WO2002020741A1 - Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides - Google Patents

Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides Download PDF

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WO2002020741A1
WO2002020741A1 PCT/FR2000/002479 FR0002479W WO0220741A1 WO 2002020741 A1 WO2002020741 A1 WO 2002020741A1 FR 0002479 W FR0002479 W FR 0002479W WO 0220741 A1 WO0220741 A1 WO 0220741A1
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hppd
chimeric gene
plants
fusion protein
coding
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PCT/FR2000/002479
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Jean-Marc Ferullo
Eric Paget
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Bayer Cropscience Sa
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    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid sequence coding for a hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) fused to a signal peptide, a chimeric gene containing this sequence as coding sequence and its use for obtaining plants resistant to certain herbicides.
  • HPPD hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase
  • Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenases are enzymes that catalyze the reaction to convert para-hydroxy-phenyl-pyruvate (HPP) to homogentisate. This reaction takes place in the presence of iron (Fe 2+ ) in the presence of oxygen (Crouch NP & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).
  • Such herbicides targeting HPPD described in the prior art are in particular isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276 ) in particular isoxaflutole, a selective corn herbicide, diketonitriles (EP 496 630, EP 496 631), in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S ⁇ 2 CH3-4-CF3 phenyl) propane- 1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S ⁇ 2 CH3-4-2,3 CI2 phenyl) propane-1,3-dione, triketones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), in particular sulcotrione or mesotrione, or also pyrazolinates.
  • isoxazoles EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482,
  • HPPDs are enzymes with cytoplasmic localization (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325: 761-769 ..), it has also been shown that better tolerance was obtained when exogenous HPPD was accumulated in plastids, more particularly chloroplasts.
  • the present invention therefore relates to a fusion protein constituted by an HPPD fused at its C-terminal or N-terminal end to a signal protein sequence allowing the addressing of HPPD in cellular compartments other than the cytoplasm or the plastids (in especially chloroplasts).
  • HPPD is meant according to the invention any native HPPD enzyme, mutated or chimeric, exhibiting HPPD activity.
  • Many HPPDs are described in the literature, in particular the HPPDs of bacteria such as Pseudomonas (R ⁇ etschi & al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), of plants such as Arabidopsis ( WO 96/38567, Genebank AF047834) or carrot (WO 96/38567, Genebank 87257), Coccicoides (Genebank COITRP), or mammals such as mice or pigs.
  • Pseudomonas Roseudomonas
  • Arabidopsis WO 96/38567, Genebank AF047834
  • carrot WO 96/38567, Genebank 87257
  • Coccicoides Genebank COITRP
  • mutated HPPD is understood to mean, according to the invention, mutated HPPDs in order to obtain improved properties of tolerance to herbicides inhibiting HPPD compared to the corresponding native HPPD.
  • the mutated HPPD is a mutated HPPD in its C-terminal part as described in patent application WO 99/24585.
  • chimeric HPPD is meant a HPPD comprising elements originating from different HPPDs, in particular the chimeric HPPDs described in patent application WO 99/24586.
  • the HPPD is an HPPD from Pseudomonas fluorescens (WO
  • the mutated HPPD comprises the mutation W336 as described in patent application WO 99/24585.
  • signal protein sequence is meant according to the invention any signal or transit peptide allowing the addressing of HPPD in cellular compartments other than the cytoplasm or the plasts (in particular chloroplasts).
  • the signal protein sequence allows the addressing of the HPPD towards the vacuolar compartment (vacuole).
  • Such peptides are widely described in the literature (Neuhaus J.M. and Rogers J.C Sorting of proteins to vacuoles in plant cells Plant molecular Biology 38: 127-144, 1998).
  • the fusion protein is described by the sequence identifier No. 3 or 4 (SEQ ID NO 3 or 4) with its coding sequence.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence coding for the fusion protein according to the invention.
  • the present invention also relates to the sequences capable of selectively hybridizing with the above nucleic acid sequence, the sequences homologous to the above sequence, the fragments of said sequences, and the sequences which differ from the sequences herein. above but which due to the degeneracy of the genetic code, code for the same fusion protein.
  • nucleic acid sequence means a nucleotide or polynucleotide sequence, which may be of DNA or RNA type, preferably of DNA type, in particular double strand.
  • sequence capable of hybridizing selectively is meant according to the invention the sequences which hybridize with the above sequences at a level above the background noise significantly.
  • the background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other cDNAs present in a cDNA library.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of hybridizing selectively and the sequences defined by the above sequence ID according to the invention is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of l interaction of other DNA sequences generating background noise.
  • the level of interaction can be measured, for example, by labeling the probe with radioactive elements, such as 32 P.
  • Hybridization is generally obtained by using very harsh environmental conditions (for example 0.03 M NaCl and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C-60 ° C). Hybridization can of course be carried out according to the usual methods of the prior art (in particular Sambrook & al, 1989, Molecular Cloning: A Labratory Manual).
  • homologous a nucleic acid fragment having one or more sequence modifications with respect to the nucleotide sequence coding for the fusion protein according to the invention. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques, or alternatively by choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. In view of the multiple combinations of nucleic acids which can lead to the expression of the same amino acid, the differences between the reference sequence according to the invention and the corresponding homolog can be significant.
  • the degree of homology will be at least 70% relative to the reference sequence, preferably at least 80%, more preferably at least 90%.
  • These modifications are generally and preferably neutral, i.e. they do not affect the primary sequence of the fusion protein. This definition also applies to the protein sequence of the fusion protein, the mutations in this case being at the amino acid level and the degrees of homology being defined with respect to the primary sequence of the fusion protein.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • the methods for measuring and identifying homologies between polypeptides or proteins are also known to those skilled in the art.
  • fragments is meant according to the invention fragments of the DNA sequences according to the invention, that is to say the above sequences for which parts have been deleted but which retain the function of said sequences, c 'ie the addressing function for the small signal and the HPPD activity for the protein HPPD.
  • nucleic acid sequence coding for the fusion protein according to the invention in a process for the transformation of plants, as a marker gene or as a coding sequence making it possible to confer on the plant. tolerance to herbicides that inhibit HPPD.
  • This sequence can of course also be used in combination with other marker gene (s) and / or coding sequence (s) for one or more agronomic properties.
  • the present invention also relates to a chimeric gene (or expression cassette) comprising a coding sequence as well as heterologous 5 ′ and 3 ′ regulatory elements capable of functioning in a host organism, in particular plant cells or plants, the coding sequence comprising at least one nucleic acid sequence coding for a fusion protein as defined above.
  • host organism any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of mutated HPPD.
  • bacteria for example E. coli, yeasts, in particular of the genera Saccharomyces or Kluyveromyces, Pichia, fungi, in particular Aspergillus, of a baculovirus, or preferably plant cells and plants.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco, cotton, etc.
  • the regulatory elements necessary for the expression of the nucleic acid sequence coding for a fusion protein according to the invention are well known to those skilled in the art depending on the host organism. They include in particular promoter sequences, transcription activators, terminator sequences, including start and stop codons. The means and methods for identifying and selecting the regulatory elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the invention relates more particularly to the transformation of plants.
  • Promoters As promoter regulatory sequence in plants, use may be made of any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter expressing in particular in the leaves of plants, such as promoters known as constitutive of bacterial, viral or plant origin or so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit of a plant or any suitable known promoter which can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • the promoters of a plant virus gene there may be mentioned that of the cauliflower mosaic (CAMN 19S or 35 S), or the circovirus promoter (AU 689 311).
  • the promoter is chosen from light-dependent promoters (WO 99/25842), the rice actin promoter, the histone promoters and the promoters constituted by the fusion of a histone promoter and the first intron of rice actin (WO 99/34005).
  • WO 99/25842 light-dependent promoters
  • the rice actin promoter the histone promoters
  • transcription activators such as transcription activators (enhancer”
  • NMT tobacco mosaic virus
  • TEN tobacco etch virus
  • any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, of viral origin, such as for example the terminator of CaMN 35 S, or of vegetable origin, such as for example a histone terminator as described in application EP 0 633 317.
  • the present invention also relates to a cloning and / or expression vector for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene as defined above.
  • This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, at least one origin of replication.
  • This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention.
  • transformation vectors as a function of the host organism to be transformed are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the vector comprises, in addition to the chimeric gene according to the invention, at least one second chimeric gene functional in the same host organism, comprising a nucleic acid sequence coding for an HPPD for addressing in a cell compartment other than the cell compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed.
  • the second chimeric gene can be another chimeric gene according to the invention allowing the addressing of HPPD in the lumen of the thylakoid or the thylakoid membrane, in the endoplasmic reticulum, the cell wall or the mitochondria, or a chimeric gene as described in the prior art allowing the addressing of HPPD either in the cytoplasm or in the chloroplasts .
  • the second chimeric gene allows the addressing of HPPD in the chloroplasts. It comprises, in addition to the regulatory elements defined above, allowing expression of the coding sequence in a host organism, a nucleic acid sequence coding for a transit peptide / HPPD fusion protein.
  • the transit peptide makes it possible to address the chimeric HPPD in the plastids, more particularly the chloroplasts, the fusion protein being cleaved between the transit peptide and the chimeric HPPD in the passage of the plastid membrane.
  • the transit peptide can be simple, like an EPSPS transit peptide (described in US Pat. No.
  • the vector comprises, in addition to the chimeric gene according to the invention, and where appropriate a second chimeric gene coding for an HPPD, another chimeric gene coding for another gene of interest.
  • a second chimeric gene coding for an HPPD another chimeric gene coding for another gene of interest.
  • It may be a gene coding for a selection marker as well as a gene conferring on the transformed plant new agronomic properties, or a gene for improving agronomic quality of the transformed plant.
  • Selection Markers Among the genes coding for selection markers, there may be mentioned antibiotic resistance genes, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells.
  • selection marker genes are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO
  • genes conferring new agronomic properties on transformed plants there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring resistance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases, etc. Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • Herbicide tolerance Among the genes conferring tolerance to certain herbicides, mention may be made of the Bar gene conferring tolerance to bialaphos, the gene coding for an appropriate EPSPS conferring resistance to herbicides having EPSPS as target such as glyphosate and its salts (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2,736,926), the gene coding for glyphosate 5,4 oxidized.
  • glyphosate and its salts US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2,
  • EPSPS EPSPS
  • FR 2 736 926 hereinafter referred to as double mutant EPSPS
  • CP4 the gene coding for an EPSPS isolated from Agrobacterium described by the sequences ID 2 and ID 3 of US patent 5,633,435, hereinafter referred to as CP4.
  • sequence coding for these enzymes is advantageously preceded by a sequence coding for a transit peptide, in particular for the transit peptide as defined above. above.
  • Resistance to Insects Among the proteins of interest conferring new properties of resistance to insects, mention will be made more particularly of the Bt proteins widely described in the literature and well known to those skilled in the art. Mention will also be made of proteins extracted from bacteria such as Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
  • chitinases glucanases, oxalate oxidase, all these proteins and their coding sequences being widely described in the literature, or else antibacterial and / or antifungal peptides, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly lyric peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and WO 99/09189), drosomicine (WO 99/02717) or thanatine (WO 99/24594).
  • cysteines such as thionines or plant defensins
  • lyric peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/
  • the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al, 1993; Panab restaurants & al, 1995). Change in quality
  • proteins enriched in sulfur amino acids will also have the function of trapping and storing excess cysteine and / or methionine, making it possible to avoid the possible problems of toxicity linked to an overproduction of these sulfur amino acids by trapping them.
  • Mention may also be made of genes coding for peptides rich in sulfur amino acids and more particularly in cysteines, the said peptides also having antibacterial and / or antifungal activity.
  • Mention will be made more particularly of plant defensins, as well as lytic peptides of any origin, and more particularly the following lytic peptides: androctonine, drosomicine or thanatine.
  • the subject of the invention is also a method of transforming host organisms, in particular plant cells by integration of at least one nucleic acid sequence or a chimeric gene as defined above, a transformation which can be obtained by any appropriate known means, fully described in the specialized literature and in particular the references cited in the present application, more particularly by the vector according to the invention.
  • a series of methods involves bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods can be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular the plant cell or the plant.
  • Another subject of the present invention is host organisms, in particular plant cells or plants, transformed and containing a chimeric gene comprising a sequence coding for a fusion protein defined above.
  • the chimeric gene is stably integrated into the genome of the host organism.
  • the host organism comprises, in addition to the chimeric gene according to the invention, at least one second chimeric gene functional in the same host organism, comprising a sequence of nucleic acid coding for an HPPD for addressing in a cell compartment other than the cell compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed as defined above.
  • the host organism comprises, in addition to the chimeric gene according to the invention, and where appropriate a second chimeric gene coding for an HPPD, another gene chimera coding for another gene of interest as defined above.
  • the various chimeric genes can be integrated into the genome of the host organism by transformation using a vector according to the invention comprising the various chimeric genes as defined above.
  • the various chimeric genes can also be stably integrated into the genome of the host organism by co-transformation by means of several vectors, each comprising at least one chimeric gene which must be integrated into the genome of the host organism.
  • Another subject of the present invention is transformed plants, in the genome of which at least one chimeric gene according to the invention is stably integrated.
  • the plants according to the invention contain transformed cells as defined above, in particular plants regenerated from the transformed cells above.
  • the regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to the transformed plants resulting from the culture and / or the crossing of the regenerated plants above, as well as the seeds of transformed plants.
  • the transformed plants comprise, in addition to the chimeric gene according to the invention, at least one second chimeric gene functional in the same host organism, comprising a nucleic acid sequence coding for an HPPD for addressing in a cell compartment other than the cell compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed as defined above.
  • the transformed plants comprise, in addition to the chimeric gene according to the invention, and where appropriate a second chimeric gene coding for an HPPD, another chimeric gene coding for another gene of interest such as defined above.
  • the various chimeric genes in plants transformed according to the invention can come either from the same parent transformed plant, and in this case the plant comes from a single transformation / regeneration process with the different chimeric genes contained in the same vector or by co-transformation using several vectors. It can also be obtained by crossing parent plants each containing at least one chimeric gene, one of the parent plants comprising at least one chimeric gene according to the invention.
  • the transformed plants obtainable according to the invention can be of the monocotyledon type such as for example cereals, sugar cane, rice and corn or dicotyledons such as for example tobacco, soybeans, rapeseed, cotton, beet, clover, etc.
  • the subject of the invention is also a process for selective weeding of plants, in particular of crops, using an HPPD inhibitor, in particular a herbicide defined previously, characterized in that this herbicide is applied to transformed plants. according to the invention, both in pre-plant, pre-emergence and post-emergence of the culture.
  • the present invention also relates to a method of controlling weeds in a surface of a field comprising seeds or plants transformed with the chimeric gene according to the invention, which method consists in applying in said field surface a toxic dose for the said weeds of a herbicide inhibiting HPPD, without however substantially affecting the seeds or plants transformed with the said chimeric gene according to the invention.
  • the present invention also relates to a process for cultivating plants transformed according to the invention with a chimeric gene according to the invention, which process consists in sowing the seeds of said transformed plants in a surface of a field suitable for the cultivation of said plants, to apply to said surface of said field a dose toxic to weeds of a herbicide targeting HPPD defined above in the presence of weeds, without substantially affecting said seeds or said plants then harvest the cultivated plants when they reach the desired maturity and possibly separate the seeds from the harvested plants.
  • the application of the herbicide targeting HPPD can be carried out according to the invention, both in pre-planting, pre-emergence and post-emergence of the crop.
  • herbicide within the meaning of the present invention is meant a herbicidal active material alone or associated with an additive which modifies its effectiveness such as for example an agent increasing activity (synergist) or limiting activity (in English safener).
  • an agent increasing activity synergist
  • limiting activity in English safener
  • HPPD inhibitor herbicides are defined above.
  • the above herbicides are associated in known manner with the adjuvants of formulations usually used in agrochemistry
  • the method according to the invention may comprise the simultaneous or delayed application of a HPPD inhibitor in combination with said herbicide, for example glyphosate.
  • Another subject of the invention is the use of the chimeric gene coding for a fusion protein according to the invention as a marker gene during the "transformation-regeneration" cycle of a plant species and selection on the above herbicide.
  • the chimeric gene according to the invention When the chimeric gene according to the invention is combined in the same vector with another chimeric gene coding for a protein of interest conferring new agronomic properties other than a herbicide tolerance gene (resistance to insects, resistance to diseases, modification of the quality), the application of the herbicide inhibitor of HPPD on the transformed plants and their descendants, makes it possible to select in the fields the plants resulting from a cross between a parent plant comprising the two chimeric genes and an unprocessed plant who will have preserved the chimeric genes.
  • a herbicide tolerance gene resistance to insects, resistance to diseases, modification of the quality
  • Clone O a derivative of pRP O described in patent WO 96/38567 containing an expression cassette for HPPD, double histone promoter - TEV - HPPD gene - nos terminator.
  • pRP O was digested with Sac I and Pvu II, the chimeric gene was purified and then ligated into pPZP 212 previously digested with Sac I and Sma I described in P. Hajdukiewicz et al Plant Molecular Biology 25: 989 -994, 1994.
  • Clone Q a derivative of pRP Q described in patent WO 96/38567 containing an expression cassette for HPPD, double histone promoter - TEV - OTP - HPPD gene - nos terminator.
  • pRP Q was digested with Sac I and Pvu II, the chimeric gene was purified and then ligated into pPZP 212 previously digested with Sac I and Sma I, pPZP 212.
  • Vacuole clone the vacuole peptide used in the context of this work is that described in the following article: J.M. FeruUo et al Plant Molecular Biology 33: 625-633, 1997
  • Transit peptide vacuole This peptide was produced using two successive PCRs.
  • the first is carried out with the aim of synthesizing the vacuole transit peptide.
  • the oligonucleotides chosen have the following sequence:
  • VAC 1 5 'AAGATCAAGG ACAAAATTCA TGGTGAAGGT GCAGATGGTG AAAAGAAAAA
  • GAAGAAGGAG AAGAAGAAAC ATG 3 'VAC 2 5' ATCACTGTCA CTGCTGCTGC TATCATGGCC ATGTTCATGA CCCTCTCCAT
  • GTTTCTTCTT CTCCTTCTTC 3 These oligonucleotides hybridize to each other in the region shown in bold and thus make it possible to reconstitute the vacuole transit peptide which comprises 123 base pairs.
  • the reaction was carried out in a HYBAID PCR device with Taq polymerase PERKIN ELMER in its buffer under standard conditions, that is to say for 50 ⁇ l of reaction the dNTPs are mixed with 200 ⁇ M, the Taq polymerase with 2.5 units and 0 , 5 ⁇ l of each oligonucleotide at 10 ⁇ M.
  • a single PCR cycle was carried out, it consists of 5 min at 95 ° C then 1 min at 64 ° C then 10 min at 72 ° C.
  • the second PCR was used to add the Xcm I and Sal I restriction sites necessary for cloning into pRP O.
  • the oligonucleotides used have the following sequences: VAC 3: 5 'ACGTCCAGGT GCGTCGTGGT GTATTGACCG CCGATAAGAT CAAGGACAAA ATTC 3' VAC 4: 5 'ACGTGTCGAC TTAATCACTG TCACTGCTGC TG 3'
  • oligonucleotides make it possible to obtain an amplified fragment of 169 base pairs.
  • the reaction was carried out in a HYBAID PCR device with Taq polymerase PERKIN ELMER in its buffer under standard conditions, that is to say for 50 ⁇ l of reaction the dNTPs are mixed with 200 ⁇ M, the Taq polymerase with 2.5 units, 0 , 5 ⁇ l of each oligonucleotide at 10 ⁇ M and 1 ⁇ l of the first PCR.
  • the amplification program used is, 4 min at 95 ° C then 35 cycles ⁇ 30 sec 95 ° C, 30 sec 66 ° C, 1 min 72 ° C> followed by 10 min at 72 ° C.
  • n pRP O - vacuole a derivative of pRP O containing an HPPD expression cassette, double histone promoter - TEV - HPPD gene - vacuole transit peptide - terminator nos.
  • the plasmid pRP O was digested with Xcm I and Sal I and then ligated to the vacuole transit peptide previously purified and digested with Xcm I and Sal I.
  • n - vacuole clone a derivative of pRP O - vacuole containing a cassette d expression of HPPD, double histone promoter - TEV - HPPD gene - vacuole transit peptide - terminator nos.
  • pRP O - vacuole was digested with Sac I and Pvu II, the chimeric gene was purified and then ligated into pPZP 212 previously digested with Sac I and Sma I.
  • the vector is introduced into the non-oncogenic strain of Agrobacterium tumefaciens EHA 105.
  • Regeneration The regeneration of "Petit Havana" tobacco from leaf explants is carried out on a Murashig and Skoog (MS) base medium comprising 30 g / l of sucrose as well as 350 mg / I of cefotaxime and 200 mg / ml of kanamycin.
  • Leaf explants are removed on plants in the greenhouse and transformed using the leaf disc technique (Science 1985, Vol 227, pl229-1231) in successive stages:
  • the first includes the induction of shoots on an MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.05mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 15 days and 200 mg / ml of kanamycin.
  • MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.05mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 15 days and 200 mg / ml of kanamycin.
  • ANA naphthylacetic acid
  • BAP benzylaminopurine
  • the green shoots formed during this stage are then developed by culture on an MS medium supplemented with 30g / l of sucrose and 200 mg / ml of kanamycin, but containing no hormone, for 10 days.
  • the tolerance of transformed plants is studied by sowing on soil treated with isoxaflutole.
  • the first includes the induction of shoots on an MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.05mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 19 days and kanamycin + variable doses herbicide.
  • MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.05mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 19 days and kanamycin + variable doses herbicide.
  • ANA naphthylacetic acid
  • BAP benzylaminopurine
  • the second corresponds to transplanting the leaf discs (on which calluses and shoots have formed) on an MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.01mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 3 days and kanamycin + variable doses of herbicide; tolerance measurement is performed at this time.
  • MS medium supplemented with 30g / l of sucrose containing 0.01mg / l of naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / l of benzylaminopurine (BAP) for 3 days and kanamycin + variable doses of herbicide; tolerance measurement is performed at this time.
  • ANA naphthylacetic acid
  • BAP benzylaminopurine
  • shoots appear this means that they have integrated the kanamycin tolerance gene; if they have integrated the kanamycin tolerance gene, this also means that they have integrated the gene allowing the expression of HPPD from Pseudomonas fluorescens and its final localization in the cytoplasm, or the chloroplast or even in the vacuole. Indeed these two genes or constructs are linked on T-DNA. If the shoots are white this means that they come from a cell which has integrated the kanamycin tolerance gene (otherwise the sprout would not appear) and the HPPD tolerance gene but that is not sufficient for induce tolerance to the herbicide. The percentage of green seedlings compared to the number of seedlings (white and green) is therefore a measure of the tolerance induced by the gene.

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Abstract

La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) fusionnée à un peptide signal, un gène chimère contenant cette séquence comme séquence codantes et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides. La protéine de fusion selon l'invention est constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C-terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes.

Description

Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase fusionnée à un peptide signal, séquence d'ADN et obtention de plantes contenant un tel gène, tolérantes aux herbicides.
La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) fusionnée à un peptide signal, un gène chimère contenant cette séquence comme séquence codante et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.
Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate. Cette réaction a lieu en présence de fer (Fe2+) en présence d'oxygène (Crouch N.P. & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).
On connaît par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate. Certaines de ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort des dites plantes (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH3-4-CF3 phényl) propane-l,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou encore les pyrazolinates. Des essais pour confirmer que l'HPPD est bien la cible des dicétonitriles (DKN) et pour mettre en évidence que l'HPPD est, au moins à certaines doses, la cible unique des dicétonitriles ont été effectués en laboratoire en faisant germer des graines d'Arabidopsis sur trois types de milieux en conditions stériles in- vitro :
1 milieu Murashig et Skoog( Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised médium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-479), expérience contrôle de la germination
2 milieu MS plus DKN à la dose de lppm 3 milieu MS plus DKN à la même dose + Homogentisate à la concentration de 5 mM.
Il est très net que sur le milieu 1 la germination se fait normalement, chaque plantule développant deux cotylédons bien verts. Le développement se fait ensuite normalement. Sur le milieu 2, la germination a lieu mais la plantule qui émerge est blanche, les deux cotylédons ne présentant aucune pigmentation. Les plantules meurent ensuite en quelques jours. Sur le milieu 3, la germination se fait normalement, les cotylédons sont bien verts. Les plantules se développent mais très rapidement, la quantité d'homogentisate dans le milieu diminuant, les premiers symptômes de blanchiment apparaissent et la croissance des plantes s'arrêtent, elles finissent par mourir comme dans l'essai effectué sur le milieu n°2.
Ceci permet de confirmer que l'HPPD est bien la cible des DKN in planta et qu'elle semble être la cible unique. Ceci montre aussi que l'homogentisate est transporté du milieu de culture jusqu'au site cellulaire où il est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule et la survie de la plante. Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ; (2) la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctionnelle moins sensible à l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991) ; ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.
C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible (non mutée) était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à un herbicide.
Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmiques (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325 : 761-769..), il a également été montré que la meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes.
Ces résultats montrent d'une part que l'homogentisate peut être transporté du milieu extérieur vers le site intra cellulaire où il est nécessaire pour complémenter.une inhibition de l'HPPD endogène, et d'autre part que l'accumulation d'une HPPD exogène dans la cellule au niveau des plastes ou du cytoplasme permet le même type de complémentation permettant l'obtention de plantes génétiquement modifiées tolérantes aux herbicides inhibiteurs d'HPPD.
On a maintenant constaté que l'adressage d'une HPPD exogène dans d'autres compartiments cellulaires que le cytoplasme ou les plastes, permettait d'améliorer la tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD par rapport à un simple adressage cytoplasmique.
La présente invention concerne donc une protéine de fusion constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C-terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).
Par HPPD, on entend selon l'invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rϋetschi & al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP), ou de mammifères comme la souris ou le cochon.
Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.
Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenants de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586. De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO
96/38567). De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.
Il est connu dans la littérature que l'ajout d'une séquence codante correspondant à un peptide supplémentaire en N-ou C-terminal de la protéine va permettre le transport de celle ci vers un autre compartiment cellulaire que le cytoplasme où l' ARNm est traduit. Ce peptide dit peptide signal ou peptide de transit selon les cas, selon sa séquence va permettre le routage vers cet autre compartiment qui peut être par exemple le plaste (membrane ou stroma), le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi cellulaire, les mitochondries, l'appareil de golgi, le noyau, la membrane nucléaire, sans que cela soit exhaustif
Par séquence protéique signal, on entend selon l'invention tout peptide signal ou de transit permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).
Le rôle de telles séquences protéiques sont notamment décrites dans le numéro 38 de le revue Plant molecular Biology (1998) consacré en grande partie aux transports des protéines dans les différents compartiments de la cellule végétale (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144 ; the nuclear pore complex ppl45-162 ; protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-207 ; multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209-221 ; mitochondrial protein import in plants pp 311-338).
De manière avantageuse, la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire (vacuole). De tels peptides sont largements décrits dans la littérature (Neuhaus J.M. and Rogers J.C Sorting of proteins to vacuoles in plant cellsPlant molecular Biology 38 : 127-144, 1998). De préférence, le peptide vacuolaire de la protéine MsaCiB décrite dans J.M.
Ferullo et al (Plant Molecular Biology 33 : 625-633, 1997) (SEQ ID NO 1 ou 2) que l'on sait maintenant être localisée dans la vacuole, fusionné à la partie C-terminale de l'HPPD.
De manière préférentielle, la protéine de fusion est décrite par l'identificateur de séquence n° 3 ou 4 (SEQ ID NO 3 ou 4) avec sa séquence codante. La présente invention concerne également une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence d'acide nucléique ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments des dites séquences, et les séquences qui diffèrent des séquences ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la même protéine de fusion.
Selon la présente invention, on entend par « séquence d'acide nucléique » une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.
Par « séquence capable de s'hybridiser de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridiqtion d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les séquence ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M a environ 50°C-60°C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al, 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence selon l'invention et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine de fusion. Cette définition s'applique également à la séquence protéique de la protéine de fusion, les mutations étant dans ce cas au niveau des acides aminés et les degrés d'homologie étant définis par rapport à la séquence primaire de la protéine de fusion.
Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 .290-300 ; Altschul & al, 1990, J. Mol. Biol. 215 .403-10). Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le « package » UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).
Par « fragments », on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN selon l'invention, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, c'est à dire la fonbction d'adressage pour le petide signal et l'activité HPPD pour la protéine HPPD.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention dans un procédé pour la transformation des plantes, comme gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. Cette séquence peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre(s) gène(s) marqueur(s) et/ou séquence(s) codante(s) pour une ou plusieurs propriétés agronomiques.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion telle que définie précédemment.
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'HPPD mutée. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Promoteurs Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMN 19S ou 35 S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).
De manière préférentielle, le promoteur est choisi parmi les promoteurs lumière dépendants (WO 99/25842), le promoteur d'actine de riz, les promoteurs d'histone et les promoteurs consitués par la fusion d'un promoteur d'histone et du premier intron de l'actine de riz (WO 99/34005). Eléments de transcription
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec le promoteur COMTII selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (NMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEN) décrit par Carrington & Freed. Terminateur
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMN 35 S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
Selon au autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnelle dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée. Par exemple, si le premier gène chimère selon l'invention permet un adressage de l'HPPD dans la vacuole, le deuxième gène chimère peut être un autre gène chimère selon l'invention permettant l'adressage de l'HPPD dans le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, dans le réticulum endoplasmique,, la paroi cellulaire ou les mitochondries, ou un gène chimère tel que décrit dans l'état de la technique permetant l'adressage de l'HPPD soit dans le cytoplasme, soit dans les chloroplastes.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes. Il comprend outre les éléments de régulations définis ci-dessus, permettant l'expression de la séquence codante dans un organisme hôte, une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.
Le peptide de transit permet d'adresser l'HPPD chimère dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes, la protéine de fusion étant clivée entre le peptide de transit et l'HPPD chimère au passage de la membrane des plastes. Le peptide de transit peut être simple, comme un peptide de transit d'EPSPS (décrit dans le brevet US 5,188,642) ou un peptide de transit de celui de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (ssu RuBisCO) d'une plante, éventuellement comprenant quelques acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO mature (EP 189 707) ou encore un peptide de transit multiple comprenant un premier peptide de transit de plante fusionné à une partie de la séquence N-terminale d'une protéine mature à localisation plastidiale, fusionnée à un deuxième peptide de transit de plante tel que décrit dans le brevet EP 508 909, et plus particulièrement le peptide de transit optimisé comprenant un peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol fusionné à 22 acides aminés de l'extrémité N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs fusionnée au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs tel que décrit avec sa séquence codante dans le brevet EP 508 909.
De tels gènes chimères sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 96/38567, WO 99/25842, WO 99/24585, WO 99/24586, WO 99/34005.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt. Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la qualité agronomique de la plante transformée. Marqueurs de Sélection Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103. Gènes d'intérêt
Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.
Tolérance herbicide Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175).
Parmi les gènes codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible, on citera plus particulièrement le gène codant pour une EPSPS végétale, en particulier de maïs, présentant deux mutations 102 et 106, décrit dans la demande de brevet FR 2 736 926, dénommé ci-dessous EPSPS double mutant, ou encore le gène codant pour une EPSPS isolée d'Agrobacterium décrit par les séquences ID 2 et ID 3 du brevet US 5,633,435, dénommé ci-dessous CP4.
Dans les cas des gènes codant pour EPSPS, et plus particulièrement pour les gènes ci-dessus, la séquence codant pour ces enzymes est avantageusement précédée par une séquence codant pour un peptide de transit, en particulier pour le peptide de transit tel que défini ci-dessus. Résistance aux Insectes Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932). Résistance aux Maladies Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lyriques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et WO 99/09189), la drosomicine (WO 99/02717) ou la thanatine (WO 99/24594).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al, 1993 ; Panabières & al, 1995). Modification de la qualité
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A.A. & al, Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334 ; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants: l'androctonine, la drosomicine ou la thanatine.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti dAgrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant un gène chimère comprenant une séquence codante pour une protéine de fusion définie ci-dessus. De préférence, le gène chimère est intégré de manière stable dans le génome de l'organisme hôte.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel qu edéfini ci-dessus.
Les différents gènes chimères peuvent être intégrés dans le génome de l'organisme hôte par transformation au moyen d'un vecteur selon l'invention comprenant les différents gènes chimères tels que définis ci-dessus.
Les différents gènes chimères peuvent également être intégrés de manière stable dans le génome de l'organisme hôte par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs, chacun comprenant au moins un gène chimère devant être intégré dans le génome de l'organisme hôte.
La présente invention a encore pour objet les plantes transformées, dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable. Les plantes selon l'invention contiennent des cellules transformées telles que définies ci- dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées ci-dessus. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel que défini ci-dessus.
Les différents gènes chimères dans les plantes transformées selon l'invention peuvent provenir soit de la même plante transformée parente, et dans ce cas la plante est issue d'un seul procédé de transformation/régénération avec les différents gènes chimères contenus dans un même vecteur ou par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs. Elle peut également être obtenue par le croisement de plantes parentes contenant chacune au moins un gène chimère , l'une des plantes parentes comprenant au moins un gène chimère selon l'invention.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.
L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture. La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini ci- dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture. Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener). Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie
Lorsque la plante transformée selon l'invention comprend un autre gène de tolérance à un autre herbicide (comme par exemple un gène codant pour une EPSPS mutée ou non conférant à la plante une tolérance au glyphosate), ou lorsque la plante transformée est naturellement insensible à un autre herbicides, le procédé selon l'invention peut comprendre l'application simultanée ou décalée dans le temps d'un inhibiteur d'HPPD en association avec ledit herbicide, par exemple le glyphosate.
L'invention a encore pour objet l'utilisation du gène chimère codant pour une protéine de fusion selon l'invention comme gène marqueur au cours du cycle "transformation-régénération" d'une espèce végétale et sélection sur l'herbicide ci-dessus.
Lorsque le gène chimère selon l'invention est combiné dans un même vecteur à un autre gène chimère codant pour une protéine d'intérêt conférant de nouvelles propriétés agronomiques autre qu'un gène de tolérance herbicide (résistance aux insectes, résistance aux maladies, modification de la qualité), l'application de l'herbicide inhibiteur d'HPPD sur les plantes transformées et leurs descendances, permet de sélectionner dans les champs les plantes issues d'un croisement entre une plante parente comprenant les deux gènes chimères et une plante non transformée qui auront conservé les gènes chimères.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,1982. Exemple 1 : Constructions des différents gènes pour l'expression dans le tabac
A) Clone O : un dérivé de pRP O décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - terminateur nos. Pour obtenir le clone O, pRP O a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I décrit dans P. Hajdukiewicz et al Plant Molecular Biology 25 :989-994, 1994.
B) Clone Q : un dérivé de pRP Q décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD - terminateur nos. Pour obtenir le clone Q, pRP Q a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I, pPZP 212.
C) Clone vacuole : le peptide vacuole utilisé dans le cadre de ce travail est celui décrit dans l'article suivant : J.M. FeruUo et al Plant Molecular Biology 33 : 625-633, 1997
Peptide de transit vacuole : Ce peptide a été réalisé à l'aide de deux PCR successives.
La première est réalisée dans le but de synthétiser le peptide de transit vacuole. Les oligonucléotides choisis ont les séquence suivantes :
VAC 1: 5' AAGATCAAGG ACAAAATTCA TGGTGAAGGT GCAGATGGTG AAAAGAAAAA
GAAGAAGGAG AAGAAGAAAC ATG 3' VAC 2: 5' ATCACTGTCA CTGCTGCTGC TATCATGGCC ATGTTCATGA CCCTCTCCAT
GTTTCTTCTT CTCCTTCTTC 3' Ces oligonucléotides s'hybrident l'un à l'autre dans la région figurée en gras et permettent ainsi de reconstituer le peptide transit vacuole qui comporte 123 paires de bases. La réaction a été réalisée dans un appareil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERKIN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 50μl de réaction on mélange les dNTP à 200μM, la Taq polymerase à 2,5 unités et 0,5 μl de chaque oligonucléotide à lOμM. Un seul cycle PCR a été réalisé, il se compose de 5 min à 95°C puis 1 min à 64°C puis 10 min à 72°C.
La seconde PCR a servi à ajouter les sites de restriction Xcm I et Sal I nécessaire au clonage dans pRP O. Les oligonucléotides utilisés ont pour séquences : VAC 3: 5' ACGTCCAGGT GCGTCGTGGT GTATTGACCG CCGATAAGAT CAAGGACAAA ATTC 3' VAC 4: 5' ACGTGTCGAC TTAATCACTG TCACTGCTGC TG 3'
Ces oligonucléotides permettent d'obtenir un fragment amplifié de 169 paires de bases. La réaction a été réalisée dans un appareil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERKIN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 50μl de réaction on mélange les dNTP à 200μM, la Taq polymerase à 2,5 unités, 0,5 μl de chaque oligonucléotides à lOμM et lμl de la première PCR . Le programme d'amplification utilisé est, 4 min à 95°C puis 35 cycles <30 sec 95°C, 30 sec 66°C, 1 min 72°C> suivi de 10 min à 72°C. n pRP O - vacuole : un dérivé de pRP O contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - peptide de transit vacuole - terminateur nos. Pour le construire le plasmide pRP O a été digère par Xcm I et Sal I puis ligué sur le peptide transit vacuole préalablement purifié et digéré par Xcm I et Sal I. n - clone vacuole : un dérive de pRP O - vacuole contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - peptide de transit vacuole - terminateur nos. Pour obtenir le clone vacuole , pRP O - vacuole a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I.
Exemple 2: Expression d'HPPD de Pseudomonas fluorescens dans le tabac
A) Transformation du Tabac "Petit havana" pour obtention de plantes : sélection kanamycine.
Les gènes chimères décrits précédemment ont été transférés dans du tabac "Petit havana" selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande européenne EP n° 0 508 909.
1) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium tumefaciens EHA 105.
2) Régénération: La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashig et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que 350mg/I de céfotaxime et 200 mg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, pl229-1231) en trais étapes successives :
- la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 200 mg/ml de kanamycine.
- Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose et 200 mg/ml de kanamycine, mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.
- Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres 200 mg/ml de kanamycine et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
La tolérance des plantes transformées est étudiée par semis sur un sol traité à l'isoxaflutole.
B) Transformation du Tabac "Petit havana" pour évaluation des construits en terme de tolérance au cours de la phase de transformation / régénération : sélection kanamycine et dicétonitrile.
1) La transformation est effectuée comme précédemment. 2) La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/l de saccharose ainsi que
350mg/l de céfotaxime et 200 mg/1 de kanamycine et des doses variables de la 2-cyano-3- cyclopropyl-l-(2-méthylsulfonyl-4-trifluorométhylphényl) propan-l,3-dione, 2,5 ppm,
3,125 ppm, 3,75 ppm. Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, pl229-1231) en deux étapes successives :
- la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.05mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 19 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide.
- La deuxième correspond à un repiquage des disques foliaires (sur lesquels des cals et des pousses se sont formés) sur un milieu MS additionné de 30g/l de saccharose contenant 0.01mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 3 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide ; la mesure de la tolérance est effectuée à ce moment là.
3) Mesure de la tolérance à l'herbicide des plantules in- vitro . Les expériences sont réalisées par action de l'isoxaflutole (ou plus précisément du dicétonitrile correspondant à l'isoxafiutole) sur les pousses.
Si au cours de la transformation, des pousses apparaissent ceci signifie qu'elles ont intégrées le gène de tolérance à la kanamycine ; si elles ont intégrées le gène de tolérance à la kanamycine cela signifie aussi qu'elles ont intégré le gène permettant l'expression de l'HPPD dde Pseudomonas fluorescens et sa localisation finale dans le cytoplasme, ou le chloroplaste ou encore dans la vacuole. En effet ces deux gènes ou construits sont liés sur le T-DNA. Si les pousses sont blanches cela signifie qu'elles sont issues d'une cellule qui a intégré le gène de tolérance à la kanamycine (sinon la pousse n' apparaîtrait pas) et le gène de tolérance HPPD mais que celui n'est pas suffisant pour induire une tolérance à l'herbicide. Le pourcentage de plantules vertes par rapport au nombre de plantules (blanches et vertes) est donc une mesure de la tolérance induite par le gène.
Cette expérience a été réalisée en utilisant différentes concentrations d'inhibiteur d'HPPD, le RPA 202248 (qui est le dicétonitrile de l'isoxafiutole), 2,5 ppm, 3,125 ppm et 3,75 ppm. Le comptage a été effectué en comptant toutes les pousses blanches ou vertes puis toutes les pousses vertes, résultat dans le tableau ci-dessous.
Tableau récapitulatif de la tolérance induite par les différentes localisation HPPD
Localisation de l'HPPD % de pousses vertes à 2,5ppm 3,125ppm cytoplasme 3,1 3,7 chloroplates 17, 2 8,6 vacuole 10,1 9
Ces résultats confirment que l'adressage de l'HPPD dans la vacuole permet d'obtenir un pourcentage de pousses vertes voisin de celui observé pour un adressage dans les chloroplastes (en particulier à 3,125 ppm), et en tous cas supérieur au pourcentage obtenu avec un adressage cytoplasmique, bien que l'HPPD native soit localisée dans le cytoplsame.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine de fusion constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C- terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes.
2. Protéine de fusion selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'HPPD est une enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD.
3. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'HPPD est choisie parmi les HPPD de bactéries comme Pseudomonas, de plantes comme d'Arabidopsis ou de carotte, de Coccicoides, ou de mammifères comme la souris ou le cochon.
4. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens.
5. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale.
6. Protéine de fusion selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'HPPD mutée comprend la mutation W336.
7. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 4 . caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD chimère comprenant des éléments provenants de différentes HPPD.
8. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi cellulaire, les mitochondries, l'appareil de golgi, le noyau, la membrane nucléaire.
9. Protéine de fusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire
(vacuole).
10. Protéine de fusion selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence protéique signal est décrite par la SEQ ID NO 1.
11. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que la séquence protéique signal est fusionnée à la partie C-terminale de l'HPPD.
12. Protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est décrite par l'identificateur de séquence n° 4 (SEQ ID NO 4).
13. Séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'une des revendications 1 à 12.
14. Gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon les revendications 1 à 12.
15. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les cellules végétales ou les plantes.
16. Gène chimère selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique est représentée par la SEQ ID NO 3.
17. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère selon les revendications 14 à 16.
18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.
19. Vecteur selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.
20. Vecteur selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt.
21. Organisme hôte transformé caractérisé en ce qu'ils contiennent un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16.
22. Organisme hôte selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.
23. Organisme hôte selon la revendication 22, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.
24. Organisme hôte selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d' intérêt.
25. Organisme hôte selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'il est une cellule végétale.
26. Organisme hôte selon la revendication 25, caractérisé en ce que les cellules végétales sont choisies parmi les cellules de plantes du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.
27. Plantes transformées,* dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16 est intégré de manière stable.
28. Plante selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle contient des cellules transformées selon l'une des revendications 25 ou 26.
29. Plante selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisée en ce qu'elles est régénérée à partir des cellules transformées selon l'une des revendications 25 ou 26.
30. Plante transformée selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 29.
31. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 30, caractérisée en ce qu'elle comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, au moins un deuxième gène chimère fonctionnel, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée.
32. Plante transformée selon la revendication 31, caractérisé en ce que le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.
33. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 32, caractérisée en ce qu'elle comprend outre le gène chimère selon l'une des revendications 14 à 16, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt.
34. Plante transformée selon l'une des revendications 27 à 33, caractérisée en ce qu'elle est du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comme le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.
35. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34.
36. Procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
37. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'une des revendications 27 à 35, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformées.
38. Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 27 à 34, lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées selon la revendication 35 dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
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