WO2001037819A2 - Utilisation de derives d'indirubine pour la fabrication de medicaments - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the subject of the invention is a new use in therapy of indirubin derivatives.
  • indirubin belongs to the indigoids family.
  • the term indigoide is used as the generic name for the dyes in the indigo group. These are bis-indoles, derived from various natural sources by fermentation, oxidation and dimerization in the presence of light.
  • CDK inhibitory properties which cause a cell cycle arrest, give these derivatives of 1 indigoids an interest in the treatment of pathologies linked to the loss of proliferation control such as cancers, psoriasis, cardiovascular diseases, infectious diseases, nephrology, neurodegenerative diseases and viral infections.
  • This kinase is an essential part of the WNT signal pathway. It is involved in multiple physiological processes: regulation of the cell cycle by controlling the levels of cyclin Dl and ⁇ -catenin, dorsoventral formation during development, action of insulin on glycogen synthesis, axonal outgrowth, neurotoxicity of HIV-1 mediated by Tat, et al.
  • GSK-3 ⁇ and CDK5 are responsible for a good part of the abnormal hyperphosphorylation of the tau protein binding microtubules as observed in the helically paired filaments in Alzheimer's disease.
  • the invention provides a solution to these problems with the use of high-efficiency indirubins with IC 50 of less than 10 ⁇ M, and more generally of the order of 5 to 50 nM, for the manufacture of GSK inhibitor drugs. -3 ⁇ .
  • R and R identical or different, represent a hydrogen atom, a halogen atom; a hydroxy group; a methylenehydroxy group; an alkyl or alkyloxy or methylenealkoxy radical, with straight or branched chain, from C1 to C18; a cycloalkyl radical having 3 to 7 carbon atoms, optionally comprising one or more heteroatornes; a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl or aryloxy radical, optionally comprising one or more heteroatoms; a mono-, di- or trialkylsilyl group having 1 to 6 carbon atoms, independently of each other, in each case, in the straight or branched chain alkyl group; a mono-, di- or triarylsilyl group, with substituted or unsubstituted aryl groups, independently of each other, in each case; a trifluoromethyl group; a -COM group; -COOM; or -CH 2 COOM, with
  • one or more atoms of one or more benzene rings are replaced by nitrogen atoms.
  • one or more aromatic or non-aromatic ring systems which may include one or more heteroatoms independently of one another, are condensed to the indirubin system.
  • the indirubin derivatives of formula (I) are linked to a polyethylene glycol ester or to a polyethylene glycol ether by bonds, respectively, ester or ether.
  • the invention relates more specifically to the indirubin derivatives having an IC 50 with respect to GSK-3 ⁇ of less than 10 ⁇ M and preferably of 1 ⁇ M, and in particular those with an IC 50 of less than 50 nM.
  • R a hydrogen atom, halogen, alkyl, -S0 3 H, -S0 2 NH 2, -S0 2 -N (CH 3) 2, -S0 2 -NC 2 H 5 - OH, - S0 2 -N- (C 2 H 5 -OH) 2 , -S0 2 -NH-CH 3 ,
  • R 4 and R 8 independently of one another: a hydrogen or halogen atom
  • R an alkyl or aryl radical, the other substituents given in formula (I) representing a hydrogen atom.
  • Derivatives of this family constituting high-efficiency GSK-3 ⁇ inhibitors with IC 50 of less than 5 ⁇ M, most generally of 1 ⁇ M, or even 50 nM, advantageously include substituents R 1 , R 3 , R 4 and R 8 with the following meanings:
  • R 1 alkyl, in particular methyl, and phenyl,
  • - R hydrogen, halogen (F, Cl, Br, I), N0 2, - S0 3 H, -S0 2 NH 2, -S0 2 -N (CH 3) 2, -S0 2 -NC 2 H 5 - 0H, -S0 2 -N- (C 2 H 5 -0H) 2 , -S0 2 -NHCH 3 ,
  • halogen in particular I or Br, the other substituents given in formula (I) representing a hydrogen atom.
  • Particularly preferred derivatives are chosen from indirubin, 5-iodo-indirubin, 5-bromo-indirubin, 5-chloro-indirubin, 5-fluoro-indirubin, 5-methyl-indirubin, 5-nitro -indirubin, 5-SO 3 H-indirubin, 5'-bromo-indirubin, 5-5 '-dibromo-indirubin or 5'-bromo-indirubin 5-sulfonic acid.
  • R 3 represents a halogen atom, in particular I, or a group -SO 3 Na.
  • the corresponding derivatives advantageously have an IC 50 with respect to GSK-3 ⁇ of less than 100 nM, and even for many of them less than 50 nM.
  • Preferred derivatives of this group are chosen from indirubin-3 '-monoxime, 5-iodo-indirubin-3' -monoxime and 5-SO 3 Na-indirubin-3 '-monoxime.
  • the derivatives defined above have already been described as inhibitors of CDKs, as well as other indigoids derived, for example, from indigo or isoindigo.
  • the indirubin derivatives also exert an inhibitory effect vis-à-vis GSK-3 ⁇ . This effect is most generally of the same order of magnitude with respect to CDKs and GSK-3 ⁇ .
  • the drugs produced in accordance with the invention using the indirubin derivatives defined above can be used for the treatment of pathologies in which GSK-3 ⁇ is involved.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors can be used as insulin mimetics. It is recalled that insulin acts by a cascade of biochemical events leading to an inhibition of GSK-3 ⁇ and that this inhibition is responsible for the response of cells to 1 insulin.
  • these drugs are of great interest for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the hyperphosphorylation of the tau protein caused by CDK5 and GSK-3 ⁇ can indeed be inhibited by the indirubin derivatives.
  • These drugs are also effective for the treatment of diseases caused by single-celled parasites such as malaria, trypanosomes, leishmanias, toxoplasmas, pneumocystis and others, or multi-cellular parasites, such as fungi and worms.
  • the active ingredients used in therapeutically effective amounts, are mixed with the pharmaceutically acceptable vehicles for the chosen mode of administration.
  • the drugs are prepared in the form of capsules, tablets, dragees, capsules, pills, drops and the like. Such drugs may contain from 1 to 100 mg of active ingredient per unit.
  • the drugs come in the form of sterile or sterilizable solutions.
  • the doses per unit of intake can vary from 1 to 50 mg of active ingredient.
  • the daily dosage is chosen so as to obtain a final concentration of at most 100 ⁇ M of derivative of 1 indirubin in the blood of the treated patient.
  • FIGS. 1 to 3 which respectively represent,
  • the elementary analyzes were carried out using an elementary analysis apparatus of CHN Perkin-Elmer 2400.
  • the spectra of RM ⁇ H were recorded at 400 MHz, of NMR 13 C at 100 MHz on a Bruker AMX apparatus. 400, with internal reference of tetramethylsilane. s denotes a singlet, d, a doublet and m, a multiplet.
  • the mass spectra were taken according to the positive ion mode under electronic impact (El 70) and with a Finingan MAT 90 device.
  • This compound is prepared as described Farb erke vorm. Meister
  • a 25% aqueous ammonia solution (5.0 ml) is cooled beforehand to 0-5 ° C before adding a sample of
  • the pads used have the following compositions:
  • Homogenization buffer - 60 mM ⁇ -glycerophosphate, 15 mM p-nitrophenylphosphate, 25 mM Mops (pH 7.2), 15 mM EGTA, 15 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1 mM sodium vanadate, 1 mM NaF, 1 mM phenylphosphate, 10 ⁇ g leupeptin / ml, 10 ⁇ g aprotinin / ml, 10 ⁇ g soybean trypsin inhibitor / ml and 100 ⁇ M benzamidine.
  • Buffer A 10 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 ⁇ g heparin / ml.
  • Buffer-C homogenization buffer, but containing 5 mM of EGTA, and devoid of NaF and protease inhibitors.
  • Tween-20 salt tris buffer 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 R.
  • Hypotonic lysis buffer 50 mM Tris-HCl ph 7.4, 120 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet-P40, 5 mM DTT, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM orthovanadate, 5 ⁇ M microcystin, 100 ⁇ g / ml of each of the following products: leupeptin, aprotinin, pepstatin.
  • HLB Hypotonic lysis buffer
  • the kinase activities were determined in buffer A or C (unless otherwise indicated), at 30 ° C, at a final ATP concentration of 15 ⁇ M.
  • the values of the blank tests were subtracted and the activities calculated in pmoles of phosphate incorporated for a 10 min incubation.
  • the values of the activities are generally expressed in% of the maximum activity, that is to say, in the absence of inhibitors.
  • Control tests were carried out using appropriate dilutions of Me 2 SO. In some cases, as indicated below, the phosphorylation of the substrates is determined by autoradiography after SDS-PAGE.
  • the GSK-3 ⁇ used is either the enzyme purified from rabbit muscle or expressed and purified from Sf9 insect cells (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem., 203: 305,311). The determinations were carried out with a 1/100 dilution in 1 mg of BSA / ml of 10 mM DTT, with 5 ⁇ l of 40 ⁇ M GS-1 as substrate, in buffer A, in the presence of 15 ⁇ M [ ⁇ 32 P ] ATP (3000 Ci / moles; 1 mCi / ml) in a final volume of 30 ⁇ l.
  • the CDK1 / cyclin B used was extracted with the aid of a homogenization buffer from oocytes of starfish (Marthasterias glacialis) and purified by affinity chromatography on p9 beads - Sepharose from oocytes of starfish (Marthasterias glacialis) and purified by affinity chromatography on p9 beads - Sepharose from oocytes of starfish (Marthasterias glacialis) and purified by affinity chromatography on p9 beads - Sepharose from
  • the kinase activity was determined in buffer C, with 1 mg of histone Hl / ml, in the presence of 15 ⁇ M of [ ⁇ 32 P] ATP
  • CDK5 / p25 was reconstituted by mixing equal amounts of recombinant mammalian CDKS and p25 expressed in E. coli as a GST fusion protein
  • Glutathione-S-transferase and purified by affinity chromatography on glutathione-agarose p25 is a truncated version of p35, the CDK5 activator of 35kDa. Its activity was determined in buffer C as described for CDKl / cyclin B.
  • Sf9 cells the Sf9 cells (InVitrogen, San Diego, CA) were cultured at 27 ° C. in a monolayer culture Grace medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), supplemented with 10% fetal bovine serum and 50 ⁇ g of gentamycin / ml and 2.5 ⁇ g of amphotericin / ml.
  • BaculoGold was obtained from PharMingen (San Diego, CA), and pVL1392 from InVitrogen.
  • Tau transfection we excised, from a bacterial expression vector pNG2 (Biernat et al., 1993, Neuron 11: 153-163) and the gene coding for htau23, the shortest human tau isoform , with Xbal and BamHI. The gene was inserted into the baculovirus transfer vector pVL1392 cut with the same endonucleases.
  • the BaculoGold system was used for the construction of the vector containing the baculovirus tau.
  • BaculoGold DNA is a modified type of baculovirus containing a lethal deletion. Co-transfection of BaculoGold DNA with a complementary baculovirus transfer vector makes it possible to recover the lethal deletion of this viral DNA and to reconstitute viable virus particles carrying the sequence coding for htau23.
  • the plasmid DNA used for the transfections was purified using QIAGEN cartridges (Hilden,
  • Sf9 cells cultured in monolayers (2 ⁇ 10 6 cells in a 60 mm cell culture vessel) were co-transfected with baculovirus DNA (0.5 ⁇ g of BaculoGold DNA) and with derivatives of pVL1392 ( 2 ⁇ g) using the calcium phosphate co-precipitation method.
  • the presence of recombinant protein was examined in infected cells 5 days after infection with SDS-
  • the Sf9 cells infected with the baculovirus expressing htau23 were treated 36 hours after infection, with 50 ⁇ M of indirubin-3 '-monoxime for 5 hours before to be collected.
  • Sf9 cells expressing htau23 were treated with 0.2 ⁇ M okadaic acid for 5 hours before harvest.
  • Sf9 cells were infected with a recombinant virus at an MOI of 1 to 5.
  • HLB hypotonic lysis buffer
  • the kinase activities were determined with an appropriate substrate (GSK-3 ⁇ : GS1 peptide; CDKs: histone Hl) in the presence of 15 ⁇ M of ATP and at increasing concentrations of the derivatives tested.
  • the IC 50 values were calculated from the dose / response curves and are given in Table 1.
  • Figures 1A to 1D give the dose-response curves for 5-iodo-indirubin-3 '-monoxime (A), 5,5'- dibromoindirubine (B), 5-sulfonic acid indirubine-3' - monoxime (C) and 1 'indirubin- 3' -monoxime (D). Inhibition of
  • GSK-3 ⁇ and CDKs is determined as indicated above.
  • the activity is expressed in% of the maximum activity (without inhibitors).
  • ATP concentrations in the reaction mixture vary from 0 to 2 ⁇ M, the concentration of GS-1 being kept constant at 6.7 ⁇ M. It is found that indirubin-3 '-monoxime acts in competition with ATP to bind.
  • the linearity of the slope in the box in the figure shows that it is a linear inhibitor.
  • FIG. 3A gives the results obtained and shows that phosphorylation is inhibited in a dose-dependent manner by 1 'indirubin-3' -monoxime, with an IC 50 around 100 nM.
  • FIG. 3B gives the% of phosphorylation of tau as a function of the concentration of indirubin-3 '-monoxine (nM).
  • K9JA pan-tau antibody recognizes all preparations containing tau.
  • AT8 and PHF1 are specific for various phosphorylated units SP or TP, namely, respectively, Ser 202; Thr 205, Thr 231; Ser 235 and Ser 396; Ser 404 (numbering in htau 40, which corresponds to the longest isoform of the human tau protein).
  • AT 100 recognizes the tau protein phosphorylee at T 212 and S214 (very specific reaction of the tau protein in Alzheimer's disease, but which also occurs in Sf9 cells, if the 2 sites are phosphorylated).
  • FIG. 3D represents the diagram of tau isoforms, epitopes recognized by antibodies and preferred phosphorylation sites: (a) htau 23, (b) htau 40, the smallest and largest of the 6 isoforms generated by the assembly alternative (residues 352 and 441).
  • the htau 23 protein lacks the N-terminal inserts and the second repeat. The repetitions are shown in gray and the adjacent regions are shaded. Some epitopes are indicated.
  • Example 4 Study of the inhibition by indirubins, in vitro and in vivo, of the phosphorylation of DARPP-32 by CDK5 / p25
  • the neural protein DARPP-32 has been identified as a physiological substrate for CDK5 / p25. DARPP-32 becomes a cAMP-dependent kinase inhibitor (PKA) when it is phosphorylated by CDK5 / p25 on Thr 75.
  • PKA cAMP-dependent kinase inhibitor
  • This protein was used as a substrate for in vitro phosphorylation by CDK5 / p25.
  • Slices of striatum from the brain of an adult mouse are prepared by operating according to standard methodology. After equilibration in a pad of oxygenated Krebs bicarbonate by continuous aeration (95% 0 2 /5% C0 2 ), the sections are treated with different concentrations of indirubin-3 '-monoxime, or with 10 ⁇ m of roscovitine for 60 min. , or are left in the Krebs bicarbonate pad for the same time. The sections are homogenized by sonication in SDS

Abstract

L'invention vise l'utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3β de dérivés d'indirubine. Application pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3β et CDK5.

Description

utilisation de dérivés d' indirubine pour la fabrication de médicaments.
L'invention a pour objet une nouvelle utilisation en thérapeutique de dérivés d' indirubine . ' indirubine appartient à la famille des indigoîdes . Le terme indigoide est utilisé comme nom générique des colorants du groupe de l'indigo. Il s'agit de bis-indoles, dérivés de diverses sources naturelles par fermentation, oxydation et dimérisation en présence de lumière.
L' indirubine (ou isoindigotine) , répond à la formule A
Figure imgf000002_0001
Elle constitue le principe actif du Danggui Longhui an, utilisé en médecine traditionnelle chinoise dans le traitement de maladies chroniques, comme les leucémies.
Dans la demande EP 98 109 854.2, dans laquelle certains des inventeurs de la demande sont co-inventeurs, on rapporte que des dérivés d' indigoîdes, parmi lesquels 1 ' indirubine et ses dérivés, sont des inhibiteurs puissants des kinases cycline- dépendantes (CDKs en abrégé) , avec des IC50 (dose inhibitrice à 50%) de 50 à 200 nM (voir également Hoessel et al . , Nature Cell Biology, vol 1, n°l, mai 1999) . Ces kinases sont des régulateurs clés du cycle cellulaire. Les inhibiteurs entrent en compétition avec 1 'ATP pour se lier à la sous-unité catalytique de la kinase .
Ces propriétés inhibitrices de CDKs, qui entraînent un arrêt du cycle cellulaire, confèrent à ces dérivés d1 indigoîdes un intérêt pour le traitement de pathologies liées à la perte du contrôle de la prolifération comme les cancers, le psoriasis, les maladies cardiovasculaires, les maladies infectieuses, la néphrologie, les maladies neurodégénératives et les infections virales.
De manière surprenante, les inventeurs ont à présent mis en évidence que, parmi ces dérivés d ' indigoîdes, seuls les dérivés d' indirubine exerçaient en outre un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique, constituée par la glycogène synthase kinase-3β ou GSK-3β en abrégé.
Cette kinase est un élément essentiel de la voie de signaux WNT. Elle est impliquée dans de multiples processus physiologiques: régulation du cycle cellulaire par contrôle de taux de cycline Dl et de β-caténine, formation dorso-ventrale durant le développement, action de l'insuline sur la synthèse de glycogène, excroissance axonale, neurotoxicité de HIV-1 à médiation par Tat, et autres.
De plus, on sait que la GSK-3β et la CDK5 sont responsables pour une bonne part de 1 ' hyperphosphorylation anormale de la protéine tau liant les microtubules comme observé dans les filaments appariés en hélice dans la maladie d'Alzheimer .
On mesure également l'intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3β pour favoriser la division cellulaire.
Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3β connus à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine.
La sélectivité du lithium n'a pas été rapportée, mais étant donné la nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, le lithium n'agit qu'à des doses considérables (IC50 autour de 10 M) . Il en est de même avec les dérivés de purine décrits dans la demande WO 98/16528, qui sont peu sélectifs et dont les IC50 sont autour de 10 μM.
L'invention apporte une solution à ces problèmes avec l'utilisation d ' indirubines de grande efficacité avec des IC50 inférieures à 10 μM, et le plus généralement de l'ordre de 5 à 50 nM, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3β.
Conformément à l'invention, pour la fabrication desdits médicaments, on utilise des dérivés d' indirubine répondant à la formule générale I :
.R1
Figure imgf000004_0001
dans laquelle R et R , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou methylenealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatornes ; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, di- ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluoromethyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe -NR 1R , dans lequel R11 et R1 , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH2-NRι:ιR12, dans lequel R11 et R présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe mêthylènesulfonate; R , R , R4, R5, R 7, R8 , R9 et R10, identiques ou di•fférents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes ; un groupe trifluoromethyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à Cl8, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes alcoxy ; un groupe -NR11R12, dans lequel
R11 et R , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe -CONR1:LR12, dans lequel R11 et R présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe sulfonamide; un groupe -S02NR1XR12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo - N=N-R , dans lequel R représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe O-glycoside ou N- glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les dissacharides; ou R et R5, et R et R , respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre; de sélénium; de tellurium; un groupe -NR 4, dans lequel R4 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate; ou -NOR14, dans lequel le groupe R 4 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.
Dans une disposition de l'invention, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.
Dans une autre disposition, un ou plusieurs systèmes cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs heteroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.
Dans encore une autre disposition, les dérivés d' indirubine de formule (I) sont liés à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.
L ' invention vise plus spécialement les dérivés d' indirubine possédant une IC50 vis-à-vis de GSK-3β inférieure à 10 μM et de préférence à 1 μM, et notamment ceux avec une IC50 inférieure à 50 nM.
De manière préférée, dans de tels dérivés, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = O ou = NOH.
Dans les familles correspondantes, les substituants R1, R3, R4 et R présentent avantageusement les significations suivantes :
R : un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -S03H, -S02NH2, -S02-N- (CH3) 2, -S02-N-C2H5-OH, - S02-N- (C2H5-OH)2, -S02-NH-CH3,
- R4 et R8, indépendamment l'un de l'autre : un atome d'hydrogène ou d'halogène,
R : un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d ' hydrogène . Dans une famille préférée selon l'invention,
X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = O.
Des dérivés de cette famille constituant des inhibiteurs de GSK-3β de grande efficacité, avec des IC50 inférieures à 5 μM, le plus généralement à 1 μM, voire à 50 nM, comprennent avantageusement des substituants R1, R3, R4 et R8 répondant aux significations suivantes :
- R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle,
- R : hydrogène, halogène (F, Cl, Br, I) , N02, - S03H, -S02NH2, -S02-N(CH3)2, -S02-N-C2H5-0H, -S02-N- (C2H5-0H) 2 , -S02-NHCH3,
-R4 et R : halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d ' hydrogène . Des dérivés particulièrement préférés sont choisis parmi 1 ' indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5-méthyl- indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-S03H-indirubine, la 5'- bromo-indirubine, la 5-5 ' -dibromo-indirubine ou l'acide 5'- bromo-indirubine 5-sulfonique.
Dans une autre famille préférée selon l'invention, X représente un groupe = NOH et Y un groupe = O.
Dans un groupe préféré de cette famille, R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe -S03Na.
Les dérivés correspondants présentent avantageusement une IC50 vis-à-vis de GSK-3β inférieure à 100 nM, et même pour nombre d'entre eux inférieure à 50 nM.
Des dérivés préférés de ce groupe sont choisis parmi 1 ' indirubine-3 ' -monoxime, la 5-iodo-indirubine-3 ' -monoxime et la 5-S03Na-indirubine-3 ' -monoxime.
Comme indiqué plus haut, les dérivés définis ci-dessus, ont déjà été décrits comme inhibiteurs des CDKs, ainsi que d'autres indigoîdes dérivés par exemple de l'indigo ou de l'isoindigo. Or de manière surprenante, seuls les dérivés d ' indirubine exercent en outre un effet inhibiteur vis-à-vis de GSK-3β. Cet effet est le plus généralement du même ordre de grandeur vis-à-vis des CDKs et de la GSK-3β.
Les médicaments fabriqués conformément à 1 ' invention en utilisant les dérivés d' indirubine définis ci-dessus sont utilisables pour le traitement des pathologies dans lesquelles la GSK-3β est impliquée.
Il en est ainsi par exemple des diabètes, où les inhibiteurs de GSK-3β sont utilisables comme insulino-mimétiques . On rappelle que l'insuline agit par une cascade d'événements biochimiques conduisant à une inhibition de la GSK-3β et que cette inhibition est responsable de la réponse des cellules à 1 ' insuline .
De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodégénératives . Comme démontré dans les exemples, l 'hyperphosphorylation de la protéine tau provoquée par CDK5 et GSK-3β peut être en effet inhibée par les dérivés d' indirubine . En administrant les médicaments fabriqués selon l'invention, il est alors possible, grâce à leur effet inhibiteur à la fois de CDK5 et de GSK-3β, d'empêcher 1 ' hyperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodégénérescence.
Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco- dépressives .
On citera également leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de GSK-3β et de CDK5, qui se traduit par 1 ' apoptose de la cellule tumorale, est avantageusement mis à profit. Ces médicaments s'avèrent également efficaces pour le traitement de maladies provoquées par des parasites unicellulaires comme la malaria, les trypanosomes, les leishmanias, les toxoplasmes, les pneumocystis et autres, ou des parasites pluricellulaires, comme les champignons et les vers.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité . Pour l'administration par voie injectable
(intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire) , les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables.
Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 μM en dérivé d1 indirubine dans le sang du patient traité.
Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages. Dans ces exemples, il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement,
- les figures 1A à 1C, les effets inhibiteurs d' indirubines utilisées selon l'invention vis-à-vis de GSK-3β , CDK5/p25 et CDKl/cycline B, - la figure 2, l'effet compétiteur avec ATP pour la fixation à GSK-3β, et
- la figure 3, l'effet inhibiteur par les indirubines, in vitro, de la phosphorylation de tau par GSK-3β. . Caractérisation des indirubines
Les analyses élémentaires ont été effectuées à l'aide d'un appareil d'analyse élémentaire de CHN Perkin-Elmer 2400. Les spectres de RM^H ont été enregistrés à 400 MHz, de RMN 13C à 100 MHz sur un appareil Bruker AMX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane . s désigne un singulet, d, un doublet et m, un multiplet. Les spectres de masse ont été pris selon le mode d'ions positifs sous impact électronique (El 70) et avec un appareil Finingan MAT 90.
. Exemples de synthèses d ' indirubines indirubine
L' indirubine est préparée selon Russell et al,
J.Am.Chem. Soc.1969, 91, 3851-3859 (méthode modifiée) en utilisant 1,76 g (12,0 mmole) d'isatine et 2,00 g (11,4 mmole) d' indoxylacétate. Après filtration, le résidu est lavé 2 fois avec du methanol, et plusieurs fois avec de l'eau froide, jusqu' à neutralité du filtrat. Le produit est séché sur KOH. On obtient 2,42 g (81,0%) de cristaux violet sombre Ry = 0,64 (acétate d'éthyle hexane l/l v/v) ; PF 341-343 °C : Hî-RMN (DMSO-d6) δ 6,91 (d, J = 8,1, C7H) , 7,02 (m, C5H et C5'H), 7,26 (m, C6H) , 7,42 (d, J = 8,1, C7'H), 7,58 (m C6'H), 7,66 (d,J" = C4'H), 8,77 (d, J = 7,7, C4H) , 11,01 (s) et 10,88 (s) (N1H et NI Η) ; 13C-RMN (DMSO -d6, 90°C) δ 106,97 (s, C3 ) , 109,57 (d,J = 162,2, C7) , 113,15 (d, J = 168,7, C7'), 119,37 (s, C3a'),121,21 (d, J = 162,1, Hz) et 121,19 (d, J = 162,1 Hz) (C5 et C5 ' ) , 121,58 (s,C3a), 124,62 (d,J = 164,6, Hz) et 124,20 (d, J = 163,8, Hz) (C6 et C4 ' ) , 129,15 {d, J = 159,8, C4), 136,85 (d, J" = 161,4, C6 ' ) , 138,48 (s, C7a) , 141,07 (s, C7a'),152,35 (s, C2 * ) , 171,11 (s, C2), 188,27 (s, C3'); MS m/e 262 (M*, 100), 234 (43), 205 (25), 131 (4) . Anal. (C16H10N2O2) C, H, N. 5-iodoindirubine On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 655 mg de 5-iodoisatine (2,40 mmole) et de 399 mg d ' indoxylacétate
(2,28 mmole, la réaction conduit à 720 mg de produit brut. Par recristallisation à partir d'éthanol, on obtient 58 mg (6,2 %) de cristaux violet sombre ; Rf = 0,68 (acétate d' éthyle/hexane
1/1 v/v) ; PF 334-335 °C : XH-RMN (DMSO-d6) δ 6,75 (d, J = 8,1, C7H) , 7,04 ;1H (m, C5'H), 7,42 (d, «7 = 8,1, C7'H), 7,57 (m, C6H et C6'H), 7,65 (d, J = 7,5, C4'H), 9,11 (s, C4H) , 11,00 (s) et 11,09 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO -d6, 90°C) δ 83,73 (d, J = 16,9, C5), 105,18 (s, C3 ) , 111,85 (d, J = 164,6, C7) , 113,43
(d,J = 167,2, C7'), 119,27 (s, C3a'), 121,65 (d,J = 163,6, C5 ' ) ,
124,03 (s, C3a) , 124,44 (d, J = 163,9, Hz, C4 ' ) , 132,49 (d, J =
171,2, C6) , 137,00 (d, J = 166,9, Hz) et 137,15 (d, J = 160,1
Hz) (C4 et C6'), 139,26 (s, C7a'), 140,44 (s,C7a), 152,41 (s, C2'), 170,48 (s,C2), 188,54 (s, C3 ' ) ; MS m/e 388 (M+, 100), 360 (3), 261 (6), 233 (16), 205 (16). Anal. (C16H9IN202) C, H, N. 5-bromoindirubine
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 1,30 g de 5-bromoisatine (5,75 mmole) et de 1,00 g d ' indoxylacétate (5,71 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et conduit à 1,16 g (59,3 %) de cristaux noirs avec une nuance violette; Rj = 0,49 (acétate d'éthyle hexane l/l v/v) : ^-RMN (DMSO-d6) δ 6,86 (d, J = 8,4, C7H) , 7,05 (pt, C5'H), 7,41- 7,31 (m, C6H et C7'H), 7,59 (m,C6'H), 7,66 (d, J ≈ 7,5, C4'H), 8,94 (s, C4H) , 11,10 (s) et 11,00 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO -d6, 90°C) δ 104,92 (s, C3), 111,24 (d,J = 165,1, C7) , 112,89 (s, C5) , 113,53 (d, J = 167,8, C7 ' ) , 118,92 (s,C3a'), 121,64 (d, " = 164,4, C5 ' ) , 123,41 (s, C3a) , 124,49 (d, J = 164,0, C4'), 126,60 (d, J = 171,3, C6) , 131,03 (d, 167,1, C4), 137,29 (d, J" = 160,9, C6'), 139,16 (s, C7a'), 139,74 (s,C7a), 152,42 (s, C2'), 170,50 (s,C2), 188,77 (s, C3 ' ) ; MS m/e 342 (M* f 100), 340 (M0 100) 314 (18), 312 (18), 261 (7). Anal. (C16H9BrN202) C, H, N. 5-chloroindirubine
On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 500 mg de
5-chloroisatine (2,75 mmole) et de 480 mg d' indoxylacétate (2,73 mmole), on obtient 766 mg (94,6 %) d'une poudre violette, R, =
0,60 (acétate d'éthyle /hexane 1/1 v/v) : Hî-RMN (DMSO-d6) δ 6,89
(d, J = 8,3, C7H) , 7,04 (m, C5'H), 7,27 (d, J = 8,3, C6'H), 7,42
(d,J = 7,8, C7'H), 7,58 (m, C6 Η) , 7,65 (d, J = 7,6, C4'H), 8,78
(s,C4H) , 10,99 (s) et 11,09 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ
104,95 (s, C3) , 110,61 (d,«7 = 164,6, C7) , 113,50 (d, J = 168,6,
C7') , 118,85 (s, C3a') , 121,54 (d, J ≈ 165,4, C5 ' ) , 122,85 (s,
C3a) , 123,76 (d, J = 170,2 Hz) et 124,41 (d, J ≈ 163,8 Hz) (C6 et C4') ,125,00 (s,C5) , 128,16 (d, " = 167,0, C4) , 137,21 (d, J =
159,8, C6') , 139,10 (s) et 139,31 (s) ( C7a et C7a ' ) , 152,39 (s,
C2') , 170,52 (s, C2) , 188,72 (s, C3 ' ) ; MS m/e 296 (M+ , 100), 268 (39), 233 (35), 205 (50) . Anal. (C16H9CIN202) C, H, N.
5-f luroroindirubine
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 500 mg de 5-fluoroisatine (3,03 mmole) et de 530 mg d' indoxylacétate
(3,00 mmole) , on obtient 776 mg (92,4 %)d'une poudre violette, Rt = 0,32 (acétate d'éthyle/ hexane 1/2 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) δ 6,87 (dd, JHιS = 8,3, JHιIt = 4,7 C7H) , 7,10-7,01 (m, C6H et C5'H) , 7,42 (d, J = 8,2, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,65 (d, J = 7,4, C4 Η) , 8,56 (d, JFfH ≈ 10,6, C4H) , 11,00 (b,NlH et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO- d6) δ 105,93 (s, C3) , 110,13 (dd,JCtH = 163,5, JC F = 8,7, C7) , 111,34 (dd, JCιlI = 169,3, JCιF = 27,6, C6) , 113,57 (d, J = 162,0, C7') , 115,24 (dd, J-C#H = 188,9, JCιF = 24,7, C4) 118,98 (s,C3a') , 121,64 (d, J = 164,2, C5 • ) , 122,41 (d, JC,F = 10,8, C3a) , 124,56 (d, J = 163,5, C4'), 137,31 (s, C7a) 137,36
(d, J = 162,8, C6'), 139,12 (s, C7a') 152,60 (s, C2 ' ) , 157,40 (d, JC<F = 233,2, C5) , 171,02 (s, C2) , 188,96 (s, C3 ' ) ; MS m/e 80 (M+ , 100), 252 (73) , 223 (32) . Anal. (C16H9FN202) C, H, N. -méthylindirubine On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 500 mg de
5-méthylisatine (3,10 mmole) et 540 mg d' indoxylacétate (3,07 mmole), on obtient 781 mg (92,0 %) d'une poudre violette, R, =
0,44 (acétate d' éthyle/hexane 1/2 v/v): ^Η-RMN (DMSO-d6) δ 2,33 (s, CH3) , 7,08-7,0 (m, C6H et C5'H), 6,79 (d, J = 7,9, C7H) , 7,42
(d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6 Η) , 7,64 (d, J = 7,6, C4'H),
8,63 (s,C4H) , 10,79 (s) et 11,00 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN
(DMSO-d6) δ 20,99 (q,J = 126,5, CH3 ) , 106,79 (s, C3) , 109,17 (d,
J = 161,3, C7) , 113,33 (d, J = 168,5, C7 ' ) , 119,94 (s, C3a') , 121,09 (d, J = 164,4 C5 ' ) 121,45 (s,C3a) , 124,19 (d, J = 163,7,
C4') , 125,11 (d, J = 164,4, C6) , 129,72 (d, J = 157,4, C4) ,
129,72 (s, C5) 136,96 (d, J = 161,6, C6 ' ) , 138,08 (s) et 138,65
(s) (C7a et C7a ' ) , 152,38(s, C2 ' ) , 171,93 (s, C2), 188,49 (s,
C3') ; MS m/e 276 (M+ , 100), 261 (10), 248 (47), 247 (53). Anal. (C17H12N202) C, H, N.
5-nitroindirubine
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 1,00 g de 5-nitroisatine (5,20 mmole) et 900 mg d ' indoxylacétate (5,14 mmole), on obtient 1,39 g (88,2 %) d'une poudre violette, Rf= 0,16 (d'éthyle acétate/hexane v/v): XH-RMN (DMSO-d6) δ 7,01 (d,
J = 8,7, C7H) , 7,05 (pt, C5'H), 7,40 (d, J ≈ 8,1, C7 ' ) , 7,58
(pt, C6-H), 7,64 (d, J = 7,5, C4'H), 8,13 (d, J = 8,7, C6H) ,
9,60 (s,C4H) , 11,15 (s) et 11,49 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN
(DMSO-d6) δ 103,51 (s, C3 ) , 109,27 (d, J = 167,8, C7) , 113,68 (d, J = 167,8, C7') , 118,83 (s, C3a') , 119,48 (d, J = 167,8 C6)
121,59 (s,C3a) , 121,97 (d, J = 163,0, C5 ' ) , 124,60 (d) et 124,69
(d) (C4 et C4') , 137,37 (d, J = 161,6, C6 • ) , 139,97 (s, C5)
136,96 (d, J = 161,6, C6 ' ) , 138, (s) et 138,65 (s, C7a'),
141,63(s, C5) , 145,71 (s, C7a) , 152,38 (s, C2 ' ) , 170,93 (s, C2) , 188,78 (s,C3') ; MS m/e 307 (M+ , 100), 276 (10) , 262 (100) , 234
(23) . Anal. (C16H9N304) C, H, N. acide indirubine- 5 -sulfoni que (sel de sodium) On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 250 mg du sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5-sulfonique (1,00 mmole) et de 170 mg d ' indoxylacétate (0,971 mmole), on obtient
258 mg (70,8 %) d'un solide violet, Rf = 0,73 (éthanol) : Hl-RMN (DMSO-d6) δ 6,84 (d, J = 8,0, C7H) , 7,04 (m, C5 Η) , 7,43 (d, J =
8,0, C7'H), 7,54-7,61 (m, C4 ' H et C6*H), 7,67 (d, J = 7,4, C6H) ,
9,13 (s,C4H) , 10,99 (s) et 11,05 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN
(DMSO-d6) δ 106,25 (s, C3 ) , 108,20 (d, J = 163,3, C7) , 113,39 (d,
J = 168,6, C7') , 120,50 (s) et 118,98 (s) (C3a et C3a') , 121,28 (d, J = 157,9 C5') 122,57
(d, J = 169, 4, C6), 124,27 (d, J = 165,6, C4 ' ) , 126,83
(d, J = 163,3, C4) , 137,02 (d, J = 161,0, C6 ' ) , 138,45 (s, C5),
140,89 (s) et 141,64 (s) (C7a et C7a'), 152,39 (s, C2 ' ) , 171,14
(s, C2) , 188,33 (s, C3 ' ) . Anal. (C16H9N2Na05S 1,5 H20) C, H, N. 5 ' -bromoindirubine
On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 59 mg d'isatine (0,40 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-indoxylacétate
(0,394 mmole), on obtient 123 mg (92,6 %) d'une poudre violette,
Rf = 0,59 (acétate d ' éthyle/hexane 1/1 v/v): ^-RMN (DMSO-d6) δ 6,89 (d, J = 7,8, C7H) , 7,02 (pt, C5H) , 7,26 (pt, C6H) , 7,39 (d,
J = 8,5, C7'H), 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), 7,76 (s,C4'H), 8,73 (d,
J = 7,8, C4H) , 10,89 (s) et 11,08 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN
(DMSO-d6) δ 107,43 (s, C3 ) , 109,54 (d, J = 161,4, C7), 112,63 (s,
C5') , 115,49 (d, J = 169,4, C7 ' ) , 120,64 (s) et 121,20 (s) (C3a et C3a') , 121,20 (d, J = 160,0 C5) 124,69 (d, J = 154,5, C6) ,
126,31 (d, J = 163,0, C4 ' ) , 129,56 (d, J" = 159,0, C4) , 137,69
(s, C7a') 138,87 (d, J = 166,1, C6 ' ) , 141,05 (s, C7a) , 151,23
(s, C21) , 170,64 (s, C2), 187,15 (s, C3 ' ) ; MS m/e 342 (M\ 100),
340 (M+, 100) , 314 (16) , 312 (16) , 261 (1) , 233 (44) . Anal. (C16H9BrN202) H, N ,C: cale, 56,3; trouvé, 55,7.
5,5' -dibromoindirubine
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 89 mg de 5-bromoisatine (0,39 mmole) et de 100 mg de 5-bromo- indoxylacétate (0,394 mmole), on obtient 154 mg (94,0 %) d'une poudre violette: hi-RMN (DMSO-d6) δ 6,84 (d, J = 8,1, C7H) , 7,42-
7,36 (m, C6H et C7'H), 7,71 (d, J ≈ 8,5, C6 Η) , 7,76 (s,C4'H),
8,88 (s, C4H) , 11,01 (s) et 11,16 (s) (N1H et Nl'H) ; MS /e 422 (M\ 47) , 420 (M*, 100) , 418 (M048), 394 (3) , 392 (7) , 390 (3) ,
342 (25) , 340 (25), 313 (15) , 311 (15) . Anal. (C16H8Br2N202) C, H,
N. acide 5 ' -bromoindirubine-5-sulfonique (sel de sodium)
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 224 mg de sel de sodium dihydrate de l'acide isatine-5-sulfonique
(0,787 mmole) et de 190 mg de 5-bromo-indoxylacétate (0, 748 mmole), on obtient 204 mg (56,9 %) d'une poudre violette: XH-RMN
(DMSO-d6) δ 6,82 (d, J = 8,0, C7H) , 7,40 (d, J = 8,5, C7 Η) , 7,55
(d, J = 8,0, C6H) , 7,73 (d, J = 8,5, C6 Η) , 7,79 (s,C4'H), 9,09 (s, C4H) , 11,11 (b,NlH et Nl'H) . Anal. (C16H8Br2N2Na05S2H20) H, N,
C: cale, 40,1 ; trouvé 39,6. indirubine-3 ' -monoxime
On prépare ce composé comme décrit Farb erke vorm. Meister
Lucius & Brùning in Hoechst a.M. Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Indirubine. DRP 283726. Le produit brut est recristallisé à partir d'éthanol/eau (7/2, v/v). On obtient le composé recherché sous forme de cristaux rouge sombre, R, = 0,55
(acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): ^-RMN (DMSO-d6) δ 6,90 (d, J
= 7,9, C7H) , 7,42 (d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J = 7,6, C7H) , 6,95 (m, C5H) , 7,03 (m,, C5'H), 7,13 (m, C6H) ,
7,41 (m, C6'H et C7 Η) , 8,24 (d, J = 7,2, C4H) , 8,65 (d, J =
7,2, C4H) 10,72 (s) et 11,73 (s) (N1H et Nl'H) , 13,48 (s, NOH) ;
13C-RMN (DMSO-d6) δ 98,88 (s, C3) , 108,91 (d, J = 162,3, C7) ,
111,52 (d, J = 165,8, C7 ' ) , 116,54 (s, C3a') , 120,43 (d, 160,2, C5') , 121, 49 (d, J = 161,6 C5) 122,66 (s,C3a) , 123,09 (d, J ≈
165,1, C6) , 125,92 (d, J = 154,0, C4) , 127,95 (d, J = 164,4,
C4-), 132,02 (d, J = 159,5, C6 ' ) , 138,34 (s, C7a) , 144,83 (s,
C7a'), 145,32 (s, C2'), 151,22 (s, C3 ' ) , 170,95 (s, C2) ; MS m/e 277 (M\ 100 %) , 260 (87 %) , 247 (24 %) , 220 (14 %) , 205 (11).
Anal. (C16H11N302 0,25 H0O) C, H, N.
5-iodoindirubine-3 ' -oxime
On opère comme décrit pour 1 ' indirubine-3 ' -monoxime . En partant de 250 mg d ' indirubine- 3 ' -monoxime (0,644 mmole) et de 175 mg de chlorhydrate d ' hydroxylamine (2,52 mmole) dans 7,5 ml de pyridine, on obtient un précipité. Le produit brut est lavé avec de l'eau et recristallisé à partir d'éthanol. On obtient 119 mg
(45,9 %) de cristaux rouge, Rf = 8,50 (d'acétate éthyle/hexane 1/1 v/v) : Hi-RMN (DMSO-d6) 6,73 (d, J = 6,7, C7H) , 7,09-7,01 (m,
C5'H), 7,44-7,40 (m, C6 , C6'H, et C7'H), 8,26 (d, J = 7,6,
C4'H), 8,90 (s, C4H) , 10,79 (s) et 11,88 (s) (N1H et Nl'H),
13,68 (s, NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 83,69 (s, C5) , 96,59 (s, C3),
110,89 (d, C7) , 111,51 (d, C7 ' ) , 116,44 (s, C3a'), 121,77 (d, C5') 125,40 (s,C3a), 127,42 (d, C4 ' ) , 130,00 (d, C6) , 131,52 (d,
C61), 133,40 (d, C4) , 137,20 (s, C7a) , 144,01 (s, C7a'), 146,68
(s, C2'), 151,52 (s, C3'), 170,25 (s, C2) ; MS m/e 403 (M+, 100),
387 (9), 373 (10), 276 (5), 260 (46). Anal. (C17H12N202) C, H, N.
6 -iodoindirubine On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 250 mg de 6-iodoisatine (0,92 mmole) et de 120 mg d' indoxylacétate (0,69 mmole), on obtient 182 mg (68,0 %) d'une poudre violette, Rf = 0,47 (acétate d' éthyle/hexane l/l v/v): XH-RMN (DMSO-d6) δ 7,01 (pt, J = 7,5, C5'H), 7,19 (s, C7H) , 7,38 (m, C5H et C7 Η) , 7,56 (pt, J = 7,3, C6'H), 7,62 (d, J = 7,6, C4'H), 8,49 (d, J = 8,3, C4H) , 10,93 (s) et 11,03 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) δ 94,60 (d, J = 10,4, C6), 105,57 (s, C3), 113,71 (d, J = 169,5, C7'), 118,05 (d, J = 167,1, C4 ' ) , 119,17 (s, C3a'), 121,24 (s,C3a), 121,65 (d, J = 163,4, C7) , 124,56 (d, J = 163,4, C5'), 126,17 (d, J = 167,1, C4) , 129,99
(d, J" = 167,5, C5), 137,29 (d, J ≈ 161,0, C6 ' ) , 139,07 (s, C7a'), 142,12 (s, C7a) , 152,56 (s, C2 ' ) , 170,70 (s, C2), 188,83 (s, C3'); MS m/e 388 (M+ , 100), 360 (9), 261 (15), 233 (53), 205 (53) , 127 (2) . Anal. (C16H9IN202) H, N. C : cale, 49,5 %; trouvé
48,5 %.
1-méthylindirubine
On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 200 mg de 1-méthylisatine (1,24 mmole) et 217 mg d1 indoxylacétate (1,24 mmole) , le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et sublimé (140°C, sous vide), on obtient 195 mg (56,9 %) de billes claires légèrement violettes violettes; Rf = 0,88 (acétate d' éthyle/hexane 3/2 v/v: XH-RMN (DMSO-d6) δ 3,29 (s, CH3) , 7,02- 7,12 (m, C5H, C7H, et C5'H), 7,35 (pt, C6H) , 7,43 (d,J = 8,3,
C7'H), 7,59 (pt, C6'H), 7,67 (d, J = 7,6, C4'H), 8,81 (d,J = 7,3,
C4H) , 11,07 (s, Nl'H) ; MS m/e 276 (M0 100) , 248 (25) , 247 (54) .
Anal. (C17H12N202) C, H, N.
1-phénylindirubine On procède comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 500 mg de 1-phénylisatine (2,24 mmole) et de 334 mg d ' indoxylacétate
(1,90 mmole), on obtient 597 mg (92,6 %) d'une poudre violette,
Rf = 0,92 (acétate d' éthyle/hexane l/l v/v) : ^Η-RMN (DMSO-d6) δ
6,83 (pt, J = 7,3, C7H) , 7,05 (pt, C5'H), 7,16 (pt, C5H) , 7,29 (pt, C6H) , 7,42 (d, J = 8,0, C7'H) , 7,53-7,48 (m) et 7,64-7,58 (m) (C6'h et 5 phényl-H, 7,69 (d, J = 7,3, C4 Η) , 8,92 (d, J 7,6, C4H) ,11,17 (s, Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 104,96 (s, C3) ,108,71 (s, C7) , 113,48 (s, C7 ' ) , 118,96 (s, C3a') , 120,80 (s, C3a) , 121,50 (d, J = 159,1, Hz) , et 122,34 (d, JC,H = 160,8, Hz), (C5 et C5 ' ) , 124,44 (d) et 124,56 (d) (C6 et C4') , 126,75 (d, J = 161,5, C3"et C5") , 127,93 (d, J = 161,5, Hz)et 128,99 (d, J = 160,8 Hz) (C4 et C4»), 129,46 (d, J =161,5, C2"et C6") , 137,18 (d, J ≈ 161,6, C6 ' ) , 139,11 (s) et 133,97 (s) (C7a' et Cl"), 141,34 (s, C7a) , 152,32 (s, C2') , 168,36 (s, C2 ) , 188,44 (s,C3!) ; MS m/e 388 (M*, 100) , 311 (13) , 310 (58) , 309 (39) Anal. (C22H14N202) C, H, N. acide 3 ' -hydroxyiminoidirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opère selon Lucius et al ci-dessus (méthode modifiée) avec
500 mg de sel de sodium de l'acide indirubine- 5 -suifonique
(0,644 mmole) et 400 mg de chlorhydrate d1 hydroxylamine (5,76 mmole) dans 15 ml de pyridine. Le précipité produit en ajoutant 100 ml d'acide chlorhydrique et 20 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium au mélange réactionnel est combiné au précipité obtenu à partir du filtrat, qui a été produit en ajoutant 15 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium. Ce produit brut est recristallisé à partir d'eau. On obtient 170 mg (34,0 %) de plaquettes noires à écailles, à nuance rouge, Rj =
0,76 (éthanol) : hî-RMN (DMSO-d6) δ 6,82 (d, J = 8,1, C7H) , 7,10-
6,97 (m, C5'H), 7,41-7,39 (m, C6 ' et C7 ' ) , 7,48 (d, J = 7,9,
C6H) , 8,26 (d, J = 7,7, C4'H), 8,92 (s, C4H) , 10,82 (s) et 11,80
(s) (N1H et Nl'H), 13,79 (s, NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 98,64 (s, C3), 107,32 (d, J = 162,3, C7) , 111,36 (d, J = 165,8, C7 ' ) , 116,59 (s, C3a'), 120,55 (d, J = 167,2, C5 ' ) , 121,42 (d, J = 159,5, C6) , 121,65 (s, C3a) , 123,74 (d, J = 163,0, C4), 128,02 (d, J = 167,8, C4'), 131,84 (d, J = 158,8, C6 ' ) , 138,21 (s, C5) , 140,87 (s, C7a) , 144,53 (s, C7a ' ) , 145,52 (s, C2 ' ) , 151,32 (s, C3'), 171,17 (s, C2) Anal. (C16H10N3NaO2S) C, H, N. indirubine-5-suifonamide
On opère comme décrit ci-dessus pour 1 ' indirubine . En partant de 120 mg d' isatine- 5 -suifonamide (0,530 mmole) et de 79 mg d' indoxylacétate (0,045 mmole), on obtient 79 mg (92,0 %) de 5- méthyl indirubine sous forme de poudre noire contenant 8% en masse d'indigo (l'indigo a été identifié par DC et hî-RMN) ; Rf = 0,79 (acétate d'éthyle): ^-RMN (DMSO-d6) δ 7,04-7,08 (m, C7H et C5'H), 7,23 (s,NH2), 7,44(d, J = 7,9, C7'H), 7,60 (pt, C6'H), 7,69 (d, J = 7,4, C6H) , 7,74 (d, J = 8,1, C4'H), 9,31 (s, C4H) , 11,15 (s) et 11.25 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 104,92 (s, C3), 113,56 (d, J = 159,9, C7 ' ) , 119,01 (s, C3a'), 121,13 (s, C3a) , 121,72 (d, J = 165,2, C5 ' ) , 122,27 (d, = 169,8, C6) , 124,44 (d, J= 164,5, C4 • ) , 126,98 (d, J= 159,2, C4 ) , 109,22 (d, J= 165,2, C7) , 137,24 (s, C5) , 137,24 (d, J= 160,5, C6 ' ) , 139,32
(s, C7a') , 142,99 (s, C7a) , 152,45 (s, C2 ' ) , 170,98 (s, C2) ,
188,52 (s, C3') . diméthylamide de l'acide indirubine-5-suifonique On opère comme décrit ci-dessus pour 1 ' indirubine . En partant de
397 mg de diméthylamide de l'acide isatine 5-sulfonique (1,56 mmole) et de 246 mg d ' indoxylacétate (1,40 mmole), on obtient
240 mg (46,5 %) de l'acide recherché sous forme de poudre violette, Rf= 0,39 (acétate d' éthyle/hexane 3/2 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) δ 2,65 (s, 2 CH3), 7,02-7,13 (m, C7H et C5'H), 7,44 (d,
J= 8,1, C7'H), 7,57-7,72 (m, C6H, C4'H, et C6'H), 9,21 (s, C4H) ,
11,18 (s) et 11,33 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 37,20
(q, J = 139, 4, CH3, ) 104,16 (s, C3 ) , 109,11 (d, J = 165,8, C7) ,
113,22 (d, J = 167,2, C7 ' ) , 118,71 (s, C3 a') , 121,36 (d, J = 165,1, C5') , 121,48 (s, C3a) , 123,18 (d, J = 172,0, C6) , 124,22
(d, J = 163,7, C4') , 127,64 (s, C5) , 128,06 (d, J = 166,5, C49,
136,93 (d, J = 164,4, C6 ' ) , 139,34 (s, C7a'), 143,53 (s, C7a) ,
152,10 (s, C2'), 170,51 (s, C2 ) , 188,37 (s, C3 ' ) ; MS m/e 369
(M+, 83), 326 (6), 262 (84), 261 (100). Anal. (C18H15N304S) H, N; C: cale, 58.5 %; trouvé, 57.8 %.
(2-hydroxyéthyl) -amide de l'acide indirubine-5 sulfonique
On opère comme décrit pour 1 ' indirubine. En partant de 150 mg du
(2-hydroxyéthyl) -amide de l'acide isatine-5-sulfonique (0,630 mmole) et de 83 mg d' indoxylacétate (0,47 mmole), on obtient 143 mg (78,9 %) du composé recherché sous forme de poudre violette;
Rf = 0,62 (methanol/ acétate d'éthyle 1/20 v/v): hî-RMN (DMSO-d6) δ 2,84 (t, J{CH2, CH21} = 6,5, visible en ajoutant D20, -N-CH2-),
3,40 (m, -CH2-0) , 4,67 (t, J = 4,6, OH), 7,07 (m, C7H et C5'H),
7,43 -7,46 (m, C7 ' H et S02-NH-; en ajoutant D20: 7,44, d, J" = 8,1, C7'H), 7,61 (pt, C6,H), 7,69-7,71 (m, C6H et C4 • ) , 9,27 (s,
C4H) , 11,18 (s) et 11,29 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ
45,00 (t, J= 138,0, -NH-CH2) , 59,85 (t, J= 141,1, -CH2-OH) ,
104,52 (s, C3), 109,44 (d, J= 165,9, C7) , 113,60 (d, J= 168,5, C7'), 118,92 (s, C3a'), 121,36 (s, C3a) , 121,74 (d, J= 164,0,
C5'), 122,95 (d, J= 162, , C6), 124,52 (d, J= 159,6, C4 • ) ,
127,53 (d,
Figure imgf000021_0001
163,4, C6'), 139,44 (s, C7a'), 143,32 (s, C7a) , 152,46 (s, C2 • ) , 170,87 (S, C2), 188,70 (s, C3 ' ) , MS m/e 385 (M+, 40), 355 (48),
325 (29), 262 (35), 261 (100). Anal. (Cl8H15N305S) C, H, N. bis- (2-hydroxyéthyl) -amide de l'acide indirubine-5-sulfonique
On opère comme décrit pour 1 ' indirubine . En partant de 400 mg de bis- (2-hydroxyéthyl) amide de l'acide isatine-5-sulfonique bis- (2-hydroxyéthyl) amide (1,27 mmole) et 167 mg d'indoxyl acétate
(0,953 mmole), on obtient 355 mg (86,7 %) de 1 ' amide mentionné ci-dessus sous forme de poudre violette, Rf = 0,51 (methanol/ acétate d'éthyle 1/20 v/v): ^Η-RMN (DMSO-d6) δ 3,20 (t, J = 6,5,
2 -N-CH2) , 3,56 (m, 2 -CH20-), 4,84 (t, J = 5,5, 2 -OH), 7,09- 7,05 (m, C7H et C5'H), 7,72-7,68 (m, C6H et C4 ' ) , 7,45 (d, J= 8,0, C7'H) , 7,61 (m, C6 ' ) , 9,26 (s, C4H) , 11,18 (s) et 11,32 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 51,32 (t, J= 135,0, 2 -NH-CH2) , 60,01 (t, = 141,0, 2 -CH2-OH) , 104,31 (s, C3), 109,48 (d, J = 165,3, C7) , 113,62 (d, J = 168,5, C7 ' ) , 118,91 (s, C3a') , 121,69 (s, C3a) , 121,79 (d, J = 164,0, C5 ' ) , 122,88 (d, J = 162,4, C6) ,
124,64 (d, J = 162,7, C4 ' ) , 127, 98 (d, J = 165,2, C4), 131,51
(s, C5), 137,32 (d, J = 160,1 Hz,C6') , 139,61 (s, C7a ' ) , 143,59
(s, C7a) , 152,48 (s, C2') , 170,81 (s, C2) , 188,87 (s, C3 ' ) ; MS m/e 429 (M*, 9), 369 (22) , 365 (22), 355 (63) , 261 (31), 43 (100) . Anal. (C20H19N3O6S) C, H, N. méthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique
On opère comme décrit ci-dessus pour 1 ' indirubine . En partant de 380 mg du méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique (1,58 mmole) et de 227 mg d ' indoxylacétate (1, 30 mmole), on obtient 370 mg (80,1 %) de 1 ' amide ci-dessus sous forme d'une poudre violette, Rf = 0,72 (acétate d'éthyle): Hî-RMN (DMSO-d6) δ 2,46 (d, J= 5,0, CH3) , 7,05-7,09 (m, C7H et C5 Η) , 7,32 (q, NH-CH3) , 7,45 (d, J= 8,3, C7'H), 7,61 (m, C6'H), 7,67-7,71 (m, C6H et C4') , 9,27 (s, C4H) , 11,18 (s) et 11,30 (s) (N1H et Nl'H) ; 13C-
RMN (DMSO-dg) δ 28,65 (q, J = 13 8,7, CH3 ) , 104,48 (s, C3) ,
109,41 (d, J= 165,7, C7) , 113,58 (d, J= 165,7, C7 ' ) , 118,90
(s, C3a') , 121,42 (s, C3a) , 121,73 (d, J = 171,0, C5 ' ) , 123,13 (d, J = 164,5, C6) , 124,50 (d, J = 159,8, C4 ' ) , 127,61 (d, J =
165,7, C4) ,131,93 (s, C5) , 137,28 (d, J= 160,6, C6 ' ) , 139,43 (s,
C7a') , 143,36 (s, C7a) , 152,45 (s, C2 ' ) , 170,85 (s, C2) , 188,68
(s, C3') ; MS m/e 255 (M+, 15) , 263 (18) , 262 (100) , 261 (7) .
Anal. (C17H13N304S) C, H, N. 5-iodoisatine
On opère comme décrit par Roedig, Mueller E. (Hrsg.) , Methoden der organishen Chemie (Houbeyn-Weyl) , Stuttgart, Georg Thieme Verlag 1960,5/4, 586, et Borsche et al Chem.Ber .1924, 1770- 1775, Rf = 0,60 (acétone/éther de pétrole 40-70 l/l v/v) ; PF 262 °C: Hl-RMN (DMSO-d6) δ 6,75 (d, J = 8,3, C7H) , 7,75 (s, C4H) , 7,78 (d, J = 8,2, C6H) , 11,09 (b, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 85,39 (s, C5) , 114,59 (d, = 167, 1, C7) ,119,89 (d, J= 7,2, C3a) , 132,38 (d,J-=170,3 , C4) , 145,76 (d, J = 167,1, C6) , 145,76 (d, J = 167,1, C6) , 149,95 (b, C7a) , 158,66 (s, C2) , 183,06 (s, C3 ) ; MS m/e 262 (M*, 100) , 234 (43) .
diméthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique
On opère comme décrit par Haller, brevet DE 715760, 1938,
Rf = 0,18 (acétate d'éthyle /hexane 1 /l v/v): XH-RMN (DMSO-d6) δ 2,62 (s, 2 CH3) , 7,12 (d, J 8 , 2 , C7H) , 7,71 (s, C4H) , 7,94 (d, J = 8,2, C6H) , 11,47 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 182,89 (s, C3 ) , 159,37 (s, C2), 153,60 (s, C7a) , 136,98
(d, J = 167,32, C6) , 128,62 (s, C5) , 123,27 (d,«J = 169,2, C4), 118,05 (s, C3a) , 112,68 (d, J= 169,2, C7) , 37,48 (q, J= 140,1, 2 CH3) . Anal. (C10H10N2O4S) C, H, N. bis- (2-hydroxyéthyl) -amide de l' acide isatine-5-suifonique
On opère comme décrit par Haller ci-dessus en partant de 526 mg de bis- (2 -hydroxyéhyl ) -aminé (5,00 mmole) et de 1,00 g de 3,3- dichloro-2-oxo-2.3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci- dessus) (3,34 mmole) . Le précipité qui se forme est huileux et boueux. On décante le surnageant, puis on mélange le précipité et le surnageant avec 5 ml d'eau. On porte à reflux 2 h. En refroidissant, on obtient un précipité de cristaux rouge. Rendement: 476 mg (45,3 %) , Rf = 0,51 (méthanol/acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) δ 2,78 (t, J = 6,2, 2 -N-CH2-), 3,38 (t, J = 6,2, 2-CH2-0-) ,7, 08 (d, J = 8,2, C7) , 7,78 (s, C4), 7,96 (d, = 8,2, C6) , 11,43 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) Ô 50,73 (t, J = 138,8,2 -N-CH2-), 59,64 (t, J = 141,7, 2 -CH20H- ) , 112 , 57 (d, J = 168,6, C7) , 117,91 (s, C3a) , 122,78 (d, J= 169,3, C4), 133,29 (S, C5) , 136,44 (d, J= 166,4, C6) , 153,28 (s, C7a) , 159,37 (s, C2),182,95 (s, C3) . Anal. ( C12H14N206S) C, H, N. 6-lodoisatine On opère comme décrit par Marvel et al , Organic Synthèses, Coll. Vol.l, 2nd éd.; Gilman,H Ed.; Wiley& Sons: New York, 1941, 327-330, en utilisant 1,50 g de 2-hydroxyimino-N- (3-iodophënyl) - acétamide (5,17 mmole) et 3,9 ml d'acide sulfurique concentré. Après filtration, le produit brut, formé d'un mélange de 4 -et 6- iodoisatine et de sous-produits, est purifié selon Sadler, J.Org.Chem. 1956, 21, 169-170 et Holt et al, Proc.R.Soc. London B 1958, 148, 481-494. On obtient 216 mg (15,0 %) de cristaux orange; PF 255-258 °C; Rf = 0,76 (acétate d' éthyle/hexane l/l v/v): ^-RMN (DMSO-d6) δ 7,25 (m, C4H et C7H) , 7,45 (d, J≈ 7,6, C5H) , 11,07 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 107,28 (d, J= 10,4, C6) , 117,41 (s, C3a) , 120,83 (d, J = 170,3, C7) , 125,84 (d, J" = 173,7, C4), 131,82 (d, J = 167,9, C5) , 151,30 (s, C7a) , 159,35 (s, C2),183,79 (s, C3) . Anal. (C8H4IN02) C, H, N. isoindigo On opère comme décrit par Wahl et al, Compte rendus hebdomadaires des séances de l'académie des sciences, 1909, 716-19 et 4(5), 1039 -43 : Rf = 0,67 (acétate d' éthyle/hexane l/l v/v): ^-RMN (DMSO-d6) δ 6,85 (d, J= 1 , 1 , C7H et C7'H), 6,97 (pt, C5'H et C5'H) , 7,34 (pt, C6H et C6'H) , 9,07 (d, J= 8,0, C4H et C4'H),
10,90 (s, N1H et Nl'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 109,42 (d, J ≈ 162,5,
C7 et C7'), 121,04 (d, J= 161,2, C5 et C5 ' ) , 121,58 (s, C3a et
C3a') , 129,21 (d, J= 166,5, C6 et C6 ' ) , 132,52 (d, J= 159,9, C4 et C4') , 133,24 (s, C3 et C3 ' ) , 143,98 (s, C7a et C7a') , 168,88
(s, C2 et C2') ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (85) , 205 (18) . Anal.
(C16H12N202) C, H, N.
2,2' -bisindole
On opère comme décrit parBergman et al, Tetrahedron 1995, 51 (19), 563-42, Rf = 0,82 (UV, acétate d'éthyle /hexane l/l): GC/MS
Rt= 14,1 min, m/e 232 (M+, 100); λ^, (éthanol) 221 (4,78), 271
(4,00), 333 (4,80) , 351 (4,79) . Anal. (C16H12N2) C, H, N.
3,3' -diphényl-2.2 ' -bisindole
On opère comme décrit par Fύrstner et al, Angewandte Chemie, 1995,107 (6), 725-8. La recristallisation à partir d'acétate d'éthyle / éther de pétrole (40-70) 115 v/v conduit à des cristaux incolores (55.8 %) , Rf = 0,50 (UV, acétate d'éthyle / éther de pétrole (40-70) 115 v/v): GC/MS Rt= 19,0 min, m/e 384
(M*, 100) . isatin-5-suifonamide
On refroidit au préalable une solution aqueuse à 25 % d'ammoniaque (5,0 ml) à 0-5°C avant d'ajouter un échantillon de
0,50 g de chlorure de 3 , 3-dichloro-2-oxo-2 , 3-dihydroindol-5- sulfonyle ( voir Haller ci-dessus), (1,7 mmole), par portions, en agitant et en refroidissant à nouveau. Après 2h, on ajoute une petite quantité de glace pilée et 20 % d'acide chlorhydrique jusqu'à réaction acide du mélange. Le solvant est éliminé sous vide et le résidu orange est séché sur KOH. La poudre jaune obtenue est extraite 3 fois avec 35 ml d'acétone. L' acétone est éliminée sous vide, ce qui conduit à 140 mg (36,4 %) de poudre orange, Rf≈ 0,73 (acétate d'éthyle): XH-RMN (DMSO-d6) δ 7,05 (d,
J = 8,2, Cl), 7.41 (s, NH2) , 7,85 (s, C4) , 7,98 (d, J = 8,2, C6) ,
11,39 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 112,12 (d, J= 168,3, C7) , 117,73 (s, C3a) , 121,67 (d, J≈ 166,8, C4) , 134,97 (d, J= 165,4,
C6) , 138,36 (s, C5) , 152,56 (s, C7a) , 159,50 (s, C2) , 184,22 (s,
C3) ; MS m/e 226 (M+, 28) , 198 (100) .
(2-hydroxyéthyl) -amide de l'acide isatine- 5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 295 mg de 2- aminoéthanol (4,83 mmole, 0,300 ml), 5,1 ml d'éthanol et 0,900 mg de chlorure 3.3-dichloro-2-oxo-2, 3-dihydroindol-5-sulfonyl
(Haller) (3,01 mmole). Après 30 min d'agitation, on ajoute à nouveau 0,100 ml de 2-aminoéthanol, et 15 min plus tard 20 g de glace pilée et 0,900 ml d'acide chlorhydrique à 20 %. En réchauffant à la température ambiante, on obtient une masse huileuse qui se dépose au fond du récipient. On laisse décanter le surnageant et le solvant restant est éliminé sous vide.
L'huile jaune obtenue est portée à reflux dans 1 ' eau .pendant 2 h. En refroidissant, la solution orange obtenue précipite 374 mg (45,8 %) de cristaux jaune, Rf = 0,52 (methanol /acétate d'éthyle 1/20 v/v): XH-RMN (DMSO-d6) δ 2,73- 2,82 (m,N-CH2-), 3,38
(t, J = 6.1 Hz,-CH2-0-), 7,07 (d, J = 7,6, C7) , 7,66 (t, J = 5,7
Hz,-S02-NH-) , 7,81 (s, C4), 7,96 (d, J= 8,4, C6) , 11,42 (s, NI H) . méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique
On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 0,572 ml d'une solution aqueuse à 40 % de méthylamine (6,62 mmole), 5,6 ml d'éthanol et 1,00 g de chlorure de 3 , 3-dichloro-2-oxo-2 , 3- dihydroindol-5-sulfonyle (Haller) (3,34 mmole). Le précipité qui se forme est éliminé par filtration et on porte à reflux dans l'eau pendant 2 h. Par refroidissement, la solution précipite
(cristaux jaune). Rendement: 420 mg (52,3 i) , Rf = 0,29 (acétate d'éthyle /hexane 2/1 v/v): XH-RMN (DMSO-d6) δ 2,41 (d, J= 5,0, CH3), 7,08 (d, J= 8,3, C7) , 7,48 (q, J= 5,0, NH2) , 7,77 (s, C4),
7,95 (d, J= 8,3, C6) , 11,42 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 28,52
(q, J= 139,2, CH3) , 112,40 (d, J= 168,9, C7) , 118,04 (s, C3a) , 122,48 (d, J= 169,2, C4), 133,13 (s, C5) , 136,15 (d, J= 166,0,
C6) , 153,44 (S, C7a) , 159,44 (s, C2), 183,04 (s, C3 ) .
2-hydroxyimino-N- (3-iodophényl) -acétamide
On opère comme décrit par Marvel et Hiers ci-dessus et on purifie le produit obtenu en procédant selon Holt and Sadler ci- dessus; PF 152-154 °C; Rf = 0,29 (acétate d'éthyle /hexane l/l v/v): Hi-RMN (DMSO-dff) δ 7,12 (pt, J = 8,1, C5 Η) , 7,44 (pt, J =
7,9, C4'H ou C6'H), 7,63 (s, C2H) , 7,65 (pt, J= 8,2, C4 'H ou
C6'H), 8,16 (Pt, J ≈ 1,7, C2'H), 10,27 (s, NH) , 12,27 (s, C2NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) δ 94,69 (d, J = 11,7, C3 • ) , 119,32 (d, J
= 165,7, C6'), 128,22 (d, J ≈ 168,0, C2 ' ) , 130,95 (d, J = 162,8,
C5) , 132,57 (d, J = 168,1, C4 ' ) , 140,06 (s, Cl ' ) , 144,05 (d, J =
171,5, C2) , 160,67 (s, Cl) .
. Tampons Les tampons utilisés ont les compositions suivantes:
Tampon d ' homogèneisation : - 60 mM de β-glycérophosphate, 15 mM de p-nitrophénylphosphate, 25 mM de Mops (pH 7,2), 15 mM d'EGTA, 15 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylphosphate , 10 μg de leupeptine/ml, 10 μg d'aprotinine/ml, 10 μg d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 μM de benzamidine .
Tampon A : 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 50 μg d 'héparine/ml . Tampon- C : tampon d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM d'EGTA, et dépourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase .
Tris-tampon salin de Tween-20 (TBST) : 50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20R.
Tampon de lyse hypotonique (HLB) : 50 mM de Tris-HCl ph 7,4, 120 mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Nonidet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d 'orthovanadate , 5 μM de microcystine, 100 μg/ml de chacun des produits suivants : leupeptine, aprotinine, pepstatine. Préparations de kinases et déterminations des activités
Les activités des kinases ont été déterminées dans le tampon A ou C (à moins d'indications contraires), à 30°C, à une concentration finale en ATP de 15 μM. Les valeurs des essais à blanc ont été soustraites et les activités calculées en pmoles de phosphate incorporé pour une incubation de 10 min. Les valeurs des activités sont généralement exprimées en % de l'activité maximale, c'est-à-dire, en l'absence d'inhibiteurs. Des essais témoins ont été réalisés à l'aide de dilutions appropriées de Me2SO. Dans quelques cas, comme indiqué ci-après, la phosphorylation des substrats est déterminée par autoradiographie après SDS-PAGE.
La GSK-3β utilisée est soit l'enzyme purifiée à partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à partir de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem. , 203 : 305,311). Les déterminations ont été effectuées avec une dilution à 1/100 dans 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, avec 5 μl de GS-1 40 μM comme substrat, dans le tampon A, en présence de 15 μM [γ32P] ATP (3000 Ci/moles ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 μl . Après 30 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 μl de surnageant ont été appliqués sur des bandes de papier de phosphocellulose Whatman P81, de 2,5 x 3 cm, et 20 secondes plus tard, les filtres ont été lavés 5 fois (pendant au moins 5 min. à chaque fois), dans une solution de 10 ml d'acide phosphorique/1 d'eau. Les filtres humides ont fait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS (Amersham) .
La CDKl/cycline B utilisée a été extraite à l'aide d'un tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer (Marthasterias glacialis) et purifiée par chromatographie d'affinité sur des billes de p9 - Sepharose à partir
CKShs1 desquelles le produit a été élue par du p9 libre, comme décrit par Meijer et al . , 1997, (Methods in Enzymology, vol 283
: 113-128), et Borgne et al . , 1999, J. Biol . Chem. 274 : 11977-
11986.
L'activité kinase a été déterminée dans le tampon C, avec 1 mg d'histone Hl/ml, en présence de 15 μM de [γ32P] ATP
((3000 Ci/mmol ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 μl .
Après 10 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de
25 μl de surnageant ont été déposés sur des papiers de phosphocellulose P81 et traités comme décrit ci-dessus. La CDK5/p25 a été reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDKS et de p25 de mammifère recombinantes, exprimées dans E. coli sous forme de protéine de fusion GST
(Glutathione-S-transférase) et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathione-agarose p25 est une version tronquée de p35, l'activateur de CDK5 de 35kDa. Son activité a été déterminée dans le tampon C comme décrit pour CDKl/cycline B.
. Phosphorylation in vitro et in vivo de tau :
Cellules et virus : on a cultivé les cellules Sf9 (InVitrogen, San Diego, CA) à 27°C dans un milieu de Grâce de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 50 μg de gentamycine/ml et 2,5 μg d' amphotéricine/ml . BaculoGold a été obtenu auprès de PharMingen (San Diego, CA) , et pVL1392 de InVitrogen.
La transfection de tau : on a excisé, à partir d'un vecteur d'expression bactérien pNG2 (Biernat et al . , 1993,Neuron 11 : 153-163) et le gène codant pour htau23, 1 ' isoforme tau humain le plus court, avec Xbal et BamHI . Le gène a été inséré dans le vecteur de transfert de baculovirus pVL1392 découpé avec les mêmes endonucléases . Le système BaculoGold a été utilisé pour la construction du vecteur contenant le baculovirus tau. L'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délétion léthale. La co-transfection de l'ADN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de récupérer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus viables portant la séquence codant pour htau23.
L'ADN plasmidique utilisé pour les transfections a été purifié en utilisant des cartouches de QIAGEN (Hilden,
Allemagne) .
Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2xl06 cellules dans un récipient de culture cellulaire de 60 mm) ont été co-transfectées avec de l'ADN de baculovirus (0,5 μg d'ADN de BaculoGold) et avec les dérivés de pVL1392 (2 μg) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protéine recombinante a été examinée dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-
PAGE et Western blot .
Phosphorylation de tau dans les cellules Sf9.
Pour déterminer les effets des inhibiteurs de kihase sur la phosphorylation de tau, les cellules Sf9 infectées par le baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après l'infection, avec 50 μM d' indirubine-3 ' -monoxime pendant 5 heures avant d'être recueillies. Pour obtenir des échantillons de tau témoins avec une phosphorylation plus élevée, les cellules Sf9 exprimant htau23 ont été traitées avec 0,2 μM d'acide okadaique pendant 5 heures avant récolte.
Western blot de tau :
Les cellules Sf9 ont été infectées avec un virus recombinant à une MOI de 1 à 5.
Les lysats cellulaires ont été préparés dans le tampon de lyse hypotonique (HLB) .
Après 15 minutes de centrifugation à 16000 g, le surnageant a été récupéré et sa concentration en NaCl augmentée jusqu'à 500 mM. Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 g pendant 15 min. Les protéines (3 μg) ont été résolues par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un Western blot avec les anticorps suivants : AT-8 (1: 2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:600) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA.
La phosphorylation de tau in vi tro a été effectuée en utilisant de la GSK-3β purifiée et la protéine tau-32 humaine recombinante en tant que substrat. Après 30 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d' indirubine-3 ' - monoxime, dans les conditions d'étude de la GSK-3β décrite ci- dessus, la réaction de la kinase a été arrêtée par addition de tampon Laemmli. La protéine tau a été résolue en SDS-PAGE à 10% et son taux de phosphorylation visualisé par autoradiographie. Exemple 1 : Etude de l'inhibition de GSK-3β, de CDK5/p25 et de CDKl/cycline B par les indirubines.
Les activités kinases ont été déterminées avec un substrat approprié (GSK-3β: GS1 peptide; CDKs: histone Hl) en présence de 15 μM d'ATP et à des concentrations croissantes en dérivés testés. Les valeurs de IC50 ont été calculées à partir des courbes dose/réponse et sont données dans le tableau 1.
Tableau 1
Figure imgf000031_0001
avec d'autres indigoîdes, comme les dérivés d' isatine ou d'indigo, donnent les résultats rapportés dans le tableau 2. Tableau 2
Figure imgf000032_0001
L'examen de ces 2 tableaux montre que, parmi les indigoîdes, seuls les dérivés d' indirubine exercent à la fois un effet inhibiteur vis-à-vis de GSK-3β et de CDKs. Il ressort en effet clairement de ces résultats que ni l' isatine, ni l'indigo ou leurs dérivés, n'exercent d'effet significatif sur l'une de ces 3 kinases.
Les figures 1A à 1D donnent les courbes dose-réponse pour la 5-iodo-indirubine-3 ' -monoxime (A), la 5,5'- dibromoindirubine (B) , l'acide 5-sulfonique indirubine-3 ' - monoxime (C) et 1 ' indirubine- 3 ' -monoxime (D) . L'inhibition de
GSK-3β et des CDKs est déterminée comme indiqué plus haut.
L'activité est exprimée en % de l'activité maximale (sans inhibiteurs) .
Exemple 2 : Etude du mécanisme d'action des indirubines
On procède à cet effet à des expériences de cinétique en faisant varier à la fois les niveaux d'ATP et les concentrations en indirubine- 3 ' -monoxime. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 (l/V en fonction de l/ATP) .
Les concentrations en ATP dans le mélange réactionnel varient de 0 à 2 μM, la concentration de GS-1 étant maintenue constante à 6,7 μM. On constate que 1 ' indirubine-3 ' -monoxime agit en compétition avec l'ATP pour se fixer.
La linéarité de la pente dans l'encadré de la figure montre qu'il s'agit d'un inhibiteur linéaire.
La constante apparente d'inhibition K± est de 50 nM. Exemple 3 : Etude de l'inhibition par les indirubines, in vi tro et in vivo, de la phosphorylation de tau par GSK-3β
On rapporte les résultats obtenus avec 1 ' indirubine-3 '
-monoxime sur la phosphorylation d'un substrat physiologique, constitué par la protéine tau liant des microtubules . On utilise une protéine tau humaine recombinante exprimée dans une bactérie . La protéine est phosphorylee in vi tro par GSK-3β en présence des concentrations croissantes en indirubine-3 ' -monoxime. On procède ensuite à une résolution par
SDS-PAGE, suivie d'une autoradiographie.
La figure 3A donne les résultats obtenus et montre que la phosphorylation est inhibée de manière dose-dépendante par 1 ' indirubine-3 ' -monoxime, avec une IC50 autour de 100 nM. Une quantification de ces résultats est donnée sur la figure 3B qui donne le % de phosphorylation de tau en fonction de la concentration en indirubine-3 ' -monoxine (nM) .
Des études in vivo ont été également effectuées. Les résultats sont illustrés par la figure 3C.
Les cellules Sf9 exprimant htau23 ou bien n'ont pas subi de traitement (-) ou ont été exposées à 0,2 μM d'acide okadaique (OA) , ou à 50 μM d' indirubine-3 ' -monoxime ou à NG-97 pendant 5h. Les lysats cellulaires (3 μg de htau23) ont été résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou mis à réagir avec divers anticorps. K9JA (anticorps pan-tau) reconnaît toutes les préparations renfermant tau. AT8, AT 180 et PHF1 sont spécifiques pour différents motifs phosphorylés SP ou TP à savoir, respectivement, Ser 202 ; Thr 205, Thr 231; Ser 235 et Ser 396 ; Ser 404 (numérotation dans htau 40, qui correspond à 1 ' isoforme le plus long de la protéine tau humaine) . AT 100 reconnaît la protéine tau phosphorylee à T 212 et S214 (réaction très spécifique de la protéine tau chez la maladie d'Alzheimer, mais qui se produit également dans les cellules Sf9, si les 2 sites sont phosphorylés) .
La disparition du signal AT100 après traitement avec 1 ' indirubine-3 ' - monoxime montre que ce dérivé est bien capable d'inhiber une activité de type GSK-3β dans les cellules Sf9. La figure 3D représente le diagramme des isoformes tau, des épitopes reconnus par les anticorps et des sites préférés de phosphorylation : (a) htau 23, (b) htau 40, le plus petit et le plus grand des 6 isoformes générés par l'assemblage alternatif (résidus 352 et 441) . La protéine htau 23 est dépourvue des inserts N-terminaux et de la deuxième répétition. Les répétitions sont représentées en grisé et les régions adjacentes ensombre . Certains épitopes sont indiqués . Exemple 4 : Etude de l'inhibition par les indirubines, in vi tro et in vivo, de la phosphorylation de DARPP-32 par CDK5/p25
La protéine neuronale DARPP-32 a été identifiée comme substrat physiologique de CDK5/p25. DARPP-32 devient un inhibiteur de kinase cAMP-dépendante (PKA) lorsqu'il est phosphoryle par CDK5/p25 sur Thr 75.
Cette protéine a été utilisée comme substrat pour la phosphorylation in vitro par CDK5/p25.
On prépare des coupes de striatum de cerveau de souris adulte en opérant selon la méthodologie standard. Après mise en équilibre dans un tampon de bicarbonate de Krebs oxygéné par aération continue (95% 02/5% C02) , les coupes sont traitées avec différentes concentrations d' indirubine- 3 ' -monoxime, ou avec lOμm de roscovitine pendant 60 min. , ou sont laissées dans le tampon de bicarbonate de Krebs pendant le même temps . Les coupes sont homogénéisées par sonication dans SDS
1% et NaF 50 mM à ébullition. Les concentrations en protéines sont déterminées par la méthode BCA en utilisant une courbe standard de BSA. On soumet des quantités égales de protéine (80μg) à un SDS-PAGE en utilisant un gel d'acrylamide à 15%, on effectue ensuite un transfert par electrophorese sur une membrane de cellulose, puis des immunoempreintes avec un anticorps spécifique d'une situation de phosphorylation capable de détecter spécifiquement DARPP-32 phosphoryle sur Thr 75. Les résultats sont rapportés sur la figure 4. On constate que 1 ' indirubine- 3 ' -monoxime inhibe cette phosphorylation de manière concentration-dépendante, avec une IC50 autour de 100 nM. La phosphorylation de DARPP-32 par CDK5/p25 peut être contrôlée avec un anticorps phosphospecifique dirigé contre
DARPP-32 phospho-Thr 75.
On n'observe pas de phosphorylation in vivo sur ce site dans le tissu p35 ~/~ • On constate une inhibition par
1 ' indirubine-3 ' -monoxime, ce qui montre que les indirubines sont capables d'inhiber CDK5 in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3β de dérivés d' indirubine répondant à la formule générale I :
Figure imgf000037_0001
dans laquelle R et R , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe methylenehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou methylenealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à Cl8; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe mono-, di- ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluoromethyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe -NR """R , dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH2-NR R , dans lequel R11 et R1 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R , R , R , c -i g g i g
R , R , R , R et R , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes ; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe trifluoromethyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH2COOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes alcoxy ; un groupe -NR1^"1"2, dans lequel
R11 et R1 , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes; un groupe -CONR1:LR12, dans lequel R11 et R1 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe suifonamide; un groupe -S02NRι"R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo - N=N-R13, dans lequel R1 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe O-glycoside ou N- glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou. les dissacharides; ou R1 et R5, et R6 et R10, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre; de sélénium; de tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs heteroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate; ou -NOR14, dans lequel le groupe R14 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d ' indirubine, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d' indirubine, un ou plusieurs systèmes cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs heteroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine .
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisée en ce que les dérivés d' indirubine sont liés à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d' indirubine, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = O ou = NOH.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les substituants R , R , R et R desdits dérivés d' indirubine présentent les significations suivantes :
- R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -S03H, -S02NH2, -S02-N- (CH3) 2, -S02-N-C2H5-OH, -S02-N- (C2H5-OH)2, -S02-NH-CH3, - R4 et R8, indépendamment l'un de l'autre: un atome d'hydrogène ou d'halogène, R : un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d ' hydrogène .
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d' indirubine, X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = O.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les substituants R , R , R et R , dans lesdits dérivés d' indirubine, répondent aux significations suivantes :
- R : alkyle, notamment méthyle, et phényle
- R3 : hydrogène, halogène (F, Cl, Br, I), N02, - S03H, -S02NH2, -S02-N(CH3)2, -S02-N-C2H5-OH, -S02-N- (C2H5-OH) 2, -
S02-NHCH3,
-R4 et R : halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d ' hydrogène .
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi 1 ' indirubine, la 5- iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5-méthyl-indirubine, la 5-nitro- indirubine, la 5-S03H-indirubine, la 5 ' -bromo-indirubine, la 5- 5 ' -dibromo-indirubine ou 1 ' acide 5 ' -bromo-indirubine 5- sulfonique.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d ' indirubine , X représente un groupe = NOH et Y un groupe = O.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que R représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe -S03Na.
12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi 1 ' indirubine-3 ' - monoxime, la 5-iodo-indirubine-3 ' -monoxime et la 5-S03Na- indirubine-3 ' -monoxime .
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 , caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie orale, sous forme de gélules, comprimés, dragées ou capsules.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 , caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3β et CDK5.
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