WO2001057520A2 - Analytical measuring and evaluation method for molecular interactions - Google Patents

Abstract

The invention relates to an analytical measuring and evaluation method for determining the interaction parameters between an analyte and a ligand, preferably in a biosensor. According to the inventive method, the concentration of the analyte is gradually changed at defined intervals ti and the initial association or dissociation rates or association and dissociation constants are determined. The invention further relates to a device for carrying out the inventive method.

Description

Analytisches Meß- und Auswerteverfahren für molekulare Interaktionen Analytical measurement and evaluation method for molecular interactions

1. Anwendungsgebiet1. Field of application

Die Erfindung bezieht sich auf ein Meß- und Auswerteverfahren zur Bestimmung von Interaktionsparametern zwischen einem Analyt und einem Ligand wie unter anderem Geschwindigkeitskonstanten oder Bindungspartner-Aktivitäten. Die Aufnahme der Meßwerte erfolgt z. B. mit Biosensoren, in denen ein i. allg. immobilisierter erster Bindungspartner (Ligand L) mit einem zweiten Bindungspartner (Analyt A) versetzt wird und die Bildung des Ligand-Analyt-Komplexes LA im zeitlichen Verlauf erfaßt wird.The invention relates to a measurement and evaluation method for determining interaction parameters between an analyte and a ligand, such as, among other things, rate constants or binding partner activities. The measurement values are recorded e.g. B. with biosensors in which an i. generally immobilized first binding partner (ligand L) is mixed with a second binding partner (analyte A) and the formation of the ligand-analyte complex LA is recorded over time.

2. Technischer Hintergrund2. Technical background

Sogenannte Biosensoren zur Erfassung der zeitlichen Verläufe der Bildung von Analyt-Ligand-Komplexen sind in den unterschiedlichsten Ausführungen bekannt, wobei auch andere Vorrichtungen wie u. a. Array-Systeme zur Erfassung derartiger Reaktionen verwendbar sind. Dabei werden sowohl die zeitlichen Verläufe der Assoziation des Analyten am Liganden erfaßt, wenn die Analytkonzentration durch die Zugabe einer Analytlösung bestimmter Konzentration erhöht wird, sowie die Dissoziation bei Zugabe einer geringer konzentrierten Lösung oder mit einer Konzentration von Null. I. allg. wird der zeitliche Verlauf der Komplexbildung mit der Funktion R(t) oder R_t beschrieben, wobei die Konzentration des Komplexes bzw. seine zeitliche Änderung mit c_t(LA) bzw. da(LÄ)/dt bezeichnet wird. In erster Näherung wird für den zeitlichen Verlauf der Funktion R ein exponentieller Verlauf erster Ordnung mit dem Exponenten k_on bei der Assoziation und k_0Tf bei der Dissoziation des Komplexes angenommen. Zur Erfassung dieser Werte ist es bisher üblich, die Reaktion, z. B. die Komplexbildung, teilweise oder bis zum Erreichen eines Gleichgewichtswertes R_eq, bei dem die Assoziation des Komplexes aus Analyt und Ligand im Gleichgewicht steht mit dessen Dissoziation, auszumessen. Es folgt eine Dissoziation des Komplexes und eine Regenerations- und Waschphase. Dies ist ein sehr zeitaufwendiges Verfahren, insbesondere wenn hintereinander mehrere Messungen mit unterschiedlichen Konzentrationsänderungen vorgenommen werden sollen. Eine weitere Auswertung der erhaltenen Exponenten führt zu den eigentlich interessierenden kinetischen Geschwindigkeitskonstanten, das Verfahren bedarf jedoch einer konstanten Analytkonzentration.So-called biosensors for recording the chronological course of the formation of analyte-ligand complexes are known in a wide variety of designs, and other devices such as, inter alia, array systems can also be used for recording such reactions. Both the time course of the association of the analyte on the ligand is recorded when the analyte concentration is increased by adding an analyte solution of a certain concentration, and the dissociation when adding a less concentrated solution or with a concentration of zero. In general, the course of the complex formation over time is described with the function R (t) or R _t , the concentration of the complex or its change over time being denoted by c _t (LA) or da (LÄ) / dt. In a first approximation, an exponential course of the first order with the exponent k _on for the association and k _0T f for the dissociation of the complex is assumed for the time course of the function R. So far it has been to record these values usual, the reaction, e.g. B. the complex formation, partially or until reaching an equilibrium value R _eq , in which the association of the complex of analyte and ligand is in equilibrium with its dissociation. This is followed by a dissociation of the complex and a regeneration and washing phase. This is a very time-consuming process, especially if several measurements with different concentration changes are to be carried out in succession. A further evaluation of the exponents obtained leads to the kinetic rate constants that are actually of interest, but the method requires a constant analyte concentration.

Bei den bisherigen Auswertungsverfahren der Meßwerte wird meistens davon ausgegangen, daß die Konzentration des zu dem Liganden zugegebenen Analyten trotz der Komplexbildung konstant ist. Dies wird z. B. dadurch angenähert, daß die Analytkonzentration vielfach höher ist als die Ligandkonzentration oder durch ständigen Austausch im Durchflußsystem. Tatsächlich jedoch tritt z. B. bei der Assoziation im Küvettensystem immer eine Verarmung des Analyten oder eine Konzentrationsänderung auf, die dazu führt, daß der Gleichgewichtswert R'_eq, der tatsächlich erreicht wird, sich von dem hypothetischen Wert R_eq bei konstanter Analytkonzentration unterscheidet. Eine Analyse der Meßwerte mit einer Näherungsfunktion zweiter Ordnung ergibt zwar einen genaueren Wert des Koeffizienten der Exponentialfunktion, ist aber aufwendig und bedarf der zusätzlichen Ermittlung bzw. Berücksichtigung einer Reihe von Randbedingungen des Tests.In the previous evaluation methods of the measured values, it is usually assumed that the concentration of the analyte added to the ligand is constant despite the complex formation. This is e.g. B. approximated in that the analyte concentration is often higher than the ligand concentration or by constant exchange in the flow system. In fact, however, z. B. in association in the cuvette system always a depletion of the analyte or a change in concentration, which leads to the fact that the equilibrium value R ' _eq that is actually achieved differs from the hypothetical value R _eq at constant analyte concentration. An analysis of the measured values with a second-order approximation function gives a more precise value of the coefficient of the exponential function, but is complex and requires the additional determination or consideration of a number of boundary conditions of the test.

Zur Konzentrationsbestimmung werden initiale Raten herangezogen. Die initialen Raten werden dadurch erhalten, daß in den Anfang der Assoziationskurve eine Ausgleichsgerade gelegt wird, deren Steigung die initiale Rate aber unterbewertet, da die Gerade die Krümmung der Kurve nicht berücksichtigt. Desweiteren ist es bekannt, daß beim Auftragen der initialen Raten in einem Diagramm über die Konzentration des Analyten c(A), bei mehrmaliger Messung mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen, theoretisch eine Gerade durch den Ursprung mit der Steigung R_maχ ^* k_ass erhalten wird, wobei R_max die maximal mögliche Reaktion z. B. des Biosensors auf die Zugabe eines Analyten im Überschuß darstellt. Die Steigung dieser Geraden ist aber durch die o.g. Unterbewertung ebenfalls verfälscht, so daß diese Art von Diagramm nicht zur Bestimmung von k_ass herangezogen wird. Zur Erfassung der Meßwerte werden u. a. Biosensoren nach dem Durchflußprinzip oder dem Küvettenprinzip verwendet, wobei die unterschiedlichsten Meßverfahren im Stand der Technik bekannt sind. Bei Durchflußsystemen wird eine Sensoroberfläche, auf der der Ligand immobilisiert ist, pro Analyse mit einem konstanten Strom einer Analytlösung beaufschlagt. Hierbei ist die Näherung einer vorgewählten konstanten Analytkonzentration im Prinzip gegeben. Bei Küvettensystemen wird eine Meßzelle mit einer Analytlösung gefüllt und die Reaktion mit dem Liganden an einer Sensoroberfläche erfaßt. Besonders hier tritt eine Verfälschung der Meßergebnisse auf, da bei tatsächlichen Reaktionen die Analytkonzentration verändert wird. Werden mehrere Meßvorgänge mit unterschiedlichen Konzentrationen hintereinander durchgeführt, so wird normalerweise die Küvette mit einer Pufferlösung gespült oder auf andere Weise regeneriert, und anschließend eine Lösung mit geänderter Konzentration eingebracht.Initial rates are used to determine the concentration. The initial rates are obtained by placing a straight line in the beginning of the association curve, the slope of which underestimates the initial rate, however, since the straight line does not take into account the curvature of the curve. Furthermore, it is known that when plotting the initial rates in a diagram over the concentration of the analyte c (A), with repeated measurements with different concentrations in each case, theoretically a straight line is obtained through the origin with the slope R _ma χ ^* k _ass , where R _max the maximum possible response z. B. the biosensor represents the addition of an analyte in excess. However, the slope of this straight line is also falsified by the undervaluation mentioned above, so that this type of diagram is not used to determine k _ass . Biosensors based on the flow principle or the cuvette principle are used, among other things, to record the measured values, the most varied of measurement methods being known in the prior art. In flow systems, a constant flow of an analyte solution is applied to a sensor surface on which the ligand is immobilized per analysis. In principle, a preselected constant analyte concentration is approximated. In the case of cuvette systems, a measuring cell is filled with an analyte solution and the reaction with the ligand is recorded on a sensor surface. Here in particular, the measurement results are falsified, since the analyte concentration is changed in actual reactions. If several measurement processes with different concentrations are carried out in succession, the cuvette is normally rinsed with a buffer solution or regenerated in some other way, and a solution with a different concentration is then introduced.

Bei mehrfachen Titrationen, d. h. Änderung der Konzentration, werden die Meßkurven bisher so lange aufgenommen, bis die Komplexbildung einen Gleichgewichtszustand erreicht hat. Es werden lediglich die Gleichgewichtszustände zur Bestimmung weiterer Größen, nicht jedoch der Kinetik oder initialer Raten, verwendet. Vielmehr wird bei solchen Mehrschritt-Titrationen ein Zugang zur Kinetik ausdrücklich ausgeschlossen.With multiple titrations, i.e. H. If the concentration changes, the measurement curves have so far been recorded until the complex formation has reached an equilibrium state. Only the equilibrium states are used to determine further quantities, but not the kinetics or initial rates. Rather, access to kinetics is expressly excluded in such multi-step titrations.

Für Durchfluß-Systeme sind sequentiell bzw. hintereinander angeordnete sogenannte Probenschleifen bekannt, die nacheinander befüllt und in die Meßkammer ausgespült werden können. Jedoch weisen die Probenschleifen jeweils ein produktionstechnisch aufwendiges exakt definiertes Volumen und zwischen ihnen ein Undefiniertes Extravolumen, das auch als Totvolumen bezeichnet wird, auf. Im Totvolumen kann es zu unerwünschten Durchmischungen verschiedener Lösungen kommen. Die Schleifen sind weder von ihrer Auslaß-Seite her noch teilweise und auch nicht unabhängig voneinander befüllbar; und sie sind nicht unabhängig voneinander in die Meßkammer spülbar. 3. Darstellung der ErfindungSo-called sample loops arranged sequentially or one after the other are known for flow systems, which can be filled in succession and rinsed out into the measuring chamber. However, the sample loops each have a precisely defined volume, which is complex in terms of production technology, and between them an undefined extra volume, which is also referred to as dead volume. Undesired mixing of different solutions can occur in the dead volume. The loops can neither be filled from their outlet side nor partially and also not independently of one another; and they cannot be flushed into the measuring chamber independently of one another. 3. Presentation of the invention

a) Technische Aufgabea) Technical task

Ausgehend vom Stand der Technik hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, ein Verfahren anzugeben, mit dem die Meßzeiten bei der Erfassung der Meßwerte bei der Komplexbildung verkürzbar sind, die tatsächlichen Verhältnisse bei der Komplexbildung, d. h. Änderung der Analytkonzentration, berücksichtigt werden, und die Durchführung mehrerer Messungen hintereinander ohne aufwendige Spülvorgänge z. B. in einer Küvette möglich ist, sowie es möglich ist, die kinetischen Konstanten aus den initialen Raten, und unter idealen Verhältnissen auch aus den Kurvenexponenten zu ermitteln.Starting from the prior art, the object of the invention is to provide a method by means of which the measuring times when acquiring the measured values during complex formation can be shortened, the actual conditions during complex formation, i. H. Change in the analyte concentration, are taken into account, and the performance of several measurements in a row without complex rinsing processes such. B. is possible in a cuvette, and it is possible to determine the kinetic constants from the initial rates, and under ideal conditions also from the curve exponents.

b) Lösung der Aufgabeb) solving the problem

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verfahrensmerkmale des Anspruchs 1 und die Vorrichtungsmerkmale des Anspruchs 13 gelöst.According to the invention, this object is achieved by the method features of claim 1 and the device features of claim 13.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind jeweils Gegenstand von Unteransprüchen.Advantageous embodiments of the invention are the subject of subclaims.

Der Kerngedanke der Erfindung besteht darin, daß die Änderung der Analytkonzentration sowohl bei der Assoziation als auch der Dissoziation des Komplexes berücksichtigt wird. Dadurch nimmt die Funktion R einen Gleichgewichtswert R'_eq an, der sich vom Wert R_eq unterscheidet. Bei der Assoziation, d.h. Zugabe eines Analyten erhöhter Konzentration zu dem Liganden, tritt während der Assoziation eine Verarmung des Analyten auf, die dazu führt, daß R'_eq kleiner ist als der theoretische Wert R_eq. Im ersten Moment der Reaktion jedoch, d. h. wenn die Analytlösung z. B. in die Küvette eines Biosensors eingebracht wird, ist die initiale Rate der Funktion R unabhängig davon, ob im späteren Verlauf eine Analytverarmung durch Bindung des Analyten an den Liganden auftritt oder konstante Analytkonzentration angenommen wird. Zum Zeitpunkt t = 0 hat noch keine Reaktion zwischen Analyt und Ligand stattgefunden. Durch die Berücksichtigung des tatsächlichen Reaktionsverlaufs ändert sich auch der Exponentialkoeffizient von on in k'_on. Tatsächlich jedoch bleibt die Beziehung zwischen den einzelnen Größen der Exponentialfunktion erhalten, d. h.:The main idea of the invention is that the change in the analyte concentration is taken into account both in the association and the dissociation of the complex. As a result, the function R assumes an equilibrium value R ' _eq which differs from the value R _eq . In association, ie adding an analyte of increased concentration to the ligand, depletion of the analyte occurs during the association, which leads to R ' _{eq being} smaller than the theoretical value R _eq . At the first moment of the reaction, however, ie when the analyte solution is e.g. B. is introduced into the cuvette of a biosensor, the initial rate of the function R is independent of whether in the later course an analyte depletion occurs due to binding of the analyte to the ligand or constant analyte concentration is assumed. At time t = 0 there was no reaction between analyte and ligand. Through the Taking into account the actual course of the reaction, the exponential coefficient also changes from on to k ' _on . In fact, however, the relationship between the individual quantities of the exponential function is preserved, ie:

|_t * dRass(t = = 0)| _t * dRass (t = = 0)

K on R'e_q ^_ dt (1 ) undK on R'e _q ^_ dt (1) and

wobei ΔR' die Differenz zwischen dem Gleichgewichtswert der Dissoziation und dem Startwert R_st der Funktion R ist.

where ΔR 'is the difference between the equilibrium value of the dissociation and the starting value R _{st of} the function R.

Das bedeutet, daß aus den tatsächlichen Meßwerten z. B. die initiale Rate ermittelbar ist. Dies gilt ebenso, wenn die Exponentialfunktion zwar nach 1. Ordung, aber mit zwei Koeffizienten k'_on(1) und k'_on(2) verläuft, wobei sich die beiden korrespondierenden initialen Raten zu einer Gesamtrate addieren.This means that z. B. the initial rate can be determined. This also applies if the exponential function runs according to the 1st order, but with two coefficients k ' _{on (1} ) and k' _on (2), the two corresponding initial rates adding up to form an overall rate.

Dabei ist es im Rahmen der Erfindung möglich, daß die Meßkurve der Funktion R bis zum Erreichen des Gleichgewichtswertes R'_eq aufgenommen wird, um z. B. mit Hilfe eines mathematischen Programms den Exponenten k'_on oder k'_o zu ermitteln und daraus die initialen Raten der Assoziation oder Dissoziation. Vorzugsweise wird lediglich ein Teil der Kurve erfaßt, z. B. kann die Erfassung der Funktion R zu einem früheren Zeitpunkt abgebrochen werden, um aus einer Extrapolation des Kurvenabschnitts die Gleichgewichtslage zu ermitteln. Der Exponent k wird dabei mit einer non-linearen Näherung erhalten, kann aber auch über die Lineare Regression der Ableitung der Funktion R bestimmt werden.It is possible within the scope of the invention that the measurement curve of the function R is recorded until the equilibrium value R ' _eq is reached, in order, for. B. with the help of a mathematical program to determine the exponent k ' _on or k' _o and from this the initial rates of association or dissociation. Preferably only part of the curve is detected, e.g. For example, the acquisition of the function R can be terminated at an earlier point in time in order to determine the equilibrium position from an extrapolation of the curve section. The exponent k is obtained with a non-linear approximation, but can also be determined using the linear regression of the derivative of the function R.

Aus den initialen Raten können dann die jeweiligen Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten k_ass und k_di_SS ermittelt werden gemäß:The respective association and dissociation rate constants k _ass and k _d i _SS can then be determined from the initial rates according to:

= k_aSs Rmax Co(A) (3) dt im Falle der Komplexassoziation mit der Startkonzentration des Analyten Co(A) bzw.:= k _aS s Rmax Co (A) (3) dt in the case of complex association with the starting concentration of the analyte Co (A) or:

dt im Falle der Komplexdissoziation, wobei die Größe R_st den Startwert der Funktion R bei der Dissoziation angibt. Die Startkonzentration Co(A) ist i. allg. durch den Versuch von außen vorgegeben.dt in the case of complex dissociation, the quantity R _st indicating the starting value of the function R in the dissociation. The starting concentration Co (A) is i. generally determined by the experiment from outside.

Der Vorteil der Erfindung besteht darin, daß mehrmals hintereinander, z. B. in einer Küvette, eine Messung mit jeweils schrittweise veränderter Analytkonzentration durchführbar ist, wobei es nicht notwendig ist, daß jede Messung bis zum Erreichen des Gleichgewichtswertes zu Ende geführt wird, sondern bereits vorher abgebrochen werden kann bzw. die Konzentration des Analyten erhöht oder erniedrigt werden kann. Auch die Durchführung von Meßserien mit mehrmaliger auch abwechselnd aufeinanderfolgender Analyterhöhung und -Verminderung zur Erfassung von Assoziations- und Dissoziationskurven ist möglich.The advantage of the invention is that several times in a row, for. B. in a cuvette, a measurement with a step-by-step change in analyte concentration can be carried out, it not being necessary for each measurement to be completed until the equilibrium value has been reached, but can be stopped beforehand or the concentration of the analyte increased or decreased can be. It is also possible to carry out series of measurements with repeated and alternating successive increase and decrease of the analyte to record association and dissociation curves.

Obschon sich die Start-Raten von multiplen, i-fachen Assoziationsschritten aus der Summe der vorangegangenen und der neuen Assoziation bilden, lassen sich die Netto-Start-Raten der jeweiligen Assoziationsschritte basierend auf den eingangs formulierten Gleichungen (1 ) und (3) für die Assoziation ermitteln gemäß: k'on.i * (R'e_q,ass,i ^— R'st.ass.i) ⁼

(5) und: (dR_ass,i/dt)_t=o -

= (dRass,i,net/dt)_t=o (6) und auswerten gemäß:Although the start rates of multiple, i-fold association steps are formed from the sum of the previous and the new association, the net start rates of the respective association steps can be based on equations (1) and (3) for the Determine association according to: k'on.i * (R'e _q , ass, i ^- R'st.ass.i) ⁼

(5) and: (dR _ass , i / dt) _t = o -

= (dRass, i, net / dt) _t = o (6) and evaluate according to:

(dR_ass,i,net/dt)t=o / Co,i,net(A) = -k_ass * Rst.ass.i ⁺ k_ass * Rmax (7) was einer Geradengleichung entspricht und sich entsprechend auftragen lässt. Der Quotient aus initialer Netto-Assoziationsrate und Analyt-Netto- Startkonzentration, aufgetragen gegen das Assoziations-Startsignal R_st,_aSs,i, liefert linear gefittet eine Gerade mit der Steigung = -k_ass und einen x-Achsenabschnitt R_max. Die einzelnen Phasen multipler Dissoziationsschritte aus Küvettensystemen können direkt nach den Gleichungen (2) und (4) für die Dissoziation ausgewertet werden.(dR _as s, i, net / dt) t = o / Co, i, net (A) = -k _ass * Rst.ass.i ⁺ k _ass * Rmax (7) which corresponds to a straight line equation and can be plotted accordingly , The quotient of the initial net association rate and the analyte net start concentration, plotted against the association start signal R _st , _aSs, i, provides a straight line with the slope = -k _ass and an x-intercept R _max . The individual phases of multiple dissociation steps from cuvette systems can be evaluated for the dissociation directly according to equations (2) and (4).

Die Berechnung von sogenannten Fit-Kurven, mit denen die erhaltenen Meßergebnisse angenähert oder im Falle des vorzeitigen Abbruchs der Messung extrapoliert werden, erfolgt mit mathematischen Annäherungsprogrammen, die eine Exponentialfunktion, auch eine Doppelt-Exponentialfunktion, erster oder höherer Ordnung ermitteln, die die Meßergebnisse mit größtmöglicher Genauigkeit annähert. Die Berechnung einer derartigen Kurve kann durch die Auswertungseinheit z. B. eines Biosensors selbsttätig während der Messung erfolgen.The calculation of so-called fit curves, with which the measurement results obtained are approximated or extrapolated in the event of the measurement being terminated prematurely, is carried out using mathematical approximation programs which determine an exponential function, also a double-exponential function, of first or higher order, which also includes the measurement results approximates the greatest possible accuracy. The calculation of such a curve can be performed by the evaluation unit e.g. B. a biosensor take place automatically during the measurement.

Die schrittweise Änderung der Konzentration in der Meßkammer kann zu beliebigen Zeitpunkten während der Aufnahme der Meßergebnisse erfolgen. Insbesondere wird jedoch die Halbwertszeit der Funktion R vorgeschlagen, zu der die Funktion, beispielsweise bei einer Assoziation die Hälfte ihres Endwertes R_eq erreicht hat.The concentration in the measuring chamber can be changed step by step at any time during the recording of the measurement results. In particular, however, the half-life of the function R is proposed, at which the function, for example in the case of an association, has reached half of its end value R _eq .

Wird die Ableitung der Funktion R(t) in einem Diagramm gegen die Funktion R(t) aufgetragen, so wird, wenn die aufgetragenen Werte z. B. mit einer linearen Regression genähert werden, eine Gerade erhalten, deren y-Achsenabschnitt gerade der initialen Rate entspricht, die sich auch, und in Übereinstimmung mit der Gleichung (1 ), aus dem absoluten Wert der Geradensteigung (-k'on) und dem x- Achsenabschnitt R'_eq ergibt.If the derivative of the function R (t) is plotted against the function R (t) in a diagram, then if the plotted values are z. B. be approximated with a linear regression, get a straight line whose y-intercept corresponds to the initial rate, which also, and in accordance with equation (1), from the absolute value of the straight line slope (-k'on) and the x-intercept R ' _eq .

Zur Vereinfachung der Auswertung wird angenommen, daß die Reaktionen unter idealen Bedingungen ablaufen, d. h., daß insbeondere keine Analytverarmung auftritt. Dies kann z. B. bei Biosensoren mit Durchflußsystemen angenähert werden, indem ein stetiger Durchsatz der Lösung in der Meßkammer erfolgt, damit vereinfachen sich die Näherungsfunktionen, da z. B. eine Exponentialfunktion erster Ordnung für den Verlauf der Funktion R angenommen werden kann.To simplify the evaluation, it is assumed that the reactions take place under ideal conditions, i. that is, in particular no analyte depletion occurs. This can e.g. B. in biosensors with flow systems can be approximated by a constant throughput of the solution in the measuring chamber, thus simplifying the approximation functions since z. B. an exponential function of the first order for the course of the function R can be assumed.

Gemäß obenstehender Formel (3) zur Bestimmung der Assoziationsgeschwindig- keitskonstante kann, wenn die anderen Größen bekannt sind, auch die Anfangskonzentration c₀(A) einer neu in eine Meßkammer eingebrachten Lösung bestimmt werden. Dazu kann z. B. in einer vorhergehenden Versuchsreihe mit bekannten Co(A)-Werten aus den ermittelten initialen Raten eine Kalibrationsgerade erstellt werden gemäß initiale Rate = f(c₀(A)); der unbekannte c₀(A)-Wert einer Probe kann dann mit der aus den Meßwerten ermittelten initialen Rate aus der Kalibrationsgeraden berechnet werden.According to formula (3) above for determining the association rate constant, if the other quantities are known, the initial concentration c ₀ (A) of a solution newly introduced into a measuring chamber can also be determined. For this, e.g. B. in a previous test series with known Co (A) values, a calibration line can be created from the determined initial rates according to the initial rate = f (c ₀ (A)); the unknown c ₀ (A) value of a sample can then be calculated from the calibration line using the initial rate determined from the measured values.

Ebenso ist es, besonders unter Verwendung von Küvettensystemen, möglich, daß aus den aus einem Assoziationsvorgang erhaltenen Werten die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante erhalten wird und umgekehrt. Dies beruht darauf, daß z. B. bei einer Assoziation im ersten Moment, zu dem die Reaktion beginnt, noch keine Dissoziation erfolgt. Da die Funktion R aber einen Gleichgewichtswert annimmt, bei dem Assoziation und Dissoziation im Gleichgewicht stehen, enthält dieser Wert also auch Informationen über k_dιSS- Die Umkehrung dieses Ansatzes führt zu einem analogen Ergebnis für die Dissoziation. Die entsprechenden Formeln lauten: (dR_d dt)_t=0 It is also possible, particularly using cuvette systems, for the dissociation rate constant to be obtained from the values obtained from an association process and vice versa. This is based insist that z. B. in an association at the first moment at which the reaction begins, there is still no dissociation. However, since the function R assumes an equilibrium value in which association and dissociation are in equilibrium, this value also contains information about k _dιSS - the reversal of this approach leads to an analogous result for the dissociation. The corresponding formulas are: (dR _d dt) _{t = 0}

wobei ΔReq-st diss der Differenz zwischen dem Endwert, der idealerweise 0 ist, und den Anfangswerten von R bei der Dissoziation entspricht, c_eq'__dιss (A) die Konzentration von A nach der Dissoziation im Gleichgewicht ist und R_eq__dιss der Gleichgewichtswert von R nach der Dissoziation ist, und in den Nenner der Grenzwert für c_eq__dι_ss = 0 eingesetzt wird, und: (dR_ass/dt)_t=0

where ΔReq-st diss is the difference between the final value, which is ideally 0, and the initial values of R in the dissociation, c _eq '_ _dιss (A) the concentration of A after the dissociation is in equilibrium and R _eq _ _dιss the Equilibrium value of R after the dissociation, and in the denominator the limit value for c _eq _ _d ι _ss = 0 is inserted, and: (dR _ass / dt) _{t = 0}

mit den entsprechenden Werten für die Assoziation.

with the corresponding values for the association.

Ebenso kann das Verfahren zur Auswertung bei anderen Affinitätsbiosensoren oder Array-Systemen in Lösung angewendet werden, sowie bei zeitaufgelösten ELISA- oder RIA-Techniken oder anderen festphasengestützten Systemen, die dem Stand der Technik entnehmbar sind.The method can also be used for evaluation with other affinity biosensors or array systems in solution, as well as with time-resolved ELISA or RIA techniques or other solid-phase-based systems which can be found in the prior art.

Zur Realisierung einer ständig die Meßkammer durchströmenden Lösung wird in einem Küvettensystem die Konzentration der Lösung durch ständige Zugabe und Entnahme eines Teils der Lösung konstant gehalten. Dazu sind z. B. zwei Kanülen mit Lösungen vorhanden, mit denen entweder ständig frische Lösung in der Meßkammer umgewälzt wird, oder mit denen ein Teil der Lösung ständig entnommen und wieder zugeführt wird, um ein Durchflußsystem mit konstanter Konzentration zu simulieren. In diesem Fall, wie auch in idealen Durchfluß-Systemen mit konstanter Konzentration der Lösung in der Meßzelle, wird die Funktion R durch eine Exponentialfunktion erster Ordnung angenähert und es gilt folgende Beziehung: k on.i ⁼ k_aSs Co,i(A) + kdiss (10) wobei der Index i die i-te schrittweise Änderung der Konzentration in einem Mehrschritt-Experiment angibt. Nach diesem Verfahren lassen sich beide Geschwindigkeitskonstanten aus derselben Beziehung ermitteln.In order to implement a solution that constantly flows through the measuring chamber, the concentration of the solution is kept constant in a cuvette system by constant addition and removal of part of the solution. For this purpose, e.g. B. two cannulas with solutions with which either fresh solution is constantly circulated in the measuring chamber, or with which a part of the solution is continuously removed and fed back in order to simulate a flow system with a constant concentration. In this case, as in ideal flow systems with a constant concentration of the solution in the measuring cell, the function R is approximated by an exponential function of the first order and the following relationship applies: k on.i ⁼ k _aS s Co, i (A) + kdiss (10) where the index i indicates the i-th gradual change in concentration in a multi-step experiment. With this method, both rate constants can be determined from the same relationship.

Für ideale Durchfluß-Systeme mit konstant gehaltener Analyt-Startkonzentration während einer Assoziationsphase ist als bekannt gezeigt worden, daß die Startkonzentration genau dann gleich der Dissoziations-Gleichgewichtskonstante K_D = k_di_ss k_aSs ist, wenn mit dieser Konzentration die Hälfte der immobilisierten Ligandenmoleküle mit Analytmolekülen gebunden werden, d.h. R_max erreicht wird. Für diesen Fall läßt sich darüber hinaus aber zeigen, daß die Assoziationsphase bis zur Erreichung des Gleichgewichtswertes gerade halb so lange dauert wie die sich anschließende Dissoziationsphase, um wieder auf den Ausgangswert Null zurückzukehren. Bei höheren Analyt-Startkonzentrationen verläuft die Assoziation schneller. Unter dieser Voraussetzung schneidet die Dissoziationskurve, wenn sie mit der vorausgelaufenen Assoziationskurve überlagert wird, diese Assoziationskurve exakt im Goldenen Schnitt des Assoziations- Gleichgewichtswert.es, was dem Wert 0,618...^* R_eq__ass entspricht. D.h. durch die Applikation verschiedener Analyt-Startkonzentrationen und eine darauf folgende Regression auf den oben beschriebenen Schnittmeßwert läßt sich der K_D-Wert extrapolieren. Umgekehrt muß eine Analyt-Startkonzentrationen, numerisch im K_D- Wert appliziert, den oben beschriebenen Schnittmeßwert ergeben; andernfalls verläuft die aufgezeichnete Interaktion nicht ideal. Prinzipiell erlaubt die Multi-Schritt- Kinetik einen analogen Ansatz.For ideal flow systems with a constant analyte start concentration during an association phase, it has been shown that the start concentration is equal to the dissociation equilibrium constant K _D = k _d i _ss k _aS s if and only if half of the immobilized with this concentration Ligand molecules are bound with analyte molecules, ie R _{max is} reached. In this case, however, it can also be shown that the association phase until the equilibrium value is reached is just half as long as the subsequent dissociation phase in order to return to the initial value zero. The association proceeds faster at higher analyte starting concentrations. Under this condition, the dissociation curve, when superimposed with the preceding association curve, intersects this association curve exactly in the golden section of the association equilibrium value, which corresponds to the value 0.618 ... ^* R _eq _ _ass . This means that the K _D value can be extrapolated by the application of different analyte starting concentrations and a subsequent regression to the measurement value described above. Conversely, an analyte starting concentration, applied numerically in the K _D value, must result in the measured cut value described above; otherwise the recorded interaction is not ideal. In principle, multi-step kinetics allow an analog approach.

Generell, insbesonders für Küvettensysteme mit variabler Analytkonzentration in der Meßzelle während eines Meßschrittes, gelten desweiteren die folgenden Beziehungen: on ⁼ K_ass C ecjass(A) + k offmax \ ' ' ) mit der Geradensteigung k_ass, wobei c'_eqass(A) die Analytgleichgewichtskonzentration nach der Assoziation und kOffmax der Maximalwert des Koeffizienten der Exponentialfunktion bei der Dissoziation ist; und k'off ⁼ k iss * (—Rstdiss)/(R'eq — Rstdiss) (12) mit der Geradensteigung kdi_SS, wobei der Index stdiss den Startwert bei der Dissoziation bedeutet.In general, especially for cuvette systems with variable analyte concentration in the measuring cell during a measuring step, the following relationships also apply: on ⁼ K _a ss C ecjass (A) + k offmax \ '') with the line _slope k _ass , where c ' _eqa ss (A) is the analyte equilibrium concentration after the association and kOffmax is the maximum value of the coefficient of the exponential function in the dissociation; and k'off ⁼ k iss * (—Rstdiss) / (R'eq - Rstdiss) (12) with the slope kdi _SS , where the index stdiss means the starting value for the dissociation.

c) Ausführungsbeispiele des Biosensorsc) Embodiments of the biosensor

Zur Durchführung des Verfahrens wird ein an sich bekannter Biosensor verwendet, der mit einer Sensoroberfläche ausgestattet ist, an der die Liganden immobilisiert d. h. gebunden sind. Diese Bindung kann z. B. wie im Stand der Technik bekannt über eine chemische Bindung des Liganden oder mit einem auf den Liganden abgestimmten Rezeptor erfolgen. Über der Sensoroberfläche ist eine Meßkammer oder Küvette ausgebildet, die mit einer Lösung des Analyten beaufschlagbar ist. Zur Erfassung der Komplexbildung, d. h. der Bindung des Analyten am Liganden, sowie deren zeitlicher Verlauf können verschiedene Meßverfahren verwendet werden, z. B. die Erfassung des Reflexionsvermögens der Rückseite des Sensors, das sich mit dem Grad der Komplexbildung c(LA) ändert. Zum Einbringen der Lösung in die Meßkammer dient eine Kanüle, die mit der Meßkammer verbunden ist und entweder die Lösung zugibt und/oder absaugt. Die Meßkammer kann auch mit zwei getrennten Kanülen zur Zugabe/Herausnahme ausgestattet sein. Auch die Beaufschlagung mit einer Spülflüssigkeit über eine der Kanülen ist möglich. Zur Durchmischung der Lösung in der Meßkammer, um Konzentrationsgradienten in der Lösung während der Reaktion zu vermeiden, ist eine Vorrichtung zur Durchmischung der Lösung vorhanden, dies kann z. B. ein Vibrationsrührer sein. Die Ausstattung des Biosensors mit einer vorzugsweise elektronischen Steuerung sowie geeigneten Meßgeräten nebst Datenerfassungssoftware ist dem Stand der Technik entnehmbar.To carry out the method, a known biosensor is used, which is equipped with a sensor surface on which the ligands are immobilized. H. are bound. This bond can e.g. B. as known in the art via chemical binding of the ligand or with a receptor matched to the ligand. A measuring chamber or cuvette is formed above the sensor surface and a solution of the analyte can be applied to it. To detect complex formation, i. H. the binding of the analyte to the ligand, as well as their time course, various measurement methods can be used, z. B. the detection of the reflectivity of the back of the sensor, which changes with the degree of complex formation c (LA). A cannula, which is connected to the measuring chamber and either adds the solution and / or sucks it off, is used to introduce the solution into the measuring chamber. The measuring chamber can also be equipped with two separate cannulas for adding / removing. It is also possible to apply a flushing liquid through one of the cannulas. To mix the solution in the measuring chamber in order to avoid concentration gradients in the solution during the reaction, a device for mixing the solution is present. B. be a vibration stirrer. The state of the art shows that the biosensor is preferably equipped with an electronic control and suitable measuring devices and data acquisition software.

Erfindungsgemäß ist der Biosensor derart ausgebildet, daß die Lösung in der Meßkammer zumindest teilweise instantan mehrmals mit Lösungen unterschiedlicher Analytkonzentration austauschbar ist, wobei das Flüssigkeitsvolumen im wesentlichen konstant gehalten wird. Das bedeutet, daß zumindest ein Teil der Lösung in der Meßkammer, oder die gesamte Lösung, entnommen und im wesentlichen gleichzeitig eine neue Lösung mit einer anderen Konzentration zugegeben wird. Durch den Austausch zumindest eines Teils der Lösung durch eine andere Lösung mit gewünschter Konzentration wird die Gesamtkonzentration in der Meßkammer in definierter Weise verändert. Die Art des Austauschens der Flüssigkeit kann im Rahmen der Erfindung beliebig ausgeführt oder wie im folgenden dargelegt vorgenommen werden. In einem Durchflußsystem wird die komplette Lösung in der Meßkammer ausgetauscht, bei einem Küvettensystem zumindest ein Teil davon. Mit dem mehrmaligen Austauschen der Lösung wird eine schrittweise Änderung der Konzentration in der Meßkammer ermöglicht, um das erfindungsgemäße Verfahren durchführen zu können.According to the invention, the biosensor is designed in such a way that the solution in the measuring chamber can be exchanged at least partially instantaneously several times with solutions of different analyte concentration, the liquid volume being kept essentially constant. That means that at least part of the Solution in the measuring chamber, or the entire solution, removed and a new solution with a different concentration is added substantially simultaneously. By replacing at least a part of the solution with another solution with the desired concentration, the total concentration in the measuring chamber is changed in a defined manner. The type of exchange of the liquid can be carried out as desired within the scope of the invention or can be carried out as set out below. In a flow system the complete solution is exchanged in the measuring chamber, in a cuvette system at least part of it. The repeated exchange of the solution enables a gradual change in the concentration in the measuring chamber in order to be able to carry out the method according to the invention.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Biosensors besteht darin, daß z.B. bei Küvettensystemen das Volumen der Lösung im wesentlichen konstant gehalten ist und damit die Anzahl der Parameter bei der mathematischen Auswertung der Meßergebnisse verringert wird. Der instantane Austausch der Lösungen führt zudem besonders bei Durchflußsystemen zu scharfen Übergängen zwischen einzelnen Assoziations- bzw. Dissoziationsphasen, was für die Bestimmung der initialen Raten notwendig ist.The advantage of the biosensor according to the invention is that e.g. in the case of cuvette systems, the volume of the solution is kept essentially constant and the number of parameters in the mathematical evaluation of the measurement results is thus reduced. The instantaneous exchange of the solutions also leads to sharp transitions between individual association or dissociation phases, particularly in flow systems, which is necessary for determining the initial rates.

Vorzugsweise erfolgt der Austausch zumindest eines Teils der Lösung in der Meßkammer über eine oder über mehrere Kanülen gleichzeitig. Insbesondere wird die Lösung mit einer Kanüle entnommen und mit einer anderen Kanüle eine neue Lösung mit einer beliebig wählbaren Konzentration zugegeben.At least part of the solution in the measuring chamber is preferably exchanged simultaneously via one or more cannulas. In particular, the solution is removed with a cannula and a new solution with an arbitrarily selectable concentration is added with another cannula.

Werden die Kanülen getrennt voneinander an der Meßkammer angeordnet, z. B. einander gegenüberliegend, kann die Entnahme und Zuführung auch gleichzeitig erfolgen, wobei zum vollständigen Austausch der Lösung in einem Küvettensystem die Entnahme bzw. Zuführung derart erfolgt, daß die Meßkammer durchgespült wird, um das Verbleiben unerwünschter Rückstände zu vermeiden. Die Kanülen können auch koaxial angeordnet werden, d. h. eine verläuft in der anderen, wobei die innere entweder die Lösung entnimmt oder zuführt. Zur Förderung der Lösungen durch die Kanülen in die Meßkammer hinein oder heraus sind Pumpen vorgesehen, mit denen die Menge der jeweils geförderten Lösung dosierbar ist. Dazu werden sogenannte Mikropumpen verwendet, die eine Dosierung mit der gewünschten Genauigkeit erlauben, um wohl definierte Mengen an Lösung der Meßkammer zu entnehmen oder ihr zuzuführen. Diese Pumpen sind unter anderem als Schlauchpumpen, Spritzenpumpen oder piezoelektrische Pumpen auslegbar, wobei die Betätigung mit Stellmotoren, elektrischen Antrieben etc. erfolgt und sie ebenfalls elektronisch angesteuert sind.If the cannulas are arranged separately from one another on the measuring chamber, e.g. B. opposite each other, the removal and supply can also take place simultaneously, with the complete exchange of the solution in a cuvette system, the removal or supply is carried out in such a way that the measuring chamber is flushed through in order to avoid remaining undesirable residues. The cannulas can also be arranged coaxially, ie one runs in the other, the inner one either taking the solution out or supplying it. To convey the solutions through the cannulas into or out of the measuring chamber, pumps are provided with which the amount of the solution conveyed can be metered. For this purpose, so-called micropumps are used which allow dosing with the desired accuracy in order to take well-defined amounts of solution from the measuring chamber or to supply it to it. These pumps can be designed, inter alia, as peristaltic pumps, syringe pumps or piezoelectric pumps, the actuation being carried out with servomotors, electrical drives, etc. and they are also electronically controlled.

Die Durchmischung der Lösung in der Meßkammer kann auch dadurch erfolgen, daß mit einer oder mehreren Kanülen ein Teil der Lösung angesaugt und sofort wieder zurückgepumpt wird, so daß die Lösung ständig umgewälzt und durchmischt wird. Vorzugsweise erfolgt eine Umwälzung mit mindestens 1 μl/rnin, um eine homogene Konzentration der Lösung in der Meßkammer während der Komplexbildung zu gewährleisten.The mixing of the solution in the measuring chamber can also be carried out by sucking in part of the solution with one or more cannulas and immediately pumping it back again, so that the solution is constantly circulated and mixed. Circulation with at least 1 μl / ml preferably takes place in order to ensure a homogeneous concentration of the solution in the measuring chamber during the formation of the complex.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß an der Meßkammer in bestimmter Weise zwei oder mehr sogenannte Probenschleifen beliebigen Volumens vorhanden sind, die manuell und/oder mittels eines Probengebers automatisch befüllt werden können. Vorzugsweise sind die Probenschleifen parallel angeordnet zwischen zwei Mehrfach-Wahlventilen, wobei diese gesamte Anordnung über ein Schaltventil in den Durchfluß einschaltbar ist. Die Probenschleifen können so außerhalb des Durchflusses einerseits über die Wahlventile unabhängig voneinander und andererseits über das Schaltventil von ihrem Ausflußende her ganz oder nur teilweise befüllt werden, um z. B. Analytlösung zu sparen. Nach der Befüllung steht an der Schnittstelle zum Durchfluß am Schaltventil ohne andere Zwischenvoiumina, d.h. ohne sogenanntes Totvolumen, die Lösung der zuletzt befüllten Probenschleife an. Das bedeutet, daß die Meßkammer mit mehreren unterschiedlichen Lösungen aus den einzelnen Probenschleifen über die Wahlventile nacheinander, unabhängig voneinander und totvolumenfrei im Durchfluß beaufschlagbar ist, und ohne daß eine beliebige Probenschleife vollständig ausgespült bzw. der Fluß durch diese in eine andere Schleife geleitet werden muß. Damit ist eine variable, instantane, praktisch durchmischungsfreie und probensparende schrittweise Konzentrationsänderung gewährleistet. Zudem kann jeweils die Konzentration des Analyten in der Lösung in der Meßkammer in erster Näherung konstant gehalten werden, um eine Verarmung zu verhindern. Vorzugsweise ist in jeder Probenschleife eine Lösung unterschiedlicher Konzentration vorhanden, um Messungen mit unterschiedlichen Konzentrationen auch unmittelbar hintereinander ausführen zu können oder durch die gezielte Ansteuerung von Probenschleifen eine Zwischenkonzentration zwischen den Werten in den einzelnen Probenschleifen zu erhalten. Die Zahl der Probenschleifen ist praktisch zwar nicht begrenzt; zwecks höherer Flexibilität kann jedoch die o.g. gesamte Anordnung mitsamt des Schaltventils z.B. zwischen zwei im Durchfluß positionierten Zweifach-Wahlventilen ohne weiteres dupliziert werden. So kann der eine Probenschleifensatz abgearbeitet werden, während der andere Satz befüllt wird und praktisch totvolumenfrei in den Fluß geschaltet werden kann, noch bevor die letzte Schleife des ersten Satzes vollständig ausgespült worden ist.A further advantageous embodiment of the invention consists in the fact that two or more so-called sample loops of any volume are present on the measuring chamber in a certain way and can be filled manually and / or automatically by means of a sampler. The sample loops are preferably arranged in parallel between two multiple selector valves, this entire arrangement being switchable into the flow through a switching valve. The sample loops can be filled outside of the flow on the one hand independently of one another via the selector valves and on the other hand completely or only partially filled via the switching valve from their outflow end, in order, for. B. save analyte solution. After filling, the solution to the last filled sample loop is available at the interface to the flow at the switching valve without any other intermediate volume, ie without so-called dead volume. This means that the measuring chamber can be supplied with several different solutions from the individual sample loops one after the other, independently of one another and free of dead volume in the flow, and without any sample loop having to be completely rinsed out or the flow through it having to be directed into another loop. This ensures a variable, instantaneous, practically mixing-free and sample-saving gradual change in concentration. It can also in each case the concentration of the analyte in the solution in the measuring chamber is kept constant in the first approximation in order to prevent depletion. A solution of different concentration is preferably present in each sample loop in order to be able to carry out measurements with different concentrations directly one after the other or to obtain an intermediate concentration between the values in the individual sample loops through the targeted control of sample loops. The number of sample loops is practically not limited; However, for the sake of greater flexibility, the entire arrangement mentioned above, including the switching valve, can easily be duplicated, for example, between two double selector valves positioned in the flow. In this way, one set of sample loops can be processed while the other set is being filled and can be switched into the river with practically no dead volume before the last loop of the first set has been completely rinsed out.

Eine Ausgestaltungsmöglichkeit der Probenaufgabe z.B. in einem Durchfluß- Meßsystem ist in Figur 1 wiedergegeben, die im folgenden beschrieben ist.A design option for the sample application e.g. in a flow measuring system is shown in Figure 1, which is described below.

Mit Ausnahme der Pumpe 30, die z.B. eine Spritzenpumpe oder eine peristaltische Pumpe sein kann, symbolisieren alle übrigen Kreise Ventile, die wie hier beschrieben ausgelegt sein können. Die Ventile 1 und 11 sind Schaltventile, mit denen je nach Schaltung der beiden Schaltpositionen die entsprechenden Ein- bzw. Auslässe der Ventile verbunden werden; wobei in Figur 1 die aktuellen Verbindungen fett gezeichnet dargestellt sind und die alternativen Verbindungen gestrichelt. Die Ventile 4, 8, 14, 18, 28 und wenn gewünscht auch 21 , 22, 33 und 39 sind Wahlventile, mit denen ein zentraler Anschluß, der mit normaler Linienbreite dargestellt ist, mit einem von beliebig vielen anderen Anschlüssen verbunden werden kann. Die Ventile 21 , 22, 33 und 39 sind hier beispielhaft als Zweifach-Wahlventile gezeigt. Alle Ventilpositionen können manuell oder automatisch und auch vorprogrammiert mit z.B. elektrischem oder Druck-Antrieb gestellt werden. Alle Ventile sind vorzugsweise im Typ der in der Chromatographie verwendeten Drehventile ausgelegt, z.B. in volumenarmer Mikroausführung, können aber auch z.B. als Magnetventile ausgelegt werden. 36 ist eine beliebig dimensionierbare Temperierungs-Kapillare, 37 ist die Interaktions-Detektionseinheit, kurz Detektor, z.B. vom Typ eines Affinitäts- Biosensors. Alle mit normaler durchgezogener Linie angezeigten Verbindungen bestehen aus Kapillaren, gefertigt z.B. aus Tefzel, PE, PEEK oder Edelstahl, mit beliebigen Dimensionen bezüglich Innendurchmesser / Außendurchmesser / Länge, z.B. 1 mm / V-ι₆ " / 0,5 m für die Verbindung 31. Eine beliebige Lösung, aus Vorräten 25 bis 27 oder folgenden n ausgewählt, wird mittels der Pumpe 30 über Ventil 33 entweder für Waschzwecke in den Abfall 43 oder durch den Detektor 37 gepumpt und über Ventil 39 in den Abfall 43 geleitet. Aus dem Detektor 37 ausgespülte Lösungen von weiterem Interesse können über das Ventil 39 im Sammler 41 gesammelt, in mehreren Gefäßen n fraktioniert aufgefangen oder mit anderen Techniken, z.B. Massenspektrometrie, direkt gekoppelt werden. Die in C enthaltenen Komponenten, mit Strich-Punkt umrahmt, können gemeinsam temperiert werden, z.B. mittels eines hier nicht gezeigten Peltier-Elementes.With the exception of the pump 30, which can be a syringe pump or a peristaltic pump, for example, all other circles symbolize valves, which can be designed as described here. Valves 1 and 11 are switching valves with which the corresponding inlets and outlets of the valves are connected, depending on the switching of the two switching positions; the current connections are shown in bold in FIG. 1 and the alternative connections are shown in dashed lines. The valves 4, 8, 14, 18, 28 and if desired also 21, 22, 33 and 39 are selector valves with which a central connection, which is shown with a normal line width, can be connected to any of any number of other connections. The valves 21, 22, 33 and 39 are shown here by way of example as double selector valves. All valve positions can be set manually or automatically and also pre-programmed with, for example, an electric or pressure actuator. All valves are preferably designed in the type of rotary valves used in chromatography, for example in a low-volume micro design, but can also be designed, for example, as solenoid valves. 36 is an arbitrarily dimensionable tempering capillary, 37 is the interaction detection unit, or detector for short, for example of the type of an affinity biosensor. All connections shown with normal solid lines consist of capillaries, for example made of Tefzel, PE, PEEK or stainless steel, with any dimensions with regard to inside diameter / outside diameter / length, for example 1 mm / V-ι ₆ "/ 0.5 m for connection 31. Any solution, from stocks 25 to 27 or the following n is selected, pump 30 pumps valve 33 into waste 43 either for washing purposes or through detector 37 and valve 39 leads into waste 43. Solutions of further interest that are flushed out of detector 37 can also be used the valve 39 is collected in the collector 41, fractionally collected in several vessels or directly coupled with other techniques, for example mass spectrometry The components contained in C, framed with a dash dot, can be tempered together, for example by means of a Peltier (not shown here) item generated.

Das erfindungsgemäß Besondere dieses Teils ist die Art der Probenaufgabe, die für eine repetitive Probenaufgabe und besonders für die Multischritt-Kinetik von Vorteil ist. Die Komponenten 1 bis 10 sind als Probenaufgabe A zusammengefaßt und über Ventil 1 entweder direkt in Verbindung 31 oder beliebig oft dupliziert über die Ventile 21 und 22 in die Verbindungen 31/32 einschaltbar; dargestellt ist hier eine Duplizierung von A, mit analoger Probenaufgabe B zusammengefaßt. In A befindet sich Ventil 1 in der Position Ladung für die Probenschleifen 5 bis 7, die über Probeneinlaß 2 entweder manuell oder mittels eines Probengebers automatisch mit beliebigen Lösungen, d.h. auch mit Analytlösungen jeweils fallender Konzentration, befüllt werden können, wobei die verdrängten Lösungen in Abfall 10 gespült werden. Minimal-Voiumina, z.B. für Mikro- oder Test-Analysen, lassen sich realisieren, indem lediglich Verbindung 3 teilweise befüllt wird. Theoretisch unbegrenzte Maximal- Volumina einer Lösung, z.B. für sogenannte Präparationen mit besonders großen Sensoroberflächen, lassen sich realisieren, indem alle Probenschleifen mit derselben Lösung befüllt werden.The special feature of this part according to the invention is the type of sample application which is advantageous for repetitive sample application and especially for multi-step kinetics. Components 1 to 10 are combined as sample task A and can be switched on via valve 1 either directly in connection 31 or duplicated as often as required via valves 21 and 22 in connections 31/32; shown here is a duplication of A, combined with analog sample task B. In A, valve 1 is in the charge position for sample loops 5 through 7, which can be fed through sample inlet 2 either manually or with a sampler automatically with any solutions, i.e. can also be filled with analyte solutions of decreasing concentration, the displaced solutions being flushed into waste 10. Minimal voiumina, e.g. for micro or test analyzes can be realized by only partially filling connection 3. Theoretically unlimited maximum volumes of a solution, e.g. For so-called preparations with particularly large sensor surfaces, all sample loops can be filled with the same solution.

Nach jeweils synchronem Schalten der Ventile 4 und 8 können die Probenschleifen 5 bis 7 nacheinander und unabhängig voneinander sowie jeweils vollständig oder zwecks Proben-Ersparnis nur teilweise befüllt werden, und zwar in jedem Fall "rückwärts", d.h. von ihrer späteren Auslaßseite her. Damit ist gewährleistet, daß, nach dem Schalten von Ventil 1 in die Position Fluß, an die Verbindung 24a totvolumenfrei die Lösung der letzten Befüllung ansteht und sich daran nach zeitlich beliebigem, schrittweisen und jeweils synchronen Schalten der Ventile 4 und 8 übergangslos und unabhängig voneinander die Lösungen der anderen Probenschleifen auf den Detektor 37 beaufschlagen lassen. Diese Beaufschlagung ist in B gezeigt, wo sich die Komponenten11 bis 20 spiegelbildlich zu A in Position Fluß befinden. Durch bevorzugt synchrones Schalten der Ventile 1 , 11 , 21 und 22 können A und B wechselseitig in Position Fluß bzw. Ladung umgeschaltet werden, so daß sich A im Fluß befindet, während B befüllt wird bzw. umgekehrt. Alle Verbindungskapillaren und Schleifen... 3, 9, 13, 19, 23a,b, 24a,b, 29, 31 , 32, 34, 35, 38, 40, 42 und 5, 6, 7, 15, 16, 17 können je nach Anwendung in ihren Dimensionen besonders optimiert ausgelegt werden. In 24a und/oder 24b befindet sich normalerweise Spül- oder sogenannter Lauf-Puffer vom letzten Spül- oder Analysengang. Bei Bedarf können diese Verbindungskapillaren auch höhervolumiger ausgestaltet werden, um nach der Beaufschlagung der Lösungen aus B bzw. A und der gleichzeitigen Umschaltung der Lösungen aus A bzw. B in die Position Fluß zunächst eine Wasch- oder Dissoziationsphase in dem Detektor 37 durchzuführen, deren Dauer durch das Volumen von 24a bzw. 24b und der Flußrate bestimmt wird, was je nach Anwendung von Interesse sein kann. Die Anordnung ist darüber hinaus offen für die Positionierung weiterer Ventile und/oder Pumpen zwecks Waschung / Spülung beliebiger Abschnitte oder zwecks Einbringung weiterer Lösungen. So können z.B. B und/oder weitere Duplikate von B über Ventil 11 wahlweise z.B. in die Verbindungen 3, 5, 6, 7 oder 32 positioniert werden.After each synchronous switching of the valves 4 and 8, the sample loops 5 to 7 can be filled one after the other and independently of one another and in each case completely or for the purpose of saving samples, and in any case "backwards", ie from their later outlet side. This ensures that, after switching valve 1 into the flow position, the connection 24a is free of dead volume and the solution of the last filling is present Any, step-by-step and synchronous switching of the valves 4 and 8 let the solutions of the other sample loops act on the detector 37 independently and independently of one another. This application is shown in B, where components 11 to 20 are mirror images of A in the flow position. By preferably synchronously switching the valves 1, 11, 21 and 22, A and B can be alternately switched to the flow or charge position, so that A is in the flow while B is being filled or vice versa. All connecting capillaries and loops ... 3, 9, 13, 19, 23a, b, 24a, b, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 40, 42 and 5, 6, 7, 15, 16, 17 Depending on the application, their dimensions can be particularly optimized. 24a and / or 24b normally contains rinsing or so-called running buffers from the last rinsing or analysis cycle. If required, these connecting capillaries can also be designed with a higher volume in order to carry out a washing or dissociation phase in the detector 37 after the loading of the solutions from B or A and the simultaneous switching of the solutions from A or B into the position flow, the duration of which is determined by the volume of 24a or 24b and the flow rate, which may be of interest depending on the application. The arrangement is also open for the positioning of further valves and / or pumps for the washing / flushing of any section or for the introduction of further solutions. For example, B and / or further duplicates of B can optionally be positioned, for example, in connections 3, 5, 6, 7 or 32 via valve 11.

Desweiteren wird durch ein häufiges Schalten bestimmter, je nach Anwendung unterschiedlicher Ventile, eine Mischung von Lösungen ermöglicht, bei Bedarf auch durch Installation eines Flußteilers z.B. in Verbindung 31 anstelle von oder zusätzlich zu Ventil 21 und/oder einer sogenannten Mikro-Mischkammer z.B. in Verbindung 32 anstelle von oder zusätzlich zu Ventil 22. Diese Anordnung ergibt insgesamt eine größtmögliche Flexibilität der Lösungs-Beaufschlagung auf die Meßzelle. Ein Mischen der Vorräte 25 bis 27 oder mehr kann auch durch häufiges Schalten von Ventil 28 erreicht werden. Für Lösungen, die temperatursensitiv sind, können alle oder nur Teile der in C enthaltenen Komponenten, exklusive z.B. der in D enthaltenen mit Strich-Punkt-Punkt umrahmten Komponenten, gesondert temperiert werden, während die z.B. in D enthaltenen Komponenten ihrerseits gesondert auf eine Arbeitstemperatur temperiert werden. Index-ListeFurthermore, a frequent switching of certain, depending on the application of different valves, enables a mixture of solutions, if necessary also by installing a flow divider e.g. in connection 31 instead of or in addition to valve 21 and / or a so-called micro-mixing chamber e.g. in connection 32 instead of or in addition to valve 22. Overall, this arrangement provides the greatest possible flexibility in the application of the solution to the measuring cell. Mixing the stocks 25 to 27 or more can also be accomplished by switching valve 28 frequently. For solutions that are temperature sensitive, all or only parts of the components contained in C, excluding, for example, the components contained in D with dash-dot-dot, can be separately tempered, while the components contained in D, for their part, are separately tempered to a working temperature become. Index list

ass Assoziation diss Dissoziation i i-ter Schritt st jeweiliger Startwert einer Assoziation oder Dissoziation eq jeweiliger Gleichgewichtswert einer Assoziation oder Dissoziation net Netto k_on Exponentialkoeffizient bei Assoziation k_off Exponentialkoeffizient bei Dissoziation ass association diss dissociation i ith step st respective start value of an association or dissociation eq respective equilibrium value of an association or dissociation net net k _on exponential coefficient with association k _off exponential coefficient with dissociation

Claims

Patentansprüche claims

1. Analytisches Mess- und Auswerteverfahren für molekulare Interaktionen von chemischen Gleichgewichts-Bindungspaaren oder -Bindungssystemen, wobei1. Analytical measurement and evaluation method for molecular interactions of chemical equilibrium binding pairs or binding systems, whereby

Assoziations- und/oder Dissoziationskurven aufgenommen werden, und wobei ein erster Bindungspartner („Ligand") mit einem in Lösung befindlichen zweitenAssociation and / or dissociation curves are recorded, and wherein a first binding partner ("ligand") with a second one in solution

Bindungsparter („Analyt") versetzt wird, der mit dem Liganden reversibel unterBinding partner ("analyte") is added, which is reversible with the ligand

Komplexbildung reagiert, die zeitliche Entwicklung der Komplexbildung sowie deren dcι(LA) Änderung (et (LA); — - — -) erfaßt und der Reaktionsverlauf in 1. Näherung mit einer dt exponentiell verlaufenden Funktion R(t) mit einem Exponenten k^' _on oder k^' _off ,die aufComplex formation reacts, the temporal development of the complex formation and its dcι (LA) change (et (LA); - - - -) recorded and the course of the reaction in a 1st approximation with a dt exponential function R (t) with an exponent k ^' _on or k ^' _off that on

einen Gleichgewichtswert R^' _eq zuläuft, beschrieben wird, wobei — — die dtan equilibrium value R ^' _eq approaches, is described, wherein - - the German

Assoziations- oder Dissoziationsrate des Analyten am Liganden angibt, dadurch gekennzeichnet, daß zu bestimmten Zeitpunkten tj die Konzentration c« (A) einmal oder mehrmals schrittweise erhöht oder erniedrigt wird, und aus den jeweiligen Differenzen zwischen den Gleichgewichtswerten R'e_q,_aSs,i und R'_st,as_s,i oder den Differenzen zwischen den Werten R'_eq,diss,i und R'_st,dιss,i und den jeweiligen Exponenten k^' _on,ι oder k^' ₀ff,, die jeweiligen initialen Assoziations- oder Dissoziationsraten und aus diesen Raten die jeweilige, Assoziations- oder Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante k_ass oder k_dιSs ermittelt werden.Association or dissociation rate of the analyte on the ligand, characterized in that at certain points in time tj the concentration c «(A) is increased or decreased stepwise once or several times, and from the respective differences between the equilibrium values R'e _q , _aS s, i and R ' _s t, as _s , i or the differences between the values R' _eq , diss, i and R ' _s t, dιss, i and the respective exponents k ^' _on , ι or k ^' ₀ ff ,, die respective initial association or dissociation rates and from these rates the respective association or dissociation rate constant k _ass or k _{dιSs are} determined.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung der Konzentration zur Halbwertszeit der Funktion Rj(t) erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the change in concentration at the half-life of the function Rj (t) takes place.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die initiale Assoziations- oder Dissoziationsrate aus einer linearen Beziehung zwischen ^^- und R(t) oder (R(t)- R_st(t)) ermittelt wird. dt 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the initial association or dissociation rate is determined from a linear relationship between ^^ - and R (t) or (R (t) - R _st (t)). dt

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ermittlung der initialen Raten unter der Annahme idealer Bedingungen erfolgt, insbesondere der Annahme, daß bei der Assoziation keine Analytverarmung und bei der Dissoziation keine Analytanreicherung erfolgt.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determination of the initial rates takes place under the assumption of ideal conditions, in particular the assumption that there is no analyte depletion in the association and no analyte enrichment in the dissociation.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die unbekannte Analytkonzentration Co(A) zu Beginn der Reaktion ermittelt wird.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the unknown analyte concentration Co (A) is determined at the beginning of the reaction.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante k_diss aus den initialen Assoziationsraten und den jeweiligen Assoziationsgieichgewichtswerten der Funktion R(t) und die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante k_ass aus den initialen Dissoziationsraten und den jeweiligen Dissoziationsgleichgewichtswerten der Funktion R(t) erhalten wird.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the dissociation rate constant k _diss from the initial association rates and the respective association equilibrium values of the function R (t) and the association rate constant k _ass from the initial dissociation rates and the respective dissociation equilibrium values of the function R (t) is obtained.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit an sich bekannten Affinitätsbiosensoren und/oder Array-Systemen in Lösung und/oder zeitaufgelösten ELISA - oder RIA-Techniken oder anderen festphasengestützten Systemen durchgeführt wird.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method is carried out with known affinity biosensors and / or array systems in solution and / or time-resolved ELISA - or RIA techniques or other solid-phase-based systems.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß in einem Küvettensystem die Konzentration der Lösung in der Meßkammer durch kontinuierliche Entnahme eines Teils der Lösung und Zugabe einer Lösung mit einer entsprechenden Konzentration über eine oder mehrere Kanülen während des Assoziations- oder Dissoziationsvorgangs im wesentlichen konstant gehalten wird. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in a cuvette system the concentration of the solution in the measuring chamber by continuously removing part of the solution and adding a solution with a corresponding concentration over one or more cannulas during the association or dissociation process essentially is kept constant.

9. Verfahren nach nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß im Falle von jeweils im wesentlichen konstanter Analytkonzentration bei Mehr-Schritt- Analysen die Werte für k_ass und k_di_SS aus der Beziehung zwischen k'_on und der Analytstartkonzentration ermittelt werden.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in the case of essentially constant analyte concentration in multi-step analyzes, the values for k _ass and k _d i _{SS are determined} from the relationship between k ' _on and the analyte start concentration.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß bei konstanter Konzentration der Lösung in der Meßkammer derjenige c₀(A)-Wert bestimmt wird, bei dem sich die Assoziationskurve oder ein Abschnitt davon mit der Dissoziationskurve oder einem Abschnitt davon im goldenen Schnitt des gesamten oder des jeweiligen Teilwerts des Assoziationswertes schneidet.10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that at constant concentration of the solution in the measuring chamber that c ₀ (A) value is determined at which the association curve or a section thereof with the dissociation curve or a section thereof in a golden ratio of all or part of the association value.

11.Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration in der Meßkammer mehrmals schrittweise geändert wird, und die jeweiligen Startkonzentrationen des Analyten ermittelt werden.11. The method according to claim 10, characterized in that the concentration in the measuring chamber is changed several times step by step, and the respective starting concentrations of the analyte are determined.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante k_ass aus der Beziehung zwischen k^' _on und der Analytgleichgewichtskonzentration und die Dissoziationsgeschwindigkeits- konstante kd_iSs aus der Beziehung zwischen k^' _off und dem Gleichgewichtswert der Funktion R(t) bei der Dissoziation ermittelt wird. 12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the association rate constant k _ass from the relationship between k ^' _on and the analyte equilibrium concentration and the dissociation rate constant kd _iS s from the relationship between k ^' _of f and the equilibrium value of the function R (t ) is determined during the dissociation.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Sensoroberfläche zur Bindung des in Lösung befindlichen Analyten am Liganden, mit einer Meßkammer auf der Sensoroberfläche, die mit dem Analyt in Lösung befüllt ist, mit jeweils einer Kanüle zur Zugabe und/oder Herausnahme der Lösung und/oder einer Spülflüssigkeit, mit einer Vorrichtung zur Durchmischung der Lösung in der Meßkammer dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungen in der Meßkammer zumindest teilweise in vorbestimmter Menge instantan mehrmals gegen Lösungen anderer Konzentration austauschbar sind, wobei das Volumen der Lösung im wesentlichen konstant gehalten ist.13. Device for performing the method according to one of the preceding claims, with a sensor surface for binding the analyte in solution to the ligand, with a measuring chamber on the sensor surface which is filled with the analyte in solution, each with a cannula for addition and / or removal of the solution and / or a rinsing liquid, with a device for mixing the solution in the measuring chamber, characterized in that the solutions in the measuring chamber are instantly interchangeable at least partially in a predetermined amount for solutions of different concentration, the volume of the solution essentially is kept constant.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Austausch der Lösungen in der Meßkammer über eine oder mehrere Kanülen erfolgt, insbesondere eine Kanüle die Lösung entnimmt und eine andere Kanüle eine neue Lösung zugibt.14. The apparatus according to claim 13, characterized in that the exchange of solutions in the measuring chamber via one or more cannulas, in particular one cannula takes the solution and another cannula adds a new solution.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanülen getrennt an der Meßkammer angeordnet sind oder die eine koaxial innerhalb der anderen.15. The apparatus according to claim 13 or 14, characterized in that the cannulas are arranged separately on the measuring chamber or one coaxially within the other.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Pumpen zur Dosierung der Menge der auszutauschenden Lösungen an den Kanülen vorgesehen sind, insbesondere Schlauchpumpen, Spritzenpumpen oder piezoelektrische Pumpen.16. The device according to one of claims 13 to 15, characterized in that one or more pumps are provided for metering the amount of the solutions to be exchanged on the cannulas, in particular peristaltic pumps, syringe pumps or piezoelectric pumps.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß über mehrere Kanülen die Lösung in der Meßkammer durch zumindest teilweise Absaugung und wieder Zugabe in die Meßkammer durchmischt wird, insbesondere mindestens 1μl/min umgewälzt wird. 17. The device according to any one of claims 13 to 16, characterized in that the solution in the measuring chamber is mixed through at least partial suction and again added to the measuring chamber, in particular at least 1μl / min, is circulated over several cannulas.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Probenschleifen vorhanden sind und ihr Inhalt entgegen seiner18. Device according to one of claims 13 to 17, characterized in that several sample loops are present and their content contrary to it

Befüllrichtung und unabhängig in die Meßkammer einbringbar ist, insbesondere daß die Probenschleifen mit jeweils unterschiedlichen Lösungen befüllt sind. Filling direction and can be introduced independently into the measuring chamber, in particular that the sample loops are filled with different solutions.