WO2002006443A2 - Lipoxygenase-inducible promoter, expression cassettes comprising same and transformed plants - Google Patents

Lipoxygenase-inducible promoter, expression cassettes comprising same and transformed plants Download PDF

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WO2002006443A2
WO2002006443A2 PCT/FR2001/002216 FR0102216W WO0206443A2 WO 2002006443 A2 WO2002006443 A2 WO 2002006443A2 FR 0102216 W FR0102216 W FR 0102216W WO 0206443 A2 WO0206443 A2 WO 0206443A2
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polynucleotide
promoter
transformed
plant
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Bertrand Verdaguer
Joëlle FOURNIER
Marie-Thérèse ESQUERRE-TUGAYE
Roland Beffa
Marie-Claire Grosjean-Cournoyer
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Rhobio
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems

Definitions

  • the present invention relates to polynucleotides comprising a novel promoter regulatory sequence inducible in response to aggression by a pathogen or in response to another inducing agent.
  • the present invention also relates to expression cassettes and vectors comprising a promoter regulatory sequence according to the invention which controls the expression of a coding sequence and in particular of a heterologous coding sequence, heterologous meaning here a coding sequence different from the native coding sequence.
  • the invention also relates to a host organism and in particular plant cells and plants transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • Plant lipoxygenases are involved in various physiological processes and these functions can be performed by different isoenzymes. This diversity in biological functions also results in regulatory mechanisms as well as different tissue and subcellular locations depending on the isoforms. An important role is attributed to LOXs in stress responses, in particular injury, and parasitic attacks (Blée, Prog. Lipid Res., 1: 33-37, 1998). A strong induction of expression of LOX genes is thus measured in many monocotyledonous or dicotyledonous plants interacting with bacteria, viruses or fungi, as well as following mechanical injuries or caused by insects on the leaves.
  • LOXs In Arabidopsis thaliana, there are at least two genes encoding LOXs.
  • the _4tLOXl gene is constitutively expressed in all plant organs with higher expression levels in the roots and in young germinations (Melan et al, Plant Physiol., 101: 441-450, 1993). Strong induction of ⁇ tLOXl activity is detected following infection with Pseudomonas syringae. A differential accumulation of LOX transcripts is highlighted between a compatible or incompatible interaction. The induction of gene expression is indeed greater and earlier after inoculation with an avirulent strain.
  • _4tLOXl gene that was inducible after treatment with MeJa (methyl jasmonate) or with abscissic acid.
  • MeJa methyl jasmonate
  • abscissic acid Another _4tLOX2 gene, divergent in terms of its peptide sequence (approximately 40% similarity with the protein sequences of Arabidopsis _4tLOXl and of tobacco NtLOXl) and having a sequence of addressing to chloroplasts, is preferentially involved in the synthesis of acid. jasmonic in response to the injury (Bell et al, P ⁇ AS, 92: 8675-8679, 1995).
  • Complementary DNA coding for LOXs has been isolated in particular from potatoes, tomatoes, rice, barley, soybeans, peas and beans.
  • the pea LOX2 promoter has also been cloned and used for expression of the reporter gene uidA in transgenic tobacco plants (Forster et al., Plant Mol. Biol., 26: 235-248, 1994). The results show high levels of expression in seeds, leaves and stems. The cloned promoter therefore does not have any marked tissue specificity whereas the pea LOX2 gene is preferentially expressed in the seeds. Promoters of two LOX genes from tomatoes which are normally expressed during fruit ripening have also been isolated (Beaudoin and Rothstein, Plant Mol. Biol., 33: 835-846, 1997). LOX promoters with specific activity in plant defense and resistance mechanisms have not yet been isolated and characterized.
  • the present invention relates to a tobacco lipoxygenase 1 promoter.
  • This promoter has a specific expression profile of the defense mechanisms of plants, it is activated in response to an inducing agent and in particular in response to the aggression of a plant by a pathogenic agent.
  • SEQ ID NO.l Promoter of tobacco lipoxy genase 1
  • SEQ ID NO. 2-3 PCR primers
  • the present invention relates to novel polynucleotides comprising a promoter regulatory sequence functional in plants.
  • promoter regulatory sequence is meant according to the invention the non-coding region of a gene involved in the binding with RNA polymerase and with other factors which are responsible for the initiation and regulation of the transcription leading to to the production of an RNA transcript.
  • polynucleotide means a single-stranded nucleotide chain or its complement or a double-stranded nucleotide chain which may be of DNA or RNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular double stranded DNA.
  • polynucleotide also refers to the modified oligonucleotides and polynucleotides.
  • polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment.
  • the polynucleotides of the present invention can be prepared by standard molecular biology techniques as described by Sambrook et al. (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) or by biochemical synthesis.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a plant promoter regulatory sequence of SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to polynucleotides comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide capable of hybridizing selectively to the polynucleotide of SEQ ID No. 1; b) a polynucleotide homologous to the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • homologous a polynucleotide having one or more sequence modifications compared to the reference sequence. These modifications can be deletions, additions or substitutions of one or more nucleotides of the reference sequence.
  • the percentage of homology will be at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% by compared to the reference sequence.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art. One can use for example the PILEUP or BLAST programs (in particular Altschul et al., J. Mol.Evol.
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising polynucleotides having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleotides having at least 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% of homology with the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • polynucleotides homologous to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
  • sequence capable of selective hybridization is meant according to the invention the sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise.
  • the stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art.
  • the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C. lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C.
  • hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA.
  • the washes are for example carried out successively at low stringency in a 2X SSC buffer, 0.1% SDS, at medium stringency in a 0.5X SSC buffer, 01% SDS and at high stringency in a 0.1X SSC buffer, 0, 1% SDS.
  • Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
  • the invention therefore relates to polynucleotides comprising a polynucleotide capable of selectively hybridizing with the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200 , 300, 400, 500, 1000 nucleotides capable of selectively hybridizing with the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
  • the polynucleotides selectively hybridizing to a reference polynucleotide retain the function of the sequence reference.
  • the invention relates to a biologically active fragment of the polynucleotide according to SEQ ID No. 1.
  • biologically active fragment is meant above a polynucleotide having a promoter activity or a transcription regulation activity in particular in response to attacks by a pathogenic agent or by another agent inducing a defense reaction of plants.
  • the polynucleotides of the present invention comprise at least one CAAT box (positions 2055-2059 of SEQ ID No. 1) and at least one TATA box (positions 2178-2185 of SEQ ID No. 1 ).
  • the polynucleotides according to the invention also comprise regulatory elements, in particular at least one G box (positions 1989-1992, 1847-1850, 1636-1639, 1162-1165, 1038-1041, 189-192, 67- 70 of SEQ ID No. 1) and / or at least one ERE box.
  • the polynucleotides of the present invention comprise at least one polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide whose sequence is between position 1938 and position 1945 of SEQ ID No. 1; and b) a polynucleotide whose sequence is between position 576 and position 584 of SEQ ID No. 1; and c) a polynucleotide whose sequence is between position 513 and position 520 of SEQ ID No. 1.
  • the polynucleotides of the present invention comprise a polynucleotide whose sequence is between position 821 and position 875 of SEQ ID No.l.
  • the polynucleotides of the present invention have promoter activity in plants.
  • the promoter activity is not detected in healthy plants.
  • the polynucleotides of the present invention have promoter activity in certain healthy plant organs important for plant survival and persistence.
  • the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is detected in the cotyledons of the embryo, in the hypocotyle and the cotyledonary leaves during germination, in the region of the collar and in the petioles of the leaves of growing plants and adult plants, as well as in the flower's reproductive organs and in the flower's petals.
  • This tissue expression profile in organs essential for the survival and persistence of the plant is consistent with a role of defense and protection.
  • activity is detected in the abscission zones of the leaves and flowers.
  • the polynucleotides of the present invention have an activity which promotes and regulates expression in relation to the defense mechanisms of plants and to pathogenesis.
  • this promoter activity is induced in response to an inducing agent and in particular in response to an attack by a pathogen or by a chemical agent.
  • inducing agent is meant any chemical agent as well as any agent produced by a pathogen capable of causing a defense reaction of plants. Mention will in particular be made of chemical elicitors as well as elicitors of pathogenic agents such as bacteria, viruses and fungi. By inducing agent is also meant any pathogenic agent capable of causing a defense reaction of the plant.
  • the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is induced following eliciting treatments, to aggression by pathogenic agents, in particular bacterial, fungal or viral, and in particular by infection with Phytophthora.
  • this induction is very early and is measurable before the onset of necrosis or symptoms.
  • the induction amplitude is high, at the quantitative level, an induction of a factor of at least 15, 25, 50, 75 and preferably a factor of 100 is measured after 12 hours.
  • the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is induced by inducing agents, in particular by treatment with MeJa (methyl jasmonate), ACC (1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid) and with heavy metals.
  • MeJa methyl jasmonate
  • ACC 1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid
  • the promoter activity of the polynucleotides according to the present invention is induced by ⁇ -carrageenan, a polysaccharide extracted from red algae of the genus Gigartina (Mercier et al., New Phytologist 149: 43-51, 2001).
  • this induction is obtained by treatment of the leaf tissue by infiltration.
  • the polynucleotides having a promoter or regulatory activity according to the invention are inserted into an expression cassette using cloning techniques well known to those skilled in the art.
  • This expression cassette comprises the elements necessary for the transcription and translation of the sequences coding for a reporter gene or a polypeptide of interest.
  • the polynucleotides of the present invention having promoter and / or expression regulating activity are therefore advantageously used to express a heterologous gene in a host organism and in particular in plant cells or in plants.
  • this expression cassette comprises both elements making it possible to produce a polypeptide by a host cell and elements necessary for the regulation of this expression.
  • the present invention therefore also relates to functional expression cassettes in plant cells or plants comprising, in the direction of transcription, a 5 ′ promoter regulatory sequence, a coding sequence and a 3 ′ regulatory sequence, in which the 5 'promoter regulatory sequence comprises a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide comprising a plant promoter regulatory sequence characterized in that it comprises the polynucleotide of SEQ ID No. 1; and b) a polynucleotide capable of selectively hybridizing to the polynucleotide of SEQ ID No.
  • any gene of interest can be expressed in a host organism under the control of a promoter according to the invention.
  • the polynucleotides according to the present invention having promoter activity are used for the expression of a heterologous gene in plant cells or in a plant.
  • the coding sequence comprises a sequence coding for a reporter gene or a sequence coding for a protein or a polypeptide of interest.
  • the reporter genes mention will be made in particular of the reporter genes GUS ( ⁇ -glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase) or ⁇ -galactosidase (lacZ).
  • the protein of interest is a protein which confers on plants properties of resistance to diseases or insects.
  • the protein of interest is chosen from fungal elicitors or lytic peptides.
  • the protein of interest is advantageously a protein which confers on plants properties of resistance to diseases and pathogens.
  • chitinases glucanases, oxalate oxidase
  • all these proteins and their coding sequences being widely described in the literature, or even antibacterial peptides and / or antifungals, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly lytic peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, deposited on August 18, 1998) or drosomicine (PCT / FR98 / 01462, deposited on July 8, 1998).
  • the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun et al., Mol. Plant microb. Internet, 6: 15-25, 1993 ; Panab restaurants et al., Mol. Plant Microb. Internet, 8, 1995).
  • the expression cassettes according to the present invention can also include any other sequence necessary for the expression of the gene of interest, such as for example regulatory elements or signal sequences allowing the addressing of the polypeptide of interest.
  • the polynucleotides according to the invention can be used alone or associated with at least part of a promoter of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter expressing in particular in plant leaves, such as promoters known as constitutive of bacterial, viral or plant origin or also light dependent promoters such as that of a gene for the small subunit of plant ribulose- biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) or any known suitable promoter that can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • the promoters of a plant virus gene there may be mentioned that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the circovirus promoter (AU 689 311).
  • the polynucleotides according to the invention can also be used in combination with at least part of a promoter specific for regions or specific tissues of plants, and more particularly promoters specific for seeds (Datla, R. et al., Biotechnology Ann. Rev., 3: 269-296, 1997), in particular the promoters of napine (EP 255 378), of phaseoline, of glutenin, of heliantinin (WO 92/17580), of albumin (WO 98/45460) or of oelosin (WO 98 / 45461).
  • any regulatory sequence can be used which makes it possible to increase the level of expression of the coding sequence inserted in said expression cassette.
  • transcription activators e.g., transcription activators
  • the leader sequences derived from viruses mention will be made, for example, of the activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or the activator of the tobacco etch virus (TEV).
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • TMV tobacco etch virus
  • Different sequences derived from plant introns can also be used to increase the level of expression of the gene of interest, especially in monocotyledonous plants. Mention will be made, for example, of the intron I of the corn gene AdhI (Callis et al., Genes Develop., 1: 1183-1200,
  • terminator sequences can be used in the expression cassettes according to the invention. These sequences allow the termination of transcription and polyadenylation of the mRNA. Any terminator sequence functional in the selected host organism can be used. For expression in plants, it is possible in particular to use the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or alternatively terminator sequences of plant origin, such as for example the histone terminator (see EP 0 633 317), the terminator CaMV 35 S and the tml terminator. These terminator sequences are usable in monocotyledonous and dicotyledonous plants.
  • the present invention also relates to a polynucleotide comprising an expression cassette according to the invention and in particular a vector comprising an expression cassette according to the invention.
  • the expression cassettes according to the present invention are inserted into a vector for their replication or for the transformation of a host organism.
  • the present invention also relates to transformation or expression vectors comprising at least one polynucleotide or an expression cassette according to the present invention.
  • the vectors of the present invention are used in particular for transforming a host organism and for expressing a polypeptide of interest in said host organism.
  • the host organism is for example a bacterium, a yeast, a fungus, a plant cell or a plant.
  • This vector can in particular consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus in which a polynucleotide or an expression cassette according to the invention is inserted.
  • any vector capable of being maintained, self-replicating or propagating in a host cell in order to induce the expression of a polynucleotide or a polypeptide can be used.
  • the vectors according to the invention comprise at least one origin of replication.
  • the vectors of the invention also comprise at least one selection marker and preferably a selection marker usable in plant cells or in plants.
  • selection markers there may be mentioned antibiotic resistance genes such as the npt11 gene for resistance to kanamycin (Bevan et al., Nature 304: 184-187, 1983) and the hph gene for resistance to hygromycin (Gritz et al., Gene 25: 179-188, 1983).
  • herbicide tolerance genes such as the bar gene (White et al., NAR 18: 1062, 1990) for bialaphos tolerance, the EPSPS gene (US 5,188,642) for glyophosate tolerance or the HPPD gene. (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. It will also be possible to use the genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS or genes coding for pigments and enzymes regulating the production of pigments in the transformed cells. Such selection marker genes are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • these vectors are used for the transformation of a host organism.
  • Those skilled in the art will choose the appropriate transformation vectors in particular according to the host organism to be transformed and according to the transformation technique implemented.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the subject of the invention is also a method of transforming host organisms, in particular plant cells with a polynucleotide, an expression cassette or a transformation or expression vector according to the invention.
  • the invention also relates to a process for transforming plant cells in which at least one polynucleotide, an expression cassette and / or a vector according to the invention is integrated into the genome of said plant cells.
  • the transformation of the host organism can be obtained by any suitable known means, the techniques of transformation and in particular of transformation of plants are amply described in the specialized literature.
  • Agrobacterium in particular for the transformation of dicotyledons.
  • a series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes.
  • Other methods include bombarding cells, protoplasts, or tissue with particles to which DNA sequences are hung.
  • Other methods can also be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
  • the present invention also relates to plant cells and plants obtained by the transformation methods described above. Host organizations
  • the present invention also relates to a host organism transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
  • host organism in particular according to the invention any mono or multicellular organism, lower or higher, in particular chosen from bacteria, yeasts, fungi or plant cells and plants.
  • bacteria are chosen from Escherichia coli
  • yeasts are chosen from Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisae
  • the fungi are chosen from Aspergillus niger.
  • the host organism is a plant cell or a plant.
  • the invention relates to transformed plant cells or transformed plants comprising at least one polynucleotide, an expression cassette and / or a vector according to the invention.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant according to the invention means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, l barley, sorghum, rapeseed, soybeans, rice, sugar cane, beet, tobacco, cotton, sunflower, clover etc.
  • the host organism comprises at least one other heterologous gene coding for a peptide, a polypeptide or a protein of interest.
  • the polynucleotide comprising a polynucleotide according to the invention and the other heterologous gene (s) may have been introduced into the host organism simultaneously by means of the same vector comprising them, or using several vectors, or sequentially using several vectors, or alternatively by crossing several host organisms, each comprising a heterologous gene.
  • heterologous gene is meant according to the invention any gene introduced artificially into the host organism, and more particularly artificially integrated into its genome, the methods allowing this introduction or integration possibly being those described above.
  • the plants transformed according to the invention can thus contain other genes of interest, conferring on plants new agronomic properties.
  • genes conferring new agronomic properties on transformed plants there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring tolerance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases.
  • Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128.
  • genes coding for proteins enriched in sulfur amino acids WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822
  • genes of interest can be combined with chimeric gene according to the invention either by conventional crossing of two plants each containing one of the genes (the first the chimeric gene according to the invention and the second the gene coding for the protein of interest) or by carrying out the transformation of cells plants of a plant containing the gene coding for the protein of interest with the chimeric gene according to the invention.
  • the present invention also relates to plants containing transformed cells as defined above, in particular plants regenerated from the transformed cells and their progeny.
  • the regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to genetically modified plants in the genome of which a polynucleotide or an expression cassette according to the invention are stably integrated and transmissible by sexual reproduction.
  • the present invention also relates to plants obtained by crossing the regenerated plants above with other plants. It also relates to the seeds of transformed plants.
  • Figure 1 Glucuronidase activity of PILOX plants after infiltration of Ppn elicitor, in the infiltrated area.
  • A The enzymatic activity was assayed (in pmol MU / h / ⁇ g prot) in leaf discs taken from areas infiltrated by the Ppn elicitor, at the times indicated (4, 8, 12, 24 hours). The measurements were carried out for 3 plants of the same transgenic line (1, 2, 3). Two controls were carried out on plants after water infiltration (4) and on control plants without infiltration (5).
  • Figure 2 Glucuronidase activity of PILOX plants after infiltration of Ppn elicitor, away from the infiltrated area.
  • the enzymatic activity was assayed (in pmol MU / h / ⁇ g prot) in leaf discs taken from the non-infiltrated half of leaves treated with Ppn elicitor, at the times indicated (0, 3, 7 days). The cross indicates the death of the tissue in the infiltrated area.
  • Leaf discs were taken from the infiltrated area (1), the near area (2), the far area (3) and from an upper leaf (4).
  • FIG. 3 Glucuronidase activity in PILOX plants inoculated with Ppn race 0.
  • the glucuronidase activity was measured (in pmol MU / h / ⁇ g prot) in the roots of inoculated plants, at the times indicated (5, 12, 24, 48 hours and 3 days).
  • Line 5 was inoculated with water (2) and with Ppn race 0 (1).
  • Line 21 was inoculated with water (4) and with Ppn race 0 (3).
  • Figure 4 Effect of MeJa (methyl jasmonate) on the glucuronidase activity of PILOX plants.
  • the glucuronidase activity was measured in plants 24 hours after treatment with MeJa (250 ⁇ M). For each measurement, the specific activity of the treated plants was compared to that of control plants treated with ethanol, controls to which the value 1 was assigned. The histograms represent the specific activity compared to that of the controls. The measurements carried out on three lines of PILOX plants are shown (lines 5, 9 and 13). Two tests (1) and (2) were carried out for each line.
  • Example 1 Obtaining a tobacco genomic clone containing the promoter region of the pathogenesis-induced LOX gene
  • Description of the probes used TL-J2 is a complementary DNA of 2888 bp, corresponding to a pathogen-induced tobacco LOX gene. Obtaining this complementary DNA is described by Véroocci et al. (Plant Physiol., 108: 1342, 1995), its sequence is deposited in GenBank under the accession number X84040. An EcoRI fragment of 1409 bp, corresponding to nucleotides 1222 to 2630 of TL-J2, called TL-35, was also used. Description of the tobacco genomic bank used
  • the tobacco genomic bank was acquired from the company Clontech (4030 Fabian Way, Palo Alto, CA 94303-4607, USA, product reference FL1071d). This is a library produced by partial digestion with the DNA enzyme Mbol isolated from plants tobacco Nicotiana tabacum, cv. Xanthi-nc, harvested 30 days after emergence, then selection of fragments of a size between 8 and 22 kb and insertion of the fragments obtained at the BamUL site of the EMBL3 vector. Tobacco LOX genomic clones Screening of the tobacco library using complementary DNA TL-35 led to the isolation and purification of a bacteriophage clone named Al, exhibiting strong probe hybridization TL-35.
  • a step of subcloning the phage DNA made it possible to isolate and sequence fragments of the clone A1 which hybridized to the LOX probe. Analysis of the sequences obtained has shown that the insert A1 contains the 3 'terminal part of the NtLOX1 gene, and in particular the nucleotides 260 to 2888 of the AD ⁇ C TL-J2 divided into 8 exons separated by 7 introns.
  • the obtaining of a second genomic tobacco clone overlapping with the clone Al and containing the 5 'terminal region of the NtLOXl gene, is described in the doctoral thesis of the University of Paris XI-Orsay by Iann Rancé (1997, pages 46 to 48). This clone was named 2A5.
  • clone 2A5 contained nucleotides 1 to 259 of TL-J2 cDNA, the untranslated region of the 5 'terminal end of the gene and all of exon 1
  • the insert 2A5 overlaps with the clone Al on 2557 nt, which correspond to nucleotides 297 to 2853 of the sequence of intron 1 (with a total size of 3798 bp).
  • a 2330 bp region containing the 5 'terminus of the LOX gene and the upstream regions has been sequenced and designated as PILOX. The sequence of this fragment is presented in SEQ ID No. 1. Isolation of a promoter fragment
  • the 2330 bp PILOX DNA fragment containing the nucleotides 728 to 3047 of the genomic clone 2A5 was isolated by chain amplification (PCR). This fragment contains the putative TATA box and approximately 2.2 kb of upstream sequence which potentially includes the majority of the cz ' s regulatory elements.
  • the 3 ′ terminal region of the fragment contains the 88 nucleotides of the leader region of the LOX RNA, the ATG initiator codon for the translation of the LOX gene as well as the nucleotides coding for the first 6 amino acids of LOX from tobacco.
  • the sequences of the two primers used in the PCR reaction are indicated below and note the insertion of the Xbal site in the sense primer and of the Smal site in the antisense primer (underlined characters).
  • Sense primer 5 * CCC TTT CTA GAC CAT TTA TTT CCC 3 'Anti-Sense primer: 5' CTG TGA TTC CCG GGA CAA TCT TCT 3 '
  • the amplification reaction contained 300 ng of phage DNA from clone 2A5, 25 picomoles of each of the two primers, 200 ⁇ M dNTP and 1 unit of Vent polymerase (New England) and its reaction buffer. The amplification was carried out over 20 cycles and the sequence of the fragment obtained was verified. Clone fragment sequence analysis
  • a sequence comparison between the tobacco PILOX promoter and the GenBank nucleic acid database does not reveal significant homologies with other promoters.
  • a sequence alignment between the tobacco LOX promoter and a 700 bp fragment upstream of the LOX1 transcribed sequence from Arabidopsis thaliana, (Melan et al, Biochem. Biophys. Actophys, 1210: 377-380, 1994) or the LOXl promoter of barley, inducible by MeJa does not reveal conserved regions.
  • this analysis makes it possible to detect in the PILOX promoter a 50 bp sequence (position 821-875 of SEQ ID No.
  • promoters induced by methyl jasmonate such as the parsley chalcone synthase promoter (Schulze-Lefert et a, EMBO J., 8: 651-656, 1989), the promoter of the gene coding for the protein reserve (VSP) soybeans (Mason et al, Plant Cell, 5: 241-251, 1993) or the promoter of the proteinase inhibitor II gene from potato (Kim et al, Plant Physiol., 99 : 571-576, 1992) contain in their sequence a G box (CACGTG) essential for induction.
  • VSP protein reserve soybeans
  • a TGACG motif analogous to the asl element identified in the CaMV 35S promoter is also involved in the response to the MeJa of the LOX 1 lipoxygenase promoter from barley (Rouster et al, Plant J., 11: 513-523, 1997). Analysis of the tobacco LOX promoter sequence does not reveal TGACG or G box consensus motifs. Several ACGT motifs which can be assimilated to poorly preserved G boxes are however identified in the promoter. Several sequence elements involved in the response to elicitors have also been identified in different plant promoters.
  • ERE boxes are mainly found for Elicitor Responsive Element, identified in particular in the PRl promoter of the PRm gene of maize (Raventos et al, Plant J., 7: 147-155, 1995) and in the PRl promoter of parsley (Rushton et al, EMBO J., 15: 5690-5700, 1996).
  • E1RE boxes (GTCAG) for Elicitor Responsive Element are also involved in activation by elicitors as shown in particular for the promoter of the tobacco gene encoding a class I chitinase (Fukuda et al, Plant Mol. Biol., 24: 485-493, 1994).
  • GCC box also called JERE element (Jasmonic acid and Elicitor-Responsive Element) involved in both activation by elicitors and jasmonic acid was characterized in the promoter of the gene encoding strictosidine synthase from Catharanthus roseus ( Menke et al, EMBO J., 18: 4445-4463 1999).
  • the search for these elements in the tobacco LOX promoter sequence did not identify any GCC or E1RE boxes.
  • Three patterns similar to the ERE box can however be located upstream of the TATA box.
  • Example 2 Obtaining the PILOX fusion construct:; GUS
  • the PlLOX GUS construct was transferred by electroporation into Agrobacteria of strain LBA4404.
  • the recombinant bacteria obtained were then used for the infection of tobacco leaf discs, Nicotiana tabacum, lines 46.8 and 49.10 according to standard procedures (Horsch et al, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Académie Publishers, 1988).
  • the tobacco lines used are quasi-isogenic and are differentiated by the presence in line 46.8 of a locus of resistance to race 0 of Ppn.
  • the plants regenerated on a Murashige and Skoog (MS) medium containing 150 ⁇ g / ml of Kanamycin are placed in a culture chamber and then in a greenhouse to obtain the Tl seeds.
  • MS Murashige and Skoog
  • the presence of the LOX-uidA promoter expression cassette as well as the number of copies of the transgene in the genome of the regenerated plants were determined by DNA / DNA hybridization experiments (Southern). The results show that the primary transformants of line 46.8 contain from 1 to 5 copies of the transgene. Plants 46.8 having a low number of copies (single copy or two copies) were selected for the study of the LOX promoter. For these lines, the Tl seeds resulting from the self-fertilization of the primary transformants were put to germinate on selective medium and the plants obtained were used for the study of the activity of the promoter.
  • the activity of the PILOX promoter was characterized from three types of experiments involving: - infiltration of leaves with preparations of elicitors
  • the experiments were carried out with transgenic plants, of generation Tl, originating from independent lines and containing one or two copies of the transgene per genome.
  • Histo-chemical detection of GUS activity is carried out essentially according to the method described by Jefferson et al. (EMBO J., 6: 3901-3907, 1987). Tissues are removed from the transgenic plants and directly incubated at 37 ° C. in a 50 mM phosphate buffer, pH 7 containing 0.5 mM of ferro and ferri cyanide potassium salts, 1 mM of X-GLUC (Eurogentec); and 0.1% Triton X100.
  • the GUS activity assay is carried out according to the standard protocol (Jefferson et a,
  • the ⁇ -glucuronidase activity was analyzed in young germinations harvested at different stages of development.
  • Stage 1 5 days after sowing.
  • Germination starts with the exit of the radicle through the integuments. At this early stage, there is an intense limited coloration in a circular area around the radicle where it emerges from the seed coat. No coloration is detected elsewhere on the radicle.
  • the expression GUS is localized at the level of the collar but the internal tissues of the integuments, around the zone of exit of the radicle, also seem strongly colored.
  • Stage 2 7 days after sowing.
  • Stage 3 10 days after sowing.
  • GUS expression limited to the seeds is observed while the placenta and the vascular system are not colored.
  • Cross sections made from seeds collected in the green capsules show that the expression GUS is essentially localized at the level of the cotyledons of the embryo whereas no expression is detected at the level of the endosperm.
  • Histological analysis of glucuronidase activity made it possible to precisely locate the tissue profile of the activity of the PILOX promoter.
  • the expression GUS is detected in the cotyledons of the embryo, in the hypocotyle and the cotyledonary leaves during germination. GUS activity is also detected in the reproductive organs of the flower as well as in the petals.
  • LOXs are expressed during germination as well as in flowers or fruits. These LOXs are generally involved specifically in development and are involved in the growth and cell senescence processes. The expression of certain defense-related genes (Henning et al, Plant J., 4: 481-493, 1993) can however be detected in the flowers and in the seeds. In addition, Melan et al. (Plant Physiol., 105: 385-393, 1994) have shown that the _4tLOXl gene induced during pathogenesis is also transiently activated in the early stages of the germination of _4 seeds. thaliana. We can therefore think that the expression GUS visualized in organs essential for the survival and persistence of the plant is also in agreement with a role of defense and protection.
  • Elicitor infiltrations are carried out using a syringe without a needle on the underside of adult leaves of 8-week-old plants and cultivated in a culture chamber (photoperiod: 16 h day / 8 h night; temperature 25 ° C day / 22 ° C night; humidity 80%).
  • the GUS assays carried out from the elicited plants are carried out on samples composed of three leaf discs of 1 cm in diameter taken from the treated areas. Several samples are taken for each treatment.
  • the experiments were carried out with transgenic plants, of generation Tl, originating from independent lines and containing one or two copies of the transgene per genome.
  • Ppn elicitor Phytophthora parasitica nicotianae
  • a preparation of Ppn walls at 30 ⁇ g / ml is infiltrated on the abaxial surface of leaves of adult transgenic plants. Areas of approximately 10 cm 2 are infiltrated except for the search for systemic activation of the promoter for which half-leaves have been fully infiltrated. Total or partial necrosis of the infiltrated tissue is generally visible 24 to 48 hours after infiltration.
  • the histochemical study of the expression of the reporter gene 6 to 8 hours after infiltration shows that a strong GUS activity is visible in the infiltrated tissues. Analyzes carried out 12 and 24 hours after infiltration show that at this stage, the GUS coloration is no longer visible except around the periphery of the necrotic area. No induction of the reporter gene is detected in areas infiltrated with water or non-infiltrated.
  • a fluorometric assay of the ⁇ -glucuronidase activity was carried out from leaf discs taken from the infiltrated areas.
  • the results obtained relate to three independent lines of PlLOX :: GUS transgenic plants.
  • An early induction of the reporter gene is measured as early as 4 hours after treatment.
  • the maximum level of expression is reached between 12 and 24 hours after infiltration and corresponds to approximately 100 times the level measured in areas infiltrated with water.
  • the results obtained for plants belonging to the same line or to independent lines are different in terms of amplitude but all have the same general profile.
  • Infiltrations of the Ppn elicitor solution were also carried out on half of adult leaves.
  • the purpose of these experiments is to search for the remote activation of the PILOX promoter in the part of the untreated leaf as well as in the leaves of higher or lower rank.
  • the GUS activity assays were carried out 3 days and 7 days after treatment. An increase in GUS activity is detected 3 days after infiltration into untreated tissue close to the infiltrated area. The activity levels measured remain moderate and represent around 20% of the values generally measured in areas infiltrated by the elicitor. This activity in the proximal tissues decreases at 7 days while at the same stage a slight increase in GUS activity is measured in tissues distant from the infiltrated area but located on the same sheet. No induction of activity was detected in the untreated leaves of higher or lower rank.
  • the end of the syringe is pressed against the underside of the sheet until an impression is obtained. These traces become necrotic after the second or third day after treatment.
  • the GUS assays carried out on injured plants are carried out on samples composed of three leaf discs of 1 cm in diameter taken from the treated areas. Several samples are taken for each treatment.
  • the GUS activity assays are carried out using leaf discs taken from injured leaves 24 hours and 7 days after treatment. The data obtained show that under the conditions of the experiment the injury does not induce an increase in glucuronidase activity, although the injured areas appear necrotic.
  • EXAMPLE 8 Root Infection with Zoospores of Race 0 of Ppn Obtaining Zoospores
  • a pastille of Ppn race 0 mycelium previously cultivated on a synthetic medium (Keen, Science, 187: 74-75, 1975) is placed on an Agryl P17 canvas (Sodoca, France) placed in a V8 liquid medium, 5% (juice Campbell). After 4 days of culture at 25 ° C. the cloth on which the mycelium has grown is transferred to 1.5% agar. This transfer leads to a nutritional deficiency which will induce the formation of sporocysts in the fungus. After 4 days of culture at 25 ° C, the mycelium is covered with 10 ml of distilled water and transferred to 4 ° C for 30 minutes. This thermal shock causes the release of the zoospores which are recovered with the liquid and counted in a Thoma cell. Plant inoculation
  • Transgenic Tl generation plants grown in a culture chamber and 5 weeks old are removed and the roots are cleared of vermiculite.
  • the roots are then placed in a 2.5 ml tube containing a suspension of zoospores of race 0 of the fungus at 400,000 spores / ml.
  • the plants are placed in a culture chamber for the duration of the experiment.
  • Control plants, not inoculated are placed in distilled water.
  • the GUS activity in infected plants is measured independently on the leaf tissues collected above the collar and on the root-collar part. Measurement of GUS activity
  • the histo-chemical revelation of ⁇ -glucuronidase shows a strong induction of the reporter gene in the roots of inoculated plants.
  • GUS activity is visible in the roots from 5 hours after inoculation but the tissue coloration is more intense after 12 hours and 24 hours. Four to five days after inoculation, the GUS activity in the roots appears much lower. The results are shown in Figure 3. In the entire root bundle, only a few main roots are strongly colored. Several profiles are observed: certain roots develop a coloration over their entire length which seems to concern all cells. On other roots, intense activity is observed at the level of the root primordia as well as in the central cylinder. Intense GUS activity is also visible in the collar. The non-inoculated plants have an activity in the collar which is less intense than in the case of inoculation. The roots of uninoculated plants do not develop GUS staining.
  • the LOX promoter is not very active in the aerial organs. Glucuronidase expression was however detected on the old cotyledonary leaves, close to the collar and in the petioles of the first leaves.
  • the fluorometric assay of GUS activity in inoculated plant roots shows rapid induction, detectable 5 hours after inoculation with maximum expression between 12 hours and 24 hours. The expression then gradually decreases until 3 ⁇ eme day post-inoculation. In leaf tissue, taken above the collar, there is a smaller induction of GUS expression (about 10 times less than in root tissue) with maximum activity measured 48 hours after inoculation.
  • the PILOX promoter is induced more strongly during an incompatible interaction than during a compatible interaction
  • the induction of the promoter was quantified during a compatible or incompatible interaction.
  • transgenic plants (lines 5 and 9) were infected either with zoospores of race 0 of Ppn, (incompatible interaction), or with zoospores of race 1 (compatible interaction).
  • plants from both batches are harvested and used for fluorimetry measurements. From 3 hrs, a GUS activity is detected for the two types of interactions, greater than that detected in the controls not inoculated in plants of the line 5.
  • the time 8 h discriminates the two types of interactions: the specific activity measured in resistant plants is more important than that measured in sensitive plants. At 24 h it is twice as high. The specific activity in uninoculated plants remains almost zero. Similar results are obtained in plants of line 9.
  • Aliette is the commercial formulation of fosetyl-Al, a product used as a systemic fungicide, in particular against oomycete fungi.
  • Bion is the commercial formulation of BTH (benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester), a chemical analogue of salicylic acid which induces the acquisition of systemic resistance (SAR) in treated plants.
  • BTH benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester
  • SAR systemic resistance
  • the Tl transgenic seeds are sterilized and germinated on an MS agar medium containing 150 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the plants are harvested at 6 weeks after sowing and placed in Petri dishes containing an MS 0.1X liquid medium, pH 5.8, without sucrose and containing 0.001% of Triton X100. Concentrated solutions different molecules or products tested are then added to the medium to reach the following concentrations:
  • Methyl jasmonate (Aldrich): 200 ⁇ M, 500 ⁇ M and 1 mM
  • the dishes are sealed with Parafilm and placed in culture chambers for 24 hours before analysis of the GUS activity.
  • the GUS activity assays are carried out on samples corresponding to 3 plants collected.
  • Hydrogen peroxide was used to test the effect of a molecule involved in oxidative shock on the PILOX promoter.
  • the transgenic plants were treated with three concentrations of hydrogen peroxide (200 ⁇ M, 2 and 20 mM), with or without the presence of catalase (which detoxifies H 2 O 2 in planta). GUS activity is detected histochemically after 1 h or 4 h of treatment. Under these conditions, no inducing effect of hydrogen peroxide on the PILOX promoter has been demonstrated.
  • Treatment with phytosanitary products 200 ⁇ M, 2 and 20 mM
  • the LOX promoter is not induced by BION. Indeed, all of the experiments carried out on two transgenic lines indicate an average induction of activity by a factor of 1.5.

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Abstract

The invention concerns novel polynucleotides comprising a novel regulating sequence promoting a tobacco lipoxygenase gene inducible by an inducer and in particular in response to a stress by a pathogen. The invention also concerns an expression cassette comprising said regulating promoter sequence. The invention further concerns plant cells or plants transformed with said inventive polynucleotide or expression cassette.

Description

Promoteur inductible de lipoxy enase, cassettes d'expression le comprenant et plantes transformées Inducible lipoxy enase promoter, expression cassettes comprising it and transformed plants
La présente invention concerne des polynucleotides comprenant une nouvelle séquence de régulation promotrice inductible en réponse à une agression par un pathogène ou en réponse à un autre agent d'induction. La présente invention a également pour objet des cassettes d'expression et des vecteurs comprenant une séquence de régulation promotrice selon l'invention qui contrôle l'expression d'une séquence codante et notamment d'une séquence codante hétérologue, hétérologue signifiant ici une séquence codante différente de la séquence codante native. L'invention concerne également un organisme hôte et notamment des cellules végétales et des plantes transformées avec un polynucleotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.The present invention relates to polynucleotides comprising a novel promoter regulatory sequence inducible in response to aggression by a pathogen or in response to another inducing agent. The present invention also relates to expression cassettes and vectors comprising a promoter regulatory sequence according to the invention which controls the expression of a coding sequence and in particular of a heterologous coding sequence, heterologous meaning here a coding sequence different from the native coding sequence. The invention also relates to a host organism and in particular plant cells and plants transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
Les lipoxygenases (LOXs) de plantes sont impliquées dans des processus physiologiques variés et ces fonctions peuvent être assurées par différentes isoenzymes. Cette diversité dans les fonctions biologiques se traduit aussi par des mécanismes de régulation ainsi que des localisations tissulaires et subcellulaires différentes selon les isoformes. Un rôle important est attribué aux LOXs dans les réponses aux stress, en particulier la blessure, et les attaques parasitaires (Blée, Prog. Lipid Res., 1 :33-37, 1998). Une forte induction de l'expression de gènes LOX est ainsi mesurée dans de nombreuses plantes monocotylédones ou dicotylédones interagissant avec des bactéries, des virus ou des champignons, ainsi que suite à des blessures mécaniques ou causées par des insectes sur les feuilles. Un ADNc et un fragment génomique codant une LOX de tabac a été clone (Rancé, Thèse de Doctorat de l'Université de Paris XI, 1997; Véronési et al., Plant Physiol., 108:1342, 1995; GenbankX84040). Des expériences d'hybridation ADN/ARN (hybridation de type northern) ont montré que ce gène LOX s'exprime dans des cellules de tabac en culture consécutivement à l'application d'éliciteur et dans des plantes de tabac inoculées par le champignon Phytophthora parasitica nicotianae, Ppn (Véronési et al., Plant Physiol., 112:997-1004, 1996). Chez Arabidopsis thaliana , il existe au moins deux gènes codant des LOXs. Le gène _4tLOXl s'exprime de manière constitutive dans tous les organes de la plante avec des niveaux d'expression plus élevés dans les racines et dans les jeunes germinations (Melan et al, Plant Physiol., 101:441-450, 1993). Un forte induction de l'activité ^tLOXl est détectée consécutivement à l'infection par Pseudomonas syringae. Une accumulation différentielle des transcrits LOX est mise en évidence entre une interaction compatible ou incompatible. L'induction de l'expression du gène est en effet plus importante et plus précoce après inoculation par une souche avirulente. Par ailleurs il a été montré que l'expression du gène _4tLOXl était inductible après traitement par le MeJa (méthyl jasmonate) ou par l'acide abscissique. Un autre gène _4tLOX2, divergent au niveau de sa séquence peptidique (environ 40% de similarité avec les séquences protéiques d' Arabidopsis _4tLOXl et de tabac NtLOXl) et possédant une séquence d'adressage aux chloroplastes, est préférentiellement impliqué dans la synthèse d'acide jasmonique en réponse à la blessure (Bell et al, PΝAS, 92:8675-8679, 1995). Des ADN complémentaire codant des LOXs ont notamment été isolés chez la pomme de terre, la tomate, le riz, l'orge, le soja, le pois et le haricot.Plant lipoxygenases (LOXs) are involved in various physiological processes and these functions can be performed by different isoenzymes. This diversity in biological functions also results in regulatory mechanisms as well as different tissue and subcellular locations depending on the isoforms. An important role is attributed to LOXs in stress responses, in particular injury, and parasitic attacks (Blée, Prog. Lipid Res., 1: 33-37, 1998). A strong induction of expression of LOX genes is thus measured in many monocotyledonous or dicotyledonous plants interacting with bacteria, viruses or fungi, as well as following mechanical injuries or caused by insects on the leaves. A cDNA and a genomic fragment encoding a tobacco LOX has been cloned (Rancé, Doctoral Thesis of the University of Paris XI, 1997; Véronési et al., Plant Physiol., 108: 1342, 1995; GenbankX84040). DNA / RNA hybridization experiments (northern hybridization) have shown that this LOX gene is expressed in tobacco cells in culture following the application of elicitor and in tobacco plants inoculated with the fungus Phytophthora parasitica nicotianae, Ppn (Véronési et al., Plant Physiol., 112: 997-1004, 1996). In Arabidopsis thaliana, there are at least two genes encoding LOXs. The _4tLOXl gene is constitutively expressed in all plant organs with higher expression levels in the roots and in young germinations (Melan et al, Plant Physiol., 101: 441-450, 1993). Strong induction of ^ tLOXl activity is detected following infection with Pseudomonas syringae. A differential accumulation of LOX transcripts is highlighted between a compatible or incompatible interaction. The induction of gene expression is indeed greater and earlier after inoculation with an avirulent strain. Furthermore, it has been shown that the expression of the _4tLOXl gene was inducible after treatment with MeJa (methyl jasmonate) or with abscissic acid. Another _4tLOX2 gene, divergent in terms of its peptide sequence (approximately 40% similarity with the protein sequences of Arabidopsis _4tLOXl and of tobacco NtLOXl) and having a sequence of addressing to chloroplasts, is preferentially involved in the synthesis of acid. jasmonic in response to the injury (Bell et al, PΝAS, 92: 8675-8679, 1995). Complementary DNA coding for LOXs has been isolated in particular from potatoes, tomatoes, rice, barley, soybeans, peas and beans.
Cependant, un nombre restreint de gènes de LOXs spécifiquement impliquées dans les mécanismes de résistance des plantes ont été isolés. Par conséquent, le nombre de promoteurs de gènes LOX de plantes caractérisés est limité en regard des nombreux clones d' ADNc isolés. Le promoteur du gène _4tLOXl induit par la pathogénèse n'a pas été isolé et caractérisé et les promoteurs de gènes LOX isolés jusqu'à présent concernent des LOXs normalement exprimées dans les graines, au cours de la germination ou de la maturation des fruits. Rouster et al. ( Plant J., 11 :513-523, 1997) ont ainsi isolé le promoteur de la LOXl de l'orge, normalement active dans les germinations et dans les feuilles traitées par le MeJa. Le promoteur de la LOX2 du pois a aussi été clone et utilisé pour l'expression du gène rapporteur uidA dans des plantes de tabac transgéniques (Forster et al., Plant Mol. Biol., 26:235-248, 1994). Les résultats montrent des niveaux d'expression élevés dans les graines, les feuilles et les tiges. Le promoteur clone ne présente donc pas de spécificité tissulaire marquée alors que le gène de la LOX2 de pois est préférentiellement exprimé dans les graines. Les promoteurs de deux gènes LOX de la tomate qui s'expriment normalement au cours de la maturation des fruits ont aussi été isolés (Beaudoin et Rothstein, Plant Mol. Biol., 33:835-846, 1997). Des promoteurs LOX ayant une activité spécifique des mécanismes de défenses et de résistance des plantes n'ont pas encore été isolés et caractérisés.However, a limited number of LOXs genes specifically involved in the resistance mechanisms of plants have been isolated. Consequently, the number of promoters of LOX genes from characterized plants is limited compared with the numerous clones of cDNA isolated. The promoter of the _4tLOX1 gene induced by the pathogenesis has not been isolated and characterized and the promoters of LOX genes isolated so far relate to LOXs normally expressed in the seeds, during germination or ripening of the fruits. Rouster et al. (Plant J., 11: 513-523, 1997) have thus isolated the LOXl promoter from barley, normally active in germination and in leaves treated with MeJa. The pea LOX2 promoter has also been cloned and used for expression of the reporter gene uidA in transgenic tobacco plants (Forster et al., Plant Mol. Biol., 26: 235-248, 1994). The results show high levels of expression in seeds, leaves and stems. The cloned promoter therefore does not have any marked tissue specificity whereas the pea LOX2 gene is preferentially expressed in the seeds. Promoters of two LOX genes from tomatoes which are normally expressed during fruit ripening have also been isolated (Beaudoin and Rothstein, Plant Mol. Biol., 33: 835-846, 1997). LOX promoters with specific activity in plant defense and resistance mechanisms have not yet been isolated and characterized.
La présente invention concerne un promoteur de lipoxygenase 1 de tabac. Ce promoteur a un profil d'expression spécifique des mécanismes de défenses des plantes, il est activé en réponse à un agent inducteur et notamment en réponse à l'agression d'une plante par un agent pathogène.The present invention relates to a tobacco lipoxygenase 1 promoter. This promoter has a specific expression profile of the defense mechanisms of plants, it is activated in response to an inducing agent and in particular in response to the aggression of a plant by a pathogenic agent.
Description de la liste de séquencesDescription of the sequence list
SEQ ID NO.l : Promoteur de la lipoxy genase 1 de tabacSEQ ID NO.l: Promoter of tobacco lipoxy genase 1
SEQ ID NO. 2-3 : Amorces PCRSEQ ID NO. 2-3: PCR primers
Description de l'invention PolynucleotidesDescription of the Invention Polynucleotides
La présente invention concerne de nouveaux polynucleotides comprenant une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plantes.The present invention relates to novel polynucleotides comprising a promoter regulatory sequence functional in plants.
Par séquence de régulation promotrice, on entend selon l'invention la région non codante d'un gène impliquée dans la liaison avec l'ARN polymérase et avec d'autres facteurs qui sont responsables de l'initiation et de la régulation de la transcription conduisant à la production d'un transcrit d'ARN.By promoter regulatory sequence is meant according to the invention the non-coding region of a gene involved in the binding with RNA polymerase and with other factors which are responsible for the initiation and regulation of the transcription leading to to the production of an RNA transcript.
Selon la présente invention, on entend par "polynucleotide " une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucleotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Le termeAccording to the present invention, the term “polynucleotide” means a single-stranded nucleotide chain or its complement or a double-stranded nucleotide chain which may be of DNA or RNA type. Preferably, the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular double stranded DNA. The term
"polynucleotide" désigne également les oligonucléotides et les polynucleotides modifiés."polynucleotide" also refers to the modified oligonucleotides and polynucleotides.
Les polynucleotides de la présente invention sont isolés ou purifiés de leur environnement naturel. De préférence, les polynucleotides de la présente invention peuvent être préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989) ou par synthèse biochimique.The polynucleotides of the present invention are isolated or purified from their natural environment. Preferably, the polynucleotides of the present invention can be prepared by standard molecular biology techniques as described by Sambrook et al. (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) or by biochemical synthesis.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un polynucleotide comprenant une séquence de régulation promotrice de plante de la SEQ ID No.l. Dans un autre mode de réalisation, l'invention a également pour objet des polynucleotides comprenant un polynucleotide choisi parmi les polynucleotides suivants: a) un polynucleotide capable de s'hybrider de manière sélective au polynucleotide de la SEQ ID No.l; b) un polynucleotide homologue au polynucleotide de la SEQ ID No. 1.In a first embodiment, the invention relates to a polynucleotide comprising a plant promoter regulatory sequence of SEQ ID No. 1. In another embodiment, the invention also relates to polynucleotides comprising a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide capable of hybridizing selectively to the polynucleotide of SEQ ID No. 1; b) a polynucleotide homologous to the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
Par " homologue " on entend selon l'invention un polynucleotide présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence de référence. Ces modifications peuvent être des délétions, des additions ou des substitutions d'un ou plusieurs nucléotides de la séquence de référence. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence d'au moins 98% et plus préférentiellement d'au moins 99% par rapport à la séquence de référence. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al., J.Mol.Evol. 36:290-300, 1993; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215 :403-10, 1990). De préférence on utilisera les paramètres par défaut. L'invention concerne donc des polynucleotides comprenant des polynucleotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec le polynucleotide de la SEQ ID No. 1. De préférence l'invention concerne un polynucleotide comprenant un polynucleotide d'au moins 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 98% et plus préférentiellement au moins 99% d'homologie avec le polynucleotide de SEQ ID No. 1 . De préférence, les polynucleotides homologues à un polynucleotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.By "homologous" is meant according to the invention a polynucleotide having one or more sequence modifications compared to the reference sequence. These modifications can be deletions, additions or substitutions of one or more nucleotides of the reference sequence. Advantageously, the percentage of homology will be at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% by compared to the reference sequence. The methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art. One can use for example the PILEUP or BLAST programs (in particular Altschul et al., J. Mol.Evol. 36: 290-300, 1993; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215: 403-10, 1990) . Preferably we will use the default settings. The invention therefore relates to polynucleotides comprising polynucleotides having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% homology with the polynucleotide of SEQ ID No. 1. Preferably the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleotides having at least 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 98% and more preferably at least 99% of homology with the polynucleotide of SEQ ID No. 1. Preferably, polynucleotides homologous to a reference polynucleotide retain the function of the reference sequence.
Par " séquence capable de s'hybrider de manière sélective ", on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucleotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucleotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml denatured salmon sperm DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1%SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01%SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). L'invention concerne donc des polynucleotides comprenant un polynucleotide capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucleotide de la SEQ ID No. 1. De préférence, l'invention concerne un polynucleotide comprenant un polynucleotide d'au moins 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucléotides capable de s'hybrider de manière sélective avec le polynucleotide de la SEQ ID No. 1. De préférence, les polynucleotides s'hybridant de manière sélective à un polynucleotide de référence conservent la fonction de la séquence de référence.By "sequence capable of selective hybridization" is meant according to the invention the sequences which hybridize with the reference sequence at a level above the background noise significantly. The level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise. The stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art. In general, the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C. lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength. Typically the hybridization temperature is at least 30 ° C. for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C for a polynucleotide of more than 50 nucleotides. As an example, hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg / ml denatured salmon sperm DNA. The washes are for example carried out successively at low stringency in a 2X SSC buffer, 0.1% SDS, at medium stringency in a 0.5X SSC buffer, 01% SDS and at high stringency in a 0.1X SSC buffer, 0, 1% SDS. Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989). The invention therefore relates to polynucleotides comprising a polynucleotide capable of selectively hybridizing with the polynucleotide of SEQ ID No. 1. Preferably, the invention relates to a polynucleotide comprising a polynucleotide of at least 50, 100, 200 , 300, 400, 500, 1000 nucleotides capable of selectively hybridizing with the polynucleotide of SEQ ID No. 1. Preferably, the polynucleotides selectively hybridizing to a reference polynucleotide retain the function of the sequence reference.
Dans un troisième mode de réalisation, l'invention concerne un fragment biologiquement actif du polynucleotide selon la SEQ ID No. 1.In a third embodiment, the invention relates to a biologically active fragment of the polynucleotide according to SEQ ID No. 1.
Par "fragment biologiquement actif on entend ci-dessus un polynucleotide ayant une activité promotrice ou une activité de régulation de la transcription notamment en réponse à des agressions par un agent pathogène ou par un autre agent inducteur d'une réaction de défense des plantes.By “biologically active fragment” is meant above a polynucleotide having a promoter activity or a transcription regulation activity in particular in response to attacks by a pathogenic agent or by another agent inducing a defense reaction of plants.
Dans un mode de réalisation préféré, les polynucleotides de la présente invention comprennent au moins une boite CAAT (positions 2055-2059 de la SEQ ID No.l) et au moins une boite TATA (positions 2178-2185 de la SEQ ID No. 1). De préférence, les polynucleotides selon l'invention comprennent également des éléments régulateurs, en particulier au moins une boite G (positions 1989-1992, 1847-1850, 1636-1639, 1162- 1165, 1038-1041, 189-192, 67-70 de la SEQ ID No.l) et/ou au moins une boite ERE. Préférentiellement, les polynucleotides de la présente invention comprennent au moins un polynucleotide choisi parmi les polynucleotides suivants: a) un polynucleotide dont la séquence est comprise entre la position 1938 et la position 1945 de la SEQ ID No. 1; et b) un polynucleotide dont la séquence est comprise entre la position 576 et la position 584 de la SEQ ID No. 1; et c) un polynucleotide dont la séquence est comprise entre la position 513 et la position 520 de la SEQ ID No. 1. Dans un mode de réalisation préféré, les polynucleotides de la présente invention comprennent un polynucleotide dont la séquence est comprise entre la position 821 et la position 875 de la SEQ ID No.l.In a preferred embodiment, the polynucleotides of the present invention comprise at least one CAAT box (positions 2055-2059 of SEQ ID No. 1) and at least one TATA box (positions 2178-2185 of SEQ ID No. 1 ). Preferably, the polynucleotides according to the invention also comprise regulatory elements, in particular at least one G box (positions 1989-1992, 1847-1850, 1636-1639, 1162-1165, 1038-1041, 189-192, 67- 70 of SEQ ID No. 1) and / or at least one ERE box. Preferably, the polynucleotides of the present invention comprise at least one polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide whose sequence is between position 1938 and position 1945 of SEQ ID No. 1; and b) a polynucleotide whose sequence is between position 576 and position 584 of SEQ ID No. 1; and c) a polynucleotide whose sequence is between position 513 and position 520 of SEQ ID No. 1. In a preferred embodiment, the polynucleotides of the present invention comprise a polynucleotide whose sequence is between position 821 and position 875 of SEQ ID No.l.
Dans un mode de réalisation préfère, les polynucleotides de la présente invention ont une activité promotrice dans les plantes. Avantageusement, l'activité promotrice n'est pas détectée dans les plantes saines.In a preferred embodiment, the polynucleotides of the present invention have promoter activity in plants. Advantageously, the promoter activity is not detected in healthy plants.
Dans un mode de réalisation, les polynucleotides de la présente invention ont une activité promotrice dans certains organes des plantes saines importants pour la survie et la persistance de la plante. En particulier, l'activité promotrice des polynucleotides de la présente invention est détectée dans les cotylédons de l'embryon, dans l'hypocotyle et les feuilles cotylédonaires au cours de la germination, dans la région du collet et au niveau des pétioles des feuilles de plantes en croissance et de plantes adultes, ainsi que dans les organes reproducteurs de la fleur et dans les pétales de la fleur. Ce profil expression tissulaire dans des organes essentiels pour la survie et la persistance de la plante est en accord avec un rôle de défense et de protection. En particulier, l'activité est détectée dans les zones d'abcission des feuilles et des fleurs.In one embodiment, the polynucleotides of the present invention have promoter activity in certain healthy plant organs important for plant survival and persistence. In particular, the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is detected in the cotyledons of the embryo, in the hypocotyle and the cotyledonary leaves during germination, in the region of the collar and in the petioles of the leaves of growing plants and adult plants, as well as in the flower's reproductive organs and in the flower's petals. This tissue expression profile in organs essential for the survival and persistence of the plant is consistent with a role of defense and protection. In particular, activity is detected in the abscission zones of the leaves and flowers.
De préférence, les polynucleotides de la présente invention ont une activité promotrice et régulatrice de l'expression en relation avec les mécanismes de défense des plantes et avec la pathogénèse. Préférentiellement, cette activité promotrice est induite en réponse à un agent inducteur et notamment en réponse à une agression par un pathogène ou par un agent chimique. Par "agent inducteur" on entend tout agent chimique ainsi que tout agent produit par un pathogène susceptible de provoquer une réaction de défense des plantes. On citera notamment les éliciteurs chimiques ainsi que les éliciteurs d'agents pathogènes tels que les bactéries, les virus et les champignons. Par agent inducteur on entend également tout agent pathogène susceptible de provoquer une réaction de défense de la plante.Preferably, the polynucleotides of the present invention have an activity which promotes and regulates expression in relation to the defense mechanisms of plants and to pathogenesis. Preferably, this promoter activity is induced in response to an inducing agent and in particular in response to an attack by a pathogen or by a chemical agent. By "inducing agent" is meant any chemical agent as well as any agent produced by a pathogen capable of causing a defense reaction of plants. Mention will in particular be made of chemical elicitors as well as elicitors of pathogenic agents such as bacteria, viruses and fungi. By inducing agent is also meant any pathogenic agent capable of causing a defense reaction of the plant.
Avantageusement, l'activité promotrice des polynucleotides de la présente invention est induite consécutivement à des traitements éliciteurs, à l'agression par des agents pathogènes notamment bactérien, fongique ou viral, et en particulier par l'infection par Phytophthora. De préférence, cette induction est très précoce et est mesurable avant l'apparition des nécroses ou des symptômes. Préférentiellement, l'amplitiude d'induction est élevée, au niveau quantitatif on mesure, après 12 heures, une induction d'un facteur d'au moins 15, 25, 50, 75 et de préférence d'un facteur 100. De préférence, l'activité promotrice des polynucleotides de la présente invention est induite par des agents inducteurs, en particulier par le traitement par le MeJa (méthyle jasmonate), l'ACC (acide 1-aminocyclopropane-l carboxylique) et par les métaux lourds.Advantageously, the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is induced following eliciting treatments, to aggression by pathogenic agents, in particular bacterial, fungal or viral, and in particular by infection with Phytophthora. Preferably, this induction is very early and is measurable before the onset of necrosis or symptoms. Preferably, the induction amplitude is high, at the quantitative level, an induction of a factor of at least 15, 25, 50, 75 and preferably a factor of 100 is measured after 12 hours. Preferably, the promoter activity of the polynucleotides of the present invention is induced by inducing agents, in particular by treatment with MeJa (methyl jasmonate), ACC (1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid) and with heavy metals.
Avantageusement, l'activité promotrice des polynucleotides selon la présent invention est induite par le λ-carraghénane, un polysaccharide extrait d'algues rouges du genre Gigartina (Mercier et al., New Phytologist 149:43-51, 2001). Avantageusement, cette induction est obtenue par traitement des tissus foliaires par infiltration.Advantageously, the promoter activity of the polynucleotides according to the present invention is induced by λ-carrageenan, a polysaccharide extracted from red algae of the genus Gigartina (Mercier et al., New Phytologist 149: 43-51, 2001). Advantageously, this induction is obtained by treatment of the leaf tissue by infiltration.
Les techniques permettant d'évaluer l'activité promotrice d'un polynucleotide sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques impliquent classiquement l'utilisation d'un vecteur d'expression comprenant dans le sens de la transcription le polynucleotide à tester et un gène rapporteur (voir Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989). Cassettes d'expressionThe techniques for evaluating the promoter activity of a polynucleotide are well known to those skilled in the art. These techniques conventionally involve the use of an expression vector comprising, in the direction of transcription, the polynucleotide to be tested and a reporter gene (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Expression tapes
Selon un mode de réalisation de l'invention, les polynucleotides ayant une activité promotrice ou régulatrice selon l'invention sont insérés dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier. Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour un gène rapporteur ou un polypeptide d'intérêt. Les polynucleotides de la présente invention ayant une activité promotrice et/ou régulatrice de l'expression sont donc avantageusement utilisés pour exprimer un gène hétérologue dans un organisme hôte et notamment dans les cellules végétales ou dans les plantes. Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire un polypeptide par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. La présente invention a donc également pour objet des cassettes d'expression fonctionnelles dans les cellules végétales ou les plantes comprenant dans le sens de la transcription, une séquence de régulation promotrice en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', danslaquelle la séquence de régulation promotrice en 5' comprend un polynucleotide choisi parmi les polynucleotides suivants: a) un polynucleotide comprenant une séquence de régulation promotrice de plante caractérisé en ce qu'il comprend le polynucleotide de la SEQ ID No. 1; et b) un polynucleotide capable de s'hybrider de manière sélective au polynucleotide de la SEQ ID No.l; et c) un polynucleotide homologue au polynucleotide de la SEQ ID No. 1; et d) un polynucleotide selon b) ou c) ayant une activité promotrice dans les cellules végétales et les plantes; e) un polynucleotide selon b), c) ou d) dont l'activité promotrice est induite en réponse à un agent inducteur et notamment en réponse à une agression par un pathogène.According to one embodiment of the invention, the polynucleotides having a promoter or regulatory activity according to the invention are inserted into an expression cassette using cloning techniques well known to those skilled in the art. This expression cassette comprises the elements necessary for the transcription and translation of the sequences coding for a reporter gene or a polypeptide of interest. The polynucleotides of the present invention having promoter and / or expression regulating activity are therefore advantageously used to express a heterologous gene in a host organism and in particular in plant cells or in plants. Advantageously, this expression cassette comprises both elements making it possible to produce a polypeptide by a host cell and elements necessary for the regulation of this expression. The present invention therefore also relates to functional expression cassettes in plant cells or plants comprising, in the direction of transcription, a 5 ′ promoter regulatory sequence, a coding sequence and a 3 ′ regulatory sequence, in which the 5 'promoter regulatory sequence comprises a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide comprising a plant promoter regulatory sequence characterized in that it comprises the polynucleotide of SEQ ID No. 1; and b) a polynucleotide capable of selectively hybridizing to the polynucleotide of SEQ ID No. 1; and c) a polynucleotide homologous to the polynucleotide of SEQ ID No. 1; and d) a polynucleotide according to b) or c) having promoter activity in plant cells and plants; e) a polynucleotide according to b), c) or d), the promoter activity of which is induced in response to an inducing agent and in particular in response to aggression by a pathogen.
Tout gène d'intérêt peut être exprimé dans un organisme hôte sous le contrôle d'un promoteur selon l'invention. De préférence, les polynucleotides selon la présente invention ayant une activité promotrice sont utilisés pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cellule de plante ou dans une plante. Avantageusement, la séquence codante comprend une séquence codant pour un gène rapporteur ou une séquence codant pour une protéine ou un polypeptide d'intérêt. Parmi les gènes rapporteurs on citera notamment les gènes rapporteurs GUS (β- glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase) ou β-galactosidase (lacZ). De préférence, la protéine d'intérêt est une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes.Any gene of interest can be expressed in a host organism under the control of a promoter according to the invention. Preferably, the polynucleotides according to the present invention having promoter activity are used for the expression of a heterologous gene in plant cells or in a plant. Advantageously, the coding sequence comprises a sequence coding for a reporter gene or a sequence coding for a protein or a polypeptide of interest. Among the reporter genes, mention will be made in particular of the reporter genes GUS (β-glucuronidase), GFP (green fluorescent protein), LUC (luciferase), CAT (chloramphenicol transferase) or β-galactosidase (lacZ). Preferably, the protein of interest is a protein which confers on plants properties of resistance to diseases or insects.
Dans un mode de réalisation préféré, la protéine d'intérêt est choisi parmi les éliciteurs fongiques ou les peptides lytiques.In a preferred embodiment, the protein of interest is chosen from fungal elicitors or lytic peptides.
Au regard du mode d'induction du promoteur selon l'invention, la protéine d'intérêt est avantageusement une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies et aux pathogènes.With regard to the mode of induction of the promoter according to the invention, the protein of interest is advantageously a protein which confers on plants properties of resistance to diseases and pathogens.
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).Among the proteins or peptides of interest which confer new disease resistance properties, mention will be made in particular of chitinases, glucanases, oxalate oxidase, all these proteins and their coding sequences being widely described in the literature, or even antibacterial peptides and / or antifungals, in particular peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly lytic peptides of all origins comprising one or more disulfide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides: androctonine (WO 97/30082 and PCT / FR98 / 01814, deposited on August 18, 1998) or drosomicine (PCT / FR98 / 01462, deposited on July 8, 1998).
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun et al., Mol. Plant microb. Internet, 6:15-25, 1993 ; Panabières et al., Mol. Plant Microb. Internet, 8, 1995).According to a preferred embodiment of the invention, the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun et al., Mol. Plant microb. Internet, 6: 15-25, 1993 ; Panabières et al., Mol. Plant Microb. Internet, 8, 1995).
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).Among the proteins of interest conferring new insect resistance properties, there will be mentioned more particularly the Bt proteins widely described in the literature and well known to those skilled in the art. Mention will also be made of proteins extracted from bacteria such as Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression du gène d'intérêt, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant l'adressage du polypeptide d'intérêt.The expression cassettes according to the present invention can also include any other sequence necessary for the expression of the gene of interest, such as for example regulatory elements or signal sequences allowing the addressing of the polypeptide of interest.
Les techniques de construction de ces cassettes d'expression sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989).The construction techniques of these expression cassettes are widely described in the literature (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989).
Certains éléments des cassettes d'expression selon l'invention sont illustrés ci- dessous à titre non limitatif.Certain elements of the expression cassettes according to the invention are illustrated below without implied limitation.
Comme séquence de régulation en 5', on peut utiliser les polynucleotides selon l'invention seuls ou associés à au moins une partie d'un promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).As a 5 ′ regulatory sequence, the polynucleotides according to the invention can be used alone or associated with at least part of a promoter of a gene expressing itself naturally in plants, in particular a promoter expressing in particular in plant leaves, such as promoters known as constitutive of bacterial, viral or plant origin or also light dependent promoters such as that of a gene for the small subunit of plant ribulose- biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) or any known suitable promoter that can be used. Among the promoters of plant origin, mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876). Among the promoters of a plant virus gene, there may be mentioned that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the circovirus promoter (AU 689 311).
On peut encore utiliser les polynucleotides selon l'invention en association avec au moins une partie d'un promoteur spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ( Datla, R. et al., Biotechnology Ann. Rev., 3:269-296, 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460) ou de l'oélosine (WO 98/45461).The polynucleotides according to the invention can also be used in combination with at least part of a promoter specific for regions or specific tissues of plants, and more particularly promoters specific for seeds (Datla, R. et al., Biotechnology Ann. Rev., 3: 269-296, 1997), in particular the promoters of napine (EP 255 378), of phaseoline, of glutenin, of heliantinin (WO 92/17580), of albumin (WO 98/45460) or of oelosin (WO 98 / 45461).
Dans les cassettes d'expression de la présente invention on peut utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans ladite cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Parmi les séquences leader dérivées de virus on citera par exemple l'activateur du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou l'activateur du virus etch du tabac (TEV). Différentes séquences dérivées d'introns de plantes peuvent également être utilisées pour augmenter le niveau d'expression du gène d'intérêt notamment chez les plantes monocotylédones. On citera par exemple l'intron I du gène de mais AdhI (Callis et al., Gènes Develop., 1:1183-1200, 1987).In the expression cassettes of the present invention, any regulatory sequence can be used which makes it possible to increase the level of expression of the coding sequence inserted in said expression cassette. According to the invention, it is possible in particular to use, in association with the promoter regulatory sequence, other regulatory sequences which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators ("enhancer"). Among the leader sequences derived from viruses, mention will be made, for example, of the activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or the activator of the tobacco etch virus (TEV). Different sequences derived from plant introns can also be used to increase the level of expression of the gene of interest, especially in monocotyledonous plants. Mention will be made, for example, of the intron I of the corn gene AdhI (Callis et al., Genes Develop., 1: 1183-1200, 1987).
Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention. Ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes on peut notamment utiliser le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore des séquences terminatrices d'origine végétale, comme par exemple le terminateur d'histone (voir EP 0 633 317), le terminateur CaMV 35 S et le terminateur tml. Ces séquences terminatrices sont utilisables dans les plantes monocotylédones et dicotylédones.A wide variety of terminator sequences can be used in the expression cassettes according to the invention. These sequences allow the termination of transcription and polyadenylation of the mRNA. Any terminator sequence functional in the selected host organism can be used. For expression in plants, it is possible in particular to use the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or alternatively terminator sequences of plant origin, such as for example the histone terminator (see EP 0 633 317), the terminator CaMV 35 S and the tml terminator. These terminator sequences are usable in monocotyledonous and dicotyledonous plants.
La présente invention a également pour objet un polynucleotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention et notamment un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur pour leur réplication ou pour la transformation d'un organisme hôte.The present invention also relates to a polynucleotide comprising an expression cassette according to the invention and in particular a vector comprising an expression cassette according to the invention. Advantageously, the expression cassettes according to the present invention are inserted into a vector for their replication or for the transformation of a host organism.
Vecteurs La présente invention concerne également des vecteurs de transformation ou d'expression comprenant au moins un polynucleotide ou une cassette d'expression selon la présente invention. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte et pour exprimer un polypeptide d'intérêt dans ledit organisme hôte. L'organisme hôte est par exemple une bactérie, une levure, un champignon, une cellule de plante ou une plante. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucleotide ou une cassette d'expression selon l'invention. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte afin d'induire l'expression d'un polynucleotide ou d'un polypeptide peut être utilisé.vectors The present invention also relates to transformation or expression vectors comprising at least one polynucleotide or an expression cassette according to the present invention. The vectors of the present invention are used in particular for transforming a host organism and for expressing a polypeptide of interest in said host organism. The host organism is for example a bacterium, a yeast, a fungus, a plant cell or a plant. This vector can in particular consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus in which a polynucleotide or an expression cassette according to the invention is inserted. In general, any vector capable of being maintained, self-replicating or propagating in a host cell in order to induce the expression of a polynucleotide or a polypeptide can be used.
Les techniques de construction de ces vecteurs et les techniques d'insertion d'une séquence appropriée dans ces vecteurs sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Labratory Manual, 1989). Avantageusement, les vecteurs selon l'invention comprennent au moins une origine de réplication. De manière préférée, les vecteurs de l'invention comprennent également au moins un marqueur de sélection et de préférence un marqueur de sélection utilisable dans les cellules végétales ou dans les plantes. Parmi les marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que le gène nptll pour la résistance à la kanamycine (Bevan et al., Nature 304:184-187, 1983) et le gène hph pour la résistance à l'hygromycine (Gritz et al., Gène 25:179-188, 1983). On citera également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyophosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On pourra également utiliser les gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS ou des gènes codant pour des pigments et des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.The techniques for constructing these vectors and the techniques for inserting an appropriate sequence into these vectors are widely described in the literature (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989). Advantageously, the vectors according to the invention comprise at least one origin of replication. Preferably, the vectors of the invention also comprise at least one selection marker and preferably a selection marker usable in plant cells or in plants. Among the selection markers, there may be mentioned antibiotic resistance genes such as the npt11 gene for resistance to kanamycin (Bevan et al., Nature 304: 184-187, 1983) and the hph gene for resistance to hygromycin (Gritz et al., Gene 25: 179-188, 1983). We will also mention the herbicide tolerance genes such as the bar gene (White et al., NAR 18: 1062, 1990) for bialaphos tolerance, the EPSPS gene (US 5,188,642) for glyophosate tolerance or the HPPD gene. (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. It will also be possible to use the genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS or genes coding for pigments and enzymes regulating the production of pigments in the transformed cells. Such selection marker genes are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
Avantageusement, ces vecteurs sont utilisés pour la transformation d'un organisme hôte. L'homme du métier choisira les vecteurs de transformation appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.Advantageously, these vectors are used for the transformation of a host organism. Those skilled in the art will choose the appropriate transformation vectors in particular according to the host organism to be transformed and according to the transformation technique implemented.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.For the transformation of plant cells or plants, it will in particular be a virus which can be used for the transformation of developed plants and which additionally contains its own elements of replication and expression. Preferably, the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
De nombreux vecteurs ont été développés pour la transformation des plantes avec Agrobacterium tumefaciens. D'autres vecteurs sont utilisés pour les techniques de transformation ne reposant pas sur l'utilisation d Agrobacterium. Ces vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. TransformationMany vectors have been developed for the transformation of plants with Agrobacterium tumefaciens. Other vectors are used for transformation techniques not based on the use of Agrobacterium. These vectors are well known to those skilled in the art and widely described in the literature. Transformation
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales avec un polynucleotide, une cassette d'expression ou un vecteur de transformation ou d'expression selon l'invention.The subject of the invention is also a method of transforming host organisms, in particular plant cells with a polynucleotide, an expression cassette or a transformation or expression vector according to the invention.
L'invention concerne également un procédé de transformation des cellules végétales dans lequel on intègre dans le génome des dites cellules végétales au moins un polynucleotide, une cassette d'expression et/ou ou un vecteur selon l'invention. Selon la présente invention la transformation de l'organisme hôte peut être obtenue par tout moyen connu approprié, les techniques de transformation et notamment de transformation des plantes sont amplement décrites dans la littérature spécialisée. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674725, WO 91/02071 et WO 95/06128.The invention also relates to a process for transforming plant cells in which at least one polynucleotide, an expression cassette and / or a vector according to the invention is integrated into the genome of said plant cells. According to the present invention, the transformation of the host organism can be obtained by any suitable known means, the techniques of transformation and in particular of transformation of plants are amply described in the specialized literature. For the processes of transformation of plant cells and regeneration of plants, the following patents and patent applications may be mentioned in particular: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752 , US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253,175 EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
Certaines techniques utilisent Agrobacterium notamment pour la transformation des dicotylédones. Une série de méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes consistent à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. D'autres méthodes peuvent également être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.Certain techniques use Agrobacterium in particular for the transformation of dicotyledons. A series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes. Other methods include bombarding cells, protoplasts, or tissue with particles to which DNA sequences are hung. Other methods can also be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism, in particular the plant cell or the plant.
La présente invention a également pour objet des cellules végétales et des plantes obtenus par les procédés de transformation décrits ci-dessus. Organismes hôtesThe present invention also relates to plant cells and plants obtained by the transformation methods described above. Host organizations
La présente invention concerne également un organisme hôte transformé avec un polynucleotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention.The present invention also relates to a host organism transformed with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the invention.
Par organisme hôte, on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les cellules végétales et les plantes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli, les levures sont choisies parmi Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisae, les champignons sont choisis parmi Aspergillus niger. De manière préférentielle, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante.By host organism is meant in particular according to the invention any mono or multicellular organism, lower or higher, in particular chosen from bacteria, yeasts, fungi or plant cells and plants. Advantageously, the bacteria are chosen from Escherichia coli, the yeasts are chosen from Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisae, the fungi are chosen from Aspergillus niger. Preferably, the host organism is a plant cell or a plant.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet des cellules végétales transformées ou des plantes transformées comprenant au moins un polynucleotide, une cassette d'expression et/ou un vecteur selon l'invention..In a preferred embodiment, the invention relates to transformed plant cells or transformed plants comprising at least one polynucleotide, an expression cassette and / or a vector according to the invention.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences. On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton,, le tournesol, le trèfle etc.By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds. The term "plant" according to the invention means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, l barley, sorghum, rapeseed, soybeans, rice, sugar cane, beet, tobacco, cotton, sunflower, clover etc.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide, un polypeptide ou une protéine d'intérêt. Le polynucleotide comprenant un polynucleotide selon l'invention et le ou les autres gènes hétérologues peuvent avoir été introduits dans l'organisme hôte simultanément au moyen d'un même vecteur les comprenant, ou au moyen de plusieurs vecteurs, ou de manière séquentielle au moyen de plusieurs vecteurs, ou encore par croisement de plusieurs organismes hôtes, chacun comprenant un gène hétérologue.According to a particular embodiment of the invention, the host organism comprises at least one other heterologous gene coding for a peptide, a polypeptide or a protein of interest. The polynucleotide comprising a polynucleotide according to the invention and the other heterologous gene (s) may have been introduced into the host organism simultaneously by means of the same vector comprising them, or using several vectors, or sequentially using several vectors, or alternatively by crossing several host organisms, each comprising a heterologous gene.
Par gène hétérologue, on entend selon l'invention tout gène introduit de manière artificielle dans l'organisme hôte, et plus particulièrement intégré de manière artificielle dans son génome, les méthodes permettant cette introduction ou intégration pouvant être celles décrites précédemment.By heterologous gene is meant according to the invention any gene introduced artificially into the host organism, and more particularly artificially integrated into its genome, the methods allowing this introduction or integration possibly being those described above.
Les plantes transformées selon l'invention peuvent ainsi contenir d'autres gènes d'intérêt, conférant aux plantes de nouvelles propriétés agronomiques. Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une tolérance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies . De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128. On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828; WO 92/14822 Ces autres gènes d'intérêt peuvent être combinés au gène chimère selon l'invention soit par croisement conventionnel de deux plantes contenant chacune l'un des gènes (la première le gène chimère selon l'invention et la seconde le gène codant pour la protéine d'intérêt) soit en effectuant la transformation de cellules végétales d'une plante contenant le gène codant pour la protéine d'intérêt avec le gène chimère selon l'invention.The plants transformed according to the invention can thus contain other genes of interest, conferring on plants new agronomic properties. Among the genes conferring new agronomic properties on transformed plants, there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring tolerance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases. Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and WO 95/06128. Mention may also be made of the genes modifying the constitution of the modified plants, in particular the content and quality of certain essential fatty acids (EP 666 918) or also the content and quality of proteins, in particular in the leaves and / or seeds. of said plants. Mention will in particular be made of the genes coding for proteins enriched in sulfur amino acids (WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822 These other genes of interest can be combined with chimeric gene according to the invention either by conventional crossing of two plants each containing one of the genes (the first the chimeric gene according to the invention and the second the gene coding for the protein of interest) or by carrying out the transformation of cells plants of a plant containing the gene coding for the protein of interest with the chimeric gene according to the invention.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées et leur descendance. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus.The present invention also relates to plants containing transformed cells as defined above, in particular plants regenerated from the transformed cells and their progeny. The regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
La présente invention concerne aussi les plantes génétiquement modifiées dans le génome desquelles un polynucleotide ou une cassette d'expression selon l'invention sont intégrés de manière stable et transmissible par reproduction sexuée. La présente invention concerne également des plantes obtenues par croisement des plantes régénérées ci-dessus avec d'autres plantes. Elle concerne aussi les graines de plantes transformées.The present invention also relates to genetically modified plants in the genome of which a polynucleotide or an expression cassette according to the invention are stably integrated and transmissible by sexual reproduction. The present invention also relates to plants obtained by crossing the regenerated plants above with other plants. It also relates to the seeds of transformed plants.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.The examples below illustrate the invention, without however seeking to limit its scope.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al. ou dans Sambrook et al 1989.All the methods or operations described below in these examples are given by way of examples and correspond to a choice made from among the different methods available to achieve the same result. This choice does not affect the quality of the result and therefore, any suitable method can be used by those skilled in the art to achieve the same result. Most of the methods for engineering DNA fragments are described in "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and 2, Ausubel F.M. et al. or in Sambrook et al 1989.
Description des figuresDescription of the figures
Figure 1: Activité glucuronidase des plantes PILOX après infiltration d'eliciteur de Ppn, dans la zone infiltrée. A: L'activité enzymatique a été dosée (en pmol MU/h/μg prot) dans des disques foliaires prélevés dans des zones infiltrées par l'éliciteur Ppn, aux temps indiqués (4, 8, 12, 24 heures). Les mesures ont été effectuées pour 3 plantes d'une même lignée transgénique (1, 2, 3). Deux contrôles ont été réalisés sur des plantes après infiltration d'eau (4) et sur des plantes témoins sans infiltration (5). B: L'activité enzymatique a été dosée (en pmol MU/h/μg prot) dans des disques foliaires prélevés dans des zones infiltrées par l'éliciteur Ppn, aux temps indiqués (4, 8, 12, 24 heures). Les mesures ont été effectuées pour 3 lignées transgéniques différentes (l-.lignée 4, 2: lignée 5, 3: lignéel3).Figure 1: Glucuronidase activity of PILOX plants after infiltration of Ppn elicitor, in the infiltrated area. A: The enzymatic activity was assayed (in pmol MU / h / μg prot) in leaf discs taken from areas infiltrated by the Ppn elicitor, at the times indicated (4, 8, 12, 24 hours). The measurements were carried out for 3 plants of the same transgenic line (1, 2, 3). Two controls were carried out on plants after water infiltration (4) and on control plants without infiltration (5). B: The enzymatic activity was assayed (in pmol MU / h / μg prot) in leaf discs taken from areas infiltrated by the Ppn elicitor, at the times indicated (4, 8, 12, 24 hours). The measurements were carried out for 3 different transgenic lines (l-.line 4, 2: line 5, 3: line3).
Figure 2: Activité glucuronidase des plantes PILOX après infiltration d'eliciteur de Ppn, à distance de la zone infiltrée.Figure 2: Glucuronidase activity of PILOX plants after infiltration of Ppn elicitor, away from the infiltrated area.
L'activité enzymatique a été dosée (en pmol MU/h/μg prot) dans des disques foliaires prélevés dans la moitié non infiltrée de feuilles traitées par éliciteur de Ppn, aux temps indiqués (0, 3, 7 jours). La croix indique la mort des tissus dans la zone infiltrée. Des disques foliaires ont été prélevés dans la zone infiltrée (1), dans la zone proche (2), dans la zone éloignée (3) et dans une feuille supérieure (4).The enzymatic activity was assayed (in pmol MU / h / μg prot) in leaf discs taken from the non-infiltrated half of leaves treated with Ppn elicitor, at the times indicated (0, 3, 7 days). The cross indicates the death of the tissue in the infiltrated area. Leaf discs were taken from the infiltrated area (1), the near area (2), the far area (3) and from an upper leaf (4).
Figure 3: Activité glucuronidase dans les plantes PILOX inoculées par Ppn race 0.Figure 3: Glucuronidase activity in PILOX plants inoculated with Ppn race 0.
L'activité glucuronidase a été mesurée (en pmol MU/h/μg prot) dans les racines de plantes inoculées, aux temps indiqués (5, 12, 24, 48 heures et 3 jours). La lignée 5 a été inoculée avec de l'eau (2) et avec Ppn race 0 (1). La lignée 21 a été inoculée avec de l'eau (4) et avec Ppn race 0 (3).The glucuronidase activity was measured (in pmol MU / h / μg prot) in the roots of inoculated plants, at the times indicated (5, 12, 24, 48 hours and 3 days). Line 5 was inoculated with water (2) and with Ppn race 0 (1). Line 21 was inoculated with water (4) and with Ppn race 0 (3).
Figure 4: Effet du MeJa (méthyl jasmonate) sur l'activité glucuronidase des plantes PILOX.Figure 4: Effect of MeJa (methyl jasmonate) on the glucuronidase activity of PILOX plants.
L'activité glucuronidase a été mesurée dans les plantes 24 heures après traitement par le MeJa (250μM). Pour chaque mesure, l'activité spécifique des plantes traitées a été rapportée à celle de plantes témoin traitées avec de l'éthanol, témoins auxquels la valeur 1 a été attribuée. Les histogrammes représentent l'activité spécifique rapporté à celle des témoins. Les mesures réalisées sur trois lignées de plantes PILOX sont représentées (lignées 5, 9 et 13). Deux essais (1) et (2) ont été réalisés pour chaque lignée.The glucuronidase activity was measured in plants 24 hours after treatment with MeJa (250 μM). For each measurement, the specific activity of the treated plants was compared to that of control plants treated with ethanol, controls to which the value 1 was assigned. The histograms represent the specific activity compared to that of the controls. The measurements carried out on three lines of PILOX plants are shown (lines 5, 9 and 13). Two tests (1) and (2) were carried out for each line.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1; Obtention d'un clone génomique de tabac renfermant la région promotrice du gène LOX induit par la pathogenèse Description des sondes utilisées TL-J2 est un ADN complémentaire de 2888 pb, correspondant à un gène de LOX de tabac induit par la pathogenèse. L'obtention de cet ADN complémentaire est décrite par Véronési et al. (Plant Physiol., 108:1342, 1995), sa séquence est déposée dans GenBank sous le numéro d'accession X84040. Un fragment EcoRl de 1409 pb, correspondant aux nucléotides 1222 à 2630 de TL-J2, nommé TL-35, a également été utilisé. Description de la banque génomique de tabac utiliséeExample 1; Obtaining a tobacco genomic clone containing the promoter region of the pathogenesis-induced LOX gene Description of the probes used TL-J2 is a complementary DNA of 2888 bp, corresponding to a pathogen-induced tobacco LOX gene. Obtaining this complementary DNA is described by Véronési et al. (Plant Physiol., 108: 1342, 1995), its sequence is deposited in GenBank under the accession number X84040. An EcoRI fragment of 1409 bp, corresponding to nucleotides 1222 to 2630 of TL-J2, called TL-35, was also used. Description of the tobacco genomic bank used
La banque génomique de tabac a été acquise auprès de la société Clontech (4030 Fabian Way, Palo Alto, CA 94303-4607, USA, référence du produit FL1071d). Il s'agit d'une banque réalisée par digestion partielle par l'enzyme Mbol d'ADN isolé de plantes de tabac Nicotiana tabacum, cv. Xanthi-nc, récoltées 30 jours après émergence, puis sélection de fragments d'une taille comprise entre 8 et 22kb et insertion des fragments obtenus au site BamUl du vecteur EMBL3. Clones génomiques LOX de tabac Le criblage de la banque de tabac à l'aide de l'ADN complémentaire TL-35 a conduit à l'isolement et à la purification d'un clone de bactériophage nommé Al, présentant une forte hybridation à la sonde TL-35. Une étape de sous-clonage de l'ADN phagique a permis d'isoler et de séquencer des fragments du clone Al qui s'hybridaient à la sonde LOX. L'analyse des séquences obtenues a montré que l'insert Al renfermait la partie 3' terminale du gène NtLOXl, et en particulier les nucléotides 260 à 2888 de 1' ADΝC TL-J2 répartis en 8 exons séparés par 7 introns. L'obtention d'un deuxième clone génomique de tabac chevauchant avec le clone Al et renfermant la région 5' terminale du gène NtLOXl, est décrite dans la thèse de Doctorat de l'Université de Paris XI- Orsay de Iann Rancé (1997, pages 46 à 48). Ce clone a été nommé 2A5. Le séquençage partiel de l'ADN phagique a montré que le clone 2A5 contenait les nucléotides 1 à 259 de l' ADNc TL-J2, soit la région non traduite de l'extrémité 5' terminale du gène et la totalité de l'exon 1. L'insert 2A5 est chevauchant avec le clone Al sur 2557 nt, qui correspondent aux nucléotides 297 à 2853 de la séquence de l'intron 1 (d'une taille totale de 3798 pb). Une région de 2330 pb contenant l'extrémité 5' terminale du gène LOX et les régions en amont a été séquencée et dénommée PILOX. La séquence de ce fragment est présentée dans la SEQ ID No. 1. Isolement d'un fragment promoteurThe tobacco genomic bank was acquired from the company Clontech (4030 Fabian Way, Palo Alto, CA 94303-4607, USA, product reference FL1071d). This is a library produced by partial digestion with the DNA enzyme Mbol isolated from plants tobacco Nicotiana tabacum, cv. Xanthi-nc, harvested 30 days after emergence, then selection of fragments of a size between 8 and 22 kb and insertion of the fragments obtained at the BamUL site of the EMBL3 vector. Tobacco LOX genomic clones Screening of the tobacco library using complementary DNA TL-35 led to the isolation and purification of a bacteriophage clone named Al, exhibiting strong probe hybridization TL-35. A step of subcloning the phage DNA made it possible to isolate and sequence fragments of the clone A1 which hybridized to the LOX probe. Analysis of the sequences obtained has shown that the insert A1 contains the 3 'terminal part of the NtLOX1 gene, and in particular the nucleotides 260 to 2888 of the ADΝC TL-J2 divided into 8 exons separated by 7 introns. The obtaining of a second genomic tobacco clone overlapping with the clone Al and containing the 5 'terminal region of the NtLOXl gene, is described in the doctoral thesis of the University of Paris XI-Orsay by Iann Rancé (1997, pages 46 to 48). This clone was named 2A5. Partial sequencing of phage DNA showed that clone 2A5 contained nucleotides 1 to 259 of TL-J2 cDNA, the untranslated region of the 5 'terminal end of the gene and all of exon 1 The insert 2A5 overlaps with the clone Al on 2557 nt, which correspond to nucleotides 297 to 2853 of the sequence of intron 1 (with a total size of 3798 bp). A 2330 bp region containing the 5 'terminus of the LOX gene and the upstream regions has been sequenced and designated as PILOX. The sequence of this fragment is presented in SEQ ID No. 1. Isolation of a promoter fragment
Le fragment d'ADN PILOX de 2330 pb contenant les nucléotides 728 à 3047 du clone génomique 2A5 a été isolé par amplification en chaîne (PCR). Ce fragment contient la boîte TATA putative et environ 2.2 kb de séquence en amont qui incluent potentiellement la majorité des éléments cz's-régulateurs. La région 3' terminale du fragment contient les 88 nucléotides de la région leader de l'ARN LOX, le codon initiateur ATG de la traduction du gène LOX ainsi que les nucléotides codant pour les 6 premiers acides aminés de la LOX de tabac. Les séquences des deux amorces utilisées dans la réaction PCR sont indiquées ci-dessous et il faut noter l'insertion du site Xbal dans l'amorce sens et du site Smal dans l'amorce anti-sens (caractères soulignés). Amorce Sens: 5* CCC TTT CTA GAC CAT TTA TTT CCC 3' Amorce Anti-Sens: 5' CTG TGA TTC CCG GGA CAA TCT TCT 3' La réaction d'amplification contenait 300 ng d'ADN phagique du clone 2A5, 25 picomoles de chacune des deux amorces, 200 μM dNTP et 1 unité de Vent polymérase (New England) et son tampon de réaction. L'amplification s'est déroulée sur 20 cycles et la séquence du fragment obtenu a été vérifiée. Analyse de la séquence du fragment cloneThe 2330 bp PILOX DNA fragment containing the nucleotides 728 to 3047 of the genomic clone 2A5 was isolated by chain amplification (PCR). This fragment contains the putative TATA box and approximately 2.2 kb of upstream sequence which potentially includes the majority of the cz ' s regulatory elements. The 3 ′ terminal region of the fragment contains the 88 nucleotides of the leader region of the LOX RNA, the ATG initiator codon for the translation of the LOX gene as well as the nucleotides coding for the first 6 amino acids of LOX from tobacco. The sequences of the two primers used in the PCR reaction are indicated below and note the insertion of the Xbal site in the sense primer and of the Smal site in the antisense primer (underlined characters). Sense primer: 5 * CCC TTT CTA GAC CAT TTA TTT CCC 3 'Anti-Sense primer: 5' CTG TGA TTC CCG GGA CAA TCT TCT 3 ' The amplification reaction contained 300 ng of phage DNA from clone 2A5, 25 picomoles of each of the two primers, 200 μM dNTP and 1 unit of Vent polymerase (New England) and its reaction buffer. The amplification was carried out over 20 cycles and the sequence of the fragment obtained was verified. Clone fragment sequence analysis
Une comparaison de séquence entre le promoteur PILOX de tabac et la banque de données d'acides nucléiques GenBank ne révèle pas d'homologies significatives avec d'autres promoteurs. En particulier, un alignement de séquence entre le promoteur LOX de tabac et un fragment de 700 pb en amont de la séquence transcrite de la LOXl d'Arabidopsis thaliana, (Melan et al, Biochem. Biophys. Acta, 1210:377-380, 1994) ou le promoteur LOXl de l'orge, inductible par le MeJa, ne met pas en évidence de régions conservées. Cette analyse permet cependant de détecter dans le promoteur PILOX une séquence de 50 pb (position 821-875 de la SEQ ID No.l), en amont de la boîte TATA, qui présente 90% d'homologie avec une région de l'intron 2 d'un gène de tabac codant pour une phenylalanine ammonia-lyase ainsi qu'avec une région de l'intron 5 du gène rbvmfl de tabac codant pour la methyl-transférase de la grande sous-unité de la Rubisco.A sequence comparison between the tobacco PILOX promoter and the GenBank nucleic acid database does not reveal significant homologies with other promoters. In particular, a sequence alignment between the tobacco LOX promoter and a 700 bp fragment upstream of the LOX1 transcribed sequence from Arabidopsis thaliana, (Melan et al, Biochem. Biophys. Actophys, 1210: 377-380, 1994) or the LOXl promoter of barley, inducible by MeJa, does not reveal conserved regions. However, this analysis makes it possible to detect in the PILOX promoter a 50 bp sequence (position 821-875 of SEQ ID No. 1), upstream of the TATA box, which has 90% homology with an intron region. 2 of a tobacco gene coding for a phenylalanine ammonia-lyase as well as with an intron region 5 of the tobacco rbvmfl gene coding for methyl-transferase of the large Rubisco subunit.
Des éléments régulateurs potentiels, impliqués dans la régulation par le méthyl jasmonate ou par les éliciteurs, ont aussi été recherchés dans la séquence du promoteur PILOX de tabac.Potential regulatory elements, involved in regulation by methyl jasmonate or by elicitors, were also sought in the sequence of the tobacco PILOX promoter.
De nombreux promoteurs induits par le méthyl-jasmonate (MeJa) tels que le promoteur de la chalcone synthase du persil (Schulze-Lefert et a , EMBO J., 8:651-656, 1989), le promoteur du gène codant pour la protéine de réserve (VSP) du soja (Mason et al, Plant Cell, 5:241-251, 1993) ou le promoteur du gène de l'inhibiteur de protéinase II de la pomme de terre (Kim et al, Plant Physiol., 99:571-576, 1992) contiennent dans leur séquence une boîte G (CACGTG) essentielle pour l'induction. Un motif TGACG analogue à l'élément asl identifié dans le promoteur 35S du CaMV est aussi impliqué dans la réponse au MeJa du promoteur de la lipoxygénase LOX 1 de l'orge (Rouster et al, Plant J., 11:513-523, 1997). L'analyse de la séquence du promoteur LOX de tabac ne révèle pas de motifs TGACG ou de boîtes G consensus. Plusieurs motifs ACGT pouvant être assimilés à des boîtes G peu conservées sont cependant identifiés dans le promoteur. Plusieurs éléments de séquence impliqués dans la réponse à des éliciteurs ont aussi été identifiés dans différents promoteurs de plantes. On trouve principalement des boîtes ERE (AATTGACC) pour Elicitor Responsive Elément, identifiées en particulier dans le promoteur PRl du gène PRm du maïs (Raventos et al, Plant J., 7:147-155, 1995) et dans le promoteur PRl de persil (Rushton et al, EMBO J., 15:5690-5700, 1996). Des boîtes E1RE (GTCAG) pour Elicitor Responsive Elément sont aussi impliquées dans l'activation par les éliciteurs comme montré en particulier pour le promoteur du gène de tabac codant une chitinase de classe I (Fukuda et al, Plant Mol. Biol., 24:485-493, 1994). Récemment, une boite GCC appelée aussi élément JERE (Jasmonic acid and Elicitor-Responsive Elément) impliqué à la fois dans l'activation par les éliciteurs et l'acide jasmonique a été caractérisée dans le promoteur du gène codant la strictosidine synthase de Catharanthus roseus (Menke et al, EMBO J., 18:4445-4463 1999). La recherche de ces éléments dans la séquence du promoteur de la LOX de tabac n'a pas permis d'identifier de boîtes GCC ou E1RE. Trois motifs analogues à la boîte ERE peuvent cependant être localisés en amont de la boîte TATA. Exemple 2: Obtention de la construction de fusion PILOX: ;GUSMany promoters induced by methyl jasmonate (MeJa) such as the parsley chalcone synthase promoter (Schulze-Lefert et a, EMBO J., 8: 651-656, 1989), the promoter of the gene coding for the protein reserve (VSP) soybeans (Mason et al, Plant Cell, 5: 241-251, 1993) or the promoter of the proteinase inhibitor II gene from potato (Kim et al, Plant Physiol., 99 : 571-576, 1992) contain in their sequence a G box (CACGTG) essential for induction. A TGACG motif analogous to the asl element identified in the CaMV 35S promoter is also involved in the response to the MeJa of the LOX 1 lipoxygenase promoter from barley (Rouster et al, Plant J., 11: 513-523, 1997). Analysis of the tobacco LOX promoter sequence does not reveal TGACG or G box consensus motifs. Several ACGT motifs which can be assimilated to poorly preserved G boxes are however identified in the promoter. Several sequence elements involved in the response to elicitors have also been identified in different plant promoters. ERE boxes (AATTGACC) are mainly found for Elicitor Responsive Element, identified in particular in the PRl promoter of the PRm gene of maize (Raventos et al, Plant J., 7: 147-155, 1995) and in the PRl promoter of parsley (Rushton et al, EMBO J., 15: 5690-5700, 1996). E1RE boxes (GTCAG) for Elicitor Responsive Element are also involved in activation by elicitors as shown in particular for the promoter of the tobacco gene encoding a class I chitinase (Fukuda et al, Plant Mol. Biol., 24: 485-493, 1994). Recently, a GCC box also called JERE element (Jasmonic acid and Elicitor-Responsive Element) involved in both activation by elicitors and jasmonic acid was characterized in the promoter of the gene encoding strictosidine synthase from Catharanthus roseus ( Menke et al, EMBO J., 18: 4445-4463 1999). The search for these elements in the tobacco LOX promoter sequence did not identify any GCC or E1RE boxes. Three patterns similar to the ERE box can however be located upstream of the TATA box. Example 2: Obtaining the PILOX fusion construct:; GUS
Après une réaction de digestion par les enzymes Xbal et Smal, le fragment promoteur amplifié a été clone aux même sites dans le vecteur pBHOl (Clontech). Le clonage est réalisé de manière à ce que le codon ATG du gène LOX soit dans le même cadre de lecture que la séquence codante du gène rapporteur uidA. La construction chimérique ainsi obtenue est appelée PlLOX::GUS. Exemple 3: Transformation génétique du tabacAfter a digestion reaction with the enzymes Xbal and Smal, the amplified promoter fragment was cloned at the same sites in the vector pBHO1 (Clontech). The cloning is carried out so that the ATG codon of the LOX gene is in the same reading frame as the coding sequence of the reporter gene uidA. The chimeric construction thus obtained is called PlLOX :: GUS. EXAMPLE 3 Genetic Transformation of Tobacco
La construction PlLOX::GUS a été transférée par éléctroporation dans des Agrobactéries de souche LBA4404. Les bactéries recombinantes obtenues ont ensuite été utilisées pour l'infection de disques foliaires de tabac, Nicotiana tabacum, lignées 46.8 et 49.10 suivant des procédures standard (Horsch et al, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Académie Publishers, 1988). Les lignées de tabacs utilisées sont quasi- isogéniques et se différencient par la présence dans la lignée 46.8 d'un locus de résistance à la race 0 de Ppn. Les plantes régénérées sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) contenant 150 μg/ml de Kanamycine sont placées en chambre de culture puis en serre pour l'obtention des graines Tl. La présence de la cassette d'expression promoteur LOX- gène uidA ainsi que le nombre de copies du transgène dans le génome des plantes régénérées ont été déterminés par des expériences d'hybridation ADN/ ADN (Southern). Les résultats montrent que les transformants primaires de la lignée 46.8 contiennent de 1 à 5 copies du transgène. Les plantes 46.8 possédant un faible nombre de copies ( monocopie ou deux copies) ont été sélectionnées pour l'étude du promoteur LOX. Pour ces lignées, les graines Tl issues de l' autofécondation des transformants primaires ont été mises à germer sur milieu sélectif et les plantes obtenues ont été utilisées pour l'étude de l'activité du promoteur.The PlLOX :: GUS construct was transferred by electroporation into Agrobacteria of strain LBA4404. The recombinant bacteria obtained were then used for the infection of tobacco leaf discs, Nicotiana tabacum, lines 46.8 and 49.10 according to standard procedures (Horsch et al, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Académie Publishers, 1988). The tobacco lines used are quasi-isogenic and are differentiated by the presence in line 46.8 of a locus of resistance to race 0 of Ppn. The plants regenerated on a Murashige and Skoog (MS) medium containing 150 μg / ml of Kanamycin are placed in a culture chamber and then in a greenhouse to obtain the Tl seeds. The presence of the LOX-uidA promoter expression cassette as well as the number of copies of the transgene in the genome of the regenerated plants were determined by DNA / DNA hybridization experiments (Southern). The results show that the primary transformants of line 46.8 contain from 1 to 5 copies of the transgene. Plants 46.8 having a low number of copies (single copy or two copies) were selected for the study of the LOX promoter. For these lines, the Tl seeds resulting from the self-fertilization of the primary transformants were put to germinate on selective medium and the plants obtained were used for the study of the activity of the promoter.
L'activité du promoteur PILOX a été caractérisée à partir de trois types d'expériences mettant enjeu : - des infiltrations de feuilles avec des préparations d'éliciteursThe activity of the PILOX promoter was characterized from three types of experiments involving: - infiltration of leaves with preparations of elicitors
- des inoculations racinaires par Phytophthora parasitica nicotianae (Ppn).- root inoculations with Phytophthora parasitica nicotianae (Ppn).
- des tests d'induction sur jeunes plantes permettant d'analyser l'influence de diverses molécules sur la régulation de l'activité du promoteur.- induction tests on young plants to analyze the influence of various molecules on the regulation of promoter activity.
Les expériences ont été réalisées avec des plantes transgéniques, de génération Tl, issues de lignées indépendantes et contenant une ou deux copies du transgène par génome.The experiments were carried out with transgenic plants, of generation Tl, originating from independent lines and containing one or two copies of the transgene per genome.
Exemple 4: Détection et mesure de l'activité glucuronidaseExample 4 Detection and Measurement of Glucuronidase Activity
La détection histo-chimique de l'activité GUS est réalisée essentiellement selon la méthode décrite par Jefferson et al. (EMBO J., 6:3901-3907, 1987). Des tissus sont prélevés sur les plantes transgéniques et directement incubés à 37°C dans un tampon phosphate 50 mM, pH 7 contenant 0.5 mM de sels de potassium de ferro et ferri cyanure, 1 mM de X-GLUC (Eurogentec); et 0,1 % Triton X100.Histo-chemical detection of GUS activity is carried out essentially according to the method described by Jefferson et al. (EMBO J., 6: 3901-3907, 1987). Tissues are removed from the transgenic plants and directly incubated at 37 ° C. in a 50 mM phosphate buffer, pH 7 containing 0.5 mM of ferro and ferri cyanide potassium salts, 1 mM of X-GLUC (Eurogentec); and 0.1% Triton X100.
Après coloration, les échantillons sont placés dans une solution d'éthanol 70%, permettant d'éliminer les pigments chlorophylliens, puis observés pour analyse. Le dosage de l'activité GUS est réalisé selon le protocole standard (Jefferson et a ,After coloring, the samples are placed in a 70% ethanol solution, making it possible to remove the chlorophyll pigments, then observed for analysis. The GUS activity assay is carried out according to the standard protocol (Jefferson et a,
EMBO J., 6:3901-3907, 1987). Les échantillons récoltés sont broyés dans un tampon d'extraction pour obtenir un extrait protéique sur lequel est mesurée l'activité glucuronidase. La réaction enzymatique est réalisée pour 50 μL d'extrait en présence du substrat MUG (Sigma) à lmM. L'apparition de méthyl-umbelliférone (MU) est mesurée par dosage fluorométrique et les valeurs d'activité sont exprimées en picomoles de MU produites par heure et par μg de protéines. La quantité de protéines est évaluée par la méthode de Bradford (Biorad). Exemple 5: Activité du promoteur PILOX dans des plantes transgéniques au cours du développementEMBO J., 6: 3901-3907, 1987). The collected samples are ground in an extraction buffer to obtain a protein extract on which the glucuronidase activity is measured. The enzymatic reaction is carried out for 50 μL of extract in the presence of the substrate MUG (Sigma) at 1 mM. The appearance of methyl umbelliferone (MU) is measured by fluorometric determination and the activity values are expressed in picomoles of MU produced per hour and per μg of proteins. The amount of protein is evaluated by the method of Bradford (Biorad). Example 5 Activity of the PILOX Promoter in Transgenic Plants During Development
Cette étude a été réalisée essentiellement sur des plantes Tl, issues de lignées transgéniques indépendantes, contenant une ou deux copies de la construction PILOX::GUS. L'analyse de l'activité du gène rapporteur dans les parties florales n'a été effectuée que sur les transformants primaires.This study was carried out essentially on Tl plants, derived from independent transgenic lines, containing one or two copies of the PILOX :: GUS construct. Analysis of the activity of the reporter gene in the floral parts was only carried out on the primary transformants.
On peut distinguer trois profils d'expression distincts au cours du développement.We can distinguish three distinct expression profiles during development.
GerminationGermination
L'activité β-glucuronidase a été analysée dans de jeunes germinations récoltées à différents stades de développement.The β-glucuronidase activity was analyzed in young germinations harvested at different stages of development.
Stade 1: 5 jours après semis.Stage 1: 5 days after sowing.
La germination démarre par la sortie de la radicule à travers les téguments. On note à ce stade précoce une intense coloration limitée dans une zone circulaire autour de la radicule à l'endroit où elle émerge des téguments de la graine. Aucune coloration n'est détectée ailleurs sur la radicule. L'expression GUS est localisée au niveau du collet mais les tissus internes des téguments, autour de la zone de sortie de la radicule, semblent aussi fortement colorés.Germination starts with the exit of the radicle through the integuments. At this early stage, there is an intense limited coloration in a circular area around the radicle where it emerges from the seed coat. No coloration is detected elsewhere on the radicle. The expression GUS is localized at the level of the collar but the internal tissues of the integuments, around the zone of exit of the radicle, also seem strongly colored.
Stade 2: 7 jours après semis.Stage 2: 7 days after sowing.
On observe à ce stade une élongation de la radicule et de l'hypocotyle. Les cotylédons sont généralement en dehors des téguments, qui pour leur part restent encore attachés à la plantule au niveau du collet. L'expression GUS est détectée au niveau du collet et de l'hypocotyle en élongation. Une expression forte est aussi visible sur les cotylédons. La coloration semble être localisée sur les cellules épidermiques mais des coupes histologiques seront nécessaires pour confirmer ce résultat. Aucune activité n'est détectée dans les racines et il y a une délimitation nette au niveau du collet entre zone colorée et non colorée.At this stage, an elongation of the radicle and the hypocotyle is observed. The cotyledons are generally outside the integuments, which for their part still remain attached to the seedling at the level of the collar. The expression GUS is detected at the level of the neck and the elongated hypocotyle. A strong expression is also visible on the cotyledons. The staining seems to be localized on the epidermal cells but histological sections will be necessary to confirm this result. No activity is detected in the roots and there is a clear delimitation at the level of the collar between colored and non-colored zone.
Stade 3: 10 jours après semis.Stage 3: 10 days after sowing.
On a un développement général des plantules avec une racine, un hypocotyle allongé et deux cotylédons développés. Une expression GUS résiduelle persiste dans les cotylédons. L'intensité de cette coloration est variable selon les individus et diminue au cours du développement.There is a general development of the seedlings with a root, an elongated hypocotyle and two developed cotyledons. A residual GUS expression persists in the cotyledons. The intensity of this coloring is variable depending on the individual and decreases during development.
Stade VégétatifVegetative stage
L'analyse de l'expression du gène rapporteur dans les différents tissus de plantes en croissance et de plantes adultes a montré une activité β-glucuronidase limitée à la région du collet ainsi qu'au niveau des pétioles des feuilles. Une expression GUS a été détectée au niveau du collet à tous les stades du développement analysés. L'analyse de coupes sur du matériel frais a montré que cette expression est localisée au niveau des éléments conducteurs. Une coloration GUS est visible dans le cylindre central de la partie haute de la racine et dans les vaisseaux du phloème interne dans la partie basse de la tige. Une expression GUS a aussi été observée à la base des pétioles des feuilles. L'observation microscopique de coupes transversales au niveau des nœuds de la tige a montré que les cellules qui développent une coloration bleue appartiennent au parenchyme cortical. Ces indications suggèrent que la zone colorée constitue la future zone d'abscission de la feuille. A l'exception de ces tissus, aucune activité GUS n'a été détectée dans les organes végétatifs (feuilles, tiges, racines). Plante en floraisonAnalysis of reporter gene expression in different plant tissues in growing and adult plants showed β-glucuronidase activity limited to the collar region as well as to the leaf petioles. GUS expression was detected at the collar at all stages of development analyzed. Analysis of sections on fresh material has shown that this expression is localized at the level of the conductive elements. A GUS coloration is visible in the central cylinder of the upper part of the root and in the vessels of the internal phloem in the lower part of the stem. GUS expression was also observed at the base of the leaf petioles. Microscopic observation of cross sections at the nodes of the stem has shown that the cells which develop a blue color belong to the cortical parenchyma. These indications suggest that the colored zone constitutes the future abscission zone of the leaf. With the exception of these tissues, no GUS activity was detected in the vegetative organs (leaves, stems, roots). Flowering plant
Des fleurs à différents stades ainsi que des capsides encore immatures ont été collectées pour l'analyse histo-chimique de l'expression GUS. Les résultats montrent que les parties vertes de la fleur telles que les sépales et le réceptacle ne présentent pas de coloration GUS. Une expression GUS est cependant détectable dans les pétales mais limitée à la zone supérieure pigmentée. Les étamines ne semblent pas exprimer le gène alors qu'une expression forte est détectée dans le pollen. On observe aussi une coloration bleue au niveau du stigmate (peut être due au dépôt de pollen) ainsi qu'à la base du sac embryonnaire. A l'intérieur du sac embryonnaire, on observe que les ovules développent aussi une expression GUS. Cette activité est modérée et semble surtout localisée dans les cellules de surface. La zone d'abscission entre le style et le sac embryonnaire est aussi fortement colorée. Au niveau des capsides on observe une expression GUS limitée aux graines alors que le placenta et le système vasculaire ne sont pas colorés. Des coupes transversales réalisées dans des graines récoltées dans les capsules vertes montrent que l'expression GUS est essentiellement localisée au niveau des cotylédons de l'embryon alors qu'aucune expression n'est détectée au niveau de l'endosperme. L'analyse histologique de l'activité glucuronidase a permis de localiser précisément le profil tissulaire de l'activité du promoteur PILOX. L'expression GUS est détectée dans les cotylédons de l'embryon, dans l'hypocotyle et les feuilles cotylédonaires au cours de la germination. Une activité GUS est aussi détectée dans les organes reproducteurs de la fleur ainsi que dans les pétales. De nombreuses LOXs sont exprimées au cours de la germination ainsi que dans les fleurs ou les fruits. Ces LOXs sont généralement impliquées spécifiquement dans le développement et interviennent dans les processus de croissance et de sénescence cellulaire. L'expression de certains gènes liés à la défense (Henning et al, Plant J., 4:481-493, 1993) peut être cependant détectée dans les fleurs et dans les graines. De plus, Melan et collaborateurs (Plant Physiol., 105:385-393, 1994) ont montré que le gène _4tLOXl induit lors de la pathogénèse est aussi activé de manière transitoire dans les étapes précoces de la germination des graines d'_4. thaliana. On peut donc penser que l'expression GUS visualisée dans des organes essentiels pour la survie et la persistance de la plante est aussi en accord avec un rôle de défense et de protection. Celui-ci est d'ailleurs souligné par l'expression GUS détectée dans le collet et dans les zones d'abscission, deux types de tissus correspondant à des zones de communication entre organes. Ce type d'expression tissu-spécifique a aussi été détecté pour d'autres gènes liés à la défense. En particulier il a été montré que le promoteur du gène PRB-lb du tabac s'exprimait spécifiquement dans les zones d'abscission des feuilles et des fleurs (Eyal et al, Plant J., 4:225-234, 1993). L'expression constitutive de la LOX dans ces zones de compartimentation pourrait constituer une obstacle à la colonisation de la plante par un agent pathogène. Exemple 6; Infiltration d'eliciteurFlowers at different stages as well as still immature capsids were collected for the histochemical analysis of the expression GUS. The results show that the green parts of the flower such as the sepals and the receptacle do not show GUS staining. GUS expression is however detectable in the petals but limited to the upper pigmented area. The stamens do not seem to express the gene while a strong expression is detected in the pollen. There is also a blue color at the stigma (may be due to the deposition of pollen) as well as at the base of the embryonic sac. Inside the embryo sac, we observe that the ova also develop a GUS expression. This activity is moderate and seems mainly localized in surface cells. The abscission zone between the style and the embryonic sac is also strongly colored. At the level of the capsids, a GUS expression limited to the seeds is observed while the placenta and the vascular system are not colored. Cross sections made from seeds collected in the green capsules show that the expression GUS is essentially localized at the level of the cotyledons of the embryo whereas no expression is detected at the level of the endosperm. Histological analysis of glucuronidase activity made it possible to precisely locate the tissue profile of the activity of the PILOX promoter. The expression GUS is detected in the cotyledons of the embryo, in the hypocotyle and the cotyledonary leaves during germination. GUS activity is also detected in the reproductive organs of the flower as well as in the petals. Many LOXs are expressed during germination as well as in flowers or fruits. These LOXs are generally involved specifically in development and are involved in the growth and cell senescence processes. The expression of certain defense-related genes (Henning et al, Plant J., 4: 481-493, 1993) can however be detected in the flowers and in the seeds. In addition, Melan et al. (Plant Physiol., 105: 385-393, 1994) have shown that the _4tLOXl gene induced during pathogenesis is also transiently activated in the early stages of the germination of _4 seeds. thaliana. We can therefore think that the expression GUS visualized in organs essential for the survival and persistence of the plant is also in agreement with a role of defense and protection. This is also underlined by the expression GUS detected in the collar and in the abscission zones, two types of tissue corresponding to zones of communication between organs. This type of tissue-specific expression has also been detected for other defense-related genes. In particular, it has been shown that the promoter of the PRB-1b gene of tobacco expresses itself specifically in the abscission zones of the leaves and flowers (Eyal et al, Plant J., 4: 225-234, 1993). The constitutive expression of LOX in these compartmentalization zones could constitute an obstacle to the colonization of the plant by a pathogenic agent. Example 6; Elicitor infiltration
Des infiltrations d' éliciteurs sont effectuées à l'aide d'une seringue sans aiguille sur la face inférieure de feuilles adultes de plantes âgées de 8 semaines et cultivées en chambre de culture (photopériode: 16 h jour/8 h nuit; température 25°C jour/22°C nuit; hygrométrie 80 %). Les dosages GUS effectués à partir des plantes élicitées sont réalisés sur des échantillons composés de trois disques foliaires de 1 cm de diamètre prélevés dans les zones traitées. Plusieurs échantillons sont prélevés pour chaque traitement. Les expériences ont été réalisées avec des plantes transgéniques, de génération Tl, issues de lignées indépendantes et contenant une ou deux copies du transgène par génome. Infiltration d'eliciteur de Ppn (Phytophthora parasitica nicotianae)Elicitor infiltrations are carried out using a syringe without a needle on the underside of adult leaves of 8-week-old plants and cultivated in a culture chamber (photoperiod: 16 h day / 8 h night; temperature 25 ° C day / 22 ° C night; humidity 80%). The GUS assays carried out from the elicited plants are carried out on samples composed of three leaf discs of 1 cm in diameter taken from the treated areas. Several samples are taken for each treatment. The experiments were carried out with transgenic plants, of generation Tl, originating from independent lines and containing one or two copies of the transgene per genome. Infiltration of Ppn elicitor (Phytophthora parasitica nicotianae)
Une préparation de parois de Ppn à 30 μg/ml est infiltrée sur la face abaxiale de feuilles de plantes transgéniques adultes. Des zones d'environ 10 cm2 sont infiltrées sauf pour la recherche d'activation systémique du promoteur pour laquelle des demi-feuilles ont été entièrement infiltrées. Une nécrose totale ou partielle des tissus infiltrés est généralement visible 24 à 48 heures après infiltration. L'étude histo-chimique de l'expression du gène rapporteur 6 à 8 heures après infiltration montre qu'une forte activité GUS est visible dans les tissus infiltrés. Des analyses réalisées 12 et 24 heures après infiltration montrent, qu'à ce stade, la coloration GUS n'est plus visible que sur le pourtour de la zone nécrosée. Aucune induction du gène rapporteur n'est détectée dans des zones infiltrées avec de l'eau ou non infiltrées.A preparation of Ppn walls at 30 μg / ml is infiltrated on the abaxial surface of leaves of adult transgenic plants. Areas of approximately 10 cm 2 are infiltrated except for the search for systemic activation of the promoter for which half-leaves have been fully infiltrated. Total or partial necrosis of the infiltrated tissue is generally visible 24 to 48 hours after infiltration. The histochemical study of the expression of the reporter gene 6 to 8 hours after infiltration shows that a strong GUS activity is visible in the infiltrated tissues. Analyzes carried out 12 and 24 hours after infiltration show that at this stage, the GUS coloration is no longer visible except around the periphery of the necrotic area. No induction of the reporter gene is detected in areas infiltrated with water or non-infiltrated.
Un dosage fluorométrique de l'activité β-glucuronidase a été effectué à partir de disques foliaires prélevés dans les zones infiltrées. Les résultats obtenus concernent trois lignées indépendantes de plantes transgéniques PlLOX::GUS. On mesure une induction précoce du gène rapporteur dès 4 heures après traitement. Le niveau d'expression maximum est atteint entre 12 et 24 heures après infiltration et correspond à environ 100 fois le niveau mesuré dans des zones infiltrées avec de l'eau. Les résultats obtenus pour des plantes appartenant à la même lignée ou à des lignées indépendantes sont différents en terme d'amplitude mais présentent tous le même profil général.A fluorometric assay of the β-glucuronidase activity was carried out from leaf discs taken from the infiltrated areas. The results obtained relate to three independent lines of PlLOX :: GUS transgenic plants. An early induction of the reporter gene is measured as early as 4 hours after treatment. The maximum level of expression is reached between 12 and 24 hours after infiltration and corresponds to approximately 100 times the level measured in areas infiltrated with water. The results obtained for plants belonging to the same line or to independent lines are different in terms of amplitude but all have the same general profile.
Des infiltrations de la solution d'eliciteur de Ppn ont aussi été réalisées sur des moitiés de feuilles adultes. Ces expériences ont pour but de rechercher l'activation à distance du promoteur PILOX dans la partie de la feuille non traitée ainsi que dans les feuilles de rang supérieur ou inférieur. Les dosages d'activités GUS ont été réalisés 3 jours et 7 jours après traitement. Une augmentation de l'activité GUS est détectée 3 jours après infiltration dans les tissus non traités proches de la zone infiltrée. Les niveaux d'activité mesurés restent modérés et représentent environ 20% des valeurs mesurées généralement dans des zones infiltrées par l'éliciteur. Cette activité dans les tissus proximaux diminue à 7 jours alors qu'au même stade une augmentation faible de l'activité GUS est mesurée dans des tissus éloignés de la zone infiltrée mais localisés sur la même feuille. Aucune induction d'activité n'a été détectée dans les feuilles non traitées de rang supérieur ou inférieur.Infiltrations of the Ppn elicitor solution were also carried out on half of adult leaves. The purpose of these experiments is to search for the remote activation of the PILOX promoter in the part of the untreated leaf as well as in the leaves of higher or lower rank. The GUS activity assays were carried out 3 days and 7 days after treatment. An increase in GUS activity is detected 3 days after infiltration into untreated tissue close to the infiltrated area. The activity levels measured remain moderate and represent around 20% of the values generally measured in areas infiltrated by the elicitor. This activity in the proximal tissues decreases at 7 days while at the same stage a slight increase in GUS activity is measured in tissues distant from the infiltrated area but located on the same sheet. No induction of activity was detected in the untreated leaves of higher or lower rank.
Ces résultats sont représentés aux figures 1-2. Infiltration de métaux lourds Des infiltrations de nitrate de plomb (PbNO3) ont été réalisées pour analyser l'activité du promoteur consécutivement à des traitements par des métaux lourds. Ceux- ci se comportent comme des éliciteurs abiotiques et provoquent la nécrose cellulaire des tissus traités. Nos expériences mettent en évidence une induction de l'activité du gène GUS après l'infiltration de PbNO3 à 10 mM. La révélation de la β-glucuronidase, 20 heures après traitement, fait apparaître une forte coloration bleue dans les zones infiltrées en cours de nécrose. Exemple 7: Réalisation de blessures Les blessures sont réalisées sur des plantes au même stade de développement que celles utilisées pour l'infiltration d'éliciteurs. Des feuilles développées sont entièrement blessées à l'aide d'une seringue sans aiguille. L'extrémité de la seringue est appuyée sur la face inférieure de la feuille jusqu'à l'obtention d'une empreinte. Ces traces se nécrosent par la suite au bout du deuxième ou troisième jour après traitement. Les dosages GUS effectués à partir des plantes blessées sont réalisés sur des échantillons composés de trois disques foliaires de 1 cm de diamètre prélevés dans les zones traitées. Plusieurs échantillons sont prélevés pour chaque traitement. Les dosages d'activité GUS sont réalisés à partir de disques foliaires prélevés sur des feuilles blessées 24 heures et 7 jours après traitement. Les données obtenues montrent que dans les conditions de l'expérience la blessure n'induit pas d'augmentation de l'activité glucuronidase, bien que les zones blessées apparaissent nécrosées. Exemple 8: Infection racinaire par des zoospores de la race 0 de Ppn Obtention de zoosporesThese results are shown in Figures 1-2. Heavy metal infiltration Lead nitrate (PbNO 3 ) infiltration was carried out to analyze the activity of the promoter following treatment with heavy metals. These act as abiotic elicitors and cause cell necrosis of the treated tissues. Our experiments demonstrate an induction of gene activity GUS after infiltration of PbNO 3 at 10 mM. The revelation of β-glucuronidase, 20 hours after treatment, reveals a strong blue coloration in the infiltrated areas during necrosis. Example 7: Realization of wounds Wounds are carried out on plants at the same stage of development as those used for the infiltration of elicitors. Developed leaves are fully injured using a needleless syringe. The end of the syringe is pressed against the underside of the sheet until an impression is obtained. These traces become necrotic after the second or third day after treatment. The GUS assays carried out on injured plants are carried out on samples composed of three leaf discs of 1 cm in diameter taken from the treated areas. Several samples are taken for each treatment. The GUS activity assays are carried out using leaf discs taken from injured leaves 24 hours and 7 days after treatment. The data obtained show that under the conditions of the experiment the injury does not induce an increase in glucuronidase activity, although the injured areas appear necrotic. EXAMPLE 8 Root Infection with Zoospores of Race 0 of Ppn Obtaining Zoospores
Une pastille de mycélium de Ppn race 0 préalablement cultivé sur un milieu synthétique (Keen, Science, 187:74-75, 1975) est placé sur une toile Agryl P17 (Sodoca, France) placée dans un milieu liquide V8, 5% (jus Campbell). Après 4 jours de culture à 25 °C la toile sur laquelle s'est développé le mycélium est transférée sur de la gélose 1,5 %. Ce transfert entraîne une carence nutritionnelle qui va induire chez le champignon la formation de sporocystes. Au bout de 4 jours de culture à 25°C, le mycélium est recouvert de 10 ml d'eau distillée et transféré à 4°C pour 30 minutes. Ce choc thermique provoque la libération des zoospores qui sont récupérées avec le liquide et comptées dans une cellule de Thoma. Inoculation des plantesA pastille of Ppn race 0 mycelium previously cultivated on a synthetic medium (Keen, Science, 187: 74-75, 1975) is placed on an Agryl P17 canvas (Sodoca, France) placed in a V8 liquid medium, 5% (juice Campbell). After 4 days of culture at 25 ° C. the cloth on which the mycelium has grown is transferred to 1.5% agar. This transfer leads to a nutritional deficiency which will induce the formation of sporocysts in the fungus. After 4 days of culture at 25 ° C, the mycelium is covered with 10 ml of distilled water and transferred to 4 ° C for 30 minutes. This thermal shock causes the release of the zoospores which are recovered with the liquid and counted in a Thoma cell. Plant inoculation
Des plantes transgéniques de génération Tl cultivées en chambre de culture et âgées de 5 semaines sont prélevées et les racines sont débarrassées de la vermiculite. Les racines sont ensuite placées dans un tube de 2.5 ml contenant une suspension de zoospores de la race 0 du champignon à 400,000 spores/ml. Les plantes sont placées en chambre de culture pour la durée de l'expérience. Les plantes témoins, non inoculées, sont placées dans de l'eau distillée. L'activité GUS dans les plantes infectées est mesurée indépendamment sur les tissus foliaires prélevés au dessus du collet et sur la partie racine-collet. Mesure de l'activité GUS La révélation histo-chimique de la β-glucuronidase montre une induction forte du gène rapporteur dans les racines des plantes inoculées. Une activité GUS est visible dans les racines dès 5 heures après inoculation mais la coloration des tissus est plus intense après 12 heures et 24 heures. Quatre à cinq jours après inoculation, l'activité GUS dans les racines apparaît beaucoup plus faible. Les résultats sont représentés à la figure 3. Dans l'ensemble du faisceau racinaire, seules quelques racines principales sont fortement colorées. Plusieurs profils sont observés: certaines racines développent une coloration sur toute leur longueur qui semble concerner toutes les cellules. Sur d'autres racines, on observe une activité intense au niveau des primordiums racinaires ainsi que dans le cylindre central. Une activité GUS intense est aussi visible dans le collet. Les plantes non inoculées présentent une activité dans le collet qui est moins intense que dans le cas de l'inoculation. Les racines des plantes non inoculées ne développent pas de coloration GUS. Au cours de l'interaction, le promoteur LOX est peu actif dans les organes aériens. Une expression glucuronidase a cependant été détectée sur les anciennes feuilles cotylédonaires, proches du collet et au niveau des pétioles des premières feuilles. Le dosage fluorométrique de l'activité GUS dans les racines de plante inoculées montre une induction rapide, détectable 5 heures après inoculation avec un maximum d'expression entre 12 heures et 24 heures. L'expression diminue ensuite progressivement jusqu'au 3ιeme jour post-inoculation. Dans les tissus foliaires, prélevés au-dessus du collet, on note une induction de l'expression GUS de plus faible ampleur (environ 10 fois moins que dans les tissus racinaires) avec un maximum d'activité mesuré 48 heures après inoculation.Transgenic Tl generation plants grown in a culture chamber and 5 weeks old are removed and the roots are cleared of vermiculite. The roots are then placed in a 2.5 ml tube containing a suspension of zoospores of race 0 of the fungus at 400,000 spores / ml. The plants are placed in a culture chamber for the duration of the experiment. Control plants, not inoculated, are placed in distilled water. The GUS activity in infected plants is measured independently on the leaf tissues collected above the collar and on the root-collar part. Measurement of GUS activity The histo-chemical revelation of β-glucuronidase shows a strong induction of the reporter gene in the roots of inoculated plants. GUS activity is visible in the roots from 5 hours after inoculation but the tissue coloration is more intense after 12 hours and 24 hours. Four to five days after inoculation, the GUS activity in the roots appears much lower. The results are shown in Figure 3. In the entire root bundle, only a few main roots are strongly colored. Several profiles are observed: certain roots develop a coloration over their entire length which seems to concern all cells. On other roots, intense activity is observed at the level of the root primordia as well as in the central cylinder. Intense GUS activity is also visible in the collar. The non-inoculated plants have an activity in the collar which is less intense than in the case of inoculation. The roots of uninoculated plants do not develop GUS staining. During the interaction, the LOX promoter is not very active in the aerial organs. Glucuronidase expression was however detected on the old cotyledonary leaves, close to the collar and in the petioles of the first leaves. The fluorometric assay of GUS activity in inoculated plant roots shows rapid induction, detectable 5 hours after inoculation with maximum expression between 12 hours and 24 hours. The expression then gradually decreases until 3 ιeme day post-inoculation. In leaf tissue, taken above the collar, there is a smaller induction of GUS expression (about 10 times less than in root tissue) with maximum activity measured 48 hours after inoculation.
Le promoteur PILOX est induit plus fortement lors d'une interaction incompatible que lors d'une interaction compatibleThe PILOX promoter is induced more strongly during an incompatible interaction than during a compatible interaction
L'induction du promoteur a été quantifiée au cours d'une interaction de type compatible ou incompatible.The induction of the promoter was quantified during a compatible or incompatible interaction.
Des plantes 46.8 transgéniques (lignées 5 et 9) ont été infectées soit avec des zoospores de la race 0 de Ppn, (interaction incompatible), soit avec des zoospores de la race 1 (interaction compatible). A 3h, 8h ou 24 h après inoculation, des plantes des deux lots sont récoltées et utilisées pour des mesures de fluorimétrie. Dès 3h on détecte une activité GUS pour les deux types d'interactions, supérieure à celle détectée dans les témoins non inoculés chez les plantes de la lignée 5. Le temps 8 h discrimine les deux types d'interactions : l'activité spécifique mesurée chez des plantes résistantes est plus importante que celle mesurée chez des plantes sensibles. A 24 h elle est deux fois supérieure. L'activité spécifique dans les plantes non inoculées reste quasi-nulle. Des résultats similaires sont obtenus chez les plantes de la lignée 9.46.8 transgenic plants (lines 5 and 9) were infected either with zoospores of race 0 of Ppn, (incompatible interaction), or with zoospores of race 1 (compatible interaction). At 3, 8 or 24 hours after inoculation, plants from both batches are harvested and used for fluorimetry measurements. From 3 hrs, a GUS activity is detected for the two types of interactions, greater than that detected in the controls not inoculated in plants of the line 5. The time 8 h discriminates the two types of interactions: the specific activity measured in resistant plants is more important than that measured in sensitive plants. At 24 h it is twice as high. The specific activity in uninoculated plants remains almost zero. Similar results are obtained in plants of line 9.
Ces résultats semblent montrer que la lipoxygénase est induite beaucoup plus fortement pendant une interaction incompatible que lors d'une interaction compatible. Exemple 9: Traitements par des messagers secondaires et des produits phvtosanitairesThese results seem to show that lipoxygenase is induced much more strongly during an incompatible interaction than during a compatible interaction. Example 9: Treatments with Secondary Messengers and Phytosanitary Products
Ces expériences ont pour but d'analyser l'influence de molécules régulant l'activité de gènes de défense sur l'activité du promoteur PILOX. On distingue classiquement trois voies de transduction des signaux déclenchant les réactions de défense : une voie mettant en jeu le méthyl-jasmonate, une autre qui concerne l'acide salicylique et une troisième qui fait intervenir l'éthylène. Ces trois molécules ont donc été testées sur l'induction du promoteur pour caractériser quelle voie de signalisation est mobilisée pour réguler l'activation du promoteur PILOX au cours de la pathogénèse. Il faut noter que nous avons utilisé de l'ACC (acide 1-aminocyclopropane-l carboxylique) plutôt que l'éthylène gazeux. L'ACC, substrat de l'ACC oxydase, est le précurseur direct de l'éthylène.The purpose of these experiments is to analyze the influence of molecules regulating the activity of defense genes on the activity of the PILOX promoter. There are typically three ways of transducing signals triggering defense reactions: one involving methyl jasmonate, another involving salicylic acid and a third involving ethylene. These three molecules were therefore tested on the induction of the promoter to characterize which signaling pathway is mobilized to regulate the activation of the PILOX promoter during pathogenesis. It should be noted that we used ACC (1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid) rather than ethylene gas. ACC, the substrate for ACC oxidase, is the direct precursor of ethylene.
Par ailleurs deux produits issus de l'industrie phyto-sanitaire, le Bion® (Novartis) et l' Aliette® (Rhône-Poulenc) ont aussi été testés. L'Aliette est la formulation commerciale du fosetyl-Al, un produit utilisé comme fongicide systémique en particulier contre les champignons oomycètes.In addition, two products from the phytosanitary industry, Bion ® (Novartis) and Aliette ® (Rhône-Poulenc) were also tested. Aliette is the commercial formulation of fosetyl-Al, a product used as a systemic fungicide, in particular against oomycete fungi.
Le Bion est la formulation commerciale du BTH (benzo(l,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester), un analogue chimique de l'acide salicylique qui induit l'acquisition d'une résistance systémique (SAR) chez les plantes traitées.Bion is the commercial formulation of BTH (benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester), a chemical analogue of salicylic acid which induces the acquisition of systemic resistance (SAR) in treated plants.
Les graines transgéniques Tl sont stérilisées et mises à germer sur un milieu gélose MS contenant 150 μg /ml de kanamycine. Les plantes sont récoltées à 6 semaines après semis et placées dans des boîtes de Pétri contenant un milieu liquide MS 0,1X, pH 5.8, sans saccharose et contenant 0.001 % de Triton X100. Les solutions concentrées des différentes molécules ou produits testés sont ensuite rajoutées dans le milieu pour atteindre les concentrations suivantes :The Tl transgenic seeds are sterilized and germinated on an MS agar medium containing 150 μg / ml of kanamycin. The plants are harvested at 6 weeks after sowing and placed in Petri dishes containing an MS 0.1X liquid medium, pH 5.8, without sucrose and containing 0.001% of Triton X100. Concentrated solutions different molecules or products tested are then added to the medium to reach the following concentrations:
Methyl jasmonate (Aldrich) : 200 μM, 500 μM et 1 mMMethyl jasmonate (Aldrich): 200 μM, 500 μM and 1 mM
ACC (Sigma) ImM Acide salicylique (Sigma) 50 μM, 200 μM et ImM.ACC (Sigma) ImM Salicylic acid (Sigma) 50 μM, 200 μM and ImM.
BION® 500 mg/1 soit 1.2 mM substance activeBION ® 500 mg / 1 or 1.2 mM active substance
ALIETTE® 125mg/l soit 282 μM substance activeALIETTE ® 125mg / l or 282 μM active substance
Les boites sont scellées avec du Parafilm et placées en chambres de culture durant 24 heures avant analyse de l'activité GUS. Les dosages de l'activité GUS sont réalisés sur des échantillons correspondant à 3 plantes rassemblées. Traitement avec l'ACC (acide 1-aminocyclopropane-l carboxylique)The dishes are sealed with Parafilm and placed in culture chambers for 24 hours before analysis of the GUS activity. The GUS activity assays are carried out on samples corresponding to 3 plants collected. Treatment with ACC (1-aminocyclopropane-1 carboxylic acid)
Les expériences réalisées avec de l'ACC ImM ont permis de mesurer des inductions modérées de l'activité glucuronidase, qui varient selon les lignées d'un facteur 1.5 à 2. Traitement avec le MeJa (méthyl jasmonate)The experiments carried out with ACC ImM made it possible to measure moderate inductions of glucuronidase activity, which vary according to the lines by a factor 1.5 to 2. Treatment with MeJa (methyl jasmonate)
Les plantes traitées par le méthyle jasmonate ont permis de mettre en évidence une induction de l'activité GUS élevée. Les plantes PILOX ont été traitées avec 250μM ou 500μM de MeJa. L'induction du promoteur est révélée par mesure en fluorimétrie de l'activité GUS sur 3 lots de 2 plantes. Toutes les plantes traitées présentent une activité GUS de 2 à 8 fois supérieure à celle des témoins après un traitement par 250μM de MeJA. Les résultats sont représentés à la figure 4. Les mêmes résultats sont obtenus avec une concentration de 500μM. Une expérience a cependant permis d'atteindre une valeur d'induction maximale d'un facteur 15. L'analyse histo- chimique de l'activité glucuronidase a montré que l'induction d'activité semble avoir lieu préférentiellement dans les feuilles. Il faut noter qu'une activité GUS résiduelle est détectée dans les feuilles cotylédonaires des plantes non traitées. Traitement avec SA (acide salicylique)Plants treated with methyl jasmonate made it possible to demonstrate a high induction of GUS activity. The PILOX plants were treated with 250 μM or 500 μM of MeJa. The induction of the promoter is revealed by measurement in fluorimetry of the GUS activity on 3 batches of 2 plants. All the treated plants have a GUS activity of 2 to 8 times greater than that of the controls after treatment with 250 μM of MeJA. The results are shown in FIG. 4. The same results are obtained with a concentration of 500 μM. However, an experiment has made it possible to reach a maximum induction value of a factor of 15. The histochemical analysis of the glucuronidase activity has shown that the induction of activity seems to take place preferentially in the leaves. Note that residual GUS activity is detected in the cotyledon leaves of untreated plants. Treatment with SA (salicylic acid)
Les dosages de l'activité GUS après application d'acide salicylique n'ont pas révélé d'activation de l'expression GUS dans les plantes traitées. La coloration des plantes traitées par le SA est similaire à celle des plantes non traitées et ne met pas en évidence un effet inducteur du SA sur le promoteur PILOX. Ces résultats sont confirmés par des mesures en fluorimétrie qui ne montrent pas non plus un effet inducteur du SA sur le promoteur PILOX aux doses testées. Il a précédemment été montré sur cultures cellulaires que le SA inhibe une voie de signalisation induite par Ppn : des cellules traitées par une combinaison SA + éliciteur de Ppn ont une production d'éthylène inférieure à celle de plantes traitées par l'éliciteur seul (Rickauer et al., Planta, 202:155-162, 1997). Il était intéressant d'étudier l'effet du SA sur l'activité inductrice de l'éliciteur de Ppn sur la voie de signalisation LOX dans nos plantes transgéniques. Des plantes traitées avec l'éliciteur montrent une importante coloration bleue, tant au niveau des feuilles que des racines. Lorsque les plantes sont traitées par l'éliciteur et le SA, cette coloration est moindre, suggérant que le SA a également un effet antagoniste sur l'induction de la LOX par l'éliciteur. Traitement avec H2O2The GUS activity assays after application of salicylic acid did not reveal activation of the GUS expression in the treated plants. The coloring of plants treated with AS is similar to that of untreated plants and does not demonstrate an inducing effect of SA on the PILOX promoter. These results are confirmed by fluorimetry measurements which also do not show an inducing effect of the SA on the PILOX promoter at the doses tested. It has previously been shown on cell cultures that SA inhibits a Ppn-induced signaling pathway: cells treated with an SA + Ppn elicitor combination have a lower ethylene production than plants treated with the elicitor alone (Rickauer et al., Planta, 202: 155-162, 1997). It was interesting to study the effect of SA on the inducing activity of the Ppn elicitor on the LOX signaling pathway in our transgenic plants. Plants treated with the elicitor show a significant blue coloration, both in the leaves and in the roots. When the plants are treated with the elicitor and the SA, this coloration is less, suggesting that the SA also has an antagonistic effect on the induction of LOX by the elicitor. Treatment with H 2 O2
Le peroxyde d'hydrogène a été utilisé pour tester l'effet d'une molécule impliquée dans le choc oxydant sur le promoteur PILOX. Les plantes transgéniques ont été traitées par trois concentrations de peroxyde hydrogène (200 μM, 2 et 20 mM), en présence ou non de catalase (qui détoxifie l'H2O2 in planta). L'activité GUS est détectée histochimiquement après 1 h ou 4 h de traitement. Dans ces conditions, aucun effet inducteur de l'eau oxygénée sur le promoteur PILOX n'a été mis en évidence. Nous avons par ailleurs produit de l'eau oxygénée directement dans nos milieux de traitement en utilisant la glucose oxydase et le glucose (6mM). Ces essais ne mettent pas non plus en évidence un effet inducteur de l'H O2 sur le promoteur PILOX . Traitement avec des produits phytosanitairesHydrogen peroxide was used to test the effect of a molecule involved in oxidative shock on the PILOX promoter. The transgenic plants were treated with three concentrations of hydrogen peroxide (200 μM, 2 and 20 mM), with or without the presence of catalase (which detoxifies H 2 O 2 in planta). GUS activity is detected histochemically after 1 h or 4 h of treatment. Under these conditions, no inducing effect of hydrogen peroxide on the PILOX promoter has been demonstrated. We also produced hydrogen peroxide directly in our treatment media using glucose oxidase and glucose (6mM). These tests also do not demonstrate an inducing effect of H O 2 on the PILOX promoter. Treatment with phytosanitary products
Le dosage de l'activité GUS dans les tissus de plantes traitées par une solution d'Aliette à 125 mg/1 a permis de mettre en évidence une augmentation nette de l'activité. Sur deux lignées transgéniques indépendantes, on mesure des niveaux d'activation compris entre 2 et 8 avec une moyenne de 4.5. Ces résultats sont confirmés par l'analyse histo-chimique de la glucuronidase qui montre l'apparition d'une coloration bleue dans les plantes traitées. L'induction semble concerner les tissus foliaires ainsi que les racines.The assay of GUS activity in the tissues of plants treated with a Aliette solution at 125 mg / 1 made it possible to demonstrate a marked increase in activity. On two independent transgenic lines, we measure activation levels between 2 and 8 with an average of 4.5. These results are confirmed by the histochemical analysis of the glucuronidase which shows the appearance of a blue coloration in the treated plants. The induction seems to concern the leaf tissue as well as the roots.
Le promoteur LOX n'est pas induit par le BION. En effet, l'ensemble des expériences réalisées sur deux lignées transgéniques indique une induction moyenne de l'activité d'un facteur 1.5. The LOX promoter is not induced by BION. Indeed, all of the experiments carried out on two transgenic lines indicate an average induction of activity by a factor of 1.5.

Claims

Revendications claims
1) Polynucleotide comprenant une séquence de régulation promotrice de plante caractérisé en ce qu'il comprend le polynucleotide de la SEQ ID No. 1.1) Polynucleotide comprising a plant promoter regulatory sequence characterized in that it comprises the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
2) Polynucleotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucleotide choisi parmi les polynucleotides suivants: a) un polynucleotide capable de s'hybrider de manière sélective au polynucleotide de la SEQ ID No.l; et b) un polynucleotide homologue à au moins 80 % au polynucleotide de la SEQ ID No. 1.2) Polynucleotide characterized in that it comprises a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) a polynucleotide capable of hybridizing selectively to the polynucleotide of SEQ ID No. 1; and b) a polynucleotide homologous at least 80% to the polynucleotide of SEQ ID No. 1.
3) Polynucleotide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il a une activité promotrice dans les cellules végétales et les plantes.3) Polynucleotide according to claim 2 characterized in that it has a promoter activity in plant cells and plants.
4) Polynucleotide selon l'une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que ladite activité promotrice est induite en réponse à une agression par un pathogène.4) Polynucleotide according to one of claims 2 or 3 characterized in that said promoter activity is induced in response to aggression by a pathogen.
5) Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes comprenant dans le sens de la transcription, une séquence de régulation promotrice en 5', une séquence codante et une séquence de régulation en 3', caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice en 5' comprend un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4.5) Cassette of functional expression in plant cells or plants comprising, in the direction of transcription, a promoter regulatory sequence in 5 ′, a coding sequence and a regulatory sequence in 3 ′, characterized in that the sequence of 5 'promoter regulation comprises a polynucleotide according to one of claims 1 to 4.
6) Cassette d'expression selon la revendication 5 caractérisée en ce que la séquence codante comprend une séquence codant pour un gène rapporteur ou une séquence codant pour une protéine d'intérêt.6) Expression cassette according to claim 5 characterized in that the coding sequence comprises a sequence coding for a reporter gene or a sequence coding for a protein of interest.
7) Cassette d'expression selon la revendication 6 caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est une protéine conférant aux plantes des propriétés de résistance aux maladies ou aux insectes.7) Expression cassette according to claim 6 characterized in that the protein of interest is a protein conferring on plants resistance properties to diseases or insects.
8) Cassette d'expression selon la revendication 7 caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est choisi parmi les éliciteurs fongiques ou les peptides lytiques.8) Expression cassette according to claim 7 characterized in that the protein of interest is chosen from fungal elicitors or lytic peptides.
9) Vecteur comprenant un polynucleotide selon l'une des revendications 1-8.9) Vector comprising a polynucleotide according to one of claims 1-8.
10) Procédé de transformation des cellules végétales caractérisé en ce qu'il consiste à intégrer dans le génome des dites cellules végétales au moins un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4, au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 à 8 ou un vecteur selon la revendication 9.10) Process for transforming plant cells, characterized in that it consists in integrating into the genome of said plant cells at least one polynucleotide according to one of claims 1 to 4, at least one expression cassette according to one of claims 5 to 8 or a vector according to claim 9.
11) Cellules végétales transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 à 8 ou un vecteur selon la revendication 9.11) Transformed plant cells characterized in that they comprise a polynucleotide according to one of claims 1 to 4, an expression cassette according to one of claims 5 to 8 or a vector according to claim 9.
12) Procédé d'obtention de plantes transformées caractérisé en ce que: a) on transforme des cellules végétales par intégration dans le génome des dites cellules végétales d'au moins un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4, d'au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 à 8 ou d'un vecteur selon la revendication 9; et b) on régénère une plante à partir des cellules végétales transformées.12) Process for obtaining transformed plants characterized in that: a) plant cells are transformed by integration into the genome of said plant cells of at least one polynucleotide according to one of claims 1 to 4, at least an expression cassette according to one of claims 5 to 8 or a vector according to claim 9; and b) a plant is regenerated from the transformed plant cells.
13) Procédé d'obtention de plantes transformées caractérisé en ce que: a) on transforme des cellules végétales par intégration dans le génome des dites cellules végétales d'au moins un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4, d'au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 à 8 ou d'un vecteur selon la revendication 9; et b) on régénère une plante à partir des cellules végétales transformées, et c) on croise la plante régénérée avec d'autres plantes.13) Process for obtaining transformed plants characterized in that: a) plant cells are transformed by integration into the genome of said plant cells of at least one polynucleotide according to one of claims 1 to 4, at least an expression cassette according to one of claims 5 to 8 or a vector according to claim 9; and b) a plant is regenerated from the transformed plant cells, and c) the regenerated plant is crossed with other plants.
14) Plantes transformées susceptibles d'être obtenues par un procédé selon les revendications 12 ou 13.14) Transformed plants capable of being obtained by a process according to claims 12 or 13.
15) Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent un polynucleotide selon l'une des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 à 8 ou un vecteur selon la revendication 9.15) Transformed plants characterized in that they comprise a polynucleotide according to one of claims 1 to 4, an expression cassette according to one of claims 5 to 8 or a vector according to claim 9.
16) Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles contiennent des cellules transformées selon la revendication 11.16) Transformed plants characterized in that they contain transformed cells according to claim 11.
17) Plantes transformées selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisées en ce qu'elles sont choisi parmi les plantes suivantes : le tabac, le blé, l'orge, le sorgho le riz, le maïs, le soja, le colza, le coton, le tournesol, la betterave, le trèfle.17) Plants transformed according to one of claims 14 to 16, characterized in that they are chosen from the following plants: tobacco, wheat, barley, sorghum rice, corn, soybeans, rapeseed , cotton, sunflower, beet, clover.
18) Graines des plantes transformées selon l'une des revendications 14 à 17. 18) Seeds of the plants transformed according to one of claims 14 to 17.
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