WO2001038495A2 - Method for producing a thrombocyte preparation and a thrombocyte preparation - Google Patents

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WO2001038495A2
WO2001038495A2 PCT/EP2000/011390 EP0011390W WO0138495A2 WO 2001038495 A2 WO2001038495 A2 WO 2001038495A2 EP 0011390 W EP0011390 W EP 0011390W WO 0138495 A2 WO0138495 A2 WO 0138495A2
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platelets
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Lothar Kanz
Stefan Scheding
Markus Bergmann
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]

Definitions

  • the present invention relates to a method for processing a platelet preparation and a platelet preparation.
  • Platelets also called platelets, are the cellular components of the blood that are responsible for blood clotting. A lack of platelets or a sharp decrease in the usual platelet count results in an increased tendency to bleed and can cause life-threatening bleeding. Like the erythrocytes and the leukocytes, the platelets are peripheral blood cells and develop from the hematopoietic stem and progenitor cells of the bone marrow via defined bone marrow precursors. The progenitor cells of the platelets in the blood are the megakaryocytes in the bone marrow.
  • TPO thrombopoietin
  • MGDF megacaryocyte growth and development factor
  • thrombopoietin not only stimulates the production of mature platelets in vitro and in vivo, but is also the decisive growth and maturation factor for megakaryocytic precursor cells and bone marrow megakaryocytes; see Kaushansky: "The Mpl ligand. Molecular and cellular biology of the critical regulator of megacaryocyte development” in Stern Cells, Volume 12 (Supplement 1), 1994, pages 91-97.
  • TPO thrombopoietin
  • the object of the present invention is to ensure rapid regeneration of the blood formation in patients, preferably in patients treated with radiation or chemotherapy.
  • this object is achieved according to the invention in that the TPO receptors on the platelets are blocked in such a way that after transfusion of the platelet preparation, binding of the body's own TPO is reduced, preferably almost prevented.
  • the TPO receptors are saturated in vitro with a substance that binds to and blocks the TPO receptors.
  • the saturation of these receptors by substances binding to them is a very simple method which e.g. platelet preparations provided by a blood bank must e.g. prior to the transfusion, only be incubated with the corresponding substance, which in the simplest case means adding the substance to the platelet preparation and briefly incubating with gentle shaking.
  • the saturated platelets showed no differences in their aggregation behavior compared to unsaturated platelets, so that on the one hand they efficiently prevent bleeding, but on the other hand ensure that the TPO level is maintained, so that the patient forms his own platelets faster again.
  • the invention further relates to a method for treating a patient suffering from thrombopenia and / or megakaryopenia, in which a platelet preparation is transfused to increase the platelet level, before the transfusion the TPO receptors of the platelet preparation are blocked in vitro in such a way that after transfusion binding of the body's own TPO is avoided, preferably almost prevented.
  • the invention also relates to a method for the treatment of a patient exposed to radiation and / or chemotherapy, to whom a platelet preparation is administered, the TPO receptors of the platelet preparation being blocked in vitro in such a way that the binding of the body's own TPO is reduced before the platelet preparation is administered , preferably almost prevented.
  • the platelets are incubated with the substance for a certain time and the incubated platelets are then washed, if necessary, in order to at least predominantly remove unbound substance from the preparation.
  • This measure has the advantage that there is no free substance in the platelet preparation, e.g. act as an antigen and could trigger the formation of unwanted antibodies.
  • the inventors of the present application have recognized that this washing step in no way reduces the effectiveness of the blocking of the TPO receptors; after transfusion of a platelet preparation prepared in this way, no drop in the TPO level was observed.
  • a washing process following the saturation of the TPO receptors in vitro is absolutely necessary if the TPO receptors are blocked by substances that have no TPO function. Because in this case the excess sige substance block TPO receptors in vivo without signaling, which can be expected to have a negative impact on the regeneration of megakaryoses and thrombocytopoiesis.
  • washing process is not required for clinical use if the blocking of the TPO receptors by adding TPO or MGDF alone or another substance that blocks c-mpl and has TPO functions.
  • the advantage here is that the loss of platelets through the washing process (centrifugation, removal of the supernatant and resuspending the platelets) is avoided.
  • the washing step was carried out in order to prevent the expected decrease in the endogenous TPO level from being masked by excess MGDF in the platelet preparation.
  • an agonistically acting, preferably monoclonal antibody against the TPO receptor is used, as described by Deng et al .: "An agonist murine monoclonal antibody to the human c-Mpl receptor stimulates mega-caryocytopoiesis” in: Blood, Volume 92 (1998), pages 1981-1988.
  • synthetic agonists can be used which bind to the TPO receptor, such as, for example, the cytokine promegapietin from Searle R&D, Monsanto, or that from Cwirla et al .: "Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine "in: Science, volume 276 (1997), pages 1696-1699, agonist. After all, it is possible to use natural or synthetic TPO or MGDF, which is available in unlimited quantities due to the known sequence.
  • Platelets from standard platelet preparations from the applicant's blood bank were adjusted with respect to the cell number to approx. 2 ⁇ 10 ml (in PBS + 1% HSA).
  • TPO from CellGenix or MGDF from Kirin was used as the substance for blocking the TPO receptors.
  • the latter is present as PEG-rhMGDF, that is to say as a polyethylene glycol-conjugated recombinant human protein, which is essentially shortened to the receptor binding region compared to the naturally occurring TPO.
  • the supernatant was removed and frozen at -80 ° C until analysis.
  • the TPO concentration in the supernatant from Example 1 or in the plasma of patients transfused with TPO-saturated platelet preparation was determined using the human TPO immunoassay Quantikine® from R & D Systems, Minneapolis, USA. This test is based on the sandwich technique, a TPO-specific monoclonal antibody is immobilized on a test plate, whereupon the samples are placed on the test plate so that TPO present in the sample binds to the immobilized antibodies. After washing, an enzyme-linked monoclonal antibody is applied, which is also specific for TPO. After a further washing step, a substrate solution is added, whereupon a color reaction results which is proportional to the amount of bound TPO. The color development is stopped and the intensity of the color is determined as a measure of the TPO concentration.
  • the platelet preparation is washed to remove unbound TPO or MGDF.
  • the platelet preparation is centrifuged at 1400 g at room temperature for 15 minutes and the supernatant is removed.
  • the platelets are then resuspended in 5% HSA (Human Serum Albumin).
  • platelet aggregation was measured in a commercially available aggregometer.
  • the TPO concentration was measured as described in Example 2, the platelet function was measured as described in Example 4.

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Abstract

The invention relates to a method for producing a thrombocyte preparation, whereby the TPO receptors on the thrombocytes are blocked in such a way that, after transfusion of the thrombocyte preparation, a binding of bodily TPO is reduced and preferably effectively prevented.

Description

Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten und Thrombozytenpräparat Process for the preparation of a platelet preparation and platelet preparation
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten und ein Thrombozytenpräparat.The present invention relates to a method for processing a platelet preparation and a platelet preparation.
Thrombozyten, die auch Blutplättchen genannt werden, sind die zellulären Bestandteile des Blutes, die für die Blutgerinnung verantwortlich sind. Ein Fehlen der Thrombozyten oder eine starke Verringerung der üblichen Thrombozytenzahl resultiert in einer erhöhten Blutungsneigung und kann lebensbedrohliche Blutungen verursachen. Wie die Erythrozyten und die Leukozyten sind auch die Thrombozyten periphere Blutzellen und entwickeln sich über definierte Knochenmarksvorstufen aus den hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks. Die Vorläuferzellen der Thrombozyten im Blut sind die Megakaryozyten im Knochenmark.Platelets, also called platelets, are the cellular components of the blood that are responsible for blood clotting. A lack of platelets or a sharp decrease in the usual platelet count results in an increased tendency to bleed and can cause life-threatening bleeding. Like the erythrocytes and the leukocytes, the platelets are peripheral blood cells and develop from the hematopoietic stem and progenitor cells of the bone marrow via defined bone marrow precursors. The progenitor cells of the platelets in the blood are the megakaryocytes in the bone marrow.
Das zentrale Regulationshormon der Megakaryopoese und Thrombo- poese ist das Thrombopoetin (TPO) . Ein verkürztes Protein, das nur die Rezeptorbindungsregion von TPO umfaßt, wird als MGDF (megacaryocyte growth and development factor) bezeichnet. Sind die Thrombozyten im Blut vermindert, läßt sich ein erhöhter TPO-Gehalt im Blut nachweisen. Diese Erhöhung des Hormons führt dann zu einer gesteigerten Produktion der Megakaryopoese mit dem Ziel, die Blutwerte für die Thrombozyten im Normbereich zu halten.The central regulatory hormone in megakaryopoiesis and thrombopoiesis is thrombopoietin (TPO). A truncated protein that includes only the receptor binding region of TPO is called MGDF (megacaryocyte growth and development factor). If the platelets in the blood are reduced, an increased TPO content in the blood can be detected. This increase in the hormone then leads to an increased production of megakaryopoiesis with the aim of keeping the blood values for the platelets in the normal range.
Im Jahre 1994 gelang es mehreren Arbeitsgruppen, Thrombopoetin zu isolieren und zu charakterisieren; siehe z.B. Bartley et al.: "Identification and cloning of a megacaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor Mpl" in Cell, Band 77 (July 1994), Seiten 1117-1124. Mit Hilfe des daraufhin in ausreichenden Mengen verfügbaren rekombinanten Hormons konnte gezeigt werden, daß Thrombopoetin sowohl in vitro als auch in vivo nicht nur die Produktion der reifen Thrombozyten stimuliert, sondern auch der entscheidende Wachstumsund Reifungsfaktor für megakaryozytäre Vorläuferzellen und Kno- chenmarksmegakaryozyten ist; siehe Kaushansky: "The Mpl ligand. Molecular and cellular biology of the critical regulator of megacaryocyte development" in Stern Cells, Band 12 (Supplement 1), 1994, Seiten 91-97. Die Rolle des Thrombopoetins (TPO) als zentrales Regulationshormon der Megakaryozytopoese/Thrombopoese kann aufgrund der vorliegenden Daten als hinreichend belegt angesehen werden, die Mechanismen der Thrombopoetinregulation sind jedoch derzeit noch unklar. Verschiedene experimentelle Studien deuten darauf hin, daß die Höhe des Thrombopoetinspiegels durch die Masse der vorhandenen Thrombozyten bestimmt wird. So haben Mäuse, die eine Defizienz für den TPO-Rezeptor (auch c-mpl genannt) aufweisen, erniedrigte Thrombozytenzahlen bei erhöhtem TPO-Spiegel; Siehe Gurney et al . : "Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice" in Science, Band 265 (1994), Seiten 1445-1447.In 1994, several working groups succeeded in isolating and characterizing thrombopoietin; see, e.g., Bartley et al .: "Identification and cloning of a megacaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor Mpl" in Cell, Volume 77 (July 1994), pages 1117-1124. With the help of the recombinant hormone that was then available in sufficient quantities, it could be shown that thrombopoietin not only stimulates the production of mature platelets in vitro and in vivo, but is also the decisive growth and maturation factor for megakaryocytic precursor cells and bone marrow megakaryocytes; see Kaushansky: "The Mpl ligand. Molecular and cellular biology of the critical regulator of megacaryocyte development" in Stern Cells, Volume 12 (Supplement 1), 1994, pages 91-97. The role of thrombopoietin (TPO) as a central regulatory hormone in megakaryocytopoiesis / thrombopoiesis can be considered to be sufficiently proven based on the available data, but the mechanisms of thrombopoietin regulation are currently still unclear. Various experimental studies indicate that the level of thrombopoietin is determined by the mass of the platelets present. Mice that have a deficiency for the TPO receptor (also called c-mpl) have reduced platelet counts with an increased TPO level; See Gurney et al. : "Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice" in Science, volume 265 (1994), pages 1445-1447.
Filder et al.: "Regulation of thrombopoietin levels by c-mpl- mediated binding of platelets" in Blood, Band 87 (1996), Seiten 2154-2161, konnten zeigen, daß die Infusion von gewaschenen normalen, TPO-Rezeptor tragenden Thrombozyten zu einem Abfall des TPO-Spiegels führt. Kuter et al.: "The reciprocal relati- onship of thrombopoietin (c-mpl ligand) to changes in the plateless mass during busulfan-induced thrombocytopenia in the rabbit" in Blood, Band 85 (1995), Seiten 2720-2730, konnten anhand eines Chemotherapie-Modells bei Kaninchen zeigen, daß der TPO-Plasmaspiegel proportional zum Busulfan-induzierten Abfall der Thrombozytenmasse ansteigt. Weiterhin führten Thrombozyten- transfusionen bei thrombozytopenen Tieren zu einem Abfall des TPO-Spiegels.Filder et al .: "Regulation of thrombopoietin levels by c-mpl-mediated binding of platelets" in Blood, Volume 87 (1996), pages 2154-2161, were able to show that the infusion of washed normal platelets carrying TPO receptors increased leads to a drop in the TPO level. Kuter et al .: "The reciprocal relationship of thrombopoietin (c-mpl ligand) to changes in the plateless mass during busulfan-induced thrombocytopenia in the rabbit" in Blood, Volume 85 (1995), pages 2720-2730 of a chemotherapy model in rabbits show that the TPO plasma level increases in proportion to the busulfan-induced drop in platelet mass. Furthermore, platelet transfusions in thrombocytopenic animals led to a drop in the TPO level.
Zu den wichtigsten Nebenwirkungen einer Strahlen- oder Chemotherapie gehört die Schädigung des blutbildenden Systems, die u.a. in einer Reduktion der weißen Blutzellen (Leukopenie) sowie der Thrombozyten (Thrombopenie) resultiert. Bei Patienten mit stark erniedrigten Blut-Thrombozytenwerten werden daher Spender-Thrombozytenpräparate transfundiert, wobei sich durch diese Thrombozytensubstitution ernsthafte Blutungen weitgehend vermeiden lassen. Sobald sich die Blutbildung des Patienten nach der Behandlung wieder erholt hat, kann auf die Verabreichung weiterer Thrombozytenpräparate verzichtet werden. Je schneller diese Regeneration erfolgt, desto größer ist der Vorteil für die Patienten, der vor allem in verringerter Blutungsgefahr sowie einer schnelleren Entlassung aus der Krankenhausbehandlung zu sehen ist.One of the most important side effects of radiation or chemotherapy is damage to the hematopoietic system, which results, among other things, in a reduction in white blood cells (leukopenia) and thrombocytes (thrombopenia). Patients with severely reduced blood platelet counts are therefore Donor platelet preparations transfused, whereby serious bleeding can be largely avoided by this platelet substitution. As soon as the patient's blood formation has recovered after the treatment, the administration of further platelet preparations can be dispensed with. The faster this regeneration takes place, the greater the benefit for the patient, which can be seen above all in the reduced risk of bleeding and a faster discharge from hospital treatment.
Shinjo et al.: "Serum thrombopoietin levels in patients corre- late inversely with platelet counts during chemotherapy-induced thrombocytopenia" in Leukemia, Band 12 (1998), Seiten 295-300, berichten in diesem Zusammenhang, daß eine Transfusion von Thrombozyten bei chemotherapeutisch behandelten Patienten zu einem zeitweiligen Absacken des TPO-Spiegels bei gleichzeitigem Anstieg des Thrombozytenspiegels führte. Die Studie wurde an drei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durchgeführt. Die Autoren schlußfolgern aus ihren Ergebnissen, daß die TPO- Rezeptoren mit endogenem TPO des Patienten abesättigt wurden, so daß die Thrombozytenmasse direkt den Serum-TPO-Spiegel durch Rezeptor-vermittelte Adsorption reguliert.Shinjo et al .: "Serum thrombopoietin levels in patients correct inversely with platelet counts during chemotherapy-induced thrombocytopenia" in Leukemia, volume 12 (1998), pages 295-300, report in this connection that transfusion of platelets in chemotherapy treated patients led to a temporary drop in the level of TPO with a simultaneous increase in platelet levels. The study was conducted in three patients with acute myeloid leukemia. The authors conclude from their results that the TPO receptors were saturated with the patient's endogenous TPO, so that the platelet mass directly regulates the serum TPO level by receptor-mediated adsorption.
Kaushansky: "Thrombopoietin" in: The New England Journal of Me- dicine, Band 339 (1998), Seiten 746-754 beschreibt, daß TPO in vitro und in vivo die Zahl von megakaryozytischen Vorläuferzellen in vitro und in vivo erhöht und berichtet über die Verwendung von rekombinantem humanem TPO, um die Thrombozytenzahl bei Patienten zu erhöhen. Zu diesem Zweck wurde TPO unmittelbar verabreicht. Bei Patienten mit autologer Knochenmarkstransplantation konnte die Transfusion von Thrombozyten- Präparaten reduziert werden, während diese Behandlung bei Patienten mit autologer Stammzellertransplantation nicht erfolgreich war.Kaushansky: "Thrombopoietin" in: The New England Journal of Medicine, volume 339 (1998), pages 746-754 describes that TPO increases the number of megakaryocytic progenitor cells in vitro and in vivo and reports on the Use of recombinant human TPO to increase platelet counts in patients. For this purpose, TPO was administered immediately. In patients with autologous bone marrow transplantation, the transfusion of platelet Preparations were reduced while this treatment was unsuccessful in patients with autologous stem cell transplantation.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, für eine schnelle Regeneration der Blutbildung von Patienten, vorzugsweise von strahlen- oder chemotherapeutisch behandelten Patienten zu sorgen.Against this background, the object of the present invention is to ensure rapid regeneration of the blood formation in patients, preferably in patients treated with radiation or chemotherapy.
Bei dem eingangs erwähnten Verfahren zur Aufbereitung eines Präparates von Thrombozyten wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten derart blockiert werden, daß nach Transfusion des Thrombozytenpräparates eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.In the method mentioned above for the preparation of a platelet preparation, this object is achieved according to the invention in that the TPO receptors on the platelets are blocked in such a way that after transfusion of the platelet preparation, binding of the body's own TPO is reduced, preferably almost prevented.
Bei dem eingangs erwähnten Thrombozytenpräparat wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten blockiert sind.In the case of the platelet preparation mentioned at the outset, this object is achieved according to the invention in that the TPO receptors on the platelets are blocked.
Während die bisher in der Literatur beschriebenen Ansätze zur Unterstützung der Regeneration der Blutbildung unmittelbar z.B. durch subkutane oder intravenöse Infusion von TPO auf den Patientenorganismus direkt einwirkten, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung erkannt, daß im Gegenteil eine Vorbehandlung des Thrombozytenpräparates nebenwirkungsfrei zu dem gewünschten Ergebnis führt. Die Erfinder gehen nicht etwa den auch denkbaren Weg, den Thrombopoetinspiegel in dem Patienten vor oder während der Transfusion zu erhöhen, sie verhindern vielmehr das Absacken des Thrombopoetinspiegels dadurch, daß auf den transfundierten Thrombozyten die TPO-Rezeptoren derart blockiert sind, daß körpereigenes TPO nicht mehr binden kann. Wie die Erfinder in ersten klinischen Untersuchungen zeigen konnten, kommt es bei einer Transfusion mit derart blockierten Thrombozyten zu keinerlei Absenkung des TPO-Spiegels, so daß der vorhandene TPO-Spiegel die Blutbildung begünstigen kann.While the approaches to support the regeneration of blood formation described directly in the literature, for example by subcutaneous or intravenous infusion of TPO, acted directly on the patient organism, the inventors of the present application recognized that on the contrary, pretreatment of the platelet preparation leads to the desired result without side effects , The inventors do not go about the also conceivable way to increase the thrombopoietin level in the patient before or during the transfusion, rather they prevent the thrombopoietin level from sagging in that the TPO receptors in such a way on the transfused platelets are blocked so that the body's own TPO can no longer bind. As the inventors were able to show in initial clinical studies, a transfusion with platelets blocked in this way does not result in any reduction in the TPO level, so that the TPO level present can favor blood formation.
Dabei ist es bevorzugt, wenn die TPO-Rezeptoren in vitro mit einer Substanz abgesättigt werden, die an die TPO-Rezeptoren bindet und diese blockiert.It is preferred if the TPO receptors are saturated in vitro with a substance that binds to and blocks the TPO receptors.
Obwohl grundsätzlich auch andere Verfahren zur Blockierung der TPO-Rezeptoren denkbar sind, stellt doch die Absättigung dieser Rezeptoren durch an sie bindende Substanzen ein denkbar einfaches Verfahren dar, die z.B. von einer Blutbank zur Verfügung gestellten Thrombozytenpräparate müssen z.B. vor der Transfusion lediglich mit der entsprechenden Substanz inkubiert werden, was im einfachsten Falle eine Zugabe der Substanz zu dem Thrombozytenpräparat sowie eine kurzzeitige Inkubation unter leichtem Schütteln bedeutet.Although other methods for blocking the TPO receptors are also conceivable in principle, the saturation of these receptors by substances binding to them is a very simple method which e.g. platelet preparations provided by a blood bank must e.g. prior to the transfusion, only be incubated with the corresponding substance, which in the simplest case means adding the substance to the platelet preparation and briefly incubating with gentle shaking.
Dabei ist von besonderem Vorteil, daß die abgesättigten Thrombozyten bezüglich ihres Aggregationsverhaltens keine Unterschiede zu nicht abgesättigten Thrombozyten zeigten, so daß sie einerseits effizient Blutungen verhindern, andererseits aber für den Erhalt des TPO-Spiegels sorgen, so daß der Patient schneller wieder eigene Thrombozyten bildet.It is particularly advantageous that the saturated platelets showed no differences in their aggregation behavior compared to unsaturated platelets, so that on the one hand they efficiently prevent bleeding, but on the other hand ensure that the TPO level is maintained, so that the patient forms his own platelets faster again.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Behandlung eines an Thrombopenie und/oder Mega- karyopenie leidenden Patienten, bei dem zur Erhöhung des Throm- bozyten-Spiegels ein Thrombozytenpräparat transfundiert wird, wobei vor der Transfusion die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß nach Transfusion eine Bindung von körpereigenem TPO vermieden, vorzugsweise nahezu verhindert wird.Against this background, the invention further relates to a method for treating a patient suffering from thrombopenia and / or megakaryopenia, in which a platelet preparation is transfused to increase the platelet level, before the transfusion the TPO receptors of the platelet preparation are blocked in vitro in such a way that after transfusion binding of the body's own TPO is avoided, preferably almost prevented.
Gleichfalls betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines einer Strahlen- und/oder Chemotherapie ausgesetzten Patienten, dem ein Thrombozytenpräparat verabreicht wird, wobei vor der Verabreichung des Thrombozytenpräparates die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.The invention also relates to a method for the treatment of a patient exposed to radiation and / or chemotherapy, to whom a platelet preparation is administered, the TPO receptors of the platelet preparation being blocked in vitro in such a way that the binding of the body's own TPO is reduced before the platelet preparation is administered , preferably almost prevented.
Dabei ist es dann bevorzugt, wenn die Thrombozyten für eine bestimmte Zeit mit der Substanz inkubiert und die inkubierten Thrombozyten danach ggf. gewaschen werden, um nicht-gebundene Substanz aus dem Präparat zumindest überwiegend zu entfernen.It is then preferred if the platelets are incubated with the substance for a certain time and the incubated platelets are then washed, if necessary, in order to at least predominantly remove unbound substance from the preparation.
Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, daß in dem Thrombozytenpräparat keine freie Substanz vorhanden ist, die z.B. als Anti- gen wirken und die Bildung unerwünschter Antikörper auslösen könnte. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erkannt, daß dieser Waschschritt die Wirksamkeit der Blockierung der TPO-Rezeptoren in keiner Weise vermindert, nach Transfusion eines derart aufbereiteten Thrombozytenpräparates war kein Absinken des TPO-Spiegels zu beobachten.This measure has the advantage that there is no free substance in the platelet preparation, e.g. act as an antigen and could trigger the formation of unwanted antibodies. The inventors of the present application have recognized that this washing step in no way reduces the effectiveness of the blocking of the TPO receptors; after transfusion of a platelet preparation prepared in this way, no drop in the TPO level was observed.
Ein Waschvorgang im Anschluß an die Absättigung der TPO- Rezeptoren in vitro ist unbedingt dann erforderlich, wenn die Blockade der TPO-Rezeptoren durch Substanzen erfolgt, die keine TPO-Funktion haben. Denn in diesem Falle könnte die überschüs- sige Substanz eine Blockierung von TPO-Rezeptoren in vivo ohne Signalvermittlung bewirken, wodurch ein negativer Einfluß auf die Regeneration der Megakaryo- und Thrombozytopoese zu erwarten sein kann.A washing process following the saturation of the TPO receptors in vitro is absolutely necessary if the TPO receptors are blocked by substances that have no TPO function. Because in this case the excess sige substance block TPO receptors in vivo without signaling, which can be expected to have a negative impact on the regeneration of megakaryoses and thrombocytopoiesis.
Für die klinische Anwendung ist ein Waschvorgang jedoch dann nicht erforderlich, wenn die Blockierung der TPO-Rezeptoren durch alleinige Zugabe von TPO oder MGDF oder einer anderen Substanz, die c-mpl blockiert und TPO-Funktionen hat. Dabei ist dann nämlich von Vorteil, daß der Verlust von Thrombozyten durch den Waschvorgang ( Zentrifugation, Abnahme des Überstandes und Resuspendieren der Thrombozyten) vermieden wird. Bei den bereits durchgeführten klinischen Untersuchungen (siehe unten Beispiel 5) wurde der Waschschritt jedoch durchgeführt, um eine Maskierung des erwarteten Abfalls des endogenen TPO-Spiegels durch überschüssiges MGDF im Thrombozytenpräparat zu verhindern.However, a washing process is not required for clinical use if the blocking of the TPO receptors by adding TPO or MGDF alone or another substance that blocks c-mpl and has TPO functions. The advantage here is that the loss of platelets through the washing process (centrifugation, removal of the supernatant and resuspending the platelets) is avoided. In the clinical investigations already carried out (see Example 5 below), however, the washing step was carried out in order to prevent the expected decrease in the endogenous TPO level from being masked by excess MGDF in the platelet preparation.
Als Substanz kann dabei z.B. ein agonistisch wirkender, vorzugsweise monoklonaler Antikörper gegen den TPO-Rezeptor eingesetzt werden, wie er von Deng et al.: "An agonist murine mo- noclonal antibody to the human c-Mpl receptor stimulates mega-- caryocytopoiesis" in: Blood, Band 92 (1998), Seiten 1981-1988, beschrieben wurde.As a substance, e.g. an agonistically acting, preferably monoclonal antibody against the TPO receptor is used, as described by Deng et al .: "An agonist murine monoclonal antibody to the human c-Mpl receptor stimulates mega-caryocytopoiesis" in: Blood, Volume 92 (1998), pages 1981-1988.
Darüber hinaus können synthetische Agonisten verwendet werden, die an den TPO-Rezeptor binden, wie z.B. das Cytokin Promega- poietin der Firma Searle R & D, Monsanto, oder der von Cwirla et al.: "Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine" in: Science, Band 276 (1997), Seiten 1696-1699, beschriebene Agonist. Schließlich ist es auch möglich, natürliches oder synthetisches TPO bzw. MGDF einzusetzen, das aufgrund der bekannten Sequenz in unbegrenzter Menge verfügbar ist.In addition, synthetic agonists can be used which bind to the TPO receptor, such as, for example, the cytokine promegapietin from Searle R&D, Monsanto, or that from Cwirla et al .: "Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine "in: Science, volume 276 (1997), pages 1696-1699, agonist. After all, it is possible to use natural or synthetic TPO or MGDF, which is available in unlimited quantities due to the known sequence.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.Further advantages result from the description below.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It goes without saying that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the combination indicated in each case, but also in other combinations or on their own without departing from the scope of the present invention.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und Ausführungsbeispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below on the basis of application and exemplary embodiments.
Beispiel 1: Bestimmung der Bindungskapazität für TPO in vitroExample 1: Determination of the binding capacity for TPO in vitro
Thrombozyten aus Standard-Thrombozytenpräparaten der Blutbank der Anmelderin wurden bezüglich der Zellzahl eingestellt auf ca. 2 x lOVml (in PBS + 1 % HSA) .Platelets from standard platelet preparations from the applicant's blood bank were adjusted with respect to the cell number to approx. 2 × 10 ml (in PBS + 1% HSA).
Als Substanz zur Blockierung der TPO-Rezeptoren wurde TPO der Firma CellGenix bzw. MGDF der Firma Kirin verwendet. Das letztere liegt als PEG-rhMGDF, also als Polyethylen-Glykol- konjugiertes rekombinantes humanes Protein vor, das gegenüber dem natürlich vorkommenden TPO im wesentlichen auf die Rezeptorbindungsregion verkürzt ist. Die Thrombozyten wurden nach Zugabe von 10 ng/ml TPO bzw. MGDF für eine Stunde bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Bewegen inkubiert .TPO from CellGenix or MGDF from Kirin was used as the substance for blocking the TPO receptors. The latter is present as PEG-rhMGDF, that is to say as a polyethylene glycol-conjugated recombinant human protein, which is essentially shortened to the receptor binding region compared to the naturally occurring TPO. After the addition of 10 ng / ml TPO or MGDF, the platelets were incubated for one hour at room temperature with gentle agitation.
Nach bestimmten Zeiten wurden Aliquots entnommen, die umgehend für zehn Minuten bei Raumtemperatur bei 1000 g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abgenommen und erneut für zehn Minuten bei 4°C bei 10000 g zentrifugiert.After certain times, aliquots were taken, which were immediately centrifuged for ten minutes at room temperature at 1000 g. The supernatant was removed and centrifuged again at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C.
Der Überstand wurde abgenommen und bis zur Analyse bei -80°C eingefroren.The supernatant was removed and frozen at -80 ° C until analysis.
Die Versuche zeigten, daß nach einer Stunde Inkubationszeit zwischen 50 und 60 % von 10 ng/ml TPO bzw. MGDF gebunden wurde, die TPO-Rezeptoren der Thrombozyten waren abgesättigt.The experiments showed that after an hour of incubation between 50 and 60% of 10 ng / ml TPO or MGDF was bound, the TPO receptors of the platelets were saturated.
Zusätzliches TPO konnte in einer zweiten Inkubationsrunde nicht mehr gebunden werden, wobei ferner festgestellt wurde, daß gebundenes TPO nicht wieder freigegeben wurde.Additional TPO could no longer be bound in a second round of incubation, and it was also found that bound TPO was not released again.
Beispiel 2: Bestimmung der TPO-KonzentrationExample 2: Determination of the TPO concentration
Die TPO-Konzentration im Überstand aus Beispiel 1 bzw. im Plasma von mit TPO-abgesättigtem Thrombozytenpräparat transfundierten Patienten wurde mit den humanen TPO-Immunoassay Quantiki- ne® der Firma R & D Systems, Minneapolis, USA, bestimmt. Dieser Test basiert auf der Sandwichtechnik, ein TPO-spezifischer monoklonaler Antikörper wird auf einer Testplatte immobilisiert, woraufhin die Proben auf die Testplatte gegeben werden, so daß in der Probe vorhandenes TPO an die immobilisierten Antikörper bindet. Nach dem Waschen wird ein enzymgekoppelter monoklonaler Antikörper aufgegeben, der ebenfalls spezifisch für TPO ist. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung hinzugegeben, woraufhin sich eine Farbreaktion proportional zu der Menge an gebundenem TPO ergibt. Die Farbentwicklung wird abgestoppt und die Intensität der Farbe wird als Maß für die TPO- Konzentration bestimmt.The TPO concentration in the supernatant from Example 1 or in the plasma of patients transfused with TPO-saturated platelet preparation was determined using the human TPO immunoassay Quantikine® from R & D Systems, Minneapolis, USA. This test is based on the sandwich technique, a TPO-specific monoclonal antibody is immobilized on a test plate, whereupon the samples are placed on the test plate so that TPO present in the sample binds to the immobilized antibodies. After washing, an enzyme-linked monoclonal antibody is applied, which is also specific for TPO. After a further washing step, a substrate solution is added, whereupon a color reaction results which is proportional to the amount of bound TPO. The color development is stopped and the intensity of the color is determined as a measure of the TPO concentration.
Beispiel 3: Aufbereitung von ThrombozytenpräparatenExample 3: Preparation of platelet preparations
Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden Standard-Thrombozyten- präparate mit ausreichenden Mengen (30-40 ng/ml) von TPO bzw. MGDF für eine Stunde unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur inkubiert.As described in Example 1, standard platelet preparations are incubated with sufficient amounts (30-40 ng / ml) of TPO or MGDF for one hour with gentle agitation at room temperature.
Nach der Inkubation wird das Thrombozytenpräparat gewaschen, um nicht-gebundenes TPO bzw. MGDF zu entfernen. Hierzu wird das Thrombozytenpräparat mit 1400 g bei Raumtemperatur für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Thrombozyten werden dann in 5%igem HSA (Humanes Serum Albumin) resuspendiert.After incubation, the platelet preparation is washed to remove unbound TPO or MGDF. For this purpose, the platelet preparation is centrifuged at 1400 g at room temperature for 15 minutes and the supernatant is removed. The platelets are then resuspended in 5% HSA (Human Serum Albumin).
Eine Überprüfung der TPO-Konzentration im Überstand gemäß Beispiel 2 zeigte, daß durch diesen Waschschritt kein TPO wieder entfernt wurde, die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten des Präparates sind abgesättigt und somit derart blockiert, daß körpereigenes TPO nicht mehr an diese TPO-Rezeptoren binden sollte. Beispiel 4 : Messung der ThrombozytenfunktionA check of the TPO concentration in the supernatant according to Example 2 showed that no TPO was removed by this washing step, the TPO receptors on the platelets of the preparation are saturated and thus blocked in such a way that the body's own TPO no longer binds to these TPO receptors should. Example 4: Measurement of platelet function
Als Maß für die Thrombozytenfunktion wurde die Thrombozytenag- gregation in einem handelsüblichen Aggregometer gemessen.As a measure of platelet function, platelet aggregation was measured in a commercially available aggregometer.
Beispiel 5: Klinische UntersuchungenExample 5: Clinical investigations
Die TPO-Konzentration wurde jeweils wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen, die Messung der Thrombozytenfunktion erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben.The TPO concentration was measured as described in Example 2, the platelet function was measured as described in Example 4.
Bezüglich der Thrombozytenaggregation zeigten unbehandelte sowie abgesättigte Thrombozyten keine Unterschiede.Regarding platelet aggregation, untreated and saturated platelets showed no differences.
Bei Patienten, denen unbehandelte Thrombozytenpräparate verabreicht wurden, nahm die Zahl der zirkulierenden Thrombozyten nach einer Stunde ca. um das 3-fache und nach drei Stunden ca. um das 2,5-fache zu, wobei die TPO-Plasmaspiegel signifikant auf ca. 70 % (einer Stunde) bzw. ca. 85 % (drei Stunden) der Vortransfusionswerte absank. Vergleichbare Ergebnisse zeigten sich, wenn den Patienten gewaschene (siehe Beispiel 3) aber nicht mit MGDF inkubierte Thrombozytenpräparate verabreicht wurden.In patients to whom untreated platelet preparations were administered, the number of circulating platelets increased approximately three times after one hour and approximately 2.5 times after three hours, with the TPO plasma level increasing significantly to approximately 70 % (one hour) or approx. 85% (three hours) of the pre-transfusion values decreased. Comparable results were obtained when the patients were given washed (see Example 3) but not platelet preparations incubated with MGDF.
Sechs von diesen Patienten erhielten dann bei der nächsten erforderlichen Transfusion Thrombozytenpräparationen mit abgesättigten TPO-Rezeptoren gemäß Beispiel 3. Die Zahl der zirkulierenden Thrombozyten nahm ebenfalls nach der Transfusion signifikant zu (2-fach nach einer Stunde und 2,3-fach nach drei Stunden), während die entsprechenden TPO-Plasmaspiegel unverändert blieben. Aufgrund des intraindividuellen Vergleichs konnte gezeigt werden, daß der Erhalt des TPO-Plasmaspiegels auf die Absättigung der TPO-Rezeptoren zurückzuführen ist. Six of these patients then received platelet preparations with saturated TPO receptors according to Example 3 at the next required transfusion. The number of circulating platelets also increased significantly after the transfusion (2-fold after one hour and 2.3-fold after three hours). while the corresponding TPO plasma levels remained unchanged. Based on the intraindividual comparison it could be shown that the maintenance of the TPO plasma level is due to the saturation of the TPO receptors.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Aufbreitung eines Präparates von Thrombozyten, dadurch gekennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten derart blockiert werden, daß nach Transfusion des Thrombozytenpräparates eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.1. A method for spreading a preparation of platelets, characterized in that the TPO receptors on the platelets are blocked in such a way that after transfusion of the platelet preparation, binding of the body's own TPO is reduced, preferably almost prevented.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren in vitro mit einer Substanz abgesättigt werden, die an die TPO-Rezeptoren bindet und diese blok- kiert.2. The method according to claim 1, characterized in that the TPO receptors are saturated in vitro with a substance which binds to the TPO receptors and blocks them.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper ist.3. The method according to claim 2, characterized in that the substance is an antibody, preferably a monoclonal antibody.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Agonist des TPO-Rezeptors ist.4. The method according to claim 2, characterized in that the substance is an agonist of the TPO receptor.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz natürliches oder synthetisches Thrombopoetin oder MGDF ist. 5. The method according to claim 2, characterized in that the substance is natural or synthetic thrombopoietin or MGDF.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombozyten für eine bestimmte Zeit mit der Substanz inkubiert und die inkubierten Thrombozyten dann ggf. gewaschen werden, um nicht-gebundene Substanz aus dem Präparat zumindest überwiegend zu entfernen.6. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the platelets are incubated for a certain time with the substance and the incubated platelets are then optionally washed in order to remove at least predominantly unbound substance from the preparation.
7. Thrombozytenpräparat, bei dem die TPO-Rezeptoren auf den Thrombozyten blockiert sind.7. Platelet preparation in which the TPO receptors on the platelets are blocked.
8. Thrombozytenpräparat, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufbereitet wurde.8. platelet preparation, which was prepared by the method according to any one of claims 1 to 6.
9. Verfahren zur Behandlung eines an Thrombopenie und/oder Megakaryopenie leidenden Patienten, bei dem zur Erhöhung des Thrombozytenspiegels ein Thrombozytenpräparat transfundiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Transfusion die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird.9. A method for the treatment of a patient suffering from thrombopenia and / or megakaryopenia, in which a platelet preparation is transfused to increase the platelet level, characterized in that the TPO receptors of the platelet preparation are blocked in vitro in such a way that a binding of the body's own tissue is blocked before the transfusion TPO is reduced, preferably almost prevented.
10. Verfahren zur Behandlung eines einer Strahlen- und/oder Chemotherapie ausgesetzten Patienten, bei dem dem Patienten ein Thrombozytenpräparat verabreicht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die TPO-Rezeptoren des Thrombozytenpräparates in vitro derart blockiert werden, daß eine Bindung von körpereigenem TPO vermindert, vorzugsweise nahezu verhindert wird. 10. A method for treating a patient exposed to radiation and / or chemotherapy, in which the patient is administered a platelet preparation, characterized in that the TPO receptors of the platelet preparation are blocked in vitro in such a way that binding of the body's own TPO is reduced, preferably is almost prevented.
1. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombozytenpräparat das Thrombozytenpräparat aus den Ansprüchen 7 oder 8 ist. 1. The method according to claim 9 or claim 10, characterized in that the platelet preparation is the platelet preparation from claims 7 or 8.
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