WO2001055724A1

WO2001055724A1 - Method for quantitating autoimmune disease antibody and quantification reagent and quantification kit therefor

Info

Publication number: WO2001055724A1
Application number: PCT/JP2000/000394
Authority: WO
Inventors: Tatsuyuki Hachisu; Masaaki Kojima; Tadahiro Kikukawa
Original assignee: Shibayagi Co., Ltd
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2001-08-02

Abstract

An autoimmune disease antibody assay system which comprises administering a candidate for a drug or a candidate for a functional food to an autoimmune disease test animal and expressing an autoimmune disease antibody (a rheumatoid factor in serum, an autoantibody, etc.) level by using a standard antibody curve. Use of this assay system makes it possible to easily and efficiently quantitate an antibody (a rheumatoid factor in serum, an autoantibody, etc.) in the serum of an animal to which a candidate for a drug or a candidate for a functional food is administered.

Description

明細書自己免疫疾患抗体定量方法およびその定量用試薬ならびに定量用キッ卜技術分野 Description Method for quantification of autoimmune disease antibody, reagent for quantification thereof, and kit for quantification

本発明は、新規な制菌ならびに殺菌用組成物およびその使用方法に関し、更に詳細には、制菌作用を有する物質同士を混合することによって殺菌作用を示すことができる制菌ならびに殺菌用組成物であって、飲食品などに対して直接添加しても安全であるばかりでなく、食器類、厨房用具や、トイレまわりの洗浄用などにも、または抗菌卜などとしても安全に使用することができる制菌ならびに殺菌用組成物およびその使用方法に関するものである。背景技術 The present invention relates to a novel bacteriostatic and bactericidal composition and a method for using the same, and more particularly to a bacteriostatic and bactericidal composition capable of exhibiting a bactericidal action by mixing substances having a bacteriostatic action. It is not only safe to add directly to foods and drinks, but also safe for dishes, kitchen utensils, cleaning around toilets, and antibacterial bottles. The present invention relates to a bacteriostatic and bactericidal composition that can be used and a method for using the same. Background art

自己免疫疾患には多岐な症例があり、主たる疾患例として甲状腺の自己免疫疾患、 S L E (全身性エリ卜テマトーデス）、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、自己免疫性血液疾患等がある。一般には、同一個体內で自己抗原に対する免疫応答は抑制されているが、免疫疾患では異常なリンパ系組織の増生が起こり、免疫応答が異常になり、自己抗原と反応する自己抗体が検出される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫応答が原因となって起こる疾患であるが、成因については不明な点が多いため、機序解明が待たれている。 There are a wide variety of autoimmune diseases, the main examples being autoimmune diseases of the thyroid gland, SLE (systemic erythrothematosus), rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, autoimmunity Sexual blood disease. In general, the same individual は suppresses the immune response to the autoantigen in the same individual.However, in an immune disease, abnormal lymphocyte tissue hyperplasia occurs, the immune response becomes abnormal, and the autoreactor reacts with the autoantigen. Autoantibodies are detected. Autoimmune diseases are diseases caused by the immune response to autoantigens. However, the etiology of the autoimmune disease remains unclear, and elucidation of the mechanism is awaited.

そこで、ヒ卜と同様な自己免疫疾患を自然発症する実験動物や、人ェ的に炎症を発症させたマウス · ラットを使用して自己免疫疾患の機序解明の研究が今日進められている。発明の開示 Therefore, research on the elucidation of the mechanism of autoimmune diseases using experimental animals that naturally develop autoimmune diseases similar to humans and mouse rats that have artificially developed inflammation has been carried out today. Is underway. Disclosure of the invention

この発明は、自己免疫疾患動物に薬物候補または機能性食品候補を投与して、投与された動物の血清中のリゥマチ因子や自己抗体などの抗体量を定量することを目的としている。 An object of the present invention is to administer a drug candidate or a functional food candidate to an autoimmune disease animal and quantify the amount of an antibody such as a rheumatoid factor or an autoantibody in the serum of the administered animal. ing.

更に詳細には、この発明は、実験動物の血清中のリゥマチ因子ゃ自己抗体を定量することができる自己免疫疾患抗体定量方法を提供することを目的としている。つまり、この発明は、投与された動物の血清中のリゥマチ因子や自己抗体などの抗体量を、標準抗体曲線を使用して数値化をすることができる自己免疫疾患抗体測定系を提供することを目的としている。 More specifically, an object of the present invention is to provide an autoimmune disease antibody quantification method capable of quantifying a rheumatoid factor autoantibody in the serum of a laboratory animal. . In other words, the present invention relates to an autoimmune disease antibody capable of quantifying the amount of an antibody such as a rheumatoid factor or an autoantibody in the serum of an administered animal using a standard antibody curve. It is intended to provide a measurement system.

また、この発明は、実験動物の自己免疫疾患抗体定量方法に使用することができる定量用試薬を提供することを目的としている。 Another object of the present invention is to provide a quantification reagent that can be used in a method for quantifying an autoimmune disease antibody in a laboratory animal.

更に、この発明は実験動物の自己免疫疾患抗体定量用キッ卜を提供することを目的としている。 Further, it is an object of the present invention to provide a kit for quantifying autoimmune disease antibodies in experimental animals.

この発明の上記目的を達成するために、この発明は、 1 つの態様として、自己免疫疾患抗体定量方法を提供する。 In order to achieve the above object of the present invention, the present invention provides, as one aspect, a method for quantifying an antibody in an autoimmune disease.

更に詳細には、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法は、ヒ卜を除く哺乳動物の自己免疫疾患動物の自己免疫疾患抗体定量用試薬を使用することを特徴とする。 More specifically, the method for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention is characterized by using a reagent for quantifying an autoimmune disease antibody in a mammalian autoimmune disease animal excluding a human.

この発明の好ましい実施態様においては、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法において、該自己免疫疾患抗体定量用試薬として、マウスリゥマチ因子定量用試薬またはマウス自己抗体定量用試薬を使用することを特徴とする。 In a preferred embodiment of the present invention, in the method for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention, the autoimmune disease antibody quantification reagent includes a mouse rheumatoid factor quantification reagent or a mouse autoimmune disease quantification reagent. It is characterized by using a reagent for quantifying the self antibody.

この発明の更に好ましい実施態様においては、該マウスリゥマチ因子定量用試薬として、マウス I g G型リウマチ因子定量用試薬またはマウス I _g M型リウマチ因子定量用試薬を使用すること。また、該自己抗体定量用試薬として、抗マウス一本鎖（ s i n g l e s t r a n d ) D N A定量用試薬または抗マウス二本鎖（ d o u b 1 e s t r a n d ) D N A定量用試薬を使用することを特徴とする。 In a further preferred correct implementation of the invention in this, as a該Ma mortar Li Umachi factor quantitative reagent, Ma U scan I g G type rheumatism factor quantitative reagent or mouse I _g M type rheumatism factor quantitatively Use reagents for In addition, the self It is characterized in that a reagent for quantifying anti-mouse single-strand (singlestrand) DNA or a reagent for quantifying anti-mouse double-strand (doub 1 estrand) DNA is used as the reagent for quantifying the self-antibody.

更にまた、この発明の好ましい実施態様においては、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法において、自己免疫疾患動物に薬物候補または機能性食品候補を投与して、投与された動物の血清中のリゥマチ因子ゃ自己抗体などの自己免疫疾患抗体量を定量するに当たって、かかる自己免疫疾患抗体量の標準抗体曲線を作成し、抗体値を数値化することを特徴とする。 Furthermore, in a preferred embodiment of the present invention, in the method for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention, a drug candidate or a functional food candidate is administered to an autoimmune disease animal, and In quantifying the amount of autoimmune disease antibodies such as rheumatoid factor autoantibodies in serum, a standard antibody curve for the amount of autoimmune disease antibodies is created and the antibody values are quantified. And

この発明は、別の態様として、上記自己免疫疾患抗体定量方法に使用することができる自己免疫疾患抗体定量用試薬を提供する。 In another aspect, the present invention provides a reagent for quantifying an autoimmune disease antibody, which can be used in the method for quantifying an autoimmune disease antibody.

この発明の好ましい実施態様においては、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量用試薬として、マウスリゥマチ因子定量用試薬またはマウス自己抗体定量用試薬を提供している。 In a preferred embodiment of the present invention, a reagent for quantifying a mouse rheumatoid factor or a reagent for quantifying a mouse autoantibody is provided as the reagent for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention. I have.

この発明の更に好ましい実施態様においては、上記マウスリゥマチ因子定量用試薬がマウス I g G型リゥマチ因子定量用試薬またはマウス I g M型リウマチ因子定量用試薬であること、また、上記マウス自己抗体定量用試薬がマウス抗 s s D N A定量用試薬またはマウス抗 d s D N A定量用試薬であることを特徴とする。 In a further preferred embodiment of the present invention, the reagent for quantifying a mouse rheumatoid factor is a reagent for quantifying a mouse Ig G type rheumatoid factor or a reagent for quantifying a mouse Ig M type rheumatoid factor. Also, the mouse autoantibody quantification reagent is a mouse anti-ssDNA quantification reagent or a mouse anti-ds DNA quantification reagent.

この発明は、更に別の態様として、上記自己免疫疾患抗体定量方法に使用することができる自己免疫疾患抗体定量用キットを提供する。この発明の好ましい実施態様においては、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量用キッ卜が、ィムノグロブリン分画固相化プレー卜と、マウス自己抗体検出用標識抗体（第二抗体）と、標準抗体と、標識物発色物質と、発色反応停止剤とからなるマウス自己免疫疾患抗体定量用キット、または、マウス抗ニ本鎖 D N A固相化プレート、マウス自己抗体検出用標識抗体（第二抗体）と、標準抗体と、標識物発色物質と、発色反応停止剤とからなるマウス自己抗体定量用キットであることを特徴とする。 In another aspect, the present invention provides a kit for quantifying an autoimmune disease antibody, which can be used in the above-described method for quantifying an autoimmune disease antibody. In a preferred embodiment of the present invention, the kit for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention comprises an immoglobulin fraction-immobilized plate, and a mouse for detecting a mouse autoantibody. Mouse consisting of a labeled antibody (second antibody), a standard antibody, a labeling substance, a coloring substance, and a coloring reaction terminator Kit for quantifying antibodies for autoimmune diseases, or mouse anti-double-stranded DNA solid phase Plate, mouse It is characterized in that it is a mouse autoantibody quantification kit comprising a labeled antibody for detection of self-antibody (second antibody), a standard antibody, a label-forming substance, and a coloring reaction terminator.

この発明の更に好ましい実施態様においては、上記自己免疫疾患抗体定量用キッ卜がマウス I g G型リゥマチ因子，マウス I g M型リゥマチ因子，マウス抗 s s D N A, マウス抗 d s D N A抗体定量用 E L I S Aキッ卜であることを特徴とする。 In a further preferred embodiment of the present invention, the kit for quantifying an antibody for an autoimmune disease is a mouse IgG type rheumatoid factor, a mouse IgM type rheumatoid factor, a mouse anti-ssDNA, a mouse anti-ssDNA. It is an ELISA kit for anti-ds DNA antibody quantification.

この発明のその他の目的、特長ならびに利点は、添付図面を参照した下記明細書の記載により明白となろう„ 図面の簡単な説明 Other objects, features, and advantages of the present invention will become apparent from the following description with reference to the accompanying drawings. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

図 1 は、マウス I g G型リウマチ因子並びに I g M型リウマチ因子定量用標準抗体曲線を示す。 FIG. 1 shows a standard antibody curve for quantification of mouse IgG type rheumatoid factor and Ig M type rheumatoid factor.

図 2 は、マウス抗 d s D N A定量用標準抗体曲線を示す。発明を実施するための最良の形態 FIG. 2 shows a standard antibody curve for quantification of mouse anti-dsDNA. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

この発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法は、自己免疫疾患動物に薬物候補または機能性食品候補を投与して、投与された動物の血清中のリゥマチ因子や自己抗体などの抗体量を定量するに当たって、標準抗体曲線を作成し、抗体値を数値化することから構成されている。なお、この発明において使用される実験動物、実験試薬、実験方法などは、従来から自己免疫疾患動物に薬物候補または機能性食品候補を投与して抗体を産生するために慣用されているものと変わらないので、当業者であれば熟知されているので、ここでは明細書の記载を簡略にするために記載を省略することにする。 An autoimmune disease antibody quantification method according to the present invention comprises administering a drug candidate or a functional food candidate to an autoimmune disease animal, and measuring the amount of antibody such as rheumatoid factor or autoantibody in the serum of the administered animal. In quantifying the antibody, a standard antibody curve is created and the antibody value is quantified. The experimental animals, experimental reagents, experimental methods, and the like used in the present invention are those conventionally used to produce antibodies by administering drug candidates or functional food candidates to autoimmune disease animals. Since the description does not change, those skilled in the art are familiar with the description, and the description is omitted here to simplify the description of the specification.

次に、自己免疫疾患抗体定量方法に使用する標準抗体曲線について記載する。 Next, the standard antibody curve used for autoimmune disease antibody quantification Describe.

例えば、マウス I g G型リゥマチ因子定量用 E L I S A キットを使用する自己免疫疾患抗体定量方法において、標準抗体曲線用の抗体としては、 2 0週令時の M R L / i p r マウス 2 匹以上から採血した血清を混ぜて使用する。ポジティブ抗体の各希釈系列を作り希釈標準品毎にュニットを決め、各希釈標準抗体を U Vで測定し、その O D値を得ることにより標準抗体曲線を作成することができる。つまり、図 1 に示すように、標準抗体曲線は、縦軸に測定試薬の O D値を、また横軸に抗体価（ユニット表示）を表示することにより作成することができる。この標準抗体曲線より検体の抗体価を決めることができるので、検体の抗体価を検体別に数値化ができる。したがって、施設間での薬理試験の比較をすることが可能となり、例えばリユーマチ薬理試験の評価としても有用である。 For example, in an autoimmune disease antibody quantification method using an ELISA kit for quantification of a mouse IgG type R rheumatoid factor, an antibody for a standard antibody curve is an MRL / ipr mouse at the age of 20 weeks. Mix the sera collected from two or more animals. A standard antibody curve can be created by creating a dilution series for each positive antibody, determining a unit for each dilution standard, measuring each diluted standard antibody with UV, and obtaining its OD value. it can. In other words, as shown in Fig. 1, a standard antibody curve is created by displaying the OD value of the measurement reagent on the vertical axis and the antibody titer (unit display) on the horizontal axis. I can do it. Since the antibody titer of the sample can be determined from the standard antibody curve, the antibody titer of the sample can be quantified for each sample. This makes it possible to compare pharmacological tests between facilities, and is useful, for example, in the evaluation of rheumatic pharmacological tests.

この発明を実施例により更に詳細に説明する。 The present invention will be described in more detail with reference to examples.

実施例 1 ：標準抗体の作製 Example 1: Preparation of standard antibody

M R L / i p r マウス（日本チヤ一ルスリバ一株式会社製）、 d\ 2 0週令時 3 0 匹から全血採血を行い、定法により血清を分離した。分離した血清をさらに純度を上げる為に遠心分離（ 1 0， 000 G、 3 0 分）して、 0. 22 / mフィルターろ過した。希釈液を用い 1 0倍に希釈し標準抗体溶液とした。 1 0倍に希釈した標準抗体溶液をさらに希釈液で 6段階に希釈して 7濃度の標準曲線作製用標準抗体とした。 Whole blood was collected from 30 MRL / ip r mice (manufactured by Nippon Charls River Co., Ltd.) at d \ 20 weeks of age, and serum was separated by a standard method. The separated serum was centrifuged (10,000 G, 30 minutes) to further increase the purity, and filtered through a 0.22 / m filter. It was diluted 10-fold with a diluent to obtain a standard antibody solution. The 10-fold diluted standard antibody solution was further diluted in 6 steps with a diluent to obtain a standard antibody for preparing a standard curve having 7 concentrations.

また、 1 0倍希釈前の血清中の生化学検査を行い 2 次標準抗体作製の基礎資料とした。 In addition, a serum biochemical test before 10-fold dilution was performed and used as basic data for preparation of a secondary standard antibody.

実施例 2 ：マウス I g G型リゥマチ因子定量用標準抗体曲線の作製とシクロホスフアミド投与試験結果。 Example 2: Preparation of standard antibody curve for quantification of mouse IgG type R rheumatoid factor and results of cyclophosphamide administration test.

ィムノグロブリン分画固相化 9 6 ゥエルプレートを洗浄液（ツイ一ン 2 0 ) で 3 回洗浄した。各サンプルと、実施例 1 で得た標準抗体とを 1 0 0 // 1 づっ生理的食塩水に添加し、この溶液を各ゥエルに添加して、プレートを室温で所定時間反応させた。その後、洗浄液で 3 回洗浄した。次いで、 H R P c o n j u g a t e d抗マウス I g Gを各ゥエルに対して 1 0 0 μ 1 づっ添加して、室温で所定時間反応させた。反応後、各ゥエルを洗浄液で 3 回洗浄した。洗浄後、更に、テトラメチルベンチジン（ Τ Μ Β ) +基質一クロモーゲンを各ゥエルに対して 1 0 0 1 づっ添加して、室温で 2 0 分間反応させた。次いで、反応停止液（ 1 Ν硫酸）を各ゥエルに 1 0 0 μ 1 づっ添加して、反応を停止させた。各ゥエルの反応液を 4 5 0 n m / 6 0 0 n mの吸光度を測定して、それぞれのグループのマウス血清中 I g G型リウマチ因子量の平均値を得た。 Immobilize iminoglobulin fraction on solid phase 96 Washed three times with 20). Each sample and the standard antibody obtained in Example 1 were added to physiological saline in a ratio of 100 // 1 and this solution was added to each well, and the plate was allowed to react at room temperature for a predetermined time. . Then, it was washed three times with the washing solution. Next, 100 μl of HRP conjugated anti-mouse IgG was added to each well and allowed to react at room temperature for a predetermined time. After the reaction, each well was washed three times with a washing solution. After washing, tetramethyltilbenzidine (Τ Τ +) + substrate chromogen was added in a quantity of 1001 to each well, and reacted at room temperature for 20 minutes. Next, a reaction stop solution (1 停止 sulfuric acid) was added to each well at 100 μl to stop the reaction. The absorbance of the reaction solution in each well was measured at 450 nm / 600 nm to obtain the average value of the amount of IgG type rheumatoid factor in the mouse serum of each group.

抗炎症物質として認知されているシクロホスフアミド（和光純薬株式会社製コード番号； 034 12951 ) 投与試験は、 M R L / i p r マウス (日本チヤ一ルスリバ一株式会社製）、、 1 2 匹、 8週令から週 1 回 2 5 m g / k g を皮下投与（ l m g / 0 . 5 m l 生理食塩水）し、 2 0 週令時のマウス I g G型リゥマチ因子の定量測定を行った。 Cyclophosphamide (code number: 034-12951, a product of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is recognized as an anti-inflammatory substance, was administered in MRL / ipr mouse (Nippon Chills River, Inc.). ), 12 animals, subcutaneously administered 25 mg / kg (lmg / 0.5 ml physiological saline) once a week from the age of 8 weeks, and the mouse IgG G type rheumatism at the age of 20 weeks. Factors were quantitatively measured.

その結果は次の通りである。 The results are as follows.

M R Lマウス（ 2 0週令）にシクロホスフアミド（ 2 5 m g Z K g ) 投与試験結果 R F— I g Gのュニット換算値 Cyclophosphamide (25 mg ZK g) administration test results to MRL mouse (20 weeks old) RF—unit value of IgG

平均値 ― (mU) Average value-(mU)

0. 6 7 2 7 8 0 0.6 6 7 2 7 8 0

実施例 3 ：マウス I g M型リウマチ因子定量用標準抗体曲線の作製とシクロホスフアミド投与試験結果（図 1 参照）。 Example 3: Preparation of standard antibody curve for quantification of mouse Ig M type M rheumatoid factor and results of cyclophosphamide administration test (see Fig. 1).

ィムノグロブリン分画固相化 9 6 ゥエルプレートを洗浄液（ツイ一ン 2 0 ) で 3 回洗浄した。各サンプルと、実施例 1 で得た標準抗体とを 1 0 0 μ 1 づっ生理的食塩水に添加し、この溶液を各ゥエルに添加して、プレートを室温で所定時間反応させた。その後、洗浄液で 3 回洗浄した。次いで、 H R P c o n j u g a t e d抗マウス I g Mを各ゥエルに対して 1 0 0 z 1 づっ添加して、室温で所定時間反応させた。反応後、各ゥエルを洗浄液で 3 回洗浄した。洗浄後、更に、テトラメチルベンチジン（ T M B ) +基質一クロモーゲンを各ゥエルに対して 1 0 0 1 づっ添加して、室温で 2 0分間反応させた。次いで、反応停止液（ 1 Ν硫酸）を各ゥエルに 1 0 0 μ 1 づっ添加して、反応を停止させた。各ゥエルの反応液を 4 5 0 n m/ 6 0 0 n mの吸光度を測定して、それぞれのグループのマウス血清中 I g M型リゥマチ因子量の平均値を得た。 The immobilized 96-ml plate was washed three times with a washing solution (Twin 20). Each sample and 100 μl of the standard antibody obtained in Example 1 were added to physiological saline, and this solution was added to each well, and the plate was allowed to react at room temperature for a predetermined time. Then, it was washed three times with the washing solution. Next, HRPconjugatted anti-mouse IgM was added to each well at a rate of 100 z1 and reacted at room temperature for a predetermined time. After the reaction, each well was washed three times with a washing solution. After washing, tetramethyltilbenzidine (TMB) + substrate-chromogen was added to each well in a quantity of 1001, and reacted at room temperature for 20 minutes. Next, a reaction stop solution (1Ν sulfuric acid) was added to each well in an amount of 100 μl to stop the reaction. The absorbance of the reaction solution in each well was measured at 450 nm / 600 nm, and the average value of the IgM-type rheumatoid factor in mouse serum of each group was obtained.

抗炎症物質として認知されているシクロホスフアミド（和光純薬株式会社製コード番号； 034-12951) 投与試験は、 M R L / i p r マウス（日本チヤ一ルスリバ一株式会社製）、、 1 2 匹、 8週令から週 1 回 2 5 m g / k g を皮下投与（lm g Z O . 5 m l 生理食塩水）し、 2 0週令時のマウス I g M型リゥマチ因子の定量測定を行った。 Cyclophosphamide (code number: 034-12951, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is recognized as an anti-inflammatory substance, was administered in MRL / ipr mice (Japan 12 mice, 25 mg / kg once a week (8 mg ZO. 5 ml saline) administered once a week from the age of 8 weeks.定量 Quantitative measurement of gusset factor was performed.

その結果は次の通りである。表 2 The results are as follows. Table 2

M R L マウス（ 2 0週令）にシクロホスフアミド（ 2 5 m g Z K g ) 投与試験結果 Cyclophosphamide (25 mg ZKg) administration test results to MRL mice (20 weeks old)

R F — I g M のユニット換算値 R F — Unit value of Ig M

平均値 (mU) Average value (mU)

0 . 6 5 2 3 1 3 0. 6 5 2 3 1 3

実施例 4 ：マウス抗 d s D N A定量用標準抗体曲線の作成（図 2参照 d s D N A分画固相化 9 6 ゥエルプレー卜を洗浄液（ツイーン 2 0 ) で 3 回洗浄した。各サンプルと、実施例 1 で得た標準抗体とを 1 0 0 μ 1 づっ生理的食塩水に添加し、この溶液を各ゥエルに添加して、プレ— トを室温で所定時間反応させた。その後、洗浄液で 3 回洗浄した。次いで、 H R P c o n j u g a t e d 抗マウス I g Mを各ゥエルに対して 1 0 0 μ 1 づっ添加して、室温で所定時間反応させた。反応後、各ゥエルを洗浄液で 3 回洗浄した。洗浄後、更に、テトラメチルベンチジン（ Τ Μ Β ) +基質一クロモーゲンを各ウエノレに対して 1 0 0 μ 1 づっ添加して、室温で 2 0分間反応させた。次いで、反応停止液（ 1 Ν硫酸）を各ゥエルに 1 0 Ο μ ΐ づっ添加して、反応を停止させた。各ゥエルの反応液を 4 5 0 n m / 6 0 0 n mの吸光度を測定して、それぞれのグループのマウス血清中抗 d s D N A量の平均値を得た。 Example 4: Preparation of a standard antibody curve for mouse anti-ds DNA quantification (see FIG. 2) A 96-ml plate with immobilized ds DNA fraction was washed three times with a washing solution (Tween 20). 100 μl of the standard antibody obtained in Example 1 was added to physiological saline, this solution was added to each well, and the plate was allowed to react at room temperature for a predetermined time. After washing three times with the washing solution, HRP conjugated anti-mouse IgM was added to each well in a volume of 100 μl, and the mixture was reacted at room temperature for a predetermined time. After washing, add tetramethyl benzylbenzidine (Τ Μ Β) + substrate chromogen (100 μl / well) to each well, and react at room temperature for 20 minutes. Next, add 10 µl of a reaction stop solution (1 µsulfuric acid) to each well. The reaction solution in each well was measured for absorbance at 450 nm / 600 nm to obtain the average amount of anti-ds DNA in mouse serum of each group. Was.

その結果は次の通りである。表 3 The results are as follows. Table 3

実施例 5 ：

Example 5:

マウス I g G型リゥマチ因子定量用 E L I S Aキットは次の構成からなっている。 The ELISA kit for mouse IgG type R rheumatoid factor quantification has the following composition.

ィムノグロブリン分画固相 9 6 ゥエルプレート： 1 枚 Imnoglobulin fractionated solid phase 96 6 ゥ el plate: 1 piece

マウス自己抗体検出用酵素標識抗体（第二抗体）： Mouse Enzyme-labeled antibody for detection of self-antibody (second antibody):

2 0 μ \ Ζ本、 1 本 2 0 μ \ Ζ, 1

マウス I g G型リゥマチ因子標準抗体： Mouse Ig type G rheumatoid factor standard antibody:

6 ( 7 ) 濃度、 5 0 0 1 本、 1 本 6 (7) concentration, 500 1 bottle, 1 bottle

標識物発色物質（T M B ) : I S m l Z本、 1 本 Labeling substance (T M B): I S ml Z, 1

発色反応停止剤（ 1 N硫酸）： 1 2 m l /本、 1 本 Coloring reaction terminator (1N sulfuric acid): 12 ml / bottle, 1 bottle

検体希釈液（ P B S系）： 5 0 ( 6 0 ) m l /本、 1 本 9 6 ゥエルプレート洗浄溶液： 5 0 m l Z本、 1 本 Sample diluent (PBS system): 50 (60) ml / bottle, 1 bottle 96 ゥ Elplate washing solution: 50 ml Z, 1 bottle

実施例 6 ： Example 6:

マウス抗 d s D N A定量用 E L I S Aキットは次の構成からなっている。 The mouse anti-dsDNA quantification ELISA kit has the following composition.

d s D N A固相 9 6 ゥエルプレート： 1 枚 d s D N A Solid phase 9 6 ゥ El plate: 1 piece

マウス自己抗体検出用酵素標識抗体（第二抗体）： Mouse Enzyme-labeled antibody for detection of autoantibody (second antibody):

2 0 μ 1 /本、 1 本 20 μ 1 / book, 1 book

マウス d s D N A標準抗体： Mouse dsDNA standard antibody:

6 ( 7 ) 濃度、 5 0 0 μ 1 Ζ本、 1 本標識物発色物質（ TM B ) : 1 2 m l /本、 1 本 6 (7) Concentration, 500 μl 1 bottle, 1 bottle Labeled substance (TMB): 12 ml / bottle, 1 bottle

発色反応停止剤（ 1 N硫酸）： 1 2 m l / 本、 1 本 Coloring reaction terminator (1 N sulfuric acid): 12 ml / bottle, 1 bottle

検体希釈液（ P B S系）： 5 0 ( 6 0 ) m l Z本、 1 本 Sample diluent (PBS system): 50 (60) ml Z, 1

9 6 ゥエルプレート洗浄溶液： 5 0 m l Z本、 1 本 9 6 ゥ El plate cleaning solution: 50 ml Z, 1

実施例 7 ：酵素標識抗体の作製 Example 7: Preparation of enzyme-labeled antibody

抗マウス I g G ( H + L ) ャギ血清を P r o t e i _n G で精製し、得られた抗マウス I g G ( H + L ) ャギ I g G を H R P (ホースラデッシュぺロォキシダーゼ）で常法に従って標識すると、抗マウス I g G ( H + L ) ャギ I g G— H R P が得られた。マウス血清中の非特異物質を除去するために常法に従って精製して、酵素標識抗体を作製した。発明の効果 The anti-mouse I g G (H + L) turbocharger formic serum was purified by P rotei _n G, resulting anti-mouse I g G (H + L) turbocharger formic I g G a HRP (Horse La Defense Mesh Perot Oxidase) to give anti-mouse IgG (H + L) goat IgG—HRP. Purification was performed according to a conventional method to remove non-specific substances from mouse serum, and an enzyme-labeled antibody was prepared. The invention's effect

前述したように、この発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法は、ヒトを除く哺乳動物の自己免疫疾患動物の自己免疫疾患抗体定量用試薬、例えば、マウス I g G型リウマチ因子定量用試薬またはマウス I g M 型リゥマチ因子定量用試薬などのマウスリゥマチ因子定量用試薬。または、マウス抗 s s D N A定量用試薬またはマウス抗 d s D N A定量用試薬などのマウス自己抗体定量用試薬などを使用して、標準抗体曲線を用いて自己免疫疾患抗体量を比較定量することができるようになつている。したがって、自己免疫疾患抗体量を数値化できるので、実験施設間での数値の変動を無くしたりまたは少なくすることができるので、自己免疫疾患の薬理実験を客観的に判断できるという利点がある。 As described above, the method for quantifying an autoimmune disease antibody according to the present invention includes a reagent for quantifying an autoimmune disease antibody in a mammal with an autoimmune disease excluding human, such as mouse IgG G Rheumatoid factor quantification reagents, such as rheumatoid factor quantification reagents or mouse Ig M type rheumatoid factor quantification reagents. Alternatively, using a mouse autoantibody quantification reagent such as a mouse anti-ssDNA quantification reagent or a mouse anti-dsDNA quantification reagent, the amount of autoimmune disease antibody is determined using a standard antibody curve. This allows for comparative quantification. Therefore, since the amount of autoimmune disease antibody can be quantified, it is possible to eliminate or reduce the fluctuation of the value between laboratories, and objectively judge the pharmacological experiment for autoimmune disease. It has the advantage of being able to do so.

前述した自己免疫疾患抗体定量方法に使用できる定量用試薬ならびに定量用キットは、上記のような効果の他に、上記定量方法を簡便でかつ効率よく実施するのに極めて有効である。 The quantification reagents and quantification kits that can be used in the above-described autoimmune disease antibody quantification method have the effects described above, and are simple to use. It is extremely effective for efficient implementation.

前述したような構成からなるこの発明に係る自己免疫疾患抗体定量方法およびその定量用試薬ならびに定量用キットは、例えば、 A N A 抗体， R N P抗体、 S m抗体、 S c l — 7 0抗体、ミトコンドリア抗体、好中球細胞質抗体、平滑筋抗体骨格筋抗体、胃壁細胞抗体、表皮成分自己抗体、下垂体抗体、カルジォリピン抗体、 3 3 —八 1¾ 0抗体、 s s — B / L a 抗体、】 0 — 1 抗体、セントロメァ抗体、 D N A 抗体、サイログロブリン抗体、副腎皮質抗体、リボゾーム抗体などのヒトを除く哺乳動物の自己免疫疾患抗体の定量測定に応用することができる。 The autoimmune disease antibody quantification method and the quantification reagent and the quantification kit according to the present invention having the above-mentioned constitution include, for example, ANA antibody, RNP antibody, Sm antibody, Scl-70 antibody, Mitochondrial antibody, neutrophil cytoplasmic antibody, smooth muscle antibody, skeletal muscle antibody, gastric parietal cell antibody, epidermal component autoantibody, pituitary antibody, cardiolipin antibody, 33–80 antibody , Ss—B / La antibody,】 0-1 Antibody, centromeric antibody, DNA antibody, thyroglobulin antibody, adrenocortical antibody, ribosome antibody, etc. It can be applied to quantitative measurement of autoimmune disease antibodies.

Claims

1 請求の範囲 1 Scope of request

1 . 自己免疫疾患抗体定量方法として、ヒトを除く哺乳動物の自己免疫疾患動物の自己免疫疾患抗体定量用試薬を使用することを特徴とする自己免疫疾患抗体定量方法。 1. An autoimmune disease antibody quantification method characterized by using a reagent for quantifying autoimmune disease antibodies in mammals excluding humans, as an autoimmune disease antibody quantification method. .

2 . 請求の範囲第 1 項に記載する自己免疫疾患抗体定量方法において、前記自己免疫疾患抗体定量用試薬として、マウスリウマチ因子定量用試薬またはマウス自己抗体定量用試薬を使用することを特徴とする自己免疫疾患抗体定量方法。 2. The autoimmune disease antibody quantification method according to claim 1, wherein the autoimmune disease antibody quantification reagent is a mouse rheumatoid factor quantification reagent or a mouse autoantibody. An autoimmune disease antibody quantification method characterized by using a quantification reagent.

3 . 請求の範囲第 1 項または第 2 項に記載する自己免疫疾患抗体定量方法において、前記マウスリウマチ因子定量用試薬がマウス I g G 型リウマチ因子（ R F — I g G ) 定量用試薬またはマウス I g M型リゥマチ因子（ R F — I g M) 定量用試薬であることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量方法。 3. The method for quantifying an antibody to an autoimmune disease according to claim 1 or 2, wherein the reagent for quantifying murine rheumatoid factor is mouse Ig G-type rheumatoid factor (RF—Ig). G) An autoimmune disease antibody quantification method, characterized in that the reagent is a quantification reagent or a mouse IgM type rheumatoid factor (RF-IgM) quantification reagent.

4 . 請求の範囲第 1 項または第 2項に記载する自己免疫疾患抗体定量方法において、前記マウス自己抗体定量用試薬が抗マウス一本鎖 D N A (抗 s s D N A ) 定量用試薬または抗マウス二本鎖 D N A (抗 d s D N A ) 定量用試薬であることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量方法。 4. The method for quantifying an autoimmune disease antibody according to claim 1 or 2, wherein the mouse autoantibody quantification reagent is used for anti-mouse single-stranded DNA (anti-ssDNA) quantification. A method for quantifying an antibody to an autoimmune disease, which is a reagent for quantification of anti-mouse double-stranded DNA (anti-ds DNA).

5 . 請求の範囲第 1 項ないし第 4項のいずれか 1 項に記载する自己免疫疾患抗体定量方法において、前記自己免疫疾患抗体定量方法が標準抗体曲線を用いて比較定量することを特徴とする自己免疫疾患抗体定量方法。 5. The method for quantifying an antibody for an autoimmune disease according to any one of claims 1 to 4, wherein the method for quantifying an antibody for an autoimmune disease performs comparative quantification using a standard antibody curve. An autoimmune disease antibody quantification method characterized by the above.

6 . 自己免疫疾患抗体定量用試薬がマウスリゥマチ因子定量用試薬またはマウス自己抗体定量用試薬であることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量用試薬。 6. An autoimmune disease antibody quantification reagent, wherein the autoimmune disease antibody quantification reagent is a mouse rheumatoid factor quantification reagent or a mouse autologous antibody quantification reagent.

7 . 請求の範囲第 5項に記載する自己免疫疾患抗体定量用試薬において、前記マウスリゥマチ因子定量用試薬がマウス I g G型リゥマチ因子定量用試薬またはマウス I g M型リゥマチ因子定量用試薬であることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量用試薬。 7. The reagent for quantifying an antibody for an autoimmune disease according to claim 5, wherein the reagent for quantifying a mouse rheumatoid factor is a reagent for quantifying a mouse IgG G-type rheumatoid factor or a mouse IgM. An autoimmune disease antibody quantification reagent, characterized in that it is a reagent for quantifying rheumatoid factor.

8 . 請求の範囲第 5 項に記載する自己免疫疾患抗体定量用試薬において、前記マウス自己抗体定量用試薬がマウス抗 s s D N A定量用試薬またはマウス抗 d s D N A定量用試薬であることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量用試薬。 8. The autoimmune disease antibody quantification reagent according to claim 5, wherein the mouse autoantibody quantification reagent is a mouse anti-ssDNA quantification reagent or a mouse anti-ds DNA quantification reagent. An autoimmune disease antibody quantification reagent, which is characterized in that:

9 . ィムノグロブリン分画固相化プレートと、マウス自己抗体検出用標識抗体（第二抗体）と、標準抗体と、標識物発色物質と、発色反応停止剤とからなることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量用キット。 9. Immobilized immobilized plate for immunoglobulin fractionation, labeled antibody (second antibody) for mouse autoantibody detection, standard antibody, labeling substance, color reaction stopping agent An autoimmune disease antibody quantification kit characterized by comprising:

1 0 . 請求の範囲第 7項に記载する自己免疫疾患抗体定量用キットにおいて、前記自己免疫疾患抗体定量用キッ卜がマウス I g G型リゥマチ因子定量用 E L I S A キットであることを特徴とする自己免疫疾患抗体定量用キッ卜。 10. The kit for quantifying an autoimmune disease antibody according to claim 7, wherein the kit for quantifying an autoimmune disease antibody is used for quantifying a mouse IgG type rheumatoid factor. An autoimmune disease antibody quantification kit characterized by being an ELISA kit.

1 1 . 二本鎖 D N A固相化プレート、マウス自己抗体検出用標識抗体（第二抗体）と、標準抗体と、標識物発色物質と、発色反応停止剤とからなることを特徴とするマウス自己抗体定量用キット。 1 1. Double-stranded DNA-immobilized plate, mouse Autoantibody-detected labeled antibody (second antibody), standard antibody, labeled substance, and coloring reaction terminator A mouse autoantibody quantification kit characterized by: