WO2000078989A1 - Procedimiento de obtencion de acido 7-aminodes-acetoxicefalosporanico (7-adca) - Google Patents

Procedimiento de obtencion de acido 7-aminodes-acetoxicefalosporanico (7-adca) Download PDF

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Javier Velasco Alvarez
José ADRIO FONDEVILA
Miguel Angel Moreno Valle
Bruno Diez Garcia
Manuel Esteban Morales
Ermanno Bernasconi
José Luis BARREDO FUENTE
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Antibioticos, S.A.U.
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Definitions

  • the invention is ascribed to the production of 7-ADCA, or its intermediate compounds penicillin N or deacetoxycephalosporin C by fermentation of transformed Acremonium chrysogenum strains.
  • Cephalosporins are a group of antibiotics of great therapeutic importance produced industrially by fermentation of A. chrysogenum or alternatively by chemical expansion of the penicillin thiazo-15 ring generating a dihydrotiazine ring.
  • chrysogenum or alternatively by chemical expansion of the penicillin thiazo-15 ring generating a dihydrotiazine ring.
  • side chains in different positions of the ⁇ -lactam and dihydrotiazine rings, a huge number of cephalosporins with greater antibiotic capacity or better pharmacokinetic properties can be synthesized.
  • the preparation of these semi-synthetic antibiotics has
  • 7-Aminodeacetoxycephalosporic acid (7-ADCA) is one of the substrates used for the preparation of cephalosporins characterized by the absence of functionalization at position 3. Due to this absence of functionalization, 7-ADCA is generally synthesized by expansion of the thiazolidine ring of penicillins obtained by fermentation, while the rest of the cephalosporic compounds are prepared from natural cephalosporins obtained by fermentation. Room
  • 7-ADCA is produced from penicillin G or V, requiring 4 to 5 chemical stages to expand the 5-member ring.
  • This process like many of the chemical processes, has a series of disadvantages compared to biological processes: it is a complex process with multiple stages, it requires the use of expensive and toxic chemical reagents, it uses organic solvents harmful to the environment and during the process originate by-products and impurities that require complex purification systems.
  • different strategies for obtaining 7- ADCA based on the fermentation of microorganisms and bioconversion have been described.
  • DAO D-amino acid oxidase
  • glutaryl-7-ACA acylase which hydrolyzes the glutaric acid side chain generating 7-ACA
  • 6-APA produced directly by fermentation and / or enzymatic hydrolysis of penicillins G or V could be expanded to 7- AC ⁇ through the use of DAOCS, but unfortunately none of the DAOCS described so far recognize 6- APA as a substrate and therefore are unable to effect the expansion of the thiazolidine ring.
  • the possibility of expanding G or V penicillins, both in vitro and in vivo has been described by means of a DAOCS to form the corresponding G or V cephalosporins, which can be enzymatically hydrolyzed to 7-ADCA.
  • the efficiencies and productivity of these systems are far from an industrial application.
  • adipoil-7-ADCA has been described through the use of a recombinant strain of P. chrysogenum in which the DAOCS of S. clavuligerus has been expressed.
  • the addition of adipic acid during fermentation causes the production of adipoil-6-APA, a molecule that is recognized in vivo by DAOCS causing the expansion of the thiazolidine ring and producing adipoyl-7-ADCA.
  • the adipoyl-7-ADCA is purified from the rest of the components of the fermentation medium (in particular the adipoyl-6-APA) and enzymatically hydrolyzed by the use of an adipyl acylase generating 7-ADCA.
  • ⁇ -Lactam antibiotics are derived from three precursor amino acids: L- ⁇ -aminoadipic acid, L-cysteine and L-valine, which are condensed to form the precursor tripeptide ⁇ - (L- ⁇ -aminoadipil) -L-cysteinyl-D -valine (LLD-ACV) by the enzyme ACV synthetase (ACVS).
  • IPNS isopenicillin N synthase
  • IPN isopenicillin N
  • This compound has a weak antibiotic activity and is the precursor of both penicillins and cephalosporins and cephamycins.
  • the transformation of IPN into penicillin G takes place by exchanging the side chain of ⁇ -aminoadipic acid for another of phenylacetic acid, previously activated as phenylacetyl-CoA, in a reaction catalyzed by the enzyme acyl-CoA: 6-APA acyltransferase.
  • the following reaction consists in the hydroxylation of the DAOC molecule to generate deacetylcephalosporin C (DAC) and is catalyzed by the enzyme DAC synthetase (DACS) or hydroxylase.
  • DAC deacetylcephalosporin C
  • CPC cephalosporin C
  • pcbAB codes for ACVS (Gutiérrez et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 2354-2365), pcbC codes for IPNS (Samson et al. 1985. Nature 318: 191-194), cefEF codes for DAOCS / DACS (Samson et al. 1987. Biotechnology 5: 1207-1214) and cefG codes for DAC acetyltransferase (Gutierrez et al. 1992. J. Bacteriol. 174: 3056-3064).
  • DAOCS and DACS activities are located in a single polypeptide (Scheidegger et al. 1984. J. Antibiot. 37: 522-531) encoded by the cefEF gene in A. chrysogenum (Samson 1987. Biotechnology 5: 1207-1214), while in the microorganisms pro Cephamycin ductors, these activities are located in two independent polypeptides encoded respectively by the cefE genes (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171: 754-760; Barredo et al. 1991. Microbiology 7: 1-12; Ingolia TD et al. 1991. US5070020; Coque et al. 1993. Mol Gen. Genet.
  • chrysogenum capable of producing penicillin G have been developed by heterologous expression of the penDE gene of Penicillium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1990. Mol. Gen. Genet. 225: 56-64).
  • the penDE gene codes for the acyl-CoA enzyme activity: 6-APA acyltransferase, which is capable of exchanging the side chain of ⁇ -aminoadipic acid present in the isopenicillin N molecule for another consisting of aromatic acids, such as phenylacetic acid .
  • Another type of transfor- A. chrysogenum mantés of great interest are those capable of directly producing 7-amino cephalosporic acid (7- AC ⁇ ) (Isogai et al. 1991.
  • A. chrysogenum was transformed with the genes that code for the D-amino acid oxidase (DAO) activities of Fusarium solani and glutaryl-7-ACA acylase (GLA) of Pseudo-monas diminuta.
  • DAO D-amino acid oxidase
  • GLA glutaryl-7-ACA acylase
  • 7-ADCA is used as a substrate for the production of semisynthetic cephalosporins.
  • the most commonly used industrial process for the production of 7-ADCA consists in the expansion of the thiazolidine ring of penicillin by chemical methods.
  • the starting point for the chemical synthesis of 7-ADCA is an aqueous solution of penicillin, which is oxidized to penicillin sulfoxide with a peroxide and then its ring of 5 carbon atoms expands forming a ring of 6 atoms (acid 7 -phenylacetamide deacetoxycephalosporic acid or FADCH), in the presence of an appropriate chemical catalyst.
  • the purified FADCH is subjected to an enzymatic treatment catalyzed by the enzyme penicillin amidase or penicillin acylase for the elimination of the amide bond present in its molecule.
  • reaction products 7-ADCA and the side chain are obtained.
  • the last step is the purification of 7-ADCA.
  • A. chrysogenum expresses the DAOCS enzyme capable of expanding the thiazolidine ring of penicillins to the dihydrotiazine ring of cephalosporins.
  • the cefEF gene is present, which codes for the bifunctional enzyme DAOCS / DACS. Therefore, the final product of this enzyme is DAC and not DAOC as occurs in cephamycin producing organisms, which have separate DAOCS and DACS enzymes.
  • Several types of penicillins have been treated with an acellular extract of A. chrysogenum obtaining the corresponding cephalosporins (Demain et al. 1979. US4178210; Demain et al. 1979.
  • penicillin G an intermediate compound of the biosynthesis of cephalosporins and cephamycins not commercially available
  • penicillins produced industrially by P. chrysogenum penicillin G and penicillin V.
  • the idea of modifying The substrate specificity of the DAOCS enzyme in order to be able to use penicillin G as a substrate and expand it to phenylacetyl-7-ADCA has been shared by a number of research groups for years (Cantwell et al. 1990. Curr. Genet. 17: 213-221), however, its achievement has not yet been described.
  • chrysogenum is an efficient substrate for DAOCS since its side chain (adipic acid) is equivalent to that of penicillin N, the natural substrate of DAOCS.
  • adipic acid side chain
  • penicillin N the natural substrate of DAOCS.
  • 5 rum transformants were selected from industrial strains of P. chrysogenum expressing the S. clavuligerus cefE gene, which were capable of producing adipil-7- ADCA in a proportion of 17% with respect to the production of penicillin V of the parental strain.
  • adipic acid side chain was efficiently removed by treatment with the Pseudomonas cephalosporin acylase activity or enzyme.
  • P. chrysogenum transformants expressing the cefEF gene (DAOCS- DACS) from C. acremonium produced both adipyl-7-ADCA and adipyl-7-aminodeacetylcephalosporic acid (adipil-7-ADACA).
  • P. Chrysogenum transformants expressing the cefEF and cefG genes (DAC acetyltransferase) produced a mixture of adipyl-7-ADCA, adipil-7-ADACA and adipil-7-ACA.
  • the method included in the present patent consists in obtaining a strain of A. acremonium whose biosynthetic route of CPC is blocked at the level of the DAOCS / DACS enzymatic activity, so that it produces penicillin N.
  • This strain is obtained by inactivating the cefEF gene function by gene disruption by a double recombination process with a plasmid in which the cefEF gene is disrupted. Inactivation of gene function by disruption is a technique used for the modification of biosynthetic pathways and the accumulation of biosynthetic intermediates useful in obtaining certain secondary metabolites.
  • this technique has been used successfully in industrial strains of filamentous fungi. As an example in P.
  • chrysogenum the disruption of the lys2 gene can be cited, making lysine auxotrophic strains capable of biosynthesizing a greater amount of ⁇ -aminoadipic acid, which intervenes as a precursor to penicillin biosynthesis (Casqueiro et al., 1997. Spanish
  • chrysogenum the inactivation of the pcbAB genes (Hoskins et al. 1990. Curr. Genet. 18: 523-530), pcbC (Waltz and Kück. 1993. Curr. Genet. 24: 421-427) and cefG (Matsuda et al. 1992. Biochemistry. Biophys. Res. Commun. 186: 40-6), obtaining in all cases transformants incapable of producing cephalosporin C.
  • A. chrysogenum is a species where it is not they obtain gene disruptions with ease (Waltz and Kück. 1993. Curr. Genet. 24: 421-427), in this patent the inactivation by cefEF gene disruption is described for the first time. The strain of A.
  • ketoadipil-7-ADCA formed reacts non-enzymatically with hydrogen peroxide to give rise to 7- ⁇ - (carboxybutanamide) -deacetoxycephalosporin (glutaryl-7-ADCA or GL-7- ADCA).
  • glutaryl moiety of GL-7-ADCA is removed by treatment with the GLA enzyme generating 7-ADCA.
  • the described process allows obtaining 7-ADCA by a completely biological route and without the use of organic solvents.
  • DAOC as an intermediate useful in the production of 7-ADCA has not been described so far due to the impossibility of obtaining DAOC as the sole product of the fermentation of A. chrysogenum. In all cases a mixture of DAOC and DAC difficult to separate subsequently occurs. Also, the difficulty of eliminating until recently the aminoadipic acid side chain of the DAOC molecule using enzymatic procedures made the DAOC a molecule not suitable for the industrial manufacture of 7-ADCA. However, the construction of the strain A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE, allows a high production of DAOC, the latter being the majority cephalosporin.
  • the DAOC produced can be transformed to 7-ADCA by using the DAO and GLA enzymes by methods equivalent to those previously described (Croux et al. 1994. US5354667; Cambiaghi et al. 1991. EP0496993; Garc ⁇ a et al. 1998. EP0843015 ).
  • EXAMPLE 1 CefEF gene disruption in A. chrysogenum.
  • the hygromycin resistance cassette formed by the promoter of the gpd (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene of A. Nidulans, the hygromycin resistance gene (hyg R ) and the terminator was integrated of the trpC gene (tryptophan C), at the Xhol site of the cefEF gene ( Figure 1A-B). To do this, the Xhol site present in pBC KS (+) was first eliminated by double Sall-Xhol digestion and religation, resulting in the pBC * KS (+) plasmid which lacks the Xhol and Sal ⁇ restriction sites.
  • gpd glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • chrysogenum containing the cefEF and cefG genes respectively The transformants of A. chrysogenum with pALC73 were obtained according to previously described procedures (Queener et al. 1985. Lieve (ed.) Microbiology-1985. Pp. 468-472. ASM. Washington) and were selected for resistance to 5-10 ⁇ g / ml hygromycin.
  • the strain that includes plasmid pALC73, called E. coli TOP10 / pALC73 was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Research Building, Burjasot Campus, 46100 Burjasot (Valencia) with No. 5151 .
  • the transformants selected for hygromycin resistance were grown on LPE solid medium plates (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162: 163-171) by incubation for 7 days at 28 ° C. Then two cylinders or dowels were removed from each transformant with the help of a punch.
  • one of the tacos was bioassayed on a LB medium plate to which a culture of E. coli sensitive to ⁇ -lactams (E. coli ESS) and a penicillinase type preparation were added. I (Sigma P-0389) at a final concentration of 0.1 mg ml. The other taco was tested on a LB medium plate with E.
  • transformants 2672, 2673, 2675, 2680, 2691, 2692, 2693, 2694, 2695, 2696, 2697, 2698 and 2699 (marked with an asterisk) possessed the characteristics sought and were selected for subsequent tests.
  • EXAMPLE 2 Production of penicillin N by A. chrysogenum ⁇ cefEF.
  • Fermentation in liquid medium was initiated by inoculating the spores from a slant in a 250 ml flask containing 50 ml of medium or complex inoculum (Shen et al, 1986, Bio / Technology 4: 61-64). East flask was incubated for 48 hours at 28 ° C and 250 rpm to obtain an abundant vegetative mycelium. Fermentation under antibiotic production conditions began by inoculating 0.5 ml (3%) of the previous vegetative culture in a 500 ml flask with 15 ml of fermentation complex medium (Shen et al., 1986, Bio / Technology 4: 61-64).
  • This culture was incubated for 7 days at 25 ° C and 250 rpm, collecting samples of 1 ml every 24 hours for the study of antibiotic production throughout the fermentation. Subsequently, analyzes were carried out in order to determine: (I) that the antibiotic produced by the A. chrysogenum ⁇ cefEF transformants was penicillin N, (II) the level of penicillin N production of these transformants and (III) the eventual presence of others antibiotics in the fermentation medium.
  • the fermentation samples were centrifuged for 5 minutes at 20,000 g to remove the mycelium and then 50 ⁇ l of the supernatant was diluted 10 times with water and analyzed on a Waters TAD chromatograph (Waters Associates, Milford, MA) with 486M1 detector, pump W600, auto injector 717 and a Nucleosil C 18 -10 ⁇ m column (250x4.6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA).
  • the samples were analyzed with a flow of 2.3 ml / min and a variable wavelength (214 to detect penicillins or 254 nm to detect cephalosporins).
  • Enzymatic expansion of penicillin N was performed using resting cells or cell-free extracts of Streptomyces clavuligerus NP1. This strain practically does not produce cefamycin when compared to the parental strain (Mahro and Demain, 1987), which facilitates the determination of cephalosporins and / or cephamycins synthesized in vitro from penicillin N.
  • MST inoculum medium 1% soluble starch, 3% trypticase I am broth without dextrose, 90 mM MOPS; pH 7.0
  • MST was also used as fermentation medium, in this case inoculating with 5% of the previous culture and incubating at 200 rpm and 28 ° C for 24 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (10,000 rpm / 10 min. / 4 ° C) and were they washed twice with demineralized water. Finally, the cells were resuspended in 40 ml of demineralized water.
  • the reaction mixture (10 ml) for enzymatic expansion was prepared according to the procedures described (Shen et al. 1984. Enzyme Microbiol. Technol. 6: 402-404) using penicillin N produced by A. chrysogenum ⁇ cefEF TI as substrate : 50 mM MOPS pH 6.5, FeS0 4 (heptahydrate) 1.8 mM, 2.56 mM ⁇ -ketoglutaric acid, 8 ml of cell suspension and 0.2 mM N penicillin.
  • the reaction was incubated at 30 ° C and 200 rpm for 3 hours. At different times, 1 ml samples were taken, which were centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The supernatants obtained were analyzed by bioassay and HPLC.
  • the bioassay was performed on LB plates (2% agar) containing E. coli ESS as indicator microorganism and 50,000 Ul / ml penicillinase (Difco Bacto penase concentrate, Difco Laboratories, Detroit, MI). In wells prepared with the aid of a punch, 200 ⁇ l of each sample was placed and the plates were incubated at 37 ° C for 16 hours. Samples taken at zero time did not show growth inhibition halos of E. coli ESS, while those incubated for 1 or 3 hours resulted in 17 and 21 mm inhibition halos respectively, indicating the presence of reaction products (cephalosporins ) resistant to penicillinase.
  • HPLC analysis was performed with a Waters TAD device (Waters Associates, Milford, MA) with 486M1 detector, W600 pump, 717 autoinjector and a Nucleosil C 18 -10 ⁇ m column (250x4.6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA) .
  • the samples of the expansion reactions (50 ⁇ l) were analyzed with a flow of 2.3 ml / min and a variable wavelength (214 or 254 nm). The analysis at 214 nm serves to determine the presence of penicillins and at 254 nm to detect cephalosporins.
  • Elution was performed using as a mobile phase ammonium formate pH 3,3-methanol-tetrahydrofuran (99.85: 0.1: 0.05) in isocratic mode for 30 minutes.
  • the 214 nm analysis of the fermentation broth used as a substrate revealed the existence of a peak at 10.1 minutes that coincides with the retention time obtained for penicillin N, while at 254 nm it did not reveal the existence of cephalosporins.
  • the MST inoculum medium (1% soluble starch, 3% trypticase I'm broth without dextrose, 90 mM MOPS; pH 7.0) was seeded with a spore suspension of S. clavuligerus NP1 and incubated at 200 rpm. and 28 ° C for 48 hours. Cells were collected by centrifugation (10,000 rpm JIO min J4 ° C), washed twice with buffer E (15 mM Tris HCl pH 7.5, 10% ethanol) and resuspended in buffer E containing 10 mM DTT and 2 mM PMSF . The cells were broken by sonication using a Labsonic 2000 (Braun Biotech) applying 3 pulses of 25 seconds. The sample was centrifuged at 20,000 rpm. and 4 ° C for 20 minutes. The resulting extract was divided into aliquots that were frozen at -20 ° C and their protein content was analyzed by Bradford's technique.
  • the reaction for enzymatic expansion was carried out by adding
  • plasmid pALE36 ( Figure 4A-B) was constructed, which has a 400 bp BglII-Clal fragment of plasmid pT7-7 (Tabor and Richardson, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci USA 82: 1074-1078) in pBC KS +. This fragment contains a multiple cloning region downstream of the ⁇ 10 bacteriophage T7 gene promoter.
  • pALE36 has the advantage over pT7-7 of using the Cm R gene instead of the Ap R gene. This last gene codes for a ⁇ -lactamase activity that would degrade the penicillin N used as a substrate.
  • pALE36 was digested Ndel-BamHI and a 1.25 Kb Ndel-BglII fragment containing the cefE of N. lactamdurans. Finally, it was verified by sequencing that the fusion between the promoter and the cefE gene was correct and with the plasmid obtained, pALE38, competent cells of E. coli / JM109 (DE3) were transformed, selecting the transforming clones for chloramphenicol resistance .
  • IPTG was added to a final concentration of 1 mM and incubated for a further 6 hours.
  • the processing of the cells obtained, the enzymatic expansion reaction and the bioassay and HPLC analysis of the reaction products were carried out as indicated in section 2.3.2.
  • EXAMPLE 3 Expression of the cefE gene in A. chrysogenum ⁇ cefEF.
  • the cefE gene which codes for DAOCS activity, was expressed in A. chrysogenum ⁇ cefEF.
  • actinomycetes S. clavuligerus, Nocardia lactamdurans and Lysobacter lactamgenus.
  • A. chrysogenum ⁇ cefEF a series of plasmids were designed in which the cefE genes of S. clavuligerus and N. lactamdurans were placed under the control of fungal gene promoters.
  • Two promoters were chosen: one corresponding to a gene with high level of expression under fermentation conditions (pcbC gene, which codes for IPNS in P. chrysogenum) and the other belonging to the gpdA gene of A. nidulans, which constitutively expresses and codes for glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase activity.
  • the set formed by the fungic promoter, the cefE gene and the transcription terminator of the trpC gene of Aspergillus niger was inserted into plasmid pALfleo7 (Barredo et al. 1997. Spanish patent P9700482).
  • This 5.4 kb plasmid has the phleomycin resistance gene of Streptoalloteichus hindustanus flanked by the promoter of the gdhA gene of P. chrysogenum and the transcription terminator of the trpC gene of Aspergillus niger.
  • the S. clavuligerus cefE gene was subcloned into plasmid pBluescript I KS (+) (Stratagene) as a 1.6 kb BamHI-Kpnl fragment of the S. clavuligerus genome that includes the complete cefE gene and 582 bp of end 3 'of the cefD gene.
  • an Ncol restriction site was created at the 5 'end of said gene by directed mutation using the commercial kit QuikChange (Stratagene) and the oligonucleotides described in SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • the mutation process was carried out following the manufacturer's instructions and the creation of the Ncol restriction site and the absence of additional mutations were verified by sequencing.
  • the plasmid resulting from this process was called pALC83 ( Figure 6A-B).
  • pALC83 was digested with Kpnl, its ends were filled with Klenow, it was subsequently digested with Ncol and finally the 0.95 kb DNA fragment was purified using the QIAEX II kit (Qiagen). The 0.95 kb fragment was then ligated with the plasmid pALpcbC ( Figure 6A-B) digested with HindIII, filled in with Klenow and digested with Ncol.
  • pALC87 contains: (I) the S. clavuligerus cefE gene expressed under the control of the penicillium chrysogenum pcbC gene promoter and (II) the A. nidulans trpC gene downstream of the cefE gene .
  • pALC87 was digested with PvuII and the fragment containing the cefE gene was ligated with pALfleo7 digested with EcoRV and dephosphorylated.
  • plasmid pALC88 was obtained, which is a carrier of the PpcbC-cefE-TtrpC insert ( Figure 6A-B).
  • the S. clavuligerus cefE gene was also expressed under the promoter of the gpdA gene of A. nidulans.
  • the 0.95 kb fragment containing the S. clavuligerus cefE gene used in the construction of pALC87 was ligated with the plasmid pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digested with HindIII, filled with Klenow and later digested with Ncol.
  • the S. clavuligerus cefE gene is located under the control of the gpdA gene promoter of A.
  • the cefE gene of N. lactamdurans was obtained by digestion of pALE38 (section 2.3.3) with Ndel, filled in with Klenow and digestion with HindIII. In this way, a 1,250 bp DNA fragment that was ligated with the plasmid pALpcbC ( Figure 6A-B) previously digested with Ncol was purified, the protruding ends were removed with Mung Bean nuclease and digested with HindIIL in the resulting plasmid (pALC84 ) the cefE gene of N. lactamdurans is under the control of the pcbC gene promoter of Penicillium chrysogenum and followed by the trpC gene terminator of A.
  • plasmids pALC85 and pALC86 were obtained in which the PpcbC-cefE-TtrpC insert is in the two possible orientations.
  • the strain that includes plasmid pALC85, called E. coli DH5 ⁇ / pALC85 was deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Research Building, Burjasot Campus, 46100 Burjasot (Valencia) with No. 5150.
  • the cefE gene of N. lactamdurans was also expressed under the promoter of the gpdA gene of A. nidulans.
  • the 1,250 bp 5 DNA fragment containing the N. lactamdurans cefE gene described above was ligated with the plasmid pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digested with Ncol, the protruding ends with Mung Bean nuclease removed and later digested with HindIII.
  • the cefE gene of N. Lactamdurans is under the control or promoter of the gpdA gene of A.
  • the selected transformants were grown on LPE medium or solid plates (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162: 163-171) by incubation for 7 days at 28 ° C. Then, with the help of a punch, a cylinder or block was extracted from each transformant, which was bioassayed on a plate of LB medium to which a culture of E. coli sensitive to ⁇ -lactams (E. coli) was added ESS) and a penicillinase type I (Sigma) preparation at a final concentration of 0.1 mg / ml. In this way, those transformants that produced the greatest halos of inhibition were selected, indicating that they were able to synthesize larger amounts of penicillinase resistant antibiotics.
  • Total DNA was digested with the enzymes BamHI and Sal ⁇ and, after separation by electrophoresis and transfer to nitrocellulose filters, hybridized using a 0.6 kb HindlII-Kpnl probe corresponding to the cefE gene of N. lactamdurans (transformants 2800 0 2808) or with a 0.5 kb Kpnl-Scal probe corresponding to the S. clavuligerus cefE gene (transformants 2809 to 2817).
  • the result obtained showed the expected restriction pattern: the parental strain A. chrysogenum and the strains A. chrysogenum ⁇ cefEF TI, A. chrysogenum ⁇ cefEF T2 and A.
  • chrysogenum ⁇ cefEF T3 did not show any hybridization band, while in the transformants called A.
  • chrysogenum ⁇ cefEF-cefE appeared additional hybridization bands indicating the integration of the cefE gene in the genome of A. chrysogenum ⁇ cefEF.
  • the fermentation of the strains of A. chrysogenum, A. chrysogenum ⁇ cefEF and A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE was performed as indicated in section 2.1, determining (I) that the antibiotic produced by A. chryso-genum ⁇ cefEF-cefE DAOC was, (II) the level of DAOC production of 5 such transforming strains and (III) the possible presence of other antibiotics in the fermentation medium.
  • a total of 10 liters of the A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE fermentation broth containing 20 g / 1 DAOC was adjusted to pH 3.0 with concentrated H 2 S0 4 and filtered through a vacuum Büchner filter and with the help of a diatomaceous earth as a filter aid.
  • the filtered biomass is washed with 10 liters of demineralized water in order to deplete the entire DAOC of the biomass, obtaining a volume of filtered broth of 16.4 liters.
  • the filtered broth was passed through a column (1 mx 16 cm) of XAD4 polystyrene resin (Rohm & Haas) packed with 10 liters of resin at a flow rate of 150 ml / min.
  • the column was washed with approximately 10 liters of water and eluted with a 0.15 M solution of sodium acetate.
  • the eluted fractions were analyzed by HPLC to examine the DAOC content. Subsequently, those fractions rich in DAOC were collected, obtaining an eluate volume of 23.5 liters.
  • the eluate was adjusted to pH 5.5 and subjected to decolorization and purification by percolation through a column packed with IRA68 ammonium exchange resin (Rohm & Haas).
  • the decolorized solution was subjected to a process of concentration by reverse osmosis until a concentration greater than 200 g / 1 of DAOC was reached.
  • DAOC bioconversion in glutaryl-7-ADCA catalyzed by immobilized DAO To perform the bioconversion of the DAOC obtained as described in example 4, 66 g of DAOC sodium salt was dissolved in 2 liters of 25 mM potassium phosphate buffer containing 0.5 g of sodium metabisulfite. The DAOC solution was placed in a 3 liter reactor containing 150 g of DAO immobilized in Eupergit C (Rohm) according to the methods described (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993). The mixture was incubated at 25 ° C with slight stirring and bubbling of oxygen (1 vol./volJmin.) Through a diffuser located at the bottom of the reactor. The pH was maintained at 7.5 by automatic addition of 5% ammonium hydroxide. In 75 minutes, the DAOC was completely transformed to obtain a mixture of glutaryl-7-ADCA (90%) and ketoadipil-7-ADCA (10%).
  • ketoadipil-7-ADCA To transform the residual ketoadipil-7-ADCA to glutaryl-7-ADCA, the solution obtained after incubation was filtered off the immobilized enzyme and 10 ml of hydrogen peroxide (H 2 0 2 ) was added at a concentration of 3 , 5% per liter of filtrate. The mixture was incubated for 15 minutes at 25 ° C, after which 0.5 g of sodium pyruvate was added. After said treatment the ketoadipil-7-ADCA is completely transformed into glutaryl-7-ADCA, obtaining a solution of 3% glutaryl-7-ADCA. Said solution was concentrated by osmosis at 4 ° C to a concentration of 5% to be used in the next enzymatic stage.
  • H 2 0 2 hydrogen peroxide
  • the solids were then separated from the fermentation, mainly containing A. Chrysogenum and Rhodotorula gracilis cells together with varying amounts of insoluble material from the fermentation medium, by using an ultrafiltration system through membranes with a molecular cut of 30,000 Da.
  • ketoadipil-7- ADCA was transformed into glutaryl-7-ADCA, obtaining a solution with a richness in glutaryl-7-ADCA of 1%. Said solution was concentrated by reverse osmosis to an approximate concentration of 5% in glutaryl-7-ADCA.
  • the organic phase was washed with 0.25 liters of 25 mM phosphate buffer at pH 8.0 in order to exhaust it thoroughly from glutaryl-7-ADCA.
  • Aqueous extracts obtained containing 50 g / 1 glutaryl-7-ADCA were pooled and used directly for the next enzymatic conversion or were subjected to a vacuum distillation process to remove organic solvent residues and thus increase the life of the catalyst in the next enzymatic conversion.
  • 7-ADCA was treated with 3 g of active carbon for 20 minutes at room temperature and with stirring in order to remove impurities and reduce the color of the final product.
  • the coal was removed by filtration and washed with 10 ml of water.
  • the filtered solution was adjusted to pH 4.5 by the addition of H 2 S0 4 6 N, so that crystallization of 7-ADCA was initiated, and it was incubated for 15 minutes with slow stirring so that crystallization progressed.
  • the temperature was lowered to 5-10 ° C, the pH finally being adjusted to 3.8 by the addition of H 2 S0 4 6 N. After 2 hours of incubation, the precipitate was recovered by filtration and was washed with 25 ml of water.
  • the crystallization yield was 95.5%, obtaining a 7-ADCA with a purity of 98.3%.
  • the coal was removed by filtration and washed with 10 ml of water.
  • the filtered solution was adjusted to pH 3.0 by the addition of 2N ammoniacal solution so that crystallization of 7-ADCA was initiated. It was then incubated for 15 minutes with slow stirring until crystallization progressed, finally adjusting the pH to 3.7 by adding NH 4 OH 2N and at a temperature between 5-10 ° C. After 2 hours the precipitate was recovered by filtration and washed with 25 ml of water.
  • the crystallization yield was 94%, obtaining a 7-ADCA with a purity of 98.5%.
  • EXAMPLE 7 Production of 7- ADCA by A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE-dao-gla and A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE-cac. Based on a previous description, it is possible to construct a biosynthetic operon for the production of 7-ACA directly by fermentation of A. chrysogenum (Isogai et al. 1991 Biotechnology 9: 188-91). The system described is based on the expression in A. chrysogenum of the genes (cDNAs) that code for the DAO and GLA enzymatic activities of Fusarium solani and Pseudomonas diminuta respectively. Applying this same idea to the strain A.
  • cDNAs genes
  • chrysogenum ⁇ cefEF-cefE it is possible to construct a biosynthetic operon for the production of 7- ADCA directly by fermentation of A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE-dao-gla. In this case, due to the impossibility of A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE to produce CPC, the biosynthesis of 7-ADCA takes place instead of 7-ACA.
  • the 7-ADCA produced by fermentation of A. chrysogenum ⁇ cefEF-cefE-dao-gla can be purified as indicated in example 6.
  • FIGURES Figure 1A-B DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1A-B.- Scheme of the construction of pALC73, plasmid for the disruption of the cefEF gene of A. chrysogenum.
  • plasmid pExp7.2 BB which includes the cefEF and cefG genes of A. chrysogenum, was subcloned into the BamHI site of plasmid pBC KS (+) which had previously been inactivated the Xhol site.
  • the resulting plasmid was named pALC72.
  • the hygromycin resistance (hygR) gene was then inserted into the Xhol site of the cefEF gene giving rise to pALC73.
  • This 14.6 kb plasmid includes the chloramphenicol resistance gene (CmR) as a selection marker in E. coli and the hygromycin resistance gene (hygR) as a selective marker in A. chrysogenum.
  • CmR chloramphenicol resistance gene
  • hygR hygromycin resistance gene
  • the hygR gene is expressed under the control of the gpd promoter (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase) and has the trpC terminator (tryptophan C).
  • FIG. 2 Scheme of the disruption of the cefEF gene of A. chrysogenum. Plasmid pALC73 is integrated by double recombination in one of the A. chrysogenum chromosomes inactivating the cefEF gene. In the lower part of the figure, Southern analysis of the disrupted A. chrysogenum clones in the cefEF gene is shown. The hybridization band obtained by BamHI digestion of the parental strain DNA is converted into two 5.7 kb and 5.3 kb bands in the transforming strains with the inactivated cefEF gene. Similarly, the 0.5 kb hybridization band I left the parental strain becomes another 2.2 kb band in the disrupted transformants in the cefEF gene.
  • the disrupted transformants are called A. chrysogenum ⁇ cefEF TI, A. chrysogenum ⁇ cefEF T2 and A. chrysogenum ⁇ ce EF T3.
  • P corresponds to the parental strain A. chrysogenum
  • TI, T2 and T3 are transformants of A. chrysogenum with the inactivated cefEF gene.
  • Figure 3 Enzymatic expansion of penicillin N to DAOC using enzymatic extracts free of S. clavuligerus NP1 cells.
  • a chromatogram of the reaction mixture is shown at time 0 and in the lower panel the same mixture after 2 hours of reaction.
  • Abcisas time in minutes; Ordered: Optical Density (D.O.)
  • FIG. 4A-B Scheme of the construction of pALE38, plasmid for the expression of the cecard gene of Nocardia lactamdurans in E. coli under the control of T7 promoter.
  • FIG. 5A-B Analysis by LC masses of penicillin N produced by A. chrysogenum ⁇ cefEF TI. In the upper panel a chromatogram is shown at 214 nm and in the lower one the mass spectrum corresponding to the peak eluting at 11.92 minutes.
  • Figure 6A-B Scheme of the construction of pALC88, plasmid for the expression of the S. clavuligerus cefE gene in A. chrysogenum under the control of the pcbC gene promoter of P. chrysogenum.
  • Figure 7A-B Scheme of the construction of pALC93 and pALC94, plasmids for the expression of the S. clavuligerus cefE gene in A. chrysogenum under the control of the gpdA promoter of A. nidulans.
  • Figure 8A-B Scheme of the construction of pALC85 and pALC86, plasmids for the expression of the cefE gene of N. lactamdurans in A. chrysogenum under the control of the pcbC gene promoter of P. chrysogenum.
  • Figure 9A-B Scheme of the construction of pALC90 and pALC91, plasmids for the expression of the cefE gene of N. lactamdurans in A. chrysogenum under the control of the gpdA gene promoter of A. nidulans.

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Abstract

El procedimiento está basado en la utilización de desacetoxicefalosporina C (DAOC) producida directamente por fermentación de Acremonium chrysogenum (también denominado Cephalosporium acremonium) y catalizado por las actividades enzimáticas D-aminoácido oxidasa (DAO) y glutaril-7-ACA acilasa (GLA). El método de producción de DAOC por fermentación de A. chrysogenum está basado en la inactivación del gen cefEF y posterior expresión del gen cefE dando lugar a la cepa A. chrysogenum ΔcefEF-cefE. La invención incluye los siguientes apartados: (I) inactivación del gen cefEF de A. Chrysogenum, el cual codifica para las actividades enzimáticas desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS o expandasa) y desacetilcefalosporina C sintasa (DACS o hidroxilasa), (II) expresión del gen cefE, el cual codifica para la actividad enzimática DAOCS, procedente de un actinomiceto en el transformante de A. chrysogenum inactivado en el gen cefEF, (III) desarrollo de un método de fermentación de la cepa recombinante para la producción de DAOC y (IV) conversión enzimática de DAOC en 7-ADCA catalizada por las enzimas DAO y GLA. Alternativamente, sería posible producir 7-ADCA directamente por fermentación de A. chrysogenum mediante la expresión conjunta de los genes que codifican para DAO y GLA en la cepa A. chrysogenum ΔcefEF-cefE productora de DAOC o a través de la expresión de un gen que codifica para la enzima cefalosporina acilasa en A. chrysogenum ΔcefEF-cefE.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ACIDO 7-AMLNODES- ACETOXICEFALOSPORANICO (7-ADCA)
CAMPO DE LA INVENCIÓN
5
La invención se adscribe a la producción de 7-ADCA, o sus compuestos intermedios penicilina N o desacetoxicefalosporina C mediante fermentación de cepas Acremonium chrysogenum transformadas.
i o ESTADO DE LA TÉCNICA
Las cefalosporinas son un grupo de antibióticos de gran importancia terapéutica producidos industrialmente por fermentación de A. chrysogenum o alternativamente mediante la expansión química del anillo tiazo- 15 lidínico de las penicilinas generando un anillo dihidrotiazínico. Mediante la incorporación de cadenas laterales en diferentes posiciones de los anillos β- lactámico y dihidrotiazínico se pueden sintetizar un ingente número de cefalosporinas con mayor capacidad antibiótica o mejores propiedades farmacocinéticas. La preparación de estos antibióticos semisintéticos ha
2 o despertado un gran interés en los últimos años, lo que ha conducido a una optimización e innovación en los procedimientos y métodos utilizados para su preparación.
El ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA) es uno de los sustratos utilizados para la preparación de cefalosporinas caracterizadas por 5 la ausencia de funcionalización en la posición 3. Debido a esta ausencia de funcionalización, el 7-ADCA es sintetizado generalmente mediante la expansión del anillo tiazolidínico de penicilinas obtenidas por fermentación, mientras que el resto de los compuestos cefalosporánicos son preparados a partir de cefalosporinas naturales obtenidas por fermentación. Habi-
3 o tualmente el 7-ADCA es producido a partir de penicilina G o V, requiriendo de 4 a 5 etapas químicas para expandir el anillo de 5 miembros carac- terístico de las penicilinas hasta el anillo de 6 miembros característico de las cefalosporinas. Dicho proceso, como muchos de los procesos químicos, presenta una serie de desventajas frente a los procesos biológicos: se trata de un proceso complejo con múltiples etapas, requiere la utilización de reac- 5 tivos químicos costosos y tóxicos, utiliza solventes orgánicos nocivos para el medio ambiente y durante el proceso se originan subproductos e impurezas que requieren complejos sistemas de purificación. Como alternativa al proceso químico se han descrito diferentes estrategias de obtención de 7- ADCA basados en la fermentación de microorganismos y bioconversión. Se i o trata de procedimientos equivalentes a los desarrollados en los años 80 para la obtención de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) por hidrólisis enzimática de las penicilinas G y V o a las estrategias descritas en los años 90 para la obtención de ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA) por hidrólisis enzimática de la cadena lateral de ácido D-(α)-aminoadípico de la
15 cefalosporina C. En este último caso la reacción está catalizada por las enzimas D-aminoácido oxidasa (DAO), la cual participa en la transami- nación que transforma la cadena lateral de ácido aminoadípico en ácido glutárico, y glutaril-7-ACA acilasa, la cual hidroliza la cadena lateral de ácido glutárico generando 7-ACA,
20 La obtención de cepas de A. chrysogenum superproductoras de des- acetoxicefalosporina C (DAOC), precursor directo del 7-ADCA, es compleja debido a la existencia en dicho microorganismo de la enzima bi- funcional desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS o expandasa), la cual expande e hidroxila el anillo tiazolidínico generando desacetilcefalosporina
25 C (DAC). Un problema equivalente se plantea en actinomicetos, donde la presencia de enzimas capaces de metoxilar la posición 7 de la molécula de cefalosporina formando cefamicinas, impide la obtención de cepas superproductoras de DAOC. La mayoría de los intentos de obtención de 7-ADCA mediante un proceso enzimático o fermentativo se han centrado en la uti-
30 lización de enzimas con actividad DAOCS, las cuales catalizan la expansión del anillo tiazolidínico de 5 miembros presente en las penicilinas al anillo dihidrotiazínico de 6 miembros presente en las cefalosporinas.
Teóricamente, el 6-APA producido directamente por fermentación y/o hidrólisis enzimática de las penicilinas G o V, podría ser expandido a 7- ACÁ mediante la utilización de DAOCS, pero desafortunadamente ninguna de las DAOCS descritas hasta el momento reconocen el 6- APA como sustrato y por tanto son incapaces de efectuar la expansión del anillo tiazolidínico. Por otro lado, ha sido descrita la posibilidad de expandir las penicilinas G o V, tanto in vitro como in vivo, mediante una DAOCS para formar las correspondientes cefalosporinas G o V, las cuales pueden ser hidrolizadas enzimáticamente a 7-ADCA. No obstante, dada la elevada especificidad de sustrato de la DAOCS, las eficiencias y productividades de estos sistemas se encuentran muy lejos de una aplicación industrial.
Recientemente ha sido descrita la producción de adipoil-7-ADCA mediante la utilización de una cepa recombinante de P. chrysogenum en la cual se ha expresado la DAOCS de S. clavuligerus. La adición de ácido adípico durante la fermentación (en lugar de los ácidos fenilacético o fenoxiacético que se utilizan en la producción de las penicilinas G o V respectivamente) origina la producción de adipoil-6-APA, molécula que es reconocida in vivo por la DAOCS originando la expansión del anillo tiazolidínico y produciendo adipoil-7-ADCA. Posteriormente se purifica el adipoil-7-ADCA del resto de componentes del medio de fermentación (en particular del adipoil-6-APA) y se hidroliza enzimáticamente mediante la utilización de una adipil acilasa generando 7-ADCA. Aunque dicho proceso presenta elevadas eficiencias tanto de producción como de expansión enzimática e hidrólisis de la cadena lateral, presenta como principales desventajas: (I) la necesidad de adicionar una cadena lateral de precio elevado como es el ácido adípico y (II) la producción de mezclas de adipoil-6-APA y adipoil-7-ADCA que, debido tanto a la similitud de su estructura como a su comportamiento en hidrólisis enzimática con adipil acilasa, es necesario separar previamente, lo cual aporta una complejidad añadida al proceso. ESTADO DE LA TÉCNICA
Las rutas biosintéticas de penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas (esquema 1) han sido estudiadas detalladamente en los últimos años, con lo que se ha alcanzado un conocimiento profundo de los pasos biosintéticos implicados. Los antibióticos β-lactámicos derivan de tres aminoácidos precursores: ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína y L-valina, los cuales son condensados para formar el tripéptido precursor δ-(L-α-aminoadipil)-L- cisteinil-D-valina (LLD-ACV) por la enzima ACV sintetasa (ACVS). Se- guidamente, el tripéptido lineal es ciclado oxidativamente por acción de la enzima isopenicilina N sintasa (IPNS) dando lugar a isopenicilina N (IPN). Este compuesto posee una débil actividad antibiótica y es el precursor tanto de penicilinas como de cefalosporinas y cefamicinas. La transformación de IPN en penicilina G tiene lugar mediante el intercambio de la cadena lateral de ácido α-aminoadípico por otra de ácido fenilacético, previamente activado como fenilacetil-CoA, en una reacción catalizada por la enzima acil-CoA:6-APA aciltransferasa.
Ácido L-α-Aminoadípico L-Císteina L-Valina
Figure imgf000007_0001
ESQUEMA 1 HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Por su parte, la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas a partir de IPN se inicia con la isomerización de la cadena lateral de L-α-aminoadipilo en D-α-aminoadipilo, catalizada por la enzima IPN epimerasa (IPNE). La penicilina N formada es transformada en DAOC por acción de la enzima DAOCS, la cual convierte el anillo tiazolidínico de 5 miembros típico de las penicilinas en el anillo dihidrotiazínico de 6 miembros de cefalosporinas y cefamicinas. La siguiente reacción consiste en la hidroxilación de la molécula de DAOC para generar desacetilcefalosporina C (DAC) y está catalizada por la enzima DAC sintetasa (DACS) o hidroxilasa. La acetilación de la DAC con la consiguiente formación de cefalosporina C (CPC) es el paso biosintético final en los hongos productores de cefalosporinas. Esta reacción está catalizada por la enzima DAC acetiltransferasa.
La mayor parte de los genes que codifican para enzimas implicados en la biosíntesis de cefalosporina en A. chrysogenum han sido identi- ficados: pcbAB codifica para ACVS (Gutiérrez et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 2354-2365), pcbC codifica para IPNS (Samson et al. 1985. Nature 318: 191-194), cefEF codifica para DAOCS/DACS (Samson et al. 1987. Biotechnology 5: 1207-1214) y cefG codifica para DAC acetiltransferasa (Gutiérrez et al. 1992. J. Bacteriol. 174: 3056-3064). Los genes que codifican para las dos primeras enzimas de la ruta biosintética (pcbAB y pcbC) se encuentran agrupados en el cromosoma VI, mientras que cefEF y cefG, los cuales codifican para las enzimas que catalizan los dos últimos pasos de la ruta, se encuentran agrupados en el cromosoma II (Skatrud and Queener, 1989. Gene 78: 331-338). No obstante, aún no ha sido identifi- cado el gen de A. chrysogenum que codifica para la actividad enzimática IPNE equivalente al gen cefD descrito en actinomicetos (Coque et al. 1993. Mol. Gen. Genet. 236: 453-458; Kovacevic et al. 1990. J. Bacteriol. 172: 3952-3958). Las actividades DAOCS y DACS se encuentran localizadas en un único polipéptido (Scheidegger et al. 1984. J. Antibiot. 37: 522-531) codificado por el gen cefEF en A. chrysogenum (Samson 1987. Biotechnology 5: 1207-1214), mientras que en los microorganismos pro- ductores de cefamicinas, dichas actividades están localizadas en dos poli- péptidos independientes codificados respectivamente por los genes cefE (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171 : 754-760; Barredo et al. 1991. Microbiología 7: 1-12; Ingolia T.D. et al. 1991. US5070020; Coque et al. 1993. Mol Gen. Genet. 236: 453-458; Kimura et al. 1996. Appl. Microbiol Biotechnol. 44: 589-596; Enguita et al. 1998. J. Bacteriol. 180: 5489-5494) y cefF (Kovacevic et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 398-400). Los programas industriales de mejora de cepas de A. chrysogenum han dado lugar a reorganizaciones cromosómicas, las cuales originan patrones electroforé- ticos alterados en cepas con diferente producción de cefalosporina, no conociéndose en profundidad la relación existente entre dichas translocaciones y el nivel de producción de antibiótico (Mathison et al. 1993. Curr. Genet. 23: 33-41).
Los genes biosintéticos de cefalosporina han sido utilizados previa- mente para la mejora de la producción de una cepa industrial de A. chrysogenum (Skatrud et al. 1989. Biotechnology 7: 477-485). En dicha cepa, que acumulaba una importante cantidad de penicilina N, se introdujeron por transformación copias adicionales de los genes cefEF y cefG consiguiendo incrementar la actividad enzimática DAOCS, disminuir la cantidad de penicilina N acumulada e incrementar notablemente la producción de CPC. También se han descrito mejoras de producción de CPC en A. chrysogenum mediante el incremento de oxígeno disponible gracias a la expresión de una hemoglobina bacteriana procedente de Vitreoscilla (DeModena et al. 1993. Biotechnology 11 : 926-929). Asimismo, se han desarrollado cepas de A. chrysogenum capaces de producir penicilina G mediante la expresión heteróloga del gen penDE de Penicillium chrysogenum (Gutiérrez et al. 1990. Mol. Gen. Genet. 225: 56-64). El gen penDE codifica para la actividad enzimática acil-CoA:6-APA aciltransferasa, la cual es capaz de intercambiar la cadena lateral de ácido α-aminoadípico presente en la molécula de isopenicilina N por otra consistente en ácidos aromáticos, como por ejemplo ácido fenilacético. Otro tipo de transfor- mantés de A. chrysogenum de gran interés son aquellos capaces de producir directamente ácido 7-amino cefalosporánico (7- ACÁ) (Isogai et al. 1991. Biotechnology 9: 188-191). En este caso, A. chrysogenum fue transformado con los genes que codifican para las actividades D-aminoácido oxidasa (DAO) de Fusarium solani y glutaril-7-ACA acilasa (GLA) de Pseudo- monas diminuta. Dichos transformantes producen pequeñas cantidades de 7-ACA, 7-ADCA y ácido 7-aminodesacetilcefalosporánico.
Uno de los compuestos de mayor interés en la industria farmacéutica es el 7-ADCA, el cual se utiliza como sustrato para la producción de cefalosporinas semisintéticas. El procedimiento industrial más utilizado para la producción de 7-ADCA consiste en la expansión del anillo tiazolidínico de la penicilina mediante métodos químicos. El punto de partida para la síntesis química de 7-ADCA es una solución acuosa de penicilina, la cual se oxida a sulfóxido de penicilina con un peróxido y seguidamente su anillo de 5 átomos de carbono se expande formando un anillo de 6 átomos (ácido 7-fenilacetamido desacetoxicefalosporánico o FADCH), en presencia de un catalizador químico apropiado. El FADCH purificado se somete a un tratamiento enzimático catalizado por la enzima penicilina amidasa o penicilina acilasa para la eliminación del enlace amídico presente en su molécula. Como productos de la reacción se obtienen 7-ADCA y la cadena lateral. El último paso consiste en la purificación del 7-ADCA.
Figure imgf000011_0001
oxidasa
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ESQUEMA 2 Una de las claves para la sustitución del procedimiento químico descrito anteriormente por un proceso biológico de fermentación o biocon- versión consiste en la caracterización de los genes y enzimas implicados en la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas. En este sentido ha sido descrita la purificación de las actividades enzimáticas IPNS, IPNE y DAOCS a partir de extractos acelulares de diversos organismos procariotas entre los que se incluye S. clavuligerus (Wolfe et al. 1985. US4510246; Wolfe et al. 1985. US4536476). Asimismo, ha sido descrita la clonación y caracterización de los genes cefE, los cuales codifican para DAOCS, de S. clavuligerus y Nocardia lactamdurans (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171: 754-760; Coque et al. 1993. Mol Gen. Genet. 236: 453-458).
A. chrysogenum expresa la enzima DAOCS capaz de expandir el anillo tiazolidínico de las penicilinas hasta el anillo dihidrotiazínico de las cefalosporinas. En este microorganismo está presente el gen cefEF el cual codifica para la enzima bifimcional DAOCS/DACS. Por tanto, el producto final de esta enzima es DAC y no DAOC como ocurre en los organismos productores de cefamicinas, los cuales presentan enzimas DAOCS y DACS separadas. Varios tipos de penicilinas han sido tratadas con un extracto acelular de A. chrysogenum obteniéndose las correspondientes cefalos- porinas (Demain et al. 1979. US4178210; Demain et al. 1979. US4248966; Demain et al. 1981. US4307192). Asimismo, han sido determinados una serie de parámetros de la enzima DAOCS/DACS de A. chrysogenum como punto isoeléctrico, peso molecular, composición de aminoácidos, relación entre las actividades hidroxilasa/expandasa y fragmentación peptídica (Wu- Kuang et al. 1988. US 4753881). A pesar de que se han realizado importantes esfuerzos en conseguir enzimas que posean separadas las actividades ex- pandasa e hidroxilasa, y que por tanto pudieran expandir la penicilina N a DAOC, los resultados obtenidos hasta el momento han sido totalmente infructuosos. Se ha sugerido la posibilidad de separar la información genética que codifica para DAOCS y DACS y expresar separadamente ambas actividades, si bien no existe descripción alguna al respecto. Diferentes intentos han sido descritos para conseguir la expansión enzimática de penicilina G o V a su correspondiente desacetoxicefalospo- rina G o V utilizando DAOCS de diferentes orígenes. Recientemente se ha descrito la optimización de la expansión in vitro de un gran número de penicilinas, entre las que se encuentra la penicilina G, mediante el empleo de un extracto libre de células de S. clavuligerus NP1, mutante deficiente en la producción de cefalosporinas (Cho et al. 1998. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 11544-11548). Aunque en este caso se incrementan notablemente los rendimientos de expansión mediante un ajuste de las condiciones de reacción, dichos resultados están lejos de un posible uso industrial debido a la naturaleza y coste de los cofactores, bajos rendimientos del proceso de expansión y dificultades de aislamiento y purificación de la cefalosporina G en presencia de importantes concentraciones de penicilina G no expandida.
Las DAOCS naturales descritas hasta el momento actúan eficiente- mente sobre penicilina N, compuesto intermediario de la biosíntesis de cefalosporinas y cefamicinas no disponible comercialmente, pero no sobre las penicilinas producidas industrialmente por P. chrysogenum: penicilina G y penicilina V. La idea de modificar la especificidad de sustrato de la enzima DAOCS con la finalidad de que sea capaz de utilizar penicilina G como sustrato y expandirlo a fenilacetil-7-ADCA es compartida por una serie de grupos de investigación desde hace años (Cantwell et al. 1990. Curr. Genet. 17: 213-221), no obstante, su consecución aún no ha sido descrita. La cadena lateral aromática del fenilacetil-7-ADCA podría ser fácilmente eliminada mediante la enzima penicilina acilasa, originando 7- ADCA. Asimismo, los genes cefD y cefE de S. clavuligerus, los cuales codifican para las actividades enzimáticas IPNE y DAOCS, han sido simultáneamente expresados en P. chrysogenum originando pequeñas cantidades de DAOC debido a la isomerización de IPN a penicilina N y posterior formación del anillo de 6 miembros característico de las cefalosporinas (Cantwell et al. 1992. P. Roy. Soc. Lond. B 248: 283-289). La clonación y caracterización y expresión en E. coli del gen cefE de S. clavuligerus, el cual codifica para la actividad DAOCS, ha sido previamente descrita (Kovacevic et al. 1989. J. Bacteriol. 171 : 754-760). Asimismo, se conoce la secuencia de DNA del gen cefE de S. clavuligerus y que su expresión en P. chrysogenum genera actividad DAOCS en dicho hongo (Ingolia T.D. et al. 5 1991. US5070020; Queener et al. 1994. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721 : 178- 193). Por su parte, el gen cefEF de A. chrysogenum ha sido expresado en P. Chrysogenum, si bien, al igual que ocurre con el gen cefE de S. clavuligerus, no ha sido demostrada hasta el momento la conversión de penicilina G o V a sus correspondientes cefalosporinas usando estas cepas recombi- 0 nantes de P. chrysogenum.
Otra estrategia utilizada, dada la dificultad de la expansión directa de las penicilinas G o V a las correspondientes cefalosporinas, ha sido la expansión de penicilinas con cadenas laterales diferentes a los ácidos fenilacé- tico o fenoxiacético. La adición de los ácidos fenilacético o fenoxiacético a 5 fermentaciones de P. chrysogenum origina la biosíntesis de penicilina G o penicilina V respectivamente. Asimismo, cuando en el medio de cultivo se añade ácido adípico, P. chrysogenum produce adipil-6-APA o carboxi-n- butil-penicilina (Ballio et al. 1960. Nature 185: 97-99). El adipil-6-APA producido por P. chrysogenum es un sustrato eficiente para la DAOCS ya 0 que su cadena lateral (ácido adípico) es equivalente a la de la penicilina N, sustrato natural de la DAOCS. Tomando como base estos estudios se realizó la primera descripción de un proceso utilizable industrialmente para la biosíntesis de 7-ACA y 7-ADCA (Crawford et al. 1995. Biotechnology 13: 58-62; Bovenberg et al. 1998. WO9802551A2). En este caso se selecciona- 5 ron transformantes de cepas industriales de P. chrysogenum que expresaban el gen cefE de S. clavuligerus, los cuales eran capaces de producir adipil-7- ADCA en una proporción del 17 % respecto de la producción de penicilina V de la cepa parental. Como era de esperar, la cadena lateral de ácido adípico era eficientemente eliminada mediante tratamiento con la actividad o enzimática cefalosporina acilasa de Pseudomonas. De forma similar, transformantes de P. chrysogenum que expresaban el gen cefEF (DAOCS- DACS) de C. acremonium produjeron tanto adipil-7-ADCA como ácido adipil-7-aminodesacetilcefalosporánico (adipil-7-ADACA). Asimismo, transformantes de P. Chrysogenum que expresaban los genes cefEF y cefG (DAC acetiltransferasa) produjeron una mezcla de adipil-7-ADCA, adipil- 7-ADACA y adipil-7-ACA. Aunque obtuvieron cantidades relativamente pequeñas de estos adipil-derivados (0,6% de la penicilina V producida en fermentaciones con adición de ácido fenoxiacético), los autores proponen que mediante técnicas clásicas de mejora de cepas se podrían obtener productividades que hicieran posible su aplicación a escala industrial (Crawford et al. 1995. Biotechnology 13 : 58-62).
El método recogido en la presente patente consiste en la obtención de una cepa de A. acremonium cuya ruta biosintética de CPC está bloqueada a nivel de la actividad enzimática DAOCS/DACS, de forma que produce penicilina N. Esta cepa se obtiene por inactivación de la función del gen cefEF mediante disrupción génica por un proceso de doble recombinación con un plásmido en el que el gen cefEF se encuentra interrumpido. La inactivación de la función del gen mediante disrupción es una técnica utilizada para la modificación de rutas de biosíntesis y la acumulación de intermediarios biosintéticos útiles en la obtención de determinados metabo- litos secundarios. Sin embargo, son pocos los casos en los que esta técnica ha sido empleada con éxito en cepas industriales de hongos filamentosos. Como ejemplo en P. chrysogenum puede citarse la disrupción del gen lys2, consiguiéndose cepas auxótrofas de lisina capaces de biosintetizar una mayor cantidad de ácido α-aminoadípico, el cual interviene como precursor de la biosíntesis de penicilina (Casqueiro et al., 1997. Patente española
P9701343. Casqueiro et al, 1999. J Bacteriol 181 :1181-1188). En el caso de A. nidulans se ha disrupcionado el gen phacA lográndose disminuir la actividad fenilacetato hidroxilasa, limitando por tanto la oxidación de ácido fenilacético, y favoreciendo su incorporación en penicilina G (Fernández- Cañón et al., 1997. Patente española P9700833; Fernández-Cañón et al., 1998. PCT/ES98/0010; Mingot et al., 1999. J Biol Chem 274: 14545- 14550). En A. chrysogenum se ha descrito la inactivación de los genes pcbAB (Hoskins et al. 1990. Curr. Genet. 18: 523-530), pcbC (Waltz and Kück. 1993. Curr. Genet. 24: 421-427) y cefG (Matsuda et al. 1992. Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 186: 40-6), obteniéndose en todos los casos transformantes incapaces de producir cefalosporina C. A pesar de que A. chrysogenum es una especie donde no se obtienen disrupciones génicas con facilidad (Waltz and Kück. 1993. Curr. Genet. 24: 421-427), en la presente patente se describe por primera vez la inactivación por disrupción del gen cefEF. La cepa de A. acremonium con la función del gen cefEF inactivada se transforma posteriormente con un plásmido que incluye el gen cefE procedente de un actinomiceto expresado bajo el control de diferentes promotores füngicos. Por último se seleccionan los transformantes que producen mayor cantidad de DAOC, la cual se convierte en 7-ADCA mediante un proceso enzimático en dos pasos: (I) Conversión de DAOC en 7-β-(5- caboxi-5-oxopentanamido)-desacetoxicefalosporina (cetoadipil-7-ADCA) catalizado por la actividad DAO. El cetoadipil-7-ADCA formado reacciona de forma no enzimática con el peróxido de hidrógeno para dar lugar a 7-β- (carboxibutanamido)-desacetoxicefalosporina (glutaril-7-ADCA ó GL-7- ADCA). (II) El resto glutarilo del GL-7-ADCA se elimina mediante tratamiento con la enzima GLA generando 7-ADCA. Globalmente, el proceso descrito permite la obtención de 7-ADCA por una vía totalmente biológica y sin la utilización de solventes orgánicos.
Hasta el momento no se ha descrito la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum con la finalidad de incrementar la producción de penicilina N, dado el escaso valor comercial de este antibiótico debido fundamentalmente a: (I) la escasa actividad antimicrobiana que presenta la penicilina N frente a las penicilinas hidrofóbicas (G o V), penicilinas semisintéticas y cefalosporinas, (II) su escasa utilidad como compuesto intermedio en la prepara- ción de 6-APA dada su reducida estabilidad, así como sus propiedades físico-químicas de solubilidad y acidez-basicidad que complican enormemente su aislamiento y (III) la imposibilidad de eliminar su cadena lateral con las acilasas de penicilina G o V convencionales. Únicamente se conoce la existencia de imitantes de A. chrysogenum capaces de acumular penicilina N, los cuales han sido utilizados para la caracterización de la ruta biosintética de cefalosporina. Por otro lado, se ha descrito la acumulación de DAOC junto con DAC y CPC en fermentaciones de A. Chrysogenum. En este caso, la DAOC es considerada como un contaminante indeseable que complica la producción industrial de CPC con un grado de pureza aceptable.
La utilización de la DAOC como compuesto intermedio útil en la producción de 7-ADCA no ha sido descrita hasta el momento debido a la imposibilidad de obtener DAOC como único producto de la fermentación de A. chrysogenum. En todos los casos se produce una mezcla de DAOC y DAC difíciles de separar posteriormente. Asimismo, la dificultad de eliminar hasta hace poco tiempo la cadena lateral de ácido aminoadípico de la molécula de DAOC utilizando procedimientos enzimáticos, hacían de la DAOC una molécula no apta para la fabricación industrial de 7-ADCA. Sin embargo, la construcción de la cepa A. chrysogenum ΔcefEF-cefE, posibilita una elevada producción de DAOC, siendo esta última la cefalosporina mayoritaria. La DAOC producida puede ser transformada a 7-ADCA mediante la utilización de las enzimas DAO y GLA por métodos equivalentes a los previamente descritos (Croux et al. 1994. US5354667; Cambiaghi et al. 1991. EP0496993; García et al. 1998. EP0843015).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1. Disrupción del gen cefEF en A. chrysogenum.
1.1. Construcción de pALC73, plásmido para la inactivación del gen cefEF de A. chrysogenum.
Con el fin de inactivar el gen cefEF de A. chrysogenum y obtener un muíante ΔcefEF que acumulara penicilina N se utilizó la técnica de dis- rupción génica por doble recombinación denominada "one step gene disruption" (Rothstein. 1983. Meth. Enzymol. 101 : 202-211). El resultado de esta técnica consiste en la obtención de un transformante disrupcionado estable, ya que no se generan copias directamente repetidas en la zona de recombinación. El método se basa en integrar un marcador de selección de transformantes en un sitio de restricción del gen de interés, de manera que se rompa el marco de lectura de dicho gen. El gen marcador debe poseer a ambos lados un fragmento de DNA homólogo a la secuencia diana de un tamaño suficiente como para permitir el sobrecruzamiento. Se ha descrito un tamaño mínimo de 500 pb para estas secuencias homologas (Rothstein, 1991 Meth. Enzymol. 194: 281-301).
En el presente ejemplo se integró el cassette de resistencia a higromi- cina, formado por el promotor del gen gpd (gliceraldehido-3-fosfato deshi- drogenasa) de A. Nidulans, el gen de resistencia a higromicina (hygR) y el terminador del gen trpC (triptófano C), en el sitio Xhol del gen cefEF (figura 1A-B). Para ello, en primer lugar se eliminó el sitio Xhol presente en pBC KS (+) mediante doble digestión Sall-Xhol y religación, originando el plásmido pBC* KS (+) el cual carece de los sitios de restricción Xhol y Salí. A continuación se insertó en pBC* KS (+) un fragmento BamHI de 7,2 kb que incluye los genes cefiEF y cefG de A. chrysogenum, dando lugar al plásmido pALC72 (figura 1A-B). Finalmente se insertó el fragmento BglII- Xbal del plásmido pAN7,l, el cual incluye el cassette de resistencia a higromicina y cuyos extremos fueron previamente convertidos en romos con Klenow, en el sitio Xhol interno al gen cefEF de pALC72, obtenién- dose el plásmido pALC73 (figura 1A-B). De esta forma el marcador de selección, se encuentra flanqueado por dos fragmentos de DNA de 2,2 kb y 5,0 kb homólogos a la región del genoma de A. chrysogenum que contiene los genes cefEF y cefG respectivamente. Los transformantes de A. chrysogenum con pALC73 se obtuvieron de acuerdo con procedimientos pre- viamente descritos (Queener et al. 1985. Lieve (ed.) Microbiology-1985. pp. 468-472. ASM. Washington) y se seleccionaron por resistencia a 5-10 μg/ml de higromicina. La cepa que incluye el plásmido pALC73, denominada E. coli TOP10/pALC73 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 5151.
1.2. Preselección de transformantes por pérdida de producción de cefalosporina.
Los transformantes seleccionados por resistencia a higromicina se crecieron en placas de medio sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162 : 163-171) mediante incubación durante 7 días a 28°C. A continuación se extrajeron dos cilindros o tacos de cada transformante con la ayuda de un sacabocados. Con la finalidad de determinar la producción de cefalosporina, uno de los tacos se bioensayó en una placa de medio LB a la que se añadió un cultivo de E. coli sensible a β-lactamas (E. coli ESS) y una preparación de penicilinasa tipo I (Sigma P-0389) a una concentración final de 0,1 mg ml. El otro taco se ensayó en una placa de medio LB con E. coli ESS pero sin añadir penicilinasa con el fin de determinar la presencia tanto de cefalosporina como de penicilina. Se seleccionaron aquellos transformantes que producían halo de inhibición en las placas sin penicilinasa y no originaron halo en las placas con penicilinasa, indicando que eran inca- paces de sintetizar cefalosporinas.
En la tabla siguiente se muestran los resultados obtenidos:
Transformante Resistencia a Halo sin Halo con
N° higromicina penicilinasa penicilinasa
(μg/ml) (mm) (mm)
2672* 5 12 0
2673* 10 16 0
2674 10 11 12
2675* 10 11 0
2676 5 15 12
2677 5 13 11
2678 5 14 11
2679 5 17 11
2680* 10 14 0
2681 5 17 12
2682 5 14 12
2683 10 14 12
2684 5 15 12
2685 5 16 12
2686 5 15 12
2687 5 18 12
2688 5 17 12
2689 5 16 12
2690 5 15 12
2691* 10 15 0
2692* 10 14 0
2693* 5 18 0
2694* 10 17 0
2695* 10 15 0
2696* 10 14 0
2697* 10 14 0
2698* 10 13 0
2699* 10 12 0
2700 10 12 12
Los transformantes 2672, 2673, 2675, 2680, 2691, 2692, 2693, 2694, 2695, 2696, 2697, 2698 y 2699 (señalados con un asterisco) poseían las características buscadas y se seleccionaron para posteriores ensayos.
1.3. Comprobación de la inactivación del gen cefEF mediante estudio de Southern. El gen cefEF de A. chrysogenum se localiza en un fragmento BamHI de DNA genómico de 7,2 kb. La doble recombinación homologa entre el plásmido pALC73 y los fragmentos adyacentes al gen cefEF debería provocar la modificación del patrón de restricción anteriormente citado, 5 pudiendo visualizarse dicho cambio mediante un análisis de Southern (figura 2). Para ello, se purificó DNA total de la cepa parental A. chrysogenum y de 3 de los transformantes seleccionados por bioensayo (2691, 2696 y 2698) tal y como se indica en el apartado anterior. El DNA total se digirió con las enzimas BamHI y Salí y tras su separación electroforética y i o transferencia a filtros de nitrocelulosa se híbrido utilizando como sonda un fragmento de DNA de 0,5 kb Salí interno al gen cefEF. El resultado obtenido (figura 2) muestra el cambio de patrón de restricción esperado: con la cepa parental A. chrysogenum se obtuvo una banda de hibridación de 7,2 kb BamHI, mientras que en los transformantes aparecieron dos bandas
15 de 5,7 kb y 5,3 kb respectivamente. Asimismo, los resultados con la enzima Salí confirmaron la inactivación del gen cefEF: una banda de hibridación de 0,5 kb en la cepa parental A. chrysogenum y una doble banda de 2,2 kb en los transformantes disrupcionados. Las cepas disrupcionadas en el gen cefEF obtenidas se denominaron A. chrysogenum ΔcefEF TI, A. chryso- o genum ΔcefEF T2 y A. chrysogenum ΔcefEF T3.
EJEMPLO 2. Producción de penicilina N por A. chrysogenum ΔcefEF.
2.1. Fermentación de A. chrysogenum y A. chrysogenum ΔcefEF.
Para la fermentación de la cepa parental A. chrysogenum y de las cepas portadoras del gen cefEF inactivado A. chrysogenum ΔcefEFTl, A. 5 chrysogenum ΔcefEFT2 y A. chrysogenum ΔcefEFT3, se sembraron slants de medio sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162 : 163- 171) y se incubaron durante 7 días a 28°C hasta obtener un cultivo esporu- lado. La fermentación en medio líquido se inició inoculando las esporas procedentes de un slant en un matraz de 250 mi que contenía 50 mi de medio 0 de inoculo complejo (Shen et al, 1986, Bio/Technology 4: 61-64). Este matraz se incubó durante 48 horas a 28°C y 250 rpm para obtener un micelio vegetativo abundante. La fermentación en condiciones de producción de antibióticos se inició al inocular 0,5 mi (3%) del cultivo vegetativo anterior en un matraz de 500 mi con 15 mi de medio de complejo de fermentación (Shen et al., 1986, Bio/Technology 4 : 61-64). Este cultivo se incubó durante 7 días a 25°C y 250 r.p.m., recogiéndose muestras de 1 mi cada 24 horas para el estudio de la producción de antibióticos a lo largo de la fermentación. Seguidamente se realizaron análisis con la finalidad de determinar: (I) que el antibiótico producido por los transformantes A. chrysogenum ΔcefEF era penicilina N, (II) el nivel de producción de penicilina N de estos transformantes y (III) la eventual presencia de otros antibióticos en el medio de fermentación. Los análisis realizados, tal y como se describe a continuación, fueron los siguientes: HPLC, expansión enzimática in vitro y LC masas.
2.2. Determinación de la producción de antibióticos por HPLC.
Las muestras de fermentación se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 g para eliminar el micelio y seguidamente, 50 μl del sobrenadante se diluyeron 10 veces con agua y se analizaron en un cromatógrafo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, autoinyector 717 y una columna Nucleosil C18-10 μm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda variable (214 para detectar penicilinas ó 254 nm para detectar cefalosporinas). La elución se realizó utilizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidrofiιrano (99,85: 0,1: 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. La asignación de los picos obtenidos a cada compuesto se realizó por comparación con patrones de CPC, DAC, DAOC y penicilina N analizados en las mismas condiciones.
El análisis de los resultados mostró que, tras 7 días de fermentación, las cepas transformantes A. chrysogenum ΔcefEF TI, A. chrysogenum ΔcefEF T2 y A. chrysogenum ΔcefEF T3 acumulaban una cantidad de penicilina N equivalente a la suma de las cantidades de CPC, DAC, DAOC y penicilina N producidas por la cepa parental. Por tanto, la inactivación del gen cefEF origina el bloqueo de la ruta de biosíntesis de cefalosporinas sin afectar a la cantidad total de β-lactamas producidas. En la siguiente tabla se muestran los porcentajes de cada tipo de antibiótico sobre el total de β- lactamas producido por las diferentes cepas:
Cepa CPC DAC DAOC PenN
A. chrysogenum 75,2 6,3 1,9 16,5
A. chrysogenum ΔcefEF TI 0,0 0,5 0,0 99,5
A. chrysogenum ΔcefEF T2 0,1 0,3 0,0 99,6
A. chrysogenum ΔcefEF T3 0,1 0,2 0,0 99,7
2.3. Bioconversión de penicilina N en cefalosporinas.
La expansión enzimática de penicilina N se realizó utilizando células en reposo ("resting cells") o extractos libres de células de Streptomyces clavuligerus NP1. Esta cepa prácticamente no produce cefamicina cuando se compara con la cepa parental (Mahro y Demain, 1987), lo cual facilita la determinación de las cefalosporinas y/o cefamicinas sintetizadas in vitro a partir de penicilina N.
2.3.1. Expansión enzimática utilizando células en reposo de S. clavuligerus
NP1.
El medio de inoculo MST (1% almidón soluble, 3% trypticase soy broth without dextrose, 90 mM MOPS; pH 7,0) se sembró con una suspensión de esporas de S. clavuligerus NP1 y se incubó a 200 r.p.m. y 28°C durante 48 horas. Como medio de fermentación también se utilizó MST, inoculando en este caso con un 5% del cultivo anterior e incubando a 200 r.p.m. y 28°C durante 24 horas. Una vez crecidos los cultivos, las células se recogieron por centrifugación (10.000 r.p.m. / 10 min. / 4°C) y se lavaron dos veces con agua desmineralizada. Por último, las células se resuspendieron en 40 mi de agua desmineralizada.
La mezcla de reacción (10 mi) para la expansión enzimática se preparó de acuerdo con procedimientos descritos (Shen et al. 1984. Enzyme Microbiol. Technol. 6: 402-404) utilizando la penicilina N producida por A. chrysogenum ΔcefEF TI como sustrato: MOPS 50 mM pH 6,5, FeS04 (heptahidratado) 1,8 mM, ácido α-cetoglutárico 2,56 mM, 8 mi de suspensión celular y penicilina N 0,2 mM. La reacción se incubó a 30°C y 200 r.p.m. durante 3 horas. A diferentes tiempos se tomaron muestras de 1 mi, las cuales se centrifugaron a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos. Los sobrenadantes obtenidos se analizaron por bioensayo y HPLC.
El bioensayo se realizó sobre placas de LB (2% agar) conteniendo E. coli ESS como microorganismo indicador y 50.000 Ul/ml de penicilinasa (Difco Bacto penase concéntrate, Difco Laboratories, Detroit, MI). En pocilios preparados con ayuda de un sacabocados se colocaron 200 μl de cada muestra y las placas se incubaron a 37°C durante 16 horas. Las muestras tomadas a tiempo cero no presentaron halos de inhibición del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incubadas durante 1 ó 3 horas dieron lugar a halos de inhibición de 17 y 21 mm respectivamente, indicando la presencia de productos de reacción (cefalosporinas) resistentes a penicilinasa.
El análisis de HPLC se realizó con un equipo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, autoinyector 717 y una columna Nucleosil C18-10 μm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras de las reacciones de expansión (50 μl) se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda variable (214 ó 254 nm). El análisis a 214 nm sirve para determinar la presencia de penicilinas y a 254 nm para detectar cefalosporinas. La elución se realizó utilizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidro- furano (99,85: 0,1 : 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. El análisis a 214 nm del caldo de fermentación utilizado como substrato reveló la existencia de un pico a los 10,1 minutos que coincide con el tiempo de retención obtenido para la penicilina N, mientras que a 254 nm no reveló la existencia de cefalosporinas. El análisis de las muestras de reacción a tiempo cero a 214 nm mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos (penicilina N), mientras que a 254 nm aparecieron tres picos con tiempos de retención muy cortos (1,8-4 min.) que no coincidían con los obtenidos para DAC (2,98 min.), cefamicina C (3,3 min.), DAOC (8,8 min.) y CPC (17 min.). Las muestras de 1-3 horas de reacción analizadas a 254 nm mostraron un pico nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC. Este resultado demuestra que el antibiótico producido por A. chrysogenum ΔcefEF TI es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por células en reposo de S. clavuligerus.
2.3.2. Expansión enzimática utilizando extractos libres de células de S. clavuligerus NP 1.
El medio de inoculo MST (1% almidón soluble, 3% trypticase soy broth without dextrose, 90 mM MOPS ; pH 7,0) se sembró con una suspensión de esporas de S. clavuligerus NP1 y se incubó a 200 r.p.m. y 28°C durante 48 horas. Las células se recogieron por centrifugación (10.000 r.p.mJIO minJ4°C), se lavaron dos veces con buffer E (15 mM Tris HCl pH 7,5, 10% etanol) y se resuspendieron en buffer E conteniendo DTT 10 mM y PMSF 2 mM. Las células se rompieron por sonicación utilizando un Labsonic 2000 (Braun Biotech) aplicando 3 pulsos de 25 segundos. La muestra se centrifugó a 20.000 r.p.m. y 4°C durante 20 minutos. El extracto resultante se dividió en alícuotas que se congelaron a -20°C y se analizó su contenido proteico por la técnica de Bradford.
La reacción para la expansión enzimática se llevó a cabo añadiendo
100-200 μl del extracto proteico a 0,5 mi de una mezcla de reacción que contenía: Tris HCl 50 mM pH 7,5, ácido ascórbico 4 mM, FeS04 (heptahidratado) 1,8 mM, ácido α-cetoglutárico 1,28 mM y penicilina N producida por A. chrysogenum ΔcefEF TI 0,2 mM. La reacción se incubó a 30°C y 200 r.p.m. durante 2 horas y se detuvo mediante la adición de 1 volumen de metanol y centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos. Los sobrenadantes obtenidos se analizaron tanto por bioensayo como por HPLC tal y como se indica en el apartado 2.3.1. Las muestras tomadas a tiempo cero no originaron halos de inhibición del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incubadas durante 2 horas dieron lugar a halos de inhibición, indicando la presencia de productos de reacción (cefalosporinas) resistentes a penicilinasa. Asimismo, el análisis por HPLC a 214 nm de las muestras de reacción a tiempo cero mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos (penicilina N), mientras que a 254 nm aparecieron tres picos con tiempos de retención muy cortos (1,8-4 min.) que no coincidieron con los obtenidos para DAC (2,98 min.), cefamicina C (3,3 min.), DAOC (8,8 min.) y CPC (17 min.). Las muestras de 1-3 horas de reacción analizadas a 254 nm mostraron un pico nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC (figura 3). Este resultado demuestra que el antibiótico producido por A. chrysogenum ΔcefEF TI es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por un extracto enzimático de S. clavuligerus.
2.3.3. Expansión enzimática utilizando extractos libres de células de E. coli
JM109 (DE3) pALE38.
Para la expresión del gen cefE de Nocardia lactamdurans en E. coli se construyó el plásmido pALE36 (figura 4A-B), el cual posee un fragmento de 400 pb BglII-Clal del plásmido pT7-7 (Tabor y Richardson, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci USA 82: 1074-1078) en pBC KS+. Este fragmento contiene una región de clonación múltiple situada aguas abajo del promotor del gen Φ10 del bacteriófago T7. pALE36 presenta la ventaja frente a pT7-7 de utilizar el gen CmR en lugar del gen ApR. Este último gen codifica para una actividad β-lactamasa que degradaría la penicilina N utilizada como sustrato. Seguidamente pALE36 se digirió Ndel-BamHI y se insertó un fragmento de 1,25 Kb Ndel-BglII que contenía el cefE de N. lactamdurans. Por último, se comprobó mediante secuenciación que la fusión entre el promotor y el gen cefE era correcta y con el plásmido obtenido, pALE38, se transformaron células competentes de E. coli/JM109(DE3), seleccionando 5 los clones transformantes por resistencia a cloranfenicol.
Con una colonia de E. coli JM109 (DE3) pALE38 se inoculó un matraz de 250 mi con 50 mi de medio LB al que se añadieron 30 μg/ml de cloranfenicol (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y el cultivo se incubó a 250 0 r.p.m. y 37°C durante 14 horas. Seguidamente se utilizaron 2 mi de este cultivo para sembrar un matraz de 250 mi con 50 mi de medio LB-cloran- fenicol y se incubó a 37°C y 250 r.p.m. hasta que alcanzó una D.O.660 de 0,4. En ese momento se añadió IPTG a una concentración final 1 mM y se incubó durante 6 horas más. El procesamiento de las células obtenidas, la 5 reacción de expansión enzimática y el análisis por bioensayo y HPLC de los productos de la reacción se realizaron tal y como se indica en el apartado 2.3.2.
Las muestras tomadas a tiempo de reacción cero no originaron halos de inhibición del crecimiento de E. coli ESS, mientras que aquellas incuba- o das durante 2 horas dieron lugar a halos de inhibición, indicando la presencia de productos de reacción resistentes a penicilinasa. El análisis de HPLC a 214 nm de las muestras de reacción a tiempo cero mostró la presencia de un pico a los 10,1 minutos que se correspondía con penicilina N. Las muestras incubadas durante 2 horas analizadas a 254 nm mostraron un pico 5 nuevo con respecto a los cromatogramas de las muestras a tiempo cero. Este pico eluyó a los 8,8 minutos, coincidiendo con el tiempo de retención obtenido para DAOC. Este resultado demuestra que el antibiótico producido por A. chrysogenum ΔcefEF es penicilina N, la cual es expandida a la DAOC por un extracto enzimático de E. coli JM109 (DE3) pALE38.
0 2.4. Determinación de penicilina N por LC masas. Las muestras de fermentación de la cepa de A. Chrysogenum ΔcefEF se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 x g con la finalidad de eliminar el micelio. Seguidamente se tomaron 50 μl del sobrenadante, los cuales se diluyeron 10 veces con agua y 25 μl de esta muestra se analizaron en un cromatógrafo Waters 2690 TAD (Waters Associates, Milford, MA) equipado con una columna Symmetry 300 C18 5μm (2.1 x 150 mm). La fase móvil utilizada fue tampón formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidrofiιrano (99,85:0,1 :0,05) con un flujo de 0,25 ml/min. El análisis del espectro de masas se realizó con un detector Waters ZMD utilizando los siguientes parámetros: rango de detección (996): 200 - 320 nm; potencial capilar: 3,50 Kvolts; potencial cono: 40 Volts. Sean 1; 70 Volts. Sean 2; interfase: ES+. El espectro obtenido para el pico que eluye a los 11 ,92 minutos coincide con el esperado para la penicilina N, presentando un pico molecular a 360 que se corresponde con el peso molecular de la penicilina N (figura 5A-B).
EJEMPLO 3. Expresión del gen cefE en A. chrysogenum ΔcefEF.
Con el fin de conseguir una cepa de A. chrysogenum que produjera DAOC por fermentación, se expresó el gen cefE, el cual codifica para la actividad DAOCS, en A. chrysogenum ΔcefEF. Los genes cefE clonados hasta el momento proceden de actinomicetos (S. clavuligerus, Nocardia lactamdurans y Lysobacter lactamgenus). Para su expresión en A. chrysogenum ΔcefEF, se diseñaron una serie de plásmidos en los que se dispusieron los genes cefE de S. clavuligerus y N. lactamdurans bajo el control de promotores de genes fúngicos. Se eligieron dos promotores: uno de ellos correspondiente a un gen con elevado nivel de expresión en condiciones de fermentación (gen pcbC, el cual codifica para IPNS en P. chrysogenum) y el otro perteneciente al gen gpdA de A. nidulans, el cual se expresa constitutivamente y codifica para la actividad gliceraldehido 3 -fosfato deshidro- genasa.
El conjunto formado por el promotor f ngico, el gen cefE y el ter- minador de la transcripción del gen trpC de Aspergillus niger se insertó en el plásmido pALfleo7 (Barredo et al. 1997. Patente española P9700482). Este plásmido de 5,4 kb posee el gen de resistencia a fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus flanqueado por el promotor del gen gdhA de P. chrysogenum y el terminador de la transcripción del gen trpC de Aspergillus niger.
3.1. Expresión en A. chrysogenum ΔcefEF del gen cefE de S. clavuligerus.
El gen cefE de S. clavuligerus se subclonó en el plásmido pBluescript I KS (+) (Stratagene) como un fragmento BamHI-Kpnl de 1,6 kb del genoma de S. clavuligerus que incluye el gen cefE completo y 582 pb del extremo 3' del gen cefD. Con la finalidad de expresar el gen cefE bajo el control de un promotor fungico, se creó un sitio de restricción Ncol en el extremo 5' de dicho gen mediante mutación dirigida utilizando el kit comercial QuikChange (Stratagene) y los oligonucleótidos que se describen en SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2. El proceso de mutación se realizó siguien- do las instrucciones del fabricante y se comprobó mediante secuenciación la creación del sitio de restricción Ncol y la ausencia de mutaciones adicionales. El plásmido resultante de este proceso se denominó pALC83 (figura 6A-B). pALC83 se digirió con Kpnl, se rellenaron sus extremos con Klenow, se digirió posteriormente con Ncol y por último se purificó el fragmento de DNA de 0,95 kb utilizando el kit QIAEX II (Qiagen). Seguidamente el fragmento de 0,95 kb se ligó con el plásmido pALpcbC (figura 6A-B) digerido con HindIII, rellenado con Klenow y digerido con Ncol. En el plásmido resultante se denominó pALC87 y contiene: (I) el gen cefE de S. clavuligerus expresado bajo el control del promotor del gen pcbC de Penicillium chrysogenum y (II) el terminador del gen trpC de A. nidulans aguas abajo del gen cefE. Por último, pALC87 se digirió con PvuII y el fragmento que contenía el gen cefE se ligó con pALfleo7 digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvo el plásmido pALC88, el cual es portador del inserto PpcbC-cefE-TtrpC (figura 6A-B). El gen cefE de S. clavuligerus también se expresó bajo el promotor del gen gpdA de A. nidulans. Para ello, el fragmento de 0,95 kb que contiene el gen cefE de S. clavuligerus utilizado en la construcción de pALC87, se ligó con el plásmido pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digerido con HindIII, rellenado con Klenow y digerido posteriormente con Ncol. En el plásmido resultante (pALC92; figura 7A-B) el gen cefE de S. clavuligerus se localiza bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. El cassette de expresión PgpdA-cefE-TtrpC obtenido por digestión de pALC92 con las enzimas EcoRI y Pvul y rellenado con Klenow se insertó en pALfleo7 digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvieron los plásmidos pALC93 y pALC94 (figura 7A-B), en los cuales el inserto PpcbC-cefE-TtrpC se encuentra en las dos posibles orientaciones.
3.2. Expresión en A. chrysogenum ΔcefEF del gen cefE de N. lactamdurans.
El gen cefE de N. lactamdurans se obtuvo por digestión de pALE38 (apartado 2.3.3) con Ndel, rellenado con Klenow y digestión con HindIII. De esta forma se purificó un fragmento de DNA de 1.250 pb que se ligó con el plásmido pALpcbC (figura 6A-B) previamente digerido con Ncol, eli- minados los extremos protuberantes con nucleasa Mung Bean y digerido con HindIIL En el plásmido resultante (pALC84) el gen cefE de N. lactamdurans se encuentra bajo el control del promotor del gen pcbC de Penicillium chrysogenum y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. La fusión entre el promotor y el gen cefE fue confirmada por secuenciación. pALC84 se digirió a continuación con la enzima PvuII y el fragmento generado se ligó con pALfleo7 previamente digerido con EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvieron los plásmidos pALC85 y pALC86 (figura 8A-B) en los cuales el inserto PpcbC-cefE-TtrpC se encuentra en las dos orientaciones posibles. La cepa que incluye el plásmido pALC85, denominada E. coli DH5α/pALC85 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con el n° 5150.
El gen cefE de N. lactamdurans también se expresó bajo el promotor del gen gpdA de A. nidulans. Para ello, el fragmento de DNA de 1.250 pb 5 que contiene el gen cefE de N. lactamdurans descrito anteriormente se ligó con el plásmido pTh (Uriach et al. 1995. EPA 0684312A2) digerido con Ncol, eliminados los extremos protuberantes con nucleasa Mung Bean y digerido posteriormente con HindIII. En el plásmido resultante (pALC89; figura 9A-B) el gen cefE de N. Lactamdurans se encuentra bajo el control o del promotor del gen gpdA de A. nidulans y seguido por el terminador del gen trpC de A. nidulans. La fusión entre el promotor y el gen ceflE fue confirmada por secuenciación. El cassette de expresión PgpdA-cefE-TtrpC obtenido por digestión de pALC89 con las enzimas EcoRI y Pvul y rellenado con Klenow se insertó en pALfleo7 previamente digerido con 5 EcoRV y desfosforilado. Como resultado de esta ligación se obtuvieron los plásmidos pALC90 y pALC91 (figura 9A-B) en los cuales el inserto se encuentra en las dos orientación posibles.
3.3. Transformación en la cepa A. chrysogenum ΔcefEF.
Tres cepas diferentes de A. chrysogenum ΔcefEF (TI, T2 y T3) se 0 transformaron con los plásmidos pALC85, pALC86, pALC88, pALC90, pALC91 , pALC93 y pALC94 de acuerdo con procedimientos previamente descritos (Queener et al. 1985. Lieve (ed.) Microbiology-1985. pp. 468-472. ASM. Washington). Los transformantes se seleccionaron primeramente por resistencia a 3 μg/ml de fleomicina y posteriormente se ensayó su resisten- 5 cia a concentraciones mayores, debido a que existen descripciones que indican que existe una correlación directa entre nivel de resistencia a fleomicina y número de copias del plásmido integradas en el genoma.
3.4. Selección de los transformantes con mayor producción de DAOC.
Los transformantes seleccionados se crecieron en placas de medio 0 sólido LPE (Le Page & Campbell, 1946, J. Biol. Chem. 162 : 163-171) mediante incubación durante 7 días a 28°C. A continuación, con la ayuda de un sacabocados, se extrajo un cilindro o taco de cada transformante, el cual se bioensayó en una placa de medio LB a la que se añadió un cultivo de E. coli sensible a β-lactamas (E. coli ESS) y una preparación de penicilinasa tipo I (Sigma) a una concentración final de 0,1 mg/ml. De esta forma se seleccionaron aquellos transformantes que producían los mayores halos de inhibición, indicando que eran capaces de sintetizar mayores cantidades de antibióticos resistentes a penicilinasa.
En la tabla siguiente se muestran los resultados obtenidos:
Transformante Cepa/plásmido Resistencia a Halo con
N° fleomicina penicilinasa
(μg/ml) (mm)
2800 Tl/pALC88 3 12
2801 T2/pALC88 6 15
2802 T3/pALC88 9 17
2803 Tl/pALC92 9 18
2804 T2/pALC92 9 18
2805 T3/pALC92 6 17
2806 Tl/pALC93 9 18
2807 T2/pALC93 9 20
2808 T3/pALC93 6 17
2809 Tl/pALC85 9 18
2810 T2/pALC85 9 18
2811 T3/pALC85 9 20
2812 Tl/pALC86 9 18
2810 T2/pALC86 9 18
2811 T3/pALC86 12 20
2812 Tl/pALC90 9 18
2813 T2/pALC90 9 18
2814 T3/pALC90 12 20
2815 Tl/pALC91 9 18
2816 T2/pALC91 9 18
2817 T3/pALC91 12 20 Para analizar la integración del gen cefE en el genoma de los transformantes, se purificó DNA total de la cepa parental A. chrysogenum, de las cepas A. chrysogenum ΔcefEF TI , A. chrysogenum ΔcefEF T2 y A. 5 chrysogenum ΔcefEF T3 y de los transformantes (A. chrysogenum ΔcefEF- cefE) seleccionados por bioensayo. El DNA total se digirió con las enzimas BamHI y Salí y, tras su separación mediante electroforesis y transferencia a filtros de nitrocelulosa, se híbrido utilizando una sonda de 0,6 kb HindlII- Kpnl correspondiente al gen cefE de N. lactamdurans (transformantes 2800 0 al 2808) o con una sonda de 0,5 kb Kpnl-Scal correspondiente al gen cefE de S. clavuligerus (transformantes 2809 al 2817). El resultado obtenido mostró el patrón de restricción esperado: la cepa parental A. chrysogenum y las cepas A. chrysogenum ΔcefEF TI, A. chrysogenum ΔcefEF T2 y A. chrysogenum ΔcefEF T3 no mostraron ninguna banda de hibridación, mien- 5 tras que en los transformantes denominados A. chrysogenum ΔcefEF-cefE aparecieron bandas de hibridación adicionales que indicaban la integración del gen cefE en el genoma de A. chrysogenum ΔcefEF.
EJEMPLO 4. Producción de DAOC por A. chrysogenum ΔcefF-cefE.
4.1. Fermentación de A. chrysogenum, A. chrysogenum ΔcefEF y A. o chrysogenum ΔcefEF-cefE.
La fermentación de las cepas de A. chrysogenum, A. chrysogenum ΔcefEF y A. chrysogenum ΔcefEF-cefE se realizó tal y como se indica en el apartado 2.1, determinándose (I) que el antibiótico producido por A. chryso- genum ΔcefEF-cefE era DAOC, (II) el nivel de producción de DAOC de 5 dichas cepas transformantes y (III) la eventual presencia de otros antibióticos en el medio de fermentación. Los análisis realizados, tal y como se describe a continuación, fueron HPLC y LC masas.
4.2. Determinación de la producción de antibióticos por HPLC. Las muestras de fermentación se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 g para eliminar el micelio y seguidamente 50 μl del sobrenadante se diluyeron 10 veces con agua y se analizaron en un cromatógrafo Waters TAD (Waters Associates, Milford, MA) con detector 486M1, bomba W600, 5 autoinyector 717 y una columna Nucleosil C18-10 μm (250x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA). Las muestras se analizaron con un flujo de 2,3 ml/min y una longitud de onda de 254 nm. La elución se realizó utilizando como fase móvil formiato amónico pH 3,3-metanol-tetrahidro- furano (99,85: 0,1: 0,05) en modo isocrático durante 30 minutos. La asig- o nación de los picos obtenidos a cada compuesto se realizó por comparación con patrones de CPC, DAC, DAOC y penicilina N analizados en las mismas condiciones.
El análisis de los resultados mostró que, tras 7 días de fermentación, las cepas transformantes A. chrysogenum ΔcefEF-cefE acumulaban DAOC. 5 En la siguiente tabla se muestran los porcentajes de cada tipo de antibiótico sobre el total de β-lactamas producido por las diferentes cepas:
Cepa CPC DAC DAOC PenN
A. chrysogenum 75,2 6,3 1,9 16,5
A. chrysogenum ΔcefEF TI 0,0 0,5 0,0 99,5
A. chrysogenum ΔcefEF-cefE 0,1 0,3 95,9 3,7
T3/pALC85
A. chrysogenum ΔcefEF-cefE 0,1 0,7 93,3 5,9
T3/pALC86
A. chrysogenum ΔcefEF-cefE 0,1 0,9 96,7 2,3
T3/pALC87 4.3. Purificación de la DAOC producida por A. chrysogenum ΔcefEF-cefE.
Un total de 10 litros del caldo de fermentación de A. chrysogenum ΔcefEF-cefE conteniendo 20 g/1 de DAOC se ajustó a pH 3,0 con H2S04 concentrado y se filtró a través de un filtro Büchner con vacío y con la ayu- da de una tierra de diatomeas como coadyuvante de filtración. La biomasa filtrada se lava con 10 litros de agua desmineralizada con el fin de agotar toda la DAOC de la biomasa, obteniéndose un volumen de caldo filtrado de 16,4 litros. El caldo filtrado se pasó a través de una columna (1 m x 16 cm) de resina poliestirénica XAD4 (Rohm & Haas) empaquetada con 10 litros de resina a un caudal de 150 ml/min. La columna se lavó con aproximadamente 10 litros de agua y se eluyó con una solución de acetato sódico 0,15 M. La fracciones eluídas se analizaron por HPLC para examinar el contenido en DAOC. Seguidamente se reunieron aquellas fracciones ricas en DAOC, obteniéndose un volumen de eluato de 23,5 litros. El eluato se ajustó a pH 5,5 y se sometió a una decoloración y purificación por percolación a través de una columna empaquetada con resina de intercambio amónico IRA68 (Rohm & Haas). La solución decolorada se sometió a un proceso de concentración mediante osmosis reversa hasta alcanzar una concentración superior a 200 g/1 de DAOC. Seguidamente, 1,1 litros del concentrado de osmosis reversa se precipitaron con agitación mediante la lenta adición de 4 litros de alcohol isopropílico. Tras 2 horas de precipitación, se filtró a través de una placa de vidrio poroso y el precipitado obtenido se lavó con aproximadamente 1 litro de alcohol isopropílico. El precipitado se secó en una estufa de vacío a 50°C obteniéndose 147,3 g de DAOC sal sódica con una pureza del 92 %.
EJEMPLO 5. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA.
5.1. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA catalizada por DAO inmovilizada. Para realizar la bioconversión de la DAOC obtenida tal y como se describe en el ejemplo 4, se disolvieron 66 g de DAOC sal sódica en 2 litros de buffer fosfato potásico 25 mM conteniendo 0,5 g de metabisulfito sódico. La solución de DAOC se dispuso en un reactor de 3 litros conteniendo 150 g de DAO inmovilizada en Eupergit C (Rohm) según métodos descritos (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993). La mezcla se incubó a 25°C con ligera agitación y borboteo de oxígeno (1 vol./volJmin.) a través de un difusor localizado en el fondo del reactor. El pH se mantuvo a 7,5 por adición automática de hidróxido amónico al 5 %. En 75 minutos la DAOC se transformó completamente obteniéndose una mezcla de glutaril-7-ADCA (90 %) y del cetoadipil-7-ADCA (10 %).
Para transformar el cetoadipil-7-ADCA residual a glutaril-7-ADCA, la solución obtenida después de la incubación se separó por filtración del enzima inmovilizada y se añadieron 10 mi de peróxido de hidrogeno (H202) a una concentración del 3,5 % por cada litro de filtrado. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 25°C, después de lo cual se añadieron 0,5 g de piruvato sódico. Tras dicho tratamiento el cetoadipil-7-ADCA es completamente transformado en glutaril-7-ADCA, obteniéndose una solución de glutaril-7-ADCA al 3 %. Dicha solución se concentró por osmosis a 4°C hasta una concentración del 5 % para ser utilizada en la siguiente etapa enzimática.
5.2. Bioconversión de DAOC en glutaril-7-ADCA catalizada por células enteras de Rhodotorula gracilis.
Un total de 100 litros de caldo de fermentación de A. chrysogenum ΔcefEF-cefE conteniendo 35 g/1 de DAOC se ajustaron a pH 7,5 y, en el mismo fermentador, se le añadieron 5 Kg de concentrado de células de Rhodotorula gracilis ATCC 26217 correspondientes a 500.000 unidades de DAO según métodos previamente descritos (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993). La reacción de bioconversión transcurrió a 25°C bajo ligera agita- ción mientras se añadió oxigeno a 1 vol./volJmin. a través del difusor sitúa- do en el fondo del fermentador. El pH se mantuvo a pH 7,5 por adición automática de amoniaco al 5% y al cabo de 90-120 minutos se completó la transformación de DAOC en glutaril-7-ADCA.
Seguidamente se separaron los sólidos de la fermentación, contenien- do principalmente células de A. Chrysogenum y de Rhodotorula gracilis junto a cantidades variables de material insoluble del medio de fermentación, mediante la utilización de un sistema de ultrafiltración a través de membranas con un corte molecular de 30.000 Da. Una vez finalizada la ultrafiltración y con el fin de transformar el cetoadipil-7-ADCA residual a glutaril-7-ADCA, se añadieron con agitación 5 mi de peróxido de hidrógeno (H202) a una concentración del 3,5 % por cada litro de filtrado. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 25°C, tras lo cual se añadieron 50 g de piruvato sódico. Después de dicho tratamiento todo el cetoadipil-7- ADCA fue transformado en glutaril-7-ADCA, obteniéndose una solución con una riqueza en glutaril-7-ADCA del 1 %. Dicha solución se concentró por osmosis reversa hasta una concentración aproximada del 5 % en glutaril-7-ADCA.
5.3. Extracción de glutaril-7-ADCA
A 1 litro de la solución de glutaril-7-ADCA se le añadió 1 litro de acetato de isobutilo, se agitó fuertemente y se enfrió entre 0 y 5°C. Seguidamente se añadió H2S04 2 N con agitación hasta que la solución alcanzó un pH de 1,5 y rápidamente se separaron las fases. Esta operación se repitió de nuevo con 1 litro de acetato de isobutilo fresco manteniendo al temperatura entre 0 y 5°C hasta agotar la fase acuosa de glutaril-7-ADCA. Ambos extractos de acetato de isobutilo rico se juntaron y se extrajeron con 0,75 litros de buffer fosfato 25 mM a pH 8,0. La solución se ajustó a pH 8,0 mediante adición de KOH 2 N y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó con 0,25 litros de buffer fosfato 25 mM a pH 8,0 con el fin de agotarla exhaustivamente de glutaril-7-ADCA. Los extractos acuosos obtenidos conteniendo 50 g/1 de glutaril-7-ADCA se reunieron y fueron utilizados directamente para la siguiente conversión enzimática o bien fueron sometidos a un proceso de destilación a vacío para eliminar los restos de solvente orgánico y así aumentar la vida del catalizador en la siguiente conversión enzimática.
EJEMPLO 6. Bioconversión de glutaril-7-ADCA en 7-ADCA.
6.1. Transformación de glutaril-7-ADCA en 7-ADCA catalizada por glutaril acilasa inmovilizada.
Un total de 150 mi de solución de glutaril-7-ADCA conteniendo 7,5 g de glutaril- 7 -ADCA se incubaron a 25°C en presencia de 30 g de glutaril acilasa inmovilizada en Eupergit C (31 U/g húmedo). La mezcla de reacción se incubó con agitación durante 60 minutos, manteniendo el pH a 8,0 mediante adición automática de solución amoniacal al 5%. Al cabo de dicho tiempo la transformación de glutaril-7-ADCA en 7ADCA resultó ser superior al 98%. El biocatalizador se separó de la solución por filtración, laván- dose a continuación con 25 mi de agua y reutilizándose durante un mínimo de 100 ciclos para nuevas bioconversiones (Cambiaghi et al. 1991. EP 496993).
6.2. Recuperación de 7-ADCA.
Un total de 175 mi de solución de conversión de glutaril-7-ADCA en
7-ADCA fue tratada con 3 g de carbón activo durante 20 minutos a temperatura ambiente y con agitación con la finalidad de eliminar impurezas y reducir el color del producto final. El carbón fue eliminado por filtración y lavado con 10 mi de agua. La solución filtrada se ajustó a pH 4,5 mediante la adición de H2S04 6 N, de forma que se iniciara la cristalización del 7-ADCA, y se incubó durante 15 minutos con agitación lenta para que la cristalización progresara. La temperatura se disminuyó hasta 5-10°C, ajustándose finalmente el pH a 3,8 por adición de H2S04 6 N. Tras 2 horas de incubación, el precipitado se recuperó por filtración y se lavó con 25 mi de agua. El rendimiento de cristalización fue del 95.5 %, obteniéndose un 7-ADCA con una pureza del 98,3 %.
6.3. Purificación y cristalización de 7-ADCA.
A un total de 875 mi de solución de 7- ADCA se le añadieron 125 mi de diclorometano, se disminuyó la temperatura hasta 0-5°C y se ajustó el pH a 0,8 rápidamente con agitación mediante la adición de H2S04 6 N. Una vez alcanzado el pH de 0,8, las fases se separaron por decantación o centrifugación, lavándose la fase acuosa con otros 125 mi de diclorometano. Esta operación tiene como objetivo la eliminación de sustancias hidrofóbi- cas y de carácter ácido, las cuales son extraídas por el diclorometano en estas condiciones, permitiendo alcanzar una mayor pureza del producto final. La fase acuosa así obtenida se trató con 3 g de carbón activo durante 20 minutos con agitación para eliminar impurezas y reducir el color del producto final. El carbón fue eliminado por filtración y lavado con 10 mi de agua. La solución filtrada se ajustó a pH 3,0 por adición de solución amoniacal 2N de forma que se iniciara la cristalización del 7-ADCA. Seguidamente se incubó durante 15 minutos con agitación lenta hasta que la cristalización progresara, ajustándose finalmente el pH a 3,7 por adición de NH4OH 2N y a una temperatura entre 5-10°C. Después de 2 horas el precipitado se recuperó por filtración y se lavó con 25 mi de agua. El rendimiento de cristalización fue del 94 %, obteniéndose un 7-ADCA con una pureza del 98,5 %.
EJEMPLO 7. Producción de 7- ADCA por A. chrysogenum ΔcefEF-cefE- dao-gla y A. chrysogenum ΔcefEF-cefE-cac. Tomando como base una descripción previa, es posible la construcción de un operón biosintético para la producción de 7-ACA directamente por fermentación de A. chrysogenum (Isogai et al. 1991 Biotechnology 9: 188-91). El sistema descrito se basa en la expresión en A. chrysogenum de los genes (cDNAs) que codifican para las actividades enzimáticas DAO y GLA de Fusarium solani y Pseudomonas diminuta respectivamente. Aplicando esta misma idea a la cepa A. chrysogenum ΔcefEF-cefE, es posible la construcción de un operón biosintético para la producción de 7- ADCA directamente por fermentación de A. chrysogenum ΔcefEF-cefE- dao-gla. En este caso, debido a la imposibilidad de A. chrysogenum ΔcefEF-cefE para producir CPC, tiene lugar la biosíntesis de 7-ADCA en lugar de 7-ACA. El 7-ADCA producido por fermentación de A. chryso- genum ΔcefEF-cefE-dao-gla puede ser purificado tal y como se indica en el ejemplo 6.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A-B.- Esquema de la construcción de pALC73, plásmido para la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum. En primer lugar el plásmido pExp7,2 BB, el cual incluye los genes cefEF y cefG de A. chrysogenum se subclonó en el sitio BamHI del plásmido pBC KS (+) al que previamente se le había inactivado el sitio Xhol. El plásmido resultante se denominó pALC72. Seguidamente se insertó el gen de resistencia a higromicina (hygR) en el sitio Xhol del gen cefEF dando lugar a pALC73. Este plásmido de 14,6 kb incluye el gen de resistencia a cloranfenicol (CmR) como marcador de selección en E. coli y el gen de resistencia a higromicina (hygR) como marcador selectivo en A. chrysogenum. El gen hygR está expresado bajo el control del promotor gpd (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) y posee el terminador trpC (triptófano C).
Figura 2.- Esquema de la disrupción del gen cefEF de A. chrysogenum. El plásmido pALC73 se integra por doble recombinación en uno de los cromosomas de A. chrysogenum inactivando el gen cefEF. En la parte inferior de la figura se muestra el análisis de Southern de los clones de A. chrysogenum disrupcionados en el gen cefEF. La banda de hibridación obtenida mediante digestión BamHI del DNA de la cepa parental se convierte en dos bandas de 5,7 kb y 5,3 kb en las cepas transformantes con el gen cefEF inactivado. Del mismo modo, la banda de hibridación de 0,5 kb Salí de la cepa parental se convierte en otra banda de 2,2 kb en los transformantes disrupcionados en el gen cefEF. Los transformantes disrupcionados se denominan A. chrysogenum ΔcefEF TI, A. chrysogenum ΔcefEF T2 y A. chrysogenum Δce EF T3. P se corresponde con la cepa parental A. chrysogenum, mientras que TI, T2 y T3 son transformantes de A. chrysogenum con el gen cefEF inactivado.
Figura 3.- Expansión enzimática de penicilina N a DAOC utilizando extractos enzimáticos libres de células de S. clavuligerus NP1. En el panel superior se muestra un cromatograma de la mezcla de reacción a tiempo 0 y en el inferior la misma mezcla tras 2 horas de reacción. Abcisas: tiempo en minutos; Ordenadas: Densidad Óptica (D.O.)
Figura 4A-B.- Esquema de la construcción de pALE38, plásmido para la expresión del gen cefE de Nocardia lactamdurans en E. coli bajo el control de promotor T7.
Figura 5A-B.- Análisis por LC masas de la penicilina N producida por A. chrysogenum ΔcefEF TI. En el panel superior se muestra un cromatograma a 214 nm y en el inferior el espectro de masas correspondiente al pico que eluye a los 11,92 minutos.
Figura 6A-B.- Esquema de la construcción de pALC88, plásmido para la expresión del gen cefE de S. clavuligerus en A. chrysogenum bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.
Figura 7A-B.- Esquema de la construcción de pALC93 y pALC94, plásmidos para la expresión del gen cefE de S. clavuligerus en A. chrysogenum bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.
Figura 8A-B.- Esquema de la construcción de pALC85 y pALC86, plás- midos para la expresión del gen cefE de N. lactamdurans en A. chryso- genum bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.
Figura 9A-B.- Esquema de la construcción de pALC90 y pALC91, plásmidos para la expresión del gen cefE de N. lactamdurans en A. chrysogenum bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la producción de ácido 7-aminodesacetoxi- cefalosporánico (7-ADCA) caracterizado por comprender las siguientes
5 operaciones: a) Inactivar en una cepa de A. chrysogenum productora de cefalosporina C la actividad enzimática desacetoxicefalosporina C sintasa / desacetil- cefalosporina C sintasa (DAOCS/DACS) codificada por el gen cefEF, mediante la disrupción de dicho gen, construyendo una cepa productora 0 de penicilina N. b) Expresar en dicha cepa productora de penicilina N, el gen cefE, el cual codifica para la actividad enzimática desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS), construyendo una cepa productora de desacetoxicefalosporina C (DAOC). 5 c) Crecer la cepa productora de DAOC en condiciones de producción de DAOC y purificar la DAOC producida. d) Bioconvertir la DAOC producida en glutaril-7-ADCA mediante la utilización de la enzima D-aminoácido oxidasa (DAO). e) Bioconvertir el glutaril-7-ADCA en 7-ADCA mediante la utilización de 0 la enzima glutaril acilasa (GLA). f) Purificar el 7-ADCA producido en la bioconversión.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas d) y e) se llevan a cabo mediante la expresión, en una cepa de A. chrysogenum en la que previamente se ha inactivado el gen cefEF y 5 expresado el gen cefE, de los genes dao y gla, los cuales codifican para las actividades enzimáticas D-aminoácido oxidasa (DAO) y glutaril acilasa (GLA) respectivamente, dando lugar a una cepa productora de 7-ADCA y crecer dicha cepa en condiciones de producción de 7-ADCA.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque o las etapas d) y e) se llevan a cabo mediante la expresión, en una cepa de A. chrysogenum en la que previamente se han inactivado el gen cefEF y expresado el gen cefE, el gen cae, el cual codifica para la actividad enzimática cefalosporina acilasa (CAC), dando lugar a una cepa productora de 7- ADCA y crecer dicha cepa en condiciones de producción de 7-ADCA.
4. Un procedimiento para la producción de penicilina N, caracteri- zado por interrumpir cualquiera de las operaciones descritas en las reivindicaciones 1 a 3, una vez concluida la etapa a).
5. Un compuesto de ADN, definido por el mapa de restricción de pALC73 que incluye el gen cefEF inactivado por el gen de resistencia a higromicina (hygR).
6. Vectores que portan los compuestos de ADN descritos en la reivindicación 5 o fragmentos de los mismos.
7. Vectores de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizados por consistir en un plásmido.
8. Plásmido de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por consistir en pALC73.
9. Microorganismos hospedantes transformados caracterizados por poseer disrupcionado el gen cefEF mediante la introducción de compuestos de ADN de la reivindicación 5, incluidos total o parcialmente en los vectores de las reivindicaciones 6 a 8.
10. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 9, caracterizado por consistir en un procariota, preferentemente E. coli o un actinomiceto.
1 1. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 10, caracterizado por consistir en cepas puras de E. coli representadas por CECT5151 o sus mutantes o derivados transformados.
12. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 9, caracterizado por consistir en un eucariota, preferentemente del género Acremonium o Penicillium.
13. Microorganismo hospedante transformado según la reivindi- cación 12, caracterizado por consistir preferentemente en Acremonium chrysogenum o Penicillium chrysogenum.
14. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 13, caracterizado por consistir en cepas puras de Acremonium chrysogenum o sus mutantes y derivados transformados.
15. Procedimiento para la obtención de microorganismos transfor- mados con producción mejorada de penicilina N caracterizado por comprender las siguientes operaciones: a) Construir vectores que porten, total o parcialmente, el compuesto de ADN descrito en la reivindicación 5 o compuestos de ADN recombinante del mismo. b) Introducir los vectores anteriores en A. chrysogenum mactivando la función del gen cefEF. c) Seleccionar los microorganismos transformados que presentan incrementada la producción de penicilina N cuando se comparan con microorganismos controles sin transformar.
16. Procedimiento para la obtención de microorganismos transformados según la reivindicación 15, caracterizado porque los vectores construidos son los definidos en las reivindicaciones 6 a 8.
17. Procedimiento según la reivindicación 16 en que los microorganismos hospedantes transformados son los definidos en las reivindicaciones 9 a 14.
18. Un procedimiento para la producción de desacetoxicefalosporina C (DAOC) caracterizado por interrumpir cualquiera de los procedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 3, una vez concluida la etapa c).
19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC88, el cual incluye el gen cefE de S. clavuligerus expresado bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.
20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC85, el cual incluye el gen cefE de N. lactamdurans expresado bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum.
21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC86, el cual incluye el gen cefE de N. lactamdurans expresado bajo el control del promotor del gen pcbC de P. chrysogenum. 5
22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC93, el cual incluye el gen cefE de S. clavuligerus expresado bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.
23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual 0 en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC94, el cual incluye el gen cefE de S. clavuligerus expresado bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.
24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de 5 restricción de pALC90, el cual incluye el gen cefE de N. lactamdurans expresado bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.
25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual en la etapa b) se utiliza un compuesto de ADN definido por el mapa de restricción de pALC91, el cual incluye el gen cefE de N. lactamdurans o expresado bajo el control del promotor del gen gpdA de A. nidulans.
26. Vectores que portan los compuestos de ADN descritos en las reivindicaciones 19 a 25 o fragmentos de los mismos.
27. Vectores de acuerdo con la reivindicación 26 caracterizados por consistir en un plásmido. 5
28. Plásmidos de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizados por consistir en pALC85, pALC86, pALC88, pALC90, ρALC91 , pALC93 o pALC94.
29. Microorganismos hospedantes transformados caracterizados por poseer disrupcionado el gen cefEF y producir penicilina N, en los cuales se 0 ha expresado el gen cefE mediante la introducción de los compuestos de
ADN de las reivindicaciones 19 a 25, incluidos total o parcialmente en los vectores de las reivindicaciones 26 a 28.
30. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 29, caracterizado por consistir en un procariota, preferentemente E. coli o un actinomiceto.
31. Microorganismo hospedante transformado según la reivindica- ción 30, caracterizado por consistir en cepas puras de E. coli representadas por CECT5150 o sus mutantes o derivados transformados.
32. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 29, caracterizado por consistir en un eucariota, preferentemente del género Acremonium o Penicillium.
33. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 32, caracterizado por consistir preferentemente en Acremonium chrysogenum o Penicillium chrysogenum.
34. Microorganismo hospedante transformado según la reivindicación 33, caracterizado por consistir en cepas puras de Acremonium chrysogenum o sus mutantes y derivados transformados.
35. Procedimiento para la obtención de microorganismos transformados con producción mejorada de desacetoxicefalosporina C (DAOC) caracterizado por comprender las siguientes operaciones: a) Construir vectores que porten, total o parcialmente, los compuestos de ADN descritos en las reivindicaciones 19 a 25 o compuestos de ADN recombinante de los mismos. b) Introducir dichos vectores en una cepa de A. chrysogenum cuyo gen cefEF ha sido inactivado. c) Seleccionar los microorganismos transformados que presentan incre- mentada la producción de desacetoxicefalosporina C (DAOC) cuando se comparan con organismos controles sin transformar.
36. Procedimiento para la obtención de microorganismos transformados según la reivindicación 35, caracterizado porque los vectores construidos son los definidos en las reivindicaciones 26 a 28.
37. Procedimiento según la reivindicación 36 en que los microorganismos transformados son los definidos en las reivindicaciones 29 a 34.
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