WO2000049041A1 - Protein preparations - Google Patents

Abstract

A fused protein which is capable of inducing a potent cellular immune response and thus useful in treating or preventing infectious diseases such as malaria or diseases such as cancer; and medicinal compositions containing this fused protein as the active ingredient. Namely, a fused protein composed of a peptide containing a CTL epitope recognized by cytotoxic T cells and a protein containing the ATPase domain of heat shock protein; medicinal compositions containing this fused protein as the active ingredient; a DNA encoding the fused protein; an expression vector containing this DNA; and a transformant carrying this expression vector. The most efficacious way for administering the medicinal compositions is intravenous injection into a living body.

Description

明 細 書  Specification

蛋白質製剤 技術分野  Protein preparation technology

本発明は、 強力な細胞性免疫応答の誘導能を有し、 ワクチンや治療剤として使 用可能な融合蛋白質、 該融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物、 該融合蛋 白質をコードする D N A、該融合蛋白質をコードする D N Aを含む発現べクタ一、 並びに該発現ベクターを保持する形質転換体に関する。 背景技術  The present invention relates to a fusion protein which has a strong ability to induce a cellular immune response and can be used as a vaccine or a therapeutic agent, a pharmaceutical composition containing the fusion protein as an active ingredient, a DNA encoding the fusion protein, The present invention relates to an expression vector containing a DNA encoding the fusion protein, and a transformant carrying the expression vector. Background art

脊椎動物においては、 リンパ球が関与する免疫応答は細胞性免疫応答と液性免 疫応答の二つに大別される。  In vertebrates, immune responses involving lymphocytes can be broadly divided into cellular immune responses and humoral immune responses.

ウィルスや癌抗原などの内在性抗原は、 細胞性免疫応答により排除される。 細 胞性免疫応答においては、以下の経路で、内在性抗原を有する細胞が破壊される。 まず、 内在性抗原がプロテアソ―ムによって分解され、 抗原ペプチドになる。 こ の抗原ペプチドが、 小胞体内に汲み込まれ、 M H Cクラス I分子と会合した後、 細胞表面に輸送され、 細胞傷害性 T細胞 （C T L ) ェピト一プ （以降 C T Lェピ トープという） として細胞表面に提示される。 こうして C T Lェビトープが細胞 表面に提示されると、 その細胞を攻撃する C T Lが誘導される。 そして、 該 C T Lが前記 C T Lェピトープを表面に提示した細胞を攻撃し、 該細胞を破壊する。 一方、 原虫、 細菌、 可溶性抗原などの外来性抗原は、 液性免疫応答により排除 される。 液性免疫応答においては、 外来性抗原に対する抗体が産生され、 該抗体 が前記抗原を捕捉する。 そして、 最終的に補体系やマクロファージの異物処理作 用を介して前記抗原が排除される。  Endogenous antigens such as virus and cancer antigens are eliminated by the cellular immune response. In the cellular immune response, cells having endogenous antigens are destroyed by the following route. First, endogenous antigens are degraded by proteasomes to become antigenic peptides. This antigenic peptide is pumped into the endoplasmic reticulum, associates with MHC class I molecules, is transported to the cell surface, and becomes a cytotoxic T cell (CTL) epitope (hereinafter referred to as CTL epitope). Presented on the surface. When the CTL ebitope is displayed on the cell surface, the CTL that attacks the cell is induced. Then, the CTL attacks cells that present the CTL epitope on the surface, and destroys the cells. On the other hand, foreign antigens such as protozoa, bacteria, and soluble antigens are eliminated by the humoral immune response. In a humoral immune response, antibodies to foreign antigens are produced, which capture the antigens. Finally, the antigen is eliminated through the complement system and the action of foreign substances on macrophages.

通常、 原虫や細菌といった外来性抗原に分類される病原体の感染による疾患の 予防のために使用されるワクチンは、 液性免疫応答によって該病原体の排除を行 うように作用する。 このとき、 細胞性免疫応答によっても病原体の排除がなされ れば、 該疾患をより完全に予防することができる。 例えば、 マラリアの場合、 抗 体によるマラリァ原虫の排除能力には限界があると考えられ、 細胞性免疫応答を 介してマラリア原虫を排除することによって、 より有効なマラリアの予防または 治療が達成できると考えられる。 Usually, vaccines used for the prevention of diseases caused by infection with a pathogen classified as a foreign antigen such as protozoa or bacteria act to eliminate the pathogen by a humoral immune response. At this time, the pathogen is eliminated by the cellular immune response. Then, the disease can be more completely prevented. For example, in the case of malaria, the ability of the antibody to eliminate malaria parasites is considered to be limited, and eliminating malaria parasites through a cellular immune response can achieve more effective malaria prevention or treatment. Conceivable.

さらに、 外来性抗原に対する抗体がうまく産生されない場合は、 細胞性免疫応 答によって病原体を排除することが必要である。  In addition, if antibodies to foreign antigens are not successfully produced, it may be necessary to eliminate the pathogen by a cellular immune response.

一方、 癌を治療する目的で、 癌の CTLェピトープを投与することが試みられ ている。 投与された CTLェピトープが細胞の表面に提示されれば、 癌を攻撃す る CTLが誘導され、 該 CTLが癌細胞を破壊する。 しかしながら、 投与された CTLェピト一プは外来性抗原であるので、 そのままでは CTLを誘導しない。 このように、 外来性抗原が内在性抗原の提示経路に入ることは、 疾患の予防や 治療の上で意義深い。  On the other hand, attempts have been made to administer cancer CTL epitopes for the purpose of treating cancer. When the administered CTL epitope is displayed on the cell surface, CTLs that attack cancer are induced, and the CTLs destroy cancer cells. However, since the administered CTL epitope is a foreign antigen, it does not induce CTL as it is. Thus, the entry of exogenous antigens into the endogenous antigen presentation pathway is significant in preventing and treating diseases.

外来性抗原である抗原分子が内在性抗原の提示経路に入るようにするには、 各 種アジュバントまたはリボソームなどに該抗原分子を封入することが必要である と考えられている。  In order for an antigen molecule, which is a foreign antigen, to enter the endogenous antigen presentation pathway, it is considered necessary to encapsulate the antigen molecule in various adjuvants or ribosomes.

ストレス蛋白質は天然に存在するアジュバント様分子としての作用があること が指摘されている。 そして、 ス トレス蛋白質を外来性の抗原分子の担体分子とし て使用するストレス蛋白質と抗原分子との複合体は、 癌または感染症に対するヮ クチン効果を有することが認められている （J.Exp. Med., 178:1391、 Science 278:117および J. Exp. Med.187:685)。 さらに外来性の抗原分子が内在性抗原の提 示経路に入ることも示されている （ Pro Natl. Acad. Sci, USA 91:3077 および Science 269:1585)。  It has been pointed out that stress proteins act as naturally occurring adjuvant-like molecules. A complex of a stress protein and an antigen molecule, which uses the stress protein as a carrier molecule for an exogenous antigen molecule, has been confirmed to have an effect on cancer or infectious disease (J. Exp. Med., 178: 1391, Science 278: 117 and J. Exp. Med. 187: 685). In addition, foreign antigen molecules have been shown to enter the presentation pathway for endogenous antigens (Pro Natl. Acad. Sci, USA 91: 3077 and Science 269: 1585).

本発明者らは、アジュバントとしてヒートショック蛋白質 Hsp70を使用し、 プラスモディウムベルゲイ （Plasmodium berghei、 本明細書中以下においては P.berghei と表記する） のサ一力ムスポロゾィ ト （以降、 CSと表記する） 蛋白 質由来の CTLェピトープとヒートショック蛋白質 H sp70とを in vi t r oで混在させることにより、 H s p 70と前記 CT Lェピト一プとを会合させ、 H s p 70—ぺプチド複合体を生成させた。 この H s p 70一べプチド複合体を マウスに投与した結果、 弱いながらも投与した CTLぺプチドに特異的な CTL の誘導が観察された。 しかし、 ここで誘導された細胞性免疫は非常に弱いもので あり、実際の臨床上の治療に利用するには不十分であり、実用化に至っていない。 また、 Suzue らにより、 マイコバクテリゥム由来の Hsp 70に卵白アルブミ ン （OVA) の断片を融合した融合蛋白質 （Hs p70— OVA) をマウスに投 与すると OVA特異的な C T Lが誘導されることが明らかにされている (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 94:13146-13151)。 The present inventors have used the heat shock protein Hsp70 as an adjuvant, and have been shown to use the heat shock protein Hsp70 (Plasmodium berghei, hereinafter referred to as P. berghei) to produce a muscorozoite (hereinafter referred to as CS). Notation) By mixing the protein-derived CTL peptide and the heat shock protein Hsp70 in vitro, Hsp70 is associated with the CTL peptide, The Hsp70-peptide complex was generated. When the Hsp70-one peptide complex was administered to mice, induction of CTLs specific to the administered CTL peptide, although weak, was observed. However, the cell-mediated immunity induced here is very weak, is not enough for practical clinical treatment, and has not been put to practical use. In addition, Suzue et al. Showed that when a fusion protein (Hsp70-OVA) obtained by fusing a fragment of ovalbumin (OVA) with mycobacterial Hsp70 was administered to mice, OVA-specific CTLs were induced. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13146-13151).

Suzue らの手法は、 抗原分子として OVAを使用したものであるが、 この手法 は OVA以外の蛋白質全てに適用することができるわけではない。 融合蛋白質を 作製するには、 該融合蛋白質をコ一ドする DNAを大腸菌等の宿主に導入して、 形質転換体を作製し、 該形質転換体に該融合蛋白質を発現させることが一般的に 行われるが、 抗原分子とする蛋白質の種類によっては融合蛋白質を宿主に発現さ せることが難しいことがある。 例えば、 P.berghei の CS蛋白質を H s p 70に 融合させた融合蛋白質は大腸菌では発現させることができないが、 これは大腸菌 とヒトとではコドン使用が相違しているためであると考えられる。 また、 蛋白質 の種類によっては、 得られた融合蛋白質が不溶化するという問題がある。 発明の開示  The method of Suzue et al. Uses OVA as an antigen molecule, but this method cannot be applied to all proteins other than OVA. In order to prepare a fusion protein, it is general to introduce a DNA encoding the fusion protein into a host such as Escherichia coli, prepare a transformant, and express the fusion protein in the transformant. However, depending on the type of protein used as the antigen molecule, it may be difficult to express the fusion protein in the host. For example, a fusion protein obtained by fusing the P. berghei CS protein to Hsp70 cannot be expressed in Escherichia coli, which is probably due to the difference in codon usage between Escherichia coli and humans. In addition, there is a problem that the obtained fusion protein is insolubilized depending on the type of the protein. Disclosure of the invention

本発明は、 強力な細胞性免疫応答の誘導能を有し、 マラリア等の感染症または 癌等の疾患を治療または予防するのに有用な融合蛋白質、 該融合蛋白質を有効成 分として含む医薬組成物、 該融合蛋白質をコードする DNA、 該融合蛋白質をコ 一ドする DNAを含む発現ベクター、 該発現ベクターを保持する形質転換体を提 供することを課題とする。  The present invention relates to a fusion protein which has a strong ability to induce a cellular immune response and is useful for treating or preventing an infectious disease such as malaria or a disease such as cancer, and a pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient. A DNA encoding the fusion protein; an expression vector containing a DNA encoding the fusion protein; and a transformant carrying the expression vector.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 抗原分子として C TLェピト一プを含み、 アジュバントとしてヒートショック蛋白質の ATP a s eドメインを含む融合蛋白質を構築し、 これを生体に投与することにより、 CT Lェピトープ （抗原分子） に対する CTLが誘導されることを見出し、 本発明を 完成するに至った。 The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, constructed a fusion protein containing CTL epitope as an antigen molecule and an ATPase domain of a heat shock protein as an adjuvant, and administered this to a living body. By doing CT The present inventors have found that CTL against L-epitope (antigen molecule) is induced, and have completed the present invention.

即ち、 本発明によれば、 細胞傷害性 T細胞が認識する CTLェピ卜一プを含む ぺプチド及びヒートショック蛋白質の ATP a s eドメインを含む蛋白質とから 成る融合蛋白質が提供される。  That is, according to the present invention, there is provided a fusion protein comprising a peptide containing a CTL peptide recognized by a cytotoxic T cell and a protein containing an ATPase domain of a heat shock protein.

好ましくは、ヒートショック蛋白質は、 Hsp 70蛋白質もしくは Hsp70. 1蛋白質または H s c 70蛋白質である。 さらに好ましくは、 ヒートショック蛋 白質の ATPaseドメインを含む蛋白質は以下の （1) から （5) に記載の蛋 白質から選択される何れかの蛋白質である。  Preferably, the heat shock protein is an Hsp70 protein or an Hsp70.1 protein or an Hsc70 protein. More preferably, the protein containing the ATPase domain of the heat shock protein is any protein selected from the following proteins (1) to (5).

( 1 )配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (1) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,

( 2 ) 配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列の 1番目の Metから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (2) a protein comprising an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,

( 3 )配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列の 1番目の Metから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (3) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,

(4)配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (4) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,

( 5 )配列表の配列番号 5に記載のァミノ酸配列の 1番目の Metから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質。  (5) A protein comprising an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

本発明の一つの好ましい態様では、 細胞傷害性 T細胞が認識する C T Lェピト 一プはマラリァ原虫が発現している C T Lェピトープであり、さらに好ましくは、 細胞傷害性 T細胞が認識する C T Lェピ卜ープを含むぺプチドは、 配列表の配列 番号 6から配列番号 10のいずれかに記載のァミノ酸配列を有する。  In one preferred embodiment of the present invention, the CTL epitope recognized by cytotoxic T cells is a CTL epitope expressed by malaria parasite, and more preferably, a CTL epitope recognized by cytotoxic T cells. The peptide containing the hoop has the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.

本発明の別の好ましい態様では、 細胞傷害性 T細胞が認識する CTLェピトー プは腫瘍における C T Lェピトープであり、 さらに好ましくは細胞傷害性 T細胞 が認識する CTLェビト一プを含むペプチドは、 配列表の配列番号 1 1から配列 番号 61のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する。 本発明の別の側面によれば、 有効成分として本発明の融合蛋白質を含む医薬組 成物が提供される。 本発明の医薬組成物は、 マラリア等の感染症や癌などの疾患 の治療および/または予防のために使用することができる。 従って、 本発明の別 の側面によれば、 薬学的又は免疫学的に有効量の本発明の融合蛋白質をヒトを含 む哺乳動物に投与することを含む、 マラリア等の感染症又は癌等の疾患の治療お よび/または予防のための方法、 並びにマラリア等の感染症又は癌等の疾患の治 療および/または予防のための医薬の製造における、 本発明の融合蛋白質の使用 が提供される。 In another preferred embodiment of the present invention, the CTL epitope recognized by the cytotoxic T cell is a CTL epitope in a tumor, and more preferably, the peptide containing the CTL epitope recognized by the cytotoxic T cell is represented by the following sequence listing: Has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 61. According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient. The pharmaceutical composition of the present invention can be used for treating and / or preventing infectious diseases such as malaria and diseases such as cancer. Therefore, according to another aspect of the present invention, the method comprises administering a pharmaceutically or immunologically effective amount of the fusion protein of the present invention to mammals, including humans, for infectious diseases such as malaria or cancer. A method for treating and / or preventing a disease, and use of the fusion protein of the present invention in the manufacture of a medicament for treating and / or preventing an infectious disease such as malaria or a disease such as cancer are provided. .

本発明のさらに別の側面によれば、 本発明の融合蛋白質をコードする DNA、 本発明の融合蛋白質をコードする DNAを含む発現ベクター、 並びに該発現べク ターを保持する形質転換体が提供される。 図面の簡単な説明  According to still another aspect of the present invention, there are provided a DNA encoding the fusion protein of the present invention, an expression vector containing the DNA encoding the fusion protein of the present invention, and a transformant carrying the expression vector. You. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

図 1は、 N i— NT Aァガロースカラムで精製した H s c 70融合蛋白質を電 気泳動した結果を示す写真である。  FIG. 1 is a photograph showing the results of electrophoresis of an Hsc70 fusion protein purified by a Ni—NT A agarose column.

図 2は、 ATPァガロースカラムで精製した H s c 70融合蛋白質を電気泳動 した結果を示す写真である。  FIG. 2 is a photograph showing the result of electrophoresis of an H sc 70 fusion protein purified on an ATP agarose column.

図 3は、 H s c 70融合蛋白質のマラリアに対する CT L誘導活性を調べた結 果を示す図である。  FIG. 3 shows the results of examining the CTL-inducing activity of the Hsc70 fusion protein against malaria.

図 4は、 Hs c 70ATPaseドメイン一 P YE蛋白質および H s c 70ぺ プチド結合ドメイン— PYE蛋白質それぞれの CTL誘導活性を調べた結果を示 す図である。  FIG. 4 shows the results of examining the CTL-inducing activity of each of the Hsc70ATPase domain-PYE protein and the Hsc70 ぺ peptide binding domain—PYE protein.

図 5は、 Hs c 70融合蛋白質の腫瘍に対する CTL誘導活性を調べた結果を 示す図である。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 5 shows the results of examining the CTL-inducing activity of the Hsc70 fusion protein on tumors. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

本発明は、 抗原分子として CTLェピトープ、 アジュバントとしてヒートショ ック蛋白質の ATP as eドメインを含む蛋白質を使用し、 それらを融合させた 融合蛋白質を提供する。 該融合蛋白質を生体に投与することにより、 CTLェピ トープ （抗原分子） に対する CTLが誘導される。 そして、 誘導された CTLが 疾患の原因となっている細胞を破壊する。 こうして、 前記融合蛋白質を有効成分 として含む医薬組成物は癌や感染症といった疾患の治療または予防に使用できる <： また、 本発明は、 前記融合蛋白質をコードする DNA、 前記融合蛋白質を製造 するための発現ベクター、 すなわち前記融合蛋白質をコードする DNAが導入さ れた発現べクタ一を提供する。 前記発現べクタ一を大腸菌等の適当な宿主に組み 込んで形質転換体を作製し、 該形質転換体に前記融合蛋白質を発現させる。 The present invention relates to CTL epitope as an antigen molecule and heat shock as an adjuvant. A fusion protein is provided by using a protein containing the ATP ase domain of a fusion protein and fusing them. By administering the fusion protein to a living body, CTL against CTL epitope (antigen molecule) is induced. The induced CTL then destroys the disease-causing cells. Thus, a pharmaceutical composition containing the fusion protein as an active ingredient can be used for treatment or prevention of diseases such as cancer and infectious disease. <> Also, the present invention provides a DNA encoding the fusion protein and a method for producing the fusion protein. And an expression vector into which the DNA encoding the fusion protein has been introduced. A transformant is prepared by incorporating the expression vector into an appropriate host such as Escherichia coli, and the transformant is allowed to express the fusion protein.

また、 本発明の前記医薬組成物を使用するには、 該医薬組成物を生体に静脈内 注射することが最も有効である。  In order to use the pharmaceutical composition of the present invention, it is most effective to inject the pharmaceutical composition intravenously into a living body.

以下、 本発明の融合蛋白質について詳細に説明する。  Hereinafter, the fusion protein of the present invention will be described in detail.

本発明の融合蛋白質は、 抗原分子部分とアジュバント部分からなる。  The fusion protein of the present invention comprises an antigen molecule part and an adjuvant part.

抗原分子部分は、 予防または治療しょうとする疾患で発現している C T Lェピ ト一プからなる。 抗原分子として使用する CTLェピトープは、 大きすぎると、 該ペプチドを含む融合蛋白質を形質転換体に発現させることができなくなったり、 融合蛋白質が不溶となったりして使用できない。 抗原分子として使用するべプチ ドには、 30以下のアミノ酸からなるペプチドが好ましい。 20以下のアミノ酸 からなるペプチドがより好ましく、 15以下のアミノ酸からなるべプチドはさら に好ましい。  The antigenic molecule portion consists of a CTL peptide expressed in the disease to be prevented or treated. If the CTL epitope used as an antigen molecule is too large, the fusion protein containing the peptide cannot be expressed in a transformant, or the fusion protein becomes insoluble and cannot be used. As peptides used as antigen molecules, peptides consisting of 30 or less amino acids are preferable. Peptides consisting of 20 or less amino acids are more preferred, and peptides consisting of 15 or less amino acids are even more preferred.

一方、 C T Lェピトープとしては、 8以上のアミノ酸からなることが必要であ る。  On the other hand, the CTL epitope must be composed of eight or more amino acids.

C T Lェピトープのァミノ酸配列は、 すでにいくつも同定されている。  Several amino acid sequences have been identified for the CTLP epitope.

例えば、 肝細胞期のマラリア原虫 （スポロゾィ 卜と呼ばれる） が発現している For example, hepatocellular malaria parasites (called sporozoites) are expressed

C T Lェピトープのァミノ酸配列を以下に例示する。 An example of the amino acid sequence of the CTLP epitope is shown below.

S e r T y r Val Pro S e r Ala Glu Gin l ie S e r T y r Val Pro S e r Ala Glu Gin lie

(配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列）。これは、 プラスモディゥムョエリ ィ （P. y o e 1 i i) の C S蛋白質の 281番目から 289番目のアミノ酸配 列である。 CS蛋白質はマラリアの原因となる蛋白質である。 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing). This is a plus mod It is the amino acid sequence from position 281 to position 289 of CS protein of P. yoe 1 ii. CS protein is a protein that causes malaria.

L y s P r o L y s As G 1 u Leu As p T y r (配列表 の配列番号 7に記載のァミノ酸配列） または  LysProLysAsG1u LeuAspTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing) or

L y s S e r L y s Asp G 1 u Leu Asp T y r (配列表 の配列番号 8に記載のアミノ酸配列）。この二つは、プラスモディゥムフアルシパ ルム （P. f a l c iparum) の C S蛋白質の 368番目から 375番目の アミノ酸配列である。  LysSerLysAspG1uLeuAspTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 in Sequence Listing). These two are the amino acid sequences from 368 to 375 of the CS protein of P. falciparum.

Lys P r o A s n Asp L y s S e r Leu T y r (配列表 の配列番号 9に記載のァミノ酸配列）。  LysProAsnAspLysSerleLeuTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing).

Lys Pr o l i e V a 1 Gi n T y r Asp A s n P h e (配列表の配列番号 10に記載のアミノ酸配列）。  LysProlieVa1GinTyrAspAsnPhe (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 in Sequence Listing).

腫瘍における CTLェピトープとしては、 以下のアミノ酸配列からなるものが 知られている。  As the CTL epitope in tumors, those having the following amino acid sequences are known.

1. 腫瘍，精巣特異抗原  1. Tumor and testis specific antigen

MAGE— 1遺伝子由来の G lu Al a Asp Pr o Thr G 1 y H i s S e r Ty r (配列表の配列番号 1 1に記載のァミノ酸配列） または S e r Al a Tyr G 1 G 1 u Pro P r o Lys Leu (配列表の配列番号 12に記載のァミノ酸配列）。  GluAlaAspProThrG1yHisSerTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 in Sequence Listing) derived from MAGE-1 gene or SerAlaTyrG1G1uPro Pro Lys Leu (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing).

MAGE— 3遺伝子由来の G 1 u V a 1 Asp P r o l i e G 1 y H i s Leu Tyr (配列表の配列番号 13に記載のァミノ酸配列）、 P h e L eu T r p G 1 P r o A r g Al a L eu V a 1 (配列表の配列番号 14に記載のァミノ酸配列） または  G1uVa1 AspProlie G1yHisLeuTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 in Sequence Listing) derived from MAGE-3 gene, PheLeuTrpG1ProArg Al aLeuVa1 (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) or

Me t G 1 u Va l As P r o l i e G 1 H i s L eu Tyr (配列表の配列番号 15に記載のアミノ酸配列）。  MetG1uValAsProlieG1HisLeuTyr (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15 in Sequence Listing).

B AGE遺伝子由来の A 1 a Al a Ar g Al a Va l P h e L eu Al a Leu (配列表の配列番号 16に記載のァミノ酸配列）。 GAGE— 1または GAGE— 2遺伝子由来の Tyr Ar g Pr o Ar g Pr o Ar Ar g T y r (配列表の配列番号 17に記載のアミノ酸 配列）。 A1aAlaArgAlaValPheLeuAlaLeu derived from the BAGE gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing). TyrArgProArgProArArgyTyr derived from GAGE-1 or GAGE-2 gene (amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in Sequence Listing).

2. メラノサイ ト分化抗原  2. Melanosite differentiation antigen

チロシナ一ゼ遺伝子由来の Me t Leu Leu Al a V a 1 Leu Ty r C i s Leu (配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列）、 T y r Me t A s n G 1 y Thr Me t S e r G i n V a 1 (配列表の配列番号 19に記載のァミノ酸配列）、  Me t Leu Leu Al a Va 1 Leu Ty r C is Leu (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing) derived from the tyrosinase gene, T yr Me t A sn G 1 y Thr Me t SerG in Va1 (an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing),

T y r Me t As p G 1 y Thr Me t S e r G i n V a 1 T y r Me t As p G 1 y Thr Me t S e r G in V a 1

(配列表の配列番号 20に記載のァミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing),

Al a Phe L eu P r o T r p H i s Ar g L eu P h e (配列表の配列番号 21に記載のァミノ酸配列）、  Al a PheLeuProTrpHisArgLeuPhe (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 21 in Sequence Listing),

S e r G 1 u l i e T r p Ar g As p As p l i e As p S e r G 1 u l i e T r p Ar g As p As p l i e As p

Phe (配列表の配列番号 22に記載のァミノ酸配列）、 Phe (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing),

G i n Asn l i e L eu L eu S e r A s n A l a P r o Leu G 1 Pr o G i n Pro Pr o (配列表の配列番号 23に記 載のアミノ酸配列） または  G In Asn l i e L e L eu L eu S er A s n A l a P Ro Leu G 1 Pro Gin Pro Pro (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23 in Sequence Listing)

As T y r S e r T y r L eu G i n As p S e r As Pro As p Se r Phe G in A s p (配列表の配列番号 24に記 載のアミノ酸配列）。  AsTyrSerTyrReuGinAspSerAsProSepSerPheGinAsp (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 in Sequence Listing).

Me 1 an— A/MART— 1遺伝子由来の A 1 a A l a G 1 y l i e G 1 y l i e Leu Thr Va 1 (配列表の配列番号 25に記載のアミ ノ酸配列)、  Me 1 an—A / MART—A1 a Ala G 1 ylie G1 ylie Leu Thr Va 1 derived from the 1 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing),

l i e L eu Thr V a 1 l i e L eu G 1 y V a 1 L eu l i e L eu Thr V a 1 l i e L eu G 1 y V a 1 L eu

(配列表の配列番号 26に記載のアミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing),

G 1 l i e L e u Thr V a 1 l i e L eu G 1 V a 1 Leu (配列表の配列番号 27に記載のアミノ酸配列） または A l a L eu Me t As L s y S e r L e u H i s V a 1 (配列表の配列番号 28に記載のアミノ酸配列）。 G1lieLeu ThrVa1lieLeuG1Va1Leu (amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing) or AlaLeuMetAsLsySerLeuHisVa1 (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 28 in Sequence Listing).

gp 100/pme 1 17遺伝子由来の L e u L eu Asp G l y T hr Al a Thr Leu Ar g Thr (配列表の配列番号 29に記載 のアミノ酸配列）、  LeuLeueuspGlyThrAla Thr LeuArg Thr derived from gp100 / pme117 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 29 in Sequence Listing),

T y r L eu G 1 u P r o G l P r o Va l Thr A l a T yr L eu G 1 uProGlProVal ThrAla

(配列表の配列番号 30に記載のァミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing),

L s y Thr T r p G l y G i n T y r T r p G i n Va l L s y Thr T r p G l y G i n T y r T r p G i n Val

(配列表の配列番号 31に記載のアミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing),

l i e Thr As p G i n Va l P r o P h e S e r Va ll i e Thr As p G in n Va l P ro p P e S e r Va l

(配列表の配列番号 32に記載のァミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing),

Va l L eu T y r A r g T y r G l S e r P h e S e r Va l (配列表の配列番号 33に記載のアミノ酸配列）、  Va l Le eu T y r A r g T y r G l S e r P He e S e r V a l (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 33 in Sequence Listing),

Me t L eu G l y Thr H i s Thr Me t G 1 u Va l Me t L eu G l y Thr Hiis Thr Me t G 1 u Va l

(配列表の配列番号 34に記載のァミノ酸配列）、 (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing),

Al a Me t L eu G l y Thr H i s Th r Me t G 1 u Al a Me t L eu G ly Thr Hiis Thr Me t G 1 u

Va l (配列表の配列番号 35に記載のァミノ酸配列）、 Val (an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing),

S e r L eu A l a As p Thr A s n S e r L eu Al a Va l (配列表の配列番号 36に記載のアミノ酸配列）、  SerLeuAlaAsp ThrAsnSerLeuAlaVal (the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 in the sequence listing),

Al a L e u L eu A l a Va l G l y A l a Thr L s y Al a Le u L eu A la Va l G l y A l a Thr L s y

(配列表の配列番号 37に記載のアミノ酸配列） または (Amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 in the sequence listing) or

Va l T y r P h e P h e L e P r o As p H i s L eu (配列表の配列番号 38に記載のァミノ酸配列）。  ValTyrPhePHeLeLeProAsPHisLeu (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 in Sequence Listing).

gp 75/TRP— 1遺伝子由来の Me t S e r L eu Gin Ar g G i n Phe L eu Ar g (配列表の配列番号 39に記載のアミノ酸配 列）。  MetSerLeuGinArgGinPheLeuArg derived from gp75 / TRP-1 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 39 in Sequence Listing).

TRP— 2遺伝子由来の L eu L eu G l y P r o G l y A r g Pro Ty r Ar g (配列表の配列番号 40に記載のアミノ酸配列）。 Leu Leu GlyProGlyArg derived from TRP-2 gene Pro Ty r Ar g (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 in Sequence Listing).

3. 突然変異/過剰発現/ウィルス/ムチン遺伝子由来抗原 3. Mutation / overexpression / virus / mucin gene-derived antigen

CDK 4遺伝子由来の A 1 a C i s As Pr o H i s S e r G 1 y H i s Phe V a 1 (配列表の配列番号 41に記載のアミノ酸配列）。  A1aCisAsProHiSSeRG1yHisPheVa1 derived from CDK4 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 41 in Sequence Listing).

MUM— 1遺伝子由来の G 1 u G 1 u L s y L eu l i e V a 1 Va 1 Leu Phe (配列表の配列番号 42に記載のアミノ酸配列）。 MUM-1 G1uG1uLsyLeulieVa1Va1LuPhe derived from the gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 42 in Sequence Listing).

5—カテニン遺伝子由来の S e r T y r Leu As S e r G 1 l i e H i s Phe (配列表の配列番号 43に記載のァミノ酸配列）。  5-SerTyrLeuAsSerG1lieHisPhe derived from the catenin gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 43 in Sequence Listing).

HER 2/n e u遺伝子由来の L s y l i e Phe G 1 y S e r L eu Al a Phe L eu (配列表の配列番号 44に記載のァミノ酸配列）、 l i e l i e S e r A l a V a 1 V a 1 G l y l i e L e u (配列表の配列番号 45に記載のアミノ酸配列）、  L sylie Phe G 1 y Ser L eu Al a Phe Le eu derived from the HER 2 / neu gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 44 in the sequence listing), lielie Ser A la Va 1 V a 1 G lylie L eu (amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 in the sequence listing),

H i s L eu As p Me t L eu A r g H i s L eu T y r G in G l y C i s G in Va 1 Va 1 (配列表の配列番号 46に記 載のアミノ酸配列） または  HisLeuAspMetLeuArgHisLeuTyrGinGlyCysGinVa1Va1 (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 46 in Sequence Listing) or

S e r A r g L eu L eu G l y l i e C i s L eu T h r S e r Th r Va 1 G in Leu L eu (配列表の配列番号 47に記 載のアミノ酸配列）。  SeArgLeuLeuGlyleCiSLeuThr SerrThrVa1G in LeuLeu (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 47 in Sequence Listing).

GnT— V遺伝子由来の Va 1 L eu P r o As p Va 1 Phe l i e Ar g C i s Va 1 (配列表の配列番号 48に記載のアミノ酸配列） _c GnT—V1 VauLeuProAspVa1PhelieArgCisVa1 derived from the V gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 48 in Sequence Listing) _c

PR AME遺伝子由来の L e u T y r V a 1 As S e r L eu Phe Phe Leu (配列表の配列番号 49に記載のァミノ酸配列）。LeuTyrVa1AsSerLeuPhePheLeu derived from the PR AME gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 49 in the sequence listing).

15遺伝子由来の01；1 Al a T y r Gl y L eu Asp P h e Ty r l i e Leu (配列表の配列番号 50に記載のァミノ酸配列）。  01; 1 Al aTyrGlyLeuAspPheTyrlyeLeu derived from 15 genes (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 50 in Sequence Listing).

HPV 16 E 7遺伝子由来の Ty r Me t Leu Asp Leu G 1 n Pr o G 1 u Thr Thr (配列表の配列番号 5 1に記載のァミノ酸 配列）、 L eu L eu Me t G 1 y T h r L eu G 1 y l i e V a 1TyrMet Leu Asp Leu G1nProG1u Thr Thr derived from HPV 16E7 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 in Sequence Listing), L eu L eu Me t G 1 y T hr L eu G 1 ylie V a 1

(配列表の配列番号 52に記載のァミノ酸配列） または (Amino acid sequence described in SEQ ID NO: 52 in Sequence Listing) or

Thr L eu G 1 y l i e Va 1 C i s P r o l i e (配列表の 配列番号 53に記載のァミノ酸配列）。  ThrLeuG1ylieVa1CisProlie (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 53 in Sequence Listing).

MUC— 1遺伝子由来の S e r Thr Al a P r o P r o A l a Al a H i s Gl y V a 1 (配列表の配列番号 54に記載のアミノ酸配列） _c 上記の他にも以下のァミノ酸配列からなる CTLェピトープが知られている。 p 53 (野生種） 遺伝子由来の A 1 a L eu As n L s y Me t P he C i s Gin Leu (配列表の配列番号 55に記載のァミノ酸配列）。 p 53 (変異腫） 遺伝子由来の A 1 a Leu As n L s y Me t P he Ty r Gin Leu (配列表の配列番号 56に記載のァミノ酸配列）。 インフルエンザ MP遺伝子由来の G 1 y l i e Le u G l P h e Va 1 Phe Thr L e u (配列表の配列番号 57に記載のァミノ酸配列） _c Ser Thr Al Pro Pro Pro A la Al AHisGly Va1 derived from MUC-1 gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 54 in Sequence Listing) _{c In} addition to the above, the following amino acid sequence A CTL epitope consisting of is known. A1aLeuAsnLsymetPheCisGinLeu derived from the p53 (wild type) gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 55 in the sequence listing). A1a Leu Asn Lsy Me t P He Tyr Gin Leu derived from p53 (mutant tumor) gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 56 in Sequence Listing). G 1 ylie Le u G l P he Va 1 Phe Thr Le eu derived from influenza MP gene (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 57 in Sequence Listing) _c

E BNA 3 C遺伝子由来の G 1 u G 1 u A s n Leu Leu Asp Phe Va 1 Ar g Phe (配列表の配列番号 58に記載のァミノ酸配列） _c マウス白血病由来の細胞 RLc?" 1の a k t遺伝子由来の I 1 e P r o G 1 y Leu P r o Leu S e r L eu (配列表の配列番号 59に記載の ァミノ酸配列）。 これが実施例で使用した PRL l aのァミノ酸配列である。 E BNA 3 C gene-derived G 1 u G 1 u A sn Leu Leu Asp Phe Va 1 Ar g Phe (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 58 in the Sequence Listing) _c Cell derived from mouse leukemia RLc? "1 akt Gene-derived I 1 e Pro G 1 y Leu Pro Leu Ser Leu (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 59 in Sequence Listing) This is the amino acid sequence of PRL la used in the Examples.

マウス白血病由来の IAP gag蛋白質の Arg Ar g L s y G l y L s y T y r Thr G l y L eu (配列表の配列番号 60に記載のアミ ノ酸配列）。  Arg ArgLsyGlyLsyTyrThrGlyLeu of the IAP gag protein derived from mouse leukemia (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 60 in the sequence listing).

マウス UV肉腫由来のリボソーム蛋白質 L 9の Va 1 G 1 u L eu S e r H i s Leu G l y Ls y L s y Ls y L s Arg L e u Ar g Va 1 Asp (配列表の配列番号 61に記載のアミノ酸配列）。 本発明の融合蛋白質においてアジュバントとして使用するヒ一トショック蛋白 質の種類は特に限定されないが、好ましくは H s c 70または H s p 70である。 H s c 70は通常発現されている蛋白質であり、 Hs p 70はヒートショック時 に誘導される蛋白質である。 Hsp 70. 1は Hsp 70のァイソフォームであ る。 Va1G1uLeuSerHisLeuGlyLsyLsyLsyLsArgLeuArgVa1Asp of mouse UV sarcoma-derived ribosomal protein L9 (SEQ ID NO: 61 in the sequence listing). Amino acid sequence). The type of the heat shock protein used as an adjuvant in the fusion protein of the present invention is not particularly limited, but is preferably Hsc70 or Hsp70. Hsc70 is a normally expressed protein, Hsp70 is heat shocked Is a protein induced by Hsp70.1 is an isoform of Hsp70.

マウス H s c 70蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に記載する。 マウス H s p 70.1蛋白質のァミノ酸配列を配列表の配列番号 2に記載する。 ヒト Hs c 70蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 3に記載する。  The amino acid sequence of mouse H sc 70 protein is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The amino acid sequence of the mouse Hsp70.1 protein is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The amino acid sequence of the human Hsc70 protein is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

ヒト H s p 70. 1蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 4に記載する。 ヒト H s p 70蛋白質のァミノ酸配列を配列表の配列番号 5に記載する。  The amino acid sequence of the human Hsp70. 1 protein is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The amino acid sequence of the human Hsp70 protein is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

アジュバントとして使用するのは、 全長の H s c 70または全長の H s p 70 もしくは Hsp 70. 1に限られず、 それそれの ATP a s e ドメインを含む部 分であれば、 アジュバントとして使用可能である。 他のヒートショック蛋白質に ついても同様である。  The adjuvant used is not limited to full-length Hsc70 or full-length Hsp70 or Hsp70.1, but any part containing the ATPase domain can be used as an adjuvant. The same applies to other heat shock proteins.

マウス Hs c 70蛋白質の一部分であって、 配列表の配列番号 1に記載のアミ ノ酸配列の 1番目の Me tから 385番目の S e rまでの部分は、 アジュバント として好ましい。 この部分がマウス Hs c 70蛋白質の ATPas eドメインで ある。  A portion of the mouse Hsc70 protein, from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is preferable as an adjuvant. This is the ATPase domain of the mouse Hsc70 protein.

マウス Hsp 70. 1蛋白質の一部分であって、 配列表の配列番号 2に記載の アミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番目の S e rまでの部分は、 アジュバ ンドとして好ましい。 この部分がマウス H s p 70. 1蛋白質の ATPas eド メインである。  A part of the mouse Hsp70. 1 protein, from the first Met to the 385th Ser in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, is preferable as an adjuvant. This is the ATPase domain of the mouse Hsp70. 1 protein.

ヒト Hs c 70蛋白質の一部分であって、 配列表の配列番号 3に記載のァミノ 酸配列の 1番目の Me tから 385番目の S e rまでの部分は、 アジュバントと して好ましい。この部分がヒト H s c 70蛋白質の ATP a s e ドメインである。 ヒト Hs p 70. 1蛋白質の一部分であって、 配列表の配列番号 4に記載のァ ミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番目の S e rまでの部分は、 アジュバン 卜として好ましい。 この部分がヒト H s p 7◦ . 1蛋白質の ATP a s eドメイ ンである。  A part of the human Hsc70 protein, from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, is preferable as an adjuvant. This is the ATPase domain of the human Hsc70 protein. A part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, which is a part of the human Hsp70. 1 protein, from the first Met to the 385th Ser is preferable as an adjuvant. This is the ATPase domain of the human Hsp7◦.1 protein.

ヒト Hsp 70蛋白質の一部分であって、 配列表の配列番号 4に記載のァミノ 酸配列の 1番目の M e tから 3 8 5番目の S e rまでの部分は、 アジュバン卜と して好ましい。この部分がヒト H s p 7 0蛋白質の A T P a s e ドメインである。 抗原分子はアジュバントの N末端または C末端のいずれに融合させてもよい。 本発明の融合蛋白質 （マラリアの C T Lェピトープと H s c 7 0との融合蛋白 質または白血病の C T Lェピト一プと H s c 7 0との融合蛋白質） が i n v i t r oで C T Lを誘導することを後述の実施例で示す。 前記融合蛋白質が i n v i v oで C T Lを誘導することは以下のようにして確認できる。 A part of the human Hsp70 protein, the amino acid of which is set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing The portion from the first Met to the 38th Ser of the acid sequence is preferred as an adjuvant. This is the ATPase domain of the human Hsp70 protein. The antigen molecule may be fused to either the N-terminus or C-terminus of the adjuvant. Examples described below show that the fusion protein of the present invention (a fusion protein of malaria CTL peptide and Hsc70 or a fusion protein of leukemia CTL peptide and Hsc70) induces CTL in vitro. Indicated by It can be confirmed that the fusion protein induces CTL in vivo as follows.

H s c 7 0の N末端または C末端に P. yoeli i の C S蛋白質由来の C T Lェビ トープ（以下、 C Sェピトープと表記する）、 例えば、 配列表の配列番号 6に記載 のアミノ酸配列からなるぺプチドを融合した融合蛋白質を大腸菌に発現させる。 すなわち、マウス H s p 7 0遺伝子に P.yoeliiの C Sェビト一プをコ一ドする遺 伝子を結合し、 得られた結合遺伝子を大腸菌に導入して、 該大腸菌に前記結合遺 伝子がコードする融合蛋白質を発現させる。 発現された融合蛋白質を、 マウスに 投与する。 こうして、 前記融合蛋白質でマウスに細胞性免疫を誘導した後、 一匹 のマウスの体内に 1 0個の P. yoelii を尾静脈に静注すること等により侵入させ る。このときの条件は、一匹のマウスの体内に 1 0個の P.yoeliiが確実に入る条 件とする。細胞性免疫が誘導されないマウスの体内に 1 0個の P.yoeliiが侵入す ると、 該マウスは 1 0 0 %死ぬが、 細胞性免疫が誘導されたマウスは、 1 0個の P.yoeliiが侵入しても死なないことを確認できる。  A CTL peptide derived from the CS protein of P. yoelii (hereinafter referred to as CS peptide) at the N-terminus or C-terminus of Hsc70, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. A fusion protein obtained by fusing the peptide is expressed in Escherichia coli. That is, a gene coding for the CS ebtop of P. yoelii is ligated to the mouse Hsp70 gene, and the obtained ligated gene is introduced into Escherichia coli. The encoded fusion protein is expressed. The expressed fusion protein is administered to a mouse. After inducing cellular immunity in the mouse with the fusion protein in this way, 10 P. yoelii are invaded into the body of one mouse by intravenously injecting it into the tail vein or the like. The conditions at this time should be such that 10 P.yoelii can enter the body of one mouse. When 10 P. yoelii enter the body of a mouse in which cell-mediated immunity is not induced, the mouse dies 100%, but the mouse in which cell-mediated immunity is induced has 10 P. yoelii. Can be confirmed that they will not die if they enter.

実施例に例示したマラリアや白血病以外の疾患であっても、 予防または治療し ようとする疾患の C T Lェピトープのァミノ酸配列が分かれば、 該ァミノ酸配列 からなる C T Lェピトープを抗原分子とし、 ヒートショック蛋白質をアジュバン トとして、 該抗原分子と該アジュバン卜とを融合させた融合蛋白質を作製するこ とができる。 そして、 該融合蛋白質を有効成分として含むワクチンを使用するこ とにより、 該疾患の予防または治療が可能となる。  Even in diseases other than malaria and leukemia exemplified in the examples, if the amino acid sequence of the CTL epitope of the disease to be prevented or treated is known, the CTL epitope consisting of the amino acid sequence is used as an antigen molecule, and heat shock is performed. Using the protein as an adjuvant, a fusion protein in which the antigen molecule and the adjuvant are fused can be produced. By using a vaccine containing the fusion protein as an active ingredient, the disease can be prevented or treated.

本発明の融合蛋白質は C T Lを誘導する医薬組成物 （即ち、 蛋白質製剤） の有 効成分として使用可能である。 本発明の融合蛋白質を医薬として使用する場合、 そのまま使用してもよいが、 通常は、 製剤学的に許容しうる製剤用添加剤ゃ賦形 剤などを用いて前記融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物を製造し、 該医 薬組成物を疾患の治療または予防のために用いることが好ましい。 溶解度、 吸収 および***などの体内動態または製造方法などの観点から、 上記の融合蛋白質は 生理学的に許容される塩の形態であってもよい。 上記の医薬組成物の投与経路と しては、例えば、静脈内投与、 直腸内投与、経口投与などの全身投与の他、外用、 点眼、 点鼻、 点耳、 局所注射などの局所投与を挙げることができる。 The fusion protein of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for inducing CTL (ie, a protein preparation). When using the fusion protein of the present invention as a medicine, Although it may be used as it is, usually, a pharmaceutical composition containing the fusion protein as an active ingredient is produced using a pharmaceutically acceptable excipient for a pharmaceutical preparation, an excipient, or the like. Is preferably used for treating or preventing a disease. The fusion protein may be in the form of a physiologically acceptable salt from the viewpoint of pharmacokinetics such as solubility, absorption and excretion, or a production method. Examples of the administration route of the above pharmaceutical composition include systemic administration such as intravenous administration, rectal administration and oral administration, as well as topical administration such as external use, eye drops, nose drops, ear drops and local injection. be able to.

本発明の融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物の形態には、 例えば、 静 脈内投与用注射剤若しくは点滴剤などの全身投与剤、または、軟膏、クリーム剤、 貼付剤、 若しくは局所注射剤などの局所投与剤が挙げられる。 本発明で有効成分 として使用する融合蛋白質をリボソームなどに封入した医薬組成物を用いたり、 抗体を本発明の融合蛋白質に結合させたりすることにより、 標的器官に対する親 和性や選択性を改善することができる場合がある。 もっとも、 投与経路は適用対 象となる疾患の種類、 治療または予防の目的、 患部の種類、 患者の状態などに応 じて適宜選択可能であり、 それそれの投与経路に好適な製剤形態も適宜選択でき ることはいうまでもない。  Pharmaceutical compositions containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient include, for example, systemic drugs such as injections or drops for intravenous administration, or ointments, creams, patches, or topical injections And the like. Improving the affinity and selectivity for a target organ by using a pharmaceutical composition in which a fusion protein used as an active ingredient in the present invention is encapsulated in ribosomes, or by binding an antibody to the fusion protein of the present invention. May be able to. However, the administration route can be appropriately selected according to the type of the disease to be applied, the purpose of treatment or prevention, the type of the affected area, the condition of the patient, etc., and the formulation suitable for each administration route is also appropriate. It goes without saying that you can choose.

また、 本発明の融合蛋白質を有効成分として含むクリーム剤、 噴霧剤、 塗布用 の溶液剤、 または貼付剤などは、 使用目的に好適な形態で提供されることが好ま しい。 皮膚のケラチン層を通して有効成分である前記融合蛋白質を効率的に経皮 吸収させるために、 適宜の界面活性剤や脂溶性物質などをクリーム剤などに配合 することも好適である。  In addition, creams, sprays, solutions for application, patches and the like containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient are preferably provided in a form suitable for the intended use. In order to efficiently transdermally absorb the fusion protein as an active ingredient through the keratin layer of the skin, it is also preferable to add an appropriate surfactant or a fat-soluble substance to a cream or the like.

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されることはない。 実施例  The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples. Example

<実施例 1 >融合蛋白質の発現ベクターの作成  <Example 1> Construction of expression vector for fusion protein

マラリア原虫である P. yoel i i の C S蛋白質の 2 8 1番目から 2 8 9番目のァ ミノ酸配列 （配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列） からなるぺプチド （以 下 PYEと表記） を Hs c 70蛋白質の N末端に融合させた融合蛋白質 （以降、 P YE-H s c 70蛋白質と表記する） を発現する発現べクタ一および PYEを Hs c 70蛋白質の C末端に融合させた融合蛋白質 （以降、 Hs c 70— PYE 蛋白質と表記する） を発現する発現ベクターを作製した。 From the 28th to the 28th of the CS protein of the malaria parasite P. yoel ii A fusion protein (hereinafter referred to as PYE-Hsc) in which a peptide (hereinafter referred to as PYE) consisting of an amino acid sequence (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) is fused to the N-terminus of Hsc70 protein. An expression vector that expresses the Hsc70 protein and an expression vector that expresses a fusion protein in which PYE is fused to the C-terminus of the Hsc70 protein (hereinafter referred to as the Hsc70-PYE protein) were prepared. .

また、 H s c 70蛋白質の AT P a s eドメインの C末端に P Y Eを融合させ た融合蛋白質 （以降、 Hs c 70ATPas eドメイン— P Y E蛋白質と表記す る） を発現する発現ベクターを作製した。  In addition, an expression vector for expressing a fusion protein in which PYE was fused to the C-terminus of the ATPasse domain of the Hsc70 protein (hereinafter, referred to as Hsc70ATPase domain—PYE protein) was prepared.

また、 P YEを H s c 70蛋白質のぺプチド結合ドメインの C末端に融合させ た融合蛋白質 （以降、 Hs c 70ペプチド結合ドメイン— PYE蛋白質と表記す る） を発現する発現ベクターを作製した。  In addition, an expression vector was prepared which expresses a fusion protein in which PYE is fused to the C-terminus of the peptide binding domain of the Hsc70 protein (hereinafter, referred to as Hsc70 peptide binding domain—PYE protein).

また、 白血病細胞 RL 1由来の C T Lェピトープである PR L 1 aを H s c 70蛋白質の C末端に融合させた融合蛋白質 （以降、 Hs c 70-PRL 1 a蛋 白質と表記） を発現する発現べクタ一を作製した。 PRL 1 aのアミノ酸配列を 配列表の配列番号 59に示す。 前記の融合蛋白質の作製方法を以下の （1) ない し （4) に記載する。  It also expresses a fusion protein (hereinafter, referred to as Hsc70-PRL1a protein) obtained by fusing PR L1a, a CTL peptide derived from leukemia cell RL1, to the C-terminus of Hsc70 protein. Kuta one was made. The amino acid sequence of PRL1a is shown in SEQ ID NO: 59 in the sequence listing. The method for producing the fusion protein is described in (1) or (4) below.

前記の各融合蛋白質を総称して Hs c 70融合蛋白質と表記する。  The above fusion proteins are collectively referred to as Hsc70 fusion protein.

(1) pQEプラスミ ドベクターの制限酵素による切断  (1) Cleavage of pQE plasmid vector with restriction enzymes

6個の連続する H i s残基をコ一ドする DN Aを有するプラスミ ドベクター p QE-30 (キアゲン社） を B amH Iと Kpn Iで切断した。 切断反応は、 プ ラスミ ド pQE— 30ベクターを制限酵素 B amH Iおよび Kpn Iと 37°Cで 2時間反応させることによって行った。 反応終了後の反応液について 0. 8%ァ ガロースゲル上で電気泳動を行い、 エチレンプロマイ ドでゲル上の DN Aを染色 した。 長波長紫外線下でゲル上のベクタ一 DNAのバンドを確認して、 該バンド 部分のゲルを切り出した。 Gene Cl eanキット （フナコシ社） を用いて 切り出したゲルからベクター DN Aを溶出精製し、 TE緩衝液に溶解した。 (2) PCR A plasmid vector pQE-30 (Qiagen) having a DNA encoding six consecutive His residues was digested with BamHI and KpnI. The cleavage reaction was carried out by reacting the plasmid pQE-30 vector with the restriction enzymes BamHI and KpnI at 37 ° C for 2 hours. After the reaction was completed, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and the DNA on the gel was stained with ethylene bromide. After confirming the band of vector-1 DNA on the gel under long-wavelength ultraviolet light, the gel in the band was cut out. The vector DNA was eluted and purified from the cut gel using a Gene Clean kit (Funakoshi), and dissolved in TE buffer. (2) PCR

P YEをコードするミニ遺伝子を含むプライマーを、 下記の 1および 2に記載 する塩基配列からなるように設計し、 DNA合成機を用いて合成した。  A primer containing a minigene encoding PYE was designed to have the nucleotide sequences described in 1 and 2 below, and was synthesized using a DNA synthesizer.

1. H s c 70— P YE蛋白質発現用プライマ—  1. H sc 70—P YE protein expression primer

フォワー ドプライマ一 ： 5 ' — ATGGATCCCATGTCTAAGGGA CCT-3' (配列表の配列番号 62に記載の塩基配列、 BamH Iサイ トをもつ） リバ一スプライマ一 ： 5' -ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAATCCACCTCTTCAATG— 3，（配 列表の配列番号 63に記載の塩基配列、 Kpn lサイ トをもつ）  Forward primer: 5 '— ATGGATCCCATGTCTAAGGGA CCT-3' (base sequence described in SEQ ID NO: 62, having BamHI site) Reverse primer: 5 '-ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAATCCACCTCTTCAATG—3, (sequence list The nucleotide sequence described in No. 63 has the Kpnl site)

2. P YE— H s c 70蛋白質発現用プライマー 2. P YE—H sc 70 protein expression primer

フォワー ドプライマ一 ： 5 ' -ATGGATCCCTCTTATGTCCCA AGCGCGGAACAAATAATGT CTAAGGGACCT— 3，（配列表 の配列番号 64に記載の塩基配列、 B amH Iサイ トをもつ）  Forward primer: 5'-ATGGATCCCTCTTATGTCCCA AGCGCGGAACAAATAATGT CTAAGGGACCT—3 (has the base sequence described in SEQ ID NO: 64 in the sequence listing and has a BamHI site)

リバースプライマー ： 5' — ATGGTACCATGGACTGACTTAA T C C一 3， （配列表の配列番号 65に記載の塩基配列、 Kpnlサイ トをもつ） Reverse primer: 5 '— ATGGTACCATGGACTGACTTAA TCC-13, (has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 65 in the sequence listing, having the Kpnl site)

H s c 70分子には N末端側の A TPas eドメインと C末端側のぺプチド結 合ドメインが存在する。 このうちどちらのドメインが CTLの誘導に必要かを検 討するために、 PYEをコードするミニ遺伝子を含むプライマーを、 下記 3およ び 4に記載する塩基配列からなるように設計し、 D N A合成機を用いて合成した。The H sc 70 molecule has an N-terminal ATPase domain and a C-terminal peptide binding domain. To determine which domain is required for CTL induction, primers containing the PYE-encoding minigene were designed to consist of the nucleotide sequences described in 3 and 4 below, and DNA synthesis was performed. It was synthesized using a machine.

3. Hs c 7 OATPas e ドメイン一 P Y E蛋白質発現用プライマー 3. Hs c 7 OATPas e domain-P Y E protein expression primer

フォワードプライマー ： 5 ' -ATGGATCCCATGTCTAAGGGA Forward primer: 5'-ATGGATCCCATGTCTAAGGGA

CCT— 3' (配列表の配列番号 66に記載の塩基配列、 B amH Iサイ トをもつ） リバースプライマ一 ： 5' — ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAAGACTTGT CT CC— 3，（配列表の配 列番号 67に記載の塩基配列、 Kpnlサイ トをもつ） CCT—3 ′ (having the base sequence described in SEQ ID NO: 66 in the sequence listing and having a BamHI site) Reverse primer: 5′—ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAAGACTTGT CT CC—3, (described in SEQ ID NO: 67 in the sequence listing) Base sequence, with Kpnl site)

4. H s c 70ペプチド結合ドメイン— PYE蛋白質発現用プライマー  4. H sc 70 peptide binding domain—PYE protein expression primer

フォワー ドプライマー ： 5 ' -ATGGATCCCGAGAACGTTCAG G— 3， （配列表の配列番号 68に記載の塩基配列、 BamH Iサイ トをもつ） リバースプライマ一 ： 5 ' -ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAAT CCACCT CTTCAATG— 3，（配 列表の配列番号 69に記載の塩基配列、 Kpn lサイ トをもつ） Forward primer: 5'-ATGGATCCCGAGAACGTTCAG G-3, (base sequence described in SEQ ID NO: 68 in the sequence listing, having BamHI site) Reverse primer: 5'-ATGGTACCTTATATTTGTTCCG CGCTTGGGACATAAGAAT CCACCT CTTCAATG-3, (base sequence described in SEQ ID NO: 69 in the sequence listing) , With a Kpnl site)

さらに、 マウス放射線白血病細胞の CTLェビ卜一プである PR L 1 aをコ一 ドするミニ遺伝子を含むプライマーを、 下記の 5に記載する塩基配列からなるよ うに設計し、 DN A合成機を用いて合成した。  Furthermore, a primer containing a minigene encoding PRL1a, which is a CTL vector of mouse radiation leukemia cells, was designed to have the nucleotide sequence described in 5 below, and a DNA synthesizer was designed. Was synthesized using

5. H s c 70— PRL 1 a蛋白質発現用プライマー 5. H sc 70—PRL 1a protein expression primer

フォヮ一ドプライマ一 ： 5' -ATGGAT CCCATGT CTAAGGGA CCT-3' (配列表の配列番号 Ί 0に記載の塩基配列）  Former primer: 5'-ATGGAT CCCATGT CTAAGGGA CCT-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 0 in Sequence Listing)

リバースプライマ一 ： 5 ' -ATGGTACCTTACAGAGACAGGG GTAACCCAGGGATATCCACC T C T T C A A T G— 3，（配列表の 配列番号 Ί 1に記載の塩基配列、 Kpn lサイ トをもつ）  Reverse primer: 5'-ATGGTACCTTACAGAGACAGGG GTAACCCAGGGATATCCACC TCTTC AATG-3 (has the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and has a Kpnl site)

マウス線維肉腫細胞 Me t h A細胞から RN Aを抽出し、 ランダムプライマ一 を用いて逆転写酵素により cDNAを作成した。 この cDNAを錡型 DNAとし て、 前記 1ないし 5で得られた各組のフォワードプライマ一、 リバースプライマ 一を用いて P CR反応を行った。 PCR反応は、 94 °Cで 5分間熱変性した後、 「94°Cで 1分 （熱変性）、 58 °Cで 1分間 （アニーリング）、 72°Cで 2. 5分 間（伸張反応）」を 30サイクル行った。 P CR反応液をフエノール/クロ口ホル ム抽出し、 エタノール沈殿後、 TE緩衝液 （pH8. 0) に懸濁した。  RNA was extracted from mouse fibrosarcoma Meth A cells, and cDNA was prepared using a random primer with reverse transcriptase. Using this cDNA as type I DNA, a PCR reaction was performed using the forward primer and the reverse primer of each set obtained in the above 1 to 5. The PCR reaction was performed by heat denaturation at 94 ° C for 5 minutes, followed by 1 minute at 94 ° C (heat denaturation), 1 minute at 58 ° C (annealing), and 2.5 minutes at 72 ° C (extension reaction). Was performed for 30 cycles. The PCR reaction solution was extracted with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, and suspended in TE buffer (pH 8.0).

これにより  This

Hs c 70の N末端に PYEを融合した融合蛋白質（PYE— H s c 70蛋白質） をコ一ドする DNA、  DNA encoding a fusion protein (PYE—Hsc70 protein) in which PYE is fused to the N-terminus of Hsc70,

Hs c 70の C末端に PYE融合した融合蛋白質 （H s c 70—PYE蛋白質） をコ一ドする DNA、  DNA encoding a fusion protein (Hsc70-PYE protein) fused to the C-terminal of Hsc70 by PYE,

H s c 70の ATP a s e ドメインの C末端に P Y Eが融合された融合蛋白質 (Hs c 70ATP a s e ドメイン一 PYE蛋白質） をコードする DNA、 H s c 70のべプチド結合ドメインの C末端に P YEを融合した融合蛋白質 （H s c 70ぺプチド結合ドメイン一 PYE蛋白質） をコードする DNAおよび H s c 70の C末端に PRL 1 aを融合した融合蛋白質 （Hs c70— PRL 1 a蛋白質） をコードする DNAを作製した。 DNA encoding a fusion protein in which PYE is fused to the C-terminal of the ATPase domain of Hsc70 (Hsc70ATPase domain-PYE protein), DNA encoding a fusion protein in which PYE is fused to the C-terminal of the Hsc70 peptide-binding domain (Hsc70 peptide-binding domain-PYE protein) and fusion of PRL1a to the C-terminus of Hsc70 DNA encoding the protein (Hs c70—PRL 1a protein) was prepared.

( 3 ) 酵素切断  (3) Enzyme cleavage

前記（2)で得られた DN Aを、制限酵素 B amH Iおよび Kpn Iと、 37°C で 2時間反応させ、 該 DNAの両端の切断を行った。 反応終了後の反応液につい て 0. 8 %ァガロースゲル上で電気泳動を行い、 エチレンブロマイ ドでゲル上の DN Aを染色した。 長波長紫外線下でゲル上のベクタ一 DN Aのバンドを確認し て、 該バンド部分のゲルを切り出した。 Gene C 1 e a nキッ ト （フナコシ 社） を用いて切り出したゲルからベクタ一 DNAを溶出精製し、 TE緩衝液に溶 解した。  The DNA obtained in the above (2) was reacted with the restriction enzymes BamHI and KpnI at 37 ° C for 2 hours to cut both ends of the DNA. After the reaction was completed, the reaction solution was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and DNA on the gel was stained with ethylene bromide. After confirming the band of Vector-1 DNA on the gel under long-wavelength ultraviolet light, the gel in the band was cut out. Vector-1 DNA was eluted and purified from the gel excised using the Gene C 1 ean kit (Funakoshi) and dissolved in TE buffer.

( ) 形質転換体の作成  () Preparation of transformants

前記 （1) で得られた BamHIと K p n Iで切断したベクタ一と前記 （3) で得られた P CR産物のィンサ一卜とを DNAライゲ一ス （TAKARA社製） により、 16°Cで 3時間反応させることにより結合させた。 反応終了後の反応液 を M 15コンビテント大腸菌 （キアゲン社） に混合し、 42 °Cで 90秒処理後、 氷中に 2分放置してトランスフォーメーションした。 得られた形質転換体を、 3 7 °Cの SO C培地中で 90分間振盪し、 アンピシリン 50〃 /1111を含む1^8 (L B/Amp) ァガ一プレートにプレ一ティングした。 得られたコロニーのな かから少量のプラスミ ド抽出した。 該プラスミ ドを錶型に PCRを行い、 インサ —卜が挿入されているクローンを選別した。 選別されたクローンが Hs c 70融 合蛋白質を発現するベクターが導入された形質転換体である。  The vector digested with BamHI and KpnI obtained in (1) above and the PCR product insert obtained in (3) were subjected to DNA ligase (TAKARA) at 16 ° C. For 3 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was mixed with M15 competent Escherichia coli (Qiagen), treated at 42 ° C for 90 seconds, and left on ice for 2 minutes to transform. The resulting transformant was shaken for 90 minutes in a 37 ° C. SOC medium and plated on a 1 ^ 8 (LB / Amp) agar plate containing ampicillin 50〃 / 1111. A small amount of plasmid was extracted from the obtained colonies. The plasmid was subjected to PCR to form III, and a clone into which the insert was inserted was selected. The selected clone is a transformant into which the vector expressing the Hsc70 fusion protein has been introduced.

<実施例 2>Hs c 70融合蛋白質の大量発現 <Example 2> Mass expression of Hsc 70 fusion protein

(1) Hs c 70融合蛋白質の発現  (1) Expression of Hsc70 fusion protein

実施例 1の （4) で選別されたクローンをアンピシリン 100〃g/ml、 力 ナマイシン 20〃g/mlを含む LB培地 500mlで培養し、 分光光度計 （ベ ヅクマン社製） で 600 nmの波長における濁度が 0. 6から◦. 7になった時 点で I PTGを 1 mMになるように加え、 各 H s c 70融合蛋白質の発現誘導を 3時間行った。 The clones selected in (4) of Example 1 were subjected to ampicillin 100 μg / ml, Culture in 500 ml of LB medium containing 20 mg / ml of namycin. When the turbidity at a wavelength of 600 nm changes from 0.6 to ◦.7 with a spectrophotometer (manufactured by Beckman), 1 PTG was added. mM, and the expression of each Hsc70 fusion protein was induced for 3 hours.

(2) Hs c 70融合蛋白質の精製  (2) Purification of Hs c 70 fusion protein

大腸菌を回収し、下記組成の溶解液 30mlで懸濁した。得られた懸濁液を 4 °C で超音波処理し、超遠心分離器および 45 T iロー夕（いずれもベックマン社製） を使用して 5000 r pm、 4 °Cで 1時間超遠心分離した。  E. coli was recovered and suspended in 30 ml of a lysis solution having the following composition. The resulting suspension is sonicated at 4 ° C and ultracentrifuged at 5000 rpm for 1 hour at 4 ° C using an ultracentrifuge and a 45 Ti Rho-Yu (both from Beckman). did.

溶解液組成： Solution composition:

1 OmM Tr is-HCl (pH8. 0)  1 OmM Tr is-HCl (pH 8.0)

2M 尿素 2M urea

0. 1Mリン酸ナトリウム  0.1 M sodium phosphate

ImM PMS F  ImM PMS F

得られた上清を取り、 1Mイミダゾール （pH7. 5) を終濃度 ImMになる ように加え、 N i—NT Aァガロースカラム （キアゲン社製） を用いて非変性条 件で取扱説明書に従って精製した。カラムのべッドボリュームは、 1mlとした。 カラムは、 下記組成の第一洗浄液 3 Omlで洗浄した後、 下記組成の第二洗浄 液 5mlで洗浄した。  The resulting supernatant was collected, 1M imidazole (pH 7.5) was added to a final concentration of ImM, and purified using a Ni-NT A agarose column (Qiagen) under non-denaturing conditions according to the instruction manual. . The bed volume of the column was 1 ml. The column was washed with 3 Oml of a first washing solution having the following composition, and then washed with 5 ml of a second washing solution having the following composition.

第一洗浄液組成： First cleaning liquid composition:

0. 01M Tris-HCl (pH8. 0)  0.01M Tris-HCl (pH 8.0)

2M 尿素 2M urea

0. 1Mリン酸ナトリウム  0.1 M sodium phosphate

ImM PMS F  ImM PMS F

2 OmM イミダゾ一ル 2 OmM imidazole

第二洗浄液組成： Second cleaning liquid composition:

0. 01M T r i s— HC1 ( H 6. 3)  0. 01M T r i s— HC1 (H6.3)

2M 尿素 0. 1Mリン酸ナトリウム 2M urea 0.1 M sodium phosphate

ImM PMS F  ImM PMS F

2 OmM イミダゾール  2 OmM imidazole

溶出時には、 下記組成の溶出 1 Omlをカラムに流した。  During elution, 1 Oml of the following composition was passed through the column.

溶出液組成： Eluate composition:

0. 01M T r i s-HC 1 (pH 6. 3)  0.01M Tris-HC 1 (pH 6.3)

2M 尿素  2M urea

0. 1Mリン酸ナトリウム  0.1 M sodium phosphate

0. 5mM PMS F  0.5mM PMS F

20 OmM イミダゾール  20 OmM imidazole

溶出された Hs c 70融合蛋白質画分を下記組成の第一透析液で計 24時間透 祈し （透析液を 3回交換した）、 さらに第二透析液で 24時間透析した （透析液は 3回交換した） 後、 0. 22〃mのフィル夕一を通して一 80°Cで保存した。 第一透析液組成：  The eluted Hsc70 fusion protein fraction was permeated with the first dialysate having the following composition for a total of 24 hours (the dialysate was changed three times), and further dialyzed for 24 hours with the second dialysate (the dialysate was 3 times). (Changed twice) and stored at 180 ° C throughout the 0.22 m fill. First dialysate composition:

0. 01M Tri s - HC1 (pH 8. 0)  0.01M Tris-HC1 (pH 8.0)

1M 尿素  1M urea

0. 1Mリン酸ナトリウム  0.1 M sodium phosphate

第二透析液組成： Second dialysate composition:

0. 01M T r i s -HC 1 (pH 8. 0)  0.01M Tris -HC 1 (pH 8.0)

0. 1Mリン酸ナトリウム 0.1 M sodium phosphate

溶出された Hs c 70融合蛋白質画分について電気泳動 （SDS— PAGE) を行った。 クマシ一プリリアントブルーで蛋白質部分を染色した。  The eluted Hsc70 fusion protein fraction was subjected to electrophoresis (SDS-PAGE). The protein portion was stained with Coomassie brilliant blue.

P YE-H s c 70蛋白質および H s c 70— P Y E蛋白質の電気泳動の結果 を図 1に示す。 対照として、 Hsc 70 (P YEを融合させなかった） を電気泳 動した。 図中、 Mはマ一カーのレーンであり、 バンドが見られるのは 67 kDの 位置である。 1は対照のレーンである。 2は P YE— H s c 70蛋白質のレーン である。 3は H s c 70— P YE蛋白質のレーンである。 いずれの画分にも 70 kDの位置の少し上にに H s c 70融合蛋白質のバンド が確認された （ぺプチドの分だけやや大きめの位置にバンドが現れている）。 FIG. 1 shows the results of electrophoresis of the PYE-Hsc70 protein and the Hsc70-PYE protein. As a control, Hsc 70 (PYE was not fused) was electrophoresed. In the figure, M is the marker lane, and the band is seen at 67 kD. 1 is a control lane. 2 is a lane for PYE-Hsc70 protein. 3 is a lane for the Hsc70-P YE protein. In each of the fractions, a band of the Hsc70 fusion protein was confirmed slightly above the position of 70 kD (the band appeared slightly larger for the peptide).

(3) ATPァガロースカラムによる Hs c70融合蛋白質の精製  (3) Purification of Hs c70 fusion protein using ATP agarose column

上記 （2) の操作で N i— NT Aァガロースカラムの代わりに AT Pァガ口一 スカラム （シグマ社製） を使用して Hs c 70融合蛋白質を精製した。 溶出液に は 3mM ATPを使用した。  The Hsc70 fusion protein was purified by the above procedure (2) using an AT Paga mouth column (manufactured by Sigma) instead of the Ni—NT A agarose column. 3 mM ATP was used for the eluate.

溶出された Hs c 70融合蛋白質画分について電気泳動 （SDS— PAGE) を行った。 クマシ一プリリアントブルーで蛋白質部分を染色した。  The eluted Hsc70 fusion protein fraction was subjected to electrophoresis (SDS-PAGE). The protein portion was stained with Coomassie brilliant blue.

結果を図 2に示す。対照として、 H s c 70 (PYEを融合させなかったもの） および H s c 70. 1 (PYEを融合させなかったもの）を電気泳動した。図中、 Mはマ一カーのレーンであり、 バンドが見られるのは 67 kDの位置である。 1 は対照 （H s c 70) のレーンである。 2は対照 （Hsp70. 1) のレーンで ある。 3は P YE— Hs c 70蛋白質のレーンである。 4は Hsc70— PYE 蛋白質のレーンである。  The result is shown in figure 2. As controls, H sc 70 (without PYE fusion) and H sc 70.1 (without PYE fusion) were electrophoresed. In the figure, M is the marker lane, and the band can be seen at 67 kD. 1 is a control (H sc 70) lane. 2 is a control (Hsp70. 1) lane. 3 is a lane of PYE-Hsc70 protein. 4 is a lane for Hsc70-PYE protein.

いずれの H s c 70融合蛋白質も AT Pァガロースカラムで精製することがで きた。 このことから、 いずれの H s c 70融合蛋白質も AT Pァガロースカラム に結合することができること、 すなわち、 少なくとも ATP a s eドメインでは 本来の 3次元分子構造が保たれていることが示された。 く実施例 3 >マラリア蛋白質のェピトープを組み込んだ Hs c 70融合蛋白質の CTL誘導活性  Both Hsc70 fusion proteins could be purified on an AT P agarose column. This indicates that any of the Hsc70 fusion proteins can bind to the ATP agarose column, that is, that the original three-dimensional molecular structure is maintained at least in the ATPase domain. Example 3> CTL Inducing Activity of Hsc70 Fusion Protein Incorporating Malaria Protein Epitope

実施例 2で精製した Hs c70— PYEとPYE— Hs c— 70をマゥスに投 与することにより細胞性免疫が誘導されることを、 すなわち赤外型マラリアワク チンとしての有効性があることを、 以下に示す in vi t roにおける細胞性 免疫応答の誘導実験により調べた。  It was confirmed that the administration of Hs c70-PYE and PYE-Hs c-70 purified in Example 2 to a mouse induces cell-mediated immunity, that is, the effectiveness as an infrared-type malaria vaccine. It was examined by the following in vitro induction experiment of cellular immune response.

(1) H s c融合蛋白質のマウスへの投与  (1) administration of H sc fusion protein to mice

実施例 2で作製した PYE— Hs c 70蛋白質、 Hs c 70— PYE蛋白質を それそれ別のマウスに投与した。前記蛋白質は 2回投与（各回の投与量は 5 / g) し、 各回に投与する場所を表 1に示す 4通りとなるようにした。 The PYE-Hsc70 protein and Hsc70-PYE protein prepared in Example 2 were used. Each was administered to another mouse. The protein was administered twice (each time was administered at a dose of 5 / g), and the locations where each protein was administered were as shown in Table 1 in four ways.

表 1 ： table 1 :

1向曰の 与簡所 2 ίΐΠ日の 与簡所 _  1 person's Yorosho 2 Yorosho _

皮下 皮下  Subcutaneous subcutaneous

皮下 静注  Subcutaneous intravenous injection

皮内 皮内 Intradermal intradermal

m^ ( mm^ (^  m ^ (mm ^ (^

l回目の投与後 1週間おいて 2回目の投与を行った。 2回目の投与から 1ない し 2週後に該マウスから脾臓細胞を取り出した。  One week after the first administration, the second administration was performed. One to two weeks after the second administration, spleen cells were removed from the mice.

(2) CTL (エフェクター細胞） の調製  (2) Preparation of CTL (effector cells)

前記 （ 1) で得られたマウス脾臓細胞を Kd拘束性の PYE ( 1 s/ml) と i n v i t r oで 6日間混合培養した。 脾臓細胞は 7. O 1 0⁶ c e 1 1 sZmlの濃度で、 牛胎児血清 （FB S) および 2—メルカプトエタノールをそ れそれ 1 0%、 5x 10— ⁵Mの濃度になるように含む RPMI培地（完全培養液） で培養した。 The mouse spleen cells obtained in (1) above were mixed-cultured with Kd-restricted PYE (1 s / ml) in vitro for 6 days. Spleen cells at a concentration of ^{7. O 1 0 6 ce 1 1} sZml, fetal bovine serum (FB S) and 2-mercaptoethanol are their it 1 0%, RPMI containing to a concentration of 5x 10- ⁵ M The cells were cultured in a medium (complete culture solution).

(3) 標的腫瘍細胞 （夕—ゲット細胞） の調製  (3) Preparation of target tumor cells (evening-get cells)

マウス肥満細胞腫細胞である P 8 1 5細胞 （理研ジーンバンクより購入。 カタ ログ番号は RCB 1 1 67) 2. O x l O⁶個を、 1. 85 MB qの N a ₂ ⁵¹ C r 0₄で 1時間標識し、 PYEをパルスした。 この細胞を、 牛胎児血清 （FB S) および 2—メルカプトエタノールをそれそれ 1 0%、 5 x 1 0— ⁵ Mの濃度になる ように含む RPMI培地で培養した。 また、 P YEをパルスしない P 8 1 5細胞 も同様に培養し、 標的細胞とした。 (Purchased from RIKEN Gene Bank. Catalog number RCB 1 1 67) P 8 1 5 cells, a murine mastocytoma cell 2. O xl O ⁶ pieces of, N a ₂ ⁵¹ C r 0 of 1. 85 MB q Labeled with ₄ for 1 hour and pulsed with PYE. The cells, bovine fetal serum (FB S) and 2-mercaptoethanol it it 1 0%, were cultured in RPMI medium containing to a concentration of ⁵ x 1 0- 5 M. P815 cells not pulsed with PYE were similarly cultured and used as target cells.

(4) ⁵¹ Cr遊離活性測定 (4) ⁵¹ Cr release activity measurement

前記 （2) で培養された CTL (エフェクター細胞） を PB Sで 1. 2 5 x 1 0⁶ c e 1 1 s /mlに調製して、 1 00〃 1ずつ 9 6we l lプレートにまい た。 さらにこの CTLを完全培養液で 8 w e 11を 1列として各列間で 2倍ずつ に希釈した。 Wherein (2) cultured CTL (the effector cells) were prepared in ^{1. 2 5 x 1 0 6 ce} 1 1 s / ml in PB S, the plated onto one 00〃 1 9 6we ll plate. In addition, this CTL was completely cultured with 2x11 between each row with 8 we 11 as one row. Diluted.

前記 （3) で培養した P 815細胞 （夕一ゲッ ト細胞） を RPMI培地で洗浄 し、 5x l 0⁴ce l l s/mlに調製した。 この細胞液を 100〃 1ずつエフ ェク夕一細胞の入っている we 11にまいた。 この結果、 E/T (エフェク夕一 細胞/夕—ゲッ ト細胞） 比が 25 : 1、 12 : 1、 6 : 1、 3 : 1、 1. 5 : 1 になった。 この状態で 4時間培養して、 培養上清中に遊離した⁵¹ Crをァ—カウ ン夕一で測定した。 測定された⁵¹ C rの量から細胞傷害性を計算した。 The P815 cells (evening get cells) cultured in the above (3) were washed with an RPMI medium and adjusted to 5 × 10 ⁴ cells / ml. This cell solution was spread on we11 each containing 100 μl of each cell. As a result, the E / T (Effek evening cell / evening-get cell) ratio was 25: 1, 12: 1, 6: 1, 3: 1, 1.5: 1. In this state, the cells were cultured for 4 hours, and ⁵¹ Cr released in the culture supernatant was measured overnight. The cytotoxicity was calculated from the measured amount of ⁵¹ Cr.

結果を図 3に示す。 図中、 〇が P YEをパルスした標的細胞に CTLを作用さ せた結果であり、 秦が PYEをパルスしなかった結果である。 図の最上段は融合 蛋白質を 2回ともマウスの皮下に投与した場合の結果である。 上から 2段目は融 合蛋白質を 1回目はマウスの皮下に 2回目はマウスの静脈内に投与した場合の結 果である。 上から 3段目は融合蛋白質を 2回ともマウスの皮内に投与した場合の 結果である。 最下段は融合蛋白質を 2回ともマウスの静脈内に投与した場合の結 果である。  The results are shown in Figure 3. In the figure, 〇 shows the results obtained when CTL was applied to target cells pulsed with PYE, and Hata did not pulse PYE. The top row of the figure shows the results when the fusion protein was administered subcutaneously to mice both times. The second row from the top shows the results when the fusion protein was first administered subcutaneously to the mice and the second time intravenously to the mice. The third row from the top shows the results when the fusion protein was administered twice intradermally to mice. The bottom row shows the results when the fusion protein was administered twice intravenously to mice.

投与した融合蛋白質が PYE—Hs c 70蛋白質、 Hs c70— PYE蛋白質 いずれの場合についても、 EZT比の増加につれて細胞傷害活性が大きくなった。 特に、 2回ともマウスの静脈内に投与 （静脈内注射） した場合は、 細胞傷害活性 が大きな値となり、 CTLが強く誘導されたことが分かった。 すなわち、 静注を 2回行う免疫法によりマラリァに対して全身性の防御免疫能が獲得されることが 考えられる。  Regardless of whether the administered fusion protein was PYE-Hsc70 protein or Hsc70-PYE protein, the cytotoxic activity increased as the EZT ratio increased. In particular, when the mice were administered intravenously (intravenous injection) both times, the cytotoxic activity became large, indicating that CTL was strongly induced. In other words, it is conceivable that systemic protective immunity against malaria is acquired by immunization with two intravenous injections.

C末端に P Y Eを融合させた場合は、 2回目の投与を静注で行うことにより、 CTLが強く誘導された。 く実施例 4>Hs c 70 ATPas eドメイン— P Y E蛋白質の C T L誘導活 性および Hs c 70ぺプチド結合ドメイン一 PYE蛋白質の CTL誘導活性 実施例 3と同様にして、 Hs c70ATPas eドメイン一 P Y E蛋白質およ び Hs c 70ペプチド結合ドメイン— PYE蛋白質それぞれの CTL誘導活性を 調べた。 When PYE was fused to the C-terminus, CTL was strongly induced by the second administration intravenously. Example 4> Hs c70 ATPase e-domain—CTL Inducing Activity of PYE Protein and Hsc 70 Peptide Binding Domain—CTL Inducing Activity of PYE Protein In the same manner as in Example 3, the Hs c70 ATPase e domain—PYE protein And Hsc 70 peptide-binding domain-CTL-inducing activity of each PYE protein Examined.

結果を図 4に示す。 図中、 上段は Hs c 70— PYE蛋白質をマウスに投与し た場合の結果である。 中段は、 Hs c 7 OATPas eドメイン— PYE蛋白質 をマウスに投与した場合の結果である。 下段は Hs c 70ペプチド結合ドメイン 一 PYE蛋白質をマウスに投与した場合の結果である。 図中、 〇が PYEをパル スした標的細胞に C T Lを作用させた結果であり、 が P Y Eをパルスしなかつ た結果である。  Fig. 4 shows the results. In the figure, the upper row shows the results when the Hsc70-PYE protein was administered to mice. The middle row shows the results when the Hsc 7 OATPas e domain-PYE protein was administered to mice. The lower row shows the results when the Hsc 70 peptide binding domain-PYE protein was administered to mice. In the figure, 〇 indicates the result of the action of CTL on the target cells pulsed with PYE, and indicates the result without pulsing PYE.

図 4に示すように、 Hs c70ATPas eドメイン一に P Y E蛋白質は H s c 70— PYE蛋白質と同程度に CTLを誘導した。 一方、 ペプチド結合ドメィ ンに PYEを融合させた融合蛋白質は、 PYEをパルスした標的細胞に CTLを 作用させた結果と P Y Eをパルスしなかった標的細胞に C T Lを作用させた結果 が同じであり、 CTLを誘導しないと結論された。 このことから、 アジュバント として使用する H s c 70は、 少なくとも ATP a s eドメインを有するもので あればよいことが分かった。  As shown in FIG. 4, the PYE protein induced CTL to the same extent as the Hsc70-PYE protein in the Hsc70ATPase domain. On the other hand, in the fusion protein in which PYE was fused to the peptide-bound domain, the result of CTL acting on PYE-pulsed target cells was the same as the result of CTL acting on non-PYE-pulsed target cells. It was concluded that it did not induce CTL. From this, it was found that Hsc70 used as an adjuvant should have at least an ATPase domain.

<実施例 5 >腫瘍拒絶抗原ェピトープを組み込んだ Hs c 70融合蛋白質の C TL誘導活性 Example 5 CTL Inducing Activity of Hsc70 Fusion Protein Incorporating Tumor Rejection Antigen Epitope

実施例 2で精製した Hs c 70-PRL 1 a蛋白質をマウスに投与することに より細胞性免疫が誘導されること、 すなわち白血病ワクチンとしての有効性があ ることを、 以下に示す in V i t r oにおける細胞性免疫応答の誘導実験によ り調べた。  It was shown in vitro that administration of the Hsc 70-PRL 1a protein purified in Example 2 to mice induces cell-mediated immunity, that is, that it is effective as a leukemia vaccine. Was examined by an experiment for inducing a cellular immune response in E. coli.

(1) Hs c融合蛋白質のマウスへの投与  (1) Administration of Hsc fusion protein to mice

作成した融合蛋白質分子 Hs c 70-PRL 1 a蛋白質を 2回それそれ静注に より投与した。 1回目の投与後 1週間おいて 2回目の投与を行った。 2回目の投 与から 1ないし 2週後に該マウスから脾臓細胞を取り出した。  The prepared fusion protein molecule Hsc70-PRL1a protein was administered twice intravenously. One week after the first administration, the second administration was performed. One to two weeks after the second administration, spleen cells were removed from the mice.

(2) CTL (エフヱクタ一細胞） の調製  (2) Preparation of CTL (Effector cell)

前記 （1) で得られたマウス脾臓細胞を、 マイ トマイシン 50〃g/mlで 4 5分間処理した RL 1腫瘍 （Pro Natl. Acad. Sci. USA 76:3486) と、 6日間混 合培養した。 脾臓細胞は 7. 0 X 10⁶ c e 11 s /mlの濃度、 RL 1腫瘍 は 3. 5 X 10⁵ c e 11 s /m 1の濃度で牛胎児血清 （FBS) および 2—メ ルカプトエタノールをそれそれ 10%、 5x 10— ⁵Mの濃度になるように含む R PMI培地 （完全培養液） で培養した。 The mouse spleen cells obtained in (1) above were mixed with 50 g of mitomycin at 4 g / ml. RL1 tumor (Pro Natl. Acad. Sci. USA 76: 3486) treated for 5 minutes was mixed and cultured for 6 days. Spleen cells at a concentration of 7.0 × 10 ⁶ ce 11 s / ml, RL1 tumors at a concentration of 3.5 × 10 ⁵ ce 11 s / m 1 and fetal bovine serum (FBS) and 2-mercaptoethanol. it then 10%, and cultured in R PMI medium containing to a concentration of 5x 10- ⁵ M (complete medium).

(3)標的腫瘍細胞 （ターゲット細胞） の調製  (3) Preparation of target tumor cells (target cells)

RL 1細胞 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3486) 2. 0 x 10⁶個を、 1·RL 1 cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3486) 2.0 x 10 ⁶

85MBqのNa₂ ⁵¹CΓ0₄で 1時間標識し、 5χ 10⁴c e 11 s/mlの濃 度で、牛胎児血清（FB S)および 2—メルカプトエタノールをそれそれ 10%、 5x 10— ⁵Mの濃度になるように含む RPMI培地で培養した。 また、 対照とし て、 RL 1細胞と同じ H— 2ハロタイプ （H2— d) を有する別の腫瘍細胞で ある P815細胞を 1.85MBqの Na₂ ⁵¹Cr 0₄で標識し、標的細胞とした。 Labeled for one hour with Na ₂ ⁵¹ CΓ0 ₄ of 85MBq, at concentrations of ^{5χ 10 4 ce 11 s / ml} , fetal bovine serum (FB S), and 2-mercaptoethanol it it 10% of 5x 10- ⁵ M The cells were cultured in an RPMI medium containing the same concentration. Further, as a control, P815 cells, another tumor cells with the same H- 2 haplotypes (H2-d) and RL 1 cells were labeled with Na ₂ ⁵¹ Cr 0 ₄ of 1.85 MBq, it was targeted cells.

(4) ⁵¹ Cr遊離活性測定 (4) ⁵¹ Cr release activity measurement

前記 （2) で培養された CTL (エフェクター細胞） を PBSで 1. 25x1 0⁶ c e 11 s/mlに調製して、 100〃 1ずつ 96 w e 11プレートにまい た。 さらにこの CTLを完全培養液で 8 w e 11を 1列として各列間で 2倍ずつ に希釈した。 The CTL (effector cells) cultured in the above (2) were adjusted to 1.25 × 10 ⁶ ce 11 s / ml with PBS, and 100 μl of each was spread on a 96 we 11 plate. Further, this CTL was diluted with the complete culture solution twice in each column with 8 we11 as one column.

前記 （3) で培養した RL 1細胞または P 815細胞 （夕ーゲット細胞） を RPMI培地で洗浄し、 5 X 10⁴ c e 11 s/m 1にそれそれ調製した。 この 細胞液を 100〃 1ずつエフェクター細胞の入っている we 11にまいた。 この 結果、 E/T (エフェクター細胞/夕一ゲッ ト細胞） 比が 25 : 1、 12 : 1、 6 : 1、 3 : 1、 1. 5 ： 1になった。 この状態で 4時間培養して、 培養上清中 に遊離した⁵¹ C rをァ—カウン夕一で測定した。測定された⁵¹ C rの量から細胞 傷害活性を計算した。 The RL1 cells or P815 cells (evening get cells) cultured in the above (3) were washed with RPMI medium and adjusted to 5 × 10 ⁴ ce 11 s / m 1. This cell solution was spread on we11 containing the effector cells in an amount of 100 μl each. As a result, the E / T (effector cells / evening get cells) ratio was 25: 1, 12: 1, 6: 1, 3: 1, 1.5: 1. In this state, the cells were cultured for 4 hours, and ⁵¹ Cr released into the culture supernatant was measured overnight. The cytotoxic activity was calculated from the measured amount of ⁵¹ Cr.

結果を図 5に示す。 図中、 〇が RL 1細胞をターゲット細胞とした結果であ り、 翁が P815細胞を夕ーゲット細胞とした結果である。 RL 1を夕一ゲッ ト細胞とした場合、 E/T比につれて細胞傷害活性が大きな値となり、 RL l a を特異的に攻撃する C T Lが強く誘導されたことが分かった。 すなわち、 静注を 2回行う免疫法により白血病に対して全身性の防御免疫能が獲得されることが考 えられる。 産業上の利用の可能性 Fig. 5 shows the results. In the figure, 〇 indicates the result of using RL1 cells as target cells, and Okina indicates the results of using P815 cells as evening get cells. When RL 1 was used as the overnight get cell, the cytotoxic activity became larger as the E / T ratio increased. It was found that CTLs that specifically attack CTLs were strongly induced. In other words, it is conceivable that systemic protective immunity against leukemia is obtained by immunization with two intravenous injections. Industrial applicability

本発明の融合蛋白質は、 マラリアのような外来抗原を液性免疫応答と細胞性免 疫応答の両者により排除するので、 治療または予防の効果が高い。 また、 癌のよ うな内在性抗原が原因となる疾患についても、 人為的に該内在性抗原に特異的な C T Lを誘導し、 治療または予防することができる。  Since the fusion protein of the present invention eliminates foreign antigens such as malaria by both humoral immune response and cellular immune response, it has a high therapeutic or preventive effect. In addition, a disease caused by an endogenous antigen such as cancer can be artificially induced to induce or treat or prevent CTL specific to the endogenous antigen.

本発明では、 アジュバントにヒ一トショック蛋白質の A T P a s e ドメインを 含む蛋白質を使用するので、 8アミノ酸残基からなるぺプチドを該アジュバント に封入することが可能である。 これは人工的なアジュバントでは不可能なことで ある。また。人工的アジュバントを使用する場合に比して、体内での代謝がなく、 抗原提示細胞以外の細胞に取り込まれることがなく、 体内に蓄積されることもな い。 したがって、 投与した融合蛋白質が有効に作用しなかったり、 副作用を生じ たりすることがない。 また、 該融合蛋白質は保存性にも優れる。 さらに、 本発明 で用いるアジュバントは T h 1タイプの細胞を活性化するので、 マクロファージ が活性化され、 感染した原虫がマクロファージによって消化される。 これにより 原虫による感染症が効果的に治療される。 また、 T h 1タイプの細胞の活性化に より C T Lの活性が維持される。  In the present invention, since a protein containing the ATPase domain of a heat shock protein is used as an adjuvant, a peptide consisting of 8 amino acid residues can be encapsulated in the adjuvant. This is impossible with artificial adjuvants. Also. Compared to using an artificial adjuvant, there is no metabolism in the body, no uptake by cells other than antigen presenting cells, and no accumulation in the body. Therefore, the administered fusion protein does not work effectively and does not cause any side effects. Further, the fusion protein is excellent in storage stability. Furthermore, the adjuvant used in the present invention activates Th1 type cells, so that macrophages are activated and infected parasites are digested by macrophages. This effectively treats protozoal infections. In addition, CTL activity is maintained by activating Th1 type cells.

本発明の融合蛋白質は大腸菌等の宿主に発現させることが可能であり、 作製が 容易である。  The fusion protein of the present invention can be expressed in a host such as Escherichia coli and is easy to prepare.

本発明の蛋白質を静注することにより、 疾患に対して全身性の防御免疫能が獲 得される。  By intravenously administering the protein of the present invention, systemic protective immunity against disease can be obtained.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

1. 細胞傷害性 T細胞が認識する C T Lェピト一プを含むぺプチド及びヒート ショック蛋白質の ATPas eドメインを含む蛋白質とから成る融合蛋白質。1. A fusion protein consisting of a peptide containing a CTL peptide recognized by a cytotoxic T cell and a protein containing an ATPase domain of a heat shock protein.

2. ヒートショック蛋白質が、 Hsp70蛋白質もしくは Hsp70. 1蛋白 質または Hs c 70蛋白質である、 請求の範囲第 1項に記載の融合蛋白質。 2. The fusion protein according to claim 1, wherein the heat shock protein is an Hsp70 protein, an Hsp70.1 protein, or an Hsc70 protein.

3. ヒートショック蛋白質の ATPa s eドメインを含む蛋白質が以下の（ 1 ) から （5) に記載の蛋白質から選択される何れかの蛋白質である、 請求の範囲第 2項に記載の融合蛋白質：  3. The fusion protein according to claim 2, wherein the protein containing the ATPa se domain of the heat shock protein is any protein selected from the following proteins (1) to (5):

(1)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (1) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,

( 2 )配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列の 1番目の Metから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (2) a protein consisting of the amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,

(3)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (3) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,

(4)配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質、  (4) a protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,

(5)配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目の Me tから 385番 目の S e rまでのアミノ酸配列からなる蛋白質。  (5) A protein consisting of an amino acid sequence from the first Met to the 385th Ser of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.

4. 細胞傷害性 T細胞が認識する CTLェピト一プが、 マラリア原虫が発現し ている C T Lェピトープである、 請求の範囲第 1項から第 3項の何れか 1項に記 載の融合蛋白質。  4. The fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the CTL epitope recognized by the cytotoxic T cell is a CTL epitope expressing malaria parasite.

5. 細胞傷害性 T細胞が認識する CTLェピトープを含むペプチドが、 配列表 の配列番号 6から配列番号 10のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、 請求 の範囲第 4項に記載の融合蛋白質。  5. The fusion protein according to claim 4, wherein the peptide containing a CTL epitope that is recognized by cytotoxic T cells has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.

6. 細胞傷害性 T細胞が認識する CTLェビトープが、 腫瘍における C TL ピトープである、請求の範囲第 1項から第 3項の何れか 1項に記載の融合蛋白質。 6. The fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the CTL ebitope recognized by cytotoxic T cells is a CTL pitope in a tumor.

7 . 細胞傷害性 T細胞が認識する C T Lェピトープを含むぺプチドが配列表の 配列番号 1 1から配列番号 6 1のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、 請求 の範囲第 6項に記載の融合蛋白質。 7. The fusion according to claim 6, wherein the peptide containing a CTL peptide that is recognized by cytotoxic T cells has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 61 in the sequence listing. protein.

8 . 有効成分として請求の範囲第 1項から第 7項の何れかに記載の融合蛋白質 を含む医薬組成物。  8. A pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of claims 1 to 7 as an active ingredient.

9 . 請求の範囲第 1項から第 7項の何れかに記載の融合蛋白質をコ一ドする D NA。  9. A DNA encoding the fusion protein according to any one of claims 1 to 7.

1 0 . 請求の範囲第 1項から第 7項の何れかに記載の融合蛋白質をコードする D N Aを含む発現ベクター。  10. An expression vector containing DNA encoding the fusion protein according to any one of claims 1 to 7.

1 1 . 請求の範囲第 1 0項に記載の発現ベクターを保持する形質転換体。  11. A transformant carrying the expression vector according to claim 10.