 1 a  A 1 a (103) A 1 a
2 V a 1 (99) V a 1  2 V a 1 (99) V a 1
3 I 1 e (88) I 1 e  3 I 1 e (88) I 1 e
4 Th r (54) Th r  4 Th r (54) Th r
5 G 1 y (66) G 1 y  5 G 1 y (66) G 1 y
6 A 1 a (79) A 1 a  6 A 1 a (79) A 1 a
7 N. D. C y s  7 N.D.C y s
8 A s p (47) As  8 A s p (47) As
9 L y s (62) L y s  9 Lys (62) Lys
0 A s p (50) As  0 A s p (50) As
S e r (36) S e r  S e r (36) S e r
12 G 1 n (52) G 1 n  12 G 1 n (52) G 1 n
1 3 N. D. C y s  1 3 N.D.C y s
14 G 1 y (44) G 1 y  14 G 1 y (44) G 1 y
15 G 1 y (55) G 1 y  15 G 1 y (55) G 1 y
16 G 1 y (56) G 1  16 G 1 y (56) G 1
1 7 Me t (50) Me t  1 7 Me t (50) Me t
18 N. D. C y s  18 N. D. Cys
1 9 N. D. C y s  1 9 N.D.C y s
20 A 1 a (33)一 A 1 a  20 A 1 a (33) One A 1 a
1) PTH (フェニールチオヒダントイン） 誘導体として検出した。 ヒ ト型 B v 8を 150 pmo l用いて分析を行った。 1) It was detected as a PTH (phenylthiohydantoin) derivative. Analysis was performed using 150 pmol of human Bv8.
N. D. は未検出を示す。 (d) C末端アミノ酸分析 ND indicates not detected. (d) C-terminal amino acid analysis
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L—8500A Amino Acid Analyze r) を用いて決定した。 得られたヒト型 B V 8は DNAの塩基配列から推定され た C末端アミノ酸と一致した （表 6) 。 表 6  The C-terminal amino acid was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). The obtained human BV8 coincided with the C-terminal amino acid deduced from the nucleotide sequence of the DNA (Table 6). Table 6
C末端アミノ酸 回収率 （％) C-terminal amino acid recovery (%)
L y s 18. 9 気相ヒドラジン分解法 （100°C， 3. 5時間） Lys 18.9 Gas phase hydrazine decomposition method (100 ° C, 3.5 hours)
(e) 質量分析 (e) Mass spectrometry
質量分析を n a n oES Iイオン源を装着'  Attach mass spectrometry with nanoESI ion source '
計 （サーモクエストネ土製） を用いて行った。 その結果、 分子量 8792. 8 ±0 . 5力 S得られ、 配列番号： 30の、 しかも配列番号： 30が有する 10残基の C y sが 5対のジスルフィド結合を形成したヒト型 B V 8の理論分子量 (8792.5)と 良く一致していた。 実施例 2— 6 ヒ ト型 Bv 8の活性測定 （FLIPRを用いた細胞内 Caィオン濃度上 昇活性の測定） The measurement was performed using a total (made by ThermoQuestone clay). As a result, a molecular weight of 879.2 ± 0.5 force S was obtained, and the theory of human BV8 of SEQ ID NO: 30, and in which the 10-residue Cys of SEQ ID NO: 30 formed 5 pairs of disulfide bonds It was in good agreement with the molecular weight (8792.5). Example 2-6 Measurement of human Bv8 activity (measurement of intracellular Ca ion concentration increasing activity using FLIPR)
実施例 2— 4で得られた純化された大腸菌由来の組換え型ヒト型 Bv 8標品を 参考例 （4一 3— 4) の方法を用いて、 活性測定 （FLIPRを用いた細胞内 Caィォ ン濃度上昇活性の測定） を行った。 その結果、 CH0細胞由来の組換え型標品 （ヒ ト型 B v 8の精製品） と同等の活性を有していた。 産業上の利用の可能性 本発明の製造法は、 従来の製造法に比べ、 薬理的に活性な Z AQリガンドをェ 業的に大量にかつ効率的に製造するために有用である。 Using the purified recombinant Escherichia coli-derived Bv8 preparation obtained in Example 2-4, the activity was measured (intracellular Ca using FLIPR) using the method of Reference Example (4-1-3-4). Measurement of ion concentration increasing activity). As a result, it had an activity equivalent to that of the recombinant sample derived from CH0 cells (purified human Bv8). Industrial applicability The production method of the present invention is useful for industrially producing a pharmacologically active ZAQ ligand in a large amount and efficiently as compared with the conventional production method.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性ィ匕する能力を有するぺプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原核 細胞宿主中で発現させ、 レドックスバッファ一中でリフォールデイングすること を特徴とする配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパ ク質またはその塩を活性ィヒする能力を有する活性型のペプチドまたはその塩の製 造方法。 1. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof. Alternatively, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, characterized in that a salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering and refolded in a redox buffer. A method for producing an active peptide or a salt thereof, which has the ability to bind to a protein or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof.
2 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 2 1で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺ プチドまたはその塩である請求項 1記載の製造方法。  2. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or the salt thereof, or 2. The method according to claim 1, wherein the salt is an peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a salt thereof.
3 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 2 1で 表わされるアミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその塩である請求項 1記載の 製造方法。  3. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof, or The method according to claim 1, wherein the salt is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a salt thereof.
4 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 1 9で 表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩である請求項 1記載の 製造方法。  4. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof, or The method according to claim 1, wherein the salt is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or a salt thereof.
5 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 3 0で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺ プチドまたはその塩である請求項 1記載の製造方法。 5. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof, or a peptide thereof. The salt has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30. 2. The method according to claim 1, which is a peptide or a salt thereof.
6 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質また はその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩が、 配列番号： 3 0で 表わされるァミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩である請求項 1記載の 製造方法。  6. A peptide having the ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof; 2. The method according to claim 1, wherein the salt is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 or a salt thereof.
7. 配列番号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるァミノ酸配列と同一また は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその塩を遺伝子工学的 に原核細胞宿主中で発現させ、 レドックスバッファ一中でリフォールディングす ることを特徴とする活性型の該ぺプチドまたはその塩の製造方法。  7. Genetically engineered peptide or salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 in a prokaryotic host And refolding in a redox buffer, the method for producing the active form of the peptide or a salt thereof.
8 . 配列番号： 2 1、 配列番号： 1 9または配列番号： 3 0で表わされるァミノ 酸配列を含有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現 させ、 レドックスバッファ一中でリフォールデイングすることを特徴とする活性 型のぺプチドまたはその塩の製造方法。  8. A peptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically engineered in a prokaryotic host, and is expressed in a redox buffer. A method for producing an active peptide or a salt thereof, which is characterized by refolding.
9 . レドックスバッファ一が還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを含 有する緩衝液である請求項 1記載の製造方法。  9. The method according to claim 1, wherein the redox buffer is a buffer containing reduced glutathione and oxidized glutathione.
1 0 . レドックスバッファ一中の還元型ダルタチオンおょぴ酸化型ダルタチオン の濃度が、 それぞれ約 0 . 0 1〜 1 0 0ミリモル/リットルである請求項 9記載 の製造方法。  10. The production method according to claim 9, wherein the concentration of reduced daltathione and oxidized daltathione in the redox buffer is about 0.01 to 100 mmol / liter, respectively.
1 1 緩衝液がトリス緩衝液である請求項 8記載の製造方法。  9. The method according to claim 8, wherein the 11 buffer is a Tris buffer.
1 2 レドックスバッファーの p Hが 7から 9の範囲である請求項 1記載の製造 方法,  12.The method according to claim 1, wherein the pH of the redox buffer is in the range of 7 to 9.
1 3 レドックスバッファーの p Hが約 8である請求項 1記載の製造方法。 1 4 レドックスバッファーが、 メルカプト基を有さないアミノ酸を、 さらに含 有する請求項 1記載の製造方法。  The method according to claim 1, wherein the pH of the 13 redox buffer is about 8. 14. The production method according to claim 1, wherein the 14 redox buffer further contains an amino acid having no mercapto group.
1 5 . メルカプト基を有さないアミノ酸がアルギニンである請求項 1 4記載の製 造方法。  15. The production method according to claim 14, wherein the amino acid having no mercapto group is arginine.
1 6 . メルカプト基を有さないアミノ酸のレドックスバッファ一中の濃度が約 0 リットルである請求項 1 4記載の製造方法。 16. The method according to claim 14, wherein the concentration of the amino acid having no mercapto group in the redox buffer is about 0 liter.
1 7 . 0〜 3 0 °C下でリフォールディングする請求項 1記載の製造方法。 2. The production method according to claim 1, wherein the refolding is performed at 170 to 30 ° C.
1 8 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原 核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を可溶ィ匕し、 ついでレドックスバッファ一中で リフォールディングする請求項 1記載の製造方法。  18. The ability to bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or to activate the protein or a salt thereof. The production method according to claim 1, wherein the peptide or the salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, the cells are solubilized, and then refolded in a redox buffer.
1 9 · 配列番号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるァミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するべプチドまたはその塩を遺伝子工学 的に原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を可溶化し、 ついでレドックスバッファ 一中でリフォールディングする請求項 7記載の製造方法。  1 9 · A peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically engineered into a prokaryotic host. The method according to claim 7, wherein the cells are solubilized, and the cells are solubilized, and then refolded in a redox buffer.
2 0 . 還元剤非存在下で可溶化する請求項 1 8または請求項 1 9記載の製造方法  20. The method according to claim 18 or claim 19, wherein the solubilization is carried out in the absence of a reducing agent.
2 1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性化する能力を有するぺプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原 核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を変性剤で可溶ィヒし、 ついでメルカプト基を有 さないァミノ酸をさらに含有する p H 7〜 9のレドックスバッファ一で、 変性剤 を不作用濃度まで希釈することを特徴とする請求項 1記載の製造方法。 21. Has the ability to bind to or activate a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 The peptide or a salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, the cells are solubilized with a denaturing agent, and then the pH 7 to 9 further containing an amino acid having no mercapto group. 2. The method according to claim 1, wherein the denaturing agent is diluted to an inactive concentration with a redox buffer.
2 2 . 配列番号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるァミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するぺプチドまたはその塩を遺伝子工学 的に原核細胞宿主中で発現させ、 該細胞を変性剤で可溶化し、 ついでメルカプト 基を有さないァミノ酸をさらに含有する p H 7〜 9のレドックスバッファーで、 変性剤を不作用濃度まで希釈することを特徴とする請求項 7記載の製造方法。 2 3 . 変性剤がグァニジンまたは尿素である請求項 2 1または請求項 2 2記載の 製造方法。  22. A peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 or a salt thereof is genetically engineered into a prokaryotic host. And solubilizing the cells with a denaturing agent, and then diluting the denaturing agent to an inactive concentration with a redox buffer having a pH of 7 to 9 further containing an amino acid having no mercapto group. 8. The production method according to claim 7, wherein: 23. The method according to claim 21, wherein the denaturing agent is guanidine or urea.
2 4 . 希釈液中の変性剤の濃度が、 約 0〜 2モル/リットルになるまで、 レドッ クスバッファーで希釈する請求項 2 1または請求項 2 2記載の製造方法。  24. The production method according to claim 21 or 22, wherein the diluent is diluted with a redox buffer until the concentration of the denaturing agent in the diluent is about 0 to 2 mol / l.
2 5 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結合する、 または該タンパク質ま たはその塩を活性ィ匕する能力を有するペプチドまたはその塩を遺伝子工学的に原 核細胞宿主中で発現させ、 形成された封入体に存在する該ぺプチドまたはその塩 を、 レドックスバッファ一中でリフオールディングする請求項 1記載の製造方法 2 6 . ぺプチドが、 配列番号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドである請求項 2 5記載の製造方法。 25. Binds to, or binds to, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof. Alternatively, a peptide having the ability to activate a salt thereof or a salt thereof is expressed in a prokaryotic host by genetic engineering, and the peptide or a salt thereof present in the formed inclusion body is converted into a redox buffer. 2. The method according to claim 1, wherein the peptide comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30. 26. The production method according to claim 25, wherein
2 7 . 配列番号： 2 1または配列番号： 3 0で表わされるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドを遺伝子工学的に発現させ た原核細胞宿主を、 変性剤で可溶ィ匕し、 ついでメルカプト基を有さないアミノ酸 27. A prokaryotic host in which a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 30 has been genetically engineered to be denatured Amino acid without mercapto group
、 還元型ダルタチオンおよぴ酸化型グルタチオンを含有する緩衝液と反応させる 活性型の該ぺプチドまたはその塩の製造方法。 A method for producing an active form of the peptide or a salt thereof, which is reacted with a buffer containing reduced daltathione and oxidized glutathione.
1/24 1/24
[SEQUENCE LISTING] [SEQUENCE LISTING]
く 110〉 Takeda Chemical Industries, Ltd. く 120〉 Method of Producing ZAQ l igand 110> Takeda Chemical Industries, Ltd. K 120> Method of Producing ZAQ l igand
〈130〉 P01-0292PCT く 150〉 JP 2001-13027 <130> P01-0292PCT K 150> JP 2001-13027
<151> 2001-01-22 <151> 2001-01-22
<150> JP 2001-147759 <150> JP 2001-147759
<151> 2001-05-17 <151> 2001-05-17
<160> 41 <160> 41
〈210〉 1 <210> 1
<211> 393 <211> 393
く 212〉 PRT K 212> PRT
<213> Human く柳〉 1 <213> Human Kuyanagi> 1
Met Glu Thr Thr Met Gly Phe Met Asp Asp Asn Ala Thr Asn Thr Ser  Met Glu Thr Thr Met Gly Phe Met Asp Asp Asn Ala Thr Asn Thr Ser
5 10 15 5 10 15
Thr Ser Phe Leu Ser Val Leu Asn Pro His Gly Ala His Ala Thr Ser Thr Ser Phe Leu Ser Val Leu Asn Pro His Gly Ala His Ala Thr Ser
20 25 30  20 25 30
Phe Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu  Phe Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu
35 40 45 2/24 35 40 45 2/24
Asp Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys lie ValAsp Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys lie Val
50 55 60 50 55 60
lie Gly Met Ala Leu Val Gly lie Met Leu Val Cys Gly He Gly Asn 65 70 75 80lie Gly Met Ala Leu Val Gly lie Met Leu Val Cys Gly He Gly Asn 65 70 75 80
Phe lie Phe lie Ala Ala Leu Val Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu Phe lie Phe lie Ala Ala Leu Val Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Asn Leu Leu He Ala Asn Leu Ala lie Ser Asp Phe Leu Val Ala Thr Asn Leu Leu He Ala Asn Leu Ala lie Ser Asp Phe Leu Val Ala
100 105 110 lie Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gin Leu  100 105 110 lie Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gin Leu
115 120 125  115 120 125
Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Thr Ser Val Asn Tyr Leu Arg Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Thr Ser Val Asn Tyr Leu Arg
130 135 140 130 135 140
Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala l ie Ala lie 145 150 155 160 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala lie Ala lie 145 150 155 160
Asp Arg Tyr Leu Ala l ie Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys Asp Arg Tyr Leu Ala lie Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys
165 170 175 165 170 175
Gin Thr Ala Thr Gly Leu l ie Ala Leu Val Trp Thr Val Ser lie Leu Gin Thr Ala Thr Gly Leu lie Ala Leu Val Trp Thr Val Ser lie Leu
180 185 190 l ie Ala l ie Pro Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val lie  180 185 190 l ie Ala lie Pro Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val lie
195 200 205  195 200 205
Val Lys Ser Gin Glu Lys l ie Phe Cys Gly Gin l ie Trp Pro Val Asp Val Lys Ser Gin Glu Lys lie Phe Cys Gly Gin lie Trp Pro Val Asp
210 215 220 210 215 220
Gin Gin Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe lie Phe Gly lie Glu 225 230 235 240 Gin Gin Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe lie Phe Gly lie Glu 225 230 235 240
Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg lie Ser Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg lie Ser
245 250 255 245 250 255
Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gin Thr Glu Gin lie 3/24 Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gin Thr Glu Gin lie 3/24
260 265 270 260 265 270
Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu Val Leu Met Cys  Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu Val Leu Met Cys
275 280 285  275 280 285
lie Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr lie Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr
290 295 300  290 295 300
lie Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320lie Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320
Leu Thr Ala Phe Tyr lie Val Glu Cys lie Ala Met Ser Asn Ser Met Leu Thr Ala Phe Tyr lie Val Glu Cys lie Ala Met Ser Asn Ser Met
325 330 335  325 330 335
lie Asn Thr Leu Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asp Thr Val Lys Tyr lie Asn Thr Leu Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asp Thr Val Vals Tyr
340 345 350  340 345 350
Phe Lys Lys lie Met Leu Leu His Trp Lys Ala Ser Tyr Asn Gly Gly  Phe Lys Lys lie Met Leu Leu His Trp Lys Ala Ser Tyr Asn Gly Gly
355 360 365  355 360 365
Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys Thr lie Gly Met Pro Ala Thr  Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys Thr lie Gly Met Pro Ala Thr
370 · 375 380  370 375 380
Glu Glu Val Asp Cys lie Arg Leu Lys  Glu Glu Val Asp Cys lie Arg Leu Lys
385 390 く 210〉 2 385 390 ku 210〉 2
く 211〉 1179 C 211> 1179
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Human く 400〉 2 K 213〉 Human K 400〉 2
atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgacca attccaggac gttctttgct 180 atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgaccg attccttggct gtt
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
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〉 < 〉窗曰 6/24 ＞ <＞ Window 6/24
gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 く 210〉 5 gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 ku 210〉 5
<211> 36 <211> 36
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Sequence く 220〉 K 213〉 Artificial Sequence K 220〉
く 223〉 Primer く棚〉 5 K 223> Primer K shelf> 5
actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36 actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36
<210> 6 <210> 6
く 211〉 16 C 211> 16
<212> PRT <212> PRT
く 213〉 Bovine 213〉 Bovine
<400> 6 <400> 6
Ala Val lie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly  Ala Val lie Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly
5 10 15 く 210〉 7  5 10 15 ku 210〉 7
く 211〉 28 K 211> 28
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence く 220〉 <223> Primer く棚〉 7 K 213〉 Artificial Seauence K 220〉 <223> Primer shelf> 7
ggtgccacgc gagtctcaat catgctcc 28 ggtgccacgc gagtctcaat catgctcc 28
<210> 8 <210> 8
く 211〉 28 K 211> 28
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Artificial Sequence く 220〉 K 213〉 Artificial Sequence K 220〉
く 223〉 Primer く柳〉 8 Ku 223> Primer Kuyanagi> 8
ggggcctgtg agcgggatgt ccagtgtg 28 く 210〉 9 ggggcctgtg agcgggatgt ccagtgtg 28 ku 210〉 9
<211> 28 <211> 28
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Sequence <220> 213> Artificial Sequence <220>
く 223〉 Primer く棚〉 9 K 223> Primer K shelf> 9
cttcttcagg aaacgcaagc accacacc 28 8/24 く 210〉 10 cttcttcagg aaacgcaagc accacacc 28 8/24 ku 210〉 10
く 211〉 409 C 211> 409
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Human く 400〉 10 K 213〉 Human K 400〉 10
cttcttcagg aaacgcaagc accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag 60 gttcccggac ggcaggtacc gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct 120 tgcctggtct caggataccc accatccttt tcctgagcac agcctggatt tttatttctg 180 ccatgaaacc cagctcccat gactctccca gtccctacac tgactaccct gatctctctt 240 gtctagtacg cacatatgca cacaggcaga catacctccc atcatgacat ggtccccagg 300 ctggcctgag gatgtcacag cttgaggctg tggtgtgaaa ggtggccagc ctggttctct 360 tccctgctca ggctgccaga gaggtggtaa atggcagaaa ggacattcc 409 cttcttcagg aaacgcaagc accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag 60 gttcccggac ggcaggtacc gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct 120 tgcctggtct caggataccc accatccttt tcctgagcac agcctggatt tttatttctg 180 ccatgaaacc cagctcccat gactctccca gtccctacac tgactaccct gatctctctt 240 gtctagtacg cacatatgca cacaggcaga catacctccc atcatgacat ggtccccagg 300 ctggcctgag gatgtcacag cttgaggctg tggtgtgaaa ggtggccagc ctggttctct 360 tccctgctca ggctgccaga gaggtggtaa atggcagaaa ggacattcc 409
〈210〉 11 <210> 11
<211> 20 <211> 20
<212> DNA <212> DNA
く 213> Artificial Seauence <220> 213> Artificial Seauence <220>
く 223〉 Primer く棚〉 11 K 223> Primer K shelf> 11
ccaccatgag aggtgccacg 20 く 210〉 12 ccaccatgag aggtgccacg 20 ku 210〉 12
く 211〉 24 9/24 C 211> 24 9/24
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence 〈220〉 Ku 213> Artificial Seauence <220>
〈223〉 Primer く 400〉 12  <223> Primer K 400> 12
ctcgagctca ggaaaaggat ggtg 24 ctcgagctca ggaaaaggat ggtg 24
<210> 13 <210> 13
く 211〉 371 K 211> 371
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Human 213> Human
<400> 13 <400> 13
ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aagatcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371 ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aagatcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371
<210> 14 <210> 14
く 211〉 371 K 211> 371
〈212〉 DNA <212> DNA
<213> Human 10/24 <213> Human 10/24
く 400〉 14 C 400> 14
ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aaggtcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371 ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aaggtcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371
〈210〉 15 <210> 15
く 211〉 105 C 211> 105
く 212〉 PRT K 212> PRT
く 213〉 Human く 400〉 15 K 213〉 Human K 400〉 15
Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser lie Met Leu Leu Leu Val Thr Val  Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser lie Met Leu Leu Leu Val Thr Thr Val
5 10 15  5 10 15
Ser Asp Cys Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys  Ser Asp Cys Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys
20 25 30 20 25 30
Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg
35 40 45  35 40 45
Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser  Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser
50 . 55 60  50. 55 60
His Lys lie Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 His Lys lie Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80
Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys
85 90 95 11/24 85 90 95 11/24
Ser Met Asp Leu Lys Asn lie Asn Phe Ser Met Asp Leu Lys Asn lie Asn Phe
100 105  100 105
く 210〉 16 C 210> 16
<211> 315 <211> 315
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213> Human く 400〉 16 K 213> Human K 400> 16
atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaagat ccccttcttc aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc 240 ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctc catggacttg 300 aagaacatca atttt 315 atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaagat ccccttcttc aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc 240 ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctc catggacttg 300 aagaacatca atttt 315
<210> 17 <210> 17
く 211〉 105 C 211> 105
く 212〉 PRT K 212> PRT
<213> Human く柳〉 17 <213> Human Kuyanagi> 17
Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser lie Met Leu Leu Leu Val Thr Val  Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser lie Met Leu Leu Leu Val Thr Thr Val
5 10 15  5 10 15
Ser Asp Cys Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys  Ser Asp Cys Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys
20 25 30 20 25 30
Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg
35 40 45 12/24 35 40 45 12/24
Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser
50 55 60  50 55 60
His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80
Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys
85 90 95  85 90 95
Ser Met Asp Leu Lys Asn l ie Asn Phe  Ser Met Asp Leu Lys Asn lie Asn Phe
100 105  100 105
<210> 18 <210> 18
<211> 315 <211> 315
<212> DNA <212> DNA
<213> Human <213> Human
<400> 18 <400> 18
atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcc tcctag taac tgtgtc tgactgtgc t 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc t tcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaaggt cccct tct tc aggaaacgca agcaccacac c tgtcct tgc 240 t tgcccaacc tgctgtgctc caggt tcccg gacggcaggt accgctgctc catggact tg 300 aagaacatca at t t t 315 く 210〉 19 atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcc tcctag taac tgtgtc tgactgtgc t 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc t tcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaaggt cccct tct tc aggaaacgca agcaccacac c tgtcct tgc 240 t tgcccaacc tgctgtgctc caggt tcccg gacggcaggt accgctgctc catggact tg 300 aagaacatca at ttt 315 C 210> 19
く 211〉 86 C 211> 86
く 212〉 PRT K 212> PRT
く 213〉 Human 13/24 く 400〉 19 213> Human 13/24 c 400> 19
Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys Gly Ala Gly  Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys Gly Ala Gly
5 10 15  5 10 15
Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr  Thr Cys Cys Ala lie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr
20 25 30  20 25 30
Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys lie  Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys lie
35 40 45  35 40 45
Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn  Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn
50 55 60  50 55 60
Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp  Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp
65 70 75 80  65 70 75 80
Leu Lys Asn lie Asn Phe  Leu Lys Asn lie Asn Phe
85  85
<210> 20 <210> 20
く 211〉 258 K 211> 258
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Human く 400〉 20 K 213〉 Human K 400〉 20
gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggcttcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagccacaa gatccccttc ttcaggaaac gcaagcacca cacctgtcct 180 . tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258 gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggcttcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagccacaa gatccccttc ttcaggaaac gcaagcacca cacctgtcct 180. tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258
<210> 21 14/24 <210> 21 14/24
〈211〉 86 <211> 86
〈212〉 PRT <212> PRT
〈213〉 Human く棚〉 21 <213> Human Ku shelf> 21
Ala Val l ie Thr Gly Al a Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys Gly Al a Gly  Ala Val lie Thr Gly Al a Cys Glu Arg Asp Val Gin Cys Gly Al a Gly
5 10 15  5 10 15
Thr Cys Cys Al a l ie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr  Thr Cys Cys Al alie Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr
20 25 30 20 25 30
Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Val Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Val
35 40 45  35 40 45
Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn  Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn
50 55 60  50 55 60
Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp 65 70 75 80 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp 65 70 75 80
Leu Lys Asn l ie Asn Phe Leu Lys Asn lie Asn Phe
85 く 210〉 22  85 ku 210〉 22
く 211〉 258 K 211> 258
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Human く 400〉 22 Ku 213〉 Human ku 400〉 22
gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggct tcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagccacaa ggtcccct tc t tcaggaaac gcaagcacca cacctgtcct 180 15/24 tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258 gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggct tcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagcccacca ggtcacctcac tcagccctcagccctcagccctc 15/24 tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258
〈210〉 23 <210> 23
<211> 382 <211> 382
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213> Human く 400〉 23 K 213> Human K 400> 23
gaattcgccc ttccaccatg agaggtgcca cgcgagtctc aatcatgctc ctcctagtaa 60 ctgtgtctga ctgtgctgtg atcacagggg cctgtgagcg ggatgtccag tgtggggcag 120 gcacctgctg tgccatcagc ctgtggcttc gagggctgcg gatgtgcacc ccgctggggc 180 gggaaggcga ggagtgccac cccggcagcc acaaggtccc cttcttcagg aaacgcaagc 240 accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag gttcccggac ggcaggtacc 300 gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct tgcctggtct caggataccc 360 accatccttt cctgagctcg ag 382 gaattcgccc ttccaccatg agaggtgcca cgcgagtctc aatcatgctc ctcctagtaa 60 ctgtgtctga ctgtgctgtg atcacagggg cctgtgagcg ggatgtccag tgtggggcag 120 gcacctgctg tgccatcagc ctgtggcttc gagggctgcg gatgtgcacc ccgctggggc 180 gggaaggcga ggagtgccac cccggcagcc acaaggtccc cttcttcagg aaacgcaagc 240 accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag gttcccggac ggcaggtacc 300 gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct tgcctggtct caggataccc 360 accatccttt cctgagctcg ag 382
〈210〉 24 <210> 24
く 211〉 88 K 211> 88
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213> Artificial Seauence <220> 213> Artificial Seauence <220>
く 223〉 Primer く柳〉 4 Ku 223> Primer Kuyanagi> 4
tatggcggtg attaccggtg cgtgcgaacg tgatgtgcag tgcggtgcgg gtacctgctg 60 16/24 cgcgattagc ctgtggctgc gtggtctg 88 tatggcggtg attaccggtg cgtgcgaacg tgatgtgcag tgcggtgcgg gtacctgctg 60 16/24 cgcgattagc ctgtggctgc gtggtctg 88
<210> 25 <210> 25
<211> 92 <211> 92
〈212〉 DNA <212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence く 220〉 K 213〉 Artificial Seauence K 220〉
く 223〉 Primer く棚〉 25 K 223> Primer K shelf> 25
cgtatgtgca ccccgctggg tcgtgaaggt gaagaatgcc atccgggtag ccataaagtg 60 ccgttcttcc gtaaacgtaa acatcatacc tg 92 く 210〉 26 cgtatgtgca ccccgctggg tcgtgaaggt gaagaatgcc atccgggtag ccataaagtg 60 ccgttcttcc gtaaacgtaa acatcatacc tg 92 ku 210〉 26
<211> 86 <211> 86
<212> DNA <212> DNA
く 213> Artificial Seauence く 220〉 K 213> Artificial Seauence K 220>
く 223〉 Primer く棚〉 26 K 223> Primer K shelf> 26
cccgtgcctg ccgaacctgc tgtgcagccg tttcccggat ggtcgttatc gttgcagcat 60 ggatctgaaa aacattaact tttagg 86 く 210〉 27 17/24 く 211〉 94 cccgtgcctg ccgaacctgc tgtgcagccg tttcccggat ggtcgttatc gttgcagcat 60 ggatctgaaa aacattaact tttagg 86 ku 210〉 27 17/24 c 211> 94
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213> Artificial Seauence く 220〉 K 213> Artificial Seauence K 220>
く 223〉 Primer <400> 27 223> Primer <400> 27
cacatacgca gaccacgcag ccacaggcta atcgcgcagc aggtacccgc accgcactgc 60 acatcacgtt cgcacgcacc ggtaatcacc gcca 94 cacatacgca gaccacgcag ccacaggcta atcgcgcagc aggtacccgc accgcactgc 60 acatcacgtt cgcacgcacc ggtaatcacc gcca 94
<210> 28 <210> 28
く 211〉 93 C 211> 93
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Artificial Sequence <220> 213> Artificial Sequence <220>
く 223〉 Primer く 400〉 28 K 223> Primer K 400> 28
aggcacgggc aggtatgatg tttacgttta cggaagaacg gcactttatg gctacccgga 60 tggcattctt caccttcacg acccagcggg gtg 93 く 210〉 29 aggcacgggc aggtatgatg tttacgttta cggaagaacg gcactttatg gctacccgga 60 tggcattctt caccttcacg acccagcggg gtg 93 ku 210〉 29
く 211〉 81 C 211> 81
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Sequence 〈220〉 Ku 213〉 Artificial Sequence <220>
<223> Primer く 400〉 29  <223> Primer K 400> 29
gatccctaaa agt taatgt t t t tcagatcc atgctgcaac gataacgacc atccgggaaa 60 cggctgcaca gcaggt tcgg c 81 gatccctaaa agt taatgt t t t tcagatcc atgctgcaac gataacgacc atccgggaaa 60 cggctgcaca gcaggt tcgg c 81
<210> 30 <210> 30
く 211〉 81 C 211> 81
く 212〉 PRT K 212> PRT
く 213〉 Human く棚〉 30 K 213〉 Human K shelf> 30
Ala Val l ie Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly  Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly
5 10 15  5 10 15
Met Cys Cys Ala Val Ser l ie Trp Val Lys Ser l ie Arg l ie Cys Thr  Met Cys Cys Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie Cys Thr
20 25 30 20 25 30
Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val
35 40 45  35 40 45
Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly  Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly
50 55 60  50 55 60
Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe l ie Cys Leu Ala Gin 65 70 75 80 Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phelie Cys Leu Ala Gin 65 70 75 80
Lys く 210〉 31 Lys Ku 210〉 31
く 211> 243 19/24 く 212〉 DNA C 211> 243 19/24 ku 212> DNA
<213> Human く■〉 31 <213> Human Kupo> 31
gccgtgatca ccggggcttg tgacaaggac tcccaatgtg gtggaggcat gtgctgtgct 60 gtcagtatct gggtcaagag cataaggatt tgcacaccta tgggcaaact gggagacagc 120 tgccatccac tgactcgtaa agttccattt tttgggcgga ggatgcatca cacttgccca 180 tgtctgccag gcttggcctg tttacggact tcatttaacc gatttatttg tttagcccaa 240 aag 243 gccgtgatca ccggggcttg tgacaaggac tcccaatgtg gtggaggcat gtgctgtgct 60 gtcagtatct gggtcaagag cataaggatt tgcacaccta tgggcaaact gggagacagc 120 tgccatccac tgactcgtaa agttccattt tttgggcgga ggatgcatca cacttgccca 180 tgtctgccag gcttggcctg tttacggact tcatttaacc gatttatttg tttagcccaa 240 aag 243
<210> 32 <210> 32
く 211〉 82 C 211> 82
<212> DNA <212> DNA
<213> Artificial Seauence <220>  <213> Artificial Seauence <220>
く 223〉 Primer く 400〉 32 K 223〉 Primer K 400〉 32
tatggcggtg attaccggtg cgtgcgataa agatagccag tgcggtggcg gtatgtgctg 60 tgcggtgagc atttgggtga aa 82 tatggcggtg attaccggtg cgtgcgataa agatagccag tgcggtggcg gtatgtgctg 60 tgcggtgagc atttgggtga aa 82
<210> 33 <210> 33
く 211〉 82 C 211> 82
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence 20/24 く 220〉 Ku 213〉 Artificial Seauence 20/24 c 220>
く 223〉 Primer く棚〉 33 K 223> Primer K shelf> 33
agcattcgta tttgcacccc gatgggcaaa ctgggcgata gctgccatcc gctgacccgt 60 aaagtgccgt tttttggccg cc 82 く 210〉 34 agcattcgta tttgcacccc gatgggcaaa ctgggcgata gctgccatcc gctgacccgt 60 aaagtgccgt tttttggccg cc 82 ku 210〉 34
<211> 87 <211> 87
<212> DNA <212> DNA
く 213> Artificial Seauence <220> 213> Artificial Seauence <220>
く 223〉 Primer く 400〉 34 K 223〉 Primer K 400〉 34
gtatgcatca tacctgcccg tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc 60 gctttatttg cctggcgcag aaatagg 87 gtatgcatca tacctgcccg tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc 60 gctttatttg cctggcgcag aaatagg 87
<210> 35 <210> 35
く 211〉 88 K 211> 88
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence <220> 213> Artificial Seauence <220>
<223> Primer 21/24 く棚〉 35 <223> Primer 21/24 shelf> 35
cgaatgcttt tcacccaaat gctcaccgca cagcacatac cgccaccgca ctggctatct 60 ttatcgcacg caccggtaat caccgcca 88 く 210> 36 cgaatgcttt tcacccaaat gctcaccgca cagcacatac cgccaccgca ctggctatct 60 ttatcgcacg caccggtaat caccgcca 88 ku 210> 36
<211> 85 <211> 85
<212> DNA <212> DNA
く 213> Artificial Seauence く 220〉 K 213> Artificial Seauence K 220>
く 223〉 Primer く 400〉 36 K 223〉 Primer K 400〉 36
atgatgcata cggcggccaa aaaacggcac tttacgggtc agcggatggc agctatcgcc 60 cagtttgccc atcggggtgc aaata 85 く 210〉 37 atgatgcata cggcggccaa aaaacggcac tttacgggtc agcggatggc agctatcgcc 60 cagtttgccc atcggggtgc aaata 85 ku 210〉 37
く 211〉 80 C 211> 80
く 212〉 DNA K 212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence <220> 213> Artificial Seauence <220>
く 223〉 Primer く棚〉 37 K 223> Primer K shelf> 37
gatccctatt tctgcgccag gcaaataaag cggttaaagc tggtgcgcag gcacgccagg 60 cccggcaggc acgggcaggt 80 22/24 gatccctatt tctgcgccag gcaaataaag cggttaaagc tggtgcgcag gcacgccagg 60 cccggcaggc acgggcaggt 80 22/24
<210> 38 <210> 38
く 211〉 258 K 211> 258
<212> DNA <212> DNA
く 213〉 Artificial Seauence Ku 213〉 Artificial Seauence
<220> <220>
く 223〉 223>
<400> 38 <400> 38
gcggtgatta ccggtgcgtg cgaacgtgat gtgcagtgcg gtgcgggtac ctgctgcgcg 60 attagcctgt ggctgcgtgg tctgcgtatg tgcaccccgc tgggtcgtga aggtgaagaa 120 tgccatccgg gtagccataa agtgccgttc ttccgtaaac gtaaacatca tacctgcccg 180 tgcctgccga acctgctgtg cagccgtttc ccggatggtc gttatcgttg cagcatggat 240 ctgaaaaaca ttaacttt 258 く 210〉 39 gcggtgatta ccggtgcgtg cgaacgtgat gtgcagtgcg gtgcgggtac ctgctgcgcg 60 attagcctgt ggctgcgtgg tctgcgtatg tgcaccccgc tgggtcgtga aggtgaagaa 120 tgccatccgg gtagccataa agtgccgttc ttccgtaaac gtaaacatca tacctgcccg 180 tgcctgccga acctgctgtg cagccgtttc ccggatggtc gttatcgttg cagcatggat 240 ctgaaaaaca ttaacttt 258 ° 210> 39
く 211〉 243 C 211> 243
く 212〉 DNA K 212> DNA
<213> Artificial Seauence く 220〉  <213> Artificial Seauence K 220>
く 223〉 く 400〉 39 C 223> c 400> 39
gcggtgatta ccggtgcgtg cgataaagat agccagtgcg gtggcggtat gtgctgtgcg 60 gtgagcattt gggtgaaaag cattcgtatt tgcaccccga tgggcaaact gggcgatagc 120 23/24 tgccatccgc tgacccgtaa agtgccgttt tttggccgcc gtatgcatca tacctgcccg 180 tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc gctttatttg cctggcgcag 240 aaa 243 く 210〉 40 gcggtgatta ccggtgcgtg cgataaagat agccagtgcg gtggcggtat gtgctgtgcg 60 gtgagcattt gggtgaaaag cattcgtatt tgcaccccga tgggcaaact gggcgatagc 120 23/24 tgccatccgc tgacccgtaa agtgccgttt tttggccgcc gtatgcatca tacctgcccg 180 tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc gctttatttg cctggcgcag 240 aaa 243 ku 210> 40
<211> 108 <211> 108
<212> PRT <212> PRT
<213> Human く 400〉 40 <213> Human Ku 400> 40
Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro  Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro
5 10 15  5 10 15
Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val lie Thr Gly  Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val lie Thr Gly
20 25 30  20 25 30
Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val  Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val
35 40 45  35 40 45
Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu  Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu
50 55 60  50 55 60
Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Phe Phe Gly Arg 65 70 75 80  Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Phe Phe Gly Arg 65 70 75 80
Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg  Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg
85 90 95  85 90 95
Thr Ser Phe Asn Arg Phe lie Cys Leu Ala Gin Lys  Thr Ser Phe Asn Arg Phe lie Cys Leu Ala Gin Lys
100 105  100 105
<210> 41 <210> 41
<211> 324 24/24 く 212〉 DNA <211> 324 24/24 ku 212> DNA
く 213> Human 213> Human
<400> 41 <400> 41
atgaggagcc tgtgctgcgc cccactcctg ctcctcttgc tgctgccgcc gctgctgctc 60 acgccccgcg ctggggacgc cgccgtgatc accggggctt gtgacaagga ctcccaatgt 120 ggtggaggca tgtgctgtgc tgtcagtatc tgggtcaaga gGataaggat ttgcacacct 180 atgggcaaac tgggagacag ctgccatcca ctgactcgta aagttccatt ttttgggcgg 240 aggatgcatc acacttgccc atgtctgcca ggcttggcct gtttacggac ttcatttaac 300 cgatttattt gtttagccca aaag 324 atgaggagcc tgtgctgcgc cccactcctg ctcctcttgc tgctgccgcc gctgctgctc 60 acgccccgcg ctggggacgc cgccgtgatc accggggctt gtgacaagga ctcccaatgt 120 ggtggaggca tgtgctgtgc tgtcagtatc tgggtcaaga gGataaggat ttgcacacct 180 atgggcaaac tgggagacag ctgccatcca ctgactcgta aagttccatt ttttgggcgg 240 aggatgcatc acacttgccc atgtctgcca ggcttggcct gtttacggac ttcatttaac 300 cgatttattt gtttagccca aaag 324
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