WO2002046232A2 - Multimerer mehrfach-antigenbindender einzelkettiger antikörper - Google Patents

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Roland Kontermann
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Vectron Therapeutics Ag
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to multimers, multi-antigen-binding single-chain antibodies, in particular cyclic homodimers, and to their production and use.
  • Naturally occurring antibodies are usually composed of two identical heavy (H) and two identical light (L) protein chains. Each of these chains has a variable (VR and V L ) and a constant (C R and C L ) part.
  • the variable part of a heavy and a light chain each form a binding center, so that a typical antibody (IgG) has two binding centers of identical specificity (see, for example, J. Klein (1991) Immunologie, 1. Auf., 128-153, NCH Nerlagsgesellschaft) Weinheim).
  • Naturally occurring antibodies (IgGs) are therefore monospecific and bivalent.
  • Bispecific antibodies are antibodies that have two binding centers with different specificities and are therefore able to recognize two different antigens or epitopes (Fanger et al. 1992, Crit. Rev. Immunol. 12, 101). They can bind to two different structures, such as pharmacological agents, viral coat proteins, cell receptors, and thereby bring together a wide variety of molecules, cells or viruses. Bispecific antibodies thus act as binding mediators. This ability allows bispecific antibodies to be used in a number of diagnostic applications, such as binding an enzyme to a molecule to be detected. However, the possible therapeutic applications are much more diverse. A wide variety of effector molecules (e.g.
  • radioisotopes can be used with bispecific antibodies, but also larger ones recruit structures such as niren or effector cells (eg cytotoxic T lymphocytes, natural killer cells and macrophages) to target cells or other target structures. So far, bispecific antibodies have been used in both immunotherapeutic and gene therapy applications (van Spriel et al. 2000, Immunol. Today 21, 391; Pelegrin et al. 1998, Human Gene Ther. 9, 2165).
  • bispecific antibodies A number of methods for producing bispecific antibodies have been developed in recent years. For example, two different antibodies or antibody fragments (e.g. Fab fragments) can be linked by chemical cross-linking. Another method is hybrid hybridoma technology, in which two different antibody-secreting hybridomas are fused into a quadroma. However, both chemical cross-linking and hybrid hybridoma technology generate considerable amounts of non-functional molecules.
  • variable polypeptide chains that form the binding domain were held together by short Neritatispeptiden (usually 5-6 amino acid residues). These short connecting peptides prevent the assembly of the variable chains of an antibody molecule, ie the intramolecular interaction, which would lead to a single-chain monospecific Fv fragment (scFv).
  • scFv single-chain monospecific Fv fragment
  • this format also leads to the formation of non-functional homodimers, so that special purification processes, such as affinity chromatography, have to be used for the production of pure populations of bispecific diabodies.
  • bispecific diabodies This problem in the production of bispecific diabodies has recently been solved by linking the two chains to form a single-chain molecule (Brusselsbach et al, 1999, Tumor Targeting 4, 115-123; DE 198 16 141.7).
  • the structure of such a bispecific single-chain multiple antigen-binding antibody fragment may be, for example, V H A-VLB-VLA-VHB and V L A-VHB-V H BV A.
  • the variable domains in these bispecific multi-antigen-binding single-chain diabodies are held together via three connecting peptides.
  • Connection peptide A connects the first two domains
  • connection peptide M connects the middle domains
  • connection peptide B connects the last two domains, so that the following structure arises: V H A-PA-V L B-PM -V H B-PB-V L A and VLA-PA-VHB-PM-VLB-PB-V H A.
  • Connection peptides PA and PB are usually 5 to 6 amino acid residues long, while connection peptide PM 12 to 25 amino acid residues long is.
  • V HA polypeptide chain with the V L B chain in a molecule of the structure V HA -PA-V L B-PM-V H B-PB-V L A and the VRB chain interacts with the VA chain, which would result in the formation of non-functional V H V L binding domains.
  • These multi-antigen-binding single-chain antibody fragments also referred to as "single-chain diabodies" (scDb)
  • scDb single-chain diabodies
  • all monomers that have a molecular weight of about 55,000 are identical and inevitably bispecific.
  • Non-functional molecules of this size can, as in the case of bispecific diabodies do not arise.
  • multiple-antigen-binding single-chain antibody fragments are also used for the production of bivalent molecules in which both antigen-binding sites are directed against the same epitope.
  • multivalent molecules Due to the presence of two or more binding sites in the same molecule, multivalent molecules have an increased functional affinity, ie binding strength, compared to monovalent molecules. This can significantly increase the sensitivity of the detection for diagnostic purposes.
  • the increased functional affinity leads to an increased binding to the target structure (eg a cell or a tissue).
  • the efficiency of the therapeutic application can be increased, inter alia, by improving the pharmacokinetic properties (Plückthun & Pack, 1997, Immunotechnology 3, 83).
  • Alt et al. (1999, FEBS Letter 454, 90) have shown that the functional affinity of multi-antigen-binding single-chain antibody fragments can be significantly increased by homodimerization.
  • the multi-antigen-binding single-chain antibody fragments were fused with the C H 3 or the Fc region of human IgG. These molecules therefore have four functional binding sites.
  • the disadvantage of these multivalent molecules is their size.
  • the CH3 fusion protein is approximately 150 kD and the Fc fusion protein is approximately 200 kD.
  • smaller molecules are advantageous for therapeutic applications which, for example, require good penetration into the tissue to be treated.
  • Le Gall et al. (1999, FEBS Lett. 453, 164) and Hudson & Kortt, (1999, J. Immunol. Meth. 231, 177) describe monospecific, tetravalent tetrabodies consisting of four scFv fragments.
  • Another object of the present invention is a
  • Antibody multimer at least one of the antibodies being a variant.
  • a variant of the antibody is an antibody which has a homology of 60%, preferably 70%, particularly preferably 80%, in particular 90% at the amino acid level and specifically binds to the extracellular domain of human endoglin.
  • the homology can be determined, for example, using a program such as ALIGN, which is accessible on the Internet (for example at http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLaun-cher/).
  • the change in the amino acid sequence is preferably so-called conservative changes, such as, for example, aspartic acid to glutamic acid or leucine to isoleucine.
  • conservative changes such as, for example, aspartic acid to glutamic acid or leucine to isoleucine.
  • the specific binding can be detected by standard tests such as ELISA.
  • At least one antibody can also be fused with at least one peptide and / or one protein.
  • Amino acid sequences of less than 50 amino acids are referred to as peptides.
  • a fusion occurs when the amino acids of the antibody are linked to the peptide and / or the protein via a peptide bond.
  • the fusion protein is preferably translated contiguously and encoded by an mRNA. Suitable proteins and peptides are, for example, enzymes, growth factors, hormones, cytokines, chemokines, viral coat proteins, and / or antibodies.
  • the fusion with a cytokine or chemokine allows, for example, the recruitment of a substance that is toxic to the target cell and thus enables the targeted destruction of, for example, tumor endothelial cells.
  • the fusion with a viral coat protein allows the production of recombinant viruses which carry an antibody on their surface which is, for example, specific for endoglin and thus the Recruitment of the respective recombinant virus to exemplary endothelial cells enables.
  • a suitable coat protein is, for example, the adenovirus fiber protein.
  • a similar goal can also be achieved by fusion with a second antibody, preferably with an scFv fragment, if this fragment specifically binds to a specific virus.
  • Peptides or proteins that are recognized by viral surface molecules or an antibody are also suitable.
  • the protein or the peptide interacts with a receptor.
  • Suitable receptors are, for example, receptors on cells of the immune system, which are recruited through the interaction, for example to endothelial cells.
  • the present invention further provides an antibody multimer, at least one component being coupled to at least one antibody which is part of the antibody multimer.
  • Coupling is understood to mean the covalent or non-covalent binding of a component to the antibody, the antibody and the component not being translated together and not being encoded by an mRNA.
  • a covalent coupling can take place, for example, through formaldehyde, glutaraldehyde or via a peptide bond.
  • a non-covalent coupling is obtained, for example, by incubating an antibody multimer according to the invention, which is fused to a peptide or protein which specifically binds to the knob domones of the adenoviral fiber protein, with adenovirus.
  • Preferred components are peptides, proteins, enzymes, growth factors, hormones, cytokines, chemokines, viral coat proteins, carbohydrates, antibodies, lipids, isotopes, liposomes, viruses, virus-like particles, nucleic acids, and / or cells.
  • the nucleic acids coupled to the antibody multimer of the invention can be "naked” or, for example, condensed with a poly cation such as poly-lysine.
  • the coupling of the antibody multimer according to the invention to liposomes is a further embodiment of the present invention, since liposomes can be loaded with a wide variety of therapeutically active substances.
  • the liposomes that can be coupled to an antibody multimer of the present invention preferably contain at least one antisense RNA, at least one chemotherapeutic agent, at least one nucleic acid coding for an active ingredient or at least one active ingredient.
  • the antisense RNA can inhibit the translation of genes that are required for cell division.
  • chemotherapeutic agents are substances such as doxirubicin, cis-platinum or taxol. The person skilled in the art is aware of further chemotherapeutic agents which are used in tumor therapy and which are also encompassed by the present invention.
  • an active ingredient that is encoded by a nucleic acid contained in liposomes can be an inhibitor of cell proliferation.
  • Suitable proteins are known to the person skilled in the art and include anion cogenes, such as, for example, p53 or pRb, and cell cycle inhibitors, such as, for example, p21 WAF , pl ⁇ 1 ⁇ , p57 INK2 , p27 KIP or GADD45.
  • the nucleic acids can also code for cytostatic or cytotoxic proteins, such as for example perforin, granzyme, IL-2, IL-4, IL-12 or Oncostatin M.
  • An active substance can be any pharmacologically active substance which is suitable, for example, for the therapy of diseases in which endothelial cells are involved.
  • the component interacts with a receptor.
  • Suitable receptors are, for example, receptors on cells of the immune system that are recruited through the interaction with endothelial cells.
  • the present invention further provides a nucleic acid which codes for an antibody which is part of an antibody multimer according to the invention. It is known that there may be small changes in the sequence of a nucleic acid, for example due to the degeneracy of the genetic code, or that untranslated sequences may be attached to the 5 'and / or 3' end of the nucleic acid without this the encoded antibody is changed significantly. This invention therefore also includes so-called “variants” of the nucleic acids described above.
  • nucleic acids are understood to mean all nucleic acid sequences that are complementary to a nucleic acid sequence that hybridize under stringent conditions with the reference sequence and that code for proteins that bind specifically to human endoglin.
  • “Stringent hybridization conditions” are understood to mean those conditions in which hybridization takes place at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C. in a lower buffer concentration and remains stable.
  • the nucleic acid can be present as a plasmid, as part of a viral or non-viral vector.
  • the present invention therefore furthermore relates to a vector, in particular an expression vector, which contains a nucleic acid which codes for an antibody which is part of an antibody multimer according to the invention.
  • Baculoviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes viruses are particularly suitable as viral vectors.
  • Non-viral vectors Virosomes, liposomes, cationic lipids or poly-lysine conjugated DNA are particularly suitable.
  • the antibody contains one or more secretion signals in a preferred embodiment.
  • secretion signals By means of these secretion signals, the antibody according to the invention is excreted from the cell into the periplasm and can be obtained directly from the culture medium of the production cell line.
  • the pelB secretion signal sequence (Lei et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 4379-4383) with a sequence according to SEQ ID No. 17 is particularly suitable as the secretion signal.
  • the present invention further relates to a cell which contains at least one nucleic acid according to the invention.
  • this cell expresses the antibody which is part of the antibody analyzer according to the invention.
  • the antibody can then be isolated from the cell or is secreted by the cell. If the antibody contains a cleavable secretion signal sequence, this can be cleaved in a further step, for example by incubation with a suitable endopeptidase or, in the case of intein, by adding dithiothreitol (DTT) to the medium.
  • DTT dithiothreitol
  • prokaryotic and eukaryotic cells are suitable, in particular bacterial cells such as E. coli, yeast cells such as S. cerevisiae, insect cells such as Spodoptera frugiperda cells (Sf-9) or Trichoplusia ni cells or Mammalian cells such as COS cells or HeLa cells.
  • bacterial cells such as E. coli
  • yeast cells such as S. cerevisiae
  • insect cells such as Spodoptera frugiperda cells (Sf-9) or Trichoplusia ni cells
  • Mammalian cells such as COS cells or HeLa cells.
  • Another object of the present invention is therefore a method for producing an antibody multimer according to the invention, in at least one nucleic acid according to the invention is expressed in a cell.
  • this coupling can take place in a further step by incubation or chemical reaction with a component.
  • the antibody multimer according to the invention can be used as a diagnostic tool.
  • Another object of the present invention is accordingly the use of at least one antibody multimer for the detection of an antigen in vitro and / or in vivo.
  • the detection can be done directly by fusion or coupling a detectable
  • Component take place (e.g. with an enzyme or a radioisotope) or indirectly through a labeled component which
  • Endoglin recognizes antibodies. Detection methods are preferred
  • the antibody multimer can also serve as a ligand in order to specifically recognize and bind, for example, endoglin-expressing cells (e.g. tumor endothelial cells).
  • Another object of the present invention is accordingly the use of at least one antibody multimer for binding at least one component and / or at least one fused peptide or protein to a cell.
  • Antibody multimer toxic to the cell This effect can be achieved, for example, by recruiting cytotoxic T cells, or by fusion or coupling
  • Cytokines or enzymes such as "prodrug converting enzymes” achieved.
  • the binding to the cell leads to infection, transduction or transfection of the cell with a virus, a virus-like particle, a liposome and / or a nucleic acid.
  • Another object of the present invention is the use of at least one antibody multimer, at least one nucleic acid and / or at least one vector as described above for the therapy of
  • Diseases preferably diseases in which endothelial cells are involved.
  • the antibody multimers, nucleic acid and / or vectors according to the invention are used for the therapy of diseases which are characterized by the hyperprohferation of endoglin-expressing cells. Hyperprohferation of endothelial cells is observed, for example, in the neovascularization of tumor tissue, which is why the therapy of tumor diseases is a particularly preferred use of the antibodies, amino acid sequences, nucleic acids and / or vectors according to the invention.
  • the antibody being a polypeptide chain of the structure variable chain (V ⁇ ) -connection peptide A (PA) - variable chain (V 2 ) -connection peptide M (PM) -variable chain (V 3 ) - Connection peptide B (PB) - variable chain (V 4 ), and PA and PB independently of one another have a length of 0 to 1 amino acid residues.
  • the present invention furthermore relates to a medicament or diagnostic agent which contains at least one antibody multimer, at least one nucleic acid and / or at least one vector as described above and, if appropriate, suitable auxiliaries and additives.
  • suitable auxiliaries and additives lead, for example, to improving the shelf life and to improving the tolerance or increasing the availability of the medicament or diagnostic agent according to the invention and are known to the person skilled in the art.
  • Homodimers of multi-antigen-binding single-chain antibody fragments are, for example, expressed by expression of polypeptide chains of the structure V H -PA-V L -PM-V L -PB-VH or VL-PA-V H -PM-V L -PB-V H a connecting peptide M of 12-25 amino acid residues and connecting peptides PA and PB of 0-1 amino acid residues.
  • the length of the connecting peptides A and B can be the same or different.
  • the compound peptides can have any amino acid sequence.
  • the compound peptides preferably contain glycine, alanine, serine-threonine, aspartic acid and asparagine residues and the sequences described in Table 1.
  • Bispecific homodimers from multi-antigen-binding single-chain antibody fragments are produced by expressing a polypeptide chain in which the variable domains are directed against two different epitopes or antigens. These molecules have two binding sites for each epitope or antigen.
  • Monospecific homodimers from multi-antigen-binding single-chain antibody fragments are expressed by expression Polypeptide chain in which all variable domains are directed against the same epitope. These molecules therefore have four binding sites for the same epitope or antigen.
  • the homodimers have a molecular weight of approximately 110,000 and have four functional antigen binding sites. They are therefore only slightly larger than four Fv fragments without corresponding connecting peptides (molecular weight approximately 100,000). These dimeric, multi-antigen-binding single-chain antibody fragments thus correspond almost to the smallest tetravalent molecules based on the variable antibody domains. They thus combine a small size with a bi- or tetravalent bond to the respective epitope.
  • polypeptide chains are produced, for example, at the DNA level by joining DNA sequences which code for the variable domains and the connecting peptides. This is done with the aid of methods known to the person skilled in the art.
  • the expression of the polypeptides takes place using suitable expression vectors and organisms known to the person skilled in the art. These organisms can be, for example: bacteria, yeasts, plants or mammalian cells.
  • Fig. 1 Formation of monomeric and dimeric multi-antigen binding single-chain antibody fragments (scDb).
  • scDb monomeric multi-antigen binding single-chain antibody fragments
  • a first step AI the central variable domains assemble to form an antigen binding site. This requires a PM of 12-25 amino acid residues.
  • a second step A2a the marginal variable domains then assemble to form the second antigen binding site.
  • the optimal length of PA and PB is between
  • Fig. 2 Position of the connecting peptides PA, PM and PB.
  • the position of the connecting peptides PM (A), PA and PB (B) between the variable antibody domains of the multi-antigen-binding single-chain antibody fragment (scDb CEAGal) is shown.
  • Table 1 Amino acid sequences of the connecting peptides M, A and B. The names of the mutants and the sequences used instead of the wt sequence are given.
  • Table 2 Expression analysis of some mutants tested. The length of the connection peptides PM, PA and PB used is indicated. In The right column shows whether the expressed protein was present as monomer (M) or dimer (D) after purification.
  • Example 1 Production of polypeptide chains for the expression of homodimers from multi-antigen-binding single-chain antibody fragments
  • scDb CEAGal A bispecific multiple-antigen-binding single-chain antibody fragment (scDb CEAGal), which is directed against the tumor marker carcinoembryonic antigen (CEA) and E. coli ß-galactosidase (Brusselsbach et al., 1999).
  • This construct was in the configuration VHA-PA-VLB-PM-V L B-PB-V H A and had a Myc tag at the C-terminus for detection by the monoclonal antibody 9E10 and a hexahistidyl sequence for purification by means of metal affinity chromatography , PA and PB had the sequence SGGGGS (6 amino acid residues) and PM the sequence GGGGSGGRASGGGGS (15 amino acid residues).
  • plasmid pABl scDb CEAGal was cut with the restriction enzymes Sfil and Ascl (fragment 1) or with Ascl and Notl (fragment 2). Fragment 1 served as a template to attach the DNA for the N-terminal half of the connecting peptide M (up to the AscI interface) by means of PCR.
  • the PCR product was cut with Sfil and Ascl.
  • Fragment 2 served as a template to use PCR to attach the DNA for the C-terminal half of connecting peptide M (from the AscI site).
  • the PCR product was cut with Ascl and Notl.
  • the PCR products were cloned into the bacterial expression vector pABl cut with Sfil and Notl (Kontermann et al., 1997, Immunotechnology 3, 137-144). These plasmids served in one second step as a template for the insertion of DNA sequences for the connecting peptides PA and PB.
  • the section of the medium variable domains including the connecting peptides PA and PB was amplified, cut with the restriction enzymes BstEII and Sacl, and cloned in plasmid pABl scDb CEAGal, which had been cut with the same enzymes.
  • Expression vector pABl has the IPTG-inducible LacZ promoter and a pelB leader sequence for the transport of the protein into the periplasmic space. All constructs with shortened compound peptides A and B were based on construct M3 and consequently had the compound peptide M3 consisting of 16 amino acid residues.
  • the expression took place in bacteria (E. coli TG1 strain). For this, 10 ml of an overnight culture of scFv C4 were added per liter of LB medium which had been mixed with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 0.1% glucose and shaken at 37 ° C. When an OD 6 oo of 0.8 was reached, 1 mM final concentration of IPTG was added and the bacteria were shaken at room temperature for 3 hours. The bacteria were centrifuged off and the pellet was resuspended with extraction buffer (30 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 20% sucrose).
  • MgCl 2 was added to a final concentration of 5 mM and the solution was centrifuged again. The supernatant was dialyzed against IMAC loading buffer (50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole).
  • the dialysate was loaded onto a Ni-NTA-loaded column (Qiagen), which was equilibrated with loading buffer, washed with washing buffer (50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 35 mM imidazole) and the bound antibody fragment was then eluted with buffer (50 mM sodium phosphate buffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 100 mM imidazole) eluted. The protein-containing fractions were dialyzed against PBS.
  • Example 3 Characterization of homodimers from multi-antigen-binding single-chain antibody fragments
  • the functional analysis of the monomeric and dimeric molecules was carried out in an ELISA or in recruitment experiments.
  • CEA was bound to microtiter plates and then incubated with 50 ⁇ l of the fractions from the gel filtration. Bound molecules were detected using a peroxidase-labeled anti-hexahistidyl antibody.
  • recruitment experiments the detection was carried out by incubation with ß-galactosidase and subsequent reaction of a chromogenic substrate (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside). In this way, the simultaneous binding of both antigens can be analyzed directly.
  • dimers are functionally active and can be relatively easily, e.g. by means of gel filtration.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Multimere mehrfach-antigenbindender einzelkettiger Antikörper, insbesondere cyclische Homodimere, sowie deren Herstellung und Verwendung.

Description

Multimerer mehrfach-antigenbindender einzelkettiger Antikörper
Die vorliegende Erfindung betrifft Multimere mehrfach-antigenbindender einzelkettiger Antikörper, insbesondere cyclische Homodimere, sowie deren Herstellung und Verwendung.
Natürlich vorkommende Antikörper sind in der Regel aus zwei identischen schweren (H) und zwei identischen leichten (L) Proteinketten zusammengesetzt. Jede dieser Ketten verfugt über einen variablen (VR und VL) und einen konstanten (CR und CL) Teil. Der variable Teil einer schweren und einer leichten Kette bilden jeweils ein Bindungszentrum, so daß ein typischer Antikörper (IgG) über zwei Bindungszentren identischer Spezifität verfügt (siehe beispielsweise J. Klein (1991) Immunologie, 1. Auf., 128-153, NCH Nerlagsgesellschaft Weinheim). Natürlich vorkommende Antikörper (IgGs) sind demnach monospezifisch und bivalent.
Bispezifische Antikörper sind Antikörper, die zwei Bindungszentren mit unterschiedlicher Spezifität besitzen und deshalb in der Lage sind zwei unterschiedliche Antigene bzw. Epitope zu erkennen (Fanger et al. 1992, Crit. Rev. Immunol. 12, 101). Sie können gleichzeitig an zwei unterschiedliche Strukturen, wie beispielsweise pharmakologische Wirkstoffe, virale Hüllproteine, Zellrezeptoren binden, und dadurch verschiedenste Moleküle, Zellen oder Viren, zusammenbringen. Bispezifische Antikörper fungieren somit als Bindungsmediatoren. Diese Fähigkeit erlaubt es bispezifische Antikörper in einer Reihe diagnostischer Anwendungen einzusetzen, wie beispielsweise der Bindung eines Enzyms an ein nachzuweisendes Molekül. Die möglichen therpeutische Anwendungen sind jedoch noch weitaus vielfältiger. So lassen sich mit bispezifischen Antikörpern verschiedenste Effektormoleküle (z.B. Radioisotope, Enzyme, toxische Moleküle, Wachstumsfaktoren und Zytokine) aber auch größere Strukturen, wie z.B. Niren oder Effektorzellen (z.B. zytotoxische T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen und Makrophagen) zu Zielzellen oder anderen Targetstrukturen rekrutieren. Bisher sind bispezifische Antikörper sowohl in immunotherapeutischen als auch in gentherapeutischen Anwendungen eingesetzt worden (van Spriel et al. 2000, Immunol. Today 21, 391; Pelegrin et al. 1998, Human Gene Ther. 9, 2165).
In den letzten Jahren sind eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um bispezifische Antikörper herzustellen. So können beispielsweise zwei unterschiedliche Antikörper bzw. Antikörperfragmente (z.B. Fab-Fragmente) durch chemische Quervernetzung verbunden werden. Eine weitere Methode stellt die Hybrid-Hybridom-Technologie dar, bei der zwei unterschiedliche antikörpersezernierende Hybridome zu einem Quadrom verschmolzen werden. Sowohl bei der chemischen Quervernetzung als auch bei der Hybrid-Hybridom- Technologie werden jedoch erhebliche Mengen an nichtfiinktionellen Molekülen erzeugt.
Eine weitere Methode war die Herstellung rekombinanter Antikörperfragmente (Plückthun & Pack, 1997, Immunotechnology 3, 83). Hierbei wurden die antigenbindenden Teile eines Antikörpers, d.h. die variablen Domänen, auf genetischer Ebene zu funktionellen Molekülen verbunden und in geeigneten Expressionssystemen rekombinant hergestellt. Holliger et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6444) beschrieben die Expression eines Antikörperfragments in Form eines "Diabodies". Bispezifische Diabodies sind Heterodimere, die aus zwei Ketten der Struktur NHA-NLB und NLB-NHA bestehen, wobei A und B jeweils die Spezifität der variablen Kette für die Antigene A und B angeben. Die beiden variablen Polypeptidketten, die die Bindungsdomäne bilden, wurden dabei von kurzen Nerbindungspeptiden (in der Regel 5-6 Aminosäurereste) zusammengehalten. Durch diese kurzen Verbindungspeptide wird die Zusammenlagerung der variablen Ketten eines Antikörpermoleküls, d.h. die intramolekulare Wechselwirkung, die zu einem einzelkettige monospezifischen Fv-Fragment fuhren würde (scFv), verhindert. Dieses Format fuhrt jedoch auch zur Ausbildung von nichtfiinktionellen Homodimeren, so daß für die Herstellung reiner Populationen bispezifischer Diabodies spezielle Reinigungsverfahren, wie z.B. Affinitätscl romatographien, angewandt werden müssen.
Dieses Problem bei der Herstellung bispezifischer Diabodies wurde kürzlich dadurch gelöst, daß die beiden Ketten zu einem einzelkettigen Molekül verbunden wurden (Brüsselbach et al, 1999, Tumor Targeting 4, 115-123; DE 198 16 141.7). Die Struktur eines solchen bispezifischen mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragments kann beispielsweise VHA-VLB-VHB-VLA bzw. VLA-VHB-V B-VHA sein. Die variablen Domänen in diesen bispezifischen mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Diabodies werden über drei Verbindungspeptide zusammengehalten. Verbindungspeptid A (PA) verbindet die ersten beiden Domänen, Verbindungspeptid M (PM) verbindet die mittleren Domänen und Verbindungspeptid B (PB) verbindet die letzten beiden Domänen, so daß die folgende Struktur entsteht: VHA-PA-VLB-PM-VHB-PB-VLA bzw. VLA-PA-VHB-PM-VLB-PB-VHA. Verbindungspeptide PA und PB sind in der Regel 5 bis 6 Aminosäurereste lang, während Verbindungspeptid PM 12 bis 25 Aminosäurereste lang ist. Durch die gezielte Wahl der Länge der Verbindungspeptide wurde verhindert, daß beispielsweise in einem Molekül der Struktur VHA-PA-VLB-PM-VHB-PB-VLA die VHA Polypeptidkette mit der VLB Kette und die VRB Kette mit der V A Kette interagiert, was zur Ausbildung nichtfunktioneller VH VL Bindungsdomänen führen würde. Diese mehrfach- antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten, auch als "single-chain diabodies" (scDb) bezeichnet, besitzen im Vergleich zu den heterodimeren Diabodies eine erhöhte Stabilität in Serum. Ferner sind alle Monomere, die ein Molekulargewicht von etwa 55.000 besitzen, identisch und zwangsläufig bispezifisch. Nichtftmktionelle Moleküle dieser Größe können wie im Fall von bispezifschen Diabodies nicht entstehen. Neben der Herstellung von bispezifischen Molekülen, werden mehrfach-antigenbindende einzelkettige Antikörperfragmente auch für die Herstellung bivalenter Moleküle, bei dem beide Antigenbindestellen gegen das gleiche Epitop gerichtet sind, eingesetzt.
Multivalente Moleküle verfügen aufgrund der Anwesenheit von zwei oder mehr Bindungsstellen im gleichen Molekül im Vergleich zu monovalenten Molekülen über eine erhöhte funktioneile Affinität, d.h. Bindungsstärke. Für diagnostische Zwecke läßt sich hierdurch die Sensitivität des Nachweises deutlich erhöhen. In therapeutischen Ansätzen führt die erhöhte funktionelle Affinität zu einer verstärkten Bindung an die Zielstruktur (z.B. eine Zelle oder eine Gewebe). Hierdurch kann die Effizienz der therapeutischen Applikation u.a. durch Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften erhöht werden (Plückthun & Pack, 1997, Immunotechnology 3, 83). Alt et al. (1999, FEBS Letter 454, 90) haben gezeigt, daß sich die funktioneile Affinität von mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten durch Homodimerisierung deutlich erhöhen läßt. In diesen Experimenten wurden die mehrfach antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten mit der CH3 bzw. der Fc-Region von humanem IgG fusioniert. Diese Moleküle besitzen somit vier funktionelle Bindungsstellen. Der Nachteil dieser multivalenten Moleküle ist jedoch ihre Größe. Das CH3 -Fusionsprotein ist etwa 150 kD und das Fc-Fusionsprotein etwa 200 kD groß. Für therapeutische Anwendungen, die beispielsweise eine gute Penetration in das zu behandelnde Gewebe erfordern, sind kleinere Moleküle jedoch von Vorteil. Le Gall et al. (1999, FEBS Lett. 453, 164) und Hudson & Kortt, (1999, J. Immunol. Meth. 231, 177) beschreiben aus vier scFv-Fragmenten bestehende monospezifische, tetravalente Tetrabodies. Diese entstehen neben trivalenten Triabodies und bivalenten Diabodies, wenn das Verbindungspeptid (P) des verwendeten scFv-Fragments (VH-P-VL) sehr kurz ist (0 bis 1 Aminosäurereste). So müssen tetravalenten Tetrabodies auch bei diesem Ansatz beispielsweise durch "Size-exclusion" Chromatographie weiter aufgereinigt werden. Es besteht deshalb weiterhin ein Bedarf an mono, bi- oder multispezifischen Antikörpern, insbesondere bispezifϊschen Antikörpern, die zu multivalenter Antigenbindung fähig sind, die stabil sind und die dennoch nur eine geringe Größe aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Antikörpermultimer, wobei mindestens einer der Antikörper eine Variante ist. Eine Variante des Antikörpers ist ein Antikörper, der auf Aminosäureebene eine Homologie von 60%, vorzugsweise 70%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere 90% besitzt und spezifisch an die extrazelluläre Domäne von humanen Endoglin bindet. Die Bestimmung der Homologie kann beispielsweise mit einem Programm wie ALIGN, das im Internet zugänglich ist (beispielsweise unter http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLaun-cher/) durchgeführt werden.
Vorzugsweise sind die Änderung der Aminosäuresequenz sogenannte konservative Änderungen, wie beispielsweise Asparaginsäure zu Glutaminsäure oder Leucin zu Isoleucin. Die spezifische Bindung kann durch Standardtests, wie beispielsweise ELISA nachgewiesen werden.
In dem erfindungsgemäßen Antikörpermultimer kann auch mindestens ein Antikörper mit mindestens einem Peptid und/oder einem Protein fusioniert vorliegen. Als Peptid werden Aminosäuresequenzen von weniger als 50 Aminosäuren bezeichnet. Eine Fusion liegt dann vor, wenn die Aminosäuren des Antikörpers über eine Peptidbindung mit dem Peptid und/oder dem Protein verknüpft sind. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein zusammenhängend translatiert und von einer mRNA kodiert. Geeignete Proteine und Peptide sind beispielsweise Enzyme, Wachstumsfaktoren, Hormone, Zytokine, Chemokine, virale Hüllproteine, und/oder Antikörper. Die Fusion mit einem Zytokin oder Chemokin erlaubt beispielsweise die Rekrutierung einer für die Zielzelle toxischen Substanz und ermöglicht damit die gezielte Abtötung von beispielsweise Tumorendothelzellen. Die Fusion mit einem viralen Hüllprotein erlaubt die Herstellung von rekombinanten Viren, die auf ihrer Oberfläche einen Antikörper tragen, der beispieslweise für Endoglin spezifisch ist und damit die Rekrutierung des jeweiligen rekombinanten Virus zu beispieslweise Endothelzellen ermöglicht. Ein geeignetes Hüllprotein ist beispielsweise das Adenovirus Fiberprotein. Ein ähnliches Ziel kann auch durch die Fusion mit einem zweiten Antikörper, vorzugsweise mit einem scFv-Fragment erreicht werden, wenn dieser spezifisch an ein bestimmtes Virus bindet. Geeignet sind auch Peptide oder Protein, die von viralen Oberflächenmolekülen oder einem Antikörper erkannt werden.
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Antikörper- multimers wobei mindestens ein Antikörper an mindestens ein Peptid oder Protein fusioniert ist, interagiert das Protein oder das Peptid mit einem Rezeptor. Geeignete Rezeptoren sind beispielsweise Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems, die durch die Interaktion beispielsweise zu Endothelzellen rekrutiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörpermultimer, wobei an mindestens einen Antikörper, der Teil des Antikörpermultimers ist, mindestens eine Komponente gekoppelt ist. Unter Kopplung versteht man die kovalente oder nicht-kovalente Bindung einer Komponente an den Antikörper, wobei der Antikörper und die Komponente nicht zusammen translatiert und nicht von einer mRNA kodiert werden. Eine kovalente Kopplung kann beispielsweise durch Formaldehyd, Glutaraldehyd oder über eine Peptidbindung erfolgen. Eine nicht-kovalente Kopplung wird beispielsweise durch Inkubation eines erfindungsgemäßen Antikörpermultimers, das mit einem Peptid oder Protein fusioniert ist, das spezifisch an die Knobdomöne des adenoviralen Fiberproteins bindet, mit Adenovirus erhalten. Bevorzugte Komponenten sind Peptide, Proteine, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Hormone, Zytokine, Chemokine, virale Hüllproteine, Kohlenhydrate, Antikörper, Lipide, Isotope, Liposomen, Viren, Virusähnliche Partikel, Nukleinsäuren, und/oder Zellen. Die Nukleinsäuren, die an das erfindungsgemäßen Antikörpermultimer gekoppelt werden können „nackt" vorliegen oder beispielsweise mit einem poly Kation wie z.B. poly-Lysin kondensiert sein.
Die Kopplung des erfindungsgemäßen Antikörpermultimers an Liposomen ist eine weitere Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung, da Liposomen mit den verschiedensten therapeutisch wirksamen Substanzen beladen werden können. Die Liposomen, die an ein Antikörpermultimer der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden können, enthalten vorzugsweise mindestens eine antisense- RNA, mindestens ein Chemotherapeutikum, mindestens eine Nukleinsäure kodierend für einen Wirkstoff oder mindestens eine aktive Substanz enthält. Die antisense-RNA kann zum Beispiel die Translation von Genen inhibieren, die für die Zellteilung benötigt werden. Beispiele für Chemotherapeutika sind Substanzen wie beispielsweise Doxirubicin, cis-Platin oder Taxol. Dem Fachmann sind weitere Chemotherapeutika bekannt, die in der Tumortherapie eingesetzt werden und die von der vorliegenden Erfindung auch umfaßt sind.
Ein Wirkstoff, der von einer in Liposomen enthaltenden Nukleinsäure kodiert wird kann zum Beispiel ein Inhibitor der Zellproliferation sein. Geeignete Proteine sind dem Fachmann bekannt und umfassen Antionkogene, wie beispielsweise p53 oder pRb, sowie Zellzyklusinhibitoren, wie beispielsweise p21WAF, plό1^, p57INK2, p27KIP oder GADD45. Des weiteren können die Nukleinsäuren auch für zytostatische oder zytotoxische Proteine, wie zum Beispiel für Perforin, Granzym, IL-2, IL-4, IL-12 oder Oncostatin M kodieren. Eine aktive Substanz kann jede pharmakologisch wirksame Substanz sein, die beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen an denen Endothelzellen beteiligt sind, geeignet ist.
In einer bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Antikörpermultimers interagiert die Komponente mit einem Rezeptor. Geeignete Rezeptoren sind beispielsweise Rezeptoren auf Zellen des Immunsystems, die durch die Interaktion zu Endothelzellen rekrutiert werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für einen Antikörper, der Teil eines erfindungsgemäßen Antikö ermultimers ist kodiert. Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz einer Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen an das 5' und/oder 3'- Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß das der kodierte Antikörper wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte „Narianten" der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren.
Unter Varianten der Nukleinsäuren sind alle Nukleinsäuresequenzen zu verstehen, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und die für Proteine kodieren, die spezifisch an humanes Endoglin binden.
Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Um die Einführung der genannten Nukleinsäure und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen Vektors vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure, die für ein Antikörper kodiert, der Teil eines erfindungsgemäßen Antikörpermultimers ist, enthält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders Baculoviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht virale Vektoren eignen sich hierbei besonders Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.
Um die Herstellung des Antikörpers zu erleichtern, der beispielsweise in einer geeigneten Zelle rekombinant exprimiert wird, enthält der Antikörper in einer bevorzugten Ausfuhrungsform ein oder mehrere Sezernierungssignale. Durch diese Sezernierungssignale wird der erfindungsgemäße Antikörper von der Zelle ins Periplasma ausgeschieden und kann direkt aus dem Kulturmedium der Produktionszellinie gewonnen werden. Als Sezernierungssignal ist insbesondere die pelB Sezernierungssignalsequenz (Lei et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 4379- 4383) mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 17 geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Diese Zelle exprimiert unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils verwendeten regulierbaren Elemente fuhren, den Antikörper der Teil des erfindungsgemäßen Antikörpermulitmers ist. Der Antikörper kann dann aus der Zelle isoliert werden oder wird von der Zelle sezerniert. Wenn der Antikörper eine abspaltbare Sezernierungssignalsequenz enthält, kann diese in einem weiteren Schritt beispielsweise durch Inkubation mit einer geeigneten Endopeptidase oder im Falle von Intein, durch das Zufügen von Dithiothreitol (DTT) zum Medium, abgespalten werden. Zur gentechnischen Herstellung und anschließenden Aufreinigung der exprimierten, erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich prokaryotische und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli, Hefezellen wie beispielsweise S. cerevisiae, Insekten Zellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpermultimers, bei dem mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Zelle exprimiert wird.
Wenn an das erfindungsgemäße Antikörpermultimere eine Komponente gekoppelt werden soll, kann diese Kopplung in einem weiteren Schritt durch Inkubation oder chemische Reaktion mit einer Komponente erfolgen.
Das erfindungsgemäße Antikörpermultimer kann als diagnostisches Werkzeug eingesetzt werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach die Verwendung mindestens eines Antikörpersmultimers zum Nachweis eines Antigens in vitro und/oder in vivo.
Die Detektion kann direkt durch Fusion oder Kopplung einer nachweisbaren
Komponente erfolgen (z.B. mit einem Enzym oder einem Radioisotop) oder indirekt durch eine markierte Komponente, die den erfindungsgemäßen anti-
Endoglin Antikörper erkennt. Bevorzugt verwendete Nachweisverfahren sind
ELISA, RIA, Immunfluoresenz, Immunpräzipitation oder Immunscintillation.
Das Antikörpermultimer kann ferner als Ligand dienen, um gezielt beispielsweise Endoglin-exprimierende Zellen (z.B. Tumorendothelzellen) zu erkennen und zu binden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach die Verwendung mindestens eines Antikörpermultimers zur Bindung mindestens einer Komponente und/oder mindestens eines fusionierten Peptids oder Proteins and eine Zelle.
In einer bevorzugten Verwendung wirkt das erfindungsgemäße
Antikörpermultimer auf die Zelle toxisch. Dieses Effekt kann beispielsweise durch die Rekrutierung von zytotoxischen T-Zellen, die Fusion oder Kopplung mit
Zytokinen oder Enzymen, wie beispielsweise „prodrug converting enzymes", erreicht. In einer weiteren Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpermultimers fuhrt die Bindung an die Zelle zur Infektion, Transduktion bzw. Transfektion der Zelle mit einem Virus, einem virusähnlichen Partikel, einem Liposom, und/oder einer Nukleinsäure.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens eines Antikörpermultimers, mindestens einer Nukleinsäure und/oder mindestens eines Vektors wie vorangehend beschrieben zur Therapie von
Erkrankungen, vorzugsweise von Erkrankungen an denen Endothelzellen beteiligt sind.
In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antikörpermultimere, Nukleinsäure und/oder Vektoren zur Therapie von Erkrankungen verwendet, die durch die Hyperprohferation von Endoglin- exprimierenden Zellen charakterisiert sind. Hyperprohferation von Endothelzellen wird beispielsweise bei der Neovaskularisierung von Tumorgewebe beobachtet, deshalb ist die Therapie von Tumorerkrankungen eine besonders bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper, Aminosäuresequenzen, Nukleinsäuren und/oder Vektoren.
Verwendung mindestens eines Antikörpers in einem Verfahren zur Herstellung eines Antikörpermultimers, wobei der Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur variable Kette (Vι)-Verbindungspeptid A (PA)- variable Kette (V2)-Verbindungspeptid M (PM)-variable Kette (V3)- Verbindungspeptid B (PB)- variable Kette (V4), enthält und PA und PB unabhängig voneinander eine Länge von 0 bis 1 Aminosäureresten haben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum, das mindestens ein Antikörpermultimer, mindestens eine Nukleinsäure, und/oder mindestens einen Vektor wie vorangehend beschrieben und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe enthält. Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe führen beispielsweise zur Verbesserung der Lagerfähigkeit sowie zur Verbesserung der Verträglichkeit oder Erhöhung der Verfügbarkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels oder Diagnostikums und sind dem Fachmann bekannt.
Homodimere von mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten werden beispielsweise durch Expression von Polypeptidketten der Struktur VH-PA-VL-PM-VL-PB-VH bzw. VL-PA-VH-PM-VL-PB-VH mit einem Verbindungspeptid M von 12-25 Aminosäureresten und Verbindungspeptiden PA und PB von 0-1 Aminosäureresten hergestellt. Die Länge der Verbindungspeptide A und B kann gleich oder unterschiedlich sein. Durch Expression von mehrfach- antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten dieser Konfiguration können sich die beiden mittleren Domänen zu einem Fv-Fragment zusammenlagern, während die Aneinanderlagerung der randständigen variablen Domänen innerhalb einer Kette verhindert wird. Dies f hrt zu einer Aneinanderlagerung der randständigen variablen Domänen von zwei Polypeptidketten zu einem Dimer mit einer zirkulären Struktur (zirkuläre dimere mehrfach-antigenbindende einzelkettige Antikörperfragmente; cidiscDb) (siehe Abb. 1 zur Verdeutlichung). Die Verbindungspeptide können eine beliebige Aminosäureseequenz besitzen. Die Verbindungspeptide enthalten jedoch bevorzugt Glycin-, Alanin-, Serin- Threonin-, Asparaginsäure- und Asparaginreste sowie die in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzen.
Bispezifische Homodimere aus mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten werden durch Expression einer Polypeptidkette, bei der die variablen Domänen gegen zwei unterschiedliche Epitope bzw. Antigene gerichtet sind, hergestellt. Diese Moleküle besitzen zwei Bindungsstellen für jedes Epitop bzw. Antigen.
Monospezifische Homodimere aus mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten werden durch Expression einer Polypeptidkette, bei der alle variablen Domänen gegen das gleiche Epitop gerichtet sind, hergestellt. Diese Moleküle besitzen also vier Bindungsstellen für das gleiche Epitop bzw. Antigen.
Die Homodimere haben ein Molekulargewicht von etwa 110 000 und besitzen vier funktionelle Antigenbindestellen. Sie sind somit nur geringfügig größer als vier Fv-Fragmente ohne entsprechende Verbindungspeptide (Molekulargewicht cirka 100 000). Diese dimeren mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmente entsprechen somit nahezu den kleinsten tetravalenten Molekülen basierend auf den variablen Antikörperdomänen. Sie vereinen somit eine geringe Größe mit einer bi- bzw. tetravalenten Bindung an das jeweilige Epitop.
Die Herstellung der Polypeptidketten erfolgt beispielsweise auf DNA-Ebene durch Zusammenfügen von DNA-Sequenzen, die für die variablen Domänen und die Verbindungspeptide codieren. Dies erfolgt mit Hilfe dem Fachmann bekannter Methoden. Die Expression der Polypeptide erfolgt unter Verwendung geeigneter und dem Fachmann bekannter Expressionvektoren und Organismen. Diese Organismen können beispielsweis sein: Bakterien, Hefen, Pflanzen oder Säugerzellen.
Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Die folgenden Abbildungen und Tabellen und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung lediglich näher beschreiben ohne sie zu beschränken. Abbildungen und Tabellen
Abb. 1: Bildung von monomeren und dimeren mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragmenten (scDb). Die Ausbildung eines monomeren scDb erfolgt in zwei Schritten. In einem ersten Schritt AI lagern sich die zentralen variablen Domänen zu einer Antigenbindestelle zusammen. Dies erfordert ein PM von 12-25 Aminosäureresten. In einem zweiten Schritt A2a lagern sich dann die randständigen variablen Domänen zur zweiten Antigenbindestellen zusammen. Die optimale Länge von PA und PB liegt hierbei zwischen
2-8 Aminosäurereste. Diese Moleküle besitzen 2 Antigenbindestellen. Haben PA und PB eine Länge von 0-1 Aminosäurerest bilden sich Homodimere durch Zusammenlagerung der randständigen variablen Domänen zweier Ketten aus (Schritt A2b und A3b). Dies resultiert in zirkulären dimeren scDb (cidiscDb) mit vier Antigenbindestellen.
Abb. 2: Position der Verbindungspeptide PA, PM und PB. Die Position der Verbindungspeptide PM (A), PA und PB (B) zwischen den variablen Antikörperdomänen des mehrfach-antigenbindenden einzelkettigen Antikörperfragments (scDb CEAGal) ist gezeigt. Die Abbildung enthält ferner die Positionen verschiedener Restriktionsschnittstellen, die zur Herstellung der Konstrukte verwendet wurden. Schraffiert = pelB-Signalsequenz (N-terminal) und die Myc-His-Sequenz (C- terminal).
Tabelle 1: Aminosäuresequenzen der Verbindungspeptide M, A und B. Die Namen der Mutanten und die statt der wt Sequenz verwendeten Sequenzen ist angegeben.
Tabelle 2: Expressionsanalyse einiger getesteter Mutanten. Die Länge der jeweils verwendeten Verbindungspeptide PM, PA und PB ist angegeben. In der rechten Spalte wird aufgeführt, ob das exprimierte Protein nach der Reinigung als Monomer (M) oder Dimer (D) vorlag.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von Polypeptidketten zur Expression von Homo- dimeren aus mehrfach-antigenbindenen einzelkettigen Antikörperfragmenten
Als Ausgangsmaterial (hier als Wildtyp-Molekül [wt] bezeichnet) diente ein bispezifisches mehrfach-antigenbindendes einzelkettiges Antikörperfragment (scDb CEAGal), das gegen den Tumormarker Carcinoembryonales Antigen (CEA) und E. coli ß-Galaktosidase gerichtet ist (Brüsselbach et al., 1999). Dieses Konstrukt lag in der Konfiguration VHA-PA-VLB-PM-VLB-PB-VHA vor und bestitzt am C-Terminus ein Myc-Tag, zur Detektion durch den monoklonalen Antikörper 9E10, und eine Hexahistidylsequenz zur Reinigung mittels Metallaffmitätscliromatographie. PA und PB hatten die Sequenz SGGGGS (6 Aminosäurereste) und PM die Sequenz GGGGSGGRASGGGGS (15 Aminosäurereste). Mittels Polymerasekettenreaktion wurde diese Verbindungspeptide in Sequenz und Länge variiert. Die Konstrukte und deren Verbindungspeptide sind in Tabelle 1 und 2 zusammengefaßt. Abb. 2 zeigt die Bereiche, in die die Verbindungspeptide zwischen den variablen Domänen inseriert wurden. Hierfür wurde Plasmid pABl scDb CEAGal mit den Restriktionsenzymen Sfil und Ascl (Fragment 1) oder mit Ascl und Notl (Fragment 2) geschnitten. Fragment 1 diente als Matrize um mittels PCR die DNA für die N-terminale Hälfte von Verbinungspeptid M (bis zur AscI-Schnittstelle) anzuhängen. Das PCR-Product wurde mit Sfil und Ascl geschnitten. Fragment 2 diente als Matrize um mittels PCR die DNA für die C-terminale Hälfte von Verbindungspeptid M (ab der AscI-Schnittstelle) anzuhängen. Das PCR-Product wurde mit Ascl und Notl geschnitten.. Die PCR-Produkte wurden in den mit Sfil und Notl geschnitten bakteriellen Expressionsvektor pABl (Kontermann et al., 1997, Immunotechnology 3, 137-144) kloniert. Diese Plasmide dienten in einem zweiten Schritt als Matrize für die Einfügung von DNA-Sequenzen für die Verbindungspeptide PA und PB. Hierfür wurde mittels PCR der Abschnitt der für mittleren variablen Domänen einschließlich der Verbindungspeptide PA und PB amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen BstEII und Sacl geschnitten, und in Plasmid pABl scDb CEAGal, das mit den gleichen Enzymen geschnitten war, Moniert. Expressionsvektor pABl verfügt über den IPTG-induzierbaren LacZ- Promoter und eine pelB-Leadersequenz, für den Transport des Proteins in den periplasmatischen Raum, verfügt. Alle Konstrukte mit verkürzten Verbindungspeptiden A und B basierten auf Konstrukt M3 und besaßen demzufolge das Verbindungspeptide M3 bestehend aus 16 Aminosäureresten.
Beispiel 2: Expression von Homodimeren aus mehrfach-antigenbindenen einzelkettigen Antikörperfragmenten
Die Expression erfolgte in Bakterien (E. coli TG1 -Stamm). Hierfür wurden pro Liter LB-Medium, das mit 100 μg/ml Ampicillin und 0.1% Glucose versetzt war, 10 ml einer Übernachtkultur von scFv C4 zugegeben und bei 37°C geschüttelt. Beim Erreichen einer OD6oo von 0.8 wurde 1 mM Endkonzentration IPTG zugegeben und die Bakterien bei Raumtemperatur für 3 Std. geschüttelt. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und das Pellet mit Extraktionspuffer (30 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, 20% Saccharose) resuspendiert. Nach einer Inkubation von 15 min auf Eis wurde MgCl2 in einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und die Lösung erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen IMAC-Ladepuffer dialysiert (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol). Das Dialysat wurde auf eine Ni-NTA-beladene Säule (Qiagen), die mit Ladepuffer äquilibriert war, geladen, mit Waschpuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 35 mM Imidazol) gewaschen und das gebundene Antikörperfragment anschließend mit Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.5, 500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) eluiert. Die proteinenthaltenden Fraktionen wurden gegen PBS dialysiert. Beispiel 3: Charakterisierung von Homodimeren aus mehrfach-antigenbindenen einzelkettigen Antikörperfragmenten
Die Bildung von monomeren bzw. dimeren Molekülen wurde mittels FPLC- Gelfiltration über eine Superose 12-Säule analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Mit Ausnahme von Bι29 und AoBt formten diese Konstrukte ausschließlich Monomere. Bι29, mit PA und PB von jeweils einem Aminosäurerest, enthielt zu etwa 30-40% Dimere. Konstrukt AoBt bestand zu mehr als 80% aus Dimeren. Konstrukt AoB0 hingegen konnte nicht in löslicher Form exprimiert werden.
Die funktionelle Analyse der monomeren und dimeren Moleküle erfolgte im ELISA bzw. in Rekrutierungsexperimenten. Für den ELISA wurde CEA an Mikro- titerplatten gebunden und anschließend mit 50 μl der Fraktionen der Gelfiltration inkubiert. Gebundene Moleküle wurden mittels eines Peroxidase-markierten anti- hexahistidyl- Antikörpers detektiert. Für Rekrutierungsexperimente wurde erfolgte die Detektion durch Inkubation mit ß-Galaktosidase und anschließende Umsetzung eines chromogenen Substrats (o-nitrophenyl-ß-D-Galaktopyranosid). Hierdurch läßt sich die gleichzeitige Bindung beider Antigene direkt analysieren. Diese Experimente zeigten, daß sowohl die monomeren als auch die dimeren Moleküle funktionell voll aktiv waren.
Die Ergebnisse demonstrieren, daß eine Reduktion der PA und PB auf 0-1
Aminosäurerest bei Verwendung eines Verbindungspeptids M von 16
Aminosäureresten zur Ausbildung von Dimeren führt. Diese Dimere sind funktionell aktiv und lassen sich relativ einfach, z.B. mittels Gelfiltration, voneinander trennen.

Claims

Patentansprüche
1. Antikörpermultimer enthaltend mindestens zwei Antikörper, wobei jeder der Antikörper unabhängig voneinander eine Polypeptidkette der Struktur
variable Kette (N -Verbindungspeptid A (PA)-variable Kette (V2)-Nerbind- ungspeptid M (PM)-variable Kette (V3)-Verbindungspeptid B (PB)- variable Kette (N4),
enthält und PA und PB unabhängig voneinander eine Länge von 0 bis 1 Aminosäureresten haben.
2. Antikörpermultimer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils nur die Ν- und C-terminalen variablen schweren (H) oder leichten (L) Ketten der Polypeptidketten an der Interaktion der Antikörper beteiligt sind.
3. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper identisch sind.
4. Antikörpermultimer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur NHA-PA-NLB-PM-NHB-PB- VLA enthalten, wobei VRA und VLA eine Spezifität A und VRB und VLB eine Spezifität B besitzen.
5. Antikörpermultimer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur VLA-PA-VHB-PM-VLB-PB- NHN enthalten, wobei NHA und VLA eine Spezifität A und VRB und VLB eine Spezifität B besitzen.
6. Antikörpermultimer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur NL-PA-NH-PM-NL-PB-NH enthalten, wobei alle VH und VL dieselbe Spezifität besitzen.
7. Antikörpermultimer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur VH-PA-V -PM-VH-PB-VL enthalten, wobei alle VH und VL dieselbe Spezifität besitzen.
8. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß PA und/oder PB ein Glycin-, Alanin-, Asparginsäure-, Asparagin-, Threonin- oder Serinrest ist.
9. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß PA eine Länge von 0 hat und PB ein Länge von 1 hat.
10. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß PM eine Länge von 12 bis 25 Aminosäureresten hat.
11. Antikörpermultimer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß PM aus Glycin-, Alanin-, Asparginsäure-, Asparagin-, Threonin- oder Serinresten oder einer Mischung davon besteht.
12. Antikörpermultimer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß PM eine Aminosäuresequenz gemäß einer der in SEQ Νr. 1 bis 10 angegebenen
Aminosäuresequenzen aufweißt.
13. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Antikörper eine Variante eines Antikörpers ist.
14. Antikörpermultimer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Antikörper mit mindestens einem Peptid oder Protein fusioniert ist.
15. Antikörpermultimer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Peptid, ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Zytokin, ein Chemokin, ein virales Hüllprotein, und/oder ein Antikörper ist.
16. Antikörpermultimer nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Peptid mit einem Rezeptor interagiert.
17. Antikörpermultimer nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Antikörper an mindestens eine Komponente gekoppelt ist.
18. Antikörpermultimer nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente ein Peptid, ein Protein, ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Zytokin, ein Chemokin, ein virales Hüllprotein, ein Kohlenhydrat, ein Antikörper, ein Lipid, ein Isotop, ein Liposom, ein Virus, ein virusähnliches Partikel, eine Nukleinsäure, und/oder eine Zelle ist.
19. Antikörpermultimer nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom mindestens eine antisense-RNA, mindestens ein Chemothera- peutikum, mindestens eine Nukleinsäure kodierend für einen Wirkstoff oder mindestens eine aktive Substanz enthält.
20. Antikörpermultimer nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente mit einem Rezeptor interagiert.
21. Nukleinsäure, die für einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 kodiert.
22. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 21 enthält.
23. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 21 enthält.
24. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpermultimers, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 21 in einer Zelle exprimiert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt mindestens eine Komponente an mindestens einen der Antikörper des Antikörpermultimers gekoppelt wird.
26. Verwendung mindestens eines Antikörpermultimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 in diagnostischen Nachweisverfahren.
27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweisverfahren ein ELISA, ein RIA, eine Immunfluoresenz, eine
Immunpräzipitation und/oder eine Immunscintillation ist.
28. Verwendung mindestens eines Antikörpermultimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, zur Bindung mindestens einer Komponente und/oder mindestens eines fusionierten Peptids oder Proteins an eine Zelle.
29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente und/oder das fusionierte Peptid oder Protein auf die Zelle toxisch wirkt.
30. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung zur Infektion, Transduktion bzw. Transfektion der Zelle mit einem Virus, einem virusähnlichen Partikel, einem Liposom, und/oder einer Nukleinsäure führt.
31. Verwendung mindestens eines Antikörpermultimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, mindestens einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 21 und/oder mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 22 und zur Therapie von Erkrankungen.
32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankungen Tumorerkrankungen sind.
33. Verwendung mindestens eines Antikörpers, wobei der Antikörper eine Polypeptidkette der Struktur
variable Kette (V -Verbindungspeptid A (PA)-variable Kette (V )-Verbind- ungspeptid M (PM)-variable Kette (V3)-Verbindungspeptid B (PB)- variable Kette (V4),
enthält und PA und PB unabhängig voneinander eine Länge von 0 bis 1 Aminosäureresten haben, in einem Verfahren zur Herstellung eines Antikörpermultimers.
34. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens ein Antikörpermultimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, mindestens eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 21 und/oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 22 und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe.
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