Mikrobiell erzeugter, physiologisch-verträglicher, permeabler Film, bestehend aus Chitosan-enthaltender CelluloseMicrobially produced, physiologically compatible, permeable film, consisting of chitosan-containing cellulose
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein mikrobiell erzeugter, physiologisch-verträglicher, permeabler Film, bestehend aus Chitosan-enthaltender Cellulose.The present invention relates to a microbially produced, physiologically compatible, permeable film consisting of cellulose containing chitosan.
Bei der Cellulose handelt es sich um ein vorwiegend im Pflanzenreich weit verbreitetes und dort meist mit anderen Gerüstsubstanzen ( ignin) vergesellschaftetes Polysaccharid aus ß-1, 4-glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen. Auch Mikroorganismen sind in der Lage, Cellulose zu synthetisieren. Native Cellulose besteht aus ca. 8 000 bis 12 000 Glucoseeinheiten, entsprechend einer relativen Molekülmasse von 1,3 bis 2,0 Mio.Cellulose is a polysaccharide from β-1,4-glycosidically linked glucose molecules, which is predominantly widespread in the plant kingdom and is mostly associated with other framework substances (ignin) there. Microorganisms are also able to synthesize cellulose. Native cellulose consists of approx. 8,000 to 12,000 glucose units, corresponding to a relative molecular mass of 1.3 to 2.0 million.
Chitosan ist ebenfalls ein Polysaccharid biologischen Ursprungs und entsteht durch Deacetylierung von Chitin, einem ß-1, 4-glycosidisch verknüpften Biopolymeren aus Acetyl- Glucosamin-Einheiten. Chitin stellt die typischeChitosan is also a polysaccharide of biological origin and is formed by deacetylation of chitin, a β-1,4-glycosidically linked biopolymer made from acetyl-glucosamine units. Chitin represents the typical
Gerüstsubstanz der höheren Pilze (Ständerpilze) und Arthropoden dar.Framework substance of the higher fungi (stand fungi) and arthropods.
Anwendungsbereiche für Kombinationen aus Cellulose und Chitosan sind aus dem Stand der Technik bestens bekannt. So können bspw. Mischungen aus Chitosan und Cellulose mit Hilfe transformierter Pflanzenzellen erhalten werden (WO 00/09729) ; allerdings stehen im Zusammenhang von Kombinationen aus Cellulose und Chitosan kosmetische Formulierungen, die Wundversorgung und hier insbesondere spezielle Formen von künstlicher Haut im Vordergrund.Areas of application for combinations of cellulose and chitosan are well known from the prior art. For example, mixtures of chitosan and cellulose can be obtained using transformed plant cells (WO 00/09729); However, in the context of combinations of cellulose and chitosan, cosmetic formulations, wound care and in particular special forms of artificial skin are in the foreground.
So sind aus der Literatur Wundabdeckungen bekannt, die Chitosan-Derivate, wie z. B. Succinyl-Chitosan enthalten (JP 08196613) oder eine Kombination aus Heparin alsSo wound covers are known from the literature, the chitosan derivatives, such as. B. contain succinyl-chitosan (JP 08196613) or a combination of heparin as
Polysaccharid-Komponente und Chitosan (WO 96/02 260) .
Als künstliche Haut werden laut K. Matsuka et al . [Nesslo, Vol. 18, Nr. 2., 1992, Seiten 79-82] nicht verwobene, synthetische Fasern eingesetzt, die eine mit Chitosan gecoatete Cellulose enthalten. In dem japanischen Dokument JP 0390011 ist ein Kosmetikum für die Hautmassage beschrieben, mit einem Anteil an Chitosan-enthaltender Cellulose. Eine Mischung aus Chitosan und polysaccharidischen Fasern wird gemäß JP 0315475 als Bandage zum Schutz von Wunden eingesetzt.Polysaccharide component and chitosan (WO 96/02 260). According to K. Matsuka et al. [Nesslo, Vol. 18, No. 2., 1992, pages 79-82] non-woven synthetic fibers are used which contain a cellulose coated with chitosan. Japanese document JP 0390011 describes a cosmetic for skin massage with a proportion of cellulose containing chitosan. A mixture of chitosan and polysaccharidic fibers is used according to JP 0315475 as a bandage to protect wounds.
Neben diesen Mischungen sind auch reineIn addition to these mixtures are also pure
Cellulosezubereitungen als Hautersatz oder Hautabdeckung bekannt: So wird gemäß J. D. Fontana et al . [Appl . Biochem. Biotechnol., Vol 24-25, 1990, Seiten 253-264] eine von Acetobacter stammende Cellulosehaut als temporärer Hautersatz verwendet. Gemäß WO 86/02 095 wird ebenfalls Acetobacter herangezogen, um Cellulose zu produzieren, die als künstliche Haut oder als Lederersatz verwendet wird.Cellulose preparations are known as skin substitutes or skin covers: According to J. D. Fontana et al. [Appl. Biochem. Biotechnol., Vol 24-25, 1990, pages 253-264] uses a cellulose skin derived from Acetobacter as a temporary skin replacement. According to WO 86/02 095, Acetobacter is also used to produce cellulose, which is used as artificial skin or as a leather substitute.
Acetobacter wird gemäß Carbohydrates Polymers 32(1997),Acetobacter is according to Carbohydrates Polymers 32 (1997),
S. 223-227 zur Herstellung eines Polysaccharids mit einem N- Acetylglucosamin-Rest in Gegenwart von D-Glucose und Phosphorylchitin verwendet.Pp. 223-227 for the preparation of a polysaccharide with an N-acetylglucosamine residue in the presence of D-glucose and phosphorylchitin.
Aber auch bioabbaubare Filme sind bekannt, die bspw. gemäß RU 2 108 114 aus dem Protein Collagen bestehen, das mit Glutaraldehyd quervernetzt wurde und das Chitosan enthält. Schließlich beschreiben C. H. Su et al . in Biomaterials 18(17), 1997, Seiten 1169-74 ein Pilzmycel als Quelle für Chitin, das mit dem Polysaccharid ß-l,3-Glucan als Wundabdeckung eingesetzt wird.However, biodegradable films are also known which, for example in accordance with RU 2 108 114, consist of the protein collagen which has been crosslinked with glutaraldehyde and which contains chitosan. Finally, C. H. Su et al. in Biomaterials 18 (17), 1997, pages 1169-74 a fungal mycelium as a source of chitin, which is used as a wound covering with the polysaccharide β-1,3-glucan.
Im Bereich der Wundbehandlung gibt es somit eine breite Palette an Produkten biologischen Ursprungs, die neben den herkömmlichen Methoden zur Wundbehandlung, wie etwa Mull, Verband und Pflaster, vor allem für die Behandlung großflächiger Verletzungen eingesetzt werden.
So sind z. B. Filme aus mikrobiell produzierter Cellulose der Firmen BioFill, Brasilien (US 4,912,049), Johnson & Johnson, USA (US 4,588,400 und US 4,863,565) und Weyerhaeuser, USA (US 4,863,565), bekannt. Die Filme werden dabei entweder direkt von den Bakterien (z. B. Acetobacter xylinum) produziert oder es wird aus der im Rührkesselreaktor produzierten Cellulose durch chemische Behandlung ein Cellulosefilm hergestellt.In the field of wound treatment there is a wide range of products of biological origin which, in addition to the conventional methods for wound treatment, such as gauze, bandages and plasters, are mainly used to treat large-scale injuries. So z. B. Films made from microbially produced cellulose from BioFill, Brazil (US 4,912,049), Johnson & Johnson, USA (US 4,588,400 and US 4,863,565) and Weyerhaeuser, USA (US 4,863,565) are known. The films are either produced directly by the bacteria (e.g. Acetobacter xylinum) or a cellulose film is produced from the cellulose produced in the stirred tank reactor by chemical treatment.
Mit Hilfe der Gentechnologie veränderte Mikroorganismen spielen in diesem Zusammenhang allerdings noch keine oder eine nur untergeordnete Rolle. Der WO 97/16540 kann bspw. allenfalls die Expression des Chitinsynthase-1-Gens (CHS1) entnommen werden, das allerdings nicht für die Herstellung eines Wundfilmes eingesetzt wird sondern für das Zellwachstum.Microorganisms modified with the help of genetic engineering, however, do not yet play any or only a minor role in this context. For example, WO 97/16540 at most shows the expression of the chitin synthase-1 gene (CHS1), which, however, is not used for the production of a wound film but for cell growth.
Andere der eben genannten Produkte zur Wundbehandlung sorgen für eine verbesserte Wundheilung, indem sie heilfördernde Substanzen wie etwa Chitosan enthalten. So werden z. B. Wundauflagen aus Collagen/Chitosan-Mischungen verwendet (US 5,116,824 sowie US 5,166,187) oder es werden Filme aus anderen Materialien mit Chitosan beschichtet, z. B. Polyvinylpyrrolidon (JP 3151976) .Other of the aforementioned wound treatment products improve wound healing by containing healing substances such as chitosan. So z. B. wound dressings made of collagen / chitosan mixtures used (US 5,116,824 and US 5,166,187) or films made of other materials are coated with chitosan, e.g. B. polyvinyl pyrrolidone (JP 3151976).
Das Problem dabei ist allerdings das Chitosan, das erst durch Deacetylierung aus dem Chitin von Schalentieren gewonnen wird. Bei dieser Art der Chitosanproduktion sind Vorkommen und Qualität saisonal unterschiedlich und provenienzabhängig.The problem with this, however, is chitosan, which is only obtained from the chitin of shellfish by deacetylation. In this type of chitosan production, occurrence and quality are seasonally different and depend on the provenance.
Großflächige Verletzungen der menschlichen Haut, z. B. verursacht durch Verbrennungen oder Abschürfungen stellen für die Medizin immer noch ein relativ großes Problem dar. Der Grund liegt darin, dass Patienten mit derartigen Verletzungen u. a. einen hohen Feuchtigkeitsverlust erleiden. Entscheidend ist dabei vor allem die Phase bis etwa 36 Stunden nach dem
Verletzungsereignis. Anschließend tritt dann ein gegenteiliger Effekt ein, d. h. die Wunde verschließt sich primär, die Gewebsflüssigkeit wird zurückgehalten und es kommt zu lokalen oder großflächigen Schwellungen, nicht selten begleitet von Spannungsschmerzen.Large-scale injuries to human skin, e.g. B. caused by burns or abrasions are still a relatively big problem for medicine. The reason is that patients with such injuries suffer, among other things, a high loss of moisture. The decisive factor is the phase up to about 36 hours after the Injury event. Then the opposite effect occurs, ie the wound closes primarily, the tissue fluid is retained and local or large swellings occur, often accompanied by tension pain.
Die Behandlung derartiger Verletzungen beschränkt sich bislang hauptsächlich auf das wiederholte Auftragen diverser Wundsalben, das Bedecken der Wunde mit einem Mull und das Fixieren durch einen Verband. Zusätzlich werden demThe treatment of such injuries has so far been limited mainly to the repeated application of various ointments, covering the wound with a gauze and fixing it with a bandage. In addition, the
Patienten, abhängig von der Größe der Verletzung, noch Antibiotika verabreicht.Patients, depending on the size of the injury, still administered antibiotics.
Da derartige Wundauflagen die Wunde hermetisch abschließen, also keinen Gasaustausch zulassen und nicht transparent sind, ist ein häufiger Wechsel des Verbandes unvermeidbar, zumal diese Verbände auch nur eine begrenzte Aufnahmekapazität für Gewebsflüssigkeit (Blut, Lymphe) besitzen. Dies ist dem Heilungsprozess jedoch keineswegs dienlich, werden doch die neu gebildeten Hautflächen durch das Ablösen des Verbandes leicht beschädigt.Since such wound dressings hermetically seal the wound, i.e. do not allow gas exchange and are not transparent, frequent dressing changes are unavoidable, especially since these dressings also have only a limited absorption capacity for tissue fluid (blood, lymph). However, this is by no means conducive to the healing process, since the newly formed areas of the skin are easily damaged by detaching the bandage.
Abgesehen von den Schmerzen, die der Patient auch noch während der Heilung zu erdulden hat, spielt auch noch der psychische Aspekt eine Rolle. Selbst wenn die Wunden abheilen, bleiben bei der eben beschriebenen Therapie dennoch oft entstellende Narben zurück, die dem Patienten womöglich mehr Probleme bereiten als die Schmerzen.In addition to the pain that the patient has to endure during healing, the psychological aspect also plays a role. Even if the wounds heal, the therapy just described often leaves disfiguring scars, which may cause more problems for the patient than the pain.
Etwas Abhilfe können zwar Transplantationen schaffen, diese sind zum einen aber sehr zeit-, gedulds- und kostenintensiv, zum anderen wird die schon geschädigte Körperpartie erneut einem starken Stress ausgesetzt.Transplants can provide some relief, but on the one hand they are very time-consuming, patient and costly, and on the other hand, the already damaged part of the body is again exposed to severe stress.
Eine Alternative zur Wundversorgung mit Wundsalbe, Mull und Pflaster ist die Transplantation unversehrter Haut auf die Wunde. Denkbar sind autogene und heterogene
Transplantationen, die Transplantation von Spenderhaut sowie die Verwendung von künstlicher Haut.An alternative to wound care with ointment, gauze and plaster is the transplantation of intact skin on the wound. Autogenic and heterogeneous are conceivable Transplantation, the transplantation of donor skin as well as the use of artificial skin.
All diese Alternativen haben jedoch ihre Nachteile: Autogene Transplantationen verlagern zumeist lediglich die Verletzung, sind also nur bei Verbrennungen dritten Grades gerechtfertigt. Die Nachteile der anderen Methoden beginnen mit der begrenzten Haltbarkeit von maximal 2 Wochen, hinzu kommen noch z. B. ethische Bedenken und mentale Probleme bei der Verwendung der Haut Verstorbener.However, all these alternatives have their disadvantages: Autogenic transplants usually only shift the injury, so they are only justified for third-degree burns. The disadvantages of the other methods begin with the limited shelf life of a maximum of 2 weeks. B. Ethical concerns and mental problems when using the skin of the deceased.
Aus den geschilderten Nachteile des Standes der Technik hat sich deshalb für die vorliegende Erfindung die Aufgabe gestellt, einen mikrobiell erzeugten, physiologisch- verträglichen, permeablen Film, bestehend aus Chitosan- enthaltender Cellulose zu entwickeln, der elastisch und durchsichtig ist, einen Gasaustausch zulässt und der als Wundauflage verwendet werden kann.From the described disadvantages of the prior art, the object of the present invention was therefore to develop a microbially produced, physiologically compatible, permeable film consisting of chitosan-containing cellulose, which is elastic and transparent, permits gas exchange and which can be used as a wound dressing.
Gelöst wurde diese Aufgabe durch einen Film, der mit Hilfe eines Cellulose- und Chitin-produzierenden Mikroorganismuses und durch Deacetylierung der Chitin-Anteile zum Chitosan hergestellt wurde.This task was solved by a film, which was produced with the help of a cellulose and chitin-producing microorganism and by deacetylation of the chitin parts to chitosan.
Bei der praktischen Umsetzung dieser Aufgabenlösung haben sich überraschend viele Merkmale und Effekte als überaus positiv erwiesen.In the practical implementation of this task solution, a surprising number of features and effects have proven to be extremely positive.
Der Chitosan-enthaltende Cellulosefilm weist eine vernetzte Struktur auf, die seinen Einsatz als Wundauflage deshalb so interessant macht, da er in einigen Eigenschaften der Haut entspricht :The cellulose film containing chitosan has a cross-linked structure, which makes its use as a wound dressing so interesting because it corresponds to the skin in several properties:
Es ist ein Gasaustausch möglich, ein Flüssigkeitsverlust durch den Film tritt jedoch nicht auf; auch stellt der Film eine wirksame Barriere gegenüber Keimen dar.
Weiterhin ist der Film elastisch und fühlt sich auf der Haut generell als sehr angenehm an.Gas exchange is possible, but there is no loss of liquid through the film; the film also represents an effective barrier against germs. Furthermore, the film is elastic and generally feels very comfortable on the skin.
Der Film ist durchsichtig, ein oftmaliger Verbandswechsel ist somit unnötig, die damit verbundene Verletzung der heilenden Wunde und die Infektionsgefahr werden reduziert.The film is transparent, a frequent dressing change is therefore unnecessary, the associated injury to the healing wound and the risk of infection are reduced.
Daneben haben sich weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Cellulosefilms ergeben:In addition, there have been further advantages of the cellulose film according to the invention:
> Geringe Kosten für Produktion und Aufbereitung, da der Film einfach zu sterilisieren ist. Auch die Aufbewahrung erfolgt bei normalen Umgebungsbedingungen, da der Film nicht verderblich ist.> Low production and processing costs because the film is easy to sterilize. Storage is also done under normal environmental conditions because the film is not perishable.
> Der Film kann einfach auf die Wunde gelegt werden, eine Fixierung durch Pflaster und Verbände ist unnötig.> The film can simply be placed on the wound, fixation with plasters and bandages is unnecessary.
Der Film lässt sich aufgrund seiner Elastizität und Haftungsfähigkeit nahezu auf allen Körperstellen einsetzen.Due to its elasticity and adherence, the film can be used on almost all parts of the body.
Die Anwendung des Cellulosefilms reduziert die Schmerzen unmittelbar, da er die freiliegenden Nervenenden schützt .The application of the cellulose film reduces the pain immediately, since it protects the exposed nerve endings.
> Die Narbenbildung wird reduziert.> The scarring is reduced.
> Es treten keine allergischen Reaktionen auf.> There are no allergic reactions.
Im Rahmen der Erfindung haben sich Filme als besonders geeignet erwiesen, die mindestens 0,1 Gew.-% Chitosan enthalten, wobei 0,1 bis 10 Gew.-% besonders zu bevorzugen sind. Die maximale mögliche Obergrenze für den Chitosan-Films which contain at least 0.1% by weight of chitosan have proven to be particularly suitable in the context of the invention, 0.1 to 10% by weight being particularly preferred. The maximum possible upper limit for the chitosan
Gehalt variiert im allgemeinen mit den jeweiligen speziellen Anwendungsbereichen und sonstigen Inhaltsstoffen des
Cellulose-Films, überschreitet jedoch in vielen Fällen kaum die 50 Gew.-%.Content generally varies with the specific areas of application and other ingredients of the Cellulose film, however, hardly exceeds 50% by weight in many cases.
Wie bereits angedeutet, ist es für bestimmte Anwendungsfälle notwendig, dass der Film eine spezielle Permeabilität aufweist, weshalb durch die Erfindung ein Film bevorzugt wird, der gas- und/oder flüssigkeits- und/oder lichtdurchlässig ist.As already indicated, it is necessary for certain applications that the film have a special permeability, which is why the invention prefers a film which is gas and / or liquid and / or translucent.
Eine erfindungswesentliches Merkmal ist die Tatsache, dass der beanspruchte Film mit Hilfe eines Mikroorganismuses hergestellt wurde. Dafür haben sich rekombinante Bakterienzellen als besonders geeignet erwiesen, wobei rekombinante Acetobacter-Zellen, und hier besonders bevorzugt Zellen des Stammes Acetobacter xylinum, den Anforderungen insbesondere entsprechen.A feature essential to the invention is the fact that the claimed film was produced with the aid of a microorganism. Recombinant bacterial cells have proven to be particularly suitable for this, recombinant Acetobacter cells, and here particularly preferably cells of the strain Acetobacter xylinum, in particular meeting the requirements.
Für den vorliegenden Fall ist es nun besonders vorteilhaft, wenn Bakterienzellen für die Produktion des erfindungsgemäßen Filmes eingesetzt wurden, in die ein für Chitin-Synthetase und/oder Chitin-Synthase codierendes Gen (Operon) transformiert worden ist, was die Erfindung ebenfalls berücksichtigt und was vorzugsweise durch Elektroporation geschehen sein sollte.For the present case, it is now particularly advantageous if bacterial cells have been used for the production of the film according to the invention, into which a gene coding for chitin synthetase and / or chitin synthase (operon) has been transformed, which the invention also takes into account and what should preferably be done by electroporation.
Alternativ besteht auch die Möglichkeit, dass die Genübertragung mit Hilfe eines Plasmids und/oder eines Vektors erfolgt ist. Bei dieser Variante sollte die Genübertragung vorzugsweise mit Hilfe einer bakteriellen Wirtzelle durchgeführt worden sein; Escherichia coli-Zellen, die ihrerseits rekombinant sein können, sind für die Genübertragung besonders gut geeignet.Alternatively, there is also the possibility that the gene transmission was carried out with the aid of a plasmid and / or a vector. In this variant, the gene transfer should preferably have been carried out using a bacterial host cell; Escherichia coli cells, which in turn can be recombinant, are particularly well suited for gene transfer.
Hinsichtlich der Genübertragung über einen Vektor sieht die Erfindung vor, dass dies vorzugsweise mit einem Bakterienkompatiblen Vektor, wie z. B. pUC19 erfolgt ist.
Wie ebenfalls bereits beschrieben, stellt Chitin die hauptsächliche Stützsubstanz bei Pilzen dar, weshalb Pilze zur Chitinproduktion bevorzugt sind. Aus diesem Grund greift auch die vorliegende Erfindung zur Produktion von Chitin auf Gene zurück, die aus der DNA oder auch aus einer reverstranskribierten cDNA eines Hefepilzes stammen, wofür die bekannten Hefepilze Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae und Neurospora crassa in vorteilhafter Weise geeignet sind.With regard to gene transmission via a vector, the invention provides that this is preferably done with a bacterially compatible vector, such as. B. pUC19 has taken place. As already described, chitin is the main support substance for fungi, which is why fungi are preferred for chitin production. For this reason, the present invention also uses genes for the production of chitin which originate from the DNA or from a re-transcribed cDNA of a yeast, for which the known yeasts Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae and Neurospora crassa are advantageously suitable.
Selbstverständlich können auch alle anderen geeigneten Mikroorganismen natürlichen Ursprungs oder mit Hilfe bio- oder gentechnologischer Verfahren veränderte Mikroorganismen zur Lieferung des Chitin-Synthetase-/Synthase-Gens herangezogen werden.Of course, all other suitable microorganisms of natural origin or microorganisms modified with the help of bio- or genetic engineering processes can also be used to deliver the chitin synthetase / synthase gene.
Die breitgefächerten Möglichkeiten, die sich mit dem erfindungsgemäßen Film ergeben, veranschaulicht nicht zuletzt eine weitere Erfindungsvariante, die den Einsatz von Cellulose- und Chitin-produzierenden Mikroorganismen vorsieht, die Enzyme zur Synthese von Biopolymeren enthalten, die mit Chitin strukturell verwandt sind, worunter insbesondere Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und Heparin fallen. Aber auch andere physiologisch verträgliche und für den jeweiligen Anwendungsfall des erfindungsgemäßen Films geeignete Substanzen können von den im Wesentlichen den Filmproduzierenden Mikroorganismen synthetisiert werden.The wide range of possibilities that arise with the film according to the invention is illustrated not least by a further variant of the invention which provides for the use of cellulose and chitin-producing microorganisms which contain enzymes for the synthesis of biopolymers which are structurally related to chitin, including in particular hyaluronic acid , Chondroitin sulfate and heparin drop. However, other physiologically compatible substances that are suitable for the respective application of the film according to the invention can also be synthesized by the microorganisms that essentially produce the film.
Um letztendlich zum gewünschten Produkt, dem Cellulose- und gleichzeitig Chitosan-enthaltenden Film zu gelangen, müssen die Chitin-Anteile durch Deacetylierung in Chitosan umgewande1 werden .In order to finally reach the desired product, the film containing cellulose and chitosan at the same time, the chitin portions must be converted to chitosan1 by deacetylation.
Schließlich kann der beanspruchte Film zur Abrundung seiner Einsatzmöglichkeiten neben den beiden wesentlichenFinally, the claimed film can round off its possible uses in addition to the two essential ones
Hauptkomponenten Cellulose und Chitosan noch zusätzlich andere Wirkstoffe oder Füllstoffe enthalten, wobei ein oder
mehrere Antiallergene, Antibiotika, Antioxidantien, AntiSchmerzmittel, Antiseptika, Entzündungshemmer, Immunstimulantien, Moisturizer, Radikalfänger, Strahlenblocker und dermatotrophe, neurotrophe und neoplastische Wirkstoffe vorzuziehen sind.Main components cellulose and chitosan additionally contain other active ingredients or fillers, one or several antiallergens, antibiotics, antioxidants, pain relievers, antiseptics, anti-inflammatories, immunostimulants, moisturizers, radical scavengers, radiation blockers and dermatotrophic, neurotrophic and neoplastic agents are preferable.
Als bevorzugte Verwendung des beanspruchten Films sieht die Erfindung seinen Einsatz als Wundauflage und/oder Hautersatz und/oder als künstliche Blutbahn vor, wobei der Film im letztgenannten Fall sowohl in seiner Gesamtheit natürliche Blutbahnen ersetzen kann, aber auch nur als äußere Beschichtung und/oder Innenauskleidung dienen kann; er kann aber gleichermaßen auch in allen anderen medizinischen und/oder nicht-medizinischen Bereichen verwendet werden, in denen seine speziellen Eigenschaften von Vorteil sind.As a preferred use of the claimed film, the invention provides its use as a wound dressing and / or skin replacement and / or as an artificial bloodstream, the film being able to replace natural bloodstream in its entirety in the latter case, but also only as an outer coating and / or inner lining can serve; however, it can equally be used in all other medical and / or non-medical areas in which its special properties are advantageous.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von großflächigen Verletzungen, wie z.B. Verbrennungen oder Abschürfungen, durch Auflegen des erfindungsgemäßen Films auf die Verletzung.The present invention also relates to a method of treating large area injuries, e.g. Burns or abrasions, by applying the film according to the invention to the injury.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die vielfältigen Vorteile des erfindungsgemäßen Cellulose- und Chitosan- enthaltenden Filmes.The following examples illustrate the various advantages of the film containing cellulose and chitosan according to the invention.
BeispieleExamples
1. Kultivierung Acetobacter (Basiskultur)1. Cultivation Acetobacter (basic culture)
Als Cellulose-produzierender Trägerorganismus für das Chitin-As a cellulose-producing carrier organism for the chitin
Synthetase-Gen wurde Acetobacter xylinum, ein aerobes gramnegatives Bakterium ausgewählt, das in der Lage ist, Glucose in Cellulose zu metabolisieren.Synthetase gene was selected Acetobacter xylinum, an aerobic gram-negative bacterium that is able to metabolize glucose in cellulose.
Die Kultivierung erfolgte unter statischen Bedingungen bei Temperaturen zwischen 25 und 30 °C.
Für die Celluloseproduktion erwies sich das von Schramm und Hestrin in Biochem. J. 1954, 58, Seite 345-352, beschriebene Medium am geeignetsten. Dieses Medium enthält pro Liter:The cultivation was carried out under static conditions at temperatures between 25 and 30 ° C. Schramm and Hestrin in Biochem proved this for cellulose production. J. 1954, 58, pages 345-352. This medium contains per liter:
20 g Glucose20 g glucose
5 g Pepton5 g peptone
5 g Hefeextrakt5 g yeast extract
2,7 g Na2HP04 2.7 g Na 2 HP0 4
1,15 g Zitronensäure1.15 g citric acid
Rest WasserRest of water
Die Kultivierung erfolgte über eine Dauer von mehreren Tagen.The cultivation took place over a period of several days.
2. Isolierung der Chitin-Synthetase-Gene2. Isolation of the chitin synthetase genes
Die Chitin-Synthetase-Gene wurden aus Aspergillus nidulans isoliert. Die Gene wurden nach einer reversen Transkription der RNA aus der cDNA isoliert.The chitin synthetase genes were isolated from Aspergillus nidulans. The genes were isolated from the cDNA after reverse transcription of the RNA.
3. Klonierung der Chitin-Synthetase-Gene in Acetobacter3. Cloning of the chitin synthetase genes in Acetobacter
Die Chitin-Synthetase-Gene wurden nach der unter 2. beschriebenen Isolierung in entsprechende Plasmide ligiert und zur Amplifikation in Escherichia coli-Zellen transformiert. Als Selektionsmarker diente Ampicillin. Nach Kultivierung positiver E. -coli-Klone wurde das Plasmid re-isoliert, die Chitin-Synthetase herausgeschnitten, in einen Acetobacter-spezifischen Vektor vom Typ pUC19 ligiert und in Acetobacter-Zellen der Basiskultur 1 transformiert. Als Selektionsmarker in Acetobacter diente eine Ampicillin- Resistenz . Um Störungen durch die vom Acetobacter xylinum gebildete Cellulose bei der Transformation vorzubeugen, wurde den Kulturen eine Cellulase-Lösung in einer Endkonzentration von 1 Gew.-% zugegeben. Die Transformation erfolgte mittels Elektroporation .
4. Kultivierung der KloneAfter the isolation described under 2., the chitin synthetase genes were ligated into corresponding plasmids and transformed into Escherichia coli cells for amplification. Ampicillin served as a selection marker. After culturing positive E. coli clones, the plasmid was re-isolated, the chitin synthetase was cut out, ligated into an Acetobacter-specific vector of the pUC19 type and transformed into Acetobacter cells of basic culture 1. Ampicillin resistance served as a selection marker in Acetobacter. In order to prevent interference from the cellulose formed by the Acetobacter xylinum during the transformation, a cellulase solution in a final concentration of 1% by weight was added to the cultures. The transformation was carried out using electroporation. 4. Cultivation of the clones
Die Kultivierung der Chitin-positiven Acetobacter-Klone erfolgte im oben beschriebenen Schramm-Hestrin-Medium, das mit 50 μg/ml Ampicillin supplementiert war. DieThe chitin-positive Acetobacter clones were cultivated in the Schramm-hestrin medium described above, which was supplemented with 50 μg / ml ampicillin. The
Kultivierungsbedingungen wurden darüber hinaus im Vergleich zu der Basiskultur nicht verändert.In addition, cultivation conditions were not changed compared to the basic culture.
5. Ernte des Chitin-enthaltenden Cellulose-Films5. Harvesting the cellulose film containing chitin
Der nach Stufe 4. erhaltene Cellulose-Film wurde nach gängiger Methode gereinigt und durch Deacetylierung des Chitins in den Chitosan-enthaltenden Cellulose-Film überführt, der weiteren Aufarbeitungs- und Sterilisationsschritten unterzogen wurde.The cellulose film obtained after step 4 was cleaned by the usual method and converted into the chitosan-containing cellulose film by deacetylation of the chitin, which was subjected to further workup and sterilization steps.
Auf diese Weise wurde ein mikrobiell erzeugter, physiologisch-verträglicher, permeabler und über längere Zeit stabiler sowie haltbarer Film, bestehend aus Chitosan- enthaltender Cellulose mit einer Dicke von ca. 1,2 mm erhalten, der in hervorragender Weise zur Abdeckung von noch frischen oder bereits abheilenden Hautverletzungen geeignet ist .
In this way, a microbially produced, physiologically compatible, permeable and long-term stable and durable film was obtained, consisting of chitosan-containing cellulose with a thickness of about 1.2 mm, which is excellent for covering fresh or already healing skin injuries are suitable.