WO2002037116A1 - Method for determining folding conditions for recombinant proteins - Google Patents

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WO2002037116A1
WO2002037116A1 PCT/DE2001/004077 DE0104077W WO0237116A1 WO 2002037116 A1 WO2002037116 A1 WO 2002037116A1 DE 0104077 W DE0104077 W DE 0104077W WO 0237116 A1 WO0237116 A1 WO 0237116A1
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folding
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buffer
proteins
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PCT/DE2001/004077
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Christoph Heiring
Udo Heinemann
Yves A. Muller
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Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Definitions

  • the invention relates to a method for determining folding conditions for recombinant proteins. Areas of application for this method are medicine and the pharmaceutical industry.
  • the heterologous production of proteins in the prokaryotic host Escherichia coli is a technique widely used in both research and industrial production.
  • the protein is not released by the ribosomes in a soluble, native conformation, but instead forms high-molecular aggregates and accumulates in so-called inclusion bodies. Therefore, there is a need to develop methods that allow these proteins to be dissolved and their biologically active folding to be regenerated 1 ' 2 .
  • the path via inclusion bodies also has a number of advantages compared to cytoplasmic or periplasmatic accumulation.
  • the protein can be produced in large quantities by expressing the corresponding gene under the control of a strong promoter. Under these conditions, the protein produced also tends to be less proteolytic degradation and its potential toxicity to the host cell is reduced. In addition, the protein can be quickly purified by simple washing and centrifugation steps, which eliminates the need for affinity tags.
  • the method according to the invention realizes the determination of folding conditions for recombinant proteins by partial proteolysis of proteins dissolved in chaotropic reagents; it is referred to below as FSAP (folding screening assayed by proteolysis).
  • FSAP folding screening assayed by proteolysis
  • the recombinant proteins are first dissolved in chaotropic reagents after expression in, for example, E. coli, and then at least 20 aliquots of this solution are mixed with various buffer solutions. The various solutions are then dialyzed and concentrated ten times, after which protease is added in a low concentration and incubated.
  • the proteins are protected to a different degree from proteolytic digestion: the more complete the folding, the higher the resistance to cleavage by the protease. The degree of intactness or cleavage of the proteins can then be demonstrated and is an indirect measure of their folding state.
  • a 7.5 M urea solution or a 6 M guanidine / HCl solution (20 mM Tris / HCl buffer; pH 8.0; 6 M guanidine / HCl; 5 mM ⁇ DTA; 4 raM DTT) can be used as the chaotropic reagent.
  • the different buffer solutions are varied with
  • stabilizing additives such as salts, sugars or chaotropic reagents such as arginine,
  • divalent cations such as Mg 2+ , Ca 2+ or Cu 2+ ,
  • protease is not limited according to the invention.
  • other proteases customary for partial proteolysis such as thermolysin, chymotrypsin, trypsin and SV8 protease, can also be used.
  • Protease and substrate are preferably used in a ratio of 1:50 to 1: 1000 with an incubation time of preferably 50 to 150 min.
  • a ratio of protease to substrate of 1: 100 and a 100 minute incubation have proven to be particularly favorable.
  • Proteolysis is carried out by adding, for example, PMSF or Pefabloc ® stopped.
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • a major advantage of the method lies in the fact that it provides a rapid screening method that distinguishes between misfolded and a folding state similar to the native protein, without the need to first establish a specific biological assay to check protein function.
  • the FSAP method is not dependent on a conformal uniformity of the solution and can also be applied to mixtures of native protein-like and misfolded proteins.
  • the small amount of protein required for the screening (approx. 10 ⁇ g for testing a buffer condition), which allows any number of refolding buffers to be tested, is particularly advantageous.
  • the method offers the possibility of easy automation.
  • both the screening methods for the state of folding and the proteolytic assay can be varied to a large extent.
  • the goal can easily be pursued, to use multi-titer plates for the renaturation of the protein in combination with serial dialysis units and to carry out an online detection of the products by capillary electrophoresis or mass spectroscopy.
  • the FSAP method could be of particular interest for projects in the field of structural genomics. For these, a systematic production of the proteins is an indispensable prerequisite, since only limited knowledge is available about the biological functions and biophysical properties of the individual proteins.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the point mutations for the four different cysteine deletion mutants were generated using the QuikChange mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla) according to the manufacturer's instructions.
  • the inclusion bodies containing the VEGF wild type protein were produced in BL21 (DE3) cells (Novagen), while the mutants could be produced in larger yields in B834 (DE3) cells in coexpression with GroES / GroEL in a pREP4 vector without the cell culture was specifically selected for this vector.
  • the released inclusion bodies were separated from cell lysate by centrifugation (60 min., 12000 ⁇ g, 4 ° C.) and roughly cleaned (resuspended three times in each case in the above digestion buffer and centrifuged again for 30 min).
  • the pellets thus purified were placed in 20 ml of denaturing buffer (20 mM Tris / HCl pH 8.0; 6M guanidinium HC1; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) and stirred for two hours at room temperature, then undissolved constituents were centrifuged off (30 min., 46,000 ⁇ g, 4 ° C.) and the supernatant was stored at ⁇ 20 ° C.
  • 7.5 M urea was used in the denaturation buffer instead of 6 M guanidinium HC1 to dissolve the pellet.
  • composition of the refolding screen and identification of suitable conditions using limited proteolysis Composition of the refolding screen and identification of suitable conditions using limited proteolysis
  • the dissolved inclusion bodies of each mutant were adjusted to a concentration of approximately Img / ml protein (determined by UV absorption at 280 nm) by dilution in the denaturation buffer. A 10 ⁇ l aliquot of this solution was diluted in 990 ⁇ l of each of the 24 screen solutions, shaken vigorously and incubated at 4 ° C. overnight.
  • the digestion batches were incubated for 100 min at room temperature, the termination was carried out by inactivating the protease by adding 10 ⁇ l of a 10 mM PMSF solution.
  • the samples were then vacuum dried, dissolved in standard SDS loading buffer and analyzed after SDS-PAGE and silver staining.
  • VEGF wild type and the soluble, misfolded mutant Cys26Ala / Cys68Ala as reference proteins The VEGF wild type was folded back according to a known protocol: the inclusion bodies were dissolved in 7.5 M urea and then diluted 1:10 in a solution of 20 mM Tris / HCl pH 8.4 and 7 ⁇ M CuCl 2 . This solution containing about 1 mg / ml protein was stirred overnight at room temperature and the protein was then further purified by means of ion exchange, hydrophobic interaction and size exclusion chromatography.
  • the refolding step was preceded by a first purification of the dissolved inclusion bodies by means of size exclusion chromatography under denaturing conditions (20 mM Tris / HCl pH 7.5; 6 M guanidinium HC1; 4 mM DTT) on a Sephacryl S200 column (Pharmacia, Uppsala), 20 ml the combined fractions (protein concentration approx.
  • the protein was concentrated on a Q-Sepharose column (Pharmacia) and eluted in a NaCl gradient of 0-1 M in 20 mM Tris / HCl pH 8.0. The appropriate fractions were combined and concentrated to a volume of 1 ml, which was then purified by size exclusion chromatography on a Superdex 75 column (Pharmacia).
  • 1 ⁇ l protein solution (12 mg / ml protein, 20 mM Tris / HCl, pH 8.0; 100 mM NaCl) was mixed with 1 ⁇ l reservoir solution and the vapor pressure equilibrium was adjusted against 700 ⁇ l of this solution.
  • Detection limit of the method Time-resolved digestion with an initial content of 100, 95 and 0% misfolded protein. The results show that it is possible to identify folding conditions, even if the refolding rate is only 5% of the starting protein.

Abstract

The invention relates to a method for determining folding conditions for recombinant proteins . The fields of application for the inventive method are medicine and the pharmaceutical industry.The aim of the invention is to develop a method which enables easy monitoring without any prior purification steps of which buffer conditions are most suitable for regeneration of the folding of proteins. The inventive method can also be carried out with little expenditure of material and can be used independently from the biochemical function of the proteins. The invention is characterized in that the recombinant proteins obtained after an expression are dissolved in chaotropic reagents and at least 20 aliquots of this solution are added to various buffer solutions. The solutions are subsequently dialysed and concentrated tenfold. Low-concentration protease is then added, incubated and finally the folding state of the proteins is established.

Description

Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante ProteineMethod for determining folding conditions for recombinant proteins
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine. Anwendungsgebiete dieses Verfahrens sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a method for determining folding conditions for recombinant proteins. Areas of application for this method are medicine and the pharmaceutical industry.
Die heterologe Produktion von Proteinen in dem prokaryotischen Wirt Escherichia coli ist eine sowohl in der Forschung als auch in der industriellen Produktion weit verbreitete Technik. In den meisten Fällen wird das Protein von den Ribosomen jedoch nicht in einer löslichen, nativen Konformation freigesetzt, sondern bildet hochmolekulare Aggregate und akkumuliert in sogenannten inclusion bodies. Daher gibt es einen Bedarf zur Entwicklung von Methoden, die es ermöglichen, diese Proteine in Lösung zu bringen und ihre biologisch aktive Faltung zu regenerieren1'2. Obwohl es schwierig ist, die jeweiligen Faltungsbedingungen herauszufinden, hat der Weg über inclusion bodies im Vergleich zur cytoplasmatischen oder periplasmatischen Akkumulation auch eine Reihe von Vorteilen. So kann das Protein in großer Menge produziert werden, indem das entsprechende Gen unter Kontrolle eines starken Promotors exprimiert wird. Unter diesen Bedingungen neigt das produzierte Protein außerdem weniger zu proteolytischer Degradation und seine potentielle Toxizität für die Wirtszelle ist erniedrigt. Zusätzlich kann das Protein schnell durch einfache Wasch- und Zentrifugationsschritte gereinigt werden, wodurch der Gebrauch von Affinitätsmarkierungen (affinit tags) überflüssig wird.The heterologous production of proteins in the prokaryotic host Escherichia coli is a technique widely used in both research and industrial production. In most cases, the protein is not released by the ribosomes in a soluble, native conformation, but instead forms high-molecular aggregates and accumulates in so-called inclusion bodies. Therefore, there is a need to develop methods that allow these proteins to be dissolved and their biologically active folding to be regenerated 1 ' 2 . Although it is difficult to find out the respective folding conditions, the path via inclusion bodies also has a number of advantages compared to cytoplasmic or periplasmatic accumulation. The protein can be produced in large quantities by expressing the corresponding gene under the control of a strong promoter. Under these conditions, the protein produced also tends to be less proteolytic degradation and its potential toxicity to the host cell is reduced. In addition, the protein can be quickly purified by simple washing and centrifugation steps, which eliminates the need for affinity tags.
Die geschilderten Vorteile werden allerdings nutzlos, wenn keine geeigneten Faltungsbedingungen gefunden werden können.However, the advantages described are useless if no suitable folding conditions can be found.
In den vergangenen Jahren wurden bei der Etablierung allgemeiner Bedingungen für die Proteinfaltung beachtliche Fortschritte gemacht . Dies führte in einigen Fällen zur Entwicklung von käuflich zu erwerbenden Kits, die dem Screening von Faltungsbedingungen dienen4'5. Die Anwendung dieser Kits wird allerdings dadurch beeinträchtigt, daß es beim Fehlen eines für das entsprechende Protein spezifischen enzymatischen oder biologischen Assays schwierig festzustellen ist, ob die Faltung erfolgreich war oder nicht. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, schnell und ohne vorhergehende Aufreinigungsschritte zu überprüfen, welche Pufferbedingungen für eine Regeneration der Faltung von Proteinen am geeignetsten sind. Das Verfahren soll weiterhin mit sehr geringem Materialaufwand realisierbar und unabhängig von der biochemischen Funktion des Proteins einsetzbar sein.Considerable progress has been made in the past few years in establishing general conditions for protein folding. In some cases, this led to the development of commercially available kits that serve to screen folding conditions 4 ' 5 . However, the use of these kits is impaired by the fact that in the absence of an enzymatic or biological assay specific for the corresponding protein, it is difficult to determine whether the folding was successful or not. The aim of the invention is to develop a method which makes it possible to check quickly and without previous purification steps which buffer conditions are most suitable for the regeneration of the folding of proteins. The method should continue to be realizable with very little material and independent of the biochemical function of the protein.
Das erfindungsgemäße Verfahren realisiert die Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine durch partielle Proteolyse von in chaotropen Reagenzien gelösten Proteinen, es wird im folgenden als FSAP (folding screening assayed by proteolysis) bezeichnet. Dazu werden die rekombinanten Proteine nach einer Expression in beispielsweise E. coli zunächst in chaotropen Reagenzien gelöst, anschließend werden mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt. Anschließend werden die verschiedenen Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriertDanach wird Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert. In Abhängigkeit von ihrem Faltungszustand sind die Proteine vor dem proteolytischen Verdau in unterschiedlichem Maße geschützt: Je vollständiger die Faltung, desto höher ist die Resistenz gegen eine Spaltung durch die Protease. Der Grad der Intaktheit bzw. der Spaltung der Proteine läßt sich anschließend nachweisen und ist ein indirektes Maß für deren Faltungszustand.The method according to the invention realizes the determination of folding conditions for recombinant proteins by partial proteolysis of proteins dissolved in chaotropic reagents; it is referred to below as FSAP (folding screening assayed by proteolysis). For this purpose, the recombinant proteins are first dissolved in chaotropic reagents after expression in, for example, E. coli, and then at least 20 aliquots of this solution are mixed with various buffer solutions. The various solutions are then dialyzed and concentrated ten times, after which protease is added in a low concentration and incubated. Depending on their folding state, the proteins are protected to a different degree from proteolytic digestion: the more complete the folding, the higher the resistance to cleavage by the protease. The degree of intactness or cleavage of the proteins can then be demonstrated and is an indirect measure of their folding state.
Als chaotropes Reagenz kann eine 7,5 M Harnstofflösung oder eine 6 M Guanidin/HCl- Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer; pH 8,0; 6 M Guanidin/HCl; 5 mM ΕDTA; 4 raM DTT) eingesetzt werden. Die verschiedenen Pufferlösungen werden variiert mitA 7.5 M urea solution or a 6 M guanidine / HCl solution (20 mM Tris / HCl buffer; pH 8.0; 6 M guanidine / HCl; 5 mM ΕDTA; 4 raM DTT) can be used as the chaotropic reagent. The different buffer solutions are varied with
- unterschiedlichen Stabilisierungszusätzen wie Salzen, Zuckern oder chaotropen Reagenzien wie Arginin,different stabilizing additives such as salts, sugars or chaotropic reagents such as arginine,
- unterschiedlichen zweiwertigen Kationen wie Mg2+, Ca 2+ oder Cu2+,different divalent cations such as Mg 2+ , Ca 2+ or Cu 2+ ,
- unterschiedlichen Redoxzusätzen wie GSSG, GSH und DTT und unterschiedlichen pH-Werten. Die Wahl der Protease ist gemäß der Erfindung nicht limitiert. Neben der in den Beispielen aufgeführten Verwendung von Subtilisin sind auch andere für partielle Proteolyse gebräuchliche Proteasen wie Thermolysin, Chymotrypsin, Trypsin und SV8-Protease anwendbar. Protease und Substrat werden bevorzugt in einem Verhältnis von 1:50 bis 1:1000 bei einer Inkubationszeit von bevorzugt 50 bis 150 min eingesetzt. Als besonders günstig haben sich ein Verhältnis Protease zu Substrat von 1:100 und eine lOOminütige Inkubation erwiesen. Die Proteolyse wird durch Zugabe von beispielsweise PMSF oder Pefabloc® gestoppt. Der Grad der Spaltung der Proteine wird schließlich durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) in Kombination mit einer Silberfärbung nachgewiesen. Alternativ sind andere Methoden zur Proteindetektion möglich wie z.B. Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie.- Different redox additives like GSSG, GSH and DTT and different pH values. The choice of protease is not limited according to the invention. In addition to the use of subtilisin listed in the examples, other proteases customary for partial proteolysis, such as thermolysin, chymotrypsin, trypsin and SV8 protease, can also be used. Protease and substrate are preferably used in a ratio of 1:50 to 1: 1000 with an incubation time of preferably 50 to 150 min. A ratio of protease to substrate of 1: 100 and a 100 minute incubation have proven to be particularly favorable. Proteolysis is carried out by adding, for example, PMSF or Pefabloc ® stopped. The degree of cleavage of the proteins is finally detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in combination with a silver stain. Alternatively, other methods for protein detection are possible, such as capillary electrophoresis or mass spectroscopy.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es zum ersten Mal gelungen, die partielle Proteolyse erfolgreich einzusetzen, um die Faltungsbedingungen für neue Proteine schnell abzuleiten.With the method according to the invention, partial proteolysis has been successfully used for the first time in order to quickly derive the folding conditions for new proteins.
Ein Hauptvorteil des Verfahrens liegt in der Tatsache, daß sie eine schnelle Screeningmethode bereit stellt, die zwischen falsch gefaltetem und einem dem nativen Protein ähnlichen Faltungszustand unterscheidet, ohne daß zuvor ein spezifischer biologischer Assay zur Überprüfung der Proteinfunktion etabliert werden muß. Im Gegensatz zu biophysikalischen Methoden, wie der dynamischen Lichtstreuung (dynamic light scattering) und Zirkulardichroismusmessungen (circular dichroism measurements), die herkömmlicherweise benutzt werden, um den Faltungszustand von Proteinen zu bestätigen, ist die FSAP-Methode nicht von einer konformellen Einheitlichkeit der Lösung abhängig und kann auch auf Gemische von dem nativen Protein ähnlichen und falsch gefaltetem Proteinen angewandt werden. Besonders vorteilhaft ist die geringe Menge an Protein, die für das Screening benötigt wird (ca. 10 μg zum Testen einer Pufferbedingung), die es erlaubt, beliebig viele Rückfaltungspuffer zu testen. Zusätzlich bietet die Methode die Möglichkeit einer leichten Automatisierbarkeit. Zu diesem Zweck können sowohl die Screeningmethoden zum Faltungszustand als auch der proteolytische Assay in großem Maß variiert werden. Beispielsweise kann leicht das Ziel verfolgt werden, Multititerplatten für die Renaturierung des Proteins in Kombination mit seriellen Dialyseeinheiten einzusetzen und eine online- Detektion der Produkte durch Kapillarelektrophorese oder Massenspektroskopie vorzunehmen. Durch dieses hohe Automatisierungspotential könnte die FSAP-Methode von besonderem Interesse für Projekte aus dem Bereich Structural Genomics sein. Für diese ist eine systematische Produktion der Proteine eine unabdingbare Voraussetzung, da über die biologischen Funktionen und biophysikalischen Eigenschaften der individuellen Proteine nur begrenzte Kenntnisse zur Verfügung stehen.A major advantage of the method lies in the fact that it provides a rapid screening method that distinguishes between misfolded and a folding state similar to the native protein, without the need to first establish a specific biological assay to check protein function. In contrast to biophysical methods such as dynamic light scattering and circular dichroism measurements, which are traditionally used to confirm the folding state of proteins, the FSAP method is not dependent on a conformal uniformity of the solution and can also be applied to mixtures of native protein-like and misfolded proteins. The small amount of protein required for the screening (approx. 10 μg for testing a buffer condition), which allows any number of refolding buffers to be tested, is particularly advantageous. In addition, the method offers the possibility of easy automation. For this purpose, both the screening methods for the state of folding and the proteolytic assay can be varied to a large extent. For example, the goal can easily be pursued, to use multi-titer plates for the renaturation of the protein in combination with serial dialysis units and to carry out an online detection of the products by capillary electrophoresis or mass spectroscopy. Due to this high automation potential, the FSAP method could be of particular interest for projects in the field of structural genomics. For these, a systematic production of the proteins is an indispensable prerequisite, since only limited knowledge is available about the biological functions and biophysical properties of the individual proteins.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. Hierfür wurden der angiogene Wachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) ausgewählt. VEGF ist ein homodimeres Protein und enthält als St krurmotiv einen durch Disulfϊdbrücken gekennzeichneten Cysteinknoten6. Da VEGF ein ausgedehnter hydrophober Kern fehlt, nimmt man an, daß der Cysteinknoten wesentlich für die Stabilität des Proteins verantwortlich ist. Daher sollte es besonders schwierig sein, Bedingungen für die Rückfaltung von Mutanten von VEGF zu finden, in denen dieser Knoten partiell oder vollständig zerstört ist.The invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments. The angiogenic growth factor VEGF (vascular endothelial growth factor) was selected for this. VEGF is a homodimeric protein and contains a cysteine knot 6 characterized by disulfide bridges as the motif of St. Because VEGF is an extensive hydrophobic If the nucleus is missing, it is assumed that the cysteine node is essentially responsible for the stability of the protein. Therefore, it should be particularly difficult to find conditions for the refolding of VEGF mutants in which this node is partially or completely destroyed.
Zur Rückfaltung wurden vier Cystein-Deletionsmutanten hergestellt, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im VEGF-Protein des Wildtyps eine Disulfidbrücke bilden, durch Alanin ausgetauscht wurden. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens war es möglich, die Faltungsbedingungen für drei dieser vier möglichen Cystein-Deletionsmutanten von VEGF zu bestimmen (s. Abb. 1). Die so bestimmten Protokolle für die Rückfaltung der Proteine weichen vom VEGF-Wildtypprotokoll ab und können ohne zusätzliche Anpassungen für die Proteinproduktion im Milligramm-Bereich verwendet werden.For refolding, four cysteine deletion mutants were produced, in each of which two cysteine residues, which form a disulfide bridge in the wild-type VEGF protein, were replaced by alanine. By using the method according to the invention it was possible to determine the folding conditions for three of these four possible cysteine deletion mutants of VEGF (see Fig. 1). The protocols determined in this way for the refolding of the proteins differ from the VEGF wild-type protocol and can be used for the protein production in the milligram range without additional adjustments.
Herkunft der verwendeten ProteineOrigin of the proteins used
Es wurde ein pET-3d Vektor, in den das für die Aminosäuren 14 bis 108 codierenden Gen von humanem VEGF insertiert war, von der Firma Jerini Biotools GmbH (Adlershof) zur Verfügung gestellt. Die Punktmutationen für die vier verschiedenen Cystein-Deletionsmutanten wurden unter Verwendung des QuikChange mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla) nach den Angaben des Herstellers generiert. Die das VEGF- Wildtypprotein enthaltenden inclusion bodies wurden in BL21(DE3) Zellen (Novagen) produziert, während die Mutanten in größeren Ausbeuten in B834(DE3) Zellen in Coexpression mit GroES/GroEL in einem pREP4-Vektor hergestellt werden konnten, ohne daß während der Zellzucht spezifisch auf diesen Vektor selektiert wurde. Für jedes Konstrukt wurden jeweils sechs Liter LB-Medium (lOOμg/ml Ampicillin enthaltend) mit der entsprechenden Übernachtkultur angeimpft und nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C bis zu einer OD60o von ca 0,6 durch Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Nach weiteren 4 Stunden bei 37°C wurden die Zellen abzentrifugiert (20 min., 5000 x g, 4°C) in 40 ml Tris-Puffer pH 7,5 mit 5 mM EDTA-Zusatz resuspendiert und mittels French Press aufgeschlossen (2 x 1000 bar). Die freigesetzten inclusion bodies wurden durch Zentrifugation (60 min., 12000 x g, 4°C) von Zelllysat abgetrennt und grob gereinigt (dreimal jeweils resuspendiert in obigen Aufschlusspuffer und erneut 30 min. abzentrifugiert). Für die weitere Aufarbeitung der Mutanten wurden die so gereinigten Pellets in 20 ml Denaturierungs-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8,0; 6M Guanidinium HC1; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) aufgelöst und für zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurden nicht gelöste Bestandteile abzentrifugiert (30 min., 46 000 x g, 4°C) und der Überstand bei -20°C gelagert. Für den Wildtyp wurde im Denaturierungspuffer statt 6 M Guanidinium HC1 7,5 M Harnstoff zum Auflösen des Pellets verwendet.A pET-3d vector, into which the gene of human VEGF coding for amino acids 14 to 108 was inserted, was provided by Jerini Biotools GmbH (Adlershof). The point mutations for the four different cysteine deletion mutants were generated using the QuikChange mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla) according to the manufacturer's instructions. The inclusion bodies containing the VEGF wild type protein were produced in BL21 (DE3) cells (Novagen), while the mutants could be produced in larger yields in B834 (DE3) cells in coexpression with GroES / GroEL in a pREP4 vector without the cell culture was specifically selected for this vector. For each construct, six liters of LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin) were inoculated with the corresponding overnight culture and induced after 3 hours of growth at 37 ° C. to an OD 60 o of approximately 0.6 by adding 1 mM IPTG. After a further 4 hours at 37 ° C., the cells were centrifuged off (20 min., 5000 × g, 4 ° C.) in 40 ml Tris buffer pH 7.5 with 5 mM EDTA addition and disrupted by French press (2 × 1000 bar). The released inclusion bodies were separated from cell lysate by centrifugation (60 min., 12000 × g, 4 ° C.) and roughly cleaned (resuspended three times in each case in the above digestion buffer and centrifuged again for 30 min). For the further processing of the mutants, the pellets thus purified were placed in 20 ml of denaturing buffer (20 mM Tris / HCl pH 8.0; 6M guanidinium HC1; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) and stirred for two hours at room temperature, then undissolved constituents were centrifuged off (30 min., 46,000 × g, 4 ° C.) and the supernatant was stored at −20 ° C. For the wild type, 7.5 M urea was used in the denaturation buffer instead of 6 M guanidinium HC1 to dissolve the pellet.
Zusammensetzung des Rückfaltungsscreens und Identifizierung geeigneter Bedingungen mittels limitierter ProteolyseComposition of the refolding screen and identification of suitable conditions using limited proteolysis
Für die Rückfaltungsversuche wurden 24 unterschiedliche Lösungen verwendet, von den 16 von einem Screen abgeleitet waren, der ursprünglich 1997 von Chen und Gouaux4 vorgeschlagen wurde (s. Tabelle). Diese 16 Lösungen wurden durch acht Variationen der für den VEGF- Wildtyp erfolgreichen Bedingung ergänzt.24 different solutions were used for the refolding experiments, 16 of which were derived from a screen originally proposed by Chen and Gouaux 4 in 1997 (see table). These 16 solutions were supplemented by eight variations of the condition that was successful for the VEGF wild type.
Die aufgelösten inclusion bodies jeder Mutante wurden durch Verdünnen im Denaturierungspuffer auf eine Konzentration von ca. Img/ml Protein (bestimmt über UV- Absorption bei 280 nm) eingestellt. Von dieser Lösung wurde jeweils ein 10 μl-Aliquot in 990 μl jeder der 24 Screen-Lösungen verdünnt, heftig geschüttelt und bei 4°C über Nacht inkubiert.The dissolved inclusion bodies of each mutant were adjusted to a concentration of approximately Img / ml protein (determined by UV absorption at 280 nm) by dilution in the denaturation buffer. A 10 μl aliquot of this solution was diluted in 990 μl of each of the 24 screen solutions, shaken vigorously and incubated at 4 ° C. overnight.
Am nächsten Tag wurden alle 24 Rückfaltungsansätze der einzelnen Mutanten 6 Stunden gegen 100 ml Proteolyse-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0) dialysiert und jede Probe auf ein Volumen von 100 μl konzentriert (Millipore Ultrafree Centrifugal Devices, MWCO 3,5 kDa, Millipore, Bedford). Zu den konzentrierten Ansätzen wurden jeweils 0,1 μg Subtilisin zugefügt (2 μl einer 0,05 mg/ml Lösung, Boehringer Mannheim, Mannheim), was einem Verhältnis von Protease zu Protein von 1 : 100 entspricht. Die Verdauansätze wurden 100 min bei Raumtemperatur inkubiert, der Abbruch erfolgte durch Inaktivierung der Protease mittels Zusatz von lOμl einer 10 mM PMSF-Lösung. Anschließend wurden die Proben vakuumgetrocknet, in Standard SDS-Ladepuffer gelöst und nach SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.The next day, all 24 refolding batches of the individual mutants were dialyzed against 100 ml of proteolysis buffer (20 mM Tris / HCl pH 8.0) for 6 hours and each sample was concentrated to a volume of 100 μl (Millipore Ultrafree Centrifugal Devices, MWCO 3.5 kDa, Millipore, Bedford). 0.1 μg of subtilisin were added to each of the concentrated batches (2 μl of a 0.05 mg / ml solution, Boehringer Mannheim, Mannheim), which corresponds to a ratio of protease to protein of 1: 100. The digestion batches were incubated for 100 min at room temperature, the termination was carried out by inactivating the protease by adding 10 μl of a 10 mM PMSF solution. The samples were then vacuum dried, dissolved in standard SDS loading buffer and analyzed after SDS-PAGE and silver staining.
VEGF-Wildtyp und die lösliche, mißgefaltete Mutante Cys26Ala/Cys68Ala als Referenz- Proteine Der VEGF- Wildtyp wurde nach einem bekannten Protokoll zurückgefaltet: Die inclusion bodies wurden in 7,5 M Harnstoff aufgelöst und dann 1 : 10 in einer Lösung von 20 mM Tris/HCl pH 8,4 und 7 μM CuCl2 verdünnt. Diese ca 1 mg/ml Protein enthaltende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Protein anschließend mittels Ionenaustauscher-, hydrophober Interaktions- und Größenausschlußchromatographie weiter gereinigt. Bei dem Versuch, dasselbe Protokoll auf die Mutante Cys26Ala/Cys68Ala anzuwenden, wurde bei dem Rückfaltungsschritt ein lösliches Produkt erhalten, das sich nicht weiter aufreinigen ließ: Während der Ionenaustauscherchromatographie wurde die Mutante bei ungewöhnlich hohen Salzkonzentrationen eluiert und erschien verteilt über einen großen Bereich des Gradienten. Versuche, dieses Produkt über eine hydrophobe Wechselwirkung weiter zu reinigen, scheiterten völlig. In den weiteren Versuchen wurde dieses Produkt als Referenz für ungefaltetes lösliches Protein verwendet.VEGF wild type and the soluble, misfolded mutant Cys26Ala / Cys68Ala as reference proteins The VEGF wild type was folded back according to a known protocol: the inclusion bodies were dissolved in 7.5 M urea and then diluted 1:10 in a solution of 20 mM Tris / HCl pH 8.4 and 7 μM CuCl 2 . This solution containing about 1 mg / ml protein was stirred overnight at room temperature and the protein was then further purified by means of ion exchange, hydrophobic interaction and size exclusion chromatography. Attempting to apply the same protocol to the mutant Cys26Ala / Cys68Ala resulted in a soluble product in the refolding step that could not be further purified: during ion exchange chromatography, the mutant was eluted at unusually high salt concentrations and appeared distributed over a wide range of the gradient , Attempts to further purify this product via a hydrophobic interaction failed completely. In the further experiments, this product was used as a reference for unfolded soluble protein.
Nach weisgrenze der MethodeAccording to the limit of the method
Um die Sensitivität dieser Methode zu überprüfen, wurden verschiedene Testmischungen aus gefaltetem Wildtypprotein und Protein der oben beschriebenen ungefalteten Mutante hergestellt, die einem Anteil von 0, 5 oder 100% an gefaltetem Protein an der Mischung entsprachen. In allen drei Fällen wurden 100 μg Gesamtprotein in einem Volumen von 100 μl 20 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,0 dem proteolytischen Verdau durch 1,0 μg Subtilisin ausgesetzt, wobei zu unterschiedlichen Zeiten 10 μl Aliquots entnommen wurden und nach kurzem Aufkochen mittels SDS-PAGE analysiert wurden.In order to check the sensitivity of this method, various test mixtures were made from folded wild-type protein and protein of the unfolded mutant described above, which corresponded to a proportion of 0, 5 or 100% of folded protein in the mixture. In all three cases, 100 μg of total protein in a volume of 100 μl of 20 mM Tris / HCl buffer pH 8.0 was exposed to proteolytic digestion by 1.0 μg of subtilisin, 10 μl of aliquots being removed at different times and after a brief boil using SDS-PAGE were analyzed.
Rückfaltungseffizienz in Abhängigkeit von der ProteinkonzentrationRefolding efficiency depending on the protein concentration
Es wurde für drei unterschiedliche Proteinkonzentrationen die Effizienz der Rückfaltung der Mutante Cysόl Ala/Cysl04Ala bei Verdünnen von lOμl gelösten inclusion bodies in Rückfaltungspuffer Nr. 10 (s. Tabelle) untersucht. Als Konzentrationen wurden 0,01, sowie 0,1 und 1,0 mg/ml gewählt, wobei in den ersten beiden Fällen die Konzentration an Guanidinium HC1 im Rückfaltungsansatz 0,06 M, im letzten Fall jedoch aus praktischen Gründen 0,6 M war. Nach der Rückfaltung wurden jeweils gleiche Mengen an Protein (10 μg) entnommen, der Puffer ausgetauscht und die Probevolumina auf 100 μl aufkonzentriert, bevor die Proben dem proteolytischen Verdau mit Subtilisin ausgesetzt und anschließend mittels SDS-PAGE analysiert wurden.For three different protein concentrations, the efficiency of the refolding of the mutant Cysόl Ala / Cysl04Ala when diluting lOμl dissolved inclusion bodies in refolding buffer No. 10 (see table) was examined. The concentrations selected were 0.01, 0.1 and 1.0 mg / ml, the concentration of guanidinium HC1 in the refolding batch being 0.06 M in the first two cases, but 0.6 M in the latter case for practical reasons , After refolding, equal amounts of protein (10 μg) were taken out, the buffer was exchanged and the sample volumes were concentrated to 100 μl before the samples were subjected to proteolytic digestion with subtilisin and then analyzed by SDS-PAGE.
Proteinproduktion und Reinigung im Milligramm-MaßstabProtein production and purification on a milligram scale
Dem Rückfaltungsschritt vorgeschaltet wurde eine erste Reinigung der aufgelösten inclusion bodies mittels Größenausschlusschromatographie unter denaturierenden Bedingungen (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 6 M Guanidinium HC1; 4 mM DTT) über eine Sephacryl S200-Säule (Pharmacia, Uppsala), 20 ml der vereinigten Fraktionen (Proteinkonzentration ca. 1 mg/ml) wurden in 2 1 Rückfaltungspuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,2; 10,5 mM NaCl; 0,44 mM KC1, 1 mM EDTA; 0,3 mM Lauryl-Maltosid, 440 mM Sucrose, 1 mM GSH; 0,1 mM GSSG) verdünnt und über Nacht bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Lösung zweimal für 6 Stunden gegen 35 1 eines 20 mM Tris/HCl Puffers pH 8,0 dialysiert und durch einen 0,2 μm- Filter filtriert. Das Protein wurde auf einer Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) aufkonzentriert und in einem NaCl-Gradienten von 0 - 1 M in 20 mM Tris/HCl pH 8,0 eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und auf ein Volumen von 1 ml auf konzentriert welches abschließend durch Größenauschlußchromatographie über eine Superdex 75 Säule (Pharmacia) gereinigt wurde.The refolding step was preceded by a first purification of the dissolved inclusion bodies by means of size exclusion chromatography under denaturing conditions (20 mM Tris / HCl pH 7.5; 6 M guanidinium HC1; 4 mM DTT) on a Sephacryl S200 column (Pharmacia, Uppsala), 20 ml the combined fractions (protein concentration approx. 1 mg / ml) were dissolved in 2 l refolding buffer (50 mM Tris / HCl pH 8.2; 10.5 mM NaCl; 0.44 mM KC1, 1 mM EDTA; 0.3 mM lauryl) Maltoside, 440 mM sucrose, 1 mM GSH; 0.1 mM GSSG) diluted and stirred overnight at 4 ° C. The solution was then dialyzed twice for 6 hours against 35 l of a 20 mM Tris / HCl buffer pH 8.0 and filtered through a 0.2 μm filter. The protein was concentrated on a Q-Sepharose column (Pharmacia) and eluted in a NaCl gradient of 0-1 M in 20 mM Tris / HCl pH 8.0. The appropriate fractions were combined and concentrated to a volume of 1 ml, which was then purified by size exclusion chromatography on a Superdex 75 column (Pharmacia).
Kristallisationcrystallization
Kristalle der drei Mutanten, für die eine Rückfaltungsbedingung gefunden werden konnte, wuchsen bei 20° C am hängenden Tropfen. 1 μl Proteinlösung (12mg/ml Protein, 20 mM Tris/HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl) wurde mit 1 μl Reservoir-Lösung gemischt und das Dampfdruckgleichgewicht gegen 700 μl dieser Lösung eingestellt. Im Falle der Mutanten Cys51Ala/Cys60Ala und Cys61Ala/Cysl04Ala bestand die Reservoir-Lösung aus 28 % PEG 4000 (m v), 12 % Isopropanol (v/v) 100 mM Na-Citrat pH 5,6 und im Falle der Mutante Cys57Ala/Cysl02Ala aus 2,0 M Na-Format und 0,1 M Na-Acetat pH 4,6. Literatur:Crystals of the three mutants, for which a refolding condition could be found, grew at 20 ° C on the hanging drop. 1 μl protein solution (12 mg / ml protein, 20 mM Tris / HCl, pH 8.0; 100 mM NaCl) was mixed with 1 μl reservoir solution and the vapor pressure equilibrium was adjusted against 700 μl of this solution. In the case of the mutants Cys51Ala / Cys60Ala and Cys61Ala / Cysl04Ala, the reservoir solution consisted of 28% PEG 4000 (mv), 12% isopropanol (v / v) 100 mM Na citrate pH 5.6 and in the case of the mutant Cys57Ala / Cysl02Ala from 2.0 M Na format and 0.1 M Na acetate pH 4.6. Literature:
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6. Muller Y A et al. (1997) Structure 5: 1325-1338. 6. Muller YA et al. (1997) Structure 5: 1325-1338.
Legendenlegends
Abbildung 1:Illustration 1:
Skizze des VEGF-Dimeren, mit hervorgehobenem Cystein-Knoten. Die zwei Monomere, die das über Disulfidbrücken verknüpfte Homodimer bilden, sind in hell- und dunkelgrau dargestellt. Die mutierten Cysteine sind markiert. (Darstellung mit Hilfe der Programme MOLSCRIPT und RASTER3D)Sketch of the VEGF dimer with the cysteine node highlighted. The two monomers that form the homodimer linked via disulfide bridges are shown in light and dark gray. The mutated cysteines are marked. (Representation with the help of the programs MOLSCRIPT and RASTER3D)
Abbildung 2:Figure 2:
Faltungsbedingungen nach Tabelle 1 wurden mittels limitierter Proteolyse durchmustert und auf SDS-Gelen analysiert. Für die Mutante Cys51Ala-Cys60Ala können auf diese Weise mehrere positive Bedingungen identifiziert werden, während für die Mutanten CysόlAla- Cysl04Ala und Cys57Ala-Cysl02Ala nur die Bedingungen Nr. 8 und Nr. 10 erfolgreich waren.Folding conditions according to Table 1 were screened using limited proteolysis and analyzed on SDS gels. In this way, several positive conditions can be identified for the mutant Cys51Ala-Cys60Ala, whereas only conditions No. 8 and No. 10 were successful for the mutants CysόlAla-Cysl04Ala and Cys57Ala-Cysl02Ala.
Abbildung 3:Figure 3:
Nachweisgrenze der Methode: Zeitaufgelöster Verdau mit einem Anfangsgehalt von 100, 95 und 0% mißgefaltetem Protein. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, Faltungsbedingungen zu identifizieren, selbst wenn die Rückfaltungsquote bei nur 5% des Ausgangsproteins liegt.Detection limit of the method: Time-resolved digestion with an initial content of 100, 95 and 0% misfolded protein. The results show that it is possible to identify folding conditions, even if the refolding rate is only 5% of the starting protein.
Abbildung 4:Figure 4:
Einfluß der Proteinkonzentration auf den Ertrag der Rückfaltung: Gleiche Mengen an Protein, die bei unterschiedlichen Konzentration in derselben Rückfaltungslösung renaturiert wurden, wurden nach limitierter Proteolyse mittels SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß mit steigender Konzentration des Proteins die Rückfaltungseffizienz abnimmt. Abbildung 5:Influence of protein concentration on the yield of refolding: Equal amounts of protein that were renatured at different concentrations in the same refolding solution were analyzed after limited proteolysis using SDS-PAGE. The results show that the refolding efficiency decreases with increasing protein concentration. Figure 5:
Größenausschlußchromatographie der Mutante Cys61Ala-Cysl04Ala, rechts oben ein Einkristall derselben Mutante. Size exclusion chromatography of the mutant Cys61Ala-Cysl04Ala, top right a single crystal of the same mutant.
Tabelle zur Zusammensetzung der Rückfaltungspuffer:Refolding buffer composition table:
Puffer Salz Kation/ PEG Deter- Chao- ■ Polare / unpolare Redox- kein Kation gens trop Additive komponentenBuffer salt cation / PEG Deter- Chao- ■ Polar / non-polar redox- no cation against tropic additive components
1 Tris 8.2 hoch EDTA + DTT1 Tris 8.2 high EDTA + DTT
2 Mes 6.5 niedr MgCl2 / CaCl2 - LM + - GSSG/GSH 0.12 Mes 6.5 low MgCl 2 / CaCl 2 - LM + - GSSG / GSH 0.1
3 Mes 6.5 niedr EDTA + - + Sucrose/ Arginin GSSG/GSH 0.13 Mes 6.5 low EDTA + - + sucrose / arginine GSSG / GSH 0.1
4 Tris 8.2 hoch MgCl2 / CaCl2 - LM - Sucrose/ Arginin DTT4 Tris 8.2 high MgCl 2 / CaCl 2 - LM - sucrose / arginine DTT
5 Mes 6.5 hoch MgCl2 / CaCl2 - - - Sucrose GSSG/GSH 0.15 Mes 6.5 high MgCl 2 / CaCl 2 - - - sucrose GSSG / GSH 0.1
6 Tris 8.2 niedr EDTA + LM + Sucrose DTT6 Tris 8.2 low EDTA + LM + sucrose DTT
7 Tris 8.2 niedr MgCl2 / CaCl2 - - + Arginin DTT7 Tris 8.2 low MgCl 2 / CaCl 2 - - + arginine DTT
8 Mes 6.5 hoch EDTA + LM - Arginin GSSG/GSH 0.18 Mes 6.5 high EDTA + LM - Arginine GSSG / GSH 0.1
9 Mes 6.5 hoch MgCl2 / CaCl2 + - + Sucrose DTT9 Mes 6.5 high MgCl 2 / CaCl 2 + - + sucrose DTT
10 Tris 8.2 niedr EDTA - LM - Sucrose GSSG/GSH 0.110 Tris 8.2 low EDTA - LM - sucrose GSSG / GSH 0.1
11 Tris 8.2 niedr MgCl2 / CaCl2 + • - - Arginin GSSG/GSH 0.111 Tris 8.2 low MgCl 2 / CaCl 2 + • - - arginine GSSG / GSH 0.1
12 Mes 6.5 hoch EDTA - LM + Arginin DTT12 Mes 6.5 high EDTA - LM + arginine DTT
13 Tris 8.2 hoch EDTA - - + - GSSG/GSH 0.113 Tris 8.2 high EDTA - - + - GSSG / GSH 0.1
14 Mes 6.5 niedr MgCl2 / CaCl2 + LM - - DTT14 Mes 6.5 low MgCl 2 / CaCl 2 + LM - - DTT
15 Mes 6.5 niedr EDTA - - - Sucrose/ Arginin DTT15 Mes 6.5 low EDTA - - - sucrose / arginine DTT
16 Tris 8.2 hoch MgCl2 / CaCl2 + LM + Sucrose/ Arginin GSSG/GSH 0.116 Tris 8.2 high MgCl 2 / CaCl 2 + LM + sucrose / arginine GSSG / GSH 0.1
17 Tris 8.4 - CuCl2 717 Tris 8.4 - CuCl 2 7
18 Tris 8.4 - CuCl2 7 - - + - -18 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - - + - -
19 Tris 8.4 - CuCl2 20 - - + - -19 Tris 8.4 - CuCl 2 20 - - + - -
20 Tris 8.4 - CuCl2 7 - CHAPS - -20 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - CHAPS - -
21 Tris 8.4 - CuCl2 7 - - - - GSSG/GSH 121 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - - - - GSSG / GSH 1
22 Tris 8.4 - CuCl2 7 - - - Arginin -22 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - - - arginine -
23 Tris 8.4 - CuCl2 7 - + - Sucrose -23 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - + - sucrose -
24 Tris 8.4 - CuCl2 7 - CHAPS Arginin GSSG/GSH 124 Tris 8.4 - CuCl 2 7 - CHAPS arginine GSSG / GSH 1
Bedingungen 1 bis 16 nach Chen & Gouaux^. Zusammensetzung der Reagenzien: Tris 8.2: 55 mM Tris/HCl, pH 8.2; Mes 6.5: 55 mM Mes, pH 6.5; Tris 8.4: 20 mM Tris/HCl, pH 8.4; Salz hoch: 264 mM NaCl, 11 mM KC1; Salz niedr: 10.56 mM NaCl, 0.44 mM KC1; EDTA: 1.1 mM EDTA; MgCl2 / CaCl2: 2.2 mM MgCl2, 2.2 mM CaCl2; CuCl2 7: 7 μM CuCl2; CuCl2 20: 20 μM CuCl2; PEG: 0.055 % PEG 4000 (m/v), enthalten (+) oder nicht enthalten (-); Detergens: 0.3 mM ß-Laurylmaltosid (LM), 10 mM CHAPS (CHAPS), kein Detergens (-); Chaotrop: 0.55 M Guanidin/HCl, enthalten (+) oder nicht enthalten (-); Sucrose: 0.44 M; Arginin: 0.55 M; DTT: 1 mM; GSSG/GSH 0.1: 0.1 mM GSSG, 1 mM GSH; GSSG/GSH 1: 1 mM GSSG, 1 mM GSH. Conditions 1 to 16 according to Chen & Gouaux ^. Reagent composition: Tris 8.2: 55 mM Tris / HCl, pH 8.2; Mes 6.5: 55 mM Mes, pH 6.5; Tris 8.4: 20 mM Tris / HCl, pH 8.4; High salt: 264 mM NaCl, 11 mM KC1; Low salt: 10.56 mM NaCl, 0.44 mM KC1; EDTA: 1.1 mM EDTA; MgCl 2 / CaCl 2 : 2.2 mM MgCl 2 , 2.2 mM CaCl 2 ; CuCl 2 7: 7 µM CuCl 2 ; CuCl 2 20: 20 µM CuCl 2 ; PEG: 0.055% PEG 4000 (m / v), contain (+) or not contain (-); Detergent: 0.3 mM β-lauryl maltoside (LM), 10 mM CHAPS (CHAPS), no detergent (-); Chaotropic: 0.55 M guanidine / HCl, contain (+) or not contain (-); Sucrose: 0.44 M; Arginine: 0.55 M; DTT: 1mM; GSSG / GSH 0.1: 0.1 mM GSSG, 1 mM GSH; GSSG / GSH 1: 1mM GSSG, 1mM GSH.

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Verfahren zur Ermittlung von Faltungsbedingungen für rekombinante Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß1. A method for determining folding conditions for recombinant proteins, characterized in that
- nach einer Expression erhaltene rekombinante Proteine in chaotropen Reagenzien gelöst werden,recombinant proteins obtained after expression are dissolved in chaotropic reagents,
- mindestens 20 Aliquote dieser Lösung mit verschiedenen Pufferlösungen versetzt werden,different buffer solutions are added to at least 20 aliquots of this solution,
- danach die Lösungen dialysiert und auf das Zehnfache konzentriert werden,- the solutions are then dialyzed and concentrated tenfold,
- anschließend Protease in geringer Konzentration zugesetzt und inkubiert wird,- Protease is then added in a low concentration and incubated,
- abschließend der Faltungszustand der Proteine festgestellt wird.- Finally, the state of folding of the proteins is determined.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 7,5 M Harnstofflösung (20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 7,5 M Harnstoff; 4 mM DTT) eingesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a 7.5 M urea solution (20 mM Tris / HCl, pH 7.5; 7.5 M urea; 4 mM DTT) is used as the chaotropic reagent.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Reagenz eine 6 M Guanidin/HCl-Lösung (20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0; 6 M Guanidin HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) eingesetzt wird.3. The method according to claim 1, characterized in that a 6 M guanidine / HCl solution (20 mM Tris / HCl buffer, pH 8.0; 6 M guanidine HCl; 5 mM EDTA; 4 mM DTT) is used as the chaotropic reagent becomes.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösungen die Lösungen 1 bis 24 gemäß der Tabelle zur Zusammensetzung der Rückfaltungspuffer bzw. weitere Kombinationen mit den aufgeführten Parametern eingesetzt werden.4. The method according to claim 1, characterized in that solutions 1 to 24 are used as buffer solutions according to the table for the composition of the refolding buffer or other combinations with the parameters listed.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Subtilisin zugesetzt wird. 5. The method according to claim 1, characterized in that subtilisin is added as a protease.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Thermolysin zugesetzt wird.6. The method according to claim 1, characterized in that thermolysin is added as the protease.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Chymotrypsin zugesetzt wird.7. The method according to claim 1, characterized in that chymotrypsin is added as a protease.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Trypsin zugesetzt wird.8. The method according to claim 1, characterized in that trypsin is added as a protease.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease SV8-Protease zugesetzt wird.9. The method according to claim 1, characterized in that SV8 protease is added as protease.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem Verhältnis von 1:50 bis 1:1000 eingesetzt wird.10. The method according to claim 1, characterized in that protease and substrate are used in a ratio of 1:50 to 1: 1000.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protease und Substrat in einem Verhältnis von 1 : 100 eingesetzt wird.11. The method according to claim 1, characterized in that protease and substrate are used in a ratio of 1: 100.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease 50 bis 150 min durchgeführt wird.12. The method according to claim 1, characterized in that the incubation with the protease is carried out for 50 to 150 min.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit der Protease 100 min durchgeführt wird.13. The method according to claim 1, characterized in that the incubation with the protease is carried out for 100 min.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe von PMSF gestoppt wird.14. The method according to claim 1, characterized in that the proteolysis is stopped by adding PMSF.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse durch Zugabe von Pefabloc® gestoppt wird.15. The method according to claim 1, characterized in that the proteolysis is stopped by adding Pefabloc ® .
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch SDS-PAGE-Gele festgestellt wird. 16. The method according to claim 1, characterized in that the state of folding is determined by SDS-PAGE gels.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-PAGE-Gele durch eine Silberfärbung angefärbt werden.17. The method according to claim 16, characterized in that the SDS-PAGE gels are stained by silver staining.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch Kapillarelektrophorese festgestellt wird.18. The method according to claim 1, characterized in that the state of folding is determined by capillary electrophoresis.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Faltungszustand durch Massenspektroskopie festgestellt wird.19. The method according to claim 1, characterized in that the state of folding is determined by mass spectroscopy.
20. Testkit bestehend aus20. Test kit consisting of
- 20- 100 Pufferlösungen- 20-100 buffer solutions
- einer entsprechenden Anzahl von Reaktionsgefäßen- a corresponding number of reaction vessels
- einer entsprechenden Anzahl von Dialyseeinheiten- a corresponding number of dialysis units
- ausgewählten Proteasen- selected proteases
- SDS-PAGE - Gele- SDS-PAGE - gels
- Laufpuffer für die Gelelektrophorese.- Running buffer for gel electrophoresis.
21. Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten Verfahrens umfassend21. Device for carrying out an automated method comprising
- Pipettierroboter- pipetting robot
- Multititerplatten- multititer plates
- seriellen Dialyseeinheiten- serial dialysis units
- Chips für die Kapillarelektrophorese. - Chips for capillary electrophoresis.
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