WO2001007649A2 - Verfahren zum nachweis von mikroorganismen - Google Patents

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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • ribosomes Due to this vital function, the components of the ribosomes, ribosomal proteins and ribosomal RNA (rRNA) were not allowed to undergo too many mutations. Organisms that experienced too many mutations within the ribosomes due to exogenous influences were eliminated - only
  • Organisms with a minimal change in this essential component could survive. To date, this natural selection has received little change in the composition of the ribosomes. And yet, certain parts of the nucleic acid component of the ribosomes, the rRNA, whose chemical composition differs from DNA only in a single building block, could occur in certain parts. For this reason, the rRNA of the prokaryotes consists of conserved and variable regions. This composition enables the identification of phylogenetic relationships between the individual organisms. Statements about relatives can be made especially with those with little different morphological
  • the rRNA of the bacteria can be classified into three classes based on their size and specific weight: the 5S, the 16S and the 23S rRNA. All three different rRNAs can be used to determine the phylogeny if the significance increases.
  • FISH gene probe technology takes advantage of the opportunity to differentiate the bacteria based on their rRNA composition.
  • Target sites on the rRNA are used to create specific gene probes. These gene probes are just a few building blocks large, artificially assembled sections of the genetic material (DNA). Each gene probe has a specific bacterial species, a bacterial genus or a "target" Bacteria group. If one couples these gene probes with a marker molecule, a fluorescent dye, and introduces these probes into a bacterial mixture, they penetrate into the cells and, if present, attach themselves to their specific target sites. After a washing step in which all unbound probes are washed out of the cells, these specifically bound probes can be detected in the bacteria. After excitation with high-energy light, the dyes that are attached to the gene probes fluoresce, the bacterium "glows" in the microscope. If certain gene probes are now coupled with different dyes, the color in question can be used to immediately say which bacterium is in the sample.
  • a disadvantage of FISH hybridization is the complex quantification of the method. Under a microscope, the specifically detected bacterial population is quantified by counting the cells. After determining the
  • Total number of bacteria with a dye that specifically stains all cells, or by determining the total number of cells that are accessible to probes, the proportion of the specific bacterial population in the respective total population can be determined.
  • the counting additionally requires a sufficiently good training, since between real signals, those of the specifically bound ones
  • the object of the present invention is to provide a method with which microorganisms can be detected and, if necessary, quantified without prior cultivation, and which overcomes the disadvantages of the prior art.
  • this object is achieved by a method for the detection of microorganisms in a sample by means of a nucleic acid probe, the method comprising the following steps:
  • fixation of microorganisms is understood to mean a treatment with which the cell envelope of the microorganisms is made permeable to nucleic acid probes and the contact with agents
  • the nucleic acid probes which consist of an oligonucleotide and a marker attached to it, can then penetrate the cell envelope and bind to the target sequence complementary to the nucleic acid probe inside the cell.
  • the Binding is to be understood by the formation of hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid.
  • the envelope can be a lipid envelope that surrounds a virus, around the cell wall of bacteria or around the cell membrane of a unicellular animal. A low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute solution is usually used for fixation
  • Formaldehyde solution used. If, despite these measures, the cell wall cannot be penetrated by the nucleic acid probes, the person skilled in the art is sufficiently aware of further measures which lead to the desired result. These include, for example, ethanol, methanol, mixtures of these alcohols, enzymatic treatments or the like.
  • the nucleic acid probe in the sense of the invention can be a DNA or RNA probe, which will generally comprise between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 50, particularly preferably between 17 and 25 nucleotides.
  • the nucleic acid probes are selected according to the
  • nucleic acid probe By selecting a defined sequence, a bacterial species, a bacterial genus or an entire bacterial group can be detected. Complementarity should be given if possible with a probe of 15 nucleotides over 100% of the sequence. In the case of oligonucleotides with more than 15 nucleotides, one or more mismatching sites are permitted. Compliance with stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid probe molecule actually hybridizes with the target sequence. Moderate conditions in the sense of the invention are, for example, 0% formamide in a hybridization buffer as described in Example 1. Stringent conditions in the sense of the invention are, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer. The selection of the respective nucleic acid probes depends on the microorganism to be detected.
  • the nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, - 6th
  • the sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1000-50,000 times.
  • the rRNA is preferably used as the target site, since the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis are present thousands of times in each active cell.
  • the nucleic acid probe is incubated with the microorganism fixed in the abovementioned sense, in order to allow penetration of the nucleic acid probe molecules into the microorganism and hybridization of nucleic acid probe molecules with the nucleic acids of the microorganism.
  • the non-hybridized nucleic acid probe molecules are then removed by conventional washing steps.
  • the specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells.
  • the prerequisite for this is that the nucleic acid probe is connected to e.g. covalent bond is linked to a marker.
  • Fluorescent groups such as e.g.
  • CY2, CY3, CY5, FITC, FLUOS, TRITC or FLUOS-PRIME are used, all of which are well known to those skilled in the art.
  • Chemical markers, radioactive markers or enzymatic markers such as horseradish peroxidase, acid phosphatase, alkaline phosphatase, peroxidase can also be used.
  • a number of chromogens are known for each of these enzymes, which can be converted instead of the natural substrate and can be converted into either colored or fluorescent products.
  • nucleic acid probe molecules in such a way that at their 5 'or 3' end there is another suitable for hybridization - 7 -
  • Nucleic acid sequence is present. This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1000, preferably 15-50 nucleotides. This second nucleic acid region can in turn be recognized by an oligonucleotide probe which can be detected by one of the means mentioned above.
  • Another possibility is to couple the detectable nucleic acid probe molecules with a hapten. After the nucleic acid probe molecules have been detached from the target nucleic acid, the nucleic acid probe molecules, which are now present separately, can be brought into contact with antibodies recognizing the hapten. As an example of such a hapten can be
  • the microorganisms can be quantified in a suitable evaluation device, for example fluorometer, chemiluminometer or photometer, by the emitting fluorescence, chemiluminescence or production of a colored substrate.
  • the large number of possible markings also enables simultaneous marking
  • Legionella feeleii can be detected by using two different fluorescent markers in addition to Legionella pneumophila.
  • the microorganism to be detected by means of the method according to the invention can be a prokaryotic or eukaryotic microorganism. In most cases, it will be desirable to detect unicellular microorganisms. These unicellular microorganisms can also be present in larger aggregates, so-called filaments. Relevant microorganisms are above all
  • Yeast Yeast, algae, bacteria, fungi and protozoa.
  • the method according to the invention can be used in a variety of ways.
  • Environmental samples can be examined for the presence of microorganisms.
  • these samples can be taken from air, water or from the ground.
  • Another area of application for the method according to the invention is the control of foods.
  • the method according to the invention can also be used to examine medical samples. It is suitable for the examination of clinical materials from different body regions. In particular, smear materials from the eye, respiratory tract, urogenital tract and wounds, as well as examinations of body secretions such as urine, bile, saliva, sperm, sweat and the like. Also for examining stool, blood, blood cultures and biopsy materials (lungs, esophagus, gastrointestinal tract, etc.).
  • Another area of application for the present method is the investigation of waste water, e.g. Activated sludge, digested sludge or anaerobic sludge.
  • the method is suitable for analyzing biofilms in industrial plants, as well as for examining naturally forming biofilms or biofilms that form during wastewater treatment. Also the
  • the method according to the invention enables in-situ hybridization in the
  • Hybridization takes about 2-3 hours, quantification takes just a few minutes.
  • the quantification in the method according to the invention can also be carried out by untrained personnel.
  • the use of microtiter plates significantly shortens the time required to carry out hybridization reactions. If only individual reactions can be carried out on each slide when using slides, up to a hundred or more reactions can be carried out on one when using microtiter plates
  • Carrier done can also be automated, which means that personnel costs can be drastically reduced.
  • the method according to the invention can also be carried out in combination with an enzyme-labeled probe (e.g. POD-labeled).
  • an enzyme-labeled probe e.g. POD-labeled
  • the method according to the invention also allows the use of microscopes.
  • the "well”, that is to say the cutout in the microtiter plate, must not be rounded but flat.
  • An inverse microscope can also be used for the evaluation, which allows the application of a
  • kits for carrying out the method for the rapid and automatable detection of microorganisms in a sample are also provided.
  • the most important component of the kit is an oligonucleotide probe specific for the microorganism to be detected.
  • it comprises at least one hybridization and one washing buffer.
  • the choice of hybridization buffer primarily depends on the length of the nucleic acid probes used. Examples of hybridization conditions are in Stahl D.A. & Amann R. (1991) Development and application of nucleic acid probes in bacterial systematics. In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow, Ed., Sequencing and hybridization techniques in bacterial systematics, pp. 205-248. John Wiley and Sons, Chichester, England.
  • the kit contains specific probes for
  • the following example also called "Power-FISH-V experience" by the applicant, is used for the qualitative analysis of bacteria that can be assigned to the filamentous bacterial thread PPx3.
  • the identification takes place in a few hours.
  • the bacterial thread has not yet been able to be cultivated and, for this reason, has so far not been accessible for identification.
  • Oligonucleotide probes specifically recorded. After correspondingly stringent washing steps, the bound probes in the bacteria are quantified in a microtiter fluorometer. The level of the signal received can be used to make a statement as to whether or not PPx3 filaments were present in the wastewater sample.
  • the wastewater sample is fixed to kill the microorganisms it contains and to make the cells accessible to oligonucleotide probes.
  • An aliquot of the wastewater sample is poured into the well of a microtiter plate and the cells are immobilized in the well by heat. After immobilization, the cells undergo a dehydration step.
  • a hybridization buffer is then filled in and corresponding amounts of specific fluorescence-labeled oligonucleotide probes are added. In the subsequent incubation, the oligonucleotide probes can be specific to their under sufficiently stringent conditions
  • the cells are taken up in a little water and quantified in a microtiter plate fluorometer.
  • the cells can be fixed as follows: Preparation of the fixation solution:
  • Solution can be frozen for several months.
  • Pellet washed with 1 ml lxPBS (1 x PBS: 130 mM NaCl and 10 mM PBS stock solution). After a further centrifugation step, the pellet is completely resuspended in 250 ⁇ l 1 ⁇ PBS and mixed with the same volume of ice-cold ethanol. The fixed cells are stored at -20 ° C.
  • the cells are immobilized on a microtitre plate by applying 1-20 ⁇ l of the cells in the well of a microtitre plate and then immobilized by heating for 20 min at 80 ° C. Possible 14
  • the evaluation is carried out as follows. For microscopic observation, the cells are overlaid with an antifading reagent and viewed with an inverse epifluorescence microscope. For expansion in a fluorometer, 100 ⁇ l of 1 ⁇ PBS are added to the dried cells and the well is evaluated in a microtiter plate reader.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mittels einer Nukleinsäuresonde sowie einen Kit zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.

Description

- 2
Aufgrund dieser lebensnotwendigen Funktion durften sich die Bestandteile der Ribosomen, ribosomale Proteine und ribosomale RNA (rRNA) nicht allzu vielen Mutationen unterwerfen. Organismen, die durch exogene Einflüsse allzu viele Mutationen innerhalb der Ribosomen erfuhren, wurden eliminiert - nur
Organismen mit einer minimalen Veränderung dieser essientiellen Komponente konnten überleben. Diese natürliche Selektion erhielt bis zum heutigen Tage eine nur wenig veränderte Zusammensetzung der Ribosomen. Und doch konnte es innerhalb der Nukleinsäurekomponente der Ribosomen, der rRNA, die sich in ihrer chemischen Zusammensetzung nur in einem einzigen Baustein von der DNA, unterscheidet, in bestimmten Teilen zu Mutationen kommen. Aus diesem Grund besteht die rRNA der Prokaryonten aus konservierten und variablen Regionen. Diese Zusammensetzung ermöglicht die Erkennung von stammesgeschichtlichen Zusammenhängen zwischen den einzelnen Organismen. Aussagen über Verwandtschaft können gerade bei den mit wenig unterschiedlich morphologischen
Erkennungsmerkmalen ausgestatteten Bakterien nun mit großer Zuverlässigkeit getroffen werden.
Die rRNA der Bakterien läßt sich aufgrund ihrer Größe und ihres spezifischen Gewichtes in drei Klassen einordnen: die 5S, die 16S und die 23S rRNA. Alle drei verschiedenen rRNA können bei entsprechend ansteigender Aussagekraft für die Ermittlung der Phylogenie herangezogen werden.
Die FISH-Gensondentechnologie macht sich die Möglichkeit, die Bakterien aufgrund ihrer rRNA-Zusammensetzung zu unterscheiden, zunutze. Bestimmte
Zielstellen auf der rRNA werden verwendet, um spezifische Gensonden zu erstellen. Diese Gensonden sind nur wenige Bausteine große, künstlich zusammengestellte Abschnitte der Erbsubstanz (DNA). Jede Gensonde hat als "Ziel" eine bestimmte Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine Bakteriengruppe. Koppelt man nun diese Gensonden mit einem Markermolekül, einem fluoreszierenden Farbstoff, und bringt diese Sonden in ein Bakteriengemisch ein, so dringen sie in die Zellen ein und heften sich, sofern vorhanden, an ihre spezifischen Zielstellen. Nach einem Waschschritt, bei dem alle ungebundenen Sonden aus den Zellen herausgewaschen werden, können diese spezifisch gebundenen Sonden in den Bakterien detektiert werden. Nach Anregung mit energiereichem Licht fluoreszieren die Farbstoffe, die an den Gensonden hängen, das Bakterium "leuchtet" im Mikroskop. Werden nun bestimmte Gensonden mit unterschiedlichen Farbstoffen gekoppelt, so kann aufgrund der betreffenden Farbe sofort die Aussage getroffen werden, um welches Bakterium es sich in der Probe handelt.
Ein Nachteil der FISH-Hybridisierung liegt in der aufwendigen Quantifizierung der Methode. So werden unter einem Mikroskop die spezifisch detektieren Bakterienpopulation durch Zählen der Zellen quantifizert. Nach Ermittlung der
Gesamtbakterienzahl mit einem Farbstoff, der spezifisch alle Zellen färbt, bzw. der Ermittlung der Gesamtzahl der Zellen, die für Sonden zugänglich sind, kann der Anteil der spezifischen Bakterienpopulation an der jeweiligen Gesamtpopulation ermittelt werden. Das Auszählen erfordert zusätzlich eine ausreichend gute Ausbildung, da zwischen echten Signalen, die von den spezifisch gebundenen
Zellen stammen, und den falschen Signalen (Autofluoreszenz) unterschieden werden muß.
Ein weiterer Nachteil ist die Tatsache, dass selbst bei hohen Organismenzahlen ein negatives Ergebnis erhalten werden kann, wenn die Organismen aufgrund schlechter physiologischer Wachstumsbedingungen nur niedrige Ribosomenzahlen besitzen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung nachgewiesen und gegebenenfalls quantifiziert werden können, und das die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mittels einer Nukleinsäuresonde gelöst, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Fixieren der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen
b) Immobilisieren der Mikroorganismen auf einer Mikrotiterplatte
c) Inkubation der auf der Mikrotiterplatte fixierten und immobilisierten Mikroorganismen mit nachweisbaren Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen
d) Entfernen nicht hybridisierter Nukleinsäuresondenmoleküle
e) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren der Zellen mit hybridisierten
Nukleinsäuresondenmolekülen
Bei dieser vorliegenden Erfindung wird unter "Fixieren" von Mikroorganismen eine Behandlung verstanden, mit der die Zellhülle der Mikroorganismen für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird und der Kontakt mit Agentien die
Strukturen entweder durch Denaturierung oder durch Quervernetzung fixiert. Die Nukleinsäuresonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die zu der Nukleinsäuresonde komplementären Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist durch eine Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen. Bei der Hülle kann es sich um eine Lipidhülle handeln, die einen Virus umgibt, um die Zellwand von Bakterien oder um die Zellmembran eines einzelligen Tierchens. Zur Fixierung wird üblicherweise eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte
Formaldehydlösung verwendet. Kann die Zellwand trotz dieser Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zum gewünschten Ergebnis fuhren. Dazu zählen beispielsweise Ethanol, Methanol, Mischungen dieser Alkohole, enzymatische Behandlungen oder ähnliches.
Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 50, besonders bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den
Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfaßt werden. Komplementarität sollte möglichst bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, daß das Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z.B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er in Beispiel 1 beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer. Die Auswahld der jeweiligen Nukleinsäuresonden erfolgt in Abhängigkeit vom nachzuweisenden Mikroorganismus. Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, - 6
aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 - 100000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1000 - 50000 mal. Aus diesem
Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.
Erfindungsgemäß wird die Nukleinsäuresonde mit dem im obengenannten Sinne fixierten Mikroorganismus inkubiert, um so ein Eindringen der Nukleinsäuresondenmoleküle in den Mikroorganismus und die Hybridisierung von Nukleinsäuresondenmolekülen mit den Nukleinsäuren des Mikroorganismus zu erlauben. Anschließend werden die nicht-hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle durch übliche Waschschritte entfernt. Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass die Nukleinsäuresonde über eine z.B. kovalente Bindung mit einem Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden fluoreszierende Gruppen wie z.B. CY2, CY3, CY5, FITC, FLUOS, TRITC oder FLUOS-PRIME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können.
Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, daß an ihrem 5 '- oder 3 '-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete - 7 -
Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfaßt wiederum ca. 15 bis 1000, bevorzugt 15 - 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einer Oligonukleotidsonde erkannt werden, die durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten. Nach Ablösung der Nukleinsäuresondenmoleküle von der Zielnukleinsäure können die nunmehr separat vorliegenden Nukleinsäuresondenmoleküle mit das Hapten erkennenden Antikörpern in Kontakt gebracht werden. Als Beispiel für solch ein Hapten kann
Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.
Im Gegensatz zum herkömmlichen FISH- Verfahren werden jedoch die Mikroorganismen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf einem
Objektträger immobilisiert, sondern auf einer Mikrotiterplatte oder auf einem anderen geeigneten Träger, der das Immobilisieren von mehreren, räumlich voneinander getrennten Mikroorganismen erlaubt. Dies hat gravierende Vorteile. Zum einem ist die Durchführung der FISH-Hybridisierung dank der vorliegenden Erfindung erstmals automatisierbar. Alle Reaktionsschritte können in der
Mikrotiterplatte von statten gehen. Zum anderen ist die in der Praxis oft mühevolle Quantifizierung nun deutlich erleichtert. In der Praxis wurden die positiven Zellen, also die Zellen, die spezifisch gebundene Nukleinsäuresondenmoleküle, die mit einem Markermolekül versehen sind, enthalten, gezählt und diese Zahl mit der Gesamtzellzahl verglichen. Bei dieser Erfindung können die Mikroorganismen in einem geeigneten Auswertegerät, z.B. Fluorometer, Chemoluminometer oder Photometer, durch die ausstrahlende Fluoreszenz, Chemoluminiszenz oder Produktion eines farbigen Subtrates quantifiziert werden. - 8 -
Die Durchführung der FISH-Hybridisierung geschieht im Stand der Technik ausschließlich auf Objektträgern. Auch das Immobilisieren von Mikroorganismen auf Filtern und die daran anschließende FISH Hybridisierung sind bereits in einschlägiger, dem Fachmann bekannter Literatur beschrieben worden. Die Möglichkeit, den Nachweis von Mikroorganismen mittels Immobilisieren der
Mikroorganismen auf einer Mikrotiterplatte oder eines anderen geeigneten Trägers im Rahmen eines automatisierbaren und schnellen Verfahrens durchzuführen, ist neu.
Die Vielzahl möglicher Markierungen ermöglicht auch den gleichzeitigen
Nachweis von zwei oder mehreren sich überlappenden oder auch nicht überlappenden Populationen. So kann z.B. durch die Verwendung von zwei verschiedenen Fluoreszenzmarkem neben Legionella pneumophila auch Legionella feeleii nachgewiesen werden.
Der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens nachzuweisende Mikroorganismus kann ein prokaryontischer oder eukaryontischer Mikroorganismus sein. In den meisten Fällen wird es erwünscht sein, einzellige Mikroorganismen nachzuweisen. Diese einzellige Mikroorganismen können auch in größeren Aggregaten, sogenannten Filamenten, vorliegen. Relevante Mikroorganismen sind hierbei v.a.
Hefen, Algen, Bakterien, Pilze und Protozoen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vielfältig angewendet werden. Umweltproben können auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersucht werden. Diese Proben können hierzu aus Luft, Wasser oder aus dem Boden entnommen sein.
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Kontrolle von Lebensmitteln. In bevorzugten Ausführungsformen werden die 9 -
Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen. Für den Nachweis von Mikroorganismen in Lebensmitteln kann u.U. eine Kultivierung notwendig sein, um sicherzustellen, dass nur lebende und damit vermehrungsfähige Mikroorganismen nachgewiesen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist für die Untersuchung von klinischen Materialien von verschiedenen Körperregionen geeignet. Insbesondere Abstrichmaterialien vom Auge, den Atemwegen, dem Urogenitaltrakt und von Wunden, zudem von Untersuchungen von Körpersekreten wie Urin, Galle, Speichel, Sperma, Schweiss und ähnlichem. Außerdem zur Untersuchung von Stuhl, von Blut, von Blutkulturen und Biopsiematerialien (Lunge, Speiseröhre, Magen-Darmtrakt o.a.).
Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende Verfahren ist die Untersuchung von Abwässern, z.B. Belebtschlamm, Faulschlamm oder anaerobem Schlamm. Darüber hinaus ist das Verfahren geeignet, Biofilme in industriellen Anlagen zu analysieren, sowie auch sich natürlicherweise bildende Biofilme oder sich bei der Abwasserreinigung bildende Biofilme zu untersuchen. Auch die
Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte, Lösungen, Tropfen etc. ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die in In-Situ-Hybridisierung in der
Praxis etabliert werden. Bei Verwendung von Fluoreszenzmolekülsonden müsste als Auswerteeinheit zur Quantifizierung ein Mikrotiter-Fluorometer benutzt werden, das im Vergleich zu einem Epifluoreszenzmikroskop, das zur Durchführung des herkömmlichen FISH-Verfahrens geeignet ist und mit welchem 10
ausreichend gute In-Situ-Hybridisierungsergebnisse erzielt werden können, sowohl in der Anschaffung als auch im Unterhalt wesentlich kostengünstiger ist. Darüber hinaus muß bei der Verwendung von CY5 -Sonden eine hochwertige CCD-Kamera eingesetzt werden, was das Verfahren des Standes der Technik zusätzlich kostenintensiv macht. Aus diesem Grund stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine wesentlich preisgünstiger Meßmethode dar, als die zeitaufwendige Quantifizierung am Epifluoreszenzmikroskop. Überdies sind die laufenden Kosten geringer, da die Xenonbogenlampe des Fluorometer eine wesentlich längere Lebensdauer besitz als die Quecksilberhochdrucklame eines Epifluoreszenzmikroskops. Ebenfalls sind die Personalkosten geringer. Bei der quantitativen Analyse einer Umweltprobe mittels des herkömmlichen Verfahrens nimmt der Einsatz mehrerer Sonden mehrere Tage in Anspruch. Das erfindungsgemäße Verfahren erledigt diese Aufgabe innerhalb weniger Stunden. Hybridisierung benötigt ca. 2-3 Stunden, die Quantifizierung nur wenige Minuten. Die Quantifizierung beim erfindungsgemäßen Verfahren kann überdies auch von ungeschulten Kräften durchgeführt werden. Zusätzlich verkürzt der Einsatz von Mikrotiterplatten den Zeitaufwand bei der Durchführung von Hybridisierungsreaktionen erheblich. Können beim Einsatz von Objektträgern auf jedem Objektträger nur einzelne Reaktionen durchgeführt werden, so können beim Einsatz von Mikrotiterplatten bis zu Hundert oder mehr Reaktionen auf einem
Träger erfolgen. Überdies ist das Verfahren automatisierbar, wodurch die Personalkosten drastisch gesenkt werden können. Zudem kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Kombination mit einer enzymmarkierten Sonde (z.B. POD-markiert) durchgeführt werden. Bei Einsatz eines löslichen Enzymsubstrates, dessen Endprodukt farbig ist, kann durch eine
Absorptionsmessung direkt auf das Vorhandensein eines bestimmten Bakteriums geschlossen werden. Durch Verwendung eines internen Standards können diese Werte auch quantitativ ausgewertet werden. 1 1
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist aber auch neben der Verwendung von Fluorometem oder anderen Quantifizierungssystemen auch die Verwendung von Mikroskopen möglich. Zu diesem Zwecke muß das "Well", also die Aussparung in der Mikrotiterplatte nicht abgerundet sondern flach sein. Zur Auswertung kann auch ein inverses Mikroskop benutzt werden, welches das Aufbringen eines
Deckglases auf die immobilisierten und hybridiserten Zellen vermeidet.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Kit zur Durchführung des Verfahrens zum schnellen und automatisierbaren Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe zur Verfügung gestellt. Der Kit umfaßt als wichtigsten Bestandteil eine für den jeweils nachzuweisenden Mikroorganismus spezifische Oligonukleotidsonde. Weiterhin umfaßt er mindestens einen Hybridisierungs- und einen Waschpuffer. Die Wahl des Hybridisierungspuffers hängt in erster Linie von der Länge der verwendeten Nukleinsäuresonden ab. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen sind in Stahl D.A. & Amann R. (1991) Development and application of nucleic acid probes in bacterial systematics. In: E. Stackebrandt and M. Goodfellow, Ed., Sequencing and hybridization techniques in bacterial systematics, pp. 205-248. John Wiley and Sons, Chichester, England.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform enthält der Kit spezifische Sonden zum
Nachweis von Mikroorganismen, die im Abwasser von Abwasserreinigungsanlagen vorkommen.
Das folgende Beispiel soll der Erläuterung der Erfindung dienen und ist nicht in einschränkender Weise zu deuten. 12
Nachweis von Bakterien des Types PPx3 in einer Abwasserprobe:
Das nachfolgende Beispiel, vom Anmelder auch als "Power-FISH-V erfahren" bezeichnet, dient der qualitativen Analyse von Bakterien, die dem filamentösen Bakterienfaden PPx3 zugeordnet werden können. Die Identifizierung erfolgt in wenigen Stunden. Der Bakterienfaden konnte bisher nicht kultiviert werden und war aus diesem Grunde einer Identifizierung bislang nicht zugänglich.
Das Grundprinzip läßt sich folgendermaßen darstellen. Filamentöse Bakterien in Abwasserproben werden durch gegen rRNA-gerichtete fluoreszenzmarkierte
Oligonukleotidsonden spezifisch erfaßt. Nach entsprechend stringenten Waschschritten werden die gebundenen Sonden in den Bakterien in einem Mikrotiterfluorometer quantifiziert. Durch die Höhe des erhaltenen Signals kann eine Aussage darüber getroffen werden, ob in der Abwasserprobe PPx3-Filamente vorhanden waren oder nicht.
In einem ersten Schritt wird die Abwasserprobe zum Abtöten der darin enthaltenen Mikroorganismen und um die Zellen für Oligonukleotidsonden zugänglich zu machen, fixiert. Ein Aliquot der Abwasserprobe wird in das Well einer Mikrotiterplatte eingefüllt und die Zellen werden durch Hitze im Well immobilisiert. Nach der Immobilisierung unterlaufen die Zellen einen Dehydratisierungsschritt. Anschließend wird ein Hybridisierungspuffer eingefüllt und entprechende Mengen an spezifischen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden zugegeben. Bei der anschließenden Inkubation können unter ausreichend stringenten Bedingungen die Oligonukleotidsonden spezifisch an ihre
Zielstellen im Bakterienfaden PPx3 binden. Beim anschließenden Waschschritt werden die nicht gebundenen Sonden wieder entfernt. Für eine Detektion im Mikroskop werden die Zellen getrocknet und mit einem Antifading-Reagenz überschichtet. Das Auflegen eines Deckglases ermöglicht das Betrachten mit einem - 13 -
gängigen Mikroskop. Ohne das Auflegen eines Deckglases ist nur das Betrachten mit einem inversen Mikroskop möglich. Zur Quantifizierung in einem Fluorometer werden die Zellen in etwas Wasser aufgenommen und in einem Mikrotiterplatten- Fluorometer quantifiziert.
a) Das Fixieren der Zellen kann wie folgt durchgeführt werden: Vorbereitung der Fixierungslösung:
Zugabe von 3g Paraformaldehyd zu 30 ml auf 60°C erhitzes H 0bidest und anschließend tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH bis zum vollständigen Lösen des Paraformaldehyds. Anschließend Hinzufügen von 16,6 ml 3 x PBS (PBS-
Stammlösung: 200 mM NaH2PO4 und 200 mM Na2HPO4, pH- Wert = 7.2 - 7.4; 3 x PBS-Lösung: 390 mM NaCl und 30 mM NaxPO4 (PBS-Stammlösung); pH = 7,2 - 7,4). Abkühlen der Lösung auf ca. 20°C. Einstellen des pH- Wertes mit 1 M HC1 auf 7.2 - 7.4. Sterilfiltration der fertigen PFA-Lösung über einen 0.2 μm-Filter. Die Lösung kann bei — 4°C für ca. eine Woche aufbewahrt werden. Alternativ kann die
Lösung für mehrere Monate eingefroren werden.
Zum eigentlichen Fixieren der Zellen werden drei Teile der gekühlten Fixierungslösung mit einem Teil der Zellsuspension vermischt und 1 -6 Stunden inkubiert. Nach Zentrifugation von 2 ml dieser Suspension wird das enstandene
Pellet mit 1 ml lxPBS gewaschen (1 x PBS: 130 mM NaCl und 10 mM PBS- Stammlösung). Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wird das Pellet in 250 μl 1 x PBS vollständig resuspendiert und mit demselben Volumen eiskalten Ethanol vermischt. Die Lagerung der fixierten zellen erfolgt bei -20°C.
Die Immobilisierung der Zellen auf einer Mikrotiteφlatte erfolgt durch Aufbringen von 1-20 μl der Zellen in das Well einer Mikrotiteφlatte aufgebracht und anschließendes Immobilisieren durch Erwärmung für 20 min bei 80°C. Mögliche 14
Alternativen hierzu sind das Trocknen bei 80°C und 30 min, die Verwendung von 1/10 Volumen Formalin oder die Verwendung von 50%igem Ethanol.
Zur Dehydratation werden 100 μl 50%iger Ethanol in das Well aufgebracht. Nach 3 min wird der Ethanol entfernt und 100 μl 80%iger Ethanol aufgebracht. Nach abermals 3minütiger Inkubation wird auch dieser Ethanol entfernt und 100 μl 100%iger Ethanol aufgebracht. Nach 3 Minuten Entfernung von diesem Ethanol und Lufttrocknung der Zellen.
Für die Hybridisierung werden folgende Puffer verwendet:
Hybridisierungspuffer:
Formamid 700 μl
5 M NaCl 360 μl
1 M Tris/HCl 40 μl
10% SDS 2 μl
H20bidest auf 2 ml auffüllen
Waschpuffer:
IM Tris/HCl, pH 8,0 100 μl
10% SDS 5 μl
5 M NaCl 70 μl
0.5 M EDTA 50 μl
H 0bidest auf 5 ml auffüllen
24 μl des Hybridisierungspuffers werden in das Well pipettiert und 3 μl (Konz. 50 ng / μl) des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids dazugemischt. Über die Mikrotiteφlatte wird eine abdichtende Folie gespannt. Die Mikrotiteφlatte wird für 1,5 Stunden bei 46°C inkubiert. Anschließend werden in das Well 100 μl auf - 15
48°C vorgewärmten Waschpuffer hinzugegeben, abgenommen und abermals 100 μl auf 48°C vorgewärmten Waschpuffer hinzugegeben. Nach Inkubation für 20 min wird der Waschpuffer abgenommen und die Zellen luftgetrocknet.
Die Auswertung erfolgt wie folgt. Zur mikroskopischen Betrachtung werden die Zellen mit einem Antifading-Reagenz überschichtet und mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop betrachtet. Für die Ausweitung in einem Fluorometer werden auf die getrockneten Zellen 100 μl 1 x PBS hinzugegeben und das Well in einem Mikrotiteφlattenlesegerät ausgewertet.

Claims

- 16Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mittels einer Nukleinsäuresonde, umfassend die folgenden Schritte:
a) Fixieren der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen
b) Immobilisieren der Mikroorganismen auf einer Mikrotiteφlatte
c) Inkubation der auf der Mikrotiteφlatte fixierten und immobilisierten Mikroorganismen mit nachweisbaren Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen
d) Entfernen nicht hybridisierter Nukleinsäuresondenmoleküle
e) Detektieren und gegebenenfalls Quantifizieren der Zellen mit hybridisierten Nukleinsäuresondenmolekülen.
2. Verfahren nach Anspmch 1 , worin die Nukleinsäuresonde komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA, einer mRNA oder rRNA eines nachzuweisenden Mikroorganismus ist.
3. Verfahren nach Anspmch 1 oder 2, worin die Nukleinsäuresonde kovalent mit einem detektierbaren Marker verbunden ist. 17
4. Verfahren nach Anspmch 3, worin der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Fluoreszenzmarker b) Chemilumineszenzmarker c) Radioaktiver Marker d) enzymatisch aktive Gruppe e) Hapten f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Mikroorganismus ein einzelliger Mikroorganismus ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Mikroorganismus eine Hefe, ein Bakterium, eine Alge, ein Pilz oder ein Protozoe ist.
7. Verfahren nach Anspmch 6, worin der Mikroorganismus ein Abwasserorganismus ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe eine Umweltprobe ist, die aus Wasser, Boden oder Luft entnommen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe eine Lebensmittelprobe ist.
10. Verfahren nach Anspmch 9, worin die Probe aus Milch oder Milchprodukten,
Trinkwasser, Getränken, Backwaren oder Fleischwaren entnommen ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe eine medizinische Probe ist. 18
12. Verfahren nach Anspmch 11 , worin die Probe aus Gewebe, Sekreten, Blut oder Stuhl entnommen ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe aus Abwasser entnommen ist.
14. Verfahren nach Anspmch 13, worin die Probe aus Belebtschlamm, Faulschlamm oder anaeroben Schlamm entnommen ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe aus einem Biofilm entnommen ist.
16. Verfahren nach Anspmch 15, worin der Biofilm aus einer industriellen Anlage stammt, bei der Abwasserreinigung gebildet wurde oder ein natürlicher
Biofilm ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Probe einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt entnommen ist
18. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend a) mindstens einen Hybridisierungspuffer und b) mindestens eine Nukleinsäuresonde.
19. Kit nach Anspmch 18, enthaltend spezifische Sonden zum Nachweis von Bakterien , die im Abwasser vorkommen.
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