WO2001094556A1 - Method for conditionally immortalising cells and protein constructs therefor - Google Patents

Method for conditionally immortalising cells and protein constructs therefor Download PDF

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WO2001094556A1
WO2001094556A1 PCT/FR2001/001767 FR0101767W WO0194556A1 WO 2001094556 A1 WO2001094556 A1 WO 2001094556A1 FR 0101767 W FR0101767 W FR 0101767W WO 0194556 A1 WO0194556 A1 WO 0194556A1
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cells
protein
immortalizing
proteins
vector
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French (fr)
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Eric Parmantier
Florence Martin
Joël Crouzet
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Neurotech
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of conditionally immortalized cells, useful for the treatment by cell therapy of multiple pathologies or as a model for the understanding of cellular phenomenon or the screening of active substances or the diagnosis of multiple pathologies. More particularly, the subject of the invention is a process for the preparation of immortalized cells consisting in introducing into said cells one or more immortalizing proteins.
  • conditional immortalization is understood to mean the extension of the cell proliferation capacity and duration.
  • an immortalizing protein is a protein capable of extending the capacity and the duration of proliferation of the cells into which it has been introduced.
  • the conditional immortalization according to the present invention is remarkable in that it is non-genetic.
  • Mammalian cells and more particularly human cells isolated from the organism, have a very limited capacity to proliferate.
  • chronic conditions such as Parkinson's disease, ischemia of the heart muscles or peripheral limbs, age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, diabetes, etc.
  • AMD age-related macular degeneration
  • retinitis pigmentosa retinitis pigmentosa
  • diabetes etc.
  • it can occur degeneration or disappearance of certain cells, such as for example cardiomyocytes in ischemia of the heart muscle, dopaminergic neurons in the nervous system for Parkinson's disease, or cells of the retinal epithelium in the case of AMD, the islets of Langerhans in the case of diabetes.
  • autologous or allogenic stem cells of hematopoietic precursors can be obtained in large quantities and grafted. They are often primary cells. Unfortunately, in many cases, the cells of interest cannot be obtained in sufficient quantities.
  • the lines obtained have the advantage of being able to be propagated extensively, which makes it possible to generate a large number of cells and is therefore compatible with commercial use. These cells can also be tested intensively, both at the microbiological level and at the level of tumorigenicity.
  • the final immortalization leads to a partial dedifferentiation of the cells which makes them lose a certain number of characteristics of the primary cells from which they derive.
  • the cells are immortalized with one or more oncogenes which makes them closer to a transformation event and can potentially lead to tumors in patients after the transplant of these cells.
  • it is relatively difficult to obtain stable non-tumorigenic lines. It is indeed a long and meticulous process which is moreover empirical in the sense that there are no established rules.
  • Another approach resides in the use of autologous primary cells, but more generally allogeneic, or even xenogenic.
  • xenogenic cells pose both a problem of viral safety due to a potential horizontal transmission of an infectious agent of a given species to humans, and a problem of the host's immune response against graft, especially in the case of chronic pathologies of the type mentioned above.
  • transplantation of human fetal neurons has been used in patients with Parkinson's disease.
  • the hindsight of several years shows that this is completely positive in terms of benefit for the patient.
  • this approach suffers from a major limitation, which is the supply of cells. This limits today a large-scale therapeutic use, because, even if it is an allogeneic approach, there remains a safety problem in terms of potential contamination of the transplant recipient by the donor cells.
  • the present invention specifically aims to overcome the above drawbacks related to the use of lines or primary cells and stem cells.
  • This object is achieved according to the invention by a process for the preparation of conditionally immortalized cells comprising bringing cells into contact with one or more immortalizing proteins in conditions allowing the penetration of said protein (s) into cells.
  • the introduction of one or more immortalizing proteins into cells according to the method of the invention has the advantage of being temporary and reversible.
  • the process of the invention is remarkable in that it allows cells to pass the senescence stage and therefore to be propagated advantageously until the crisis and beyond.
  • the addition of several immortalizing proteins in the cultures allow the cells to pass the crisis stage.
  • the cells obtained by the method of the invention may be cloned so as to have clonal cell progeny if this proves necessary.
  • the process of the invention particularly relates to the preparation of conditionally immortalized primary cells. They can be: - ⁇ pancreatic cells involved in type I diabetes,
  • hematopoietic genitor cells - pigmented retinal epithelial cells involved in age-related macular degeneration
  • retinal epithelium cells of the retinal epithelium, neurons and in particular photoreceptor neurons, keratinocytes
  • the method of the invention provides means for treating pathologies by grafting cells immortalized conditionally. It may be in the case of the retina for transplanting cells of the retina epithelium, or even photoreceptor neurons whose capacity and duration of proliferation would be extended, when these neurons have disappeared or are deficient in pathologies such as age-related macular degeneration or retinitis pigmentosa. In the case of fulminant hepatitis, it is possible to graft immortalized hepatocytes. In the case of diabetes, it is possible to transplant cells from islets of Langerhans capable of secreting insulin. Coronary bypass surgery can be performed with endothelial cells and possibly smooth muscle cells.
  • the conditional and temporary immortalization or the extension of the proliferative capacity and duration of the cells produced by the process of the invention can also relate to chondrocytes for treating traumatic localized lesions of the cartilage, or arthritis linked to aging. .
  • applications in the field of skin grafts comprising, inter alia, the use of epidermis and dermis cells.
  • Other applications concerning osteoblasts, cells associated with tendons are possible thanks to the immortalized cells of the invention.
  • the invention therefore therefore also relates to a method of treatment of a pathology involving the disappearance or deficiency of a cell type consisting in grafting in a patient suffering from such a pathology an effective quantity of immortalized cells according to the invention corresponding to the type absent or deficient cell.
  • the invention therefore also relates to the use of immortalized cells conditionally obtained by the process of the invention for the preparation of compositions pharmaceutical useful in diagnosis or therapy as well as pharmaceutical compositions comprising as active agents immortalized cells conditionally obtained according to this process.
  • the cells immortalized conditionally according to the method of the invention can be genetically modified cells, not for their conditional immortalization but for the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties.
  • These genetic modifications can be obtained after the introduction of an expression vector which can be chosen among others from plasmids, AAVs, retroviruses, lentiviral vectors, or any other integrative or episomal vector.
  • They can be genetically modified cells to express, for example, a growth factor, a neurotrophic factor, an angiogenic or anti-angiogenic factor, a cytokine, chemokine, or any other diffusible factor with a therapeutic effect.
  • the method of the invention is particularly advantageous because it makes it possible to carry out cell propagation based on non-genetic immortalization. In fact, it is the culture conditions which condition the cells as regards their capacity to proliferate.
  • the genome of the manipulated cells is in no way modified by the addition of a gene immortalizing or increasing the proliferative capacity of the cells.
  • the method of the invention comprises culturing the cells in a medium containing said immortalizing proteins.
  • the method of the invention can comprise several passages of cell culture, all or part of said passages comprising the addition of immortalizing proteins.
  • the primary cells brought into contact with one or more proteins making it possible to extend their proliferation capacity, may be cultured a sufficient number of times before their injection in the patients to be treated.
  • the primary cells brought into contact with one or more proteins making it possible to extend their capacity and their duration of proliferation, can be cultured a sufficient number of times before their injection in the patients to be treated.
  • the proteins making it possible to extend the proliferation capacity of the cells may no longer be added to the culture medium during the last passage (s) before injection in patients. Indeed it has been shown by Kobayashi et al. (Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman KA, Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J., Tanaka N., Fox IJ, Leboulch P., Science.
  • the immortalizing proteins introduced into the cells according to the process of the invention can be proteins, polypeptides or peptides having a proliferative function also designated in English as conferring an "extended life-span".
  • the following proteins can be mentioned: the products of cellular and viral oncogenes such as SV40Tag, ElA of the adenovirus, E6, E7 of EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1, - the products of anti-senescence genes such as in particular telomerase,
  • immortalizing proteins in the plural is thus meant both the quantity of an immortalizing protein and a mixture of immortalizing proteins.
  • the singular and the plural are used interchangeably and unless otherwise indicated, the use of immortalizing protein in the singular covers the plural and vice versa.
  • the type of immortalizing proteins and their quantity depend on the nature of the cells to be immortalized and the culture media.
  • It can be any compound or chemical motif and in particular peptides, polypeptides or protein, particles, nanoparticles such as liposomes, to which are associated, conjugated or coupled by any type of bond, covalent or not, immortalizing proteins, and capable of allowing the transfer of said immortalizing proteins into the cytoplasm and / or the nucleus of cells.
  • a first embodiment of the method of the invention consists in introducing the immortalizing proteins into the cells using particles containing or comprising on their surface said immortalizing proteins. They may for example be liposomes having fusogenic properties making it possible to deliver their protein content into the cells.
  • a second embodiment of the process of the invention consists in using dendrimers on which the proteins can be adsorbed.
  • a third embodiment of the process of the invention consists in introducing the immortalizing proteins using the vector substance.
  • a first X type of carrier substance consists of intracellular transport systems using inactivated viruses as proposed for transferring plasmids into cells.
  • a second type of carrier substance consists of the cargo domains allowing the transfer of cis-linked proteins from the extracellular space to the intracellular space.
  • a third type of vector substance consists of any chemical motif allowing the coupling of proteins in accordance with the invention and allowing the translocation of said proteins from the extracellular medium to the cytoplasm and / or the nucleus (Service RF, Science. 2000; 288 : 28-29.).
  • the so-called "cargo" domains are defined as allowing the transfer in cis of a protein from the culture medium to the interior of the cells.
  • Various protein patterns described in the prior art can provide such cargo functions.
  • a preferred embodiment of this embodiment of the invention consists in introducing into the cells the immortalizing protein associated with a protein or transport peptide or cargo peptide through the plasma membrane.
  • the protein VP22 of the HSV-1 virus the omeodomain of the Antennapedia transcription factor or the third helix of the homeodomain of this protein, the protein transduction domain of the TAT protein of HIV, the K-FGF membrane translocation sequence, or certain murine or human, polyclonal or monoclonal antibodies recognizing DNA or peptides derived from these antibodies, chemical motifs such as poly-arginines, or sequences or fragments derived therefrom.
  • These peptides or proteins have the capacity to cross the plasma membrane of cells and to transport agents which are coupled to them.
  • proteins immortalizing in cells according to the method 1 invention will be indicated.
  • the protein VP22 of the virus HSV-1 is a constituent of 38 kDa of the integument, structure located between the capsid and the envelope of the virus (Dargan D. The structure and assembly of herpes viruses. In: Harris JR, Horne RW (eds) Viral Structure, New York: Académie Press, 1986, pp 359-437).
  • VP22 has a new transport property in both transfected and infected cells.
  • transfected cells VP22 is localized mainly in the cytoplasm where it is associated with microtubules.
  • VP22 can be transported from the cytoplasm of a producer cell to neighboring cells where it accumulates in the nucleus. This transport mechanism is not yet fully understood but seems to involve a Golgi-independent pathway involving cytoskeleton actin (Elliot G. and O'Hare P., Cell 1997; 88: 223-233).
  • Homeoproteins are a class of transcription factors initially discovered in Drosophila and involved in many morphological processes. These proteins bind to DNA through a specific sequence of 60 amino acids called homeodomain.
  • the homeodomain is formed of three oc-helices and a ⁇ elbow located between the second and the third helix (Qian YQ, Billeter M., Otting G., Muller M., Gehring WJ and Wuthrich K., Cell 1989; 59: 573-80). All vertebrates, mammals included, synthesize numerous homeoproteins phylogenetically linked to the proteins initially characterized in Drosophila.
  • the third helix of the homeodomain peptide has the same properties (Joliot A., Pernelle C., Deagostini-Bazin H. and Prochiantz A., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991; 88: 1864-1868; Derossi D., Joliot AH, Chassaing G. and Prochiantz A., J. Cell. Biol. 1994; 269: 10444-10450). These properties have been used to internalize into cells, polypeptides and oligonucleotides bound 1 homeodomain or 3 helix lerae
  • the smallest fragment of homeodomain capable of crossing membranes and serving as a vector for other peptides or else for oligonucleotides is a peptide of 16 amino acids corresponding to the third helix of the homeodomain and including amino acids 43 58 of the homeodomain.
  • TAT protein of HIV has the ability to cross the plasma membrane of cells without interaction with a specific receptor (Green M. and Loewenstein PM, Cell 1988, 55: 1179-1188; Frankel AD and Pabo C. 0., Cell 1988, 55: 1189-1193).
  • Fawell S. Seery J., Daikh Y., Moore C, Chen L. L., Pepinsky B. and Barsoum
  • heterologous proteins such as ⁇ galactosidase, chemically coupled to a domain of 36 amino acids of the TAT protein can be internalized by different cell types (Pepinsky RB, Androphy EJ, Corina K., Brown R. and Barsoum J., DNA Cell Biol. 1994, 13: 1011-1019).
  • TAT- p27 K Lpl fusion protein comprising the entire p27 K ⁇ pl sequence in phase with a fragment of 11 amino acids constituting the protein transduction domain of the TAT protein may be internalized by cells in culture.
  • _ galactosidase 120 kDa fused to the protein transduction domain of the TAT protein, after intraperitoneal injection, in mice, may be internalized by all tissues, in particular by the brain. Internalized fusion protein retains the enzymatic activity of ⁇ galactosidase
  • vector substances consisting of peptides, polypeptides or proteins constitutes a preferred embodiment of the process of the invention in the measurement or coupling of the immortalizing protein to the vector substance can be carried out not only by chemical coupling but also thanks to the production of fusion protein by genetic engineering techniques well known to those skilled in the art.
  • These recombinant proteins then constitute the immortalizing fusion proteins used in accordance with the method of the invention.
  • the invention therefore also relates to an immortalizing protein associated, conjugated or coupled by any type of bond to a vector substance capable of allowing the transfer of said immortalizing protein into the cytoplasm and / or the nucleus of cells.
  • the invention relates more particularly to a fusion protein consisting an immortalizing protein and a peptide, polypeptide or transport protein in the cytoplasm and / or the cell nucleus as defined above.
  • the cells immortalized according to the method of the invention can be genetically modified cells, not for their immortalization but for the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties.
  • the method according to the invention makes it possible to carry out jointly, the conditional immortalization, by bringing the cells into contact with immortalizing proteins, and the transformation of the cells, by bringing the cells into contact with an expression vector intended for introducing a gene of interest into said cells.
  • the invention also relates of course to the cells obtained by the method of the invention as well as a culture of cells on a medium comprising the elements necessary for the culture of said cells and one or more immortalizing proteins.
  • the medium can also contain an expression vector for the transformation of said cells.
  • pCRT7 TOPO TA The bacterial expression vector pCRT7 TOPO TA (Invitrogen) is used in this example but is not restrictive.
  • pCRT7 TOPO TA is derived from pET-3a (Rosenberg
  • the expression of the gene of interest is induced by providing a source of T7 RNA polymerase. This is accomplished using the BL21 (DE3) pLysS strain of Escherichia coli which contains a chromosomal copy of the gene encoding T7 RNA polymerase.
  • the T7 RNA polymerase gene is under the control of the LacUV5 promoter inducible by IPTG.
  • This vector offers the possibility of directly cloning a PCR product upstream of the T7 promoter thanks to the action of topoisomerase I. Furthermore, this vector presents, in phase, an Xpress epitope localized in N-terminal allowing the detection of the protein produced using anti-Xpress antibodies, an N-terminal polyhistidine tag allowing the purification of the protein produced on columns of nickel-charged agarose resin (Probond, Invitrogen), and an enterokinase cleavage site allowing elimination of the tags located in the N-terminal part of the protein.
  • pCRT7 TOPO TA also contains an ampicilin resistance gene and an origin of ori bacterial replication.
  • the cDNA coding for the immortalizing protein for example the 32 kDa ElA protein of the adenovirus is amplified by RT-PCR using a pair of specific primers.
  • the 5 ′ primer also includes a sequence coding for the third helix of the Antennapedia omeodomain. This amplification by RT-PCR is carried out on total RNA purified from cells expressing the gene coding for the immortalizing protein, for example cells expressing the ElA gene of denovirus such as 293 cells.
  • the fusion protein is produced in the bacterial strain Escherichia coli BL21 (DE3) LysS and purified on a Probond Resin column (Invitrogen) (Perez F., Joliot A., Bloch-Gallego E., Zahraoui A., Triller A. and Prochiantz A., J. Cell. Sci. 1992, 102: 717-722; Perez F., Lledo PM, Karagogeos D., Vincent JD, Prochiantz A. and Ayala J., Mol Endocrinol 1994; 8: 1278-1287) . 2) Tests on primary crops.
  • Primary cultures for example of cerebral endothelial cells or pigmented epithelial cells of the retina, are incubated in the presence of increasing concentrations of the fusion protein ranging from 0.1 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml; the culture medium can be changed daily.
  • the proliferation index of the treated cells can be compared with that of primary cells in the absence of fusion protein, for example by a test for incorporation of tritiated thy idine or by a test for incorporation of BrdU known to those skilled in the art. .
  • the cells can be passed and the conditions leading to an absence of the occurrence of senescence will thus be determined.
  • the optimal conditions for increasing the capacity and the duration of proliferation of primary cultures, by means of one or more exogenous proteins can be defined.

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Abstract

The invention concerns a method for preparing conditionally immortalised cells which consists in contacting cells with one or several immortalising proteins in conditions enabling said protein(s) to penetrate into the cells. The immortalising proteins are associated, conjugated or coupled by any type of bond to a chemical substance or unit or to a particle, capable of enabling said immortalising proteins to be transferred into the cytoplasm and/or the nucleus of the cells.

Description

PROCEDE D'IMMORTALISATION CONDITIONNELLE DE CELLULES ET LES CONSTRUCTIONS PROTEIQUES POUR SA MISE EN ŒUVRE. PROCESS FOR CONDITIONAL IMMORTALIZATION OF CELLS AND PROTEIN CONSTRUCTIONS FOR ITS IMPLEMENTATION.
La présente invention concerne la préparation de cellules immortalisées de manière conditionnelle, utiles pour le traitement par thérapie cellulaire de multiples pathologies ou comme modèle pour la compréhension de phénomène cellulaire ou le criblage de substances actives ou le diagnostic de multiples pathologies. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé de préparation de cellules immortalisées consistant à introduire dans lesdites cellules une ou plusieurs protéines immortalisantes . On entend au sens de la présente invention par immortalisation conditionnelle, l'extension de la capacité et de la durée de prolifération des cellules. Ainsi, selon l'invention, une protéine immortalisante est une protéine capable d'étendre la capacité et la durée de prolifération des cellules dans lesquelles elle a été introduite. L" immortalisation conditionnelle selon la présente invention est remarquable en ce qu'elle est non génétique.The present invention relates to the preparation of conditionally immortalized cells, useful for the treatment by cell therapy of multiple pathologies or as a model for the understanding of cellular phenomenon or the screening of active substances or the diagnosis of multiple pathologies. More particularly, the subject of the invention is a process for the preparation of immortalized cells consisting in introducing into said cells one or more immortalizing proteins. For the purposes of the present invention, conditional immortalization is understood to mean the extension of the cell proliferation capacity and duration. Thus, according to the invention, an immortalizing protein is a protein capable of extending the capacity and the duration of proliferation of the cells into which it has been introduced. The conditional immortalization according to the present invention is remarkable in that it is non-genetic.
Les cellules de mammifères et plus particulièrement les cellules humaines isolées à partir de l'organisme ont une capacité à proliférer tout à fait limitée. Dans un certain nombre de pathologies chroniques comme la maladie de Parkinson, l'ischémie des muscles cardiaques ou des membres périphériques, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), la rétinite pigmentaire, le diabète, etc., il peut se produire une dégénérescence ou une disparition de certaines cellules, telles que par exemple les cardiomyocytes dans les ischémies du muscle cardiaque, les neurones dopaminergiques dans le système nerveux pour la maladie de Parkinson, ou bien les cellules de l'épithélium de la rétine dans le cas de la DMLA, les îlots de Langerhans dans le cas du diabète .Mammalian cells, and more particularly human cells isolated from the organism, have a very limited capacity to proliferate. In a number of chronic conditions such as Parkinson's disease, ischemia of the heart muscles or peripheral limbs, age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, diabetes, etc., it can occur degeneration or disappearance of certain cells, such as for example cardiomyocytes in ischemia of the heart muscle, dopaminergic neurons in the nervous system for Parkinson's disease, or cells of the retinal epithelium in the case of AMD, the islets of Langerhans in the case of diabetes.
Or, les cellules qui dégénèrent ou disparaissent ne sont pas remplacées. Un moyen de palier à ce défaut réside dans des approches de thérapies substitutives ou des cellules pouvant remplir les fonctions déficientes sont apportées. Il peut s'agir de cellules autologues, allogéniques, voire même xénogéniques. Différentes techniques ont . été proposées dans l'art antérieur pour développer ou utiliser de telles cellules.However, cells that degenerate or disappear are not replaced. A means of remedying this defect lies in replacement therapy approaches where cells that can perform deficient functions are brought in. They can be autologous, allogenic, or even xenogenic cells. Different techniques have. have been proposed in the prior art for developing or using such cells.
Par exemple des cellules souches autologues ou allogéniques de précurseurs hématopoïétiques peuvent être obtenues en grande quantité et regreffées. Il s'agit souvent de cellules primaires. Malheureusement, dans bon nombre de cas, les cellules d'intérêt ne peuvent pas être obtenues en quantités suffisantes.For example, autologous or allogenic stem cells of hematopoietic precursors can be obtained in large quantities and grafted. They are often primary cells. Unfortunately, in many cases, the cells of interest cannot be obtained in sufficient quantities.
Une approche très utilisée réside dans le développement de lignées de cellules immortalisées qui dérivent d'un type cellulaire et peuvent être utilisées de façon indéfinies. Il s'agit de lignées cellulaires allogéniques ou xénogéniques qui permettent de remplacer les cellules manquantes ou détectives .One widely used approach is the development of immortalized cell lines that derive from a cell type and can be used indefinitely. These are allogeneic or xenogenic cell lines that replace missing or detecting cells.
Les lignées obtenues présentent l'avantage de pouvoir être propagées de manière extensive, ce qui permet de générer un grand nombre de cellules et est donc compatible avec une utilisation commerciale. Ces cellules peuvent en outre être testées de manière intensive, aussi bien au niveau microbiologique qu'au niveau de la tumorigénicité .The lines obtained have the advantage of being able to be propagated extensively, which makes it possible to generate a large number of cells and is therefore compatible with commercial use. These cells can also be tested intensively, both at the microbiological level and at the level of tumorigenicity.
Toutefois, l' immortalisation définitive conduit à une dédifférenciation partielle des cellules qui leur fait perdre un certain nombre de caractéristiques des cellules primaires dont elles dérivent . Par ailleurs les cellules sont immortalisées avec un ou plusieurs oncogènes ce qui les rend plus proche d'un événement de transformation et peut conduire potentiellement à des tumeurs chez les patients après la greffe de ces cellules. De plus, il est relativement difficile d'obtenir des lignées stables non tumorigènes . Il s'agit en effet d'un processus long et méticuleux qui est en outre empirique en ce sens qu'il n'y a pas de règles établies. Une autre approche réside dans l'utilisation de cellules primaires autologues, mais plus généralement allogéniques, voire même xénogénique. L'utilisation de cellules xénogéniques pose à la fois un problème de sécurité virale du fait d'une transmission horizontale potentielle d'un agent infectieux d'une espèce donnée à l'homme, et un problème de réponse immune de l'hôte contre le greffon, surtout dans le cas de pathologies chroniques du type mentionnées précédemment.However, the final immortalization leads to a partial dedifferentiation of the cells which makes them lose a certain number of characteristics of the primary cells from which they derive. Furthermore, the cells are immortalized with one or more oncogenes which makes them closer to a transformation event and can potentially lead to tumors in patients after the transplant of these cells. In addition, it is relatively difficult to obtain stable non-tumorigenic lines. It is indeed a long and meticulous process which is moreover empirical in the sense that there are no established rules. Another approach resides in the use of autologous primary cells, but more generally allogeneic, or even xenogenic. The use of xenogenic cells poses both a problem of viral safety due to a potential horizontal transmission of an infectious agent of a given species to humans, and a problem of the host's immune response against graft, especially in the case of chronic pathologies of the type mentioned above.
Ainsi, la greffe de neurones foetaux humains a été utilisé chez des patients atteints de la maladie de Parkinson. Le recul de plusieurs années montre que cela est tout à fait positif en terme de bénéfice pour le patient. Toutefois, cette approche souffre d'une limitation majeure, qui est l'approvisionnement en cellules. Ceci limite aujourd'hui une utilisation thérapeutique à grande échelle, car, même s'il s'agit d'une approche allogénique, il demeure un problème de sécurité en terme de contaminations potentielles du receveur de la greffe par les cellules du donneur.Thus, transplantation of human fetal neurons has been used in patients with Parkinson's disease. The hindsight of several years shows that this is completely positive in terms of benefit for the patient. However, this approach suffers from a major limitation, which is the supply of cells. This limits today a large-scale therapeutic use, because, even if it is an allogeneic approach, there remains a safety problem in terms of potential contamination of the transplant recipient by the donor cells.
Il a également été proposé une immortalisation conditionnelle des cellules obtenue par transfert rétroviral d'un oncogène et excision par recombinaison « site- specifique « ( esterman K. Y. and Leboulch P., Proc. Natl . Acad. Sci . 1996 ; 93 : 8971-8976.1996 ; Kobayashi N. , Fujiwara T., Westerman K.A. , Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J. , Tanaka N. , Fox I.J., Leboulch P., Science . 2000 ; 287 : 1258-1262) .It has also been proposed a conditional immortalization of cells obtained by retroviral transfer of an oncogene and excision by “site-specific” recombination (esterman KY and Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 8971-8976.1996 ; Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman KA, Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J., Tanaka N., Fox IJ, Leboulch P., Science. 2000; 287: 1258 -1262).
La présente invention a précisément pour but de s'affranchir des inconvénients ci-dessus liés à l'emploi de lignées ou de cellules primaires et des cellules souches. Ce but est atteint selon l'invention grâce à un procédé de préparation de cellules immortalisées conditionnellement comprenant la mise en contact de cellules avec une ou plusieurs protéines immortalisantes dans des conditions permettant la pénétration de la ou desdites protéines dans les cellules .The present invention specifically aims to overcome the above drawbacks related to the use of lines or primary cells and stem cells. This object is achieved according to the invention by a process for the preparation of conditionally immortalized cells comprising bringing cells into contact with one or more immortalizing proteins in conditions allowing the penetration of said protein (s) into cells.
L'introduction d'une ou plusieurs protéines immortalisantes dans les cellules selon le procédé de l'invention présente l'avantage d'être temporaire et réversible .The introduction of one or more immortalizing proteins into cells according to the method of the invention has the advantage of being temporary and reversible.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet aux cellules de passer l'étape de sénescence et donc d'être propagées de manière avantageuse jusqu'à la crise et au delà. En outre, l'addition de plusieurs protéines immortalisantes dans les cultures permettent aux cellules de passer l'étape de crise.The process of the invention is remarkable in that it allows cells to pass the senescence stage and therefore to be propagated advantageously until the crisis and beyond. In addition, the addition of several immortalizing proteins in the cultures allow the cells to pass the crisis stage.
Les cellules obtenues par le procédé de l'invention pourront être clonêes de manière à avoir une descendance cellulaire clonale si cela s'avère nécessaire.The cells obtained by the method of the invention may be cloned so as to have clonal cell progeny if this proves necessary.
Le procédé de l'invention concerne tout particulièrement la préparation de cellules primaires immortalisées de manière conditionnelle. Il peut s'agir de : - cellules pancréatiques β impliquées dans les diabètes de type I,The process of the invention particularly relates to the preparation of conditionally immortalized primary cells. They can be: - β pancreatic cells involved in type I diabetes,
- cellules souches neuroépithéliales impliquées dans les maladies neurodégénératives,- neuroepithelial stem cells involved in neurodegenerative diseases,
- cellules génitrices hématopoiétiques, - cellules épithéliales rétiniennes pigmentées impliquées dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge,- hematopoietic genitor cells, - pigmented retinal epithelial cells involved in age-related macular degeneration,
- cellules endothéliales,- endothelial cells,
- les cellules de l'épithélium de la rétine, les neurones et notamment les neurones photorécepteurs, les kératinocytes- cells of the retinal epithelium, neurons and in particular photoreceptor neurons, keratinocytes
- les hépatocytes,- hepatocytes,
- les cellules issues d'îlots de Langerhans,- cells from islets of Langerhans,
- les cellules musculaires lisses, - les chondrocytes,- smooth muscle cells, - chondrocytes,
- les cellules de l'épiderme et du derme,- cells of the epidermis and dermis,
- les ostéoblastes,- osteoblasts,
- les astrocytes,- astrocytes,
- les oligodendrocytes, - les cellules associées aux tendons. Plus particulièrement, le procédé de l'invention permet de disposer de moyens de traitement des pathologies grâce à la greffe de cellules immortalisées de manière conditionnelle. Il peut s'agir dans le cas de la rétine de la greffe de cellules de l'épithélium de la rétine, voire même de neurones photorécepteurs dont la capacité et la durée de prolifération seraient étendues, lorsque ces neurones ont disparu ou sont déficients dans des pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge ou bien la rétinite pigmentaire. Dans le cas d'hépatite fulminante, il est envisageable de greffer des hépatocytes immortalisées. Dans le cas du diabète, il est possible de greffer des cellules issues d' îlots de Langerhans capables de sécréter de l'insuline. Des pontage coronariens peuvent être réalisés avec des cellules endothéliales et éventuellement des cellules musculaires lisses. Dans le cas d'ulcères de la peau, il est envisageable de greffer des kératinocytes immortalisées . L' immortalisation conditionnelle et temporaire ou l'extension de la capacité et de la durée proliférative des cellules réalisés par le procédé de l'invention peut aussi concerner des chondrocytes pour traiter des lésions trau atiques localisée du cartilage, ou encore des arthroses liées au viellissement . De même des applications dans des domaine des greffes de peau comprenant entre autre la mise en oeuvre de cellules de l'épiderme et du derme. D'autres applications concernant les ostéoblastes, les cellules associées aux tendons sont possibles grâce au cellules immortalisées de l'invention.- oligodendrocytes, - cells associated with tendons. More particularly, the method of the invention provides means for treating pathologies by grafting cells immortalized conditionally. It may be in the case of the retina for transplanting cells of the retina epithelium, or even photoreceptor neurons whose capacity and duration of proliferation would be extended, when these neurons have disappeared or are deficient in pathologies such as age-related macular degeneration or retinitis pigmentosa. In the case of fulminant hepatitis, it is possible to graft immortalized hepatocytes. In the case of diabetes, it is possible to transplant cells from islets of Langerhans capable of secreting insulin. Coronary bypass surgery can be performed with endothelial cells and possibly smooth muscle cells. In the case of skin ulcers, it is possible to graft immortalized keratinocytes. The conditional and temporary immortalization or the extension of the proliferative capacity and duration of the cells produced by the process of the invention can also relate to chondrocytes for treating traumatic localized lesions of the cartilage, or arthritis linked to aging. . Likewise, applications in the field of skin grafts comprising, inter alia, the use of epidermis and dermis cells. Other applications concerning osteoblasts, cells associated with tendons are possible thanks to the immortalized cells of the invention.
L'invention concerne donc aussi une méthode de traitement d'une pathologie impliquant la disparition ou la déficience d'un type cellulaire consistant à greffer chez un patient atteint d'une telle pathologie une quantité efficace de cellules immortalisées selon l'invention correspondant au type cellulaire absent ou déficient. L'invention a donc également pour objet l'utilisation des cellules immortalisées conditionnellement obtenues par le procédé de l'invention pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles en diagnostic ou thérapie ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agents actifs des cellules immortalisées conditionnellement obtenues selon ce procédé .The invention therefore therefore also relates to a method of treatment of a pathology involving the disappearance or deficiency of a cell type consisting in grafting in a patient suffering from such a pathology an effective quantity of immortalized cells according to the invention corresponding to the type absent or deficient cell. The invention therefore also relates to the use of immortalized cells conditionally obtained by the process of the invention for the preparation of compositions pharmaceutical useful in diagnosis or therapy as well as pharmaceutical compositions comprising as active agents immortalized cells conditionally obtained according to this process.
Les cellules immortalisées de manière conditionnelle selon le procédé de l'invention peuvent être des cellules génétiquement modifiées, non pour leur immortalisation conditionnelle mais en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés. Ces modi ications génétiques pourront être obtenues après introduction d'un vecteur d'expression qui pourra être choisi entre autre parmi les plasmides, les AAV, les rétrovirus, les vecteurs lentiviraux, ou tout autre vecteur intégratif ou épisomal. Il peut s'agir de cellules génétiquement modifier pour exprimer par exemple un facteur de croissance, un facteur neurotrophique, un facteur angiogénique ou anti-angiogénique, une cytokine, chemokine, ou de tout autre facteur diffusible à effet thérapeutique.The cells immortalized conditionally according to the method of the invention can be genetically modified cells, not for their conditional immortalization but for the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties. These genetic modifications can be obtained after the introduction of an expression vector which can be chosen among others from plasmids, AAVs, retroviruses, lentiviral vectors, or any other integrative or episomal vector. They can be genetically modified cells to express, for example, a growth factor, a neurotrophic factor, an angiogenic or anti-angiogenic factor, a cytokine, chemokine, or any other diffusible factor with a therapeutic effect.
Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux car il permet de réaliser une propagation de cellules basée sur une immortalisation non génétique. En effet, ce sont les conditions de culture qui conditionnent les cellules quant à leur capacité de proliférer. Le génome des cellules manipulées n'est en aucun cas modifié par un l'ajout d'un gène immortalisant ou augmentant la capacité proliférative des cellules.The method of the invention is particularly advantageous because it makes it possible to carry out cell propagation based on non-genetic immortalization. In fact, it is the culture conditions which condition the cells as regards their capacity to proliferate. The genome of the manipulated cells is in no way modified by the addition of a gene immortalizing or increasing the proliferative capacity of the cells.
Ainsi, le procédé de l'invention comprend la culture des cellules dans un milieu contenant lesdites protéines immortalisantes.Thus, the method of the invention comprises culturing the cells in a medium containing said immortalizing proteins.
Le procédé de l'invention peut comprendre plusieurs passages de culture des cellules dont tout ou partie desdits passages comprend l'addition de protéines immortalisantes. Les cellules primaires, mise en contact avec une ou plusieurs protéines permettant d' étendre leur capacité de prolifération, pourront être cultivées un nombre de fois suffisant avant leur injection chez les patients à traiter. iThe method of the invention can comprise several passages of cell culture, all or part of said passages comprising the addition of immortalizing proteins. The primary cells, brought into contact with one or more proteins making it possible to extend their proliferation capacity, may be cultured a sufficient number of times before their injection in the patients to be treated. i
Les cellules primaires, mise en contact avec une ou plusieurs protéines permettant d'étendre leur capacité et leur durée de prolifération, peuvent être cultivées un nombre de fois suffisant avant leur injection chez les patients à traiter. Les protéines permettant d'étendre la capacité de prolifération des cellules pourront ne plus être ajoutées dans le milieu de culture au cours du ou des derniers passages avant l'injection chez les patients. En effet il a été montré par Kobayashi et al. (Kobayashi N. , Fujiwara T., Westerman K.A. , Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J. , Tanaka N. , Fox I.J., Leboulch P., Science. 2000 ; 287 : 1258-1262) que l'excision d'un gène immortalisant, tel que le gène codant pour l'antigène grand T de SV40, conduisait à une différentiation des cellules immortalisées vers le phénotype des cellules dont elles dérivent . Cette propriété est tout à fait intéressante dans la mesure où elle doit conduire à une réversion des cellules vers un phénotype totalement différencié et donc vers une meilleure activité biologique.The primary cells, brought into contact with one or more proteins making it possible to extend their capacity and their duration of proliferation, can be cultured a sufficient number of times before their injection in the patients to be treated. The proteins making it possible to extend the proliferation capacity of the cells may no longer be added to the culture medium during the last passage (s) before injection in patients. Indeed it has been shown by Kobayashi et al. (Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman KA, Inoue Y., Sakaguchi M., Noguchi H., Miyazaki M., Cai J., Tanaka N., Fox IJ, Leboulch P., Science. 2000; 287: 1258 -1262) that the excision of an immortalizing gene, such as the gene coding for the large T antigen of SV40, led to a differentiation of the immortalized cells towards the phenotype of the cells from which they derive. This property is quite advantageous insofar as it must lead to a reversion of the cells towards a completely differentiated phenotype and therefore towards better biological activity.
Les protéines immortalisantes introduites dans les cellules selon le procédé de l'invention peuvent être des protéines, polypeptides ou peptides possédant une fonction proliférative aussi désigné en anglais comme conférant une "extended life-span" . A titre d'exemple, on peut citer les protéines suivantes : les produits des oncogènes cellulaires et viraux comme notamment SV40Tag, ElA de 1 ' adenovirus , E6, E7 de l'EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1, - les produits des gènes anti-sénescence comme notamment la telomerase,The immortalizing proteins introduced into the cells according to the process of the invention can be proteins, polypeptides or peptides having a proliferative function also designated in English as conferring an "extended life-span". By way of example, the following proteins can be mentioned: the products of cellular and viral oncogenes such as SV40Tag, ElA of the adenovirus, E6, E7 of EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1, - the products of anti-senescence genes such as in particular telomerase,
- les produits des gènes anti-apoptotiques comme par exemple bcl2, FLIP, ou un mélange de ceux-ci. On entend ainsi, selon l'invention, par protéines immortalisantes au pluriel tant la quantité d'une protéine immortalisante qu'un mélange de protéines immortalisantes. Aussi, le singulier et le pluriel sont utilisés indifféremment et sauf indication contraire, l'emploi de protéine immortalisante au singulier couvre le pluriel et vice versa. Le type de protéines immortalisantes et leur quantité sont fonction de la nature des cellules à immortaliser et des milieux de culture.- the products of anti-apoptotic genes such as for example bcl2, FLIP, or a mixture of these. According to the invention, by immortalizing proteins in the plural is thus meant both the quantity of an immortalizing protein and a mixture of immortalizing proteins. Also, the singular and the plural are used interchangeably and unless otherwise indicated, the use of immortalizing protein in the singular covers the plural and vice versa. The type of immortalizing proteins and their quantity depend on the nature of the cells to be immortalized and the culture media.
La mise en contact en vue de l'introduction de protéines immortalisantes dans les cellules selon le procédé de l'invention admet plusieurs formes de mise en œuvre. Celles-ci peuvent être fonction de la nature des cellules, de leur milieu de culture et de la protéine immortalisante.Contacting for the introduction of immortalizing proteins into cells according to the method of the invention admits several forms of implementation. These can be a function of the nature of the cells, of their culture medium and of the immortalizing protein.
Il peut s'agir de tout composé ou motif chimique et notamment des peptides, polypeptides ou protéine, de particules, nanoparticules comme des liposomes, auxquels sont associées, conjuguées ou couplées par tout type de liaison, covalente ou non, des protéines immortalisantes, et capables de permettre le transfert desdites protéines immortalisantes dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules.It can be any compound or chemical motif and in particular peptides, polypeptides or protein, particles, nanoparticles such as liposomes, to which are associated, conjugated or coupled by any type of bond, covalent or not, immortalizing proteins, and capable of allowing the transfer of said immortalizing proteins into the cytoplasm and / or the nucleus of cells.
Une première forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à introduire les protéines immortalisantes dans les cellules à l'aide de particules contenant ou comprenant à leur surface lesdites protéines immortalisantes. Il peut s'agir par exemple de liposomes ayant des propriétés fusogenes permettant de délivrer leur contenu protéique dans les cellules.A first embodiment of the method of the invention consists in introducing the immortalizing proteins into the cells using particles containing or comprising on their surface said immortalizing proteins. They may for example be liposomes having fusogenic properties making it possible to deliver their protein content into the cells.
Mais il peut s'agir aussi d'autres types de particules permettant d' introduire la ou les protéines par des méthodes physiques comme le bombardement de particules ou l'utilisation de champs électriques ou encore 1 ' électroporation.But it can also be other types of particles making it possible to introduce the protein (s) by physical methods such as bombardment of particles or the use of electric fields or even electroporation.
Une deuxième forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à utiliser des dendrimers sur lesquels les protéines pourront être adsorbées .A second embodiment of the process of the invention consists in using dendrimers on which the proteins can be adsorbed.
Une troisième forme de réalisation du procédé de l'invention consiste à introduite les protéines immortalisantes à l'aide de substance vectrice. Un premier X type de substance vectrice consiste en des systèmes de transport intracellulaire utilisant des virus inactivés tel que proposé pour transférer des plasmides dans les cellules . Un second type de substance vectrice consiste en les domaines cargo permettant le transfert de protéines liées en cis, de l'espace extracellulaire vers l'espace intracellulaire. Enfin un troisième type de substance vectrice consiste en tout motif chimique permettant le couplage de protéines conformes à 1 ' invention et permettant la translocation des dites protéines depuis le milieu extracellulaire vers le cytoplasme et/ou le noyau (Service R.F., Science . 2000 ; 288 : 28-29.).A third embodiment of the process of the invention consists in introducing the immortalizing proteins using the vector substance. A first X type of carrier substance consists of intracellular transport systems using inactivated viruses as proposed for transferring plasmids into cells. A second type of carrier substance consists of the cargo domains allowing the transfer of cis-linked proteins from the extracellular space to the intracellular space. Finally, a third type of vector substance consists of any chemical motif allowing the coupling of proteins in accordance with the invention and allowing the translocation of said proteins from the extracellular medium to the cytoplasm and / or the nucleus (Service RF, Science. 2000; 288 : 28-29.).
Les domaines dit " cargo " sont définis comme permettant le transfert en cis d'une protéine du milieu de culture vers l'intérieur des cellules. Divers motifs protéiques décrits dans 1 ' art antérieur peuvent assurer de telles fonctions cargo.The so-called "cargo" domains are defined as allowing the transfer in cis of a protein from the culture medium to the interior of the cells. Various protein patterns described in the prior art can provide such cargo functions.
Une forme de mise en oeuvre préférée de ce mode de réalisation de l'invention consiste à introduire dans les cellules la protéine immortalisante associée à une protéine ou peptide de transport ou peptide cargo à travers la membrane plasmique. Parmi ceux-ci, on peut citer plus particulièrement, la protéine VP22 du virus HSV-1, 1 ' oméodomaine du facteur du transcription Antennapédia ou la troisième hélice de 1 'homéodomaine de cette protéine, le domaine de transduction protéique de la protéine TAT du VIH, la séquence de translocation de membrane K-FGF, ou encore certains anticorps murins ou humain, polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant l'ADN ou bien des peptides dérivés de ces anticorps, des motifs chimiques comme les poly- arginines, ou des séquences ou fragments dérivés de ceux-ci. Ces peptides ou protéines présentent la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules et de véhiculer des agents qui leur sont couplés .A preferred embodiment of this embodiment of the invention consists in introducing into the cells the immortalizing protein associated with a protein or transport peptide or cargo peptide through the plasma membrane. Among these, there may be mentioned more particularly, the protein VP22 of the HSV-1 virus, the omeodomain of the Antennapedia transcription factor or the third helix of the homeodomain of this protein, the protein transduction domain of the TAT protein of HIV, the K-FGF membrane translocation sequence, or certain murine or human, polyclonal or monoclonal antibodies recognizing DNA or peptides derived from these antibodies, chemical motifs such as poly-arginines, or sequences or fragments derived therefrom. These peptides or proteins have the capacity to cross the plasma membrane of cells and to transport agents which are coupled to them.
Il sera indiqué ci-après plusieurs exemples préférés de peptide ou protéine utile pour introduire les protéines immortalisantes dans des cellules selon le procédé 1 ' invention.Several preferred examples of a peptide or protein useful for introducing the following will be indicated. proteins immortalizing in cells according to the method 1 invention.
1) Le couplage de protéines immortalisantes à la protéine VP22 du virus HSV-1.1) The coupling of immortalizing proteins to the VP22 protein of the HSV-1 virus.
La protéine VP22 du virus HSV-1 est un constituant de 38 kDa du tégument, structure localisée entre la capside et l'enveloppe du virus (Dargan D. The structure and assembly of herpès viruses. In : Harris J.R., Horne R.W. (eds) Viral Structure . New York : Académie Press, 1986, pp 359-437) .The protein VP22 of the virus HSV-1 is a constituent of 38 kDa of the integument, structure located between the capsid and the envelope of the virus (Dargan D. The structure and assembly of herpes viruses. In: Harris JR, Horne RW (eds) Viral Structure, New York: Académie Press, 1986, pp 359-437).
Récemment, Elliot et O'Hare (Elliot G. and O'Hare P., Gène Therapy 1999 ; 6 : 149-151) ont démontré que VP22 présente une nouvelle propriété de transport tant dans les cellules transfectées que dans des cellules infectées. Dans les cellules transfectées, VP22 est localisée principalement dans le cytoplasme où elle est associée aux microtubules . Cependant VP22 peut être transportée depuis le cytoplasme d'une cellule productrice vers les cellules avoisinantes où elle s'accumule dans le noyau. Ce mécanisme de transport n'est pas encore complètement élucidé mais semble impliquer une voie indépendante du Golgi faisant intervenir l'actine du cytosquelette (Elliot G. and O'Hare P., Cell 1997 ; 88 : 223-233). Par ailleurs ces auteurs ont montré que la protéine VP22 fusionnée à un peptide reporteur tel que la GFP conserve ses capacités de translocation démontrant la possibilité d'utiliser les propriétés d' internalisation de la VP22 pour délivrer des protéines hëtérologues dans le cytoplasme et le noyau de cellules . Ainsi Phelan et al. (Phelan A ., Elliot G. and O'Hare P., Nat . Biotechnol . 1998 ; 16 : 440-443.), ont démontré qu'une protéine chimérique VP22-p53 conserve sa capacité à être sécrétée ainsi que ses propriétés d' internalisation et de ciblage nucléaire. De plus la protéine de fusion VP22-p53 induit l'apoptose de cellules d'ostéosarcome humain n'exprimant pas p53 (SAOS-2) .Recently, Elliot and O'Hare (Elliot G. and O'Hare P., Gene Therapy 1999; 6: 149-151) have demonstrated that VP22 has a new transport property in both transfected and infected cells. In transfected cells, VP22 is localized mainly in the cytoplasm where it is associated with microtubules. However, VP22 can be transported from the cytoplasm of a producer cell to neighboring cells where it accumulates in the nucleus. This transport mechanism is not yet fully understood but seems to involve a Golgi-independent pathway involving cytoskeleton actin (Elliot G. and O'Hare P., Cell 1997; 88: 223-233). Furthermore, these authors have shown that the VP22 protein fused to a reporter peptide such as GFP retains its translocation capacities demonstrating the possibility of using the internalization properties of VP22 to deliver heterologous proteins into the cytoplasm and the nucleus of cells. Thus Phelan et al. (Phelan A., Elliot G. and O'Hare P., Nat. Biotechnol. 1998; 16: 440-443.), Demonstrated that a chimeric protein VP22-p53 retains its ability to be secreted as well as its properties of internalisation and nuclear targeting. In addition, the fusion protein VP22-p53 induces apoptosis of human osteosarcoma cells not expressing p53 (SAOS-2).
Récemment, Dilber et al. (Dilber M. S., Phelan A., Aints A., Mohamed A.J., Elliott G., Edvard Smith CI. and O'Hare P., Gène Therapy 1999 ; 6 : 12-21) ont mis en évidence qu'une protéine de fusion formée de VP22 en phase avec la thymidine kinase (TK) du HSV conserve aussi les propriétés de transport intercellulaire de la VP22 ainsi que l'activité enzymatique de la TK. Dans cette étude, les auteurs montrent que le traitement par le ganciclovir de cellules n'exprimant pas de "gap junctions" (Neuro2-A) mais exprimant la protéine de fusion VP22-TK, conduit in vitro à un effet cytotoxic bystender' et à une régression tumorale in vivo.Recently, Dilber et al. (Dilber MS, Phelan A., Aints A., Mohamed AJ, Elliott G., Edvard Smith CI. And O'Hare P., Gène Therapy 1999; 6: 12-21) evidence that a fusion protein formed from VP22 in phase with the thymidine kinase (TK) of HSV also retains the intercellular transport properties of VP22 as well as the enzymatic activity of TK. In this study, the authors show that treatment with ganciclovir of cells not expressing "gap junctions" (Neuro2-A) but expressing the fusion protein VP22-TK, leads in vitro to a cytotoxic bystender 'effect and to tumor regression in vivo.
2) La fusion de protéine immortalisante à 1'homéodomaine d'une homéoprotéine connue pour présenter la capacité de traverser les membranes biologiques .2) The fusion of immortalizing protein to the homeodomain of a homeoprotein known to have the capacity to cross biological membranes.
Les homéoprotéines constituent une classe de facteurs de transcription initialement découverts chez la Drosophile et impliqués dans de nombreux processus morphologiques. Ces protéines se lient à l'ADN grâce à une séquence spécifique de 60 acides aminés appelée homéodomaine. L'homéodomaine est formé de trois oc-hélices et d'un coude β localisé entre la seconde et la troisième hélice (Qian Y. Q., Billeter M., Otting G., Muller M., Gehring W.J. and Wuthrich K. , Cell 1989 ; 59 : 573-80). Tous les vertébrés, mammifères inclus, synthétisent de nombreuses homéoprotéines phylogénetiquement reliées aux protéines initialement caractérisées chez la Drosophile.Homeoproteins are a class of transcription factors initially discovered in Drosophila and involved in many morphological processes. These proteins bind to DNA through a specific sequence of 60 amino acids called homeodomain. The homeodomain is formed of three oc-helices and a β elbow located between the second and the third helix (Qian YQ, Billeter M., Otting G., Muller M., Gehring WJ and Wuthrich K., Cell 1989; 59: 573-80). All vertebrates, mammals included, synthesize numerous homeoproteins phylogenetically linked to the proteins initially characterized in Drosophila.
Différents travaux sur 1 ' homéodomaine du facteur de transcription Antennapedia de Drosophile ont permis de montrer que les peptides homëodomaines traversent les membranes plasmiques par un processus énergie-indépendant et donc distinct de 1 ' endocytose . La 3ιeme hélice du peptide homéodomaine possède les mêmes propriétés (Joliot A. , Pernelle C. , Deagostini-Bazin H. and Prochiantz A. , Proc. Natl . Acad. Sci . 1991 ; 88 : 1864-1868 ; Derossi D. , Joliot A.H., Chassaing G. and Prochiantz A., J. Cell . Biol . 1994 ; 269 : 10444-10450) . Ces propriétés ont été utilisées pour internaliser, dans des cellules, des polypeptides et des oligonucléotides liés à 1 ' homéodomaine ou à la 3lerae héliceVarious studies on the homeodomain of the Drosophila Antennapedia transcription factor have made it possible to show that the homeodomain peptides cross the plasma membranes by an energy-independent process and therefore distinct from endocytosis. The third helix of the homeodomain peptide has the same properties (Joliot A., Pernelle C., Deagostini-Bazin H. and Prochiantz A., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991; 88: 1864-1868; Derossi D., Joliot AH, Chassaing G. and Prochiantz A., J. Cell. Biol. 1994; 269: 10444-10450). These properties have been used to internalize into cells, polypeptides and oligonucleotides bound 1 homeodomain or 3 helix lerae
(Derossi D., Chassaing G. and Prochiantz A., Trends Cell(Derossi D., Chassaing G. and Prochiantz A., Trends Cell
Biol . 1998, 8 : 84-87 ; Selivanova G., Iotsova I., Okan I ., Fritsche M., Strôm M., Groner B., Grafstrôm R. C. and Wiman K. G., Nature Med. 1997, 6 : 632-638 ; Bandara L. R. , Girling R. and La Thangue Ν. B., Nat . Biotechnol . 1997, 15 : 896-901. ; Kato D. , Miyazawa K. , Ruas M., Starborg M., Wada I., Oka T., Sakai T., Peters G. and Hara E. , FEBS Lett . 1998, 427 : 203-208. ; Fâhraeus R. , Lain S., Bail K. L. and Lane D., Oncogene 1998, 16, 587-596 ; Fâhraeus R., Paramio J. M., Bail K. L., Lain S. and Lane D., Curr. Biol . 1996 ; 6 : 84-91. ; Bail K. L., Lain S., Fâhraeus R. , Smythe C. and Lane D. , Curr. Biol . 1996, 7 : 71-80 ; Bonfanti M., Taverna S., Salmona M., D'Incalci M. and Broggini M., Cancer Res .Biol. 1998, 8: 84-87; Selivanova G., Iotsova I., Okan I., Fritsche M., Strôm M., Groner B., Grafstrôm RC and Wiman KG, Nature Med. 1997, 6: 632-638; Bandara LR, Girling R. and La Thangue Ν. B., Nat. Biotechnol. 1997, 15: 896-901. ; Kato D., Miyazawa K., Ruas M., Starborg M., Wada I., Oka T., Sakai T., Peters G. and Hara E., FEBS Lett. 1998, 427: 203-208. ; Fâhraeus R., Lain S., Bail KL and Lane D., Oncogene 1998, 16, 587-596; Fâhraeus R., Paramio JM, Bail KL, Lain S. and Lane D., Curr. Biol. 1996; 6: 84-91. ; Bail KL, Lain S., Fâhraeus R., Smythe C. and Lane D., Curr. Biol. 1996, 7: 71-80; Bonfanti M., Taverna S., Salmona M., D'Incalci M. and Broggini M., Cancer Res.
1997, 57 : 1442-1446 ; Warbrick E., Lane D. , Glover D. M. and Cox L. C, Curr. Biol . 1995, 5 : 275-282).1997, 57: 1442-1446; Warbrick E., Lane D., Glover D. M. and Cox L. C, Curr. Biol. 1995, 5: 275-282).
Le plus petit fragment de l' homéodomaine capable de traverser les membranes et de servir de vecteur à d'autres peptides ou bien à des oligonucléotides est un peptide de 16 acides aminés correspondant à la troisième hélice de 1 ' homéodomaine et incluant les acides aminés 43 à 58 de 1 ' homéodomaine .The smallest fragment of homeodomain capable of crossing membranes and serving as a vector for other peptides or else for oligonucleotides is a peptide of 16 amino acids corresponding to the third helix of the homeodomain and including amino acids 43 58 of the homeodomain.
3) La fusion de protéine immortalisante à la séquence complète d' homéoprotéines telles que Hoxa5 et Engrailed.3) The fusion of immortalizing protein to the complete sequence of homeoproteins such as Hoxa5 and Engrailed.
Différents travaux ont montré que ces protéines, bien qu'étant des facteurs de transcription, sont associées à des vésicules de type cavéoles et sécrétées dans le milieu extracellulaire. Une fois sécrétées ces protéines présentent, à l'image de leur homéodomaine, la capacité à traverser la membrane plasmique des cellules avoisinantes et s'accumulent dans le noyau (Châtelain L., Volovitch M., Joliot A. H., Perz F. and Prochiantz A., Mech . Dev. 1997, 55 : 111-117 ; Joliot A., Trembleau A., Raposo G., Calvet S., Volovitch M. and Prochiantz A., Development 1997, 124 : 1865-1875 ; Joliot A., Maizel A., Rosenberg D., Trembleau A., Dupas S., Volovitch M. and Prochiantz A., Curr. Biol .Various studies have shown that these proteins, although being transcription factors, are associated with vesicles of the caveola type and secreted in the extracellular medium. Once secreted, these proteins present, like their homeodomain, the ability to cross the plasma membrane of neighboring cells and accumulate in the nucleus (Châtelain L., Volovitch M., Joliot AH, Perz F. and Prochiantz A ., Mech. Dev. 1997, 55: 111-117; Joliot A., Trembleau A., Raposo G., Calvet S., Volovitch M. and Prochiantz A., Development 1997, 124: 1865-1875; Joliot A. , Maizel A., Rosenberg D., Trembleau A., Dupas S., Volovitch M. and Prochiantz A., Curr. Biol.
1998, 8 : 856-863 ; Maizel A., Bensaude 0., Prochiantz A. and Joliot A., Development 1999, 126 : 3183-3190). Par ailleurs Joliot et al. (1998) et Maizel et al. (1999) ont identifié une séquence de 11 acides aminés localisée entre la seconde et la troisième hélice de l' homéodomaine d'Engrailed et ont démontré que cette séquence est nécessaire à l' export nucléaire et à la sécrétion de la protéine.1998, 8: 856-863; Maizel A., Bensaude 0., Prochiantz A. and Joliot A., Development 1999, 126: 3183-3190). Furthermore Joliot et al. (1998) and Maizel et al. (1999) identified an 11 amino acid sequence localized between the second and the third helix of the Engrailed homeodomain and demonstrated that this sequence is necessary for nuclear export and secretion of the protein.
4) La fusion de protéine immortalisante au domaine de transduction protéique de la protéine TAT du HIV.4) The fusion of immortalizing protein to the protein transduction domain of the HIV TAT protein.
En effet, différentes études ont montré que la protéine TAT du VIH présente la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules sans interaction avec un récepteur spécifique (Green M. and Loewenstein P. M., Cell 1988, 55 : 1179-1188 ; Frankel A. D. and Pabo C. 0., Cell 1988, 55 : 1189-1193) .Indeed, various studies have shown that the TAT protein of HIV has the ability to cross the plasma membrane of cells without interaction with a specific receptor (Green M. and Loewenstein PM, Cell 1988, 55: 1179-1188; Frankel AD and Pabo C. 0., Cell 1988, 55: 1189-1193).
Par la suite Fawell et al., (Fawell S., Seery J. , Daikh Y., Moore C, Chen L. L., Pepinsky B. and BarsoumSubsequently Fawell et al. (Fawell S., Seery J., Daikh Y., Moore C, Chen L. L., Pepinsky B. and Barsoum
J. , Proc. Natl . Acad. Sci . USA 1994, 91 : 664-668) ont mis montré que des protéines heterologues telle que la β galactosidase, chimiquement couplée à un domaine de 36 acides aminés de la protéine TAT peuvent-être internalisées par différents types cellulaires (Pepinsky R. B., Androphy E. J. , Corina K. , Brown R. and Barsoum J. , DNA Cell Biol . 1994, 13 : 1011-1019) .J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91: 664-668) have shown that heterologous proteins such as β galactosidase, chemically coupled to a domain of 36 amino acids of the TAT protein can be internalized by different cell types (Pepinsky RB, Androphy EJ, Corina K., Brown R. and Barsoum J., DNA Cell Biol. 1994, 13: 1011-1019).
Récemment , Nagahara et al . , (Nagahara H . , Vocero-Akbani A. M., Snyder E. L., Ho A., Latham D.G., Lissy N. A., Becker-Hapak M., Ezhevsky S. A. and Dowdy S. F., Nat . Med. 1998, 4 : 1449-1452) ont démontré qu'une protéine de fusion TAT-p27K:Lpl comportant la totalité de la séquence p27Kιpl en phase avec un fragment de 11 acides aminés constituant le domaine de transduction protéique de la protéine TAT peut-être internalisée par des cellules en culture. Par ailleurs, la _ galactosidase (120 kDa) fusionnée au domaine de transduction protéique de la protéine TAT, après injection intrapéritonéale, chez la souris, peut-être internalisée par tous les tissus, notamment par le cerveau. La protéine de fusion internalisée conserve l'activité enzymatique de la β galactosidaseRecently, Nagahara et al. , (Nagahara H., Vocero-Akbani AM, Snyder EL, Ho A., Latham DG, Lissy NA, Becker-Hapak M., Ezhevsky SA and Dowdy SF, Nat. Med. 1998, 4: 1449-1452) that a TAT- p27 K: Lpl fusion protein comprising the entire p27 Kιpl sequence in phase with a fragment of 11 amino acids constituting the protein transduction domain of the TAT protein may be internalized by cells in culture. Furthermore, _ galactosidase (120 kDa) fused to the protein transduction domain of the TAT protein, after intraperitoneal injection, in mice, may be internalized by all tissues, in particular by the brain. Internalized fusion protein retains the enzymatic activity of β galactosidase
(Schwarze S.R., Ho A., Vocero-Akbani A. and Dowdy S. F., Science 1999, 285 : 1569-1572) . 5) La liaison de protéine immortalisante à un anticorps monoclonal polyréactif anti-ADN, à un fragment F(ab')2, à un fragment F(ab) ou à un peptide correpondant aux CDR2 et CDR3 (CDR2-3) du dit anticorps. Les anticorps monoclonaux polyréactifs anti-ADN peuvent pénétrer dans différents types cellulaires in vitro et s'accumulent dans le noyau. Ces anticorps ce fixent à des antigènes membranaires, mais aucune corrélation n'a pu être établie entre cette fixation et leur capacité à passer la membrane. De tels anticorps, fragments F(ab')2, F(ab) et peptide CDR2-3 présentent la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules. Différentes molécules(Schwarze SR, Ho A., Vocero-Akbani A. and Dowdy SF, Science 1999, 285: 1569-1572). 5) The binding of immortalizing protein to a polyréactive anti-DNA monoclonal antibody, to a fragment F (ab ') 2, to a fragment F (ab) or to a peptide corresponding to CDR2 and CDR3 (CDR2-3) of said antibody . Anti-DNA polyreactive monoclonal antibodies can enter different cell types in vitro and accumulate in the nucleus. These antibodies bind to membrane antigens, but no correlation could be established between this binding and their ability to pass the membrane. Such antibodies, fragments F (ab ') 2, F (ab) and peptide CDR2-3 exhibit the ability to cross the plasma membrane of cells. Different molecules
(Biotin, fluorescéine, oligonucléotides, peroxidase et IgG) liées de manière covalente à un anticorps monoclonal anti- ADN ou à fragment F(ab')2 ou F(ab) ou encore au peptide CDR2-3 peuvent être transloquées au travers de la membrane des cellules et s'accumuler dans le noyau (Avrameas A., Ternynck T., Nato F., Buttin G. and Avrameas S., Proc. Natl . Acad. Sci . USA 1998, 95 : 5601-5606 ; Ternynck T., Avrameas A., Ragimbeau J., Buttin G. and Avrameas S., J". Autoimmun 1998, 11 : 511-521) .(Biotin, fluorescein, oligonucleotides, peroxidase and IgG) covalently linked to an anti-DNA monoclonal antibody or to an F (ab ') 2 or F (ab) fragment or to the CDR2-3 peptide can be translocated through the cell membrane and accumulate in the nucleus (Avrameas A., Ternynck T., Nato F., Buttin G. and Avrameas S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 5601-5606; Ternynck T ., Avrameas A., Ragimbeau J., Buttin G. and Avrameas S., J " . Autoimmun 1998, 11: 511-521).
L'utilisation de substances vectrices consistant en des peptides, polypeptides ou protéines constitue un mode de mise en œuvre préféré du procédé de l'invention dans la mesure ou le couplage de la protéine immortalisante à la substance vectrice peut être réalisée non seulement par couplage chimique mais également grâce à la production de protéine de fusion par des techniques de génie génétiques bien connues de l'homme du métier. Ces protéines recombinantes constituent alors les protéines immortalisantes de fusion utilisées conformément au procédé de l'invention.The use of vector substances consisting of peptides, polypeptides or proteins constitutes a preferred embodiment of the process of the invention in the measurement or coupling of the immortalizing protein to the vector substance can be carried out not only by chemical coupling but also thanks to the production of fusion protein by genetic engineering techniques well known to those skilled in the art. These recombinant proteins then constitute the immortalizing fusion proteins used in accordance with the method of the invention.
L'invention a donc aussi pour objet une protéine immortalisante associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison à une substance vectrice capable de permettre le transfert de ladite protéine immortalisante dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules. L'invention concerne plus particulièrement une protéine de fusion constituée d'une protéine immortalisante et d'un peptide, polypeptide ou protéine de transport dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules comme défini précédemment.The invention therefore also relates to an immortalizing protein associated, conjugated or coupled by any type of bond to a vector substance capable of allowing the transfer of said immortalizing protein into the cytoplasm and / or the nucleus of cells. The invention relates more particularly to a fusion protein consisting an immortalizing protein and a peptide, polypeptide or transport protein in the cytoplasm and / or the cell nucleus as defined above.
Comme indiqué précédemment, les cellules immortalisées selon le procédé de 1 ' invention peuvent être des cellules génétiquement modifiées, non pour leur immortalisation mais en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés. Le procédé selon l'invention permet de réaliser conjointement, l' immortalisation conditionnelle, grâce à la mise en contact des cellules avec des protéines immortalisantes, et la transformation des cellules, par la mise en contact des cellules avec un vecteur d'expression destiné à introduire un gène d'intérêt dans lesdites cellules .As indicated above, the cells immortalized according to the method of the invention can be genetically modified cells, not for their immortalization but for the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties. The method according to the invention makes it possible to carry out jointly, the conditional immortalization, by bringing the cells into contact with immortalizing proteins, and the transformation of the cells, by bringing the cells into contact with an expression vector intended for introducing a gene of interest into said cells.
L'invention concerne aussi bien entendu les cellules obtenues par le procédé de l'invention ainsi qu'une culture de cellules sur un milieu comprenant les éléments nécessaire à la culture desdites cellules et une ou plusieurs protéines immortalisantes. Le milieu peut aussi contenir un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules.The invention also relates of course to the cells obtained by the method of the invention as well as a culture of cells on a medium comprising the elements necessary for the culture of said cells and one or more immortalizing proteins. The medium can also contain an expression vector for the transformation of said cells.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront de l'exemple qui suit concernant l'expression et la purification d'une protéine de fusion entre un peptide présentant la capacité de traverser la membrane plasmique et une protéine immortalisante et des essais sur cultures primaires .Other characteristics and advantages of the invention will appear from the example which follows concerning the expression and the purification of a fusion protein between a peptide having the capacity to cross the plasma membrane and an immortalizing protein and tests on cultures. primary.
1) Préparation de la protéine de fusion.1) Preparation of the fusion protein.
Le vecteur d'expression bactérien pCRT7 TOPO TA (Invitrogen) est utilisé dans cet exemple mais n'est pas restrictif. pCRT7 TOPO TA est dérivé de pET-3a (RosenbergThe bacterial expression vector pCRT7 TOPO TA (Invitrogen) is used in this example but is not restrictive. pCRT7 TOPO TA is derived from pET-3a (Rosenberg
A. H. , Lade B . . , Chui D . s . , Lin S . . , Dunn J. J. andA. H., Lade B. . , Chui D. s. , Lin S. . , Dunn J. J. and
Studier F. W. , Gène 1987, 56 : 125-135). Dans ce vecteur, l'expression du gène d'intérêt est induite en apportant une source de T7 RNA polymérase. Ceci est accompli en utilisant la souche BL21 (DE3)pLysS de Escherichia coli qui contient une copie chromosomique du gène codant pour la T7 RNA polymérase. Le gène de la T7 RNA polymérase est sous le contrôle du promoteur LacUV5 inductible par l'IPTG.Studier FW, Gene 1987, 56: 125-135). In this vector, the expression of the gene of interest is induced by providing a source of T7 RNA polymerase. This is accomplished using the BL21 (DE3) pLysS strain of Escherichia coli which contains a chromosomal copy of the gene encoding T7 RNA polymerase. The T7 RNA polymerase gene is under the control of the LacUV5 promoter inducible by IPTG.
Ce vecteur offre la possibilité de cloner directement un produit de PCR en amont du promoteur T7 grâce à l'action de la topoisomérase I. Par ailleurs, ce vecteur présente, en phase, un épitope Xpress localisé en N-terminal permettant la détection de la protéine produite à l'aide d'anticorps anti-Xpress, un tag polyhistidine en N-terminal permettant la purification de la protéine produite sur colonnes de résine d' agarose chargée au nickel (Probond, Invitrogen) , et un site de clivage enterokinase permettant l'élimination des tag localisés dans la partie N-terminale de la protéine. pCRT7 TOPO TA comporte en outre un gène de résistance à l'ampiciline et une origine de réplication bactérienne ori .This vector offers the possibility of directly cloning a PCR product upstream of the T7 promoter thanks to the action of topoisomerase I. Furthermore, this vector presents, in phase, an Xpress epitope localized in N-terminal allowing the detection of the protein produced using anti-Xpress antibodies, an N-terminal polyhistidine tag allowing the purification of the protein produced on columns of nickel-charged agarose resin (Probond, Invitrogen), and an enterokinase cleavage site allowing elimination of the tags located in the N-terminal part of the protein. pCRT7 TOPO TA also contains an ampicilin resistance gene and an origin of ori bacterial replication.
Le cDNA codant pour la protéine immortalisante, par exemple la protéine ElA de 32 kDa de l' adenovirus est amplifié par RT-PCR en utilisant un couple d'amorces spécifiques. L'amorce 5' comporte, de plus, une séquence codant pour la troisième hélice de l' oméodomaine d'Antennapedia. Cette amplification par RT-PCR est réalisée sur des d'ARN totaux purifiés à partir de cellules exprimant le gène codant pour la protéine immortalisante, par exemple des cellules exprimant le gène ElA de l' denovirus telles que les cellules 293.The cDNA coding for the immortalizing protein, for example the 32 kDa ElA protein of the adenovirus is amplified by RT-PCR using a pair of specific primers. The 5 ′ primer also includes a sequence coding for the third helix of the Antennapedia omeodomain. This amplification by RT-PCR is carried out on total RNA purified from cells expressing the gene coding for the immortalizing protein, for example cells expressing the ElA gene of denovirus such as 293 cells.
La protéine de fusion est produite dans la souche bactérienne Escherichia coli BL21 (DE3) LysS et purifiée sur une colonne Probond Resin (Invitrogen) (Perez F., Joliot A., Bloch-Gallego E., Zahraoui A., Triller A. and Prochiantz A., J. Cell . Sci . 1992, 102 : 717-722 ; Perez F., Lledo P. M., Karagogeos D., Vincent J. D., Prochiantz A. and Ayala J. , Mol Endocrinol 1994 ; 8 :1278-1287). 2) Essais sur cultures primaires .The fusion protein is produced in the bacterial strain Escherichia coli BL21 (DE3) LysS and purified on a Probond Resin column (Invitrogen) (Perez F., Joliot A., Bloch-Gallego E., Zahraoui A., Triller A. and Prochiantz A., J. Cell. Sci. 1992, 102: 717-722; Perez F., Lledo PM, Karagogeos D., Vincent JD, Prochiantz A. and Ayala J., Mol Endocrinol 1994; 8: 1278-1287) . 2) Tests on primary crops.
Des cultures primaires par exemple de cellules endothéliale cérébrales ou de cellules épithéliales pigmentées de la rétine sont incubées en présence de concentrations croissantes de la protéine de fusion allant de 0.1 μg/ml à 100 μg/ml ; le milieu de culture pouvant être changé quotidiennement. L'index de prolifération des cellules traitées peut être comparé à celui de cellules primaires en absence de protéine de fusion par exemple par un test d'incorporation de thy idine tritiée ou par un test d'incorporation de BrdU connus de l'homme du métier. Les cellules peuvent être passées et les conditions conduisant à une absence de survenue de la sénescence seront ainsi déterminées. Ainsi les conditions optimales pour augmenter la capacité et la durée de prolifération de cultures primaires, au moyen d'une ou plusieurs protéines exogènes, peuvent être définies. Primary cultures, for example of cerebral endothelial cells or pigmented epithelial cells of the retina, are incubated in the presence of increasing concentrations of the fusion protein ranging from 0.1 μg / ml to 100 μg / ml; the culture medium can be changed daily. The proliferation index of the treated cells can be compared with that of primary cells in the absence of fusion protein, for example by a test for incorporation of tritiated thy idine or by a test for incorporation of BrdU known to those skilled in the art. . The cells can be passed and the conditions leading to an absence of the occurrence of senescence will thus be determined. Thus the optimal conditions for increasing the capacity and the duration of proliferation of primary cultures, by means of one or more exogenous proteins, can be defined.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de préparation de cellules immortalisées de manière conditionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de cellules avec une ou plusieurs protéines immortalisantes dans des conditions permettant la pénétration de la ou desdites protéines dans les cellules.1) Process for the preparation of cells immortalized conditionally, characterized in that it comprises bringing cells into contact with one or more immortalizing proteins under conditions allowing the penetration of the said protein (s) into the cells.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules primaires humaines ou non humaines.2) Method according to claim 1, characterized in that the cells are human or non-human primary cells.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules sont choisies parmi : les cellules pancréatiques β, les cellules souches neuroépithéliales, les cellules génitrices hématopoiétiques, les cellules épithéliales rétiniennes pigmentées, les cellules endothéliales, les cellules de l'épithélium de la rétine, les neurones et notamment les neurones photorécepteurs, les hépatocytes, les kératinocytes, les cellules issues d'îlots de Langerhans, les cellules musculaires lisses, les chondrocytes, les cellules de l'épiderme et du derme, les ostéoblastes, les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules associées aux tendons.3) Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the cells are chosen from: β pancreatic cells, neuroepithelial stem cells, hematopoietic genitor cells, pigmented retinal epithelial cells, endothelial cells, cells of the retinal epithelium, the neurons and in particular the photoreceptor neurons, hepatocytes, keratinocytes, cells from islets of Langerhans, smooth muscle cells, chondrocytes, cells of the epidermis and dermis, osteoblasts, astrocytes, oligodendrocytes, cells associated with tendons.
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules génétiquement modifiées en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés différente de l' immortalisation.4) Method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the cells are genetically modified cells for the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties different from immortalization.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend la culture des cellules dans un milieu contenant lesdites protéines immortalisantes. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la culture comprend plusieurs passages de culture des cellules dont tout ou partie desdits passages comprend l'addition de protéines immortalisantes.5) Method according to any one of the preceding claims, characterized in that it comprises culturing the cells in a medium containing said immortalizing proteins. 6) Method according to claim 5, characterized in that the culture comprises several passages of culture of the cells of which all or part of said passages comprises the addition of immortalizing proteins.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont choisies parmi : les produits des oncogènes celulaire et viraux comme notamment SV40Tag, ElA de l' adenovirus, E6, E7 de l'EBV, v-myc, c-myc, src, ras, bmi-1,7) Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the immortalizing proteins are chosen from: products of cellular and viral oncogenes such as in particular SV40Tag, ElA of adenovirus, E6, E7 of EBV, v- myc, c-myc, src, ras, bmi-1,
- les produits des gènes anti-sénescence comme notamment la telomerase,- anti-senescence gene products such as telomerase in particular,
- les produits des gènes anti-apoptotiques comme par exemple bcl2, FLIP, ou un mélange de ceux-ci.- the products of anti-apoptotic genes such as for example bcl2, FLIP, or a mixture of these.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont associées, conjuguées ou couplées par tout type de liaison à une substance ou motif chimique ou particule capables de permettre le transfert desdites protéines immortalisantes dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules.8) Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the immortalizing proteins are associated, conjugated or coupled by any type of bond to a chemical substance or motif or particle capable of allowing the transfer of said immortalizing proteins in the cytoplasm and / or the nucleus of the cells.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec des particules contenant ou comprenant à leur surface lesdites protéines immortalisantes.9) Method according to claim 8, characterized in that the cells are brought into contact with particles containing or comprising on their surface said immortalizing proteins.
10) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec des dendrimers sur lesquels les protéines immortalisantes sont adsorbëes .10) Method according to claim 8, characterized in that the cells are brought into contact with dendrimers on which the immortalizing proteins are adsorbed.
11) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les protéines immortalisantes sont mises en contact avec une substance vectrice associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison aux protéines 2θ" immortalisantes et permettant la pénétration desdites protéines immortalisantes dans les cellules.11) Method according to claim 8, characterized in that the immortalizing proteins are brought into contact with a vector substance associated, conjugated or coupled by any type of protein binding 2θ " immortalizing and allowing the penetration of said immortalizing proteins into cells.
12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la substance vectrice est choisie parmi : des virus inactivés, des protéines, polypep ides ou peptides de transport, des motifs chimiques.12) Process according to claim 11, characterized in that the vector substance is chosen from: inactivated viruses, proteins, polypepides or transport peptides, chemical motifs.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la substance vectrice est choisie parmi : la protéine VP22 du virus HSV-1, 1 ' homéodomaine du facteur du transcription Antennapédia ou la troisième hélice de 1 ' homéodomaine de cette protéine, le domaine de transduction protéique de la protéine TAT du VIH, la séquence de translocation de membrane K-FGF, ou encore certains anticorps murins ou humain, polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant l'ADN ou bien des peptides dérivés de ces anticorps, des motifs chimiques comme les poly- arginines, ou des séquences ou fragments dérivés de ceux-ci.13) Process according to claim 12, characterized in that the vector substance is chosen from: the protein VP22 of the HSV-1 virus, the homeodomain of the transcription factor Antennapedia or the third helix of the homeodomain of this protein, the domain for protein transduction of the TAT protein of HIV, the K-FGF membrane translocation sequence, or also certain murine or human, polyclonal or monoclonal antibodies recognizing DNA or peptides derived from these antibodies, chemical motifs such as poly - arginines, or sequences or fragments derived from these.
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la substance vectrice consiste en un peptide, un polypeptide ou une protéine et en ce que la protéine immortalisante est fusionnée à la substance vectrice.14) Method according to claim 13, characterized in that the vector substance consists of a peptide, a polypeptide or a protein and in that the immortalizing protein is fused to the vector substance.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules sont mises en contact avec un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules en vue de l'expression d'un gène permettant de modifier une ou plusieurs de leurs propriétés différente de l' immortalisation.15) Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cells are brought into contact with an expression vector for the transformation of said cells with a view to the expression of a gene making it possible to modify one or more of their properties different from immortalization.
16) Des cellules obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15. 17) Une protéine immortalisante associée, conjuguée ou couplée par tout type de liaison à une substance vectrice capable de permettre le transfert de ladite protéine immortalisante dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules et susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.16) Cells obtained by a method according to any one of claims 1 to 15. 17) An immortalizing protein associated, conjugated or coupled by any type of binding to a vector substance capable of allowing the transfer of said immortalizing protein in the cytoplasm and / or the cell nucleus and capable of being used in the process according to any one of claims 1 to 15.
18) Une protéine de fusion selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une protéine immortalisante et d'un peptide, polypeptide ou protéine de transport dans le cytoplasme et/ou le noyau de cellules.18) A fusion protein according to claim 17, characterized in that it consists of an immortalizing protein and a peptide, polypeptide or transport protein in the cytoplasm and / or the cell nucleus.
19) Une culture de cellules sur un milieu comprenant les éléments nécessaire à la culture desdites cellules et une ou plusieurs protéines immortalisantes.19) A cell culture on a medium comprising the elements necessary for the culture of said cells and one or more immortalizing proteins.
20) Une culture de cellule selon la revendication 19, caractérisé en ce que le milieu de culture contient un vecteur d'expression pour la transformation desdites cellules. 20) A cell culture according to claim 19, characterized in that the culture medium contains an expression vector for the transformation of said cells.
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