WO2001029074A1 - Gene chimere codant pour un facteur de transcription myb30 et expression dans les plantes - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a new chimeric gene whose expression in plants modulates the response to pathogenic aggressions, plant cells comprising said chimeric gene integrated in a stable manner into their genome, and transformed plants comprising said chimeric gene integrated in a stable manner in their genome and / or comprising the above plant cells.
  • plants are constantly subjected to attack by pathogenic organisms. Before they can penetrate the plant, they must first cross the structural barriers represented by cutin and suberin deposits present on the surface of the leaves and stems, as well as the wall.
  • pectocellulosic of each cell Often these structural barriers are sufficient and the plant resists infection. Otherwise, the aggressor enters via the action of lytic enzymes such as cutinases and cellulases, or via natural openings (stomata, hydathodes, roots) or accidental openings (wound), and the plant must develop defense mechanisms within its tissues. The ability of the plant to rapidly implement new defense strategies to fight against its invasion, as well as the pathogen's ability to divert them, are the determinants of the outcome of the interaction.
  • a given phytopathogenic microorganism attacks a limited number of plant species, called “host” plants, all other species being called “non-host”.
  • the interaction is said to be “compatible” when a "sensitive” host plant interacts with a “virulent” pathogenic agent which develops within the plant, causing disease there.
  • the interaction is said to be “incompatible” when the "resistant” host plant develops defense reactions preventing the "avirulent” pathogen from multiplying.
  • An interaction between a non-host plant and a virulent or avirulent pathogen is also described as incompatible.
  • One of the plant's defense responses during an incompatible interaction the most spectacular is the Hypersensitive Response or HR.
  • the triggering of HR is conditioned by the recognition by the plant of the pathogen.
  • This initial recognition event via the transduction of the perceived signal (s), leads to the execution of a cell death program.
  • the so-called “gene-for-gene” theory defined by Flor in 1947 (Flor, 1947) describes the specificity of recognition between a host plant and a pathogenic agent. This recognition involves a gene for "resistance” or R gene generally dominant in the plant, and a dominant gene for "avirulence” or _4vr in the pathogen.
  • An “elicitor / receiver” model was
  • the Avr genes encode elicitors recognized directly or indirectly as ligands by the receptors encoded by the R genes (Keen, 1990). It should be noted that a plant can have many R genes, just as a pathogen can have many Avr genes. Thus, it would be possible to extend the gene-for-gene theory to non-host interactions, where the addition of several recognitions would lead to resistance. Following recognition events between the resistant plant and the avirulent pathogen, the signaling pathways leading to the hypersensitive response involve the phosphorylation / dephosphorylation of proteins, flows of electrolytes through the plasma membrane, the production of reactive oxygen species, and possibly other events as yet unknown. The role of each of these changes in plant cell metabolism is not always strictly demonstrated, but a bundle of experimental data highlights them. However, the sequence of these signaling events is not clearly determined, and may vary depending on the pathosystem.
  • Hypersensitive cell death is genetically programmed, as indicated by many recent works, and can be compared with other forms of programmed cell death (pcd) in plants and with apoptosis in animals.
  • the components required for the regulation of hypersensitive cell death are currently identified genetically by the isolation of mutants "spontaneous lesions", as previously mentioned. These mutants show phenotypes which are characterized by the appearance of necrotic lesions similar to those observed during a hypersensitive response. These lesions can be delimited, or spread. An interpretation of these phenotypes has been proposed (Walbot et al, 1983), suggesting that cell death initiated by any stimulus is autocatalytic and controlled by a suppressor system.
  • Mutations causing the spontaneous appearance of delimited lesions are thought to affect genes involved in the initiation of cell death, while mutants showing propagative lesions (propagation mutants), are thought to be affected in suppressants of cell death or genes involved in limiting cell death. Genes that are affected by these mutations are thought to play a role in resistance, with several of these mutants showing expression of histochemical, biochemical and molecular markers associated with plant resistance responses.
  • MYB factors The discovery of the existence of MYB factors comes from research carried out in the animal domain.
  • the study of leukemia affecting myeloblasts in Chicken caused by the poultry myeloblastosis virus or AMN (for Avian Myeloblastic Virus) has indeed led to the identification of the viral nucleotide sequence of the gene responsible for oncogenic power (Duesberg and al, 1980).
  • This sequence presented extremely strong homologies with a gene (PROTO-AMV) contained in the cellular AD ⁇ of the chicken (Souza et al, 1980).
  • This gene was renamed C-MYB (for cellular myeloblastosis) and the sequence transduced into the genome of the virus, V-MYB (Klempnauer et al, 1982).
  • C-MYB results from a rearrangement of cellular AD ⁇ involving deletions of a part of each of the 3 'and 5' ends of the C-MYB gene.
  • genes strongly homologous to C-MYB were identified and cloned in all the animal species studied: humans have four MYB genes (HsMYB, A-MYB, B-MYB and HsMYBCDCS) (Bernstein and Coughlin, 1997 ; Majello et al, 1986; ⁇ omura et al, 1988), one mouse (C-MYB) (Gonda et al, 1985), Drosophila at least two (D-MYB and DmMYBCDC5) (Katzen et al, 1985; Ohi et al, 1998).
  • Tobacco Yang and Klessig, 1996), Pea (Uimari and Strommer, 1997), Rice (Gubler et al, 1997; Magaraggia et al, 1997), Tomato ( Lin et al, 1996), Potato (Baranowskij et al, 1994), Craterostigma plantagineum (Iturriaga et al, 1996), Parsley (Feldbrugge et al, 1997) and Lolium temulentum (Gocal et ai, 1999), as well as Physcomitrella patens foam (Leech et ai, 1993).
  • Petunia which would have 20 to 40 MYB genes (Avila et al, 1993), and especially Arabidopsis thaliana whose members of the MYB family are at least one hundred in number (Kranz et al, 1998; Romero et al , 1998), as previously mentioned.
  • AtMYB30 gene makes it possible to increase their tolerance to pathogenic aggressions, without causing phenotypic responses of the necrosis type.
  • the present invention therefore relates to a new chimeric gene (or expression cassette) comprising, in the direction of transcription, a promoter regulatory sequence which is functional in plant cells and plants, a nucleic acid sequence coding for a factor MYB30 and a functional terminator regulatory sequence in plant cells and plants, the above being operably linked to allow expression of the MYB gene in plant cells and plants.
  • the sequence coding for the factor MYB30 is a sequence of plant origin, in particular of Arabidopsis thaliana.
  • the sequence coding for a factor MYB30 is the sequence coding for the factor _4tMYB30 represented by SEQ ID NO 1.
  • the present invention also relates to the sequences capable of hybridizing selectively with the sequence SEQ ID NO 1 above, the sequences homologous to the above sequence, the fragments of said sequence, and the sequences which differ from the sequence. above but which due to the degeneracy of the genetic code, code for the same protein.
  • nucleic acid sequence is intended to mean a nucleotide or polynucleotide sequence, which may be of the DNA type, in particular double strand, in particular of the cDNA type.
  • sequence capable of hybridizing selectively is meant according to the invention the sequences which hybridize with the above sequence at a level significantly above the background noise.
  • the background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other cDNAs present in a cDNA library.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selectively hybridize and the sequence defined by SEQ ID NO 1 above is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of other DNA sequences generating background noise.
  • the level of interaction can be measured, for example, by labeling the probe with radioactive elements, such as 32 P.
  • homolog is meant according to the invention a nucleic acid sequence having one or more sequence modifications compared to SEQ ID NO 1 and coding for the transcription factor AtMYB30. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques, or alternatively by choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. In view of the multiple combinations of nucleic acids which can lead to the expression of the same amino acid, the differences between the reference sequence described by SEQ ED NO 1 and the corresponding homolog may be significant.
  • the degree of homology will be at least 70% relative to the reference sequence, preferably at least 80%, more preferably at least 90%. These modifications are generally and preferably neutral, that is to say that they do not affect the primary sequence of the transcription factor AtMYB30.
  • fragments is meant according to the invention fragments of the DNA sequences defined by the ID sequences above, that is to say the above sequences for which parts have been deleted but which retain the function of said sequences, ie coding for a transcription factor with a function and activity similar and / or equivalent to that of the transcription factor AtMYB30.
  • the promoter regulatory sequence functional in plant cells and plants is advantageously heterologous with respect to the sequence coding for the factor MYB30.
  • heterologous is meant according to the invention a functional promoter region different from the functional promoter region native to the sequence coding for factor MYB 30.
  • any promoter sequence of a gene may be used. expressing itself naturally in plants, such as promoters known as constitutive of bacterial, viral or vegetable origin or also promoters called light dependent like that of a gene of the small subunit of ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO ) of a plant or any known suitable promoter which can be used.
  • promoters of plant origin mention will be made of the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the rice actin promoter (US Pat. No. 5,641,876).
  • promoters of a plant virus gene mention will be made of that of the cauliflower mosaic (CaMV 19S or 35 S).
  • an inducible promoter advantageously chosen from the promoters of phenylalanine ammonia lyase (PAL), of HMG-CoA reductase (HMG), of chitinases, of glucanases, of proteinase inhibitors (PI), of genes of the family.
  • PR1, nopaline synthase (nos) or the vspB gene Table 3 US 5,670,349), the HMG2 promoter (US 5,670,349), the apple ⁇ -galactosidase (ABGl) promoter or the promoter of apple amino cyclopropane carboxylate synthase (ACC synthase) (WO 98/45445).
  • promoters in combination with the above promoters, other regulatory sequences, which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators (“enhancer”), such as for example the transcription activator of the tobacco mosaic virus (VMT) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (VET) described by Carrington & Freed.
  • transcription activators such as for example the transcription activator of the tobacco mosaic virus (VMT) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (VET) described by Carrington & Freed.
  • the functional terminator regulatory sequence in plant cells and plants is also advantageously heterologous with respect to the sequence coding for the factor MYB30.
  • a terminating regulatory or polyadenylation sequence it is possible to use any corresponding sequence of bacterial origin, such as for example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, of viral origin, such as for example the terminator of
  • the present invention also relates to a cloning or expression vector for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene as defined above.
  • This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, at least one origin of replication.
  • This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention.
  • transformation vectors as a function of the host organism to be transformed are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
  • the subject of the invention is also a process for transforming plant cells or plants, by integration of at least one chimeric gene as defined above, a transformation which can be obtained by any suitable known means, amply described in the literature specialized and in particular the references cited in the present application, in particular by the vector according to the invention.
  • a series of methods involves bombarding cells, protoplasts or tissues with particles to which the DNA sequences are attached.
  • Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhi ⁇ ogenes.
  • the present invention also relates to a plant cell or a transformed plant comprising a chimeric gene according to the invention defined above.
  • the plant cell or the transformed plant comprises at least one other heterologous gene coding for a particular peptide or protein of interest.
  • the chimeric gene according to the invention and the other heterologous gene (s) may have been introduced into the host organism simultaneously by means of the same vector comprising them, or by means of several vectors, or in a sequenced manner by means of several vectors , or by crossing several host organisms, plant cells or plants, each comprising a heterologous gene.
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • heterologous gene is meant according to the invention any gene introduced artificially into the host organism, and more particularly artificially integrated into its genome, the methods allowing this introduction or integration possibly being those described above, the content of the references cited being incorporated herein by reference.
  • the heterologous gene other than the chimeric gene according to the invention may be a gene comprising a coding sequence and the regulatory elements 5 'and 3' of said coding sequence not modified with respect to the natural gene, artificially reintroduced into the genome a host organism which may be of the same species as that from which the gene was isolated, or of a different species.
  • the heterologous gene can also be a chimeric gene comprising a coding sequence of plant, bacterial, fungal, viral or animal origin, under the control of functional regulatory elements in the host organism, different from those naturally linked functionally to the sequence coding.
  • the coding sequence of the above heterologous gene can comprise any sequence coding for a protein of interest which it is desired to express in a cell plant or plant other than the transcription factor MYB30.
  • It may be a gene coding for a selection marker as well as a gene conferring on the transformed plant new agronomic properties, or a gene for improving the agronomic quality of the transformed plant.
  • antibiotic resistance genes there may be mentioned antibiotic resistance genes, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate or isoxazoles), genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells.
  • herbicide tolerance genes biashos, glyphosate or isoxazoles
  • genes coding for easily identifiable reporter enzymes such as the enzyme GUS
  • genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells are described in particular in patent applications EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • Genes of interest Among the genes conferring new agronomic properties on transformed plants, there may be mentioned the genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring resistance to certain insects, those conferring tolerance to certain diseases, etc. Such genes are described in particular in patent applications WO 91/02071 and
  • Herbicide tolerance Among the genes conferring tolerance to certain herbicides, mention may be made of the Bar gene conferring tolerance to bialaphos, the gene coding for an appropriate EPSPS conferring resistance to herbicides having EPSPS as target such as glyphosate and its salts (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2,736,926), the gene encoding glyphosate5, oxidized5,4 or a gene coding for a HPPD conferring tolerance to herbicides targeting HPPD such as isoxazoles, in particular isoxafutole (FR 95 06800, FR 95 13570), diketonitriles (EP 496 630, EP 496 631) or triketones, especially sulcotrione (EP 625
  • peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, or else fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al., 1993; Panab restaurants & al., 1995). Change in quality
  • the heterologous gene other than the chimeric gene according to the invention is a gene coding for a protein or peptide of interest conferring new properties of resistance to diseases.
  • the present invention also relates to plants containing transformed cells as defined above, in particular plants regenerated from the transformed cells and their progeny. The regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species, as for example described in the references above.
  • the present invention also relates to genetically transformed plants modified, in the genome of which the chimeric gene according to the invention is integrated in a stable manner and transmissible by sexual reproduction.
  • the present invention also relates to plants obtained by crossing the regenerated plants above with other plants. It also relates to the seeds of transformed plants.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons, more particularly crop plants intended or not for animal or human food, such as corn, wheat, rice, sugar cane, beet, tobacco, cotton, rapeseed, soybeans, etc., more particularly dicotyledonous plants, in particular cotton, rapeseed or soybeans, and preferably cruciferous plants such as rapeseed.
  • the present invention also relates to a method making it possible to improve the resistance of plants to pathogenic aggressions, in particular fungal, said method consisting in overexpressing in said plants a transcription factor MYB30.
  • overexpressing is meant according to the invention an expression of the factor MYB30 additional to the natural expression of the factor MYB30 found natively in plants.
  • the overexpression is ensured constitutively, or not induced in a given tissue of the plant, so as to ensure a constant overexpression of the factor MYB30 in the tissues likely to be infected by a pathogenic agent.
  • the overexpression is preferably ensured by the integration into the genome of the plant of a chimeric gene according to the invention as defined above, in particular a chimeric gene whose promoter regulatory sequence is chosen from constitutive promoters such as promoters histone as described in application EP 0 507 698, the rice actin promoter (US 5,641,876) the 19S or 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV 19S or 35 S), and the specific promoters particular regions or tissues of plants.
  • constitutive promoters such as promoters histone as described in application EP 0 507 698
  • the rice actin promoter US 5,641,876)
  • the 19S or 35S promoter of the cauliflower mosaic virus CaMV 19S or 35 S
  • specific promoters particular regions or tissues of plants.
  • the plant is a transformed plant according to the invention as defined above.
  • the present invention also relates to a process for treating transformed plants according to the invention with an agrochemical composition comprising them.
  • the present invention also relates to a method for cultivating transformed plants according to the invention, the method consisting in planting the seeds of said transformed plants in an area of a field suitable for the cultivation of said plants, to be applied to said surface of the said field an agrochemical composition, without substantially affecting said seeds or said transformed plants, then harvesting the cultivated plants when they reach the desired maturity and optionally separating the seeds from the harvested plants.
  • agrochemical composition is meant according to the invention any agrochemical composition comprising at least one active product having one of the following activities, herbicide, fungicide, bactericide, virucide or insecticide.
  • the agrochemical composition comprises at least one active product having at least one fungicidal and / or bactericidal activity, more preferably having an activity complementary to that of the product produced by the chimeric gene expressing the factor MYB30 in plants transformed according to the invention.
  • the spectrum of activity of the fungicidal compounds is complementary to the spectrum of resistance to pathogenic agents conferred by the chimeric gene according to the invention.
  • complementary spectrum is meant according to the invention an activity spectrum for the chimeric gene according to the invention distinct from the activity spectrum of the compounds, or an activity spectrum relating to identical infectious agents but allowing identical control or improved for lower doses of application of fungicidal compounds.
  • the expression of the chimeric gene according to the invention in transformed plants has shown, in addition to improved resistance to fungal attack without phenotype of the “necrosis” type, “spontaneous lesions” or also altered for HR, the possibility of obtaining a slowing down the phenomenon of aging of certain tissues such as the leaves.
  • This property is particularly important in a plant cultivation strategy involving the creation of a high biomass, in particular for animal feed or human, or in the case of plants genetically modified to produce proteins of high added value, such as enzymes of the food additive type, for example vitamins, of the vaccine type or for therapeutic purposes.
  • a light-dependent promoter such as a promoter of the small subunit of the plant RuBisCo, will be able to direct this property of delaying senescence in only green tissues such as the leaves, allowing in particular the increase in the biomass.
  • an antisense gene MYB30 making it possible to obtain the opposite effects, such as a reduction in resistance to pathogens or an acceleration of senescence.
  • chimeric antisense genes corresponding to the sense genes defined above that is to say for which the sequence coding for a factor MYB30 is replaced by the corresponding antisense sequence, like the corresponding plant cells or transformed plants also form part of the present invention. .
  • the Col-0 (and transgenic lines derived therefrom), Sf-2 and Ws-0 ecotypes of Arabidopsis thaliana L. (Heynh) and the mutants lds3, lsd4 and lsd5 (Dietrich et al, 1994) are cultivated under conditions previously described (Lacomme and Roby, 1996). In general, 5-week-old plants are used in the experimental work. For Isdl, the plants are cultivated under the conditions described above (Jabs et al, 1996). The procedure used with the lsd5 mutant and the suppressor lines is slightly different.
  • Seeds for sterile culture are surface sterilized in 12% bleach for 20 min, washed 5 times in sterile distilled water and sown on Murashige and Skoog medium (MS) containing 0.8% agar and 1% sucrose.
  • the conditions during sterile growth are 16 hours a day in a culture chamber with a light intensity of 0.13 mE / s / m2.
  • the conditions inducing the appearance of lesions correspond to a higher light intensity (1.52 mE / s / m2).
  • Cell suspensions are cultured as previously described (Lacomme and Roby, 1996).
  • the cultivar Bottom Special (BS) of Nicotiana t ⁇ bacum L. and the lines transgenic derivatives are cultivated as previously described (Pontier et al, 1994). 2 bacterial strains
  • the bacteria used for the generation of the various constructs are E. coli, strain DH5 ⁇ . They are cultured at 37 ° C. on LB medium (Miller, 1972) in the absence or in the presence of antibiotics, as the case may be.
  • strains of Agrobacterium tumefasciens used to transform are the strains of Agrobacterium tumefasciens used to transform.
  • LBA4404 (Bevan, 1984) in the case of Tobacco, and the strain GV3101 (Koncz and Schell, 1986) in the case of Arabidopsis. They are cultured at 28 ° C. on a LB medium supplemented with antibiotics corresponding to the genome of bacteria, to "helper" plasmids and to the plasmids containing the genetic constructs as appropriate.
  • the wild avirulent GMI1000 and virulent K60 strains of R. solanacearum are respectively responsible for the development of an observable HR from 24 hours and of the disease from 3 days on the leaves of Tobacco variety Bottom Special (BS). These strains are cultivated for 3 days at 28 ° C. on a Petri dish containing BGT medium (Boucher et al,
  • the ratio 1 DO 6 oo 1.10 9 cfu / ml makes it possible to evaluate the concentration of bacteria.
  • the bacterial suspension is adjusted to 5.10 6 , 1.10 7 and 5.10 7 cfu / ml for the strain GMI1000, and 5.10 7 cfu ml for the strain K60.
  • the strain 147 of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is responsible for the development of an observable HR from 36 hours on the leaves of the ecotype Colombia-0 of Arabidopsis when the inoculum is 1.10 8 cfu / ml. It is cultivated for 3 days at 28 ° C. on a Petri dish containing Kado medium (Kado and Heskett, 1970) supplemented with spectinomycin (100 ⁇ g / ml), then 20 ml of liquid Kado medium (spectinomycin 100 ⁇ g / ml) are sown with a colony isolated from this box.
  • this culture is centrifuged for 5 min at 6000 g.
  • the resulting pellet is washed with 10 ml of sterile water, and vigorous stirring resuspends the pellet.
  • a new centrifugation under the same conditions as before, allows the bacteria to be pelleted again.
  • the new pellet is taken up in 5 ml of sterile water, and a reading of the optical density at 600 nm is carried out on a dilution to one tenth in sterile water.
  • the ratios 1 OD 60 o 1.1O 9 cfu / ml makes it possible to evaluate the concentration of bacteria, and to adjust the bacterial suspension to 1.10 8 cfu / ml in order to inoculate the Arabidopsis plants.
  • Inoculations using three inocula are carried out on the two sides of the central rib of two leaves of two plants for each line tested.
  • the inoculated areas are identified by delimiting them with a black marker.
  • the appearance of symptoms over time is noted by visual appreciation of their severity and extent. A notation being essential, we established a hierarchy in the severity of the symptoms, according to the following scale:
  • the inoculations are carried out with an inoculum of 5.10 7 cfu / ml under the same conditions as for the avirulent strain GMI1000. Symptoms are observed over time. These being very different between the wild BS line and certain transgenic lines, it was not possible to establish a gravity scale, as in the case of the GMI 1000 strain.
  • ITC Measurement of bacterial growth in planta
  • GMI 1000 The avirulent strain GMI 1000 and the virulent strain K60 expressing resistance to rifampicin.
  • a 0.5 cm 2 disc is taken from six different eight-week-old plants with a punch in the inoculated zone, as well as in the tissues immediately around in the case of the strain virulent K60.
  • RNA extractions and Northern analyzes were performed as described in Lacomme and Roby (1996).
  • the probes were obtained from a PstI fragment of the hsr203J gene from Tobacco in the case of hsr203J, from a PstI fragment of the str246C gene from Tobacco in the case of str246C, from an EcoRI / Xhol fragment from the ACC Oxydase gene Nt-ACOl of Tobacco in the case of ACO, and of a BglI / Xbal fragment of the plasmid pBEFl-a (gift from Bernard Lescure) containing the EFI-a gene of Arabidopsis in the case of EFI-a.
  • Filters are hybridized at 42 ° C with the probes in a 6XSSC solution, 0.5%
  • a leaf sample (0.2 g) is ground in liquid nitrogen.
  • the powder obtained is transferred to 1 ml of extraction buffer (containing, for 100 ml: 2 g of CTAB; 10 ml of Tris-HCl IM pH8; 28 ml of 5M NaCl; 4 ml of 0.5M EDTA pH8; 0.5 ml of ⁇ -mercaptoethanol added extemporaneously) and the suspension is incubated for 20 min in a water bath at 65 ° C. After which, 600 ⁇ l of chloroform are added, the samples are then vigorously stirred for 15 min at room temperature, then centrifuged at 10,000 g for 10 min. The aqueous phase is recovered, and added with 600 ⁇ l of isopropanol.
  • AtMYB30 cDNA was cloned as previously described (Lacomme and Roby, 1996). Its nucleotide sequence was determined on the two strands by the dideoxynucleotide termination method according to the Sequenase kit (USB, Amersham). The results were analyzed using GCG (University of Wisconsin) programs. '4.4 Southern analysis
  • RNA extracts are treated with DNAse I, RNAse-free (Boerhinger Manheim) and subjected to phenol / chloroform extraction.
  • a control PCR is carried out to verify the absence of genomic DNA.
  • a first strand of cDNA is synthesized from 2.5 to 20 ⁇ g of total RNA without DNA, using a reverse transcriptase Super script II RNAse H- (BRL), according to the instructions of the producer.
  • ⁇ -tubulin 4 (Marks et ai, 1987) is used as a constitutive internal control and the cDNAs of AtMYB30, or of ⁇ -tubulin 4 and of PR1 (Uknes et al, 1992) are amplified by using the specific probes mentioned below. below during the same PCR reaction: GCTTACGAAT CCGAGGGTGC C and
  • GTCCAGTGT CTGTGATATT GCACC for ⁇ -tubulin 4.
  • compositions and concentrations of the various components of the reaction are those indicated by the supplier of the enzyme Taq polymerase (BRL).
  • the temperature and time conditions used for the PCR reactions are as follows:
  • Transformation experiments on E. coli bacteria are carried out using the thermal shock method (Sambrook et al, 1989). All the plasmids are extracted by mini-preparation according to the method of alkaline lysis (Sambrook et al, 1989) or by Maxiprep (Qiagen). The DNA digestion experiments are carried out with Promega restriction enzymes, and those for DNA purification on agarose gel (1%) use the Jetsorb kit (Genomed). The dephosphorylation of the ends of the DNA fragments is carried out by alkaline shrimp phosphatase (Pharmacia). All the bacteria described are E.
  • coli of strain DH5 ⁇ and the transformed bacteria are selected on LB medium (Miller, 1972) supplemented with ampicillin (50 ⁇ g / ml) or kanamycin (50 ⁇ g / ml) as the case may be.
  • the resulting 999 bp amplifier contains the entire coding region of the AtMYB30 gene, and the use of this pair of oligonucleotides made it possible to insert, by point mutagenesis, a Hpal restriction site at the two ends of the fragment. This fragment was purified and cloned into the vector pCRTMII (Invitrogen).
  • the plasmid pBI221 (Clontech) was subjected to a double Sac1 / Smal digestion (FIG. 1).
  • the sac-digested end was made blunt by the action of the Kleenow fragment of the DNA Polymerase I enzyme.
  • the latter is digested into two new fragments by the enzyme SnaBI. Thereafter, the ends of the 3.83 kb fragment are dephosphorylated in order to avoid recircularization of the vector on itself during the ligation experiments.
  • pBI221-GUS a 3.83 kb fragment
  • the binary plasmid pBI121 (Clontech, (Jefferson et al, 1987) was also subjected to digestion with the enzymes EcoRI and HindIII. The 10 kb fragment was purified and dephosphorylated, then used in ligation experiments with the 2.3 kb fragment originating from the plasmids pB_M231 or pBIW23.
  • the binary plasmid containing the "sense” construct was named "pBIM131" and that containing the "antisense” construct, "pBIW13". Their sequencing on the two strands revealed no anomaly in the sequence of the coding region of the AtMYB30 gene, nor in the junctions created during the generation of these plasmids.
  • the binary plasmid pBI121 was subjected to digestion with the enzymes Sac1 and SnaBI in the presence of the Kleenow fragment of the DNA Polymerase I enzyme, then digestion with the restriction enzyme Smal. The ligation of this fragment allowed its recircularization, and the new plasmid was named "pBIl ll". Its sequence between the 35S promoter and the NOS terminator, fully read three times, is identical to the sequence of pBI121 for these two elements.
  • pGXM1 33 The plasmid pGEX-2T (Pharmacia), chosen for the production of the recombinant protein AtMYB30 in E. coli was subjected to digestion with the restriction enzyme Smal, and after dephosphorylation, was used during of a ligation experiment with the "ORF AtMYB30" fragment. A plasmid containing the coding region of the AtMYB30 gene in "sense" orientation was retained.
  • AtMYB30 we produced a recombinant protein in E. coli, which was purified, before being used for the immunization of rabbits. Analysis of their immune serum revealed that it contained antibodies to the recombinant fusion protein GST-AtMYB30. 5.1 Production and purification of the recombinant fusion protein GST-AtMYB30
  • the coding region of the AtMYB30 gene was cloned into the expression vector pGEX-2T (Pharmacia), and the resulting plasmid, pGXM133, was used to transform E. coli bacteria. Induction of the synthesis of the GST- fusion protein
  • AtMYB30 as well as its purification, were carried out according to the suppliers' instructions. However, it was not possible to produce this soluble fusion protein in sufficient quantities to purify the AtMYB30 protein by cleavage using thrombin or Factor Xa, despite our efforts to adapt. of the protocol under more favorable conditions (bacterial strain deficient in proteases, culture temperature lowered from 37 ° C to 23 ° C). This fusion protein being particularly reluctant to solubilization, we opted for its purification on acrylamide gel of SDS-PAGE type, after the elimination of the major part of the insoluble contaminating proteins by successive washings using added buffers. from SDS. The acrylamide gel fragments containing the fusion protein were used to obtain two batches of rabbit immune serum containing polyclonal antibodies (Eurogentech). 5.2 Western analysis
  • Agrobacteria are cultivated on a Petri dish on LB selective medium (containing the antibiotics specific to the agrobacterium and to the plasmid carrying the construct) at 28 ° C. After 3 days of culture, an isolated colony is placed for a few hours in preculture in 50 ml of selective LB medium with stirring at 28 ° C., and this preculture is used to seed a culture of 1 liter of selective LB medium with stirring at 28 ° vs.
  • the agrobacteria are recovered by centrifugation and resuspended in 1 liter of MS solution containing sucrose (50 g / 1) and Silouet (50 ⁇ l 1), so that the optical density of the solution read at 600 nm is between 1 , 8 and 2.
  • the Arabidopsis flower stalks are soaked for 30 seconds in this solution and the plants are placed in "aracons". When they reach maturity, the seeds are harvested.
  • Tobacco is transformed according to the leaf disc method described by Horsch et al. (1984).
  • the transformed plants are selected on solid MS medium (0.8% Agar) supplemented with kanamycin (100 ⁇ g / ml) and carbenicillin (400 ⁇ g / ml).
  • Tl transgenic plants are brought to flowering and their self-fertilization makes it possible to obtain several thousand seeds.
  • T-DNA contains, in addition to the control, sense or antisense constructs, a gene responsible for the production of the protein Nopaline synthase II or NPT-II, responsible for the detoxification of kanamycin.
  • the percentage of resistant plants in an individual seed population is determined from 10 days after sowing for Arabidopsis, and 15 days after sowing for Tobacco.
  • This count makes it possible to estimate, according to the Mendelian laws of the segregation of dominant characters, the number of T-DNA insertion events in the genome of plants of generation Tl for each line. For this, 200 seeds from first generation plants (Tl) are sown individually, and plants resistant to kanamycin are counted. A test of ⁇ 2 is then carried out to test the validity of the estimate of the number of insertions.
  • the line "pBIM131-40A” comprises the construction meaning pBIM131, and represents the first plant (A) coming from the leaf disc number 40.
  • the T-DNA was inserted in a part of the genome that is not easily accessible to the transcription machinery in this line, leading to a very reduced production of the transgene NPTII and to a difficult detoxification of kanamycin, origin of a resistance to kanamycin reaching the limit of the test used.
  • the sense line pBIM131-15A has a very low germination rate, and it was necessary to sow very many seeds to be able to count plants resistant to kanamycin sensitive plants among 200 plants that have germinated. As a result, these last two lines were not used for the rest of the manipulations.
  • the line "pBIM131-A2" has the construction meaning pBIM131, and represents the second plant (2) resulting from the first experiment (A ) transformation of Arabidopsis. No multiple T-DNA insertion events were detected for the Arabidopsis transgenic lines. Due to the small number of lines obtained, the generation of other lines has been undertaken, and they are being selected.
  • a PCR test is done. It uses the genomic DNA of the line to be tested as a template, and a pair of oligonucleotides specific to each construct as primers.
  • FIG. 2 shows the location of the oligonucleotides used for these tests on the control (pBI11), sense (pBIM131) and antisense (pBIW13) constructs.
  • the use of the pair FIN35S / NOS-TRev provides a 311 bp fragment only with the plasmid pBIl 1 or a plant transformed by the control construct
  • the use of the pair FIN35S / RTMYB3 provides a fragment of 550 bp only with the plasmid pBIM131 or a plant transformed by the sense construct
  • the use of the pair FIN35S / RTMYB5 provides a fragment of 1050 bp only with the plasmid pBIW13 or a plant transformed by the antisense construct. All the other uses of these couples do not lead to any amplification.
  • the lines pBIl 11-9A and pBIl 11-23A from Tobacco and the lines pBIl 11-A1 and pBIl 11-A2 from Arabidopsis carry well the control construction pBIl ll, the lines pBIM131-27D, pBIM131-27F, pBIM131- 4C , pBIM131-13C, pBIM131-40A, pB_M131-47A and pBIM131-50A from Tobacco and the lines pBIM131-Al, pBIM131-A2 and pBIM131-A3 from Arabidopsis have the construction sense ⁇ BIMIM1, and the lines pBW13-25C and pB13 44B of Tobacco and the lines pBW13-Al and pBW13-A7 are effectively transformed by the antisense construct pBIW13.
  • the wild line of Tabac BS or the wild ecotype Col-0 of Arabidopsis do not show amplification with any of the three pairs of oligonucleotides.
  • none of the 40 Tobacco lines or the 12 Arabidopsis lines is at the origin of a non-specific amplification of the construction it possesses (results not shown).
  • the leaf samples (0.5 g) are ground in 5 ml of 80% acetone.
  • the solution obtained is stirred vigorously for 5 min and filtered through glass wool.
  • the residues fixed to the glass wool are washed with 80% acetone until all the pigments are extracted.
  • the eluate is collected and adjusted to 20 ml with 80% acetone.
  • the assay is carried out by spectrophotometry at 663 and 645 nm.
  • the chlorophyll a and b concentrations are calculated from the formulas below. These concentrations are expressed in milligrams of chlorophylls a and b per gram of fresh weight of plant tissue.
  • Chl a (12.7 X DO 6 5 ) - (2.69 X DO 66 _)
  • Chl b (22.9 X DO 6 5 ) - (4.68 X DO 663 )
  • Chl a + b (( Chla + Chl b) X 20)) / (10 X fresh weight)
  • the results are expressed in% of the amount of chlorophylls present in the wild line during the first extraction, for each leaf stage.
  • the 27 independent cDNA clones isolated at the end of this differential screening can be divided into seven ATHSR families (for Arabidopsis thaliana hypersensitivity-related genes) on the basis of experiments of cross hybridizations between the clones and analysis of their similarities sequences by querying the databases.
  • One of the cDNAs was completely sequenced for the ATHSR1 families (corresponding to the AtMYB30 gene), ATHSR2 (the clone RaRI2I), and ATHSR3 (the clone RaR105), and a partial sequence was carried out for the 5 'end for all the others. clones.
  • the clone corresponding to the ATHSR1 family has very strong sequence similarities with the transcriptional factors of the MYB type.
  • the ATHSRI gene has been renamed AtMYB30 in order to comply with the international nomenclature for MYB factors.
  • the nucleotide sequence of the AtMYB30 cDNA and the amino acid sequence of the deduced protein are shown in SEQ ID NO 1.
  • the cDNA has a size of 1310 bp and the predicted ORF of 969 bp encodes a polypeptide of 323 residues with a molecular weight of 36 kDa.
  • the N-terminal sequence of AtMYB30 contains the MYB repeats (R2, R3) generally present in plant MYB proteins.
  • This motif is strongly similar to the MYB domain characteristic of this family of transcriptional factors (Martin and Paz-Ares, 1997).
  • the highly conserved tryptophan residues in c-myb are present in AtMYB30.
  • the first tryptophan residue from the R3 repeat is substituted by a phenylalanine residue, a substitution which is, in addition to isoleucine, commonly found at this position in vegetable MYB proteins.
  • the amino acid sequence of AtMYB30 was then compared with that of other MYB proteins from A. thaliana, other plant and animal species. The degree of similarity among these sequences indicates that different subclasses of vegetable MYB proteins can be defined, beyond the group of animal MYB proteins.
  • AtMYB30 belongs to a subgroup including AtMYB31 (formerly cY13), AmMYB306 and LeTHM6.
  • AtMYB30 has the strongest similarities to the Qualcomm protein AmMYB306 (Jackson et al, 1991) (60% identity and 74% similarity), and to a lesser degree, to the protein AtMYB31 from A. thaliana (53% identity and 70% similarity) and the Tomato LeTHM6 protein (66% identity and 72% similarity).
  • AtMYB30 also shares similarities with other MYB proteins, more specifically in the Myb field. No significant similarity was found in the C-terminal pertie between AtMYB30 and other MYB proteins.
  • AtMYB30 In order to avoid detecting other members of the MYB gene family, a 453 bp cDNA fragment specific for the C-terminal part of the protein was used as a probe. A single fragment could be detected for the four digests involving enzymes that do not cut the cDNA, indicating that AtMYB30 is a unique gene. By comparison, a fragment of 193 bp corresponding to the Myb domain was also used as a probe. Several fragments were detected in this case, confirming the existence of a MYB gene superfamily in A. thaliana (Kranz et al., 1998).
  • the question of the role of the AtMYB30 gene in HR was tackled by implementing three complementary strategies.
  • the first strategy corresponds to the precise study of its expression profile during various interactions between Arabidopsis and pathogens, in order to provide possible data making it possible to establish a temporal correlation between the activation of the gene and the RH.
  • the second strategy was undertaken by analyzing the regulation of the transcription of the AtMYB30 gene in Isd mutants of Arabidopsis affected in cell death programs (Dietrich et al, 1994), as well as in the corresponding phx suppressors (Morel and Dangl, 1999), with the aim to explore the hypothesis of the existence of a relationship between the mutant phenotypes observed and its expression.
  • the third strategy is based on the generation and analysis of transgenic lines of plants over- or under-expressing the AtMYB30 gene, in order to have direct access to the possible phenotypic consequences of a deregulation of this gene.
  • AtMYB30 In order to study the expression of the AtMYB30 gene, we analyzed developmental regulation as well as the effects of virulent and avirulent bacterial pathogens on the level of A ⁇ MYB3Q transcripts. In the plants of A. thaliana, it was not possible to detect AtMYB30 transcripts by Northern analysis, indicating that AtMYB30 is expressed at very low level, as previously mentioned for different MYB genes (Leech et al, 1993; Li and Parish, 1995). Therefore, we determined the level of AtMYB30 transcripts by RT-PCR using the ⁇ -tubulin 4 gene constitutively expressed as internal control. The messenger RNAs of AtMYB30 accumulate during the early stages of development, i.e.
  • AtMYB30 in response to pathogens, an RNA preparation was carried out from cultured cells inoculated with Xcc, the original biological system for the isolation of the cDNA clone.
  • PAL and RaR136 probes (a constitutively expressed clone in cells, unpublished results) served to control cell infection and cell viability, respectively.
  • the AtMYB30 transcripts could not be detected during the compatible interaction, nor in response to the hcc-mutant of Xcc, incapable of causing symptoms in Arabidopsis (Arlat et al, 1991).
  • AtMYB30 the transcripts of AtMYB30 accumulate transiently one hour after inoculation with the avirulent bacterial isolate.
  • PAL transcripts accumulate during HR at a maximum rate 24 hours after inoculation.
  • a similar accumulation of PAL transcripts is observed during the compatible interaction, but the levels are significantly lower.
  • the constitutive expression of RaR136 was observed in all cases, except in infected cells for 24 hours. This exception can be explained by reduced cell viability late after infection.
  • the accumulation of AtMYB30 transcripts was also evaluated in Arabidopsis plants infected with the same pathogen.
  • AtMYB30 is expressed transiently between one and two hours, and specifically during the hypersensitive response (interaction between the avirulent isolate 147 and the resistant ecotype Col-0). No expression could be detected during the compatible interaction (interaction between isolate 147 and the sensitive Sf-2 ecotype) or in response to treatment with water. In response to another bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv.
  • AtMYB30 is transiently expressed and before the appearance of cell death, namely one hour after inoculation (hypersensitive cell death being observed 9 hours and 7 hours after inoculation, respectively), in our experimental conditions. During the compatible interaction, no expression of AtMYB30 could be detected.
  • AtMYB30 is induced in mutants affected in the initiation of programmed cell death, and suppressed in the corresponding suppressors
  • AtMYB30 Mutants of Arabidopsis showing necrotic lesions mimicking the resistance response in the absence of pathogen have been characterized (Dietrich et al, 1994; Greenberg et al, 1993; Greenberg et al, 1994). They are believed to be affected in the control of hypersensitive cell death, and therefore offer the opportunity to explore the relationships between specific activation of AtMYB30 and programmed cell death.
  • the expression of AtMYB30 was studied in three initiation mutants, lsd3, lsd4 and lsd5, whose "lesion" phenotype is dependent on light. The lesions are visible 24 hours, 4 days and 6 days after transfer of the plants under permissive conditions, respectively for lsd5, lsd3 and lsd4.
  • the expression of the PR1 gene whose accumulation of transcripts is correlated with the appearance of lesions in these mutants, was also analyzed, as a control. While PR1 transcripts only accumulate when the three conditional mutants show lesions, AtMYB30 is also expressed in the absence of lesions: constitutively and strongly in the lsd5 and lsd4 mutants. On the contrary, AtMYB30 is not not expressed in the lsd3 mutant in the absence of lesions. No expression of AtMYB30 is detected in the wild Ws-0 ecotype from which the mutants lsd3, lsd4 and lsd5 are derived.
  • AtMYB30 For a better understanding of the relationships between the lsd5 and lsd4 mutations, which lead to the constitutive expression of AtMYB30, and the expression of AtMYB30, different suppressor lines produced from the lsd5 mutant ((Morel and Dangl, 1999) , and unpublished results), were analyzed. According to our results, when transferring into permissive conditions, double mutant lines no longer show necrotic lesions (phxlllsd5, phx2llsd5, and phxll-lllsd5) or show lesions of much smaller size (phx3llsd5 and phxlOllsd ⁇ ). As previously described, AtMYB30 is expressed in lsd5 whatever the conditions.
  • AtMYB30 transcripts are not detected in any of the suppressor lines, or in the wild-type Ws-0 ecotype.
  • the activation of the AtMYB30 gene, constitutive in the lsd4 mutant is suppressed in the offspring of the phxlllsd4 cross.
  • the phxl mutant has been shown to suppress cell death normally caused by the lsd4 mutation (Morel, unpublished results).
  • AtMYB30 is not altered in the mutant Isdl, affected in the propagation of cell death
  • the Isdl mutant of A. thaliana shows an alteration in the control of cell death in the absence of a pathogen: it is unable to control the extent of cell death once it has started (Dietrich et al, 1994; Jabs et al, 1996).
  • This mutant represents an excellent tool for exploring the role of AtMYB30 in limiting cell death.
  • the expression of AtMYB30 was analyzed in Isdl plants showing or not showing lesions, in comparison with wild plants under the same conditions.
  • the expression of the PR1 gene was also followed, as a control, it accompanies the formation and the propagation of the lesions. This defense marker has been shown to accumulate systematically in plants showing lesions.
  • AtMYB30 could not be detected in Isdl, whatever the phenotype observed. Similar data have been obtained with an Isdl mutation suppressor, phx21, or in the wild-type Ws-0 ecotype.
  • the plasmids pB_M131, pBIW13, and pBIl 11 are derived from the plasmids pBI221 (Clontech), pBI121 (Clontech, (Jefferson et al, 1987)) and from the plasmid corresponding to the clone RaR015 comprising the cDNA of the AtMYB30 gene (Lacomme, 1996).
  • the plasmid pBIM131 is a binary plasmid whose T-DNA comprises a gene responsible for kanamycin resistance, and a construct in which the coding region of the AtMYB30 gene is placed under the dependence of the CaMV 35S promoter and the NOS terminator of Agrobacterium tumefasciens. This plasmid was used to transform Tobacco and Arabidopsis plants for the overproduction of the AtMYB30 protein in "sense" lines.
  • Plasmid pBIW13 is a binary plasmid, the T-DNA of which comprises a gene responsible for kanamycin resistance, and a construct in which the coding region of the AtMYB30 gene is placed in antisense orientation under the dependence of the CaMV 35S promoter and the terminator NOS of Agrobacterium tumefasciens. This construct was used to transform Tobacco and Arabidopsis plants to inhibit the production of the AtMYB30 protein in Arabidopsis, and to inhibit the production of the orthologous protein in Tobacco in "antisense" lines.
  • the plasmid pBI11 is a binary plasmid whose T-DNA comprises a gene responsible for resistance to kanamycin, and a fusion between the 35S promoter of CaMV and the NOS terminator of Agrobacterium tumefasciens.
  • This plasmid was used to transform Tobacco and Arabidopsis plants, with the aim of obtaining “control” lines in both cases, so as not to impute the cause of the phenotypes of “sense” lines and “lines”. antisense "only to the differences between the constructions, and not to the transformation event or the insertional nature of the transformation.
  • These three plasmids were subjected to verification of their nucleotide sequence three times, on the two strands of DNA.
  • Sense lines have altered phenotypes in response to bacterial inoculations Inoculation of eighteen sense lines, as well as the wild line BS, by the avirulent strain GMI 1000 and the virulent strain K60 of R. solanacearum has made it possible to '' observe a clear difference between the phenotypes of the wild line and some of the sense lines.
  • Inoculations of the virulent strain K60 of R. solanacearum were carried out on the 18 sense lines and the wild line. Inoculation of this strain at a concentration of 5.10 7 cfu / ml causes the appearance of tissue chlorosis (the color changes from deep green to light green) three days after inoculation which worsens (the tissues become yellow) and extends beyond the area inoculated in the wild line after five days. These observations are typical of a compatible interaction leading to the disease.
  • the lines which have been used are the wild line BS, two lines behaving like the latter (pBIM131-27D and pBIM131-27F), four lines whose phenotype is particularly strong (pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A and pBIM131-50A), and a line with an intermediate phenotype (pBIM131-4C).
  • the results of this analysis show that the AtMYB30 protein could not be detected in the wild line BS or the two lines pBIM131-27D and pBIM131-27F, but that it is possible to clearly detect a protein band in the other lines.
  • the pBIM131-40A line represents the category of sense lines whose phenotype is very clearly altered by comparison with that of the wild line, and that it only presents only T-DNA insertion event.
  • the pBIM131-4C line has also been used during certain manipulations because of its intermediate phenotype and its unique T-DNA insertion event.
  • Measuring bacterial growth in planta or IGC provides information on how bacteria multiply in plant tissue, and possibly deduce the effectiveness of plant defense reactions in limiting the growth of bacteria.
  • IGC experiments were carried out after inoculation with the avirulent GMI 1000 and virulent K60 strains in the wild line BS, and the control lines pBI1 11-23 A and sense pB_M131-40A.
  • the growth of the avirulent strain GMI 1000 of R. solanacearum is impaired in the senspBIM131-40A line
  • the first six days of observation do not make it possible to distinguish a difference in bacterial growth between the wild line BS, the control line pBIl 11-23 A and the sense line pB_M131-40A, although the concentration of bacteria in this latter line is lower than that detected in the wild line and the control line from the third day (72 hours).
  • a drop in the level of bacteria measured in the inoculated areas is first detected during the first 24 hours.
  • the bacteria multiply (growth corresponding to one or two logarithmic units is observed between 24 and 48 hours) and their number remains relatively constant until six days after inoculation.
  • the importance of the drop in the number of bacteria beyond six days is really greater in this line than in the control line pBIl ll -23 A or the wild line BS: at ten and fourteen days after inoculation, the bacterial growth rate is ten times lower in the pBEM131-40A line.
  • Bacterial growth was also assessed in the tissues immediately adjacent to the inoculated areas. The bacteria are detected as early as three days after inoculation, multiply and reach a maximum, then their number drops so that they are no longer detectable fourteen days after inoculation. If the three curves share the same profile, the growth peak of the bacteria appears clearly earlier (6 days) for the pB_M131-40A line than for the control line or the wild line (10 days). In all cases this growth is transient, this character being more marked for the sense line pBIM131-40 A.
  • FIG. 6 presents the results obtained on the in planta bacterial growth of R. solanacearum inoculated at 5.10 7 CFU / ml in transgenic tobacco plants.
  • A Interaction incompatible with the avirulent bacterial strain GMI1000.
  • B Interaction compatible with the virulent strain K60. In both cases (A and B) the samples were taken from the infiltration area.
  • the results present the means and standard deviations obtained over two series of samples. The results show that the bacterial population is maintained for up to 3 days after inoculation in the inoculated area. This phase is followed by a progressive decrease in the bacterial populations in the wild, control and antisense lines, which does not increase until after 9 days. However, after only 6 days, a very significant decrease in the bacterial population is observed in the sense line, with an almost total extinction of the GMI 1000 strain, 13 days after inoculation.
  • La ⁇ gure 5 illustrates the results obtained on the measurement of cell death by • Evans Blue staining (Backer and Mock, 1994) on Tobacco after inoculation with this bacterial strain, in a weak inoculum (10 7 cfu / ml).
  • the kinetics presented show the appearance of a dye penetration peak in the case of the sense line, corresponding to the appearance of symptoms, 19 hours after inoculation. After the tissue collapse, the necrosis appears, and the dye is no longer retained.
  • This peak representative of the establishment of the hypersensitive response appears earlier and is three times higher in the sense line than in the wild line where it is relatively low due to the poorly concentrated inoculum used during this experiment. Less retention of Evans Blue is also observed later in the antisense line.
  • the in planta bacterial growth profiles presented by these two lines are identical: cell death is detected approximately 48 hours after the inoculation of the bacteria, and its rate drops to three days, to become undetectable from six days.
  • the profile obtained with the plants of the sense line pBIM131-40A is very different. Cell death is detected earlier (as early as 24 hours after inoculation), its rate is higher two days after inoculation, and it is no longer detectable from three days. In addition, this rate is much higher than in the wild line or the control line, since it is possible to measure a difference reaching a factor of ten between these two lines and the sense line pBIM131-40 A.
  • the expression profile of the str246C and hsr203J genes of Tobacco was studied during inoculations with the avirulent GMI1000 and virulent K60 bacteria of R. solanacearum in the wild line BS, the control line pBI1 l l-23A, and the sense line pBIM131-40A. While these two genes show a similar expression in the first two lines, significant differences have been observed in the sense line pB_M131-40A.
  • the Arabidopsis EF-la gene is used as a constitutive internal control.
  • str246C gene is altered in the sense line pBIMl 31-40 A While the str246C gene is not induced during inoculation with water in the wild line or in the control line pBIl ll -23 A, its expression is detected very early (from 6 hours) and up to 6 days after inoculation in the sense line pB_M131-40A. In addition, this expression is earlier and stronger in response to the avirulent GMI 1000 and virulent K60 strains of R. solanacearum.
  • the expression of the str246C gene is therefore not constitutive in the sense line pB_M131-40A, but more quickly and more strongly induced during the three inoculations in this line.
  • the expression of the hsr203J gene is altered in the senspBIM131-40A line
  • the hsr203J gene is essentially expressed during the first stages of the interaction incompatible with the GMI 1000 strain, since it is detected 6 hours and 12 hours after inoculation. On the other hand, it is barely detectable during compatible interaction, and absent in plants not inoculated or inoculated with water. In contrast, the hsr203J gene has a different expression profile in the sense line pBIM131-40A. This expression is also detected 6 hours after inoculation with the GMI 1000 strain, but maintained longer than in the wild line. In addition, it is detected very clearly during the compatible interaction 12 hours after inoculation. Finally, this gene is not expressed in the absence of inoculation.
  • results obtained perfectly reflect the visual impression felt during observations of sense lines in general, and show a delay in triggering and a slowing down of the process of leaf senescence in sense lines pB_M131-4C and pBIM131-40A.
  • the delay observed is reflected, in particular for the pBIM131-40A line, by the delayed appearance of the first necrotic leaves: ninety days after sowing for this line, sixty days for the wild line.
  • the slowing down of the senescence process can be evaluated by the importance of the slopes of the different curves: they are generally lower in the two sense lines than in the control line or the wild line.
  • the fourth leaf of the pBIM131-40A line still has 50% of the initial amount of chlorophylls ninety days after sowing, when it was not possible to detect these pigments in the wild line at that date. It should also be noted that the difference observed between the sense line on the one hand, and the wild line and the control line on the other, is clearly visible from the seventieth day of cultivation of the plants.
  • the obtained results show that the expression of the ACO gene is overall weaker in the sense lines than in the wild line or the control line, even if it is very strong at the seventieth day of culture in the line pB_M131-4C.
  • Virulent (Pseudomonas syringae pv. Tabaci), avirulent (Pseudomonas syringae pv. Pisi and Pseudomonas fluorescens constitutively expressing the hate gene) or symptomless (Pseudomonas fluorescens) strains were inoculated at two different concentrations. In response to the two avirulent strains, 25 hours after inoculation, necrotic lesions localized to the inoculation zone are observed on the line overexpressing AtMYB30; these same symptoms appear later (48 hours after inoculation) in the other lines.
  • Antisense lines show altered phenotypes in response to bacterial inoculations
  • Antisense lines have reduced resistance to the avirulent GMI 1000 strain of R. solanacearum
  • the symptoms are characterized four days after inoculation by a dry and localized necrosis in the inoculated zones, just as for the wild line, but each d 'between them presents an original phenotype beyond the necrotic zone. It is a strong chlorosis around the necrotic lesions for the pBW13-28A line, while the necroses of the pBW13-28B line do not remain confined to the inoculated areas, but extend outside.
  • the symptoms obtained with the other antisense lines analyzed also differ from the phenotype of the wild line, but in a less atypical way (results not shown). While most of the sense lines showed an acceleration of HR and a worsening of necrotic symptoms, antisense lines show a completely opposite phenotype: the symptoms appear later, and the necrotic lesions rarely extend to the whole inoculated areas. Apart from the lines pBIW13-28A and pBIW13-28B, the necrotic lesions due to the avirulent strain GMI 1000 of R. solanacearum never extend beyond the limits of the inoculated zones. The course of symptoms is completed 72 hours after inoculation. The quantification of the symptoms makes it possible to divide the antisense lines into four phenotypic classes
  • the lines pBW13-41B and pBW13-4B are distinguished by an intermediate phenotype between the wild line and the three above-mentioned antisense lines: this distinction in the severity and the rapidity of onset of symptoms is only detectable at lower inoculum for the pBW13-41B line (5.10 6 cfu / ml).
  • the pBIW13-25C line has a phenotype very similar to that of the wild line, and this for the three inocula tested.
  • the fourth class comprises the two lines pBIW13-28A and pBIW13-28B which exhibit very remarkable phenotypes, because they are very different from the wild line.
  • Antisense Lines Show Modified Susceptibility to Virulent Strain K60 of R. solanacearum Inoculation of Tobacco Antisense Lines with Virulent Strain K60 of R. solanacearum revealed that not all lines reacted as the line wild BS.
  • the pBW13-28A line is characterized by a very strong chlorosis in the inoculated area, which quickly gives way to large necrotic lesions in this area, while a particularly strong chlorosis extends beyond the inoculated areas.
  • the symptoms observed in the pBW13-28B line are very different, since they are clearly necrotic. These necroses are brown, covering about one tenth of the surface of the inoculated tissue, and do not spread thereafter. These necrotic zones correspond precisely to the place where the injection with the syringe was made, therefore where the bacteria were most numerous.
  • the constructs used for the transformation of Tobacco comprising either the open reading phase of AtMYB30 in sense orientation, in antisense orientation, or without this orf (control construction), downstream of the CaMV 35S promoter, had been introduced into Arabidopsis thaliana Ws-0 ecotype. From the seeds from the transformed plants, the selection of the transformed lines was carried out. This step, carried out on MS medium supplemented with kanamycin (50 mg / l), made it possible to obtain 25, 15 and 6 transformants respectively for the sense, antisense, and control constructions. 8.2. Molecular and genetic analysis of transformants
  • the presence of the transgene has been validated in all sense lines, and in most of the transformed antisense and control plants.
  • the use of a pair of primers specific to each construct made it possible to verify the correct orientation of the transgene in the sense and antisense lines.
  • the number of T-DNA insertions containing each construct was evaluated. All transformed lines verified from a molecular point of view and having only one insertion locus were seeded. The phenotype of these lines during development was observed on 15 plants of each line and appeared in the majority of cases, similar to the wild line Ws-0. Only a few transformed lines show an altered development, characterized by a dwarf phenotype. At the end of this stage, we have 18 lines over-expressing potentially AtMYB30, 8 lines under-expressing it and 4 control lines. 8.3. Analysis of the phenotype in response to an avirulent pathogenic bacterium
  • the pathosystem selected is the interaction Arabidopsis thaliana I Xanthomonas campestris pv. campestris (X.c.c). 10 plants of each transformed line, as well as 10 wild plants Ws-0, were inoculated with the strain X.c.c. 147. Observation of the establishment and development of the hypersensitive response made it possible to classify the different lines transformed according to the intensity of the symptoms observed. In the wild line, the plants inoculated by X.cc. ⁇ 47 present as early as 10 hours after infection the first symptoms of the hypersensitive response, namely a 'collapse' of plant cells in the inoculation zone.
  • the selected sense lines inoculated by Xcc 147 exhibit a particularly marked intensification of the hypersensitive response. In addition to an increase, cell death is detected earlier in one of the sense lines.
  • Xanthomonas campestris contains a cluster of hrp genes related to the larger hrp cluster of
  • a novel zing finger protein is encoded by the Arabidopsis LSDI gene and Sanctions as a negative regulator of plant cell death.
  • EcMYBl a novel plant protein containing a DNA-binding domain with one MYB repeat, interacts in vivo with a light-regulatory promoter unit. Plant J., 11, 1079-1093.
  • Rhoades M.M. (1984) The early years of maize genetics. Ann. Rev. Broom, 18, 1-29.
  • BAS1 has a myb motif and activates HIS4 transcription only in combination with BAS. Science, 246, 931-935.
  • SHEATH2 a Myb protein that represses knox homeobox genes in maize lateral organ primordia. Science, 284, 151-153.
  • Myb26 A MYB-like protein of pea flowers with affinity for promoters of phenylpropanoid genes. Plant J., 12, 1273-1284.
  • PHANTASTICA gene encodes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in growth and dorsoventrality of lateral organs in
  • Myb genes from Hordeum vulgare tissue-specific expression of chimeric Myb promoter / Gws genes in transgenic tobacep. Plant J., 4, 411 -422.

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau gène chimère codant pour un facteur de transcription MYB30 dont l'expression dans les plantes module la réponse aux agressions pathogènes, les cellules végétales comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome, et les plantes transformées comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome et/ou comprenant les cellules végétales ci-dessus.

Description

GENE CHIMERE CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION MYB30 ET EXPRESSION DANS LES PLANTES
La présente invention concerne un nouveau gène chimère dont l'expression dans les plantes module la réponse aux agressions pathogènes, les cellules végétales comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome, et les plantes transformées comprenant ledit gène chimère intégré de manière stable dans leur génome et/ou comprenant les cellules végétales ci-dessus. Dans leur environnement naturel, les plantes sont constamment soumises à des agressions par des organismes pathogènes. Ceux-ci, avant de pouvoir pénétrer au sein de la plante, doivent tout d'abord traverser les barrières structurales représentées par les dépôts de cutine et de subérine présents à la surface des feuilles et des tiges, ainsi que la paroi
" pecto-cellulosique de chaque cellule. Souvent ces barrières structurales constitutives sont suffisantes et la plante résiste à l'infection. Dans le cas contraire, l'agresseur pénètre via l'action d'enzymes lytiques telles que les cutinases et les cellulases, ou via des ouvertures naturelles (stomates, hydathodes, racines) ou accidentelles (blessure), et la plante doit développer des mécanismes de défense au sein de ses tissus. L'aptitude de la plante à mettre en place rapidement de nouvelles stratégies de défense pour lutter contre son envahissement, ainsi que la capacité du pathogène à les détourner, sont les déterminants de l'issue de l'interaction.
Un microorganisme phytopathogène donné (bactérie, virus, champignon) attaque un nombre limité d'espèces végétales, qualifiées de plantes "hôtes", toutes les autres espèces étant qualifiées de "non-hôtes". L'interaction est dite "compatible" lorsqu'une plante hôte "sensible" interagit avec un agent pathogène "virulent" qui se développe au sein de la plante, y provoquant la maladie. A l'inverse, l'interaction est dite "incompatible" lorsque la plante hôte "résistante" développe des réactions de défense empêchant l'agent pathogène "avirulent" de se multiplier. Est également qualifiée d'incompatible une interaction ayant lieu entre une plante non-hôte et un agent pathogène virulent ou avirulent. Au cours d'une interaction incompatible, l'une des réponses de défense de la plante les plus spectaculaires est la Réponse Hypersensible ou HR. Cette réponse forte et rapide est caractérisée par la mort des cellules au point d'infection, et de celles situées immédiatement autour. La HR peut être déclenchée en réaction à l'infection par des agents pathogènes très variés et peut intervenir seulement quelques heures après contact entre la plante et l'agent pathogène entraînant une nécrose rapide et limitée. La mort cellulaire est programmée génétiquement, bien que les données expérimentales en ce sens soient encore fragmentaires. L'une des meilleures indications de l'existence de tels programmes de mort cellulaire est l'identification de mutants de plantes présentant des lésions spontanées (en l'absence de toute attaque par un agent pathogène) qui peuvent être de deux types, nécrotiques ou chlorotiques. Ceci suggère l'implication de différents programmes de mort cellulaire au cours de la pathogénèse.
Le déclenchement de la HR est conditionné par la reconnaissance par la plante du pathogène. Cet événement initial de reconnaissance, via la transduction du (des) signal (aux) perçu (s), conduit à l'exécution d'un programme de mort cellulaire. La théorie dite "gène-pour-gène" définie par Flor en 1947 (Flor, 1947) décrit la spécificité de reconnaissance entre une plante hôte et un agent pathogène. Cette reconnaissance fait intervenir un gène de "résistance" ou gène R généralement dominant chez la plante, et un gène dominant d'"avirulence" ou _4vr chez le pathogène. Un modèle "éliciteur/récepteur" fut
- proposé pour expliquer cette théorie. Dans ce modèle, les gènes Avr codent des éliciteurs reconnus directement ou indirectement comme ligands par les récepteurs codés par les gènes R (Keen, 1990). Il faut remarquer qu'une plante peut posséder de nombreux gènes R, comme un pathogène peut avoir de nombreux gènes Avr. Ainsi, il serait possible d'étendre la théorie gène-pour-gène aux interactions non-hôtes, où l'addition de plusieurs reconnaissances aboutiraient à la résistance. Suite aux événements de reconnaissance entre la plante résistante et l'agent pathogène avirulent, les voies de signalisation conduisant à la réponse hypersensible mettent en jeu la phosphorylation/déphosphorylation de protéines, des flux d'électrolytes à travers la membrane plasmique, la production d'espèces réactives de l'oxygène, et probablement d'autres événements encore inconnus. Le rôle de chacune de ces modifications du métabolisme des cellules végétales n'est pas toujours démontré de façon stricte, mais un faisceau de données expérimentales les met en exergue. Cependant, la séquence de ces événements de signalisation n'est pas clairement déterminée, et pourrait varier selon le pathosystème.
La mort cellulaire hypersensible est programmée génétiquement, comme indiqué par de nombreux travaux récents, et peut être comparée avec d'autres formes de mort cellulaire programmée (pcd) chez les plantes et avec l'apoptose chez les animaux. Les composantes requises pour la régulation de la mort cellulaire hypersensible sont actuellement identifiées génétiquement par l'isolement de mutants "lésions spontanées", comme précédemment mentionné. Ces mutants montrent des phénotypes qui sont caractérisés par l'apparition de lésions nécrotiques similaires à celles observées lors d'une réponse hypersensible. Ces lésions peuvent être délimitées, ou se propager. Une interprétation de ces phénotypes a été proposée (Walbot et ai, 1983), suggérant que la mort cellulaire initiée par quelque stimulus que ce soit est autocatalytique et contrôlée par un système suppresseur. Des mutations causant l'apparition spontanée de lésions délimitées (mutants d'initiation) sont supposées affecter des gènes impliqués dans l'initiation de la mort cellulaire, tandis que des mutants montrant des lésions propagatives (mutants de propagation), sont supposés être affectés dans des suppresseurs de la mort cellulaire ou des gènes impliqués dans la limitation de la mort cellulaire. Les gènes qui sont affectés par ces mutations joueraient un rôle dans la résistance, plusieurs de ces mutants montrant une expression de marqueurs histochimiques, biochimiques et moléculaires associés aux réponses de résistance des plantes.
Il existe à l'heure actuelle peu de données concernant les acteurs de la mort cellulaire ayant lieu au cours des interactions plantes/microorganismes pathogènes. La recherche de ces composantes est donc un terrain d'investigation particulièrement important à explorer. Diverses stratégies peuvent être développées dans ce but : l'une d'entre elles est l'identification de gènes dont l'expression est induite de façon spécifique au cours de la HR. Cette approche, développée chez Arabidopsis thaliana, a abouti à l'isolement du gène AtMYB30, qui code un facteur transcriptionnel de type MYB (Lacomme, 1996). Les facteurs MYB sont des protéines régulatrices de la transcription d'autres gènes, présents chez la quasi totalité des êtres vivants, particulièrement nombreux chez les végétaux, et notamment chez Arabidopsis, où leur famille compte plus d'une centaine de membres. Ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques, mais aucun d'entre eux n'a encore été impliqué dans la régulation de la mort cellulaire.
La découverte de l'existence des facteurs MYB provient de travaux de recherche effectués dans le domaine animal. L'étude de la leucémie affectant les myéloblastes du Poulet causée par le virus de la myéloblastose des volailles ou AMN (pour Avian Myeloblastic Virus) a en effet conduit à l'identification de la séquence nucléotidique virale du gène responsable du pouvoir oncogène (Duesberg et al, 1980). Cette séquence présentait des homologies extrêmement fortes avec un gène (PROTO-AMV) contenu dans l'ADΝ cellulaire du poulet (Souza et al, 1980). Ce gène a été rebaptisé C-MYB (pour çellular myeloblastosis) et la séquence transduite dans le génome du virus, V-MYB (Klempnauer et al, 1982). Le passage de C-MYB vers V-MYB résulte d'un réarrangement de l'ADΝ cellulaire impliquant des délétions d'une partie de chacune des extrémités 3' et 5' du gène C-MYB. Par la suite, des gènes fortement homologues à C-MYB ont été identifiés et clones chez toutes les espèces animales étudiées: l'homme possède quatre gènes MYB (HsMYB, A-MYB, B-MYB et HsMYBCDCS) (Bernstein and Coughlin, 1997; Majello et al, 1986; Νomura et al, 1988), la souris un seul (C-MYB) (Gonda et al, 1985), la drosophile au moins deux (D-MYB et DmMYBCDC5)(Katzen et ai, 1985; Ohi et al, 1998).
Ces gènes sont aussi présents chez les levures Saccharomyces cerevisiae (ScMYBBASl, ScMYBREBl et ScMYBCDCS) (Ohi et al, 1998; Tice-Baldwin et al, 1989) et Schizosaccharomyces pombe (SpMYBCDCδ) (Ohi et ai, 1994), le champignon filamenteux ascomycète Aspergillus nidulans (AnMYBFLBD)(Wieseτ and Adams, 1995), le nématode Caenorhabditis elegans (CeMYBCDC5)(Ohi et al, 1998), et l'amibe Dictyostelium discoideum (DdMYBl et DdMYB2)(Oisv a. and Van Haastert, 1998; Stober- Grasser et α/., 1992). Chez les végétaux, le premier gène codant un facteur transcriptionnel de type MYB identifié fut le gène ZmMYBCl du Maïs, correspondant à un locus étudié depuis 1984
(Rhoades, 1984; Paz- Ares et a , 1987). Contrairement à leurs homologues animaux, les gènes MYB végétaux sont représentés chez les plantes par des familles multigéniques beaucoup plus étendues : une dizaine de membres chez le Maïs (Chopra et al, 1996; Hattori et al, 1992; Marocco et al, 1989; Paz- Ares et al, 1987; Timmermans et al, 1999), l'Orge (Gubler et al, 1995; Marocco et al, 1989; Wissenbach et ai, 1993) et Antirrhinum majus (Jackson et ai, 1991; Noda et ai, 1994; Waites et al, 1998). Ils ont été identifiés chez de nombreuses autres espèces végétales : le Tabac (Yang and Klessig, 1996), le Pois (Uimari and Strommer, 1997), le Riz (Gubler et al, 1997; Magaraggia et al, 1997), la Tomate (Lin et al, 1996), la Pomme de Terre (Baranowskij et al, 1994), Craterostigma plantagineum (Iturriaga et al, 1996), le Persil (Feldbrugge et al, 1997) et Lolium temulentum (Gocal et ai, 1999), ainsi que la mousse Physcomitrella patens (Leech et ai, 1993). On peut notamment citer le Pétunia qui posséderait de 20 à 40 gènes MYB (Avila et al, 1993), et surtout Arabidopsis thaliana dont les membres de la famille MYB seraient au moins au nombre de cent (Kranz et al, 1998; Romero et al, 1998), comme précédemment mentionné.
De récentes estimations sur le nombre total de gènes chez Arabidopsis (16000 à 25000) indiquent que les gènes MYB représenteraient 0,2 à 0,6% de ce total, représentant la plus grande proportion connue à ce jour pour une famille de gènes de régulation chez les plantes (Romero et al, 1998). Il existe d'autres familles de taille égale ou supérieure chez les eucaryotes, telles que la famille des gènes codant les protéines à doigt de Zinc, qui représenterait environ 1% des gènes humains (Hoovers et al, 1992). Cependant, la conservation de séquence globale entre les gènes est très faible dans cette famille (Klug and Schwabe, 1995), alors que les facteurs MYB végétaux partagent de très fortes similitudes de séquence en acides aminés (Romero et al, 1998). Pour déterminer le potentiel global de régulation des facteurs MYB chez les plantes, la recherche de la fonction de tous les gènes de cette famille a été entreprise chez Arabidopsis thaliana via la formation d'un consortium européen regroupant quinze laboratoires. Kranz et collaborateurs (Kranz et al, 1998) publièrent une étude concernant 97 gènes MYB dont plus de 30 nouveaux. Leur distribution dans le génome d' Arabidopsis montre qu'ils couvrent 92% de sa surface : même s'il existe quelques rares loci comprenant plusieurs gènes (jusqu'à six sur 4 cM sur le chromosome V), cette distribution semble homogène et aléatoire (Kranz ét al, 1998).
Au regard des connaissances générales exposées ci-dessus, l'homme du métier aurait considéré que la surexpression d'un gène impliqué dans la mort cellulaire entraînerait la formation de nécroses importantes, impliquant un phénotype de retard de croissance très ' marqué, un phénotype de type « lésions spontanées » ou un phénotype altéré pour la HR, incompatible avec le développement de plantes transgéniques susceptibles de développement commercial.
Or, contrairement à ce qui aurait pu être attendu, la surexpression du gène AtMYB30 dans les plantes permet d'augmenter leur tolérance aux agressions pathogènes, sans entraîner de réponses phénotypique de type nécroses.
La présente invention concerne donc un nouveau gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour un facteur MYB30 et une séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, les éléments ci-dessus étant liés de manière fonctionnelle pour permettre l'expression du gène MYB 30 dans les cellules végétales et les plantes.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence codant pour le facteur MYB30 est une séquence d'origine végétale, en particulier d' Arabidopsis thaliana. De manière préférentielle, la séquence codant pour un facteur MYB30 est la séquence codant pour le facteur _4tMYB30 représentée par la SEQ ID NO 1.
La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence SEQ ID NO 1 ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments de ladite séquence, et les séquences qui diffèrent de la séquence ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la même protéine.
Selon la présente invention, on entend par «séquence d'acide nucléique » une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN, notamment double brin, en particulier de type ADNc.
Par « séquence capable de s'hybrider de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et la séquence définies par la SEQ ID NO 1 ci-dessus est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très " sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).
Par « homologue », on entend selon l'invention une séquence d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la SEQ ID NO 1 et codant pour le facteur de transcription AtMYB30. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par la SEQ ED NO 1 et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire du facteur de transcription AtMYB30.
Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10). Par « fragments », on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN définies par les séquences ID ci-dessus, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, c'est à dire codant pour un facteur de transcription de fonction et activité similaire et/ou équivalente à celle du facteur de transcription AtMYB30. Dans le gène chimère selon l'invention, la séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, est avantageusement hétérologue vis à vis de la séquence codant pour le facteur MYB30. Par « hétérologue » on entend selon l'invention une région promotrice fonctionnelle différente de la région promotrice fonctionnelle native de la séquence codant pour le facteur MYB 30. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CaMV 19S ou 35 S).
On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes.
On peut également employer un promoteur inductible avantageusement choisi parmi les promoteurs de phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de proteinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (tableau 3 US 5 670 349), le promoteur HMG2 (US 5 670 349), le promoteur de la β-galactosidase (ABGl) de pomme ou le promoteur de l'amino cyclopropane carboxylate synthase (ACC synthase) de pomme (WO 98/45445).
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec les promoteurs ci- dessus, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de transcription du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (VET) décrit par Carrington & Freed.
Dans le gène chimère selon l'invention, la séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, est également avantageusement hétérologue vis à vis de la séquence codant pour le facteur MYB30. Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du
' CaMV 35 S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales ou des plantes, par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, en particulier par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhi∑ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la cellule végétale ou de la plante à transformer. On citera notamment les brevets et demandes de
. brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073,
EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également une cellule végétale ou une plante transformée comprenant un gène chimère selon l'invention définie ci-dessus. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la cellule végétale ou la plante transformée comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine particuliers d'intérêt. Le gène chimère selon l'invention et le ou les autres gènes hétérologues peuvent avoir été introduits dans l'organisme hôte simultanément au moyen d'un même vecteur les comprenant, ou au moyen de plusieurs vecteurs, ou de manière séquencée au moyen de plusieurs vecteurs, ou encore par croisement de plusieurs organismes hôtes, cellules végétales ou plantes, chacun comprenant un gène hétérologue.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
Par gène hétérologue, on entend selon l'invention tout gène introduit de manière artificielle dans l'organisme hôte, et plus particulièrement intégré de manière artificielle dans son génome, les méthodes permettant cette introduction ou intégration pouvant être celles décrites précédemment, le contenu des références citées étant incorporé ici par référence. Le gène hétérologue autre que le gène chimère selon l'invention peut être un gène comprenant une séquence codante et les éléments de régulation en 5' et 3' de ladite séquence codante non modifiés par rapport au gène naturel, réintroduit de manière artificielle dans le génome d'un organisme hôte pouvant être de la même espèce que celui d'où le gène a été isolé, ou d'une espèce différente. Le gène hétérologue peut également être un gène chimère comprenant une séquence codante d'origine végétale, bactérienne, fongique, virale ou animale, sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels dans l'organisme hôte, différents de ceux naturellement liés fonctionnellement à la séquence codante.
La séquence codante du gène hétérologue ci-dessus peut comprendre toute séquence codant pour une protéine d'intérêt que l'on souhaite exprimer dans une cellule végétale ou une plante autre que le facteur de transcription MYB30.
Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la qualité agronomique de la plante transformée. Marqueurs de Sélection
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103. Gènes d'intérêt Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.
Tolérance herbicide Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175), ou encore un gène codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comme les isoxazoles, notamment l'isoxafutole (FR 95 06800, FR 95 13570), les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631) ou les tricétones, notamment la sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). De tels gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD sont décrits dans la demande de brevet Résistance aux Insectes Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932). Résistance aux Maladies Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, Poxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore des peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plante, ou bien les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995). Modification de la qualité
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en
- particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A.A. & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334 ; WO 98/20133 ;
WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822).
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le gène hétérologue autre que le gène chimère selon l'invention est un gène codant pour une protéine ou peptide d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies. La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées et leur descendance. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. La présente invention concerne aussi les plantes transformées, génétiquement modifiées, dans le génome desquelles le gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable et transmissible par reproduction sexuée.
La présente invention concerne également des plantes obtenues par croisement des plantes régénérées ci-dessus avec d'autres plantes. Elle concerne aussi les graines de plantes transformées.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, le colza, le soja, etc, plus particulièrement les plantes dicotylédones, en particulier coton, colza ou soja, et de préférence des crucifères comme le colza.
La présente invention concerne également un procédé permettant d'améliorer la résistance des plantes aux agressions pathogènes, en particulier fongiques, ledit procédé consistant à surexprimer dans les dites plantes un facteur de transcription MYB30. Par « surexprimer », on entend selon l'invention une expression du facteur MYB30 additionnelle à l'expression naturelle du facteur MYB30 se trouvant nativement dans les plantes.
De manière avantageuse, la surexpression est assurée de manière constitutive, ou non induite dans un tissu donné de la plante, de manière à assurer une surexpression constante du facteur MYB30 dans les tissus susceptibles d'être infectés par un agent pathogène.
La surexpression est de préférence assurée par l'intégration dans le génome de la plante d'un gène chimère selon l'invention tel que défini auparavant, en particulier un gène chimère dont la séquence de régulation promotrice est choisie parmi les promoteurs constitutifs comme les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876) le promoteur 19S ou 35S du virus de la mosaïque du chou fleur (CaMV 19S ou 35 S), et les promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes.
De manière avantageuse, la plante est une plante transformée selon l'invention telle que définie auparavant. La présente invention concerne également un procédé de traitement des plantes transformées selon l'invention avec une composition agrochimique les comprenant.
La présente invention concerne aussi un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle du produite par le gène chimère exprimant le facteur MYB30 dans les plantes transformées selon l'invention.
De manière préférentielle, le spectre d'activité des composés fongicides est complémentaire du spectre de résistance aux agents pathogènes conféré par le gène chimère selon l'invention.
Par spectre complémentaire, on entend selon l'invention un spectre d'activité pour le gène chimère selon l'invention distinct du spectre d'activité des composés, ou un spectre d'activité portant sur des agents infectieux identiques mais permettant un contrôle identique ou amélioré pour de moindres doses d'application en composés fongicides. L'expression du gène chimère selon l'invention dans les plantes transformées a montré, outre une résistance améliorée aux agressions fongiques sans phénotype de type « nécroses », « lésions spontanées » ou également altéré pour la HR, la possibilité d'obtenir un ralentissement du phénomène de vieillissement de certains tissus comme les feuilles. Cettte propriété est particulièrement importante dans une stratégie de culture de plantes impliquant la création d'une biomasse élevée, notamment pour l'alimentation animale ou humaine, ou dans le cas de plantes génétiquement modifiées pour produire des protéines d'intérêt à haute valeur ajoutée comme des enzymes de type additif alimentaire, par exemple des vitamines, de type vaccins ou à vocation thérapeutique.
L'emploi de promoteurs spécifiques de certains tissus permettra de retarder la sénescence des dits tissus. Par exemple, un promoteur de type lumière dépendant, comme un promoteur de la petite sous unité de la RuBisCo de plante, permettra d'orienter cette propriété de retard de la sénescence dans les seuls tissus verts comme les feuilles, permettant notamment l'augmentation de la biomasse.
Il est entendu que pour la présente invention, l'expression d'un gène antisens MYB30 permettant d'obtenir les effets inverses, comme une diminution de la résistance aux pathogènes ou une accélération de la sénescence.
Les gènes chimères antisens correspondants aux gènes sens définis ci-dessus, c'est à dire pour lesquels la séquence codant pour un facteur MYB30 est remplacée par la séquence antisens correspodante, comme les cellules végétales ou plantes transformées correspondantes font également partie de la présente invention.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2,
Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989. Abréviations
ACO ACC Oxydase
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADN-T ADN de transfert
AMV Virus de la myéloblastose aviaire (Avian Myeloblastic Virus) ARN Acide Ribonucléique AtMYB30 Gène ^Arabidopsis thaliana "MYB30" AtMYB30 Protéine issue du gène AtMYB 30 bp paire de bases (bases pair) CaMV Virus de la mosaïque du Chou-fleur (Cauliflower Mosaic Virus) Cfu Unités formant des colonies (Colony Forming Unit)
HR Réponse hypersensible (Hypersensitive Response) kb kilo paire de bases Isd lésion simulating disease résistance PAL Phénylalanine-ammonia-lyase PCR Réaction de la polymérase en chaîne (Polymerase Chain Reaction)
P.s.t. Pseudomonas syringae pv. tomato ROS Espèces Réactives de l'Oxygène (Reactive Oxygen Species)
X.c.c. Xanthomonas campestris pv. campestris
Matériel et Méthodes
1. Matériel végétal
Les écotypes Col-0 (et les lignées transgéniques en dérivant), Sf-2 et Ws-0 d'Arabidopsis thaliana L. (Heynh) et les mutants lds3, lsd4 et lsd5 (Dietrich et al, 1994) sont cultivés dans des conditions décrites précédemment (Lacomme and Roby, 1996). En général, des plantes âgées de 5 semaines sont employées dans les travaux expérimentaux. Pour Isdl, les plantes sont cultivées dans les conditions décrites précédemment (Jabs et al, 1996). La procédure employée avec le mutant lsd5 et les lignées suppresseurs est légèrement différente. Des graines pour culture stérile sont stérilisées en surface dans de l'eau de Javel 12% pendant 20 min, lavées 5 fois dans de l'eau distillée stérile et semées sur un milieu Murashige and Skoog (MS) contenant 0.8% d'agar et 1% de saccharose. Les conditions pendant la croissance stérile sont de 16h de jour dans une chambre de culture avec une intensité lumineuse de 0.13 mE/s/m2. Les conditions induisant l'apparition des lésions correspondent à une intensité lumineuse supérieure (1.52 mE/s/m2). Les suspensions cellulaires sont cultivées comme précédemment décrit (Lacomme and Roby, 1996). Le cultivar Bottom Spécial (BS) de Nicotiana tάbacum L. et les lignées transgéniques en dérivant sont cultivées comme précédemment décrit (Pontier ét al, 1994). 2 Souches bactériennes
2.1 Escherichia coli
Les bactéries utilisées pour la génération des différentes constructions sont des E. coli, souche DH5α. Elles sont cultivées à 37°C sur milieu LB (Miller, 1972) en absence ou en présence d'antibiotiques, selon les cas.
2.2 Agrobacterium tumefasciens
Les souches d'Agrobacterium tumefasciens utilisées pour transformer sont la souche
LBA4404 (Bevan, 1984) dans le cas du Tabac, et la souche GV3101 (Koncz and Schell, 1986) dans le cas d'Arabidopsis. Elles sont cultivées à 28°C sur mileu LB supplémenté par les antibiotiques correspondants aux génome des bactéries, aux plasmides "helper" et aux plasmides contenant les constructions génétiques selon les cas.
2.3 Ralstonia solanacearum
Les souches sauvages avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum sont respectivement responsables du développement d'une HR observable dès 24 heures et de la maladie dès 3 jours sur les feuilles de Tabac variété Bottom Spécial (BS). Ces souches sont cultivées 3 jours à 28°C sur boîte de Pétri contenant du milieu BGT (Boucher et al,
1985), puis 20 ml de milieu BGT liquide sont ensemencés avec une colonie isolée de cette boîte. Après une incubation de 12 h à 28°C sous agitation (200 tr/min), cette culture est centrifugée 5 min à 6000 g à 28°C. Le culot en résultant est lavé à l'aide de 10 ml d'eau stérile, et une vigoureuse agitation remet le culot en suspension. Une nouvelle centrifugation, dans les mêmes conditions que précédemment, permet de culoter à nouveau les bactéries. Le nouveau culot est repris par 5 ml d'eau stérile, et une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée sur une dilution au dixième dans de l'eau stérile. Le rapport 1 DO6oo = 1.109 cfu/ml permet d'évaluer la concentration en bactéries. Afin d'inoculer les plantes de tabac, la suspension bactérienne est ajustée à 5.106, 1.107 et 5.107 cfu/ml pour la souche GMI1000, et 5.107 cfu ml pour la souche K60.
2.4 Xanthomonas campestris pv. campestris
La souche 147 de Xanthomonas campestris pv. campestris (X.c.c.) est responsable du développement d'une HR observable dès 36 heures sur les feuilles de l'écotype Colombia-0 d'Arabidopsis lorsque l'inoculum est de 1.108 cfu/ml. Elle est cultivée 3 jours à 28°C sur boîte de Pétri contenant du milieu Kado (Kado and Heskett, 1970) supplémenté en spectinomycine (100 μg/ml), puis 20 ml de milieu Kado liquide (spectinomycine 100 μg/ml) sont ensemencés avec une colonie isolée de cette boîte. Après une incubation de 12 h à 28°C sous agitation (200 tr/min), cette culture est centrifugée 5 min à 6000 g. Le culot en résultant est lavé à l'aide de 10 ml d'eau stérile, et une vigoureuse agitation remet le culot en suspension. Une nouvelle centrifugation, dans les mêmes conditions que précédemment, permet de culoter à nouveau les bactéries. Le nouveau culot est repris par 5 ml d'eau stérile, et une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée sur une dilution au dixième dans de l'eau stérile. Les rapports 1 DO60o = 1.1O9 cfu/ml permet d'évaluer la concentration en bactéries, et d'ajuster la supension bactérienne à 1.108 cfu/ml afin d'inoculer les plantes d'Arabidopsis.
3 Inoculations bactériennes des plantes
3.1 Inoculation du Tabac par Ralstonia solanacearum Les inoculations sont effectuées manuellement sur la face inférieure des feuilles les plus jeunes ayant atteint leur taille maximale (environ 30 cm de long sur 20 cm de large) sur des plantes âgées de huit semaines, à l'aide d'une seringue stérile de 1 ml sans aiguille, et ceci sur une surface d'environ 5 cm2. La grande surface des feuilles utilisées permet d'effectuer plusieurs inoculations sur la même feuille. 3.1.1 Test de pathogénicité de la souche avirulente GMI 1000
Des inoculations utilisant trois inocula (5.106, 1.107 et 5.107 cfu/ml) sont effectuées sur les deux côtés de la nervure centrale de deux feuilles de deux plantes pour chaque lignée testée. Les zones inoculées sont repérées en les délimitant à l'aide d'un marqueur noir. L'apparition des symptômes au cours du temps est notée par appréciation visuelle de leur gravité et de leur étendue. Une notation étant indispensable, nous avons établi une hiérarchie dans la gravité des symptômes, selon le barème suivant :
1 : Apparition de petits groupes de cellules en "collapse" dans les zones inoculées. 2: Apparition de zones plus étendues en "collapse" dans les zones inoculées. 3: Les zones inoculées entières sont en "collapse". L'expression des résultats se fait sur la base de la somme obtenue pour chaque temps et pour chaque lignée. Le maximum étant de 24 (indice 3, 2 zones pour 2 feuilles de 2 plantes), les résultats sont finalement exprimés en pourcentage de ce maximum. Le report de ces données sur un graphique temporel permet de comparer la vitesse d'apparition des symptômes, ainsi que leur gravité. 3.1.2 Souche virulente K60
Les inoculations sont effectuées avec un inoculum de 5.107 cfu/ml dans les mêmes conditions que pour la souche avirulente GMI1000. Les symptômes sont observés au cours du temps. Ceux-ci étant très différents entre la lignée sauvage BS et certaines lignées transgéniques, il n'a pas été possible d'établir un barème de gravité, comme dans le cas de la souche GMI 1000.
3.2 Inoculation d'Arabidopsis par Xanthomonas campestris pv. campestris
Avant d'inoculer les plantes d'Arabidopsis, celles-ci sont placées dans une atmosphère à forte hygrométrie pendant 16 à 18 heures, de manière à provoquer l'ouverture des stomates. L'inoculation est effectuée sur la face inférieure des feuilles, de part et d'autre de la nervure centrale, sur cinq feuilles adultes de plantes âgées de quatre semaines, et ceci sur une surface totale équivalant au tiers de la surface totale de la feuille. Après inoculation, les plantes sont replacées dans une atmosphère à forte hygrométrie pendant 48 h afin de favoriser l'infection.
3.3 Mesure de la croissance bactérienne in planta (IGC) La mesure de la croissance bactérienne in planta se base sur le dénombrement au cours du temps des bactéries présentes dans des échantillons de tissus des plantes inoculées. Ce type de mesure a été effectué lors d'inoculations de Tabacs par les bactéries R. solanacearum, avec la souche avirulente GMI 1000 et la souche virulente K60 exprimant une résistance à la rifampicine. Pour chaque lignée et chaque point cinétique, est prélevé un disque de 0,5 cm2 sur six plantes différentes âgées de huit semaines à l'emporte-pièce dans la zone inoculée, ainsi que dans les tissus immédiatement autour dans le cas de la souche virulente K60. Ces six disques sont broyés dans 1 ml d'eau stérile dans un mortier à l'aide d'un pilon, et ce matériel est rincé dans 1 ml d'eau stérile. Cette suspension est soumise à une série de dilutions dans l'eau stérile, de façon à obtenir, selon les expériences, des dilutions allant de 10 à 100 000. Cent microlitres de ces dilutions sont étalés sur des boîtes de Pétri contenant du milieu BGT solide (1,5% Agar) supplémenté en rifampicine (50 μg/ml) afin d'inhiber la croissance de microorganismes parasites, et les boîtes sont placées en chambre d'incubation à 28°C afin de permettre la croissance des bactéries R. solanacearum. Deux jours plus tard, les colonies de R. solanacearum sont comptées. Les résultats sont exprimés en loglO(cfu/cm2) (moyennes et écarts types). 4 Méthodologies de biologie moléculaire
4.1 Extraction d'ARN et analyse Northern
Les extractions d'ARN totaux et les analyses de type Northern ont été réalisées comme décrit dans Lacomme and Roby (1996). Les sondes ont été obtenues à partir d'un fragment PstI du gène hsr203J du Tabac dans le cas de hsr203J, d'un fragment PstI du gène str246C du Tabac dans le cas de str246C, d'un fragment EcoRI/Xhol du gène ACC Oxydase Nt-ACOl du Tabac dans le cas de ACO, et d'un fragment BglI/Xbal du plasmide pBEFl-a (don de Bernard Lescure) contenant le gène EFI-a d'Arabidopsis dans le cas de EFI-a. Les filtres sont hybrides à 42°C avec les sondes dans une solution de 6XSSC, 0,5%
SDS, 5X solution Denhardt's et 0,1 mg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. Les filtres sont ensuite lavés deux fois pendant 15 min avec 2XSSC, 0,1% SDS à température ambiante et deux fois pendant 20 min avec 0,1XSSC, 0,1% SDS à 55°C. Les fragments d'ADN correspondant aux clones d'ADNc longueur totale ont été employés comme sonde, dans le cas de AtMYB30 et RaRI36; et un fragment HindIII du gène PAL-1 (Dong et al, 1991) a été employé dans le cas de la PAL.
4.2 Extraction d'ADN génomique végétal
Un échantillon de feuille (0,2 g) est broyé dans de l'azote liquide. La poudre obtenue est transférée dans 1 ml de tampon d'extraction (contenant, pour 100 ml : 2 g de CTAB; 10 ml de Tris-HCI IM pH8; 28 ml de NaCl 5M; 4 ml d'EDTA 0,5M pH8; 0,5 ml de β- mercaptoéthanol rajouté extemporanément) et la suspension est incubée 20 min dans un bain-marie à 65°C. Après quoi, 600 μl de chloroforme sont ajoutés, les échantillons sont alors agités vigoureusement pendant 15 min à température ambiante, puis centrifugés à 10000 g pendant 10 min. La phase aqueuse est récupérée, et additionnée de 600 μl d'isopropanol. Immédiatement après ils sont centrifugés à 10000 g pendant 20 secondes. Le culot est récupéré et lavé avec de l'éthanol 70 % à température ambiante. Après une centrifugation de 10 min à 10000 g, le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 50 μl d'eau. Une aliquote d'une dilution au dixième dans de l'eau stérile sera utilisée lors d'une réaction de type PCR pour un mélange final de 25 μl. 4.3 Clonage et séquençage du clone d'ADNc
L'ADNc AtMYB30 a été clone comme précédemment décrit (Lacomme and Roby, 1996). Sa séquence nucléotidique a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison aux dideoxynucléotides selon le kit Sequenase (USB, Amersham). Les résultats ont été analysés en utilisant les programmes GCG (University of Wisconsin). ' 4.4 Analyse Southern
L'ADN extrait des plantes selon le protocole décrit par Saghai-Maroof et ai (1984) est digéré avec des enzymes de restriction, séparé sur un gel d'agarose à 0.8% et transféré sur une membrane Hybond N+ (Amersham). L'hybridation est effectuée comme décrit précédemment (Lacomme and Roby, 1996) avec une sonde _4t_VT_550-3'-spécifique marquée au 32P et avec une sonde correspondant au domaine MYB. 4.5 RT-PCR
Les extraits d'ARN sont traités à la DNAse I, RNAse-free (Boerhinger Manheim) et soumis à une extraction au phenol/chloroforme. Une PCR de contrôle est effectuée pour vérifier l'absence d'ADN génomique. Un premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 2,5 à 20 μg d'ARN totaux sans ADN, employant une transcriptase reverse Super script II RNAse H- (BRL), suivant les instructions du producteur. La β-tubulin 4 (Marks et ai, 1987) est employée comme contrôle interne constitutif et les ADNc d'AtMYB30, ou de β- tubulin 4 et de PR1 (Uknes et al, 1992) sont amplifiés en employant les sondes spécifiques ci-dessous durant la même réaction PCR : GCTTACGAAT CCGAGGGTGC C et
GTCCAGTGT CTGTGATATT GCACC pour la β-tubulin 4. GATTGGTATA ACTGAACAAA CATGG et GCCCAAGACA GTCCTCAAGA C pourPRl.
Toutes les réactions PCR sont effectuées avec un Robocycler gradient 96 (Stratagene). Les travaux sont effectués deux fois dans deux expériences indépendantes. 4.6 Réaction de la Polymérase en Chaîne (PCR)
Les compositions et concentrations des différents composants de la réaction sont ceux indiqués par le fournisseur de l'enzyme Taq polymérase (BRL). Les conditions de températures et de temps utilisées pour les réactions de PCR sont les suivantes :
Température Temps Nombre de cycles
95°C 3 min
72°C 45 s 1
48°C 45s
95°C 1 min
48°C 45 s 32
72°C 45 s
72°C 10 min 1
4.7 Génération de constructions
Les expériences de transformation des bactéries E. coli sont effectuées selon la méthode du choc thermique (Sambrook et al, 1989). Tous les plasmides sont extraits par minipréparation selon la méthode de la lyse alcaline (Sambrook et al, 1989) ou par Maxiprep (Qiagen). Les expériences de digestion d'ADN sont effectuées avec des enzymes de restriction Promega, et celles de purification d'ADN sur gel d'agarose (1%) font appel au kit Jetsorb (Genomed). La déphosphorylation des extrémités des fragments d'ADN est réalisée par la phosphatase alcaline de crevette (Pharmacia). Toutes les bactéries décrites sont des E. coli de souche DH5α, et les bactéries transformées sont sélectionnées sur milieu LB (Miller, 1972) supplémenté en ampicilline (50 μg/ml) ou en kanamycine (50 μg/ml) selon les cas.
4.7.1 Constructions témoin (pBIl l l), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13)
Le plasmide extrait du clone RaR015, contenant l'ADNc du gène AtMYB30 (Lacomme, 1996), a été préparé par minipréparation et utilisé lors d'une expérience de PCR à l'aide des oligonucléotides MYB5 et MYB6 (figure 1). L'amplifiât de 999 pb en résultant contient l'entièreté de la région codante du gène AtMYB30, et l'utilisation de ce couple d'oligonucléotides a permis d'insérer par mutagénèse ponctuelle un site de restriction Hpal aux deux extrémités du fragment. Ce fragment a été purifié et clone dans le vecteur pCRTMII (Invitrogen). L'insertion a été vérifiée par la digestion du plasmide de colonies isolées en utilisant les enzymes Hpal, EcoRI, et SacII/Hpal. Une colonie a été retenue, et le plasmide correspondant baptisé pCRM2_4 (figure 1). La séquence du fragment inséré a été entièrement lue à trois reprises sur les deux brins, et aucune mutation due à la PCR n'a été détectée à l'intérieur de la région codante du gène AtMYB30. La digestion Hpal de ce plasmide, suivie de sa purification sur gel d'agarose, a abouti à l'obtention d'un fragment de 935 pb à extrémités franches, et contenant l'entièreté de la région codante du gène AtMYB30. Ce fragment, baptisé "ORF AtMYB30" a été utilisé par la suite dans des expériences de clonage en vue de l'obtention des constructions utilisées au cours de ce travail (figure 1).
Le plasmide pBI221 (Clontech) a été soumis à une double digestion Sacl/Smal (figure 1). L'extrémité digérée par Sacl a été rendue franche par l'action du fragment Kleenow de l'enzyme ADN Polymérase I. Afin de faciliter la purification du fragment de 3,83 kb et d'éviter la co-purification du fragment de 1,87 kb (correspondant à la région codante du gène GUS), ce dernier est digéré en deux nouveaux fragments par l'enzyme SnaBI. Par la suite, les extrémités du fragment de 3,83 kb sont déphosphorylées afin d'éviter la recircularisation du vecteur sur lui-même lors des expériences de ligation. Ainsi est obtenu un fragment de 3,83 kb (baptisé "pBI221-GUS") correspondant au plasmide pBI221 linéarisé, dépourvu de la région codante du gène GUS, et dont les extrémités franches peuvent accueillir le fragment "ORF AtMYB30".
Les expériences de ligation utilisant le vecteur "pBI221-GUS" et le fragment "ORF AtMYB30", puis celles de transformation de bactéries, ont conduit à l'obtention de plusieurs centaines de colonies isolées par sélection sur ampicilline. 94 colonies différentes ont été soumises à une expérience de PCR à l'aide des oligonucléotides Ml 3-20 et M13Rev, et 74 d'entre elles ont conduit à l'amplification d'un fragment de taille attendue (1995 pb). Afin de vérifier la taille et l'orientation du fragment "ORF AtMYB30", leur ADN plasmidique a été soumis à deux digestions (EcoRI/HindIII et PstI). L'analyse des résultats a montré qu'une colonie possédait un plasmide dont l'orientation était "sens", et que 25 colonies possédaient un plasmide dont l'orientation était "antisens". Les plasmides "sens" et "antisens" ont été nommés respectivement "pB__M231" et "pBIW23" (figure 1). Leur nature a été vérifiée par digestion (EcoRI/HindlII et PstI), et leur séquençage sur les deux brins à trois reprises (oligonucléotides M13-20, M13Rev, MYB2_32, MYB2_5, MYB3_5) a permis de vérifier qu'aucune mutation n'était apparue dans la région codante du gène AtMYB30, et qu'elle était insérée correctement afin d'être transcrite chez le plasmide pBIM231. Afin de sous-cloner ces constructions dans un vecteur binaire, les plasmides pBI231 et pBIW23 ont été digérés par les enzymes EcoRI et HindIII, et les fragments ont été purifiés sur gel d'agarose.
Le plasmide binaire pBI121 (Clontech, (Jefferson et al, 1987)) a également été soumis à une digestion par les enzymes EcoRI et HindIII. Le fragment de 10 kb a été purifié et déphosphorylé, puis utilisé lors d'expériences de ligation avec le fragment de 2,3 kb provenant des plasmides pB_M231 ou pBIW23. Le plasmide binaire contenant la construction "sens" a été nommé "pBIM131" et celui contenant la construction "antisens", "pBIW13". Leur séquençage sur les deux brins n'a révélé aucune anomalie dans la séquence de la région codante du gène AtMYB30, ni dans les jonctions créées lors de la génération de ces plasmides. Enfin, afin de générer une construction témoin (ne comportant pas la région codante du gène AtMYB30), le plasmide binaire pBI121 a été soumis à une digestion par les enzymes Sacl et SnaBI en présence du fragment Kleenow de l'enzyme ADN Polymérase I, puis à une digestion par l'enzyme de restriction Smal. La ligation de ce fragment a permis sa recircularisation, et le nouveau plasmide a été nommé "pBIl l l". Sa séquence comprise entre le promoteur 35S et le terminateur NOS, entièrement lue à trois reprises, est identique à la séquence de pBI121 pour ces deux éléments. 4.7.2 Construction pGXMl 33 Le plasmide pGEX-2T (Pharmacia), choisi pour la production de la protéine recombinante AtMYB30 chez E. coli a été soumis à une digestion par l'enzyme de restriction Smal, et après déphosphorylation, a été utilisé lors d'une expérience de ligation avec le fragment "ORF AtMYB30". Un plasmide contenant la région codante du gène AtMYB30 en orientation "sens" a été retenu. Son profil de restriction a été vérifié, et la séquence nucléotidique dans et autour de la région codante du gène AtMYB30 a été lue sur les deux brins à trois reprises (oligonucléotides MYB2_5, MYB2 32 et MYB3 5), démontrant l'absence de mutations vis-à-vis de la séquence originelle. Le plasmide correspondant a été nommé "pGXM133".
5 Production, purification de la protéine recombinante de fusion GST-AtMYB30 chez E. coli, et détection par analyse Western En vue de l'analyse de lignées transgéniques sur- ou sous-exprimant le gène
AtMYB30, nous avons produit une protéine recombinante chez E. coli, qui a été purifiée, avant d'être utilisée pour l'immunisation de lapins. L'analyse de leur sérum immun a révélé qu'il contenait des anticorps dirigés contre la protéine recombinante de fusion GST- AtMYB30. 5.1 Production et purification de la protéine recombinante de fusion GST-AtMYB30
La région codante du gène AtMYB30 a été clonée dans le vecteur d'expression pGEX-2T (Pharmacia), et le plasmide en résultant, pGXM133, a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli. L'induction de la synthèse de la protéine de fusion GST-
AtMYB30, ainsi que sa purification, furent effectuées selon les instructions des fournisseurs. Cependant, il n'a pas été possible de produire cette protéine de fusion soluble et en quantités suffisantes en vue de purifier la protéine AtMYB30 par clivage à l'aide de la thrombine ou du Facteur Xa, et ceci, malgré nos efforts d'adaptation du protocole à des conditions plus favorables (souche bactérienne déficiente en protéases, température de culture abaissée de 37°C à 23°C). Cette protéine de fusion étant particulièrement réticente à la solubilisation, nous avons opté pour sa purification sur gel d'acrylamide de type SDS- PAGE, après l'élimination de la majeure partie des protéines insolubles contaminantes par lavages successifs à l'aide de tampons additionnés de SDS. Les fragments de gel d'acrylamide contenant la protéine de fusion furent utilisés pour l'obtention de deux lots de sérum immuns de lapin contenant des anticorps polyclonaux (Eurogentech). 5.2 Analyse Western
Les expériences de type Western blot sont réalisées selon Sambrook et al. (1989). Les échantillons analysés correspondent à des extraits contenant les protéines solubles de plantes âgées de quatre semaines (Tabacs et Arabidopsis) cultivées en terreau. Un sérum immun anti-GST-AtMYB30 (provenant de la saignée finale) dilué au 5000e, ainsi que des anticorps ovins anti-lapin en tant qu'anticorps secondaires, ont été utilisés. La révélation est réalisée selon la méthode de la phosphatase alcaline, enzyme couplée aux anticorps secondaires.
Une expérience d'immunodétection des protéines recombinantes GST et GST- AtMYB30 a permis de déterminer le titre d'utilisation des anticorps. En effet, une dilution au 5 000e permet de détecter spécifiquement la protéine GST-AtMYB30, alors que la protéine recombinante GST, purifiée par affinité sur colonne glutathion-sépharose (Pharmacia) et fournie par Benoît Ranty (UMR UPS/CNRS 1456), n'est plus détectée à cette dilution, dans une gamme allant de 0,002 μg à 2 μg. Par contre, la protéine de fusion GST-A.MYB30 est détectée dès que sa quantité déposée sur le gel excède 0,2 μg. Ce sont donc les conditions qui ont été retenues pour analyser les lignées transgéniques de Tabac et d'Arabidopsis.
6 Génération et caractérisation de lignées transgéniques de Tabac et d'Arabidopsis
6.1 Méthodes de transformation Arabidopsis thaliana est transformé selon la méthode de trempage (dérivée de
(Bechtold et al, 1993)) des hampes florales dans une solution contenant les bactéries Agrobacterium tumefasciens préalablement transformées par les plasmides pBIl l l, pBIM131 ou pBIW13 par la méthode du choc thermique. Les agrobacteries sont cultivées sur boîte de Pétri sur milieu sélectif LB (contenant les antibiotiques spécifiques de l'agrobactérie et du plasmide portant la construction) à 28°C. Après 3 jours de culture, une colonie isolée est mise quelques heures en préculture dans 50 ml de milieu LB sélectif sous agitation à 28°C, et cette préculture est utilisée pour ensemencer une culture de 1 litre de milieu LB sélectif sous agitation à 28°C. Les agrobactéries sont récupérées par centrifugation et remises en suspension dans 1 litre de solution MS contenant du Saccharose (50 g/1) et du Silouet (50 μl 1), afin que la densité optique de la solution lue à 600 nm soit comprise entre 1,8 et 2. Les hampes florales d'Arabidopsis sont trempées 30 secondes dans cette solution et les plantes sont placées en "aracons". Arrivées à maturité, les graines sont récoltées.
Le Tabac est transformé selon la méthode des disques foliaires décrite par Horsch et al. (1984). Les plantes transformées sont sélectionnées sur milieu MS solide (0,8% Agar) supplémenté en kanamycine (100 μg/ml) et en carbénicilline (400 μg/ml). Les plantes transgéniques Tl sont amenées à floraison et leur autofertilisation permet d'obtenir plusieurs milliers de graines.
6.2 Caractérisation génétique des lignées transformantes L'estimation du nombre d'événements d'insertion de l'ADN-T chez les plantes transformées d'Arabidopsis et de Tabac est réalisée par un test de croissance des plantes sur un milieu gélose MS supplémenté en kanamycine (50 μg/ml pour les Arabidopsis, 400 μg/ml pour le Tabac). En effet, l'ADN-T comporte, en plus des constructions témoin, sens ou antisens, un gène responsable de la production de la protéine Nopaline-synthase II ou NPT-II, responsable de la détoxication de la kanamycine. La détermination du pourcentage de plantes résistantes dans une population de graines semées individuellement est réalisée dès 10 jours après semis pour Arabidopsis, et 15 jours après semis pour le Tabac. Ce dénombrement permet d'estimer, selon les lois mendéliennes de la ségrégation des caractères dominants, le nombre d'événements d'insertion de l'ADN-T dans le génome des plantes de génération Tl pour chaque lignée. Pour ceci, 200 graines issues de plantes de première génération (Tl) sont semées individuellement, et les plantes résistantes à la kanamycine sont comptées. Un test du κ2 est alors effectué pour éprouver la validité de l'estimation du nombre d'insertions.
6.2.1 Lignées transformantes de Tabac Les expériences de transformation du Tabac par les constructions témoin (pBIl 11), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13) ont conduit respectivement à l'obtention de 7, 19 et 14 lignées indépendantes.
La nomenclature utilisée pour la dénomination des différentes lignées obtenues est expliquée à l'aide de l'exemple suivant: la lignée "pBIM131-40A" comporte la construction sens pBIM131, et représente la première plante (A) issue du disque foliaire numéro 40.
Leur analyse génétique montre que la plupart des lignées transgéniques n'ont subi qu'un seul événement d'insertion de l'ADN-T : c'est le cas pour 71% (5 sur 7) des lignées témoins, 68% (13 sur 19) des lignées sens, et 57% (8 sur 14) des lignées antisens. Deux lignées témoin (29%) présentent deux événements d'insertion, de même que trois lignées sens (16%) et quatre lignées antisens (28%). Trois événements d'insertion de l'ADN-T sont estimés pour une lignée antisens (7%), mais pour aucune lignée sens ni aucune lignée témoin.
Parmi toutes les lignées obtenues, seule une lignée antisens (pBIW13-15A) ne présente pas une ségrégation mendélienne pour la résistance à la kanamycine (55% de "plantes résistantes). Cependant, un biais peut s'être insinué dans le dénombrement des plantes résistantes à la kanamycine puisque celles-ci sont petites et pâles, et difficiles à distinguer des plantes sensibles. Un test identique avec des concentrations plus faibles en kanamycine (100, 200 et 300 μg/ml) dans le milieu a conduit aux mêmes difficultés. Il est donc vraisemblable que l'ADN-T se soit inséré dans une partie du génome peu accessible à la machinerie de transcription chez cette lignée, conduisant à une production très réduite du transgène NPTII et à une difficile détoxication de la kanamycine, à l'origine d'une résistance à la kanamycine atteignant la limite du test utilisé. D'autre part, la lignée sens pBIM131-15A présente un très faible taux de germination, et il a fallu semer de très nombreuses graines pour pouvoir dénombrer les plantes résistantes à la kanamycine des plantes sensibles parmi 200 plantes ayant germé. De ce fait, ces deux dernières lignées n'ont pas été utilisées pour la suite des manipulations.
6.2.2 Lignées transformantes d'Arabidopsis
Les expériences de transformation d'Arabidopsis par les constructions témoin (pBIl l l), sens (pB_M131) et antisens (pBIW13) ont conduit respectivement à l'obtention de 2, 3 et 7 lignées indépendantes.
La nomenclature utilisée pour la dénomination des différentes lignées obtenues est expliquée à l'aide de l'exemple suivant: la lignée "pBIM131-A2" comporte la construction sens pBIM131, et représente la deuxième plante (2) issue de la première expérience (A) de transformation d'Arabidopsis. Aucun événement d'insertion multiple de l'ADN-T n'a été détecté pour les lignées transgéniques d'Arabidopsis. Du fait du faible nombre de lignées obtenues, la génération d'autres lignées a été entreprise, et elles sont en cours de sélection.
6.3 Caractérisation moléculaire des lignées transformantes
Afin de vérifier l'insertion de chacune des constructions pBIl l l, pBIM131 et -pBIW13 dans le génome des plantes transformantes de Tabac et d'Arabidopsis, un test PCR est effectué. Il utilise l'ADN génomique de la lignée à tester comme matrice, et un couple d'oligonucléotides spécifique de chaque construction comme amorces. La figure 2 présente la localisation des oligonucléotides utilisés pour ces tests sur les constructions témoin (pBIl l l), sens (pBIM131) et antisens (pBIW13). Ainsi l'utilisation du couple FIN35S/NOS-TRev procure un fragment de 311 pb uniquement avec le plasmide pBIl 1 ou une plante transformée par la construction témoin, l'utilisation du couple FIN35S/RTMYB3 procure un fragment de 550 pb uniquement avec le plasmide pBIM131 ou une plante transformée par la construction sens, et l'utilisation du couple FIN35S/RTMYB5 procure un fragment de 1050 pb uniquement avec le plasmide pBIW13 ou une plante transformée par la construction antisens. Toutes les autres utilisations des ces couples ne conduisent à aucune amplification.
La vérification de l'insertion des ADN-T pour chaque lignée transgénique de Tabac et d'Arabidopsis a été effectuée sur leur ADN génomique, en utilisant chacun des trois plasmides portant les trois constructions comme témoins positifs, et l'ADN génomique de la lignée sauvage B S ou de l'écotype sauvage Col-0 comme témoins négatifs. Sur la figure 3, sont reportés les résultats obtenus avec quelques-unes des lignées. Ainsi les lignées pBIl 11- 9A et pBIl 11-23A de Tabac et les lignées pBIl 11-A1 et pBIl 11-A2 d'Arabidopsis portent bien la construction témoin pBIl l l, les lignées pBIM131-27D, pBIM131-27F, pBIM131- 4C, pBIM131-13C, pBIM131-40A, pB_M131-47A et pBIM131-50A de Tabac et les lignées pBIM131-Al, pBIM131-A2 et pBIM131-A3 d'Arabidopsis possèdent la construction sens ρBIM131, et les lignées pBW13-25C et pBW13-44B de Tabac et les lignées pBW13-Al et pBW13-A7 sont effectivement transformées par la construction antisens pBIW13. Par contre, la lignée sauvage de Tabac BS ou l'écotype sauvage Col-0 d'Arabidopsis ne montrent pas d'amplification avec aucun des trois couples d'oligonucléotides. De même, aucune des 40 lignées de Tabacs ou des 12 lignées d'Arabidopsis n'est à l'origine d'une amplification non spécifique de la construction qu'elle possède (résultats non montrés).
7 Mesure du taux de mort cellulaire
La méthode utilisée (méthode dite au "Bleu Evans"(Baker and Mock, 1994)), permet de détecter la mort des cellules végétales. En effet, le colorant "Bleu Evans" n'est pas capable de pénétrer dans les cellules intactes, et n'est pas retenu par les cellules mortes. Par contre, il est capable de traverser les membranes endommagées et est retenu par les cellules mourantes. Il est donc possible de comparer le taux de mort cellulaire entre deux échantillons végétaux par la quantité de colorant retenu. Ce type de mesure a été effectué lors d'inoculations de Tabacs par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum. Pour chaque lignée et chaque point cinétique, sont prélevés deux disques de 0,5 cm2 sur quatre plantes différentes (soit huit disques) à l'emporte-pièce dans la zone inoculée. Ces huit disques sont plongés 20 min dans une solution de Bleu Evans (0,25 %) sous agitation circulaire modérée (80 tr/min) à 25°C. Les disques sont ensuite abondamment rincés sur verre fritte à l'aide d'eau stérile (50 ml environ) de façon à éliminer tout le Bleu Evans non retenu. Les disques sont ensuite placés dans des tubes eppendorf, congelés dans l'azote liquide, puis conservés à -80°C jusqu'à l'extraction. Celle-ci consiste au broyage des disques dans l'azote liquide. La poudre obtenue est mise en suspension dans 1 ml de SDS 0,5%, puis elle est agitée vigoureusement pendant 1 min. Après une centrifugation de 3 min à 10 000 g, 250 μl du surnageant obtenu sont dilués dans 750 μl d'eau. Une lecture de la densité optique à 600 nm est effectuée pour chaque échantillon, et les résultats sont exprimés en unité DOβoo (moyennes et écart-types) par cm2 de tissu végétal. 8 Mesure du taux de chlorophylles a et b
Les échantillons de feuille (0,5 g) sont broyés dans 5 ml d'acétone à 80%. La solution obtenue est agitée vigoureusement 5 min et filtrée sur laine de verre. Les résidus fixés à la laine de verre sont lavés avec de l'acétone 80 % jusqu'à ce que l'ensemble des pigments soient extraits. L'éluat est récupéré et ajusté à 20 ml avec de l'acétone 80%. Le dosage est réalisé par spectrophotométrie à 663 et 645 nm. Les concentrations en chlorophylles a et b sont calculées à partir des formules ci-dessous. Ces concentrations sont exprimées en milligrammes de chlorophylles a et b par gramme de poids frais de tissu végétal.
Chl a ≈ ( 12,7 X DO6 5) - (2,69 X DO66_) Chl b = (22,9 X DO6 5) - (4,68 X DO663) Chl a + b = ((Chla + Chl b) X 20)) / (10 X poids frais) Les résultats sont exprimés en % de la quantité de chlorophylles présentes chez la lignée sauvage lors de la première extraction, pour chaque étage foliaire.
Exemple 1 Isolement de l'ADNc codant pour le facteur AtMYB30
Afin d'isoler des gènes spécifiquement induits lors des étapes précoces de la HR, un criblage différentiel a été entrepris chez A. thaliana (écotype Col-0) inoculé par la souche 147 de X.c.c, une heure après inoculation, en présence de cycloheximide. Des suspensions cellulaires répondant de la même façon que des plantes entières aux inoculations furent utilisées pour obtenir des réponses homogènes et reproductibles. L'utilisation du cycloheximide permit de se focaliser sur les toutes premières étapes de la réponse hypersensible en isolant des gènes dont l'activation transcriptionnelle est indépendante de la synthèse de novo de protéines. Les 27 clones d'ADNc indépendants isolés au terme de ce criblage différentiel peuvent être répartis en sept familles ATHSR (pour Arabidopsis thaliana hypersensitivity-related gènes) sur la base d'expériences d'hybridations croisées entre les clones et d'analyse de leur similitudes de séquences par interrogation des banques de données. Un des ADNc a été entièrement séquence pour les familles ATHSR1 (correspondant au gène AtMYB30), ATHSR2 (le clone RaRI2I), et ATHSR3 (le clone RaR105), et une séquence partielle a été réalisée pour l'extrémité 5' pour tous les autres clones.
Le clone correspondant à la famille ATHSR1 présente des similitudes de séquence très fortes avec les facteurs transcriptionnels de type MYB. Le gène ATHSRI a été rebaptisé AtMYB30 afin de se conformer à la nomenclature internationale des facteurs MYB. La séquence nucléotidique de l'ADNc d'AtMYB30 et la séquence en acides aminés de la protéine déduite sont montrées dans SEQ ID NO 1. L'ADNc a une taille de 1310 pb et l'ORF prédite de 969 pb code un polypeptide de 323 résidus avec un poids moléculaire de 36 kDa. La séquence N-terminale d'AtMYB30 contient les répétitions MYB (R2, R3) généralement présentes chez les protéines MYB végétales. Ce motif est fortement similaire au domaine MYB caractéristique de cette famille de facteurs transcriptionnels (Martin and Paz- Ares, 1997). Les résidus tryptophane fortement conservés dans c-myb sont présents dans AtMYB30. Le premier résidu tryptophane de la répétition R3 est substitué par un résidu phenylalanine, une substitution qui est, en plus de l'isoleucine, communément trouvée à cette position chez les protéines MYB végétales. La séquence en acides aminés d'AtMYB30 a ensuite été comparée avec celles d'autres protéines MYB d'A. thaliana, d'autres espèces végétales et d'animaux. Le degré de similitude parmi ces séquences indique que différentes sous-classes de protéines MYB végétales peuvent être définies, au delà du groupe des protéines MYB animales. AtMYB30 appartient à un sous-groupe incluant AtMYB31 (antérieurement cY13), AmMYB306 et LeTHM6. AtMYB30 présente les plus fortes similitudes avec la protéine du Muflier AmMYB306 (Jackson et al, 1991) (60% d'identité et 74% de similitude), et à un moindre degré, à la protéine AtMYB31 d'A. thaliana (53% d'identité et 70% de similitude) et à la protéine LeTHM6 de la Tomate (66% d'identité et 72% de similitude). AtMYB30 partage aussi des similitudes avec d'autres protéines MYB, plus spécifiquement dans le domaine Myb. Aucune similitude significative n'a été trouvée dans la pertie C-terminale entre AtMYB30 et d'autres protéines MYB. Cependant, deux éléments de séquence, GQWERxLQTDIHxxKxALxxALS et TxYASSTENIAxLLxxW, sont conservés entre AtMYB30, AmMYB306, AtMYB31 et LeTHMό. Une analyse Southern a été réalisée afin d'étudier l'organisation génomique du gène
AtMYB30. Afin d'éviter de détecter d'autres membres de la famille des gènes MYB, un fragment d'ADNc de 453 bp spécifique de la partie C-terminale de la protéine a été utilisée comme sonde. Un seul fragment a pu être détecté pour les quatre digestions impliquant des enzymes qui ne coupent pas l'ADNc, indiquant qu'AtMYB30 est un gène unique. Par comparaison, un fragment de 193 bp correspondant au domaine Myb a également été utilisé comme sonde. Plusieurs fragments ont été détectés dans ce cas, confirmant l'existence d'une superfamille de gènes MYB chez A. thaliana (Kranz et al. , 1998).
La question du rôle du gène AtMYB30 dans la HR a été abordée en mettant en Oeuvre trois stratégies complémentaires. La première stratégie correspond à l'étude précise de son profil d'expression au cours de diverses interactions entre Arabidopsis et des agents pathogènes, afin d'apporter d'éventuelles données permettant d'établir une corrélation temporelle entre l'activation du gène et la HR. La deuxième stratégie a été entreprise via l'analyse de la régulation de la transcription du gène AtMYB30 chez des mutants Isd d'Arabidopsis affectés dans les programmes de mort cellulaire (Dietrich et al, 1994), ainsi que chez les suppresseurs phx correspondants (Morel and Dangl, 1999), dans le but d'explorer l'hypothèse de l'existence d'une relation entre les phénotypes mutants observés et son expression. La troisième stratégie se base sur la génération et l'analyse de lignées transgéniques de plantes sur- ou sous-exprimant le gène AtMYB30, afin d'avoir un accès direct aux conséquences phénotypiques éventuelles d'une dérégulation de ce gène.
Expression d'AtMYB30 au cours du développement et en réponse aux agents pathogènes
Afin d'étudier l'expression du gène AtMYB30, nous avons analysé la régulation développementale ainsi que les effets d'agents pathogènes bactériens virulents et avirulents sur le niveau de transcrits A ÏMYB3Q. Dans les plantes d'A. thaliana, il n'a pas été possible de détecter des transcrits AtMYB30 par analyse Northern, indiquant qu'AtMYB30 est exprimé à très faible niveau, comme précédemment mentionné pour différents gènes MYB (Leech et al, 1993; Li and Parish, 1995). Par conséquent, nous avons déterminé le niveau des transcrits AtMYB30 par RT-PCR en utilisant le gène de β-tubuline 4 exprimé constitutivement comme contrôle interne. Les ARN messagers d'AtMYB30 s'accumulent au cours des étapes précoces du développement, à savoir dans des plantules âgées de deux semaines, mais demeurent à peine détectable au cours des autres étapes développementales, dans toute la plante. Afin d'étudier l'expression d'AtMYB30 en réponse aux agents pathogènes, une préparation d'ARN a été réalisée à partir de cellules en culture inoculées par X.c.c, le système biologique d'origine pour l'isolement du clone d'ADNc. Des sondes PAL et RaR136 ( un clone constitutivement exprimé dans les cellules, résultats non publiés) ont servi de contrôle de l'infection des cellules et de la viabilité cellulaire, respectivement. Les transcrits AtMYB30 n'ont pas pu être détectés au cours de l'interaction compatible, ni en réponse au mutant hrp- de X.c.c, incapable de causer de symptômes chez Arabidopsis (Arlat et al, 1991). Au contraire, les transcrits d'AtMYB30 s'accumulent transitoirement une heure après inoculation avec l'isolât bactérien avirulent. Par comparaison, les transcrits PAL s'accumulent au cours de la HR à un taux maximal 24 heures après inoculation. Une accumulation similaire des transcrits PAL est observée au cours de l'interaction compatible, mais les niveaux sont significativament plus faibles. Comme attendu, l'expression constitutive de RaR136 a été observée dans tous les cas, sauf dans des cellules infectées pendant 24 heures. Cette exception peut être expliquée par une viabilité réduite des cellules tardivement après infection. L'accumulation des transcrits AtMYB30 a aussi été évaluée dans des plantes d'Arabidopsis infectées par le même pathogène. Il a été montré qu'AtMYB30 est exprimé transitoirement entre une et deux heures, et spécifiquement au cours de la réponse hypersensible (interaction entre l'isolât avirulent 147 et l'écotype résistant Col-0). Aucune expression n'a pu être détectée au cours de l'interaction compatible (interaction entre l'isolât 147 et l'écotype sensible Sf-2) ou en réponse à un traitement par de l'eau. En réponse à un autre agent pathogène bactérien, Pseudomonas syringae pv. tomato (isolât DC3000 (Whalen et al, 1991)), comportant ( ou non) le gène d'avirulence avrRpml (Debener et ai, 1991) ou le gène d'avirulence avrB (Wanner et ai, 1993), AtMYB30 est exprimé transitoirement et préalablement à l'apparition de la mort cellulaire, à savoir une heure après inoculation (la mort cellulaire hypersensible étant observée 9 heures et 7 heures après inoculation, respectivement), dans nos conditions expérimentales. Au cours de l'interaction compatible, aucune expression d'AtMYB30 n'a pu être détectée.
L'expression d'AtMYB30 est induite dans des mutants affectés dans l'initiation de la mort cellulaire programmée, et supprimée chez les suppresseurs correspondants
Des mutants d'Arabidopsis montrant des lésoins nécrotiques mimant la réponse de résistance en l'absence de pathogène ont été caractérisés (Dietrich et al, 1994; Greenberg et al, 1993; Greenberg et al, 1994). Ils sont supposés être affectés dans le contrôle de la mort cellulaire hypersensible, et donc offrent l'opportunité d'explorer les relations entre l'activation spécifique d'AtMYB30 et la mort cellulaire programmée. L'expression d'AtMYB30 a été étudiée chez trois mutants d'initiation, lsd3, lsd4 et lsd5, dont le phénotype "lésions" est sous la dépendance de la lumière. Les lésions sont visibles 24h, 4 jours et 6 jours après transfert des plantes dans les conditions permissives, respectivement pour lsd5, lsd3 et lsd4. En parallèle, l'expression du gène PR1, dont l'accumulation des transcrits est corrélée à l'apparition des lésions chez ces mutants, a aussi été analysée, en tant que témoin. Tandis que les transcrits PR1 ne s'accumulent que lorsque les trois mutants conditionnels montrent des lésions, AtMYB30 est aussi exprimé en l'absence de lésions : constitutivement et fortement chez les mutants lsd5 et lsd4. Au contraire, AtMYB30 n'est pas exprimé chez le mutant lsd3 en l'absence de lésions. Aucune expression d'AtMYB30 n'est détectée chez l'écotype sauvage Ws-0 dont dérivent les mutants lsd3, lsd4 et lsd5.
Pour une meilleure compréhension des relations existant entre les mutations lsd5 et lsd4, qui conduisent à l'expression constitutive d'AtMYB30, et l'expression d'AtMYB30, différentes lignées suppresseurs produites à partir du mutant lsd5 ((Morel and Dangl, 1999), et résultats non publiés), ont été analysés. Selon nos résultats, lors du transfert dans les conditions permissives, des lignées doubles mutants ne montrent plus de lésions nécrotiques (phxlllsd5, phx2llsd5, et phxll-lllsd5) ou montrent des lésions de taille beaucoup plus réduite (phx3llsd5 et phxlOllsdδ). Comme précédemment décrit, AtMYB30 est exprimé chez lsd5 quelles que soient les conditions. Au contraire, les transcrits d'AtMYB30 ne sont détectés chez aucune des lignées suppresseurs, ou chez l'écotype sauvage Ws-0. De même, l'activation du gène AtMYB30, constitutive chez le mutant lsd4, est supprimée chez la descendance du croisement phxlllsd4. Il a été montré que le mutant phxl supprime la mort cellulaire normalement provoquée par la mutation lsd4 (Morel, résultats non publiés).
L'expression d'AtMYB30 n'est pas altérée chez le mutant Isdl, affecté dans la propagation de la mort cellulaire
Le mutant Isdl d'A. thaliana montre une altération du contrôle de la mort cellulaire en l'absence de pathogène : il est incapable de contrôler l'étendue de la mort cellulaire une fois qu'elle est initiée (Dietrich et al, 1994; Jabs et al, 1996). Ce mutant représente un excellent outil pour explorer le rôle d'AtMYB30 dans la limitation de la mort cellulaire. Dans ce but, l'expression d'AtMYB30 a été analysée chez des plantes Isdl montrant ou non des lésions, en comparaison avec des plantes sauvages dans les mêmes conditions. Comme auparavant, l'expression du gène PR1 a également été suivie, en tant que témoin, elle accompagne la formation et la propagation des lésions. Il a été montré que ce marqueur de défense s'accumule systématiquement dans les plantes montrant des lésions. De façon surprenante, l'expression d'AtMYB30 n'a pas pu être détectée chez Isdl, quel que soit la phénotype observé. Des données similaires ont été obtenues avec un suppresseur de la mutation Isdl, phx21, ou chez l'écotype sauvage Ws-0. Exemple 2 Constructions permettant la modulation de l'expression du gène AtMYB30 chez des plantes transgéniques
Les plasmides pB_M131, pBIW13, et pBIl l l (figure 4) dérivent des plasmides pBI221 (Clontech), pBI121 (Clontech, (Jefferson et al, 1987)) et du plasmide correspondant au clone RaR015 comportant l'ADNc du gène AtMYB30 (Lacomme, 1996). Le plasmide pBIM131 est un plasmide binaire dont l'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une construction où la région codante du gène AtMYB30 est placée sous la dépendance du promoteur 35S du CaMV et du terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Ce plasmide a été utilisé pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis pour la surproduction de la protéine AtMYB30 chez des lignées "sens". Le plasmide pBIW13 est un plasmide binaire dont l'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une construction où la région codante du gène AtMYB30 est placée en orientation antisens sous la dépendance du promoteur 35S du CaMV et du terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Cette construction a été utilisée pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis pour inhiber la production de la protéine AtMYB30 chez Arabidopsis, et d'inhiber la production de la protéine orthologue chez le Tabac chez des lignées "antisens". Le plasmide pBIl l l est un plasmide binaire dont l'ADN-T comprend un gène responsable de la résistance à la kanamycine, et une fusion entre le promoteur 35S du CaMV et le terminateur NOS d'Agrobacterium tumefasciens. Ce plasmide a été utilisé pour transformer des plantes de Tabac et d'Arabidopsis, dans le but d'obtenir des lignées "témoins" dans les deux cas, afin de n'imputer la cause des phénotypes des lignées "sens" et des lignées "antisens" qu'aux différences entre les contructions, et non pas à l'événement de transformation ou à la nature insertionnelle de la transformation. Ces trois plasmides ont été soumis à la vérification de leur séquence nucléotidique à trois reprises, sur les deux brins de l'ADN. Elle n'a révélé aucune mutation dans la région codante du gène AtMYB30 chez les plasmides pB_M131 et pBIW13, et toutes les fusions créées lors des expériences de ligation lors de la génération des trois plasmides (pBIl l l, pBIM131, et ρBIW13) ont été vérifiées. Exemple 3 Analyse des lignées sens de Tabac Dix-huit lignées transformantes comportant la construction sens du gène AtMYB30 sous la dépendance du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur CaMV ont été examinées. Chez des plantes âgées de 2 mois, aucun phénotype ne semblait les différencier de la lignée sauvage BS (Bottom Spécial). Or, la relation forte entre son expression et la mort cellulaire hypersensible établie chez Arabidopsis laissait présager l'obtention d'un phénotype de type "lésions spontanées" ou d'un phénotype altéré pour la HR. Aucune lésion spontanée n'étant observée sur les lignées transgéniques obtenues, et afin de tester cette hypothèse, un test de pathogénicité a été effectué sur l'ensemble de nos lignées "sens" (possédant la construction sens pB_M131). Ce test consiste à inoculer les plantes par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum, bactéries nécrotrophes qui provoquent respectivement la HR en 24 heures et la maladie à partir de trois jours sur la lignée sauvage BS avec des inocula de 5.107 cfu/ml.
3.1 Des lignées sens présentent des phénotypes altérés en réponse à des inoculations bactériennes L'inoculation de dix-huit lignées sens, ainsi que de la lignée sauvage BS, par la souche avirulente GMI 1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum a permis d'observer une différence nette entre les phénotypes de la lignée sauvage et de certaines des lignées sens.
3.1.1 Des lignées sens présentent une résistance accrue vis-à-vis de la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum
L'inoculation de la souche avirulente GMI1000 de R. solanacearum des lignées sens a conduit à l'observation de phénotypes différents de celui de la lignée sauvage BS. Ces différences dans la vitesse d'apparition et la gravité des symptômes a pu être quantifiée, et a permis de classer les dix-huit lignées sens testées en trois classes, selon le phénotype observé (tableau 1 ci-dessous et figure 7). Tableau 1 Classification des différentes lignées sens de Tabacs en fonction de leur phénotype par rapport à la lignée sauvage BS lors d'inoculations par la souche avirulente
GMI 1000 de R. solanacearum.
Figure imgf000040_0001
3.1.2 Des lignées sens présentent une sensibilité altérée vis-à-vis de la souche virulente K60 de R. solanacearum
Des inoculations de la souche virulente K60 de R. solanacearum ont été effectuées sur les 18 lignées sens et la lignée sauvage. Une inoculation de cette souche à la concentration de 5.107 cfu/ml provoque l'apparition d'une chlorose des tissus (la couleur passe du vert profond au vert clair) trois jours après inoculation qui s'aggrave (les tissus deviennent jaunes) et s'étend au-delà de la zone inoculée chez la lignée sauvage après cinq jours. Ces observations sont typiques d'une interaction compatible conduisant à la maladie.
L'observation des symptômes après inoculation montre pour les lignées sens pBIM131-4D, pBIM131-13A, pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A et pBIM131-50A un phénotype très différent de la lignée sauvage. Les zones inoculées ne présentent pas de chlorose évasive, mais apparaissent des taches nécrotiques qui confluent, et aboutissent à la formation de lésions nécrotiques brunes limitées aux zones inoculées, et entourées d'un faible halo chlorotique. Ces lésions rappellent celles observées lors d'une interaction débouchant sur la réponse hypersensible, mais leur couleur est plus sombre, et leur aspect est beaucoup moins lisse. 3.1.3 Les classes phénotypiques identifiées sont corrélées à la quantité de protéine AtMYB30 produite chez les plantes transgéniques
L'hypothèse d'une corrélation entre les phénotypes observés lors d'inoculations par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum et le taux de production de la protéine AtMYB30 chez les différentes lignées sens a été testée par des .analyses de type Western blot. Les protéines solubles de lignées représentant les différentes classes phénotypiques observées ont été extraites et la production de la protéine AtMYB30 a été évaluée en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine de fusion recombinante GST-AtMYB30. Les lignées qui ont été utilisées sont la lignée sauvage BS, deux lignées se comportant comme cette dernière (pBIM131-27D et pBIM131-27F), quatre lignées dont le phénotype est particulièrement fort (pBIM131-13C, pBIM131-40A, pBIM131-47A et pBIM131-50A), et une lignée présentant un phénotype intermédiaire (pBIM131-4C). Les résultats de cette analyse montrent que la protéine AtMYB30 n'a pas pu être détectée chez la lignée sauvage BS ou les deux lignées pBIM131-27D et pBIM131- 27F, mais qu'il est possible de détecter clairement une bande protéique chez les autres lignées, d'un poids moléculaire d'environ 36 kDa, poids moléculaire attendu pour le produit protéique du gène AÏMYB30. Une même analyse de type Western blot, effectuée dans les mêmes conditions, n'a pas permis de détecter la protéine AtMYB30 chez deux lignées témoins (pBl l l-9A et pBIl l l-23A) possédant la construction témoin pBIl l l (résultats non montrés).
Pour la suite des manipulations, nous avons choisi d'utiliser la lignée pBIM131-40A car elle représente la catégorie de lignées sens dont le phénotype est très clairement altéré par comparaison avec celui de la lignée sauvage, et qu'elle ne présente qu'un seul événement d'insertion de l'ADN-T. La lignée pBIM131-4C a aussi été utilisée lors de certaines manipulations en raison de son phénotype intermédiaire et de son événement unique d'insertion de l'ADN-T. La lignée sauvage BS, ainsi que la lignée témoin pBIl 11-23 A, ont respectivement servi de témoin négatif, et de lignée témoin.
3.1.4 Mesure de la croissance bactérienne in planta
La mesure de la croissance bactérienne in planta ou IGC permet d'obtenir des informations sur la façon dont les bactéries se multiplient dans les tissus végétaux, et éventuellement d'en déduire l'efficacité des réactions de défense des plantes dans la limitation de la croissance des bactéries. Dans le but d'étudier le rôle du gène AtMYB30 dans ce phénomène de restriction de la croissance de R. solanacearum au sein des tissus de Tabac, des expériences d'IGC ont été réalisées après inoculation par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 chez la lignée sauvage BS, et les lignées témoin pBIl 11-23 A et sens pB_M131-40A. La croissance de la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum est altérée chez la lignée senspBIM131-40A
Les six premiers jours d'observation ne permettent pas de distinguer de différence de croissance bactérienne entre la lignée sauvage BS, la lignée témoin pBIl 11-23 A et la lignée sens pB_M131-40A, bien que la concentration en bactéries chez cette dernière lignée soit inférieure à celle détectée chez la lignée sauvage et la lignée témoin dès le troisième jour (72 heures). En effet, dans tous les cas, une chute du taux de bactéries mesuré dans les zones inoculées est d'abord détectée lors des premières 24 heures. Par la suite, les bactéries se multiplient (une croissance correspondant à une ou deux unités logarithmiques est observée entre 24 et 48 heures) et leur nombre reste relativement constant jusqu'à six jours après inoculation. Au-delà de ce point cinétique, une disparité entre la lignée sauvage et la lignée témoin d'un côté, et la lignée sens de l'autre, est détectée : une diminution brusque et forte des bactéries entre 6 et 14 jours après inoculation caractérise la lignée pBIM131-40A, alors que cette chute est beaucoup moins brutale, et même moins forte en fin de cinétique pour l'inoculum le plus concentré, chez la lignée sauvage BS et la lignée témoin pBIl 11-23 A.
La croissance de la souche virulente K60 de R. solanacearum est altérée chez la lignée senspBIM131-40A
Les mêmes expériences d'IGC ont été réalisées en employant la souche virulente de R. solanacearum, K60. Dans ce cas, la croissance des bactéries dans les tissus situés immédiatement autour des zones inoculées a également été mesurée. L'analyse des résultats indique que le nombre de bactéries présentes chez la lignée sauvage et chez la lignée témoin est comparable. Dans les zones inoculées, il apparaît que les bactéries virulentes sont capables de se multiplier au sein des tissus pendant les six premiers jours. Leur nombre est supérieur dans le cas de la lignée sens pBIM131-40A au troisième jour suivant l'inoculation. Par la suite, l'importance de la chute du nombre de bactéries au delà de six jours est réellement plus importante chez cette lignée que chez la lignée témoin pBIl l l -23 A ou la lignée sauvage BS : à dix et quatorze jours après inoculation, le taux de croissance bactérien est dix fois inférieur chez la lignée pBEM131-40A. La croissance bactérienne a aussi été évaluée dans les tissus immédiatement adjacent aux zones inoculées. Les bactéries sont détectées dès trois jours après inoculation, se multiplient et atteignent un maximum, puis leur nombre chute pour ne plus être détectable quatorze jours après inoculation. Si les trois courbes partagent le même profil, le pic de croissance des bactéries apparaît clairement plut tôt (6 jours) pour la lignée pB_M131-40A que pour la lignée témoin ou la lignée sauvage (10 jours). Dans tous les cas cette croissance est transitoire, ce caractère étant plus marqué pour la lignée sens pBIM131-40 A.
La figure 6 présente les résultats obtenus sur la croissance bactérienne in planta de R. solanacearum inoculée à 5.107 CFU/ml dans des plantes transgéniques de Tabac. A, Interaction incompatible avec la souche bactérienne avirulente GMI1000. B, Interaction compatible avec la souche virulente K60. Dans les deux cas (A et B) les prélèvements ont été effectués dans la zone d'infiltration. Les résultats présentent les moyennes et les écarts- types obtenus sur deux séries de prélèvements. Les résultats montrent un maintien de la population bactérienne jusqu'à 3 jours après l'inoculation dans la zone inoculée. Cette phase est suivie par une diminution progressive des populations bactériennes chez les lignées sauvage, témoin et antisens, qui ne s'accentue qu'après 9 jours. Cependant, après seulement 6 jours, une diminution très importante de la population bactérienne est observée chez la lignée sens, avec une extinction presque totale de la souche GMI 1000, 13 jours après l'inoculation.
3.1.5 Mesure du taux de mort cellulaire après inoculation bactérienne
L'observation des symptômes et des profils de croissance bactérienne in planta lors d'inoculations par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum ont permis de mettre clairement en évidence le phénotype mutant de certaines lignées sens (et notamment la lignée pBIM131-40A) en comparaison avec la lignée sauvage ou la lignée témoin pBIl l l-23A. Afin d'apporter des données complémentaires à ces résultats expérimentaux, nous avons cherché à savoir si la cinétique du déclenchement et/ou de l'extension de la mort cellulaire était aussi altérée chez cette lignée surproduisant la protéine AtMYB30. Pour ceci, nous avons réalisé des tests de type "Bleu Evans" selon la méthode décrite par Baker et Mock (1994). Des expériences utilisant la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum ont été effectuées. Laβgure 5 illustre les résultats obtenus sur la mesure de la mort cellulaire par •coloration au Bleu Evans (Backer et Mock, 1994) sur Tabac après inoculation avec cette souche bactérienne, à un inoculum faible (107 cfu/ml). Les cinétiques présentées montrent l'apparition d'un pic de pénétration du colorant dans le cas de la lignée sens, correspondant à l'apparition des symptômes, 19 heures après l'inoculation. Après le 'collapse' des tissus, les nécroses apparaissent, et le colorant n'est plus retenu. Ce pic représentatif de la mise en place de la réponse hypersensible apparaît plus précocement et est trois fois plus élevé chez la lignée sens que chez la lignée sauvage où il est relativement faible du fait de l'inoculum peu concentré utilisé lors de cette expérience. Une rétention moindre du Bleu Evans est également observée plus tardivement chez la lignée antisens.
L'interaction entre la souche virulente K60 de R. solanacearum et la lignée sauvage BS ou la lignée témoin pBIl l l-23A conduit à la maladie. Dans ce cas, les profils de croissance bactérienne in planta présentés par ces deux lignées sont identiques: la mort cellulaire est détectée environ 48 heures après l'inoculation de la bactérie, et son taux chute à trois jours, pour devenir indétectable dès six jours. Le profil obtenu avec les plantes de la lignée sens pBIM131-40A est très différent. La mort cellulaire est détectée plus tôt (dès 24 heures après inoculation), son taux est plus fort deux jours après inoculation, et elle n'est plus détectable à partir de trois jours. De plus, ce taux est beaucoup plus important que chez la lignée sauvage ou la lignée témoin, puisqu'il est possible de mesurer une différence atteignant un facteur dix entre ces deux lignées et la lignée sens pBIM131-40 A.
3.1.6 L'expression de gènes liés à la pathogénicité est altérée chez la lignée sens pBIM131-40A
Le profil d'expression des gènes str246C et hsr203J du Tabac a été étudié lors d'inoculations par les bactéries avirulente GMI1000 et virulente K60 de R. solanacearum chez la lignée sauvage BS, la lignée témoin pBIl l l-23A, et la lignée sens pBIM131-40A. Alors que ces deux gènes montrent une expression similaire chez les deux premières lignées, des différences importantes ont été observées chez la lignée sens pB_M131-40A. Lors de ces expériences, le gène EF-la d'Arabidopsis est utilisé comme témoin interne constitutif. L 'expression du gène str246C est altérée chez la lignée sens pBIMl 31-40 A Alors que le gène str246C n'est pas induit lors de l'inoculation par de l'eau chez la lignée sauvage ou chez la lignée témoin pBIl l l -23 A, son expression est détectée très tôt (dès 6 heures) et jusqu'à 6 jours après inoculation chez la lignée sens pB_M131-40A. En outre, cette expression est plus précoce et plus forte en réponse aux souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum. Cependant, elle n'est pas détectée chez les plantes non inoculées, quelle que soit la lignée : l'expression du gène str246C n'est donc pas constitutive chez la lignée sens pB_M131-40A, mais plus rapidement et plus fortement induite lors des trois inoculations chez cette lignée. L'expression du gène hsr203J est altérée chez la lignée senspBIM131-40A
Chez la lignée sauvage BS ou la lignée témoin pBIl l l -23 A, le gène hsr203J est essentiellement exprimé lors des premières étapes de l'interaction incompatible avec la souche GMI 1000, puisqu'elle est détectée 6 heures et 12 heures après inoculation. En revanche, elle est à peine détectable lors de l'interaction compatible, et absente chez les plantes non inoculées ou inoculées par de l'eau. Par contre, le gène hsr203J présente un profil d'expression différent chez la lignée sens pBIM131-40A. Cette expression est aussi détectée 6 heures après inoculation par la souche GMI 1000, mais maintenue plus longtemps que chez la lignée sauvage. De plus, elle est détectée très clairement au cours de l'interaction compatible 12 heures après inoculation. Enfin, ce gène n'est pas exprimé en absence d'inoculation..
3.2 La sénescence des feuilles de lignées sens est retardée Lors de l'étude du processus de sénescence des feuilles de Tabac, les huit premières feuilles adultes (en partant de la base de la plante) ou huit premiers étages foliaires de quatre plantes différentes sont prises en compte pour chaque lignée. Leur couleur et leur degré de nécrose sont estimés visuellement. En effet, les feuilles changent de couleur au cours de ce processus développemental. Cette dernière passe progressivement du vert profond au jaune, et l'étape ultime de cette évolution est caractérisée par la nécrose des feuilles, qui prennent une teinte brunâtre, et se dessèchent progressivement. Cette séquence d'événements est dépendante de l'âge des feuilles, et se produit d'abord pour les feuilles les plus âgées.
3.2.1. L'observation du phénotype de lignées sens montre un retard de la sénescence des feuilles Lors de l'étude du processus de la sénescence des feuilles chez les lignées sens, une différence de phénotype par rapport à la lignée sauvage a été clairement observée. Alors que les premiers étages foliaires de la lignée sauvage BS et de la lignée témoin pBIl l l-23A présentent une sénescence avancée (les dix premières feuilles sont nécrosées), les plantes issues de la lignée sens pB_M131-40A ne présentent que le début de ce processus : n'apparaissent qu'une ou deux feuilles nécrosées, et la perte de couleur des étages foliaires supérieurs est relativement faible. Il faut remarquer que l'observation de cette altération de la sénescence foliaire chez les différentes lignées sens a abouti à la même classification établie lors de l'étude de la réponse des lignées sens à l'inoculation par la souche avirulente GMI 1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum, et de la détection de la protéine AtMYB30. De façon générale, les feuilles des plantes issues des lignées sens semblaient •avoir une taille légèrement supérieure à celles de la lignée sauvage. Afin de quantifier ces observations, le nombre de feuilles vertes et de feuilles nécrosées parmi les huit premiers étages foliaires, a été déterminé chez quatre plantes des lignées sens pBIM131-40A et pBIM131-4C, de la lignée témoin pBIl l l -23 A, ainsi que de la lignée sauvage BS. Les résultats obtenus traduisent parfaitement l'impression visuelle ressentie lors des observations des lignées sens en général, et montrent un retard dans le déclenchement et un ralentissement du processus de sénescence foliaire chez les lignées sens pB_M131-4C et pBIM131-40A. Le retard observé se traduit, notamment pour la lignée pBIM131-40A, par l'apparition différée des premières feuilles nécrosées : quatre-vingt-dix jours après semis pour cette lignée, soixante jours pour la lignée sauvage. Le ralentissement du processus de sénescence peut être évalué par l'importance des pentes des différentes courbes: elles sont globalement plus faibles chez les deux lignées sens que chez la lignée témoin ou la lignée sauvage.
3.2.2 Les pigments chlorophylliens sont conservés plus longtemps Afin de confirmer les différences observées visuellement lors du processus de sénescence foliaire, une mesure de la quantité de chlorophylles dans les feuilles au cours du temps a été réalisée. Ces expériences ont été effectuées sur les plantes ayant servi aux dénombrements des feuilles vertes ou nécrosées. Les huit premiers étages foliaires ont été soumis à l'extraction des pigments chlorophylliens. La lignée sens analysée, pBIM131-40A, montre une diminution de la quantité de chlorophylles beaucoup plus lente que la lignée sauvage ou la lignée témoin pBIlll -23 A pour les quatrième et huitième étages foliaires. Ceci est vrai pour les huit étages foliaires pour lesquels cette mesure a été effectuée (résultats non montrés). Il est notamment frappant de voir que la quatrième feuille de la lignée pBIM131-40A possède encore 50% de la quantité initiale de chlorophylles quatre- vingt-dix jours après semis, alors qu'il n'a pas été possible de détecter ces pigments chez la lignée sauvage à cette date. Il faut aussi remarquer que la différence constatée entre la lignée sens d'un côté, et la lignée sauvage et la lignée témoin de l'autre, est clairement visible dès le soixante-dixième jour de culture des plantes.
3.2.3 L'expression du gène ACC oxydase est diminuée Afin de confirmer nos observations phénotypiques et biochimiques lors du processus de sénescence des feuilles des lignées sens pB_M131-4C et pBIM131-40A, nous avons entrepris une étude moléculaire de ce processus, via la détection de l'expression du gène ACC Oxydase ou ACO. L'ACC Oxydase (précédemment EFE pour Ethylene-Forming Enzyme) catalyse la dernière étape de la voie de biosynthèse de l'éthylène (Adams and Yang, 1979), hormone végétale fortement impliquée dans la maturation des fruits (Balagué et al, 1993). et la sénescence des tissus végétaux (Nadeau and O'Neill, 1995), notamment des feuilles et des fleurs. Cette enzyme peut être considérée comme un marqueur de la sénescence, et elle permet d'estimer l'implication de la voie de biosynthèse de l'éthylène dans le processus de sénescence des feuilles de nos lignées transgéniques de Tabac. Des échantillons provenant des septièmes et huitièmes étages foliaires ont été regroupés pour les différents temps de mesure, et soumis à une extraction d'ARN. La sénescence étant plus avancée pour la lignée sauvage et la lignée témoin pBIl l l -23 A, il n'a pas été possible d'extraire des ARN en quantités suffisantes au delà du soixante-dixième jour de culture des plantes, alors que ces extractions ont pu être réalisées jusqu'au quatre-vingt-quatrième jour de culture pour les lignées sens pBEVÎ131-4C et pBIM131-40A. Les résultats obtenus montrent que l'expression du gène ACO est globalement plus faible chez les lignées sens que chez la lignée sauvage ou la lignée témoin, même si elle est très forte au soixante-dizième jour de culture chez la lignée pB_M131-4C. Ceci est particulièrement vrai pour la lignée pBIM131-40A, puisque cette expression est à peine détectable aux soixantième et soixante- dizième jours de culture, alors qu'elle est forte chez la lignée sauvage BS et la lignée témoin pBIl l l-23A. Par la suite, c'est-à-dire aux quatre-vingtième et quatre- vingt-dizième jours après semis, l'expression du gène _4CO est plus facilement détectée chez la lignée pB_M131- 40A, et présente un niveau comparable à celui observé au soixantième jour de culture pour la lignée sauvage.
Exemple 4 Impact de la modulation de l'expression d,AtMYB30 sur la résistance à différents agents pathogènes chez le Tabac.
Des souches bactériennes virulentes (Pseudomonas syringae pv. tabaci), avirulentes (Pseudomonas syringae pv. pisi et Pseudomonas fluorescens exprimant de façon constitutive le gène de la haφine) ou ne causant aucun symptôme (Pseudomonas fluorescens) ont été inoculées à deux concentrations différentes. En réponse aux deux souches avirulentes, 25 heures après inoculation, des lésions nécrotiques localisées à la zone d'inoculation sont observées sur la lignée sur-exprimant AtMYB30; ces mêmes symptômes apparaissent plus tardivement (48 heures après l'inoculation) chez les autres lignées. De façon suφrenante, des chloroses plus marquées sont observées chez les plantes de la lignée sens inoculées par P. syringae pv. tabaci, en comparaison avec les autres lignées, indiquant par conséquent un comportement différent de cette lignée vis-à-vis de deux bactéries pathogènes R. solanacearum et P. syringae. Dans le cas de P. fluorescens ne contenant pas le plasmide codant une haφine, aucun symptôme n'est observé, et ce sur toutes les lignées. Par ailleurs, des champignons pathogènes ont été testés sur ces lignées transgéniques en collaboration avec la société Biogemma. Deux agents pathogènes fongiques du Tabac ont été retenus en raison de leurs modes d'invasion différents : Chalara elegans, agent pathogène racinaire et Cercospora nicotianae, agent pathogène foliaire. Aucune différence significative dans les symptômes n'a pu être observée en réponse à une infection racinaire par Chalara elegans, quelle que soit la lignée. En revanche, une inoculation foliaire par le champignon Cercospora nicotianae a permis d'observer un différentiel net entre les lignées. Alors que les lignées sauvage et témoin présentent des symptômes marqués, aucun symptôme n'est observé sur la lignée sens. La lignée antisens présente des symptômes similaires, ou légèrement inférieurs, aux témoins.
Exemple 5 Analyse des lignées antisens de tabac
Les phénotypes observés lors d'inoculations des lignées sens pBIM131 (mort cellulaire, croissance bactérienne in planta) nous ont amenés à effectuer des études similaires sur huit des lignées antisens disponibles. Leur phénotype après inoculation par les souches avirulente GMI 1000 et virulente K60 de R. solanacearum a été observé, de même que lors de la sénescence des feuilles et de la floraison.
4.1 Des lignées antisens présentent des phénotypes altérés en réponse à des inoculations bactériennes
Les expériences d'inoculation des lignées antisens par la souche avirulente GMI 1000 et la souche virulente K60 de R. solanacearum ont conduit à l'observation de phénotypes altérés vis-à-vis de la lignée sauvage BS.
Des lignées antisens présentent une résistance diminuée vis-à-vis de la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum
L'inoculation des feuilles de lignées antisens par la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum a permis d'observer une altération du phénotype par rapport à la lignée sauvage BS. En effet, la vitesse d'apparition des symptômes caractéristiques de la HR est souvent diminuée, de même que leur gravité finale. Une quantification de ces symptômes a abouti à la classification des lignées antisens testées en quatre classes phénotypiques. Observation des phénotypes Bien que, lors de cette expérience, les symptômes obtenus avec la lignée sauvage BS aient été plus forts, et leur apparition plus précoce que lors de toutes les autres inoculations, les résultats obtenus sont extrêmement clairs, et permettent notamment de distinguer plusieurs types de comportements parmi les huit lignées antisens testées vis-à-vis de la souche avirulente GMI 1000. Nous avons aussi inoculé deux lignées témoins (pBIl 1 1-9A et pBIl 11-23 A, choisies pour leur événement unique d'insertion de l'ADN-T) dans les mêmes conditions, et celles-ci présentent les mêmes phénotypes que la lignée sauvage (résultats non montrés). Les symptômes obtenus quatre jours après inoculation avec les lignées pBIW13- 28A et pBIW13-28B sont très particuliers: ils ne ressemblent en aucune manière à ceux obtenus avec la lignée sauvage BS. Pour les trois inocula testés (5.106, 1.107, et 5.107 cfu/ml), les symptômes sont caractérisés quatre jours après inoculation par une nécrose sèche et localisée au niveau des zones inoculées, tout comme pour la lignée sauvage, mais chacune d'entre elles présente un phénotype original au delà de la zone nécrotique. Il s'agit d'une forte chlorose autour des lésions nécrotiques pour la lignée pBW13-28A, alors que les nécroses de la lignée pBW13-28B ne restent pas confinées aux zones inoculées, mais s'étendent en dehors. Les symptômes obtenus avec les autres lignées antisens analysées diffèrent également du phénotype de la lignée sauvage, mais de manière moins atypique (résultats non montrés). Alors que la plupart des lignées sens montraient une accélération de la HR et une aggravation des symptômes nécrotiques, des lignées antisens montrent un phénotype tout à fait contraire : les symptômes apparaissent plus tard, et les lésions nécrotiques ne s'étendent que rarement à la totalité des zones inoculées. Mises à part les lignées pBIW13-28A et pBIW13-28B, les lésions nécrotiques dues à la souche avirulente GMI 1000 de R. solanacearum ne s'étendent jamais au delà des limites des zones inoculées. L'évolution des symptômes est achevée 72 heures après inoculation. La quantification des symptômes permet de répartir les lignées antisens en quatre classes phénotypiques
De la même façon que pour les lignées sens, il a été possible de quantifier les symptômes observés. Les symptômes observés chez la lignée sauvage avec l'inoculum de 5.106 cfu/ml sont visibles dès 15 heures après inoculation avec l'apparition de grandes zones de "collapse" des tissus, qui se limitent à la surface des tissus inoculés dès 24 heures après inoculation. Les symptômes sont encore plus précoces (12 heures après inoculation) et atteignent le maximum de sévérité dès 24 heures après inoculation pour les deux autres inocula, 1.107 et 5.107 cfu/ml. Quatre jours après inoculation, ils sont caractérisés par des nécroses ayant envahi la totalité des zones inoculées pour les trois inocula. Chez les lignées antisens testées, quatre classes phénotypiques peuvent être identifiées, en se basant sur la vitesse d'apparition et la gravité des symptômes, en comparaison avec la lignée sauvage. Tout d'abord, les lignées ρBW13-3A, ρBW13-21A et pBW13-25D, et particulièrement pour les deux inocula les plus faibles, développent beaucoup moins rapidement la réponse, et son étendue finale est bien moindre. Ensuite, les lignées pBW13-41B et pBW13-4B se distinguent par un phénotype intermédiaire entre la lignée sauvage et les trois lignées antisens sus-citées : cette distinction dans la sévérité et la rapidité d'apparition des symptômes n'est décelable qu'au plus faible inoculum pour la lignée pBW13-41B (5.106 cfu/ml). Enfin, la lignée pBIW13-25C présente un phénotype très similaire à celui de la lignée sauvage, et ceci pour les trois inocula testés. Ces différences sont d'autant plus fortes que l'inoculum est faible : elles sont difficilement détectables pour l'inoculum le plus fort (5.107 cfu ml), mais elles sont très claires lorsque l'inoculum est de 5.106 cfu/ml. La quatrième classe comprend les deux lignées pBIW13-28A et pBIW13-28B qui présentent des phénotypes tout à fait remarquables, car très différents de la lignée sauvage. Des lignées antisens présentent une sensibilité modifiée vis-à-vis de la souche virulente K60 de R. solanacearum L'inoculation de lignées antisens de Tabac par la souche virulente K60 de R. solanacearum a révélé que toutes les lignées ne réagissaient pas comme la lignée sauvage BS. Alors que la chlorose des tissus inoculés, caractéristique de la maladie, apparaît aux environs du troisième jour, et qu'elle s'étend par la suite en dehors de cette zone chez la lignée sauvage, la plupart des huit lignées antisens testées ne développent pas les mêmes symptômes. Parmi ces lignées, il est possible de déterminer quatre groupes, selon l'importance et la rapidité des symptômes causés par la souche K60. Ces groupes correspondent exactement à ceux identifiés grâce aux observations effectuées pour les inoculations par la souche avirulente GMI1000. La lignée pBW13-25C est comparable à la lignée sauvage pour la vitesse d'apparition des symptômes, même s'ils sont un peu moins forts. Parmi les lignées réagissant plus vite (l'apparition de la chlorose est visible dès 48 heures après inoculation) que la lignée sauvage, il est possible de distinguer les lignées pBIW13-3A, pBW13-21A, pBW13-25D, pBW13-41B et pBIW13-44B d'une part, et les lignées pBW13-28A et pBW13-28B d'autre part. Les premières se distinguent par une légère aggravation des symptômes (la chlorose est plus marquée, et elle s'étend sur une surface augmentée d'environ 50% par rapport à la lignée sauvage), et les dernières sont différentes de par la vitesse d'apparition des symptômes, qui est beaucoup plus rapide (ils apparaissent dès 36 heures après inoculation), et par la nature même de ces symptômes. La lignée pBW13-28A est caractérisée par une très forte chlorose dans la zone inoculée, qui laisse rapidement place à des larges lésions nécrotiques dans cette zone, alors qu'une chlorose particulièrement forte s'étend au-delà des zones inoculées. Les symptômes observés chez la lignée pBW13-28B sont très différents, puisque clairement nécrotiques. Ces nécroses sont brunes, et recouvrent environ le dixième de la surface de tissu inoculé, et ne s'étendent par par la suite. Ces zones nécrotiques correspondent précisément à l'endroit où l'injection à la seringue a été faite, donc où les bactéries ont été les plus nombreuses.
Exemple 6 Isolement de lignées transformantes d'Arabidopsis thaliana
8.1. Sélection des plantes transformées
Les constructions utilisées pour la transformation du Tabac, comprenant soit la phase ouverte de lecture d'AtMYB30 en orientation sens, en orientation antisens, ou sans cette orf (construction témoin), en aval du promoteur 35S du CaMV, avaient été introduites chez Arabidopsis thaliana écotype Ws-0. A partir des graines issues des plantes transformées, la sélection des lignées transformées a été réalisée. Cette étape, effectuée sur milieu MS supplémenté en kanamycine (50mg/l), a permis l'obtention respectivement de 25, 15 et 6 transformants pour les constructions sens, antisens, et témoin. 8.2. Analyse moléculaire et génétique des transformants
La présence du transgène a été validée chez toutes les lignées sens, et dans la majeure partie des plantes transformées antisens et témoin. L'utilisation d'un couple d'amorces spécifiques de chaque construction a permis la vérification de la bonne orientation du transgène dans les lignées sens et antisens. Par ailleurs, le nombre d'insertions de l'ADN-T renfermant chaque construction a été évalué. Toutes les lignées transformées vérifiées d'un point de vue moléculaire et ne présentant qu'un seul locus d'insertion ont été menées à graines. Le phénotype de ces lignées au cours du développement a été observé sur 15 plantes de chaque lignée et s'est révélé dans la majorité des cas, similaire à la lignée sauvage Ws-0. Seules quelques lignées transformées présentent un développement altéré, caractérisé par un phénotype nain. A l'issue de cette étape, nous disposons de 18 lignées sur-exprimant potentiellement AtMYB30, de 8 lignées le sous-exprimant et de 4 lignées témoins. 8.3. Analyse du phénotype en réponse à une bactérie pathogène avirulente
Le pathosystème retenu est l'interaction Arabidopsis thaliana I Xanthomonas campestris pv. campestris (X.c.c). 10 plantes de chaque lignée transformée, ainsi que 10 plantes sauvages Ws-0, ont été inoculées avec la souche X.c.c. 147. L'observation de la mise en place et du développement de la réponse hypersensible a permis de classer les différentes lignées transformées en fonction de l'intensité des symptômes observés. Chez la lignée sauvage, les plantes inoculées par X.cc. \47 présentent dès 10 heures après l'infection les premiers symptômes de la réponse hypersensible, à savoir un 'collapse' des cellules végétales dans la zone d'inoculation. Ces premiers symptômes évoluent jusqu'à constituer des lésions nécrotiques localisées à la zone d'inoculation 30 à 48 heures après l'inoculation. Parallèlement à cette cinétique de référence, les résultats montrent que certaines lignées sens présentent des nécroses nettement plus fortes que la lignée sauvage et que certaines lignées antisens développent des symptômes nécrotiques moindres. Les lignées témoin ne diffèrent pas phénotypiquement de la lignée Ws-0. Afin de confirmer ces observations visuelles, une mesure du taux de mort cellulaire par la technique du Bleu Evans a été effectuée sur l'ensemble des lignées testées 30 heures après l'inoculation, temps où le taux de mort cellulaire est maximal chez l'écotype sauvage. Les résultats montrent une corrélation intéressante entre l'intensité des symptômes observés et le taux de mort cellulaire mesuré. Pour la suite des expériences, 2 lignées sens (131.17A et 131.20 A), 2 lignées antisens (W13.1A et W13.19 A) ainsi qu'une lignée témoin ( 111.23 A) ont été retenues.
8.4. Impact de la modulation de l'expression d'AtMYB30 sur la mort cellulaire "hypersensible chez Arabidopsis thaliana
Les lignées sens sélectionnées inoculées par X.c.c. 147 présentent une intensification de la réponse hypersensible particulièrement marquée. En plus d'une augmentation, la mort cellulaire est détectée plus précocement chez une des lignées sens. Ces résultats montrent que les différentes lignées sélectionnées sont affectées dans la résistance à cette bactérie pathogène et constitueront un outil de choix pour valider le rôle d'AtMYB30 chez Arabidopsis thaliana dans la régulation de la réponse hypersensible. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Gène chimère comprenant dans le sens de la transcription une séquence de • régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour un facteur MYB 30 et une séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes, les éléments ci-dessus étant liés de manière fonctionnelle pour permettre l'expression du facteur MYB 30 dans les cellules végétales et les plantes.
2. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codant pour le facteur MYB30 est une séquence d'origine végétale, en particulier d'Arabidopsis thaliana (AtMYB30).
3. Gène chimère selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence codant pour le facteur MYB30 est la séquence représentée par la SEQ ID NO 1, les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la SEQ ID NO 1, les séquences homologues à la SEQ ED NO 1 et les fragments de ladite séquence.
4. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Procédé de transformation des cellules végétales ou des plantes, caractérisé en ce que l'on intègre dans le génome des cellules végétales ou des plantes au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 3.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gène chimère est intégré au moyen du vecteur selon la revendication 4.
7. Cellule végétale transformée caractérisée en ce qu'elle comprenant un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 3.
8. Cellule végétale transformée selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un autre gène hétérologue codant pour un peptide ou une protéine particuliers d'intérêt.
9. Plante transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules transformées selon l'une des revendications 7 ou 8.
10. Plante transformée selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules transformées selon l'une des revendications 7 ou 8.
11. Plante transformée, caractérisée en ce qu'un gène chimère selon l'une des revendication 1 à 3 est intégré de manière stable dans son génome et transmissible par reproduction sexuée.
12. Plante transformée selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les plantes monocotylédones, comme le maïs, le blé, le riz, la canne à sucre, ou dicotylédones, comme la betterave, le tabac, le coton, le colza, le soja.
13 Plante transformée selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les plantes dicotylédones, en particulier coton, colza ou soja, et de préférence des crucifères comme le colza.
14. Procédé permetant d'améliorer la résistance des plantes aux agressions pathogènes, en particulier fongiques, caractérisé en ce qu'il consiste à surexprimer dans les dites plantes un facteur de transcription MYB30.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la surexpression est assurée par l'intégration dans le génome de la plante un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 3.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice du gène chimère est choisie parmi les promoteurs constitutifs comme les promoteurs d'histone, le promoteur d'actine de riz ou le promoteur 19S ou 35S du virus de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35 S), et les promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes.
17. Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle du produite par le gène chimère exprimant le facteur MYB30 dans les plantes transformées.
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