WO2001092476A2 - In vitro-gewebetestsystem - Google Patents

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WO2001092476A2
WO2001092476A2 PCT/EP2001/006072 EP0106072W WO0192476A2 WO 2001092476 A2 WO2001092476 A2 WO 2001092476A2 EP 0106072 W EP0106072 W EP 0106072W WO 0192476 A2 WO0192476 A2 WO 0192476A2
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Definitions

  • the invention relates to means and methods for the analysis and diagnosis of infections caused by pathogenic and / or parasitic microorganisms and / or; Diseases of the human or animal body, means and methods for analyzing and diagnosing degenerate human and animal cells, means and methods for analyzing and diagnosing genetically modified human and animal cells, and means and methods for examining and testing anti-infectives and pharmaceuticals against Tumors, in particular cytostatics, and three-dimensional animal in vitro organ and tissue models, in particular tissues susceptible to infection, such as the intestine, skin, cornea, trachea and mucous membranes.
  • Macroorganisms for example humans, can be infected by a large number of microorganisms, which include both prokaryotic organisms, such as bacteria, and eukaryotic organisms, such as fungi and protozoa, and also viruses in the broader sense. This can lead to very different consequences for an affected macroorganism. For example, infection by microorganisms can lead to the development of an infectious disease. Other microorganisms live in or on the host organism, which means that they live at the expense of theirs Host organism without seriously becoming ill. On the other hand, some viruses, especially oncogenic viruses, are known to be able to neoplastic transform human or animal cells in vivo, some being associated with the formation of degenerate cells and tumor pathogenesis.
  • the infection of a human or animal organism by a microorganism comprises several steps, such as the transfer of the microorganism to its host organism, the adherence (adhesion) of the microorganism to cells or tissues of the host organism, the penetration of the microorganism (invasion or penetration) into spe - specific cells or tissues of the host organism and the multiplication of the microorganism therein.
  • Infection is determined by the infectious properties, for example the transferability, contagiosity, adherence, penetration and reproductive ability, and the pathogenic properties of the microorganism.
  • the development and course of an infectious disease is also determined by the susceptibility and immunity of the infected host organism.
  • the mechanisms of an infection are very different.
  • the development and course of a tumor disease also depend on the susceptibility and immunity of the host organism concerned. It is known that viruses preferentially lead to the formation of neoplasias in immunocompetent organisms.
  • Anti-infectives used against infectious diseases that damage or kill microorganisms in the body of the affected organism are aimed at inhibiting the cell wall synthesis of the microorganism, disturbing the permeability of its cytoplasmic membrane, blocking its protein synthesis and / or suppressing its nucleic acid synthesis without, however, harming the host organism itself.
  • the actual causative agent, the oncogenic virus cannot currently be targeted, but the degenerated cell is destroyed or its growth is inhibited, for example by using cytostatic agents.
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore means and methods for analyzing and diagnosing infections caused by pathogenic or parasitic microorganisms in human or animal host organisms, means and methods for analyzing and diagnosing degenerate or genetically modified human or to develop animal cells and means and methods for examining and testing diagnostic and therapeutic agents, in particular anti-infectives and anti-tumor drugs, in particular cytostatics, which overcome the above-described disadvantages in the prior art and which are particularly suitable for To investigate the development of infection-causing interactions between pathogenic or parasitic microorganisms and their target organs or tissues and the cellular and / or viral mechanisms leading to tumor formation, and the development and testing of these mechanisms allow specific diagnostic and therapeutic agents, such as anti-infectives or cytostatics.
  • the invention solves the technical problem on which it is based by providing in vitro methods for differentiating and / or multiplying isolated animal and human cells, in the course of which three-dimensional animal or human in vitro organ or tissue models are produced.
  • in vitro methods for differentiating and / or multiplying isolated animal and human cells in the course of which three-dimensional animal or human in vitro organ or tissue models are produced.
  • primary cells or other cells from tissues or organs susceptible to infections such as the intestine, skin, cornea, trachea or mucous membranes, but also degenerate cells to be checked, in particular the organs and tissues mentioned above, or genetically modified cells to be checked , in particular the organs and tissues mentioned above, are used.
  • the present invention provides in vitro methods for cocultivating the differentiated and / or increased cells with pathogenic or parasitic microorganisms and in vitro methods for investigating the interaction of substances with the in vitro co - Cultured differentiated and / or propagated cells and microorganisms ready. These methods allow the analysis of infection processes and the provision of diagnostic and therapeutic agents useful in the field of infection medicine.
  • the results obtained with the organ test systems according to the invention can be more meaningful than the results determined with animal experiments and can ensure better transferability to humans.
  • the cells described above are cultivated according to the invention in a three-dimensional, gel-like, connective tissue-like biomatrix and can multiply there.
  • this biomatrix contains a framework of collagen constituted by a collagen solution, i.e. tissue-typical matrix proteins.
  • tissue-typical matrix proteins i.e. tissue-typical matrix proteins.
  • other cell types preferably other primary cells, can be applied to this cell-containing collagen gel.
  • the cells contained in the biomatrix and the other cell types applied to the biomatrix can undergo a differentiation into a multi-layered three-dimensional animal tissue or organ test model.
  • the in vitro organ or tissue test models according to the invention can be inoculated with a parasitic or pathogenic microorganism and, together with this, under suitable ones Conditions are cultivated.
  • the cocultivation of the animal in vitro tissue or organ test system according to the invention with a parasitic or pathogenic microorganism offers the possibility of studying both the infection process itself and the defense reaction of the corresponding organoid cell systems. For example, larger amounts of an infected cell material and the pathogen itself can be obtained.
  • the material obtained can then be further analyzed using conventional histological, biochemical, molecular biological or immunological methods, for example to determine morphological changes in infected cells, the release of specific substances by the pathogen, such as toxins or proteins relevant to resistance, or the release of specific substances by infested cells
  • pathogen such as toxins or proteins relevant to resistance
  • specific substances by infested cells To study cells, such as interleukins, more closely as a defense reaction or to create transcription and / or expression profiles, on the basis of which, for example, virulence factors can be identified as targets for the development of anti-infectives.
  • the above-mentioned procedure according to the invention preferably allows the screening and analysis of potential diagnostics, with the help of which, for example, the presence of symptoms of infection can be demonstrated.
  • the invention therefore also relates to methods for identifying diagnostic agents or analyzing their specificity, with a potential or testable diagnostic agent for its being included in the co-cultivation of the single- or multi-layered in vitro tissue or organ test systems according to the invention with infectious agents Ability to recognize infections or infection processes is tested.
  • the diagnostics to be tested can be added to the system according to the invention, it being possible to determine to what extent there is a correlation between the state of infection and the marking or detection by the diagnostics on the basis of morphological, physiological or other parameters.
  • the methods according to the invention and the agents used in them can be used to screen for potential active substances and to investigate properties such as specificities and interactions of active substances with target cells.
  • active substance means any substance, but also other agents, including physical parameters such as electromagnetic radiation, radioactivity, heat, sound or the like, which can influence or recognize biological cells or parts thereof, in particular cell organelles , Such active substances can be, in particular, of a chemical nature, for example diagnostic or therapeutic agents.
  • diagnostic agents are understood to mean any substances which can specifically recognize the presence of conditions, processes or substances or their absence and in particular can provide conclusions about disease states. Diagnostics often have recognizing and marking functions.
  • therapeutic agents is understood to mean in particular those substances which can be used either prophylactically or accompanying the disease in order to avoid, alleviate or eliminate disease states.
  • diseases also understood states such as unnatural states of mind, pregnancies, signs of aging, developmental disorders or the like.
  • therapeutic agents are also understood to mean those substances which have only or also cosmetic effects.
  • the methods according to the invention are also suitable for examining the mechanisms of tumor pathogenesis and / or for examining substances for their suitability as medicaments, for example against a specific tumor.
  • an in vitro organ or tissue test system constructed from degenerate cells, in particular the organs or tissues mentioned above, can be used to obtain larger amounts of a degenerate cell material.
  • the material obtained can then be further analyzed using conventional methods, for example histological, biochemical, molecular biological or immunological methods, in order, for example, to examine morphological changes in degenerate cells or the release of specific substances more precisely or to create transcription and / or expression profiles.
  • an in vitro organ or tissue test system constructed from degenerate cells can be co-cultivated with oncogenic viruses.
  • the propagation and / or The spread of oncogenic viruses in the cells of the in vitro test system in the presence and absence of specific substances that can inhibit specific functions of the virus are examined.
  • the methods according to the invention can also be used to check genetically modified cells, in particular the above-mentioned tissues and organs.
  • cells can be tested that have been genetically modified with a view to gene therapy to eliminate gene-related malfunctions or to restore normal gene functions in diseases of the above-mentioned organs.
  • a preferred embodiment of the invention comprises the cultivation of animal or human cells in a three-dimensional gel-like biomatrix to multiply these cells and to produce a three-dimensional animal or human in vitro organ or tissue test system.
  • the invention comprises the cultivation of human dermal fibroblasts in the biomatrix to produce a three-dimensional human in vitro skin equivalent consisting of dermis equivalent and epidermis equivalent.
  • the term “culturing cells” means maintaining the vital functions of cells, for example fibroblasts, in a suitable environment, preferably in vitro, for example with the addition and removal of metabolic educts and products, in particular also an increase in the cells.
  • dermal fibroblasts are understood to mean naturally occurring fibroblasts, particularly those found in the dermis, or genetically modified fibroblasts or their precursors. Fibroblasts are the precursors of dermal fibrocytes. The fibroblasts can be of animal or human origin.
  • the biomatrix provided for the cultivation of the fibroblasts contains the fibroblasts to be cultivated and a collagen scaffold newly constituted from a, preferably fresh, collagen solution at a concentration of preferably 3.5 to 4.5 mg collagen per ml biomatrix.
  • the collagen structure is obtained from a, preferably cell-free, acidic solution of collagen I, the protein concentration of the collagen solution preferably being 5 to 7 mg / ml.
  • the pH of the collagen solution is preferably 3.8.
  • the collagen solution is preferably at 4 ° C.
  • This mixture is gelled by raising the temperature to room temperature or 37 °. After the gels have gelled, fibronectin is added to the gels.
  • the function of fibronectin in vivo consists in binding to other macromolecules, for example collagen, and in attaching cells to neighboring cells.
  • the subsequent cultivation of the fibroblasts in the collagen gel is preferably carried out in submerged culture.
  • a “submerged culture” is understood to mean a method for culturing cells, the cells being covered with a nutrient solution.
  • the biomatrix containing fibroblasts is therefore covered with a layer of cell culture medium and incubated at 37 ° C.
  • keratinocytes are understood to mean cells of the epidermis that form keratinized squamous epithelium, or genetically modified keratinocytes or their precursors, which can be of animal or human origin.
  • the keratinocytes sown on the collagen gel are preferably as possible Pre-cultivated, undifferentiated keratinocyte stem cells from human biopsy tissue, ie cytokeratin 19- or integrin ßl-positive basal stem cells.
  • the keratinocytes are sown on the biomatrix in a cell culture medium, preferably in KBM medium (clonetics), which is 5% fetal
  • KBM medium human epidermal growth factor
  • hEGF human epidermal growth factor
  • BPE bovine pituitary gland extract
  • an “airlift culture” is understood to mean a culture in which the height of the nutrient medium level is matched exactly to the height of the biomatrix, while the keratinocytes or the cell layers formed by the keratinocytes lie above the nutrient medium level and not from the nutrient medium that is, the cultivation takes place at the boundary layer air-nutrient medium, whereby the cultures are supplied with nutrients from below.
  • a skin-typical, dermis equivalent and epidermis equivalent develops existing in vitro full skin model which can be used advantageously for the test methods according to the invention.
  • the invention therefore also relates to a skin-typical in vitro whole skin test model, in particular animal or human in vitro whole skin test model, which was produced by the method according to the invention and which comprises at least 2 to 4 proliferative, some differentiating and at least 4 to 5 horny cell layers, wherein the epidermis equivalent stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum and stratum corneu, and wherein between the dermis equivalent and the epidermis equivalent there is a functional basement membrane made of matrix proteins.
  • This model is ideal as a test system for the investigation of potential or actual active substances. such as therapeutics, diagnostics or for investigations into the course of infection processes.
  • Another particularly preferred embodiment of the invention comprises the cultivation of intestinal fibroblasts in the biomatrix for producing a three-dimensional human in vitro intestinal test system consisting of preferably Caco2 cells or also intestinal epithelial cells or other human cell lines.
  • intestinal fibroblasts are understood to mean naturally occurring fibroblasts, in particular intestinal tissue, or genetically modified fibroblasts or their precursors.
  • the intestinal fibroblasts can be of animal or human origin.
  • intestinal epithelial cells are understood to mean naturally occurring epithelial cells, in particular in the intestinal tissue, or genetically modified epithelial cells or their precursors.
  • the intestinal epithelial cells can be of animal or human origin.
  • the collagen solution is mixed in a volume ratio of 1: 1, preferably at 4 ° C., with a solution also referred to as a gel solution, containing a, preferably 2-fold, cell culture medium, buffer, preferably He pes buffer and serum, preferably 10% serum, and preferably 1.5 x 10 5 / ml intestinal fibroblasts, especially pre-cultivated intestinal fibroblasts, mixed and mixed well.
  • a gel solution with a concentration of x is present
  • the collagen solution is preferably mixed in a volume ratio (xl): 1 with the gel solution, where x is the concentration factor. This mixture is gelled by raising the temperature to room temperature or 37 °.
  • the subsequent cultivation of the intestinal fibroblasts in the collagen gel is preferably carried out in submerged culture.
  • the biomatrix containing fibroblasts is incubated at 37 ° C.
  • Intestinal epithelial cells are seeded onto the gel, preferably 1 to 3 days after incubation of the gels.
  • the intestinal epithelial cells sown on the collagen gel are preferably pre-cultivated, undifferentiated intestinal epithelial cells.
  • the intestinal epithelial cells are sown on the biomatrix in a cell culture medium, preferably in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Life Technologies, Cat. No. 41966 or 52100), the 10% FCS and glutamine (2 mM) and 1% non-essential amino acids (MEM, Life Technologies, Cat. No. 11140).
  • a further advantageous embodiment of the invention comprises the cocultivation of a three-dimensional in vitro organ or tissue test system produced according to the invention with a pathogenic or parasitic microorganism.
  • pathogenic or parasitic microorganisms are understood to mean both eukaryotic and prokaryotic microorganisms, such as bacteria, fungi, protozoa, vitoids, but also prions or viruses, which attack a macroorganism, in particular a human or animal organism, and which live in or on tissues of this organism and can lead to an infection of this organism, but need not necessarily lead to it.
  • the term “cocultivation” means a, preferably In vitro simultaneous maintenance of the vital functions of animal cells and microorganisms in the same environment suitable for both, for example with the addition and removal of metabolic products and products, in particular also a simultaneous multiplication of the cells and the microorganisms.
  • the human pathogenic fungus Candida albicans is cocultivated with the human in vitro skin test system produced in accordance with the invention in order to investigate the infection process of Candida on human skin tissue and with the human in vitro intestinal test system produced in accordance with the invention around the Infection process of Candida on human intestinal tissue to investigate.
  • the results achieved with Candida in particular the detailed description of the infection process, can also be transferred to other pathogens.
  • the present invention relates to the cocultivation of the human pathogenic microorganism Candida albicans with the human in vitro skin test system or the human in vitro intestinal test system in order to increase the first stage of the infection process, namely the adhesion of the pathogen to skin or intestinal cells investigate.
  • the adhesion of the pathogen is examined using the virulent Candida strain Sc5314 and the avirulent Candida strain Can34, which have already been investigated in a mouse-macrophage model (Lo et al., Cell, 90 (1997), 939- 949).
  • the in vitro skin test system or the in vitro intestinal test system is inoculated in submerged culture with about 10 3 pathogenic organisms in each case and cultivated with shaking.
  • aliquots are removed and plated on Petri dishes with the appropriate nutrient media, for example YPD full medium (Difco). After an appropriate incubation period, the number of colonies on the Petri dishes is determined.
  • the adhesion of the pathogens to the in vitro organ test systems can be determined on the basis of the comparison between the determined number of colonies and the originally inoculated number of pathogens. With the help of this method it could be shown that the virulent strain has the ability to probably has skin as well as intestinal cells, whereas only slight adhesion could be detected in the avirulent stem.
  • the present invention the co-cultivation of human pathogenic microorganism Candida albicans with the inventively produced human in vitro skin test system relates respectively to the inventively produced human in vitro intestinal test system to a further stage of the infection process, namely the penetration / Invasion of the pathogen into cells.
  • the organoid tissue test systems are co-cultivated in the airlift process with the avirulent and virulent pathogen strains described above.
  • the pathogen is preferably fixed at 10 3 / ml in 1% agar and agar pieces with a diameter of 4 mm are placed on the organoid tissue test systems for a maximum of 98 hours.
  • the penetration of the pathogen into the organoid structures is examined after 16 hours, 24 hours, 72 hours, 86 hours and 98 hours by means of histological methods on thin sections, using the PAS staining method (Mc Manaus, Romeis, 17th edition, page 393) , Using the histological sections, the invasion process of the virulent Candida strain down to the deeper layers of the connective tissue-like matrix can be documented.
  • the term “agent” is intended in particular to include chemical, biological or physical agents, such as light or heat, which can have a potential effect on living cells.
  • the studies on the action of anti-infectives have also been carried out with Candida there are two classes of substances, namely azoles and polyenes, which are preferably used as antifungals against systemic infections. Both classes of substances have disadvantages.
  • the polyenes have strong side effects and azoles develop more and more resistance (DiDomenico, Curr. Opin. Microbiol. , 2 (1999), 509-515; Georgopapadakou, Curr. Opin. Microbiol., 1 (1999), 547-557. For this reason, the targeted development of new antifungals is urgently required.
  • the method for examining the adhesion of Candida to the in vitro intestinal test system and the in vitro skin test system according to the invention is modified in such a way that the cocultivation approach contains an antifungal, in particular amphothericin B or fluconazole. With the help of this method it could be shown that both antifungals had no influence on the adhesion of the pathogen, but on its growth rates.
  • the method for examining the penetration / invasion of Candida on the in vitro intestinal test system and the in vitro skin test system is modified such that the cocultivation approach contains amphothericin B or fluconazole. With the help of this method it could be shown that the invasion of the virulent pathogen strain could only be prevented by a complete inhibition of growth, whereby new active substances were also tested according to the invention.
  • a particularly preferred embodiment of the invention comprises the analysis of degenerate cells.
  • the term “degenerate” encompasses all changes in a normal cell, for example cell polymorphism, anisocytosis, nuclear polymorphism, polychromasia, disturbed nuclear plasma relation and aneuploidy, which lead to an impaired differentiation or to a dedifferentiation and to a deregulated growth of the Cell and malignant tumors are particularly affected, and degenerate cells, particularly the organs or tissues mentioned above, are used to build an in vitro organ or tissue test system to recover large amounts of the degenerate cell material, using conventional methods , for example histological, biochemical, molecular biological or immunological methods, are further analyzed in order to investigate the release of specific substances and to create transcription and expression profiles.
  • the in vitro organ or tissue test system built up from degenerate cells is used for d he effect of drugs and of substances potentially suitable as drugs, in particular with regard to their ability to inhibit cell division.
  • patient-specific degenerate cells are used to establish an in vitro organ test system in order to investigate therapeutic options for the specific tumor disease of the patient.
  • the checking of genetically modified cells in particular the above-mentioned tissues and organs.
  • genetically modified cells encompasses all cells which have been manipulated with the aid of genetic engineering methods, whereby either foreign DNA has been introduced into the cell or the own DNA has been modified, for example by deletions, inversions and attachments.
  • it is provided to test genetically modified cells in vitro with a view to gene therapy of patient-specific diseases, in particular for their functionality, an in vitro organ test system being established using such genetically modified cells.
  • the invention also relates to a, preferably gel-like, biomatrix in which the aforementioned cultivation processes can be carried out, specifically a biomatrix with cells of a tissue type.
  • a biomatrix with cells of a tissue type can, as described above, be used to produce an in vitro organ or tissue test system.
  • a biomatrix is understood to mean a gel structure which contains collagen, cell culture medium, serum and buffer, for example Hepes buffer.
  • the collagen solution which is used for the preparation of the biomatrix is a solution which contains a high proportion of undenatured, native collagen in an acidic, aqueous medium, preferably with a pH of 3.8, for example in acetic acid. preferably in 0.1% acetic acid solution.
  • a high proportion of undenatured collagen means a proportion of the total collagen in solution of
  • no lyophilized collagen is used.
  • the collagen content of the solution is advantageously 3 mg collagen per ml solution to 8 mg collagen per ml solution, more preferably 5 mg collagen per ml solution to 7 mg collagen per ml solution, most preferably 6 mg collagen per ml solution.
  • collagen is preferably used, the strength after isolation, for example from rats tails in 0.1 "% acetic acid was incubated for three to fourteen days at 4 ° C under stirring and wherein non-dissolved collagen parts were removed by centrifugation.
  • Fetal calf serum (FCS) or human antologous serum is preferably used as the serum and, for example, Hepes buffer as the buffer.
  • the pH of the solution of cell culture medium, buffer and serum is 7.5 to 8.5, for example 7.6 to 8.2, in particular 7.8.
  • the biomatrix can contain further factors, for example growth factors, adhesive agents, antibiotics, selection agents and the like.
  • the invention therefore also relates to methods for producing a biomatrix containing cells, wherein in a first step fresh collagen, for example from rat tails, is produced by collagen fibers isolated from collagen-containing tissue being collected in buffer solution, disinfected superficially in alcohol and then washed in buffer solution and then in an acidic solution with a pH of 0.1 to 6.9, preferably 2.0 to 5.0, particularly preferably 3.0 to 4.0, in particular 3.3, for example a 0.1% solution Acetic acid solution to be transferred.
  • a first step fresh collagen, for example from rat tails, is produced by collagen fibers isolated from collagen-containing tissue being collected in buffer solution, disinfected superficially in alcohol and then washed in buffer solution and then in an acidic solution with a pH of 0.1 to 6.9, preferably 2.0 to 5.0, particularly preferably 3.0 to 4.0, in particular 3.3, for example a 0.1% solution Acetic acid solution to be transferred.
  • the collagen in the solution is stirred at 2 to 10 ° C, in particular 4 ° C, for a few days, for example 3 to 14 days, the undissolved collagen components are centrifuged off and a collagen solution with a collagen content of 3 mg / ml to 8 mg / ml at 2 to 10 ° C, for example 4 ° C. It is of course possible to temporarily store the solution in a frozen state, for example at -10 ° C to -80 ° C, in particular -20 ° C.
  • a solution also referred to as a gel solution, of preferably multi-fold (x-fold) concentrated cell culture medium, serum and buffer mixed with precultivated and centrifuged cells, preferably 1 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 5 cells per ml, preferably 1 , 5 x 10 5 cells per ml, can be used.
  • This solution or suspension with a pH of 7.5 to 8.5, preferably 7.6 to 8.2, in particular 7.8, is then, for example in a ratio of 1: 2, with the aforementioned collagen solution at 2 to 10 ° C, especially 4 ° C, mixed.
  • the mixing ratio (volume) of collagen solution to gel solution is preferably 1: 1, with a volume ratio of (x-1): 1 collagen solution to gel solution being preferred for x-fold concentrated gel solution.
  • the gel solution is then pipetted into culture vessels and, after gelling, overlaid with medium at 37 ° C.
  • the biomatrix is then cultivated for at least 2 days and then cells of other tissue types, for example also immune system cells, can be applied to it.
  • FIG. 1 shows a longitudinal section of the in vitro intestinal system produced according to the invention.
  • FIG. 2 shows a longitudinal section of the in vitro intestinal system produced according to the invention with adherent cells of the Candida albicans fungus (adhesion of a virulent strain).
  • FIG. 3 shows a longitudinal section of the in vitro intestinal system produced according to the invention with penetrated cells of the Candida albicans fungus (invasion of a virulent strain).
  • Tissue containing collagen such as rat tail tails
  • rat tail tails is used to prepare a collagen solution. All work is carried out under sterile conditions with sterile materials.
  • the rat tails are surface disinfected at -20 ° C with 70% alcohol.
  • the skin of the rat tails is pulled off and the individual collagen fibers are pulled out. If other starting tissues are used, existing cells can be gently removed by mechanical, enzymatic or chemical treatment.
  • the collagen fibers are collected in phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.2), surface disinfected in 70% alcohol for 10 min and then washed thoroughly with PBS.
  • the weight of the fibers is determined and the fibers are transferred to a 0.1% acetic acid solution (final concentration about 8 to 12 mg / ml).
  • PBS phosphate buffered saline
  • fibronectin 5 ⁇ g / ml
  • 1 ml of M199 medium is added to each well, the inserts being overlaid with the medium.
  • the fibroblasts contained in the gel are subjected to this submerged cultivation at 37 ° C. for about 1 to 2 days, the medium being exchanged for fresh medium after every 12 hours.
  • the medium in the wells of the microtiter plate and the gels is carefully sucked off. Then 'per well 500 ul KBM medium (clone tics) containing 5% FCS was added. The gels are coated with 50 ⁇ l fibronectin solution and incubated for 1 hour at 37 ° C. Then 100,000 keratinocytes per gel are sown in 50-100 ⁇ l of KBM medium containing 5% FCS and incubated at 37 ° C. for 1 to 2 hours.
  • the gels are transferred to a 6-well plate and 1.5 to 2 ml of KBM medium with a CaCl 2 content of 1.88 mM without hEGF and BPE are added to each well, the level of the medium being exactly at the level of the gel is adjusted, while the keratinocytes or the layers formed by keratinocytes are not covered by the medium. Airlift cultivation will continue for at least 12 to 14 days.
  • 7.5 ml of collagen solution are placed in a 50 l centrifuge tube and placed on ice.
  • Pre-cultivated fibroblasts are harvested and counted.
  • 1.2 x 10 6 fibroblasts are in 7.5 ml ice-cold gel solution taken up, well suspended and added to the collagen solution without air bubbles.
  • Collagen solution and gel solution with fibroblasts are mixed well.
  • 300 ⁇ l of the mixture are carefully poured into the recess of an insert.
  • the inserts are in a 24-well microtiter plate.
  • the mixture is gelled by incubation at 37 ° C. for two minutes. After the mixture has gelled, 1 ml of medium are placed on and next to each insert.
  • the fibroblasts contained in the gel are subjected to this submerged cultivation at 37 ° C. for about 1 to 3 days, the medium being exchanged for fresh medium after every 48 hours.
  • the medium in the wells of the microtiter plate and the gels is carefully sucked off. Then 200,000 epithelial cells are sown in 200 ⁇ l DMEM medium (compare above) containing 10% FCS per gel, about 600 ⁇ l medium are added to the inserts and cultured at 37 ° C. for 10 to 20 days. The medium is changed every 48 hours.
  • Example 3 An intestinal equivalent produced in this way is shown in FIG. 1.
  • Example 3 An intestinal equivalent produced in this way is shown in FIG. 1.
  • the penetration of the pathogen into the organoid structures is examined after about 18 to 24 hours by means of histological methods on thin sections, the PAS staining method being used both in the in vitro skin system and in the in vitro intestinal system.
  • the invasion process of the virulent Candida strain down to the deeper layers of the connective tissue-like matrix was documented using the histological sections (FIG. 3). It was shown that the virulent Candida strain spreads in a star shape from the infection site into the connective tissue, whereas the avirulent strain could not penetrate the epithelial cells and showed no adhesion.
  • Example 5 Example 5:
  • Example 6 Based on the comparison between the determined number of colonies of the samples without the addition of an antifungal agent and the number of colonies of samples with the addition of an antifungal agent, it was determined that the adhesion of the virulent Candida strain could only be prevented by adding amphotericin B and fluconazole and by inhibiting growth , Example 6:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von durch pathogene und/oder parasitäre Mikroorganismen hervorgerufenen menschlichen oder tierischen Infektionen, Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von entarteten oder gentechnisch veränderten menschlichen oder tierischen Zellen sowie Mittel und Verfahren zur Untersuchung und Testung von Antiinfektiva und Arzneimitteln gegen Tumore sowie dreidimensionale in vitro-Organ- und Gewebetestmodelle, insbesondere von für Infektionen anfälligen Geweben, wie Darm, Haut, Cornea, Trachea und Schleimhäuten.

Description

Infektionsmodelle
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von durch pathogene und/oder parasitäre Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionen und/oder ; Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers, Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von entarteten menschlichen und tierischen Zellen, Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von gentechnisch veränderten menschlichen und tierischen Zellen sowie Mittel und Verfah- ren zur Untersuchung und Testung von Antiinfektiva und Arzneimitteln gegen Tumore, insbesondere Cy- tostatika, sowie dreidimensionale tierische in vitro-Organ- und Gewebemodelle, insbesondere von für Infektionen anfälligen Geweben, wie Darm, Haut, Cornea, Trachea und Schleimhäuten.
Makroorganismen, beispielsweise der Mensch, können von einer Vielzahl von Mikroorganismen befallen werden, zu denen sowohl prokaryontische Organismen, wie Bakterien, als auch eukaryontische Organismen, wie Pilze und Protozoen, sowie im weiteren Sinne auch Viren zählen. Für einen betroffenen Makroorganismus kann dies zu sehr unterschiedlichen Konsequenzen führen. Beispielsweise kann eine Infektion durch Mikroorganismen zur Entstehung einer Infekti- onskrankheit führen. Andere Mikroorganismen führen in oder auf dem Wirtsorganismus eine parasitische Lebensweise, dass heißt, sie leben auf Kosten ihres Wirtsorganismus, ohne dass dieser jedoch ernsthaft erkrankt. Andererseits ist von einigen Viren, insbesondere onkogenen Viren, bekannt, dass sie in vivo menschliche oder tierische Zellen neoplastisch transformieren können, wobei einige mit der Entstehung entarteter Zellen und der Tumorpathogenese in Verbindung gebracht werden.
Die Infektion eines menschlichen oder tierischen Organismus durch einen Mikroorganismus umfasst meh- rere Schritte, wie die Übertragung des Mikroorganismus auf seinen Wirtsorganismus, das Haftenbleiben (Adhäsion) des Mikroorganismus an Zellen oder Geweben des Wirtsorganismus, das Eindringen des Mikroorganismus (Invasion oder Penetration) in spe- zifische Zellen oder Gewebe des Wirtsorganismus und die Vermehrung des Mikroorganismus darin. Eine Infektion wird von den infektiösen Eigenschaften, beispielsweise der Übertragbarkeit, der Kontagiosi- tät, der Haftfähigkeit, dem Eindringungsvermögen und der Vermehrungsfähigkeit, sowie den pathogenen Eigenschaften des Mikroorganismus bestimmt. Die Entstehung und der Verlauf einer Infektionskrankheit wird aber auch von der Empfänglichkeit und der Immunität des befallenen Wirtsorganismus bestimmt. In Abhängigkeit vom Mikroorganismus, beispielsweise ob es sich um einen prokaryontischen oder einen eu- karyontischen Organismus handelt, und in Abhängigkeit vom betroffenen Wirtsorganismus, beispielsweise welche Organe oder Gewebe befallen werden, sind die Mechanismen einer Infektion sehr unterschiedlich. Auch die Entstehung und der Verlauf einer Tumorerkrankung hängen neben den Eigenschaften des Virus von der Empfänglichkeit und der Immunität des betroffenen Wirtsorganismus ab. So ist bekannt, dass Viren bevorzugt in immuninkompetenten Organismen zur Bildung von Neoplasien führen.
Dementsprechend unterschiedlich wirken auch die Arzneimittel, die zur Bekämpfung entweder von Infektionskrankheiten oder von Tumoren eingesetzt werden. Gegen Infektionskrankheiten eingesetzte An- tiinfektiva, die im Körper des befallenen Organismus Mikroorganismen schädigen oder abtöten, zielen auf eine Hemmung der Zellwandsynthese des Mikroorganismus, eine Störung der Permeabilität seiner Cy- toplasmamembran, eine Blockade seiner Proteinsynthese und/oder eine Unterdrückung seiner Nuclein- säuresynthese ab, ohne jedoch den Wirtsorganismus selbst zu schädigen. Bei durch onkogene Viren verursachten Krebsgeschwülsten hingegen kann der ei- gentliche Verursacher, das onkogene Virus, derzeit nicht gezielt bekämpft werden, sondern die entartete Zelle wird vernichtet oder in ihrem Wachstum gehemmt, beispielsweise unter Verwendung von Cytosta- tika.
Zur Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen zwischen einem menschlichen oder tierischen Wirt und einem Mikroorganismus, die zur Entstehung einer Infektionskrankheit führen, ebenso wie zur Analyse der zur Entstehung von entarteten tierischen Zellen führenden komplexen zellulären und/oder viralen Mechanismen sind in der Vergangenheit vorrangig Versuche an Tieren eingesetzt worden. Auch zur Ent- wicklung und Testung von Antiinfektiva oder Cy- tostatika wurden hauptsächlich Versuche an Tieren durchgeführt, beispielsweise im Rahmen vorklinischer Tests. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich an Tieren gewonnene Ergebnisse nur bedingt auf den Menschen übertragen lassen.
Mit der Entwicklung der Zellkulturtechniken wurden auch Versuche an zweidimensionalen in vitro- Zellsystemen durchgeführt, um Tierversuche zu er- ganzen oder abzulösen. Beispielsweise wurden an solchen Zellsystemen auch Untersuchungen mit dem humanpathogenen Pilz Candida albicans durchgeführt, der Candida-Mykosen beim Menschen verursacht und bei immunsupprimierten Patienten zu lebensbedrohli- chen Infektionen führen kann (Mitchell, Curr . Opin . Microbiol., 1 (1998), 687-692). Unter anderem wurde ein aus einer Zellart aufgebautes, aus einem Zell- monolayer bestehendes Epidermis-Modell zur Untersuchung der Adhäsion und Penetration von Candida ent- wickelt (Körting et al . , J. Infect., 36 (1998), 259-267; Zink et al . , Infect. Immun., 64 (1996), 5085-5091) .
Der Nachteil solcher zweidimensionalen in vitro- Zellsysteme besteht jedoch darin, dass keine Aussa- gen über einen weitergehenden Infektionsmechanismus oder den genauen Ablauf einer Tumorpathogenese getroffen werden können. Bedingt durch ihren Aufbau erlauben diese Systeme keine Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Zelltypen, wie dies zum Beispiel in vivo in vollständigen Organen der Fall ist. Außerdem enthalten diese Systeme keine binde- gewebsähnliche Matrix, sondern sind auf syntheti- sehen Membranen aufgebaut. Dadurch bedingt, erlauben es diese Systeme beispielsweise im Falle einer Infektionskrankheit nicht, die komplexen Wechselwirkungen zwischen einem Pathogen, den die Organe oder Gewebe aufbauenden Zelltypen und der festen Bindegewebsmatrix genauer zu analysieren. Solche Systeme lassen sich daher auch nur in sehr beschränkten Maße zur Entwicklung und Testung von An- tiinfektiva und Cytostatika verwenden.
Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht also darin, Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von durch pathogene oder parasitäre Mikroorganismen bei menschlichen oder tierischen Wirtsorganismen hervorgerufe- nen Infektionen, Mittel und Verfahren zur Analyse und Diagnose von entarteten oder gentechnisch veränderten menschlichen oder tierischen Zellen sowie Mittel und Verfahren zur Untersuchung und Testung von Diagnostika und Therapeutika, insbesondere An- tiinfektiva und Arzneimittel gegen Tu ore, insbesondere Cytostatika, zu entwickeln, die die vorstehend beschriebenen Nachteile im Stand der Technik überwinden und die sich insbesondere dazu eignen, die zur Entstehung von Infektionen führenden Wech- selwirkungen zwischen pathogenen oder parasitären Mikroorganismen und deren Zielorganen oder -geweben und die zur Tumorbildung führenden zellulären und/oder viralen Mechanismen zu untersuchen, und die auf Grund dessen die Entwicklung und Testung spezifischer Diagnostika und Therapeutika, wie An- tiinfektiva oder Cytostatika, erlauben. Die Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung von in vitro-Verfahren zur Differenzierung und/oder Vermehrung isolierter tierischer und humaner Zellen, im Verlaufe derer dreidimensionale tierische oder humane in vitro-Organ- oder Gewebemodelle hergestellt werden. Dafür können erfindungsgemäß insbesondere Primärzellen oder andere Zellen aus für Infektionen anfälligen Geweben oder Organen, wie Darm, Haut, Cornea, Trachea oder Schleimhäuten, a- ber auch zu überprüfende entartete Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Organe und Gewebe, oder zu überprüfende gentechnisch veränderte Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Organe und Gewebe, eingesetzt werden. Darauf aufbauend und die vorgenannten Verfahren nutzend stellt die vorliegende Erfindung in vitro-Verfahren zur Cokulti- vierung der differenzierten und/oder vermehrten Zellen mit pathogenen oder parasitären Mikroorga- nis en und in vitro-Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung von Substanzen mit den in vitro co- kultivierten differenzierten und/oder vermehrten Zellen und Mikroorganismen bereit. Diese Verfahren erlauben die Analyse von Infektionsabläufen sowie die Bereitstellung von im Bereich der Infektionsmedizin nützlichen Diagnostika und Therapeutika.
Die mit den erfindungsgemäßen Organ-Testsystemen erzielten Ergebnissen können aussagekräftiger als die mit Tierversuchen ermittelten Ergebnisse sein und eine bessere Übertragbarkeit auf den Menschen gewährleisten. Die vorstehend beschriebenen Zellen werden erfindungsgemäß in einer dreidimensionalen, gelartigen, bindegewebsähnlichen Biomatrix kultiviert und können sich dort vermehren. Diese Biomatrix enthält neben den zu kultivierenden Zellen ein aus einer Kollagenlösung konstituiertes Gerüst aus Kollagen, also gewebetypische Matrixproteine. Je nach gewünschtem Gewebetyp können andere Zelltypen, vorzugsweise andere Primärzellen, auf diesem zellhal- tigen Kollagengel ausgebracht werden. Unter Verwendung spezifischer Kulturbedingungen und spezifischer Kulturmedien können die in der Biomatrix enthaltenen Zellen und die auf die Biomatrix aufgebrachten anderen Zelltypen eine Differenzierung zu einem mehrschichtigen dreidimensionalen tierischen Gewebe- oder Organtestmodell durchlaufen.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren werden somit dreidimensionale tierische oder humane Gewebe- oder Organtestmodelle erhalten, die aus mehre- ren gewebetypischen Zellschichten bestehen und sowohl histologisch als auch funktioneil weitgehend den nativen Organen oder Geweben entsprechen. Diese Organ-oder Gewebetestmodelle sind daher wesentlich besser zur naturgetreuen Modellierung von Infekti- onsverläufen bei Tieren und beim Menschen geeignet als die nur aus einer Zellart aufgebauten üblichen in vitro-Systeme und können somit zur gezielten A- nalyse der Infektions- und Resistenzmechanismen von Bakterien, Pilzen, Viren und Protozoen verwendet werden. So können erfindungsgemäß die erfindungsgemäßen in vitro-Organ- oder Gewebetestmodelle mit einem parasitären oder pathogenen Mikroorganismus beimpft und mit diesem gemeinsam unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Durch Verwendung unterschiedlicher Primärzellen aus verschiedenen Organen zum Aufbau der tierischen in vitro-Organ- o- der Gewebetestsysteme lässt sich somit das auch das Verhalten eines Erregers an verschiedenen Gewebesystemen studieren.
Die erfindungsgemäße Cokultivierung des erfindungsgemäßen tierischen in vitro-Gewebe- oder Organtestsystems mit einem parasitären oder pathogenen Mik- roorganismus bietet die Möglichkeit, sowohl den In- fektionsprozess selbst als auch die Abwehrreaktion der entsprechenden organoiden Zellsystemen zu studieren. Beispielsweise können größere Mengen eines infizierten Zellmaterials und des Pathogens selbst gewonnen werden. Das gewonnene Material kann dann mit herkömmlichen histologischen, biochemischen, molekularbiologischen oder immunologischen Verfahren weiter analysiert werden, um beispielsweise morphologische Änderungen infizierter Zellen, die Ausschüttung spezifischer Stoffe durch das Pathogen, wie Toxine oder für auftretende Resistenzen relevante Proteine, oder die Ausschüttung spezifischer Stoffe durch befallene Zellen, wie Interleu- kine, als Abwehrreaktion genauer zu studieren oder um Transkriptions- und/oder Expressionsprofile zu erstellen, auf deren Basis sich beispielsweise Virulenzfaktoren als Targets für die Entwicklung von Antiinfektiva identifizieren lassen.
Die vorstehend genannte erfindungsgemäße Verfah- rensweise erlaubt in bevorzugter Weise das Screenen und die Analyse von potentiellen Diagnostika, mit deren Hilfe zum Beispiel das Vorhandensein bestimm- ter Symptome einer Infektionnachgewiesen werden kann. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Identifizierung von Diagnostika oder der Analyse deren Spezifität, wobei im Rahmen der erfin- dungsgemäß vorgesehenen Cokultivierung der erfindungsgemäßen ein- oder mehrschichtigen in vitro Gewebe- oder Organtestsysteme mit infektiösen Agenzien ein potentielles oder zu testendes Diagnosti- kum auf seine Fähigkeit, Infektionen oder Infekti- onsprozesse zu erkennen, getestet wird. Im Rahmen dieser Verfahren können die zu testenden Diagnostika dem erfindungsgemäßen System hinzugegeben werden, wobei anhand morphologischer, physiologischer oder sonstiger Parameter festgestellt werden kann, inwieweit eine Korrelation zwischen dem Infektionszustand und der Markierung beziehungsweise dem Nachweis durch das Diagnostikum vorliegt.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen tierischen und menschlichen in vitro-Gewebe- oder Organtestsysteme und des erfindungsgemäßen Cokultivierungsverfahrens können insbesondere die Wirksamkeit beziehungsweise der Wirkmechanismus und/oder die Nebenwirkungen von Therapeutika, wie Antiinfektiva, wesentlich genauer analysiert werden als bei herkömmlichen Testsyste- men, beispielsweise anhand ihrer Wirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel, die Proliferation, die Differenzierung und die Reorganisation der Zellen eines in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems. Diese Tests von Wirkstoffen, Therapeutika und Di- agnostika ebenso wie von Interaktionen zwischen infektiösem Agens und kultivierten Zellen an den erfindungsgemäßen tierischen oder menschlichen in vitro-Gewebetestsystemen können sowohl herkömmliche morphologische oder histologische Verfahren als auch herkömmliche biochemische, toxikologische, immunologische und/oder molekularbiologische Verfahren umfassen.
Erfindungsgemäß können die erfindungsgemäßen Verfahren und die in ihnen eingesetzten Mittel, also die ein- und mehrschichtigen in vitro Gewebe- oder Organsysteme zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen und zum Untersuchen der Eigenschaften wie Spezifitäten sowie von Interaktionen von Wirkstoffen mit Zielzellen eingesetzt werden. Erfindungsgemäß wird unter dem Begriff Wirkstoff jedweder Stoff, aber auch andere Agenzien, unter anderem auch physikalische Einflussgrößen wie elektromagne- tische Strahlen, Radioaktivität, Wärme, Schall oder ähnliches verstanden, welche biologische Zellen o- der Teile davon, insbesondere Zellorganellen, beeinflussen oder erkennen können. Derartige Wirkstoffe können insbesondere chemischer Natur sein, zum Beispiel Diagnostika oder Therapeutika. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Diagnostika jedwede Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Abwesen- heit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheitszustände geben können. Diagnostika weisen häufig erkennende und markierende Funktionen auf. Unter dem Begriff Therapeutika werden insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder pro- phylaktisch oder krankheitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krankheitszustände zu vermeiden, zu lindern oder zu beseitigen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Krankheiten auch Zustände wie unnatürliche Gemütszustände, Schwangerschaften, Alterserscheinungen, Entwicklungsstörungen oder ähnliches verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Therapeutika auch solche Stoffe verstanden, die ausschließlich oder auch kosmetische Wirkungen aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch zur Untersuchung der Mechanismen der Tumorpathoge- nese und/oder zur Untersuchung von Substanzen auf ihre Eignung als Medikament, zum Beispiel gegen einen spezifischen Tumor. Beispielsweise lässt sich ein aus entarteten Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Organe oder Gewebe, aufgebautes in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem zur Gewinnung größerer Mengen eines entarteten Zellmaterials verwenden. Das gewonnene Material kann dann mit herkömmlichen Verfahren, beispielsweise histologi- schen, biochemischen, molekularbiologischen oder immunologischen Verfahren, weiter analysiert werden, um beispielsweise morphologische Änderungen entarteter Zellen oder die Ausschüttung spezifischer Stoffe genauer zu untersuchen oder um Transkriptions- und/oder Expressionsprofile zu erstellen. Ebenso kann an einem aus entarteten Zellen aufgebauten in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem die Wirkung von Arzneimitteln oder anderen Substanzen im Hinblick auf deren Fähigkeit zur Hemmung der Zellteilung studiert werden. Andererseits kann ein aus nicht-entarteten Primärzellen aufgebautes in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem mit onkogenen Viren cokultiviert werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann dann zum Beispiel die Vermehrung und/oder Verbreitung onkogener Viren in den Zellen des in- vitro-Testsystems in An- und Abwesenheit spezifischer Substanzen, die spezifische Funktionen des Virus hemmen können, untersucht werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich darüber hinaus auch zur Überprüfung gentechnisch veränderter Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Gewebe und Organe, verwenden. Beispielsweise können Zellen getestet werden, die im Hinblick auf eine Gentherapie zur Ausschaltung genbedingter Fehlfunktionen beziehungsweise Wiederherstellung normaler Genfunktionen bei Erkrankungen der vorstehend genannten Organe gentechnisch modifiziert wurden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um- fasst die Kultivierung tierischer oder humaner Zellen in einer dreidimensionalen gelartigen Biomatrix zur Vermehrung dieser Zellen und zur Herstellung eines dreidimensionalen tierischen oder humanen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform um- fasst die Erfindung die Kultivierung humaner dermaler Fibroblasten in der Biomatrix zur Herstellung eines aus Dermisäquivalent und Epidermisäquivalent bestehenden dreidimensionalen humanen in vitro- Hautäquivalentes .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Kultivieren von Zellen" ein, vorzugsweise in vitro stattfindendes, Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen, beispiels- weise Fibroblasten, in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwech- seledukten und -produkten, insbesondere auch eine Vermehrung der Zellen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dermalen Fibroblasten natürlicherweise vorkommende, insbesondere in der Dermis vorkommende Fibroblasten oder gentechnisch veränderte Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Fibroblasten stellen die Vorläufer dermaler Fibrocyten dar. Die Fibroblasten können tierischer oder menschlicher Herkunft sein.
Die zur Kultivierung der Fibroblasten vorgesehene Biomatrix enthält die zu kultivierenden Fibroblasten und ein aus einer, vorzugsweise frischen, Kollagenlösung neu konstituiertes Kollagen- gerüst einer Konzentration von vorzugsweise 3,5 bis 4,5 mg Kollagen pro ml Biomatrix. Das Kollagengerüst wird aus einer, vorzugsweise zellfreien, sauren Lösung von Kollagen I, gewonnen, wobei die Proteinkonzentration der Kollagenlösung vorzugsweise 5 bis 7 mg/ml beträgt. Der pH-Wert der Kollagenlösung beträgt vorzugsweise 3,8. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Fibroblasten-haltigen Biomatrix wird die Kollagenlösung vorzugsweise bei 4°C mit einer Lösung, enthaltend ein, vorzugsweise fünffach konzentriertes, Zellkulturmedium, Puffer, vorzugsweise Hepes-Puffer, Serum, vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS), und Chondroitin- (4/6) -sulfat , und vorzugsweise 1,5 x 10s/ml Fibroblasten, insbesondere vorkultivierten Fibroblasten, versetzt und gut gemischt. Dieses Gemisch wird durch Erhöhung der Temperatur auf Raumtemperatur oder 37° geliert. Nach dem Gelieren der Gele wird Fibronectin auf die Gele gegeben. Die Funktion von Fibronectin in vivo besteht in der Bindung an andere Makromoleküle, beispielsweise Kollagen, und in der Anheftung von Zellen an Nachbarzellen. Die anschließende Kultivierung der Fibroblasten im Kollagengel erfolgt vorzugsweise in Submers-Kultur. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Submers-Kultur" ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen verstanden, wobei die Zellen mit einer Nährlösung bedeckt sind. Die Fibroblasten enthaltende Biomatrix wird also mit Zellkulturmedium überschichtet und bei 37 °C" inkubiert .
Ein bis drei Tage, vorzugsweise zwei Tage, nach der vorstehend beschriebenen Inkubation der Gele werden Keratinocyten auf das Gel ausgesät. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Keratinocyten" Zellen der Epidermis, die verhornendes Plattenepithel bilden, oder gentechnisch veränderte Keratinocyten oder deren Vorläufer verstanden, die tierischer oder menschlicher Herkunft sein können. Bei den auf das Kollagengel ausgesäten Keratinocyten handelt es sich vorzugsweise um möglichst vorkultivierte, undifferenzierte Keratinocyten- Stammzellen aus humanem Biopsiegewebe, das heisst Cytokeratin 19- beziehungsweise Integrin ßl- positive basale Stammzellen. Die Aussaat der Keratinocyten auf die Biomatrix erfolgt in einem Zellkulturmedium, vorzugsweise in KBM-Medium (Clone- tics), das 5% fötales Kälberserum enthält. Anschließend wird die Biomatrix mit KBM-Medium, ent- haltend humanen epidermalen Wachstumsfaktor (0,1 μg/500 ml Medium) (hEGF) , BPE (Rinderhypophysenextrakt) (15 mg Protein/500 ml Medium) und 0,8 mM CaCl2, überschichtet und einer 1 - bis 3-tägigen Submers-Kultivierung unterworfen. Eine vollständige Differenzierung der Keratinocytenschichten wird durch eine Airlift-Kultur mit 1,8 mM CaCl2 enthaltendem KBM-Medium ohne hEGF und BPE erreicht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Airlift-Kultur" eine Kultur verstanden, wobei die Höhe des Nährmedienspiegels genau auf die Höhe der Biomatrix abgestimmt ist, während die Keratinocyten oder die durch die Keratinocyten gebildeten Zellschichten über dem Nährmedienspiegel liegen und vom Nährmedium nicht bedeckt werden, das heisst die Kultivierung erfolgt an der Grenzschicht Luft-Nährmedium, wobei die Kulturen von unten mit Nährstoffen versorgt werden. Nach einer,, vorzugs- weise 12- bis 14-tägigen Airlift-Kultur entwickelt sich ein hauttypisches, aus Dermisäquivalent und Epidermisäquivalent bestehendes in vitro- Vollhautmodell, welches für die erfindungsgemäßen Testverfahren vorteilhaft eingesetzt werden kann.
Die Erfindung betrifft daher auch ein hauttypisches in vitro-Vollhauttestmodell, insbesondere tierisches oder humanes in vitro-Vollhauttestmodell, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde und das mindestens 2 bis 4 proliferative, ei- nige differenzierende und mindestens 4 bis 5 verhornte Zellschichten umfasst, wobei das Epidermisäquivalent Stratum basale, Stratum spinosum, Stra- tum granulosum und Stratum corneu umfasst und wobei zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epider- misäquivalent eine funktionsfähige Basalmembran aus Matrixproteinen enthalten ist. Dieses Modell eignet sich ausgezeichnet als Testsystem für die Untersuchung von potentiellen oder tatsächlichen Wirkstof- fen, wie Therapeutika, Diagnostika oder für Untersuchungen zum Ablauf von Infektionsprozessen.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Kultivierung von Darm- fibroblasten in der Biomatrix zur Herstellung eines aus bevorzugt Caco2-Zellen oder auch Darmepithelzellen oder anderer humaner Zelllinien bestehenden dreidimensionalen humanen in vitro-Darmtestsystems .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter Darmfibroblasten natürlicherweise vorkommende, insbesondere im Darmgewebe vorkommende Fibroblasten oder gentechnisch veränderte Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Die Darmfibroblasten können tierischer oder menschli- eher Herkunft sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Darmepithelzellen natürlicherweise vorkommende, insbesondere im Darmgewebe vorkommende Epithelzellen oder gentechnisch veränderte Epithel- zellen oder deren Vorläufer verstanden. Die Darmepithelzellen können tierischer oder menschlicher Herkunft sein.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Darm- fibroblasten-haltigen Biomatrix wird die Kollagen- lösung im Volumenverhältnis 1:1, vorzugsweise bei 4°C, mit einer auch als Gellösung bezeichneten Lösung, enthaltend ein, vorzugsweise 2-fach konzentriertes, Zellkulturmedium, Puffer, vorzugsweise He- pes-Puffer, und Serum, vorzugsweise 10 %iges Serum, und vorzugsweise 1,5 x 105/ml Darmfibroblasten, insbesondere vorkultivierten Darmfibroblasten, versetzt und gut gemischt. Liegt eine x-fach konzentrierte Gellösung vor, wird vorzugsweise die Kollagenlösung im Volumenverhältnis (x-l):l mit der Gel- lösung gemischt, wobei x der Konzentrationsfaktor ist. Dieses Gemisch wird durch Erhöhung der Temperatur auf Raumtemperatur oder 37° geliert. Die anschließende Kultivierung der Darmfibroblasten im Kollagengel erfolgt vorzugsweise in Submers-Kultur. Die Fibroblasten enthaltende Biomatrix wird bei 37°C inkubiert.
Vorzugsweise 1 bis 3 Tage nach der Inkubation der Gele werden Darmepithelzellen auf das Gel ausgesät.
Bei den auf das Kollagengel ausgesäten Darmepithel- zellen handelt es sich vorzugsweise um möglichst vorkultivierte, undifferenzierte Darmepithelzellen. Die Aussaat der Darmepithelzellen auf die Biomatrix erfolgt in einem Zellkulturmedium, vorzugsweise in DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Life Technologies, Cat. Nr. 41966 oder 52100), das 10 % FCS und Glutamin (2 mM) und 1 % nichtessentielle Aminosäuren (MEM, Life Technologies, Cat. Nr. 11140) enthält. Anschließend wird die Biomatrix mit DMEM-Medium, enthaltend 10 % FCS und Glutamin (2 mM) und 1 % nichtessentielle Aminosäuren, über- .schichtet und einer 10 bis 20-tägigen Submers- Kultivierung unterworfen, bis zu einer vollständigen Differenzierung der Epithelschicht oder Epithelschichten, die für die erfindungsgemäßen Test- verfahren vorteilhaft eingesetzt werden kann/können. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Cokultivierung eines erfindungsgemäß hergestellten dreidimensionalen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems mit einem pa- thogenen oder parasitären Mikroorganismus. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „pathogenen oder parasitären Mikroorganismen", hier auch als infektiöse Agenzien bezeichnet, sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Mik- roorganismen, wie Bakterien, Pilze, Protozoen, Vi- roide, aber auch Prionen oder Viren, verstanden, die einen Makroorganismus, insbesondere einen menschlichen oder tierischen Organismus, befallen und in oder auf Geweben dieses Organismus leben und zu einer Infektion dieses Organismus führen können, jedoch nicht notwendigerweise dazu führen müssen. Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet der Begriff "Cokultivierung" ein, vorzugsweise in vitro stattfindendes, gleichzeitiges Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von tierischen Zellen und Mikroorganismen in der gleichen, für beide geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und -produkten, insbesondere auch eine gleichzeitige Vermehrung der Zellen und der Mikroorganismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Cokultivierung des humanpathogenen Pilz Candida al- bicans mit dem erfindungsgemäß hergestellten humanen in vitro-Hauttestsystem, um den Infektionspro- zess von Candida an menschlichem Hautgewebe zu untersuchen, und mit dem erfindungsgemäß hergestellten humanen in vitro-Darmtestsystem, um den Infek- tionsprozess von Candida an menschlichem Darmgewebe zu untersuchen. Die mit Candida erzielten Ergebnisse, insbesondere die detaillierte Beschreibung des Infektionsprozesses kann auch auf andere Pathogene übertragen werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegenden Erfindung die Cokultivierung des humanpathogenen Mikroorganismus Candida albicans mit dem humanen in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise dem humanen in vitro- Darmtestsystem, um die erste Stufe des Infektionsprozesses, nämlich die Adhäsion des Pathogens an Haut- beziehungsweise Darmzellen, zu untersuchen. Die Adhäsion des Pathogens wird unter Verwendung des virulenten Candida-Stamms Sc5314 und des aviru- lenten Candida-Stamms Can34 untersucht, welche bereits in einem Maus-Makrophagen-Modell untersucht wurden (Lo et al . , Cell, 90 (1997), 939-949). Das in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise das in vitro-Darmtestsystem wird in Submers-Kultur mit je- weils etwa 103 pathogenen Organismen inokuliert und unter Schütteln kultiviert. Zu definierten Zeitpunkten, beispielsweise alle 30 Minuten (bis maximal 4 Stunden) werden Aliquots entnommen und auf Petrischalen mit den entsprechenden Nährböden, zum Beispiel YPD-Vollmedium (Difco) ausplattiert. Nach entsprechender Inkubationszeit wird die Anzahl der Kolonien auf den Petrischalen ermittelt. Aufgrund des Vergleichs zwischen der ermittelten Kolonienzahl und der ursprünglich inokulierten Zahl der Pa- thogene läßt sich die Adhäsion der Pathogene an den in vitro-Organtestsystemen bestimmen. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte so gezeigt werden, dass der virulente Stamm die Fähigkeit zur Adhäsion so- wohl an Haut- als auch an Darmzellen besitzt, während bei dem avirulenten Stamm- nur eine geringfügige Adhäsion nachgewiesen werden konnte.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform betrifft die vorliegenden Erfindung' die Cokultivierung des humanpathogenen Mikroorganismus Candida albicans mit dem erfindungsgemäß hergestellten humanen in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise mit dem erfindungsgemäß hergestellten humanen in vitro-Darmtestsystem, um eine weitere Stufe des Infektionsprozesses, nämlich die Penetration/Invasion des Pathogens in Zellen, zu untersuchen. Dazu werden die organoiden Gewebetestsysteme im Airlift-Verfahren mit den vorstehend beschriebe- nen avirulenten und virulenten Pathogen-Stämmen co- kultiviert. Das Pathogen wird bevorzugt bei einer Zellzahl von 103/ml in 1 %-igem Agar fixiert und Agarstücke mit einem Durchmesser von 4 mm werden auf die organoiden Gewebetestsysteme für maximal 98 Stunden aufgelegt. Das Eindringen des Pathogens in die organoiden Strukturen wird nach 16 Stunden, 24 Stunden, 72 Stunden, 86 Stunden und 98 Stunden mittels histologischer Verfahren an Dünnschnitten untersucht, wobei das Färbeverfahren PAS (Mc Manaus, Romeis, 17. Auflage, Seite 393) verwendet wird. Anhand der histologischen Schnitte kann so der Inva- sionsprozess des virulenten Candida-Stammes bis in tiefere Schichten der bindegewebsähnlichen Matrix dokumentiert werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, unter Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems und des erfindungsgemäßen Cokul- tivierungsverfahrens die Wirkung chemischer Substanzen, insbesondere von Antiinfektiva, oder von Agenzien auf den Infektionsprozess beziehungsweise das Wachstum eines pathogenen Mikroorganismus zu untersuchen. Im Zusammenhang mit der Erfindung soll der Begriff „Agens" insbesondere chemische, biologische oder physikalische Mittel, wie Licht oder Wärme, umfassen, die eine potentielle Wirkung auf lebende Zellen ausüben können. Die Untersuchungen zur Wirkung von Antiinfektiva wurden ebenfalls mit Candida durchgeführt. Zur Zeit existieren zwei Substanzklassen, nämlich Azole und Polyene, die bevorzugt als Antimykotika gegen systemische Infektionen eingesetzt werden. Beide Substanzklassen sind mit Nachteilen behaftet. Die Polyene weisen starke Nebenwirkungen auf und gegen Azole entwickeln sich mehr und mehr Resistenzen (DiDomenico, Curr . Opin. Microbiol., 2 (1999), 509-515; Georgopapadakou, Curr. Opin. Microbiol., 1 (1999), 547-557. Aus diesem Grund ist die gezielte Entwicklung neuer Antimykotika dringend erforderlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Untersuchung der Adhäsion von Candida an dem erfindungsgemäßen in vitro-Darmtestsystem und dem erfindungsgemäßen in vitro-Hauttestsystem dahingehend modifiziert, dass der Cokultivierungs- Ansatz ein Antimykotikum enthält, insbesondere Amphothericin B oder Fluconazol. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte so gezeigt werden, dass beide Antimykotika keinen Einfluß auf die Adhäsion des Pathogens, sondern auf dessen Wachstumsraten, hatten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Untersuchung der Penetration/Invasion von Candida an dem in vitro- Darmtestsystem und dem in vitro-Hauttestsystem da- hingehend modifiziert, dass der Cokultivierungs- Ansatz Amphothericin B oder Fluconazol enthält. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte so gezeigt werden, dass die Invasion des virulenten Pathogenstammes erst durch eine vollständige Wachstumshemmung un- terbunden werden konnte, wobei erfindungsgemäß auch neue Wirkstoffe getestet wurden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Analyse entarteter Zellen. Im Zusammenhang mit der Erfindung umfasst der Begriff „entartet" alle Veränderungen einer normalen Zelle, beispielsweise Zellpolymorphie, Anisozytose, Kern- polymorphie, Polychromasie, gestörte Kern-Plasmarelation und Aneuploidie, die zu einer gestörten Differenzierung oder zu einer Entdifferenzierung und zu einem deregulierten Wachstum der Zelle führen können, und betrifft insbesondere Zellen maligner Tumore . Aus entarteten Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Organe oder Gewebe, wird ein in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem aufgebaut, um größere Mengen des entarteten Zellmaterials zu gewinnen. Das gewonnene Material wird mit herkömmlichen Verfahren, beispielsweise histologischen, biochemischen, molekularbiologischen oder immunologischen Verfahren, weiter analysiert, um die Aus- schüttung spezifischer Stoffe zu untersuchen und Transkriptions- und Expressionsprofile zu erstellen. An dem aus entarteten Zellen aufgebauten in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem wird die Wirkung von Arzneimitteln und von potentiell als Arzneimittel geeigneten Substanzen, insbesondere im Hinblick auf deren Fähigkeit zur Hemmung der Zellteilung, untersucht .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden patientenspezifische entartete Zellen zur Etablierung eines in vitro- Organtestsystems verwendet, um Therapiemöglichkeiten für die spezielle Tumorerkrankung des Patienten zu untersuchen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Überprüfung gentechnisch veränderter Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Gewebe und Organe, vorgesehen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „gentechnisch veränderte Zellen" alle Zellen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren manipuliert wurden, wobei entweder Fremd-DNA in die Zelle eingeschleust wurde oder die eigene DNA, beispielsweise durch Deletionen, Inversionen und Anlagerungen, modifiziert wurde. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, im Hinblick auf eine Gentherapie patientenspezifischer Krankheiten gentechnisch veränderte Zellen in vitro zu testen, insbesondere auf deren Funktionalität, wobei ein in vitro-Organtestsystem unter Verwendung solcher gentechnisch veränderter Zellen etabliert wird.
Die Erfindung betrifft auch eine, vorzugsweise gelartige, Biomatrix, in der die vorgenannten Kulti- vierungsverfahren durchgeführt werden können, und zwar eine Biomatrix mit Zellen eines Gewebetyps. Die erfindungsgemäß vorgesehene Kombination aus Biomatrix und darin kultivierten Zellen kann, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung eines in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems verwendet wer- den .
Unter einer Biomatrix wird eine Gelstruktur verstanden, die Kollagen, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, beispielsweise Hepes-Puffer, enthält. Die Kollagenlösung, die für die Herstellung der Biomat- rix verwendet wird, ist eine Lösung, die einen hohen Anteil an nicht denaturiertem, nativem Kollagen in saurem, wässrigem Medium enthält, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 3,8, beispielsweise in Essigsäure, bevorzugt in 0,1 %iger Essigsäurelösung. Ein hoher Anteil von nicht denaturiertem Kollagen bedeutet einen Anteil am Gesamtkollagen in Lösung von
> 50%, insbesondere > 60%, > 70%, > 80%,- > 90% oder
> 95 %, vorzugsweise > 99%. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei kein lyophilisiertes Kollagen verwendet. Der Kollagengehalt der Lösung beträgt vorteilhafterweise 3 mg Kollagen pro ml Lösung bis 8 mg Kollagen pro ml Lösung, bevorzugter 5 mg Kollagen pro ml Lösung bis 7 mg Kollagen pro ml Lösung, am bevorzugtesten 6 mg Kollagen pro ml Lö- sung. Vorzugsweise wird dabei Kollagen verwendet, das nach Isolierung, beispielsweise aus Rattenschwänzen, in 0,1" %iger Essigsäure drei bis vierzehn Tage bei 4°C unter Rühren inkubiert wurde und wobei nicht gelöste Kollagenanteile abzentrifugiert wurden. Bevorzugte Zellkulturmedien sind DMEM (Dul- becco's Modified Eagle Medium) und M199. Jedoch kann auch jedes andere beliebige Zellkulturmedium verwendet werden, welches die Kultivierung von Zel- len ermöglicht. Als Serum wird vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS) oder humanes antologes Serum verwendet und als Puffer zum Beispiel Hepes-Puffer . Der pH-Wert der Lösung aus Zellkulturmedium, Puffer und Serum beträgt in bevorzugter Ausführung 7,5 bis 8,5, beispielsweise 7,6 bis 8,2, insbesondere 7,8. Selbstverständlich kann die Biomatrix weitere Faktoren, beispielsweise Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmittel, Antibiotika, Selektionsmittel und ähnliche enthalten.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung einer Zellen enthaltenden Biomatrix, wobei in einem ersten Schritt frisches Kollagen, beispielsweise aus Rattenschwänzen, hergestellt wird, indem aus kollagenhaltigem Gewebe isolierte Kollagenfasern in Pufferlösung gesammelt, in Alkohol oberflächlich desinfiziert und anschließend in Pufferlösung gewaschen und anschließend in eine saure Lösung eines pH-Wertes von 0,1 bis 6,9, vor- zugsweise 2,0 bis 5,0, besonders bevorzugt 3,0 bis 4,0, insbesondere 3,3, zum Beispiel eine 0,1 %ige Essigsäurelösung, überführt werden. Anschließend wird in einem weiteren Schritt das in der Lösung befindliche Kollagen bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, für einige Tage, zum Beispiel 3 bis 14 Tage, gerührt, die nicht gelösten Kollagenanteile werden abzentrifugiert und eine Kollagenlösung mit einem Kollagengehalt von 3 mg/ml bis 8 mg/ml bei 2 bis 10°C, zum Beispiel 4°C, aufbewahrt. Selbstverständ- lieh ist es möglich, die Lösung in gefrorenem Zustand zwischenzulagern, zum Beispiel bei -10°C bis -80°C, insbesondere -20°C. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zellen enthaltenden Biomatrix wird in einem dritten Schritt eine auch als Gellösung bezeichnete Lösung aus, vorzugsweise mehrfach (x- fach) konzentriertem, Zellkulturmedium, Serum und Puffer mit vorkultivierten und abzentrifugierten Zellen gemischt, wobei vorzugsweise 1 x 105 bis 2 x 105 Zellen pro ml, bevorzugt 1,5 x 105 Zellen pro ml, verwendet werden. Diese Lösung beziehungsweise Suspension eines pH-Wertes von 7,5 bis 8,5, bevorzugt 7,6 bis 8,2, insbesondere 7,8, wird anschlie- ßend, beispielsweise im Verhältnis 1:2, mit der vorgenannten Kollagenlösung bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, gemischt. Das Mischungsverhältnis (Volumen) von Kollagenlösung zu Gellösung (Puffer, Serum, Zellen, Kulturmedium) beträgt vorzugsweise 1:1, wobei bei x-fach konzentrierter Gellösung ein Volumenverhältnis von (x-1) :1 Kollagenlösung zu Gellösung bevorzugt wird. Anschließend wird die Gellösung in Kulturgefäße pipettiert und nach Gelieren bei 37 °C mit Medium überschichtet. Sodann wird die Biomatrix mindestens 2 Tage kultiviert und anschließend können Zellen anderer Gewebetypen zum Beispiel auch Immunsystemzellen darauf ausgebracht werden.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.
Figur 1 zeigt einen Längsschnitt des erfindungsgemäß hergestellten in vitro-Darmsystems . Figur 2 zeigt einen Längsschnitt des erfindungsgemäß hergestellten in vitro-Darmsystems mit anhaftenden Zellen des Pilzes Candida albicans (Adhäsion eines virulenten Stammes).
Figur 3 zeigt einen Längsschnitt des erfindungsgemäß hergestellten in vitro-Darmsystems mit penet- rierten Zellen des Pilzes Candida albicans (Invasion eines virulenten Stammes) .
Beispiel 1:
Herstellung eines dreidimensionalen humanen in vitro-Hauttestsystems
Herstellung einer Gellösung
20 Teile fünffach konzentriertes M 199-Zellkultur- medium (Life Technologies, 1999, Kat.Nr. 42966 oder
52100; DMEM) , 10 Teile HEPES-Puffer (4,76 g in 100 ml PBS-Lösung, pH-Wert 7,3) und 1 Teil Chondroitin-
(4, 6) -sulfat (5 mg/ml in PBS) werden gemischt und der pH-Wert des Gemisches wird auf 7,8 eingestellt. Das Gemisch wird sterilfiltriert und anschließend mit 10 Teilen fötalem Kälberserum versetzt.
Herstellung einer Kollagenlösung
Zur Herstellung einer Kollagenlösung wird kollagen- haltiges Gewebe, wie zum Beispiel Sehnen aus Rat- tenschwänzen, verwendet. Alle Arbeiten werden unter sterilen Bedingungen mit sterilen Materialien durchgeführt. Die Rattenschwänze werden nach Lage- rung bei -20°C mit 70%-igem Alkohol oberflächlich desinfiziert. Die Haut der Rattenschwänze wird abgezogen und die einzelnen Kollagenfasern werden herausgezogen. Bei Verwendung anderer Ausgangsgewebe können gegebenenfalls vorhandene Zellen schonend durch mechanische, enzymatische oder chemische Behandlung entfernt werden. Die Kollagenfasern werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) gesammelt, in 70%-igem Alkohol 10 min ober- flächlich desinfiziert und anschließend gründlich mit PBS gewaschen. Das Gewicht der Fasern wird bestimmt und die Fasern werden in eine 0,1%-ige Essigsäurelösung überführt (Endkonzentration etwa 8 bis 12 mg/ml) . Dieser Ansatz wird etwa 3 bis 14 Ta- ge bei 4°C gerührt • und anschließend werden die nicht gelösten Kollagenteile mittels Zentrifugation (1000 Upm, 1 Stund, 8°C) entfernt. Dadurch liegt das Kollagen in Lösung und nicht in Faser-, Gerüstoder Matrixform vor.
Herstellung der dermale Fibroblasten enthaltenden Kollagengele (Ansatz für 24 Inserts)
16 ml Kollagenlösung werden in ein 50 ml- Zentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gestellt. Vorkultivierte dermale- Fibroblasten werden geernet und ausgezählt. 1,2 x 106 Fibroblasten werden in 8 ml eiskalte Gellösung aufgenommen, gut suspendiert und luftblasenfrei in die Kollagenlösung gegeben. Gellösung und Fibroblasten werden gut gemischt. Jeweils 600 μl des Gemisches werden vorsichtig in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen (Durchmesser je Vertiefung 10 mm) gegossen. Durch eine zweiminütige Inkubation bei 37°C erfolgt - 2Q -
eine Gelierung des Gemisches. Nach dem Gelieren des Gemisches werden jeweils 50 μl Fibronectin (5 μg/ml) auf jedes Insert gegeben. Nach einer 10- minütigen Inkubation bei 37°C beziehungsweise einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird pro Vertiefung 1 ml M199-Medium zugegeben, wobei die Inserts mit dem Medium überschichtet werden. Die im Gel enthaltenen Fibroblasten werden etwa 1 bis 2 Tage dieser Submers-Kultivierung bei 37°C unterwor- fen, wobei jeweils nach 12 Stunden das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht wird.
Aussaat der Keratinocyten und Kultivierung des in vitro-HauttestSystems
Vor der Aussaat der Keratinocyten wird zunächst vorsichtig das Medium in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte und von den Gelen abgesaugt. Dann 'werden pro Vertiefung 500 μl KBM-Medium (Clone- tics), enthaltend 5% FCS, zugegeben. Die Gele werden mit jeweils 50 μl Fibronectin-Lösung beschich- tet und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dann werden pro Gel 100.000 Keratinocyten in 50-100 μl KBM- Medium, enthaltend 5% FCS, ausgesät und 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 500 μl KBM-Medium, enthaltend 5% FCS, 8 mM CaCl2, hEGF (0,1 μg/500 ml Medium) und BPE (15 mg/500 ml Medium) , zugegeben und die Gele werden 1 bis 3 Tage einer Submers-Kultivierung unterworfen, wobei das Medium täglich gegen frisches Medium ausgetauscht wird. Danach werden die Gele weitere 2 bis 3 Tage in jeweils 1 bis 1,5 ml KBM-Medium, enthaltend enthaltend 2% FCS, 8 mM CaCl2, hEGF (0,1 μg/500 ml Medium) und BPE (15 mg/500 ml Medium), einer Submers- Kultivierung unterworfen. Danach werden die Gele mit dem sich entwickelnden Hautäquivalent einer Airlift-Kultivierung unterworfen. Dazu werden die Gele in eine Platte mit 6 Vertiefungen umgesetzt und pro Vertiefung werden 1,5 bis 2 ml KBM-Medium mit einem CaCl2-Gehalt von 1,88 mM ohne hEGF und BPE zugegeben, wobei der Spiegel des Mediums genau auf die Höhe des Gels abgestimmt wird, während' die Keratinocyten oder die durch Keratinocyten gebilde- ten Schichten nicht vom Medium bedeckt werden. Die Airlift-Kultivierung wird mindestens 12 bis 14 Tge fortgeführt.
Beispiel 2:
Herstellung eines dreidimensionalen humanen in vitro-Darmtestsystems
Herstellung einer Gellösung
77,5 Teile 2-fach konzentriertes DMEM- Zellkulturmedium (Life Technologies, Kat . Nr. 41966 oder 52100, 1999), 20 Teile FCS, 2,5 Teile HEPES- Puffer (71,49 g in 100 ml PBS-Lösung, pH-Wert 7,8) werden gemischt und der pH-Wert des Gemisches wird auf 7,4 eingestellt. Das Gemisch wird sterilfiltriert .
Herstellung der Fibroblasten enthaltenden Kollagen- gele (Ansatz für 24 Inserts)
7,5 ml Kollagenlösung werden in ein 50 l- Zentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gestellt. Vorkultivierte Fibroblasten werden geernet und ausgezählt. 1,2 x 106 Fibroblasten werden in 7,5 ml eiskalte Gellösung aufgenommen, gut suspendiert und luftblasenfrei in die Kollagenlösung gegeben. Kollagenlösung und Gellösung mit Fibroblasten werden gut gemischt. Jeweils 300 μl des Gemisches werden vorsichtig in die Vertiefung eines Inserts gegossen. Die Inserts befinden sich in einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen. Durch eine zweiminütige Inkubation bei 37°C erfolgt eine Gelierung des Gemisches. Nach dem Gelieren des Gemisches werden jeweils 1 ml Medium auf und neben rjedes Insert gegeben. Die im Gel enthaltenen Fibroblasten werden etwa 1 bis 3 Tage dieser Submers-Kultivierung bei 37°C unterworfen, wobei jeweils nach 48 Stunden das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht wird.
Aussaat der Darmepithelzellen und Kultivierung der Darmäquivalente
Vor der Aussaat der Caco2-Zellen wird zunächst vorsichtig das Medium in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte und von den Gelen abgesaugt. Dann werden pro Gel 200.000 Epithelzellen in 200 μl DMEM-Medium (vergleiche vorstehend), enthaltend 10% FCS, ausgesät, neben die Inserts ca. 600 μl Medium gegeben und 10 bis 20 Tage bei 37°C kultiviert. Der Mediumswechsel erfolgt alle 48 Stunden.
Ein so hergestelltes Darmäquivalent ist in Figur 1 gezeigt . Beispiel 3 :
Cokultivierung von Candida albicans mit dem in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise dem im vitro- Darmtestsystem zur Bestimmung der Adhäsion des Pathogens an Zellen
Zur Bestimmung der Adhäsion des Pathogens an Zellen wurden jeweils 12 in Submers-Kultur gehaltene Inserts des humanen in vitro-Hautsystems beziehungsweise jeweils 12 in Submers-Kultur gehaltene In- serts des in vitro-Darmsystem mit jeweils 103 pathogenen Organismen des virulenten Candida-Stamms Sc5314 oder des avirulenten Candida-Stamms Can34 infiziert (Lo et al . , Cell 90 (1997), 937-949). Anschließend wurden die Inserts unter Schütteln bei 37°C 30, 60, 90, 120, 150 oder 180 min inkubiert.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde der Überstand entnommen und auf Petrischalen mit YPD-Nährböden ausplattiert. Nach einer Inkubationszeit von 2 Tagen wurden die Kolonien auf den Petrischalen ausge- zählt. Aufgrund des Vergleichs zwischen der ermittelten Kolonienzahl und der ursprünglich inokulierten Zahl der Pathogene wurde ermittelt, dass an dem in vitro-Hautmodell etwa 95% des virulenten Stammes nach 2 Stunden und 10% des avirulenten Stammes an- hafteten. Bei dem in vitro-Darmmodell zeigten etwa 95% des virulenten Stamms (Figur 2) und 10% des a- virulenten Stamms Adhäsion. Beispiel 4 :
Cokultivierung von Candida albicans mit dem in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise dem im vitro- Darmtestsystem zur Bestimmung der Penetration von Zellen durch das Pathogen
Zur Bestimmung der Penetration des Pathogens wurde jeweils 12 in Airlift-Kultur gehaltene Inserts des in vitro-Hautsystems und jeweils 12 in Airlift- Kultur gehaltene Inserts des in vitro-Darmsystems mit jeweils 103 pathogenen Organismen des virulenten Candida-Stamms Sc5314 oder des avirulenten Can- dida-Stamms Can34 infiziert. Anschließend wurden die Inserts bis zu 3 Tage bei 37 °C inkubiert.
Das Eindringen des Pathogens in die organoiden Strukturen wird nach etwa 18 bis 24 Stunden mittels histologischer Verfahren an Dünnschnitten untersucht, wobei sowohl bei dem in vitro-Hautsystem als auch bei dem in vitro-Darmsystem das PAS- Färbeverfahren verwendet wird. Anhand der histolo- gischen Schnitte wurde der Invasionsprozess des virulenten Candida-Stammes bis in tiefere Schichten der bindegewebsähnlichen Matrix dokumentiert (Figur 3). Dabei wurde gezeigt, dass der virulente Candi- da-Stamm sich sternförmig von der Infektionsstelle in das Bindegewebe ausbreitet, wohingegen der avirulente Stamm die Epithelzellen nicht durchdringen konnte und auch keine Adhäsion zeigte. Beispiel 5 :
Einfluß von Antimykotika auf die Adhäsion von Candida albicans an Haut- und Darmzellen in vitro
Zur Bestimmung des Einflusses von Antimykotika auf die Adhäsion von Candida albicans an Haut- und Darmzellen wurde jeweils 12 in Submers-Kultur gehaltene Inserts des in vitro-Hauttestsystems und jeweils 12 Inserts des in vitro-Darmtestsystems mit jeweils 103 pathogenen Organismen des virulenten' Candida-Stamms Sc5314 oder des avirulenten Candida- Stamms Can34 infiziert. Zu 5 Inserts wurde Amphote- ricin B in einer Konzentration von 0,1; 0,5; 1,0 und 2,0 μg/μl und zu 5 Inserts wurde Fluconazol in einer Konzentration von 0,1; 0,5; 1,0 und 2,0 μg/μl gegeben. Anschließend wurden die Inserts unter Schütteln bei 37°C bis zu 3 Tagen inkubiert.
Nach 16, 24, 72, 86 und 98 Stunden wurden Aliquots entnommen und auf Petrischalen mit YPD-Nährböden ausplattiert. Nach einer Inkubationszeit von 2 Ta- gen wurden die Kolonien auf den Petrischalen ausgezählt. Aufgrund des Vergleichs zwischen der ermittelten Kolonienzahl der Proben ohne Zugabe eines Antimykotikums und der Kolonienzahl bei Proben mit Zugabe eines Antimykotikums wurde ermittelt, dass die Adhäsion des virulenten Candida-Stammes erst durch Zugabe von Amphotericin B und Fluconazol und durch eine Inhibition des Wachstums unterbunden werden konnte . Beispiel 6 :
Cokultivierung von Candida albicans mit dem in vitro-Hauttestsystem beziehungsweise dem im vitro- Darmtestsystem zur Bestimmung der Penetration des Pathogens
Zur Bestimmung des Einflusses von Antimykotika auf die Penetration von Candida albicans in Haut- und Darmzell'en wurde jeweils 12 in Airlift-Kultur gehaltene Inserts des in vitro-Hautsystems und je- weils 12 Inserts des in vitro-Darmsystems mit jeweils 103 pathogenen Organismen des virulenten Can- dida-Sta ms Sc5314 oder des avirulenten Candida- Stam s Can34 infiziert. Zu 5 Inserts wurde Amphote- ricin B in einer Konzentration von 0,1; 0,5; 1,0 und 2,0 μg/μl und zu 5 Inserts wurde Fluconazol in einer Konzentration von 0,1; 0,5; 1,0 und 2,0 μg/μl gegeben. Anschließend wurden die Inserts unter Schütteln bei 37°C bis zu 3 Tage inkubiert.
Das Eindringen des Pathogens in die organoiden Strukturen wird nach etwa 18 bis 24 Stunden mittels histologischer Verfahren an Dünnschnitten gemäß Beispiel 4 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von Amphotericin B und Fluconazol die Invasion des virulanten Candida-Stammes offen- bar durch Inhibition dessen Wachstums unterbindet.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines einschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebetestsystems, wobei menschliche oder tierische Zellen in eine dreidimensionale, gelartige Biomatrix, enthaltend mindestens 3 mg/ml Kollagen in ge- puffertem serum-haltigen Zellkulturmedium, eingebettet und in dieser so kultiviert werden, dass ein einschichtiges in vitro-Gewebesystem gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultivierung der menschlichen oder tierischen Zellen eine mindestens ein- bis zweitägige Submerskultur umfasst .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um nicht-entartete Zellen, entartete Zellen oder ein Gemisch davon handeln kann.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um gentechnisch veränderte Zellen oder ein Gemisch von gentechnisch unveränderten Zellen und gentechnisch veränderten Zellen handeln kann.
5. Verfahren zur Herstellung eines einschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebetestsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Isolieren von kollagenhaltigem Gewebe, das Überführen des kollagenhaltigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lösung überführten Kollagengewebe bei 2 bis 10 °C, insbesondere 4"°C, das Abzentrifugieren nicht gelöster Kollagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagenlösung bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, mit einer Lösung, enthaltend die zu kultivierenden menschlichen oder tierischen Zellen, Zellkulturme- dium, Serum und Puffer, und das Gelieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Temperatur.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die menschlichen oder tierischen Zellen nach Kultivierung in der. dreidimensionalen, gelartigen Biomatrix aus dieser herausgelöst und in höherer Zelldichte weiter kultiviert werden, so dass ein einschichtiges in vitro-Gewebesystem gewonnen wird.
7. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems, wobei Zellen eines ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps in eine dreidimensionale, gelartige Biomatrix, enthaltend mindestens 3 mg/ml Kollagen in gepuffertem serum-haltigen Zellkulturmedium, eingebettet und in dieser einer mindestens ein- bis zweitägigen Kultivierung unterworfen werden und wobei danach Zellen eines zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps in einem Zellkulturmedium auf der Biomatrix ausgesät und danach weiter kultiviert werden und wobei danach gegebenenfalls in einem optionalen weiteren Schritt Zellen weiterer menschlicher oder tierischer Gewebetypen in Zellkulturmedium ausgesät und danach weiter kultiviert werden, so dass ein dreidimensionales mehrschichtiges in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem gewonnen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultivie- rung der Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps mindestens eine ein- bis zweitägige Submerskultur umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Kultivierung der ' Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps mindestens eine 2- bis 6- tägige Submerskultur und mindestens eine 10- bis 14-tägige Airlift-Kultur umfasst.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Zellen des zweiten menschlichen oder tieri- sehen Gewebetyps und gegebenenfalls die Zellen der weiteren menschlichen oder tierischen Gewebetypen einen hohen Anteil undifferenzierter Stammzellen oder/und von Immunsystemzellen aufweisen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps und den Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps sowie den Zellen der gegebenenfalls verwendeten weiteren menschlichen oder tierischen Gewebetypen um nicht-entartete, entartete Zellen oder ein Gemisch davon handeln kann.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps und den Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps so- wie den Zellen der gegebenenfalls verwendeten weiteren menschlichen oder tierischen Gewebetypen um gentechnisch veränderte Zellen oder ein Gemisch von gentechnisch unveränderten Zellen und gentechnisch veränderten Zellen handeln kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um dermale Fibroblasten und bei den Zellen des zweiten mensch- liehen oder tierischen Gewebetyps um Keratinocyten handelt, so dass nach Kultivierung ein dreidimensionales in vitro-Hauttestsystem hergestellt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschli- chen oder tierischen Gewebetyps um Bindegewebszellen des Darms und bei den Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Entero- cyten oder Darmepithelzellen handelt, so dass nach Kultivierung ein dreidimensionales in vitro- Darmtestsystem hergestellt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Cornea- Endothelzellen, bei den Zellen des zweiten mensch- liehen oder tierischen Gewebetyps um Cornea- Keratinocyten und bei den Zellen eines weiteren, dritten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Cornea-Epithelzellen handelt, so dass nach Kultivierung ein dreidimensionales in vitro-Cornea- Testsystem hergestellt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Fibroblasten, insbesondere Trachea-Fibroblasten und bei den Zel- len des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Trachea-Epithelzellen handelt, so dass nach Kultivierung ein dreidimensionales in vitro- Trachea-Testsystem hergestellt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei es sich bei den Zellen des ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Fibroblasten, insbesondere Schleimhaut-Fibroblasten und bei den Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebetyps um Schleimhaut-Epithelzellen handelt, so dass nach Kultivierung ein dreidimensionales ' in vitro-Schleimhaut-Testsystem hergestellt wird.
18. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensionalen mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems nach einem der Ansprüche 7 bis 17, um- fassend das Isolieren • von kollagenhaltigem Gewebe, das Überführen des kollagenhaltigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lösung überführten Kollagengewebe bei 2 bis 10 °C, insbesondere 4°C, das Abzentrifugieren nicht gelöster Kollagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagenlösung bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, mit einer Lösung, enthaltend die zu kultivierenden Zellen eines ersten menschlichen oder tierischen Gewebetyps, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, das Ge- lieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Temperatur, das Inkubieren des gelierten Gemisches bei 37°C und das Aussäen der Zellen des zweiten menschlichen oder tierischen Gewebesystems und gegebenenfalls das Aussäen der Zellen der weiteren menschlichen oder tierischen Gewebetypen auf das inkubierte, gelierte Gemisch.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die eingebettete menschliche oder tierische Zellen enthaltende Biomatrix hergestellt wird, indem aus einem Gewebe isolierte Kollagenfasern in saurer Lösung 3 bis 14 Tage bei 2 bis ,10°C, vor- zugsweise 4°C, gerührt, nicht gelöste Kollagenanteile abzentrifugiert und die erhaltene fertige Kollagenlösung mit einem Kollagengehalt von 3 mg/ml bis 8 mg/ml mit einer Lösung, enthaltend die einzubettenden menschlichen oder tierischen Zellen, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, gemischt und anschließend bei höherer Temperatur, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 37°C, geliert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die saure Lö- sung Essigsäurelösung, insbesondere 0,1%-ige Essigsäurelösung, ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Lösung, enthaltend die Zellen, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, in einem Volumenverhältnis von 1:1 mit der kollagenhaltigen Lösung gemischt wird.
22. Einschichtiges in-vitro-Gewebetestsystem hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 19 bis 21.
23. Dreidimensionales mehrschichtiges in vitro- Hauttestsystem, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13 oder 18 bis 21.
24. Dreidimensionales mehrschichtiges in vitro- Darmtestsystem, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, 14 oder 18 bis 21.
25. Dreidimensionales mehrschichtiges in vitro- Cornea-Testystem, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, 15 oder 18 bis
21.
26. Dreidimensionales mehrschichtiges in vitro- Trachea-Testsystem, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, 16 oder 18 bis 21.
27. Dreidimensionales mehrschichtiges in vitro- Schleimhaut-Testsystem, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 oder 17 bis 21.
28. Verfahren zur Untersuchung des Infektionsprozesses eines pathogenen oder parasitären Mikroorganismus an einem menschlichen oder tierischen Gewebe, umfassend das Inkontaktbringen eines einschichtigen in vitro-Gewebetestsystems gemäß Anspruch 22 oder eines dreidimensionalen mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 mit einem pathogenen oder parasitären Mikrorganismus und die Cokultivierung des Mikroorganismus mit dem ein- oder mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem unter Bedin- gungen, die die anschließende oder gleichzeitige Untersuchung des Infektionsprozesses erlauben.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Cokultivierung in einer Submerskultur erfolgt und die Ad- häsion des Mikroorganismus an Zellen des ein- odermehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems ermittelt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Cokultivierung in einer Airlift-Kultur erfolgt und die Pe- netration des Mikroorganismus in Zellen des ein- oder mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystems ermittelt wird.
31. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer chemischen Substanz oder eines Agens auf den Infekti- onsprozess eines pathogenen oder parasitären Mikroorganismus an einem menschlichen oder tierischen Gewebe, umfassend das Inkontaktbringen eines einschichtigen in vitro-Gewebetestsystems gemäß Anspruch 22 oder eines dreidimensionalen in vitro- Organ- oder Gewebetestsystems gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 mit einem pathogenen oder parasitären Mikrorganismus, die Cokultivierung des Mikroorganismus mit dem ein- oder mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem in Ab- und Anwe- senheit der zu untersuchenden Substanz oder des A- gens und die Bestimmung der Wechselwirkung zwischen dem ein- oder mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem, dem Mikroorganismus und der zu testenden Substanz oder dem zu testenden Agens.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Einfluss der zu testenden Substanz oder des zu testenden A- gens auf die Adhäsion des Mikroorganismus bestimmt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Einfluss der zu testenden Substanz oder des zu testenden A- gens auf die Penetration des Mikroorganismus bestimmt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei ■ der Einfluss der zu testenden Substanz oder des zu testenden A- gens auf die Wachstumsrate des Mikroorganismus bestimmt wird.
35. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer chemischen Substanz oder eines Agens auf nicht- entartete oder entartete menschliche oder tierische Zellen, umfassend das Inkontaktbringen der chemischen Substanz oder des Agens mit einem aus entarteten und/oder nicht-entarteten menschlichen oder tierischen Zellen aufgebauten einschichtigen in vitro-Gewebetestsystem gemäß Anspruch 22 oder einem aus entarteten und/oder nicht-entarteten menschlichen oder tierischen Zellen aufgebauten dreidimensionalen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 und Bestimmung der Wechselwirkung zwischen dem ein- oder mehrschichtigen in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem und der chemischen Substanz oder dem Agens.
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