WO2001098780A2 - Assay for detecting primary dna damage - Google Patents

Abstract

The invention relates to a method for detecting DNA damage. According to said method, the occurrence of a specific interaction between the DNA to be examined and DNA repair proteins, especially the recombinant UvrA/UvrB protein of E.coli is determined. The invention also relates to a reagent kit for carrying out the method.

Description

Assay zur Detektion von primären DNA-SchädenAssay for the detection of primary DNA damage

Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Schädigungen, wobei man das Auftreten einer spezifischen Wechselwirkung zwischen der zu untersuchenden DNA und DNA-Reparaturproteinen, insbesondere dem rekombinanten UvrA-/UvrB-Protein von £. coli bestimmt. Weiterhin wird ein Reagenzienkit zur Durchführung des Verfahrens offenbart.The invention relates to a method for the detection of DNA damage, wherein the occurrence of a specific interaction between the DNA to be examined and DNA repair proteins, in particular the recombinant UvrA / UvrB protein of £. coli determined. A reagent kit for carrying out the method is also disclosed.

Substanzen, die mit dem menschlichen Körper in Kontakt kommen, wie etwa Nahrungsmittelzusätze, Medikamente und Kosmetika, unterliegen einem Zulassungsverfahren, in dessen Verlauf sie auf Genotoxizität getestet werden. Dabei werden die Substanzen in geeigneten Testsystemen auf die Verursachung von DNA-Schädigungen getestet. Solche DNA-Schädigungen können Chromosomenmutationen, wie Deletionen oder Translokationen oder Genommutationen, wie Aneuploidien, sein, die durch lichtmikroskopische Untersuchungen festgestellt werden können. Weiterhin können reziproke Austausche zwischen DNA-Molekülen ei nes replizierten Chromosoms, sogenannte Schwesterchromatidaustausche, auftreten. Methoden, mit denen derart große DNA-Schädigungen sichtbar gemacht werden können, sind beispielsweise der Comet-Assay und der Schwester- Chromatidenaustausch-Assay, mit denen DNA-Strangbrüche und chromosomale Strangaustausche detektiert werden können.Substances that come into contact with the human body, such as food additives, medicines and cosmetics, are subject to an approval process, during which they are tested for genotoxicity. The substances are tested in suitable test systems for the cause of DNA damage. Such DNA damage can be chromosome mutations, such as deletions or translocations, or genome mutations, such as aneuploidies, which can be determined by light microscopic examinations. Reciprocal exchanges between DNA molecules of a replicated chromosome, so-called sister chromatid exchanges, can also occur. Methods with which such large DNA damage can be made visible are, for example, the comet assay and the sister chromatid exchange assay, with which DNA strand breaks and chromosomal strand exchanges can be detected.

Andere Arten von DNA-Schäden, z.B. Modifikationen oder Austausche einzelner oder weniger Basen, können auf diese Weise jedoch nicht nachgewiesen werden. Zur Abschätzung des genotoxischen und mutagenen Potenzials einer Substanz werden daher indirekte Verfahren, wie der Arnes-Test, das UDS-Verfahren oder die in US 6,060,288, US 5,707,806 und US 5,571 ,676 beschriebenen Verfahren, verwendet. Zum direkten Nachweis primärer DNA-Schädigungen, also von kovalenten Basenmodifikationen, gibt es zur Zeit nur eine sehr aufwendige und radioaktive Methode, das ³²P-Postlabeling-Verfahren.However, other types of DNA damage, such as modifications or exchanges of individual or fewer bases, cannot be detected in this way. Indirect methods such as the Arnes test, the UDS method or those described in US Pat. No. 6,060,288, US are therefore used to estimate the genotoxic and mutagenic potential of a substance 5,707,806 and US 5,571, 676 methods used. For the direct detection of primary DNA damage, i.e. of covalent base modifications, there is currently only one very complex and radioactive method, the ³² P postlabeling method.

Der Ames-Test weist Genmutationen in Bakterien nach. Hierbei werden Stämme von Salmonella typhimurium verwendet, die die Aminosäure Histidin nicht mehr synthetisieren können, da mehrere Gene des Histidin- Synthesewegs durch Mutationen inaktiviert sind. Die Bakterien und die Testsubstanz werden mit und ohne Zusatz eines metabolisierenden Aktivierungssystems auf Platten mit Minimalmedien gezogen (Arnes et al. (1973), PNAS USA 70, 782 - 786 und Arnes et al. (1973), PNAS USA 70, 2281 - 2285). Mutationen können hierbei zu Rückmutationen der defekten Gene, Produktion von Histidin und somit Bakterienwachstum führen. Anschließend wird die Zahl der durch die Testsubstanz induzierten Revertanten mit der Zahl von Spontanrevertanten einer Kontrollplatte verglichen. Der Ames-Test ist zwar relativ sensitiv, um positive Befunde abzusichern, es sollten jedoch immer zusätzlich andere Testsysteme verwendet werden, da durch den Ames-Test nur ein Hinweis auf ein mutagenes Potenzial gegeben wird. Andererseits ist ein negatives Ergebnis keine Garantie für das Fehlen eines mutagenen Potenzials (Fahrig (1993), Mutationsforschung und Genetische Toxikologie, Wissenschaftliche Buchgesellschaft Darmstadt).The Ames test detects gene mutations in bacteria. Strains of Salmonella typhimurium are used here, which can no longer synthesize the amino acid histidine, since several genes of the histidine synthesis pathway are inactivated by mutations. The bacteria and the test substance are drawn on plates with minimal media with and without the addition of a metabolizing activation system (Arnes et al. (1973), PNAS USA 70, 782-786 and Arnes et al. (1973), PNAS USA 70, 2281-2285 ). Mutations can lead to reverse mutations of the defective genes, production of histidine and thus bacterial growth. The number of revertants induced by the test substance is then compared with the number of spontaneous revertants on a control plate. Although the Ames test is relatively sensitive to ensure positive results, other test systems should always be used, since the Ames test only gives an indication of a mutagenic potential. On the other hand, a negative result is no guarantee for the lack of a mutagenic potential (Fahrig (1993), Mutation Research and Genetic Toxicology, Scientific Book Society Darmstadt).

Beim UDS (unscheduled DNA synthesis)-Verfahren wird der Einbau von radioaktivem Thymidin bei chemisch induzierter DNA-Reparatursynthese als Parameter für die Genotoxizität einer Testsubstanz verwendet. Hierbei können beispielsweise primäre Hepatozytenkulturen aus der Rattenleber mit der Testsubstanz behandelt werden. Anschließend werden die Zellen fixiert und mit einer dünnen Fotoschicht überzogen. Anhand der Schwärzung kann das Ausmaß der Reparatursynthese und somit die durch die Substanz verursachte DNA-Schädigung abgeschätzt werden. Durch das UDS- Verfahren werden genotoxische Substanzen aus unterschiedlichen Substanzklassen erfasst. Hierbei werden zwar kaum falsch-positive, jedoch eine Reihe falsch-negativer Ergebnisse ermittelt (Williams (1989), Mutation Res. 221 , 263-289), da Substanzen nur dann erfasst werden, wenn sie eine unerwartete zusätzliche DNA-Synthese bewirken. Die direkte DNA- Schädigung durch die Substanz kann mittels UDS nicht gemessen werden. Nachteile des Verfahrens sind jedoch die Verwendung radioaktiver Isotope und die fehlende Möglichkeit zur Automatisierung.In the UDS (unscheduled DNA synthesis) method, the incorporation of radioactive thymidine in chemically induced DNA repair synthesis is used as a parameter for the genotoxicity of a test substance. For example, primary hepatocyte cultures from rat liver can be treated with the test substance. The cells are then fixed and covered with a thin layer of photos. The extent of the repair synthesis and thus the DNA damage caused by the substance can be estimated on the basis of the blackening. Through the UDS Methods are used to record genotoxic substances from different classes of substances. Although hardly any false-positive results are found here, a number of false-negative results (Williams (1989), Mutation Res. 221, 263-289), since substances are only detected if they cause an unexpected additional DNA synthesis. The direct DNA damage caused by the substance cannot be measured using UDS. Disadvantages of the process are the use of radioactive isotopes and the lack of automation.

Mit Hilfe des in US 6,060,288 beschriebenen Verfahrens kann die Genotoxizität einer Testsubstanz abgeschätzt werden. Dabei wird ein Oligonukleotid an eine optische Faser fixiert und mit der Testsubstanz inkubiert. Anschließend wird das Oligonukleotid mit einer Reaktionsmischung behandelt, die unter anderem die E. coli Proteine UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, DNA-Polymerase I, DNA-Ligase und Fluoreszenzmarkierte Deoxynukleotidtriphosphate enthält. Durch Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Reparatur kann die durch die Testsubstanz verursachte DNA-Schädigung abgeschätzt werden. Allerdings können durch das in US 6,060,288 beschriebene Verfahren nur genotoxische Substanzen erfasst werden, die DNA-Schädigungen verursachen, die im vorliegenden System durch Neusynthese repariert werden.The genotoxicity of a test substance can be estimated using the method described in US Pat. No. 6,060,288. An oligonucleotide is fixed to an optical fiber and incubated with the test substance. The oligonucleotide is then treated with a reaction mixture which contains, among other things, the E. coli proteins UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, DNA polymerase I, DNA ligase and fluorescence-labeled deoxynucleotide triphosphates. By determining the extent of DNA repair, the DNA damage caused by the test substance can be estimated. However, the method described in US Pat. No. 6,060,288 can only detect genotoxic substances which cause DNA damage which are repaired in the present system by new synthesis.

US 5,707,806 und US 5,571 ,676 beschreiben Verfahren zum Nachweis von genetischen Veränderungen einer Ziel-DNA-Sequenz. Die Verfahren beruhen auf der Bildung eines teilweise ungepaarten Doppelstranges durch Fehlpaarung und Auseinanderlagerung des mutierten und des nicht mutierten DNA-Stranges und der anschließenden Reparatur des veränderten bzw. geschädigten DNA-Abschnitts durch Behandlung mit DNA- Reparaturproteinen. Anhand der Bestimmung des Ausmaßes der DNA- Reparatur können genetische Veränderungen der Ziel-DNA-Sequenz bestimmt werden. Jedoch können mit Hilfe der in US 5,707,806 und US 5,571 ,676 beschriebenen Verfahren nur genetische Veränderungen der Ziel-DNA-Sequenz erfasst werden, die im vorliegenden System durch Neusynthese repariert werden.US 5,707,806 and US 5,571, 676 describe methods for the detection of genetic changes in a target DNA sequence. The methods are based on the formation of a partially unpaired double strand by mismatching and separating the mutated and the non-mutated DNA strand and the subsequent repair of the altered or damaged DNA section by treatment with DNA repair proteins. By determining the extent of the DNA repair, genetic changes in the target DNA sequence can be determined. However, with the help of the methods described in US 5,707,806 and US 5,571, 676, only genetic changes in the Target DNA sequence are recorded, which are repaired in the present system by new synthesis.

Die Postlabeling-Methode ist derzeit das einzige gängige Verfahren, mit dem kovalente Basenmodifikationen, also primäre DNA-Schädigungen, direkt nachgewiesen werden können (Keith und Dirheimer (1995), CurrentThe postlabeling method is currently the only common method with which covalent base modifications, i.e. primary DNA damage, can be detected directly (Keith and Dirheimer (1995), Current

Opinion in Biotechnology 6, 3-1 1 ). Hierzu wird die zu untersuchende DNA mit Nuklease und Phosphodiesterase zu den 3'-Nukleotiden abgebaut. MitOpinion in Biotechnology 6, 3-1 1). For this purpose, the DNA to be examined is degraded to the 3'-nucleotides using nuclease and phosphodiesterase. With

[)^²-P]-ATP werden die 3'-Nukleotide durch Phosphorylierung der 5'- Position radioaktiv markiert. Durch chromatografische, z.B. Dünnschicht- chromatografische Untersuchungen können Basenmodifikationen, z.B.[) ^ ² -P] -ATP, the 3'-nucleotides are radioactively labeled by phosphorylation of the 5'-position. Base modifications, for example, can be carried out by chromatographic, for example thin-layer, chromatographic investigations

Alkylierungen oder Metallkomplexe, von unmodifizierten Nukleotiden abgetrennt werden. Diese Methode ist zwar hoch sensitiv, aber sehr aufwendig in ihrer Durchführung. Außerdem werden mit dieser Methode auch modifizierte Nukleotide erkannt, die natürlichen Ursprungs sind, wie z.B. methylierte Nukleotide, was zu falsch positiven Resultaten führen kann.Alkylations or metal complexes can be separated from unmodified nucleotides. Although this method is highly sensitive, it is very complex to carry out. In addition, this method also recognizes modified nucleotides that are of natural origin, e.g. methylated nucleotides, which can lead to false positive results.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Schädigungen bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind. Außerdem sollte das Verfahren ohne Radioaktivität und einfach durchführbar sein, es sollte weiterhin eine hohe Sensitivität und ein breites Detektionsspektrum aufweisen. Außderdem sollte das Verfahren in einen automatisierten Prozess integrierbar sein, um Screening-Studien zu ermöglichen.The object underlying the present invention was therefore to provide a method for detecting DNA damage in which the disadvantages of the prior art are at least partially eliminated. In addition, the method should be radioactive and easy to carry out, it should continue to have a high sensitivity and a wide detection spectrum. In addition, the method should be able to be integrated into an automated process in order to enable screening studies.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Detektion von DNA- Schädigungen, insbesondere UV- oder chemisch induzierten Primärschädigungen, durch ein in vitro Testsystem unter Verwendung von DNA-Reparaturproteinen, insbesondere mit Enzymen des bakteriellen UvrABC-Ausschnittsreparatursystems, gelingt. So konnte durch Bindung von UvrB in Gegenwart von UvrA ein hochsensitives in vitro Testsystem bereitgestellt werden, mit dem eine Vielzahl unterschiedlicher DNA- Schädigungen von DNA-Addukten über strukturelle Veränderungen bis Interkalationen nachgewiesen werden kann. Das entwickelte Testsystem ist als Hochdurchsatz-System automatisierbar, kostengünstig und schnell. Weiterhin besitzt es eine hohe Sensitivität, so dass beispielsweise ein Cisplatin-Addukt auf ungefähr 380 000 ungeschädigte Basen in genomischer DNA nachgewiesen werden kann. Diese Empfindlichkeit wird unter den etablierten Genotoxizitätstests bisher nur beim radioaktiven Postlabeling-Verfahren erreicht, welches jedoch nicht automatisierbar ist. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass es die direkte Untersuchung von genomischer DNA, beispielsweise aus behandelten Zellen oder Gewebe, Biopsiematerial oder Blut, auf Primärschädigungen erlaubt.Surprisingly, it was found that DNA damage, in particular UV or chemically induced primary damage, can be detected by an in vitro test system using DNA repair proteins, in particular with enzymes of the bacterial UvrABC clipping repair system. So through bonding a highly sensitive in vitro test system is provided by UvrB in the presence of UvrA, with which a variety of different DNA damage from DNA adducts via structural changes to intercalations can be detected. The developed test system can be automated as a high-throughput system, inexpensively and quickly. Furthermore, it has a high sensitivity, so that, for example, a cisplatin adduct can be detected on approximately 380,000 undamaged bases in genomic DNA. This sensitivity has so far only been achieved with the established genotoxicity tests using the radioactive postlabeling method, which, however, cannot be automated. Another advantage of the method is that it allows the direct examination of genomic DNA, for example from treated cells or tissue, biopsy material or blood, for primary damage.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Schäden, wobei man die zu untersuchende DNA-Probe in vitro mit DNA-Reparaturproteinen unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren DNA- Reparaturproteinen und geschädigter DNA erfolgt und das Auftreten der spezifischen Wechselwirkung als Maß für das Vorhandensein von DNA- Schäden bestimmt.The invention thus relates to a method for detecting DNA damage, the DNA sample to be examined being brought into contact with DNA repair proteins in vitro under conditions in which a specific interaction between one or more DNA repair proteins and damaged DNA occurs and the occurrence of the specific interaction is determined as a measure of the presence of DNA damage.

Zur in vitro Detektion von DNA-Schädigungen geeignete Proteine können Proteine von DNA-Reparatursystemen aus Eukaryonten oder Bakterien sein. Es können DNA-Fehlpaarungen erkennende Proteine (z.B. menschliches hMSH2, bakterielles mutS) verwendet werden (Modrich, P. (1991 ), Annual Reviews in Genetics 25, 229-253). Besonders geeignet sind die Proteine des bakteriellen Ausschnitt-DNA-Reparatursystems UvrABC (Grossmann, , Yeung, A.T. (1990), Photochemistry and Photobiology 51 , 749-755). Besonders bevorzugt werden rekombinant exprimierte und gereinigte Proteine des UvrABC Systems aus E. coli verwendet. Die Proteine UvrA und UvrB stammen aus dem Ausschnittsreparatursystem UvrABC von E. coli, das ein breites Spektrum von DNA-Schädigungen erkennt und in vivo im geschädigten DNA-Strang auf beiden Seiten der Schädigung Einzelstrangbrüche einführt, wonach die Basen zwischen den Einzelstrangbrüchen durch die DNA-Polymerase I abgebaut und mit der DNA-Polymerase I durch ungeschädigte Basen ersetzt werden. Die Struktur des uvrA Gens ist bei Husain et al. (J. Biol. Chem. 261 (1986), 4895- 4901 ) angegeben. Die Struktur des uvrB Gens ist bei Backendorf et al. (Nucleic Acids Res. 14 (1986), 2877-2890) angegeben. Das UvrA Protein ist eine ATPase, die als Dimer an DNA bindet. Während die Wechselwirkung mit ATP die Dimerisierung des Proteins bewirkt, ist die Hydrolyse von ATP wichtig für die Unterscheidung zwischen normaler und geschädigter DNA. Im Gegensatz zu UvrA bindet UvrB als Monomer. Wie in Polarisationsmessungen gezeigt werden konnte, ist in Gegenwart von ATP die Bindungsaffinität des (UvrA)₂B Komplexes an geschädigte DNA deutlich höher als die Affinität an nicht geschädigte DNA. Dieser Unterschied kann zur direkten Detektion primärer DNA-Modifikationen genutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beruht das erfindungsgemäße Verfahren daher auf dem Nachweis von DNA- Modifikationen durch spezifische Bindung des (UvrA)₂B Komplexes und insbesondere der UvrB-Komponente des Komplexes an geschädigte DNA (siehe z.B. Abbildung 1 ).Proteins suitable for in vitro detection of DNA damage can be proteins from DNA repair systems from eukaryotes or bacteria. Proteins recognizing DNA mismatches (eg human hMSH2, bacterial mutS) can be used (Modrich, P. (1991), Annual Reviews in Genetics 25, 229-253). The proteins of the bacterial cut-out DNA repair system UvrABC (Grossmann,, Yeung, AT (1990), Photochemistry and Photobiology 51, 749-755) are particularly suitable. Recombinantly expressed and purified proteins of the UvrABC system from E. coli are particularly preferably used. The UvrA and UvrB proteins come from the E. coli cut-out repair system UvrABC, which recognizes a broad spectrum of DNA damage and introduces single-strand breaks in vivo in the damaged DNA strand on both sides of the damage, after which the bases between the single-strand breaks are broken down by the DNA Polymerase I degraded and replaced with the DNA polymerase I by undamaged bases. The structure of the uvrA gene is described in Husain et al. (J. Biol. Chem. 261 (1986), 4895-4901). The structure of the uvrB gene is described in Backendorf et al. (Nucleic Acids Res. 14 (1986), 2877-2890). The UvrA protein is an ATPase that binds to DNA as a dimer. While the interaction with ATP causes the dimerization of the protein, the hydrolysis of ATP is important for the distinction between normal and damaged DNA. In contrast to UvrA, UvrB binds as a monomer. As could be shown in polarization measurements, the binding affinity of the (UvrA) ₂ B complex to damaged DNA is significantly higher in the presence of ATP than the affinity for undamaged DNA. This difference can be used for the direct detection of primary DNA modifications. In a preferred embodiment, the method according to the invention is therefore based on the detection of DNA modifications by specifically binding the (UvrA) ₂ B complex and in particular the UvrB component of the complex to damaged DNA (see, for example, FIG. 1).

Das Verfahren beruht darauf, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren DNA-Reparaturproteinen und geschädigter DNA erfolgt. Der Begriff "spezifische Wechselwirkung" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass eine Spezifität für geschädigte DNA gegenüber nicht geschädigter DNA vorhanden ist, die ausreicht, um das Auftreten von DNA-Schädigungen nachzuweisen. Die Spezifität der Wechselwirkung für geschädigte DNA ist vorzugsweise um mindestens den Faktor 10² und besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10³ höher als für nicht geschädigte DNA. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die spezifische Wechselwirkung eine hochaffine und selektive Bindung eines DNA-Reparaturproteins an die geschädigte DNA.The method is based on a specific interaction between one or more DNA repair proteins and damaged DNA. The term "specific interaction" in the sense of the present invention means that there is a specificity for damaged DNA in relation to undamaged DNA which is sufficient to detect the occurrence of DNA damage. The specificity of the interaction for damaged DNA is preferably higher by at least a factor of 10 ² and particularly preferably by at least a factor of 10 ³ than for undamaged DNA. In a particularly preferred embodiment, the specific interaction comprises a high affinity and selective binding of a DNA repair protein to the damaged DNA.

Die Bindung von DNA-Reparaturproteinen, insbesondere des (UvrA)₂B Komplexes, an die geschädigte DNA wird vorzugsweise in Gegenwart von ATP bestimmt. ATP kann dem Testreagenz zugegeben werden. Gegebenenfalls kann das Testreagenz auch ein ATP-Regenerationssystem, z.B. das System Phosphoenolpyruvat (PEP) und Pyruvatkinase, das System Kreatinphosphat und Kreatinkinase oder das System 1 ,3- Bisphosphoglycerat, NADH/NAD⁺ und Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase, umfassen.The binding of DNA repair proteins, in particular the (UvrA) ₂ B complex, to the damaged DNA is preferably determined in the presence of ATP. ATP can be added to the test reagent. If necessary, the test reagent can also comprise an ATP regeneration system, for example the system phosphoenolpyruvate (PEP) and pyruvate kinase, the system creatine phosphate and creatine kinase or the system 1, 3-bisphosphoglycerate, NADH / NAD ⁺ and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

Das Inkontaktbringen der zu untersuchenden DNA mit den DNA- Reparaturproteinen erfolgt vorzugsweise derart, dass die DNA in einer Form eingesetzt wird, die die freie Beweglichkeit der DNA-Reparturproteine auf der DNA nicht behindert. Hierzu kann die DNA beispielsweise in einer nicht immobilisierten Form eingesetzt werden. Nach einer ausreichenden Inkubationsdauer kann die zu untersuchende DNA mit dem gegebenenfalls daran gebundenen Protein(Komplex) an einer Festphase immobilisiert und das Auftreten der spezifischen Wechselwirkung an der immobilisierten DNA bestimmt werden. Die Festphase kann beliebig ausgewählt werden, sofern sie eine ausreichende Immobilisierung der DNA ermöglicht. Vorzugsweise werden als Festphasen Reaktionsgefäße, Mikrotiterplatten, Chips und gegebenenfalls magnetische Partikel eingesetzt, wobei solche Festphasen wie etwa Mikrotiterplatten, Chips und Partikel besonders bevorzugt sind, die eine Automatisierung des Verfahrens ermöglichen. Die Immobilisierung der DNA an die Festphase kann nach bekannten Methoden, z.B. über Antikörper gegen doppelsträngige DNA oder auf andere Weise, z.B. durch Verwendung DNA bindender Festphasen, wie magnetischer Glaspartikel, erfolgen (siehe z.B. Abbildung 2). Wenn die verwendete DNA gezielte Modifikationen (z.B. eine Markierung mit Biotin am 5'-Ende) trägt, können auch Matrices eingesetzt werden, die mit den entsprechenden Bindungspartnern der modifizierenden Reste beschichtet sind (z.B. Streptavidin).The DNA to be examined is brought into contact with the DNA repair proteins preferably in such a way that the DNA is used in a form which does not hinder the free mobility of the DNA repair proteins on the DNA. For this purpose, the DNA can be used in a non-immobilized form, for example. After a sufficient incubation period, the DNA to be examined can be immobilized on a solid phase with the protein (complex) possibly bound to it, and the occurrence of the specific interaction on the immobilized DNA can be determined. The solid phase can be selected as long as it allows sufficient immobilization of the DNA. Reaction vessels, microtiter plates, chips and, if appropriate, magnetic particles are preferably used as solid phases, solid phases such as, for example, microtiter plates, chips and particles which permit automation of the method being particularly preferred. The DNA can be immobilized on the solid phase by known methods, for example using antibodies against double-stranded DNA or in another way, for example by using DNA-binding solid phases, such as magnetic glass particles (see, for example, Figure 2). If the DNA used is targeted Modifications (eg a label with biotin at the 5 'end) can also be used matrices which are coated with the corresponding binding partners of the modifying residues (eg streptavidin).

Die Bestimmung des Auftretens einer spezifischen Wechselwirkung zwischen DNA-Reparaturprotein und geschädigter DNA erfolgt vorzugsweise durch Bestimmung eines an die geschädigte DNA gebundenen DNA-Reparaturproteins oder eines Proteinkomplexes. Hierzu werden für das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise markierte DNA- Reparaturproteine eingesetzt. So können beispielsweise DNA- Reparaturproteine verwendet werden, die direkte oder indirekte Markierungen tragen. Direkt markierte DNA-Reparaturproteine tragen eine oder mehrere signalgebende Gruppen, während indirekt markierte Proteine eine oder mehrere Gruppen tragen, die wiederum mit signalgebenden Gruppen reagieren können. Die Markierung ist vorzugsweise eine nichtradioaktive Markierung, insbesondere eine durch optische Methoden nachweisbare Markierung, beispielsweise eine Fluoreszenz, eine Lumineszenz- oder eine Enzymmarkierung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes DNA- Reparaturprotein verwendet, welches ein Hapten trägt. An dieses Hapten kann dann ein Antikörper binden, der eine Markierung trägt, die direkt nachgewiesen werden kann (z.B. Fluoreszenzfarbstoff), oder eine Markierung trägt, die in einer anschließenden Enzymreaktion detektiert werden kann (z.B. Peroxidase oder Luciferase), oder eine Markierung trägt, die von anderen Molekülen gebunden wird, die wiederum eine direkte Markierung oder Enzymmarkierung tragen (z.B. Biotin, gebunden von Avidin, das an das Enzym Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist).The occurrence of a specific interaction between DNA repair protein and damaged DNA is preferably determined by determining a DNA repair protein or a protein complex bound to the damaged DNA. For this purpose, labeled DNA repair proteins are preferably used for the method according to the invention. For example, DNA repair proteins that carry direct or indirect labels can be used. Directly labeled DNA repair proteins carry one or more signaling groups, while indirectly labeled proteins carry one or more groups, which in turn can react with signaling groups. The label is preferably a non-radioactive label, in particular a label that can be detected by optical methods, for example a fluorescence, a luminescence or an enzyme label. In a particularly preferred embodiment of the invention, a recombinant DNA repair protein is used which carries a hapten. An antibody can then bind to this hapten, which carries a label that can be detected directly (e.g. fluorescent dye), or a label that can be detected in a subsequent enzyme reaction (e.g. peroxidase or luciferase), or carries a label that is bound by other molecules, which in turn carry a direct label or enzyme label (eg biotin, bound by avidin, which is coupled to the enzyme horseradish peroxidase).

Genauso können auch die Proteine immobilisiert werden, wobei dann die Bindung der zu analysierenden DNA an die feste Matrix eine Schädigung anzeigt (Abbildung 3). Dadurch wird die Nachweisempfindlichkeit erheblich erhöht. Beispielsweise kann der quantitative Nachweis von DNA- Schädigungen in einem Kompetitionsverfahren erfolgen. Dazu wird die zu untersuchende DNA-Probe zusammen mit markierter DNA, die eine definierte Anzahl Schädigungen trägt, mit den Reparaturproteinen inkubiert. Anschließend wird das UvrB-Protein immobilisiert. Als Fänger kann ein auf der Oberfläche der Festphase aufgebrachter Antikörper dienen, der gegen das UvrB-Protein oder ein daran gebundenes Hapten, z.B. das T7-Tag, gerichtet sein kann. Die DNA wird in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise in fluoreszenzmarkierter Form eingesetzt. Dann wird die Menge der an der Festphase gebundenen markierten DNA z.B. fluoreszenzspektroskopisch bestimmt. Aus der Kompetition zwischen markierter DNA und unmarkierter Proben-DNA kann dann die relative Anzahl der Schädigungen in der zu untersuchenden DNA- Probe bestimmt werden.The proteins can also be immobilized in the same way, in which case the binding of the DNA to be analyzed to the solid matrix indicates damage (Figure 3). This increases the sensitivity of detection elevated. For example, the quantitative detection of DNA damage can be done in a competition process. For this purpose, the DNA sample to be examined is incubated with the repair proteins together with labeled DNA, which bears a defined number of damages. The UvrB protein is then immobilized. An antibody applied to the surface of the solid phase, which can be directed against the UvrB protein or a hapten bound to it, for example the T7 tag, can serve as a catcher. In this embodiment of the method according to the invention, the DNA is preferably used in fluorescence-labeled form. The amount of labeled DNA bound to the solid phase is then determined, for example, by fluorescence spectroscopy. The relative number of damages in the DNA sample to be examined can then be determined from the competition between labeled DNA and unlabeled sample DNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nicht nur eine qualitative Bestimmung des Vorhandenseins von DNA-Schäden, sondern auch eine quantitative Bestimmung, da eine Zunahme der Anzahl von DNA-Schäden mit einer Zunahme der Wechselwirkung zwischen DNA-Reparaturproteinen und geschädigter DNA einhergeht. Die durch das Verfahren erkannten DNA-Schäden sind solche Schädigungen, wie sie durch Strahlung oder/und chemische Substanzen verursacht werden, beispielsweise Basenmodifikationen, Basenverluste und Interkalationen. In der nachfolgenden Tabelle 1 sind Beispiele für DNA-Schädigungen angegeben, die nach Van Houten (Microbiol. Rev. 54 (1990), 18-51 ) durch das (UvrA)₂B-Heterotrimer erkannt werden.The method according to the invention allows not only a qualitative determination of the presence of DNA damage, but also a quantitative determination, since an increase in the number of DNA damage is accompanied by an increase in the interaction between DNA repair proteins and damaged DNA. The DNA damage recognized by the method is such damage as is caused by radiation and / or chemical substances, for example base modifications, base losses and intercalations. Table 1 below gives examples of DNA damage which, according to Van Houten (Microbiol. Rev. 54 (1990), 18-51), are recognized by the (UvrA) ₂ B heterotrimer.

Tabelle 1Table 1

DNA-schädigende Substanzen Addukt(e)DNA-damaging substances adduct (s)

N-Acetoxy-2-acetylaminofluoren C-8-GuaninN-acetoxy-2-acetylaminofluorene C-8 guanine

Anthramycin N-2-GuaninAnthramycin N-2 guanine

Apurinβ Stelle BasβnverlustApurine site loss of base

Apurine Stelle (reduziert) Ringöffnung nach Basenverlust Al oxamin-modif izierte apurineApurine site (reduced) ring opening after base loss Al oxamine-modified apurine

Stelle A -AnalogPosition A -Analog

Benzo [cd pyrendiolepoxid N-2 -GuaninBenzo [cd pyrendiolepoxide N-2 guanine

Cisplatin und Transplatin N-7 -Guanin Cyσlohexylcarbodiimid tlngepaarte G- und T-ResteCisplatin and transplatin N-7 guanine cyclohexylcarbodiimide paired G and T residues

Di ercalan um Nicht kovalente BisinterkalationDi ercalan for non-covalent bisintercalation

Doxorubicin und AD32 InterkalationDoxorubicin and AD32 intercalation

N-Hydroxya inofluoren C- 8 -GuaninN-Hydroxy inofluorene C-8 guanine

N,N' -bis (2-Chloroethyl) -N- Nitrosoharnstoff Bifunktionale AlkylierungN, N '-bis (2-chloroethyl) -N-nitrosourea Bifunctional alkylation

N-Methyl-N' -Nitro-N-N-methyl-N '-nitro-N-

Nitrosoguanidin (MNNG) 0^S -Methyl guaninNitrosoguanidine (MNNG) 0 ^S -methyl guanine

Mitomycin N-7 -GuaninMitomycin N-7 guanine

Mechlorethamin Hydrochlorid Bifunktionale Alkylierung 4 -Nitroquinolin-l-0xid InterkalationMechlorethamine Hydrochloride Bifunctional alkylation 4-nitroquinoline-l-0xid intercalation

C-8, N-2-Guanin, N-6-AdeninC-8, N-2 guanine, N-6 adenine

6 -4 Photoprodukt (UV-Bestrahlung) C-6, C-4-PyC Psoralen C-5, C-6-Thymin Pyrimidin Dinier C-5, C-6-Pyrimidin Thymin Glykol C-5, C-6-Thymin6 -4 Photoproduct (UV radiation) C-6, C-4-PyC Psoralen C-5, C-6-thymine pyrimidine Dinier C-5, C-6-pyrimidine thymine glycol C-5, C-6-thymine

Bei der zu untersuchenden DNA kann es sich um genomische DNA aus Zellen oder Organismen handeln. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens ist, dass auch eukaryontische DNA und insbesondere humane DNA untersucht werden kann. Selbstverständlich können jedoch auch andere Arten von DNA, beispielsweise bakterielle DNA oder synthetische DNA, untersucht werden. Die DNA stammt vorzugsweise aus biologischen Proben, in denen die Anzahl der DNA-Schädigungen bestimmt werden soll. Die biologischen Proben können aus tierischen oder humanen Körperflüssigkeiten oder Geweben oder aus Pflanzen stammen. Andererseits kann auch DNA aus kultivierten Zellen, z.B. eukaryotischen Zellen oder Bakterienzellen, untersucht werden.The DNA to be examined can be genomic DNA from cells or organisms. A particular advantage of the method is that eukaryotic DNA and in particular human DNA can also be examined. Of course, other types of DNA, for example bacterial DNA or synthetic DNA, can also be examined. The DNA preferably comes from biological samples in which the number of DNA damage is to be determined. The biological samples can come from animal or human body fluids or tissues or from plants. On the other hand, DNA from cultured cells, e.g. eukaryotic cells or bacterial cells.

Eine Möglichkeit ist, die DNA aus den kultivierten Zellen oder dem Organismus, der mit der Substanz behandelt wurde, deren Genotoxizität untersucht werden soll, zu reinigen und dann im Assay auf Ausmaß der Schädigung zu analysieren. So werden auch die Wirkungen der Substanzen erfasst, die erst nach Metabolisierung genotoxisch sind. Damit wird eine Aussage möglich über die Genotoxizität der Substanz in den betreffenden Zellen bzw. dem Organismus, also über die Wirkung der Substanz in der physiologischen Umgebung.One possibility is to purify the DNA from the cultured cells or the organism that has been treated with the substance whose genotoxicity is to be examined, and then to analyze the extent of the damage in the assay. So will the effects of the substances recorded that are genotoxic only after metabolism. This makes it possible to make a statement about the genotoxicity of the substance in the cells or organism in question, that is to say about the effect of the substance in the physiological environment.

Eine weitere Möglichkeit ist, gereinigte oder synthetische DNA in vitro mit der Substanz zu inkubieren und anschließend direkt zu untersuchen. Dieses Vorgehen ist schneller und einfacher, da es nicht den Einsatz von kultivierten Zellen oder sogar von Versuchstieren erfordert. Allerdings werden hier nur die genotoxischen Wirkungen der Substanzen erfasst, die direkt, also ohne vorherige Metabolisierung und außerhalb der physiologischen Umgebung, genotoxisch wirken.Another possibility is to incubate purified or synthetic DNA in vitro with the substance and then to examine it directly. This is quicker and easier because it does not require the use of cultivated cells or even laboratory animals. However, only the genotoxic effects of the substances are recorded here that are genotoxic directly, that is without prior metabolization and outside the physiological environment.

Bei der Analyse genomischer DNA wird die generelle genotoxische Wirkung auf das gesamte Genom erfasst. Dagegen bietet der Einsatz synthetischer DNA oder definierter DNA-Fragmente (z.B. durch PCR hergestellt) den Vorteil, dass die Wirkung der Substanzen auf einen bestimmten DNA- Sequenzabschnitt oder ein einzelnes Sequenzmotiv analysiert werden kann.When analyzing genomic DNA, the general genotoxic effect on the entire genome is recorded. In contrast, the use of synthetic DNA or defined DNA fragments (e.g. produced by PCR) has the advantage that the effect of the substances on a specific DNA sequence section or a single sequence motif can be analyzed.

Der erfindungsgemäße Test ist ein in vitro Verfahren, welches auf einfache Weise die parallele Bestimmung von mehreren DNA Proben, z.B. mindestens 50 oder mehr Proben, und eine Automatisierung ermöglicht. So kann das Verfahren beispielsweise in einem Mikrotiterplattenformat, z.B. mit 96- oder 384 parallelen Bestimmungen unter Verwendung entsprechender, automatisierter Pipettier- und Probenbehandlungsvorrichtungen, wie etwa Laborrobotern, durchgeführt werden.The test according to the invention is an in vitro method which allows the parallel determination of several DNA samples, e.g. at least 50 or more samples, and automation enables. For example, the method can be in a microtiter plate format, e.g. with 96 or 384 parallel determinations using appropriate automated pipetting and sample treatment devices such as laboratory robots.

Das Verfahren eignet sich zur Bestimmung der Genotoxizität von Testsubstanzen oder Testpräparaten, insbesondere vonThe method is suitable for determining the genotoxicity of test substances or test preparations, in particular of

Nahrungsmittelzusätzen, pharmazeutischen Wirkstoffen und Kosmetika. DieFood additives, active pharmaceutical ingredients and cosmetics. The

Durchführung kann in einem automatisierten Hochdurchsatz-Format erfolgen, so dass eine parallele Bestimmung einer Vielzahl von Proben ermöglicht wird. Für einen Genotoxizitätstest werden die zu testenden Substanzen oder Präparate mit DNA unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen die Substanzen oder Präparate auf die DNA einwirken und ggf. Schädigungen verursachen können. Das Inkontaktbringen kann in vitro, d.h. mit isolierter oder teilweise isolierter DNA, aber auch mit DNA in Zellen oder Organismen, z.B. Versuchstieren, erfolgen. Die zu testenden Substanzen werden vorzugsweise in mehreren Ansätzen mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen untersucht. Weiterhin können negative oder positive Kontrollen durchgeführt werden.Can be carried out in an automated high throughput format take place so that a parallel determination of a large number of samples is made possible. For a genotoxicity test, the substances or preparations to be tested are brought into contact with DNA under conditions in which the substances or preparations act on the DNA and can possibly cause damage. The contacting can take place in vitro, ie with isolated or partially isolated DNA, but also with DNA in cells or organisms, for example experimental animals. The substances to be tested are preferably examined in several batches, each with different concentrations. Furthermore, negative or positive controls can be carried out.

Eine weitere wichtige Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bestimmung von Inhibitoren DNA-schädigender Mittel, d.h. von Substanzen, welche die Wirkung von DNA-schädigenden Substanzen oder DNA-schädigenden Prozessen, wie Bestrahlung, verringern oder vollständig blockieren. Beispiele von bekannten Substanzen, die unter diesen Aspekten getestet werden können, sind Substanzen, die die physiologische Aktivierung oder die Reaktion von genotoxischen Molekülen mit DNA- Basen verhindern oder diese Moleküle abfangen (z.B. sogenannte Radikalfänger) oder Substanzen, die indirekt eine DNA-Schädigung verhindern (z.B. UV-Strahlung absorbierende Moleküle). Die Bestimmung von Inhibitoren kann in einem Testformat erfolgen, wobei die zu untersuchende DNA Probe einer Schädigung, z.B. durch ein bekanntes DNA-schädigendes Mittel oder durch Bestrahlung, in Gegenwart oder in Abwesenheit der potenziellen inhibitorischen Testsubstanz, ausgesetzt wird. Anschließend erfolgt eine Bestimmung der DNA-Schäden wie zuvor beschrieben, wobei die inhibitorische Wirkung der Testsubstanz durch eine Verringerung der DNA-Schädigungen bestimmt wird. Auch dieses Testformat kann als paralleles Hochdurchsatzverfahren durchgeführt werden. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zum Nachweis von DNA-Schäden, umfassend ein oder mehrere DNA- Reparaturproteine, die eine spezifische Wechselwirkung mit geschädigter DNA eingehen können und Mittel zur Bestimmung der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem DNA-Reparaturprotein und geschädigter DNA.Another important application of the method according to the invention is the determination of inhibitors of DNA-damaging agents, ie of substances which reduce or completely block the action of DNA-damaging substances or DNA-damaging processes, such as radiation. Examples of known substances which can be tested under these aspects are substances which prevent the physiological activation or the reaction of genotoxic molecules with DNA bases or intercept these molecules (for example so-called radical scavengers) or substances which indirectly prevent DNA damage (eg molecules that absorb UV radiation). Inhibitors can be determined in a test format, the DNA sample to be investigated being subjected to damage, for example by a known DNA-damaging agent or by radiation, in the presence or in the absence of the potential inhibitory test substance. The DNA damage is then determined as described above, the inhibitory effect of the test substance being determined by reducing the DNA damage. This test format can also be carried out as a parallel high-throughput method. Yet another object of the invention is a reagent kit for the detection of DNA damage, comprising one or more DNA repair proteins that can have a specific interaction with damaged DNA and means for determining the specific interaction between a DNA repair protein and damaged DNA.

Die Mittel zur Bestimmung der spezifischen Wechselwirkung umfassen vorzugsweise nicht radioaktive Markierungsgruppen wie zuvor beschrieben. Als DNA-Reparaturproteine sind vorzugsweise bakterielle UvrA- und UvrB- Proteine vorhanden, wobei das UvrB-Protein günstigerweise eine direkte oder indirekte Markierungsgruppe trägt. Weiterhin umfasst der Reagenzienkit vorzugsweise ATP oder/und ein ATP-Regenerationssystem sowie eine Festphase zur Immobilisierung von DNA. Außerdem kann der Reagenzienkit weitere Testkomponenten, wie etwa Puffer, Enzymsubstrate etc. und eine Produktbeschreibung aufweisen. Die Komponenten des Reagenzienkits können einzeln oder getrennt verpackt und in Form von Flüssigkeiten, Suspensionen oder Lyophilisaten vorliegen. Der Reagenzienkit ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie zuvor beschrieben, geeignet.The means for determining the specific interaction preferably comprise non-radioactive labeling groups as described above. Bacterial UvrA and UvrB proteins are preferably present as DNA repair proteins, the UvrB protein advantageously carrying a direct or indirect labeling group. Furthermore, the reagent kit preferably comprises ATP and / or an ATP regeneration system and a solid phase for immobilizing DNA. In addition, the reagent kit can have further test components such as buffers, enzyme substrates etc. and a product description. The components of the reagent kit can be packaged individually or separately and in the form of liquids, suspensions or lyophilisates. The reagent kit is particularly suitable for carrying out the method according to the invention, as described above.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden.The invention is further illustrated by the following figures and examples.

Es zeigen:Show it:

Abbildung 1 : Die schematische Darstellung einer spezifischenFigure 1: The schematic representation of a specific

Bindung von DNA-Reparaturproteinen an geschädigteBinding of DNA repair proteins to damaged ones

DNA (Modell nach Grossman und Thiagalingam (1993), J. Biol. Chem. 268, 16871 -16874). Die zu analysierende DNA, z.B. eine genomische DNA Probe, wird mit UvrA und UvrB in Gegenwart von ATP inkubiert, wobei ein Heterotrimer (UvrA)₂B gebildet wird, welches an die genomische DNA bindet. Dieses Heterotrimer kann sich unter ATP-Hydrolyse über die DNA bewegen und spezifisch an eine geschädigte DNA- Stelle binden. Nach Dissoziation von UvrA₂ bleibt das UvrB-Protein an der geschädigten Stelle gebunden.DNA (Grossman and Thiagalingam model (1993), J. Biol. Chem. 268, 16871 -16874). The DNA to be analyzed, eg a genomic DNA sample, is analyzed with UvrA and UvrB in the presence of ATP incubated, whereby a heterotrimer (UvrA) ₂ B is formed, which binds to the genomic DNA. This heterotrimer can move over the DNA under ATP hydrolysis and specifically bind to a damaged DNA site. After UvrA ₂ dissociation, the UvrB protein remains bound at the damaged site.

Abbildung 2: Die schematische Darstellung eines Testformats zum Nachweis einer spezifischen Bindung von DNA- Reparaturproteinen an geschädigte DNA. Das an eine geschädigte DNA-Stelle gebundene UvrB-Protein trägt ein Hapten, z.B. ein T7-Tag. Dieses Hapten wird durch einen entsprechenden Anti-Hapten-Antikörper, z.B. einen Anti-T7-Tag-Antikörper, erkannt, der eine Biotingruppe trägt. An diese Biotingruppe kann ein Konjugat aus Streptavidin oder Avidin mit einem Reporterenzym, z.B. Meerrettich-Peroxidase, gekoppelt und durch eine anschließende Enzymreaktion, z.B. mit dem Substrat ABTS, sichtbar gemacht werden. Die DNA-Probe kann an eine Festphase, z.B. eine 96- Depot-Mikrotiterplatte immobilisiert werden, z.B. mittels eines Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpers.Figure 2: The schematic representation of a test format for the detection of a specific binding of DNA repair proteins to damaged DNA. The UvrB protein bound to a damaged DNA site carries a hapten, e.g. a T7 day. This hapten is activated by an appropriate anti-hapten antibody, e.g. recognized an anti-T7 tag antibody carrying a biotin group. A conjugate of streptavidin or avidin with a reporter enzyme, e.g. Horseradish peroxidase, coupled and by a subsequent enzyme reaction, e.g. with the substrate ABTS. The DNA sample can be attached to a solid phase, e.g. immobilize a 96-well microtiter plate, e.g. by means of an anti-double-stranded DNA antibody.

Abbildung 3: Die schematische Darstellung eines weiteren Testformats zum Nachweis einer spezifischen Bindung von DNA-Reparaturproteinen an geschädigte DNA. Das an eine geschädigte DNA-Stelle gebundene UvrB- Protein trägt ein Hapten, z.B. ein T7-Tag. Dieses Hapten wird durch einen entsprechenden Anti-Hapten- Antikörper, der an eine Festphase gebunden ist, immobilisiert. Durch Zugabe markierter DNA mit bekannter Anzahl von DNA-Schädigungen zum Testansatz, die mit der zu untersuchenden DNA um die Bindung an den Anti-Hapten-Antikörper konkurriert (kompetitives Testformat), kann das Ausmaß der DNA- Schädigungen an der zu untersuchenden DNA quantitativ bestimmt werden.Figure 3: The schematic representation of another test format for the detection of a specific binding of DNA repair proteins to damaged DNA. The UvrB protein bound to a damaged DNA site carries a hapten, for example a T7 tag. This hapten is immobilized by an appropriate anti-hapten antibody, which is bound to a solid phase. By adding labeled DNA with a known number of DNA damage to the Test approach that competes with the DNA to be tested for binding to the anti-hapten antibody (competitive test format), the extent of DNA damage to the DNA to be examined can be determined quantitatively.

Abbildung 4: Die Quantifizierung von UV-Schäden in genomischer DNA im UvrA₂B-Assay. Isolierte Maus-Myelom-DNA wurde in vitro durch UV-Strahlung bei 254 nm und 4°C mit 0,038 J s^'1 cm^"2 geschädigt. Nach bestimmten Zeitabschnitten entnommene Proben wurden im UvrA₂B-Assay mit 500 nM UvrA, 250 nM UvrB und 0,2 μg DNA pro Ansatz eingesetzt. Das Testprinzip war wie in Abb. 2 dargestellt. Die erreichte Grünfärbung wurde spektrophotometrisch durch Messung der Absorption bei 405 nm quantifiziert.Figure 4: The quantification of UV damage in genomic DNA in the UvrA ₂ B assay. Isolated mouse myeloma DNA was damaged in vitro by UV radiation at 254 nm and 4 ° C. with 0.038 J s ^{' 1} cm ^"2. Samples taken after certain periods of time were analyzed in the UvrA ₂ B assay with 500 nM UvrA, 250 nM UvrB and 0.2 μg DNA were used per batch The test principle was as shown in Fig. 2. The green coloration was quantified spectrophotometrically by measuring the absorption at 405 nm.

Abbildung 5: Die Detektion von chemischen Schädigungen in genomischer DNA im UvrA₂B-Assay. A: In isolierter Rinderleber-DNA wurden durch Inkubation mit Cisplatin in 50 /I 20 mM Tris/HCI pH 7.9 für 4 h bei 37 °C N-7- Guanin-Addukte erzeugt. Es wurde je 400 nM UvrA, 200 nM UvrB und 1 μg DNA pro 100 l-Ansatz eingesetzt. B: In isolierter Maus-Myelom-DNA wurden durch Inkubation mit 4-Nitroquinolin-1 -Oxid (4-NQO) Interkalationen in die DNA und C-8/N-2-Guanin- und N- 6-Adenin-Addukte erzeugt. Hierbei wurden 500 nM UvrA, 250 nM UvrB und 0,2 l DNA in 100 l Ansatz eingesetzt. Das Testprinzip war wie in Abb. 2 dargestellt. Abbildung 6: Die Detektion von chemischen Schädigungen in genomischer DNA im UvrA₂B-Assay. A: In isolierter Rinderleber-DNA wurde durch Inkubation mit N-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) O⁶-Methylguanin erzeugt. B: In isolierter Rinderleber-DNA wurden durchFigure 5: The detection of chemical damage in genomic DNA in the UvrA ₂ B assay. A: In isolated beef liver DNA, N-7 guanine adducts were generated by incubation with cisplatin in 50 / I 20 mM Tris / HCl pH 7.9 for 4 h at 37 ° C. 400 nM UvrA, 200 nM UvrB and 1 μg DNA were used per 100 l batch. B: In isolated mouse myeloma DNA, intercalations into the DNA and C-8 / N-2 guanine and N-6 adenine adducts were generated by incubation with 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO). 500 nM UvrA, 250 nM UvrB and 0.2 l DNA were used in a 100 l batch. The test principle was as shown in Fig. 2. Figure 6: The detection of chemical damage in genomic DNA in the UvrA ₂ B assay. A: In isolated bovine liver DNA, O ⁶ -methylguanine was generated by incubation with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG). B: In isolated beef liver DNA were by

Inkubation mit Mechloretamin Hydrochlorid (N-Lost) bifunktionale Alkylierungen erzeugt. Es wurde je 400 nM UvrA, 200 nM UvrB und 1 μ\ DNA pro 100 μ\- Ansatz eingesetzt. Das Testprinzip war wie in Abb. 2 dargestellt.Incubation with mechloretamine hydrochloride (N-Lost) produces bifunctional alkylations. 400 nM UvrA, 200 nM UvrB and 1 μ \ DNA were used per 100 μ \ mixture. The test principle was as shown in Fig. 2.

Beispiel 1 : Klonierung der Gene uvrA und uvrB, deren Expression in E. coli und die Reinigung der rekombinanten ProteineExample 1: Cloning of the uvrA and uvrB genes, their expression in E. coli and the purification of the recombinant proteins

Das uvrA Gen wurde aus genomischer E. coli DNA durch PCR mit den Primern 5'-GAAGGATCCATGGATAAGATCGAAGTTCGG-375 '- GCCCTGAGCTCTTACAGCATCGGCTTAAGG-3' amplifiziert und in den bakteriellen Expressionsvektor pQE30 (Qiagen, Hilden) ligiert. Das mit diesem Vektor exprimierte UvrA-Protein trägt am Aminoterminus ein (His)₆ Hapten. Das Protein wurde im E. coli Stamm BL21 nach Induktion mit 800 μM IPTG. für 4 h bei 32 °C synthetisiert. Nach Lyse der Bakterien wurde das Protein mit einer Ni²⁺ NTA-Säule affinitätschromatografisch gereinigt. Um die Reinheit des Proteins zu erhöhen und die Abwesenheit jeglicher bakterieller DNA zu gewährleisten, wurde das Protein mit einer zweiten Säule (Anionenaustauscher SepharoseQ von Amersham Pharmacia Biotec) gereinigt. Das uvrB Gen wurde kloniert und das Protein nach ähnlichem Protokoll wie UvrA gereinigt, mit folgenden Änderungen: Die verwendeten Primer waren 5'-CGACATATGAGTAAACCGTTCAAACTG-375'- ATCCTCGAGCGATGCCGCGATAAACAG-3'. Das Gen wurde in den Vektor pET21 a + (Novagen) ligiert und nach Induktion mit 1 mM IPTG bei 30 °C für 4 h exprimiert. Im pET21 a + Vektor ist das UvrB-Protein aminoterminal an die kodierenden Sequenzen des T7 Epitops und carboxyterminal an das (His)₆ Epitop fusioniert. Das (His)₆ Epitop dient der Bindung an die Affinitätssäule im ersten Schritt der Reinigung. Das T7 Epitop dient der indirekten Detektion des DNA gebundenen UvrB-Proteins im Assay. Nach der Zwei-Säulen-Reinigung wurden beide rekombinanten Proteine in Reinheit höher als 90 % erhalten. Typische Präparationen resultieren in 70 mg UvrA oder 27 mg UvrB jeweils aus 90 g Bakterien. Die spektroskopische Analyse bei 260 nm bestätigte die Abwesenheit von Nukleinsäuren in den Proteinlösungen. Die Sekundärstrukturelemente der Proteine wurden durch CD Spektroskopie bestätigt.The uvrA gene was amplified from genomic E. coli DNA by PCR with the primers 5'-GAAGGATCCATGGATAAGATCGAAGTTCGG-375 '- GCCCTGAGCTCTTACAGCATCGGCTTAAGG-3' and ligated into the bacterial expression vector pQE30 (Qiagen, Hilden). The UvrA protein expressed with this vector carries a (His) ₆ hapten at the amino terminus. The protein was in the E. coli strain BL21 after induction with 800 μM IPTG. synthesized for 4 h at 32 ° C. After lysis of the bacteria, the protein was purified by affinity chromatography using a Ni ²⁺ NTA column. In order to increase the purity of the protein and to ensure the absence of any bacterial DNA, the protein was purified with a second column (anion exchanger SepharoseQ from Amersham Pharmacia Biotec). The uvrB gene was cloned and the protein was purified according to a protocol similar to UvrA, with the following changes: The primers used were 5'-CGACATATGAGTAAACCGTTCAAACTG-375'- ATCCTCGAGCGATGCCGCGATAAACAG-3 '. The gene was ligated into the vector pET21 a + (Novagen) and expressed after induction with 1 mM IPTG at 30 ° C. for 4 h. In the pET21 a + vector, the UvrB protein is amino-terminal to the coding sequences of the T7 epitope and carboxy-terminal to that (His) ₆ epitope fused. The (His) ₆ epitope serves to bind to the affinity column in the first step of the purification. The T7 epitope is used for indirect detection of the DNA-bound UvrB protein in the assay. After the two-column purification, both recombinant proteins were obtained in purity higher than 90%. Typical preparations result in 70 mg UvrA or 27 mg UvrB each from 90 g bacteria. Spectroscopic analysis at 260 nm confirmed the absence of nucleic acids in the protein solutions. The secondary structural elements of the proteins were confirmed by CD spectroscopy.

Beispiel 2: Test zum Nachweis von DNA-SchädigungenExample 2: Test for the detection of DNA damage

2.1 Testprinzip2.1 Test principle

Das Testprinzip ist in Abb. 1 und 2 schematisch dargestellt. Das Protein- Tri er UvrA₂B wird mit geschädigter oder ungeschädigter genomischer DNA vorinkubiert. Der verwendete Ansatzpuffer enthält hierbei ATP und ein ATP-Regenerationssystem aus PEP und Pyruvatkinase. ATP bewirkt eine Dimerisierung des UvrA und dient als Energielieferant für eine aktive Bewegung des Proteinkomplexes entlang der DNA bis zu einer Schädigungsstelle. Dort bildet UvrB einen stabilen Komplex mit der geschädigten DNA aus. Nach Bindung der genomischen DNA (DNA aus Rinderleber oder Maus-Myelomzellen aufgereinigt nach Standardmethoden) an die feste Phase über einen Anti-DNA-Antikörper kann gebundenes UvrB über einen Biotin-gekoppelten Antikörper gegen den an UvrB fusionierten T7-Tag quantifiziert werden. Das Biotin wird anschließend durch Streptavidin gebunden, welches an die Meerrettich-Peroxidase (HRP) gebunden ist. Die Peroxidase setzt farbloses ABTS-Substrat in einen grünen Farbstoff um.The test principle is shown schematically in Fig. 1 and 2. The protein tri UvrA ₂ B is pre-incubated with damaged or undamaged genomic DNA. The batch buffer used contains ATP and an ATP regeneration system made of PEP and pyruvate kinase. ATP causes a dimerization of the UvrA and serves as an energy supplier for an active movement of the protein complex along the DNA up to a damage site. There UvrB forms a stable complex with the damaged DNA. After binding the genomic DNA (DNA from bovine liver or mouse myeloma cells purified according to standard methods) to the solid phase via an anti-DNA antibody, bound UvrB can be quantified against the T7 tag fused to UvrB using a biotin-coupled antibody. The biotin is then bound by streptavidin, which is bound to the horseradish peroxidase (HRP). The peroxidase converts colorless ABTS substrate into a green dye.

Das Testsystem besteht aus folgenden Einzelschritten, die bei 22 °C durchgeführt wurden. Die Volumenangaben beziehen sich auf je ein Depot. Beschichtung der 96-Depot-Mikrotiterplatte mit 70 μ\ MER-2 Anti- DNA-Antikörper (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) 0,5 μg/ml in Beschichtungspuffer (50 mM NaHCO₃, Na₂CO₃ pH 6,5) . Inkubation für 2 h. - 3 mal Waschen mit 200 μ\ Waschpuffer (20 mM Tris/HCI, pH 7,9,The test system consists of the following individual steps, which were carried out at 22 ° C. The volume information relates to one depot. Coating the 96-well microtiter plate with 70 μ \ MER-2 anti-DNA antibody (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 0.5 μg / ml in coating buffer (50 mM NaHCO ₃ , Na ₂ CO ₃ pH 6.5 ). Incubation for 2 h. - 3 times washing with 200 μ \ washing buffer (20 mM Tris / HCl, pH 7.9,

100 mM KCI, 1 0 mM MgCI₂).100 mM KCI, 10 mM MgCI ₂ ).

Zugabe von 200 μ\ Absättigungslösung ( 1 % Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma) im Beschichtungspuffer). Inkubation für 2 h. 3 mal Waschen mit 200 μ\ Waschpuffer. - Vorinkubation von 400 nM UvrA, 200 nM UvrB und 1 μg genomischer DNA bzw. 500 nM UvrA, 250 nM UvrB und 0,2 μg genomischer DNA in 100 l Ansatzpuffer (20 mM Tris/HCI pH 7,9, 100 mM KCI, 5 mM Dithiothreitol (DTE), 10 mM MgCI₂; 2 mM ATP,Add 200 μ \ saturation solution (1% bovine serum albumin (fraction V, Sigma) in the coating buffer). Incubation for 2 h. Wash 3 times with 200 μ \ wash buffer. - Pre-incubation of 400 nM UvrA, 200 nM UvrB and 1 μg genomic DNA or 500 nM UvrA, 250 nM UvrB and 0.2 μg genomic DNA in 100 l preparation buffer (20 mM Tris / HCl pH 7.9, 100 mM KCI, 5 mM dithiothreitol (DTE), 10 mM MgCl ₂ ; 2 mM ATP,

2 mM PEP, 2 U/ml Pyruvatkinase) für 1 h. - Auftrag des vorinkubierten Ansatzes. Inkubation für 45 Minuten.2 mM PEP, 2 U / ml pyruvate kinase) for 1 h. - Application of the pre-incubated approach. Incubation for 45 minutes.

3 mal Waschen mit 200 μ\ Waschpuffer.Wash 3 times with 200 μ \ wash buffer.

Zugabe von 50 μ\ 1 :300 in Verdünnungspuffer (Waschpuffer mit 2 mM DTE, 0, 1 mM ATP) verdünntem biotinyliertem Anti-T7-Tag- Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland). Inkubation für 30 Minuten.Add 50 μ \ 1: 300 biotinylated anti-T7-Tag antibody (Dianova, Hamburg, Germany) diluted in dilution buffer (wash buffer with 2 mM DTE, 0.1 mM ATP). Incubation for 30 minutes.

3 mal Waschen mit 200 μ\ Waschpuffer.Wash 3 times with 200 μ \ wash buffer.

Zugabe von 100 μl einer 1 :3000-Verdünnung von Streptavidin-HRP (Röche Molecular Biochemicals) in Verdünnungspuffer. Inkubation für 30 Minuten. - 3 mal Waschen mit 200 μ\ Waschpuffer.Add 100 μl of a 1: 3000 dilution of streptavidin-HRP (Röche Molecular Biochemicals) in dilution buffer. Incubation for 30 minutes. - Wash 3 times with 200 μ \ wash buffer.

Zugabe von 50 μl ABTS-Substratlösung (60 mM NaH₂PO₄, 3,25 mM Na₃BO₄; 39,8 mM Zitronensäure; 1 mM ABTS von Sigma). Inkubation für 30 Minuten. Messung der Absorption bei 405 nm in einem 96-Kanal-Photometer. Besonders gute Resultate wurden bei einer UvrA₂B-Konzentration im Bereich von 150 - 300 nM, insbesondere 200 - 250 nM und einer DNA Menge von 0, 1 - 0,3 μg, z.B. 0,2 μg pro Ansatz, erreicht.Add 50 μl ABTS substrate solution (60 mM NaH ₂ PO ₄ , 3.25 mM Na ₃ BO ₄ ; 39.8 mM citric acid; 1 mM ABTS from Sigma). Incubation for 30 minutes. Measurement of the absorption at 405 nm in a 96-channel photometer. Particularly good results were achieved with a UvrA ₂ B concentration in the range from 150-300 nM, in particular 200-250 nM and a DNA amount of 0.1-1.3 μg, for example 0.2 μg per batch.

2.2 Ergebnisse2.2 results

Abb. 4 zeigt Ergebnisse für den Nachweis von DNA-Schädigungen, die durch Bestrahlung von Maus-Myelom-DNA erzeugt wurden. In den Messkurven ist das Ausmaß von DNA-Schädigungen (Absorption bei 405 n) gegen die Bestrahlungszeit (entsprechend der Bestrahlungsdosis) aufgetragen. Es zeigt sich bei halblogarithmischer Auftragung ein linearer Bereich mit einer Absorptionszunahme von 0,4 und somit eine Verdoppelung des Gesamtsignals. Die halbmaximale Signalzunahme ist bei einer Bestrahlungsdauer von 100 s zu finden. Die Erhöhung der KCI- Konzentration im Ansatzpuffer auf 150 mM erniedrigt den Hintergrund.Fig. 4 shows results for the detection of DNA damage caused by irradiation of mouse myeloma DNA. The extent of DNA damage (absorption at 405 n) is plotted against the radiation time (corresponding to the radiation dose) in the measurement curves. A semi-logarithmic plot shows a linear range with an increase in absorption of 0.4 and thus a doubling of the overall signal. The half-maximum signal increase can be found with an irradiation time of 100 s. Increasing the KCI concentration in the batch buffer to 150 mM lowers the background.

Abb. 5 a zeigt Ergebnisse für den Nachweis von DNA-Schädigungen, die durch Behandlung von genomischer Rinderleber-DNA mit Cisplatin erzeugt wurden. Der Signalanstieg beträgt 0,15. Die Nachweisgrenze für durch Cisplatin hervorgerufene DNA-Schädigungen liegt bei einer Konzentration von 0,1 nM Cisplatin, die mit 25 ng/μl genomischer DNA inkubiert wurden. Folglich ist unter Annahme eines vollständigen Umsatzes von Cisplatin ein Addukt von mindestens 380 000 Basen nachweisbar.Fig. 5 a shows results for the detection of DNA damage that was generated by treating genomic beef liver DNA with cisplatin. The signal increase is 0.15. The detection limit for DNA damage caused by cisplatin is at a concentration of 0.1 nM cisplatin which has been incubated with 25 ng / μl genomic DNA. Hence, assuming complete conversion of cisplatin, an adduct of at least 380,000 bases is detectable.

Abb. 5 b zeigt den Nachweis von DNA-Schädigungen, die durch Behandlung von genomischer Maus-Myelom-DNA mit 4-Nitroquinolin-1 - Oxid (4-NQO) behandelt wurde. Es zeigt sich ein ähnlicher Kurvenverlauf wie für Cisplatin-geschädigte DNA. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 nM 4- NQO.Fig. 5 b shows the detection of DNA damage which was treated by treating genomic mouse myeloma DNA with 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO). The curve is similar to that for cisplatin-damaged DNA. The detection limit is 1 nM 4- NQO.

Abb. 6 a zeigt den Nachweis von DNA-Schädigungen, die durch N-Methyl- N'-nitrosoguanin (MNNG) erzeugt wurden. Die Nachweisgrenze liegt bei 10 nM MNNG, was auf eine geringere toxische Reaktivität von MNNG zurückgeführt werden kann.Fig. 6 a shows the detection of DNA damage caused by N-methyl-N'-nitrosoguanine (MNNG). The detection limit is 10 nM MNNG, which can be attributed to a lower toxic reactivity of MNNG.

Abb. 6 b zeigt den Nachweis von DNA-Schäden, die durch Mechlorethamin- Hydrochlorid (MCE) verursacht werden. Die Nachweisgrenze liegt unter der niedrigsten eingesetzten Konzentration von 1 μM MCE.Fig. 6 b shows the detection of DNA damage caused by mechlorethamine hydrochloride (MCE). The detection limit is below the lowest concentration of 1 μM MCE used.

Die vorliegenden Daten zeigen, dass mit dem erfindungsgemässen ELISA- Testsystem UV-induzierte und chemisch verursachte Schädigungen von DNA verschiedenster Art quantitativ bestimmt werden können. Es wird erstmalig eine einfache Methode bereitgestellt, welche die Detektion von primären DNA-Läsionen erlaubt. Die entwickelte Technik ist deutlich sensitiver als bisherige Methoden. Mit Hilfe eines Pipettierroboters und eines Mikroplatten-Fotometers kann das Verfahren mit geringem Aufwand automatisiert werden, so dass auch die Analyse einer großen Probenanzahl möglich ist. Damit ist diese Technik beispielsweise zum Routine-Screening von neuen Substanzen oder zur Charakterisierung von Substanzbibliotheken t Bezug auf eine genotoxische Wirkung geeignet. The present data show that UV-induced and chemically caused damage to DNA of all kinds can be determined quantitatively with the ELISA test system according to the invention. For the first time, a simple method is provided that allows the detection of primary DNA lesions. The technology developed is significantly more sensitive than previous methods. With the help of a pipetting robot and a microplate photometer, the process can be automated with little effort, so that the analysis of a large number of samples is also possible. This technique is therefore suitable, for example, for routine screening of new substances or for the characterization of substance libraries in relation to a genotoxic effect.

Claims

Ansprüche Expectations

1 . Verfahren zum Nachweis von DNA-Schäden, dadurch gekennzeichnet, dass man eine zu untersuchende DNA-Probe in vitro mit DNA- Reparaturproteinen unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren DNA-Reparaturproteinen und geschädigter DNA erfolgt, und das Auftreten der spezifischen Wechselwirkung als Maß für das1 . Method for the detection of DNA damage, characterized in that a DNA sample to be examined is brought into contact with DNA repair proteins in vitro under conditions in which a specific interaction between one or more DNA repair proteins and damaged DNA occurs, and that Occurrence of the specific interaction as a measure of that

Vorhandensein von DNA-Schäden bestimmt.Presence of DNA damage determined.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Reparaturproteine aus dem bakteriellen2. The method according to claim 1, characterized in that the DNA repair proteins from the bacterial

Reparatursystem UvrABC ausgewählt werden.Repair system UvrABC can be selected.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Reparaturproteine aus rekombinanten E. coli UvrA- und UvrB-Proteinen ausgewählt werden.3. The method according to claim 2, characterized in that the DNA repair proteins are selected from recombinant E. coli UvrA and UvrB proteins.

4. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Wechselwirkung eine hochaffine und selektive4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the specific interaction is highly affine and selective

Bindung eines DNA-Reparaturproteins an geschädigte DNA umfasst.Binding of a DNA repair protein to damaged DNA includes.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Bindung eines Komplexes der DNA-5. The method according to claim 4, characterized in that the specific binding of a complex of DNA

Reparaturproteine UvrA und UvrB mit der Struktur (UvrA)₂B an geschädigte DNA bestimmt wird. Repair proteins UvrA and UvrB with the structure (UvrA) ₂ B of damaged DNA is determined.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung in Gegenwart von ATP bestimmt wird.6. The method according to claim 5, characterized in that the binding is determined in the presence of ATP.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das ATP durch ein ATP-Regenerationssystem erzeugt wird.7. The method according to claim 6, characterized in that the ATP is generated by an ATP regeneration system.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das ATP-Regenerationssystem Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase umfasst.8. The method according to claim 7, characterized in that the ATP regeneration system comprises phosphoenol pyruvate and pyruvate kinase.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende DNA mit den DNA-Reparaturproteinen in einer nicht-immobilisierten Form in Kontakt gebracht wird.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the DNA to be examined is brought into contact with the DNA repair proteins in a non-immobilized form.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Inkontaktbringen eine Immobilisierung der zu untersuchenden DNA an einer Festphase und die Bestimmung der spezifischen Wechselwirkung an der immobilisierten DNA erfolgt.10. The method according to claim 9, characterized in that after contacting, the DNA to be examined is immobilized on a solid phase and the specific interaction is determined on the immobilized DNA.

1 1. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Inkontaktbringen eine Immobilisierung der an die DNA gebundenen Reparaturproteine an einer Festphase und die direkte oder indirekte Bestimmung der über die Proteine an der Festphase gebundenen DNA erfolgt. 1 1. The method according to claim 9, characterized in that after contacting an immobilization of the repair proteins bound to the DNA on a solid phase and the direct or indirect determination of the DNA bound to the proteins on the solid phase.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung an eine Festphase ausgewählt aus Reaktionsgefäßen, Mikrotiterplatten, Chips, und gegebenenfalls magnetischen Partikeln erfolgt.12. The method according to claim 10 or 1 1, characterized in that the immobilization to a solid phase selected from reaction vessels, microtiter plates, chips, and optionally magnetic particles.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung an die Festphase über Antikörper erfolgt.13. The method according to any one of claims 10 to 12, characterized in that the immobilization to the solid phase takes place via antibodies.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein an geschädigte DNA gebundenes DNA-Reparaturprotein bestimmt wird.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that a DNA repair protein bound to damaged DNA is determined.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Reparaturprotein eine direkte Markierung trägt.15. The method according to claim 14, characterized in that the DNA repair protein carries a direct label.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Reparaturprotein eine indirekte Markierung trägt.16. The method according to claim 14, characterized in that the DNA repair protein carries an indirect label.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine nicht radioaktive Markierung, insbesondere eine Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Enzymmarkierung, ist.17. The method according to claim 15 or 16, characterized in that the label is a non-radioactive label, in particular a fluorescent, luminescent or enzyme label.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Hapten ist, das mit Hilfe eines direkt oder indirekt markierten Antikörpers nachgewiesen wird. 18. The method according to claim 16 or 17, characterized in that the label is a hapten, which is detected with the aid of a directly or indirectly labeled antibody.

19. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung in einem kompetitiven Testformat erfolgt, wobei man dem Ansatz eine markierte DNA mit einer definierten Anzahl von Schädigungen zusetzt.19. The method according to claim 1 1, characterized in that the determination is carried out in a competitive test format, wherein a labeled DNA with a defined number of damage is added to the approach.

20. Verfahren nach der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende DNA genomische DNA aus Zellen oder Organismen umfasst.20. The method according to the preceding claims, characterized in that the DNA to be examined comprises genomic DNA from cells or organisms.

21 . Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende DNA eukaryotische DNA und insbesondere humane DNA umfasst.21. A method according to claim 20, characterized in that the DNA to be examined comprises eukaryotic DNA and in particular human DNA.

22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Schäden durch Strahlung oder chemische Substanzen verursachte Schäden sind.22. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the DNA damage is damage caused by radiation or chemical substances.

23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass DNA aus mit den zu testenden Substanzen behandelten Zellen oder Organismen isoliert und analysiert wird oder dass synthetische23. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that DNA is isolated from cells or organisms treated with the substances to be tested and analyzed or that synthetic

DNA oder aus unbehandelten Zellen oder Organismen gereinigte genomische DNA oder DNA-Fragmente in vitro mit den Substanzen inkubiert und anschließend analysiert werden. DNA or genomic DNA or DNA fragments purified from untreated cells or organisms are incubated with the substances in vitro and then analyzed.

24. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Schäden aus Basenmodifikationen, Basenverlusten und Interkalationen ausgewählt sind.24. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the DNA damage is selected from base modifications, base losses and intercalations.

25. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine parallele Bestimmung von mehreren DNA-Proben durchführt.25. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that one carries out a parallel determination of several DNA samples.

26. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung automatisiert durchgeführt wird.26. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determination is carried out automatically.

27. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Bestimmung der Genotoxizität von Testsubstanzen oder Testpräparaten.27. Use of the method according to one of claims 1 to 26 for determining the genotoxicity of test substances or test preparations.

28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Testsubstanzen oder Testpräparate aus Nahrungsmittelzusätzen, pharmazeutischen Wirkstoffen und Kosmetika ausgewählt werden.28. Use according to claim 27, characterized in that the test substances or test preparations are selected from food additives, active pharmaceutical ingredients and cosmetics.

29. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Bestimmung von Inhibitoren von DNA-schädigenden Mitteln oder DNA-schädigenden Prozessen. 29. Use of the method according to any one of claims 1 to 26 for the determination of inhibitors of DNA-damaging agents or DNA-damaging processes.

30. Reagenzienkit zum Nachweis von DNA-Schäden umfassend ein oder mehrere DNA-Reparaturproteine, die eine spezifische Wechselwirkung mit geschädigter DNA eingehen können und Mittel zur Bestimmung der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem DNA-Reparaturprotein und geschädigter DNA.30. Reagent kit for the detection of DNA damage comprising one or more DNA repair proteins which can have a specific interaction with damaged DNA and means for determining the specific interaction between a DNA repair protein and damaged DNA.

31 . Reagenzienkit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Bestimmung eine nicht radioaktive Markierungsgruppe umfassen.31 Reagent kit according to claim 30, characterized in that the means for determination comprise a non-radioactive labeling group.

32. Reagenzienkit nach Anspruch 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, dass als DNA-Reparaturproteine bakterielle UvrA- und UvrB-Proteine vorhanden sind.32. Reagent kit according to claim 30 or 31, characterized in that bacterial UvrA and UvrB proteins are present as DNA repair proteins.

33. Reagenzienkit nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das UvrB-Protein eine direkte oder indirekte Markierungsgruppe trägt.33. Reagent kit according to claim 32, characterized in that the UvrB protein carries a direct or indirect labeling group.

34. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 30 bis 33 weiterhin umfassend ATP oder/und ein ATP-Regenerationssystem.34. Reagent kit according to one of claims 30 to 33, further comprising ATP or / and an ATP regeneration system.

35. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 30 bis 34 weiterhin umfassend eine Festphase zur Immobilisierung der DNA.35. Reagent kit according to one of claims 30 to 34 further comprising a solid phase for immobilizing the DNA.

36. Verwendung des Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 30 bis 35 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 36. Use of the reagent kit according to one of claims 30 to 35 for carrying out the method according to one of claims 1