WO2000011193A1 - Novel proteases and dnas encoding the same - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a novel protease and a DNA encoding the protease.
- the present invention relates to a novel virus which imparts infectivity to a virus belonging to the orthomyxoviridae or paramyxoviridae family, such as hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus, which cleaves the virus in a limited manner.
- the present invention relates to a protease, a DNA encoding the protease, a recombinant DNA vector comprising the DNA, a host transformed with the recombinant DNA vector, a method for producing the protease, and uses of the protease.
- Magglutinin and Sendai virus F protein exist in a precursor form after release and do not fuse with the host cell membrane as they are, so progeny viruses are not infectious.
- progeny viruses can acquire infectivity to host cells when these coat proteins are cleaved exclusively by host-derived proteases and fuse with the host cell membrane [Scheid, A. and Choppin, PW (1974) Virology, 57, 475-490; Boycott, R. et al. (1994) Virology, 203, 313-318].
- Such a protease is also called a virus-activating protease because it imparts infectivity to a virus.
- a virus-activating protease that activates Sendai virus has been purified from Clara cells of rat bronchiolar epithelium (Kido, H., (1992) Journal of Biological Chemistry, 26, 13573-13579). .
- the primary structure of this protease has not been elucidated.
- the above substances that inhibit protease activity are a new type of virus infection prevention It is thought that it can be an agent.
- the rat communicates;
- the virus-activating protease was purified from natural influenza virus host animals, and the protease was purified so as to be more preferably used as a means for searching for a human virus infectious disease preventive agent. It was desired to obtain a gene to be loaded.
- the present invention relates to a protein comprising, in a molecule thereof, an amino acid sequence represented by amino acids Nos. 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, and having a virus-activating protease activity; or
- the present invention relates to a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted, and having a virus-activating protease activity.
- the protein contains an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the molecule, and has a virus-activating protease activity.
- the substrate that can be cleaved by the virus-activating protease activity is preferably a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae (particularly preferably, the hemagglutinin of influenza virus or the FGF of Sendai virus). (Protein).
- the protein of the present invention is preferably derived from an animal that can be naturally infected with influenza virus.
- the most preferred protein of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a transformed E. coli E.co1ipTC32-l5A SANK72.
- FERMBP-6466 is a protein having an amino acid sequence encoded by DNA inserted into the plasmid carried by FERMBP-6466.
- the present invention also relates to a DNA encoding a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity.
- the DNA of the present invention contains the sequence number of the sequence listing in the molecule. No. 1 comprising a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 828 of nucleotide No. 1 or a nucleotide sequence which hybridizes with the DNA under stringent conditions and encodes a protein having a virus-activating protease activity This is the feature of this DNA.
- a substrate which can be cleaved by a virus-activating protease activity of a protein consisting of an amino acid sequence encoded by the DNA is a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae (particularly preferably, Influenza virus (hemagglutinin or Sendai virus F protein) is preferred.
- Most preferred as the DNA of the present invention is a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in the molecule of SEQ ID NO: 1 from nucleotide number 1 to 828 in the molecule or transformed E. colip TC32-1. 5 A SANK 7 2 2 9 8 (F ERM BP—6466) This is the DNA inserted in the plasmid held.
- the present invention further relates to a recombinant DNA vector containing the above DNA and a host cell transformed with the recombinant DNA vector.
- a transformed host cell the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, dated August 19, 1999 (Heisei 19) Escherichia coli E. colip TC32- 15A SANK 72298 (Accession No. FERMBP-6646) deposited internationally.
- the present invention relates to a method for producing a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity, and an antibody that specifically binds to the protein.
- the present invention relates to a method for testing the effect of a compound or composition sample as a prophylactic agent for viral infection, comprising: a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity; a substrate capable of specifically cleaving the protein. And a test sample, and then detecting the activity of the test sample to inhibit cleavage of the substrate by the protein, and the virus-activated protease for the method. It relates to the use of proteins having activity.
- the present invention provides a novel protein having a virus-activating protease activity, a DNA encoding the protein, a recombinant vector containing the DNA, a host cell transformed with the vector, a method for producing the protein, and a use thereof. And an antibody that specifically binds to the protein.
- the present inventors purified a novel protein having a virus-activating protease activity from pig, which is a natural host of influenza virus, and confirmed that the novel protein had a virus-activating protease activity. Further, the present inventors have cloned cDNA encoding the novel protein, succeeded in elucidating the entire primary structure of the novel protein, and completed the present invention.
- virus-activating protease activity refers to the recognition of a specific structure in a viral coat protein and the recognition of the specific structure only at that recognition site (when a plurality of recognition sites exist in one molecule, (At each position) refers to the activity of cleaving the coat protein to cause the coat protein to express a fusion activity to animal cell membranes, and consequently bring the virus into a state capable of infecting a host.
- the “virus” is preferably a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae, and more preferably is influenza virus or Sendai virus.
- a substrate that is cleaved by the virus-activated protease activity of the protein of the present invention is an orthomyxovirus characterized by expressing a membrane fusion activity with a host cell by the cleavage.
- the present invention is not limited thereto, but is not limited to hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus.
- the protein of the present invention includes, for example, a protein having an activity of restricting the coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae from a tissue such as animal lung or a cultured animal cell line, to a known protein. It can be obtained by performing isolation and purification using a combination of separation and purification means.
- a lung of a mammal to which the influenza virus can naturally infect particularly a tissue of a pig lung
- the present invention is not limited thereto, and other cells that can be isolated from a mammal to which the influenza virus can naturally infect.
- tissues or cell lines established from mammals that can be naturally infected with the influenza virus can be used.
- the protein of the present invention can be obtained by the method described below.
- a 25 mM potassium phosphate buffer pH 7.0 containing 2 liters of 0.15 M sodium chloride and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as “EDTA”) per 200 g of lung tissue. 5) Suspend uniformly in, and centrifuge. The precipitate after centrifugation was resuspended in 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing an equivalent amount of 1 M sodium chloride and 1% triton X-114, and centrifuged again.
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- the supernatant is fractionated by affinity chromatography using affinity chromatography resin Benzamidine Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia) column, and is subjected to the method described later in Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae.
- a fraction having an activity of cleaving the coat protein of a virus belonging to the viridae is collected.
- Whether the protein of the present invention obtained as described above has a virus-activating protease activity is determined by, for example, mixing a radiolabeled virus with the protein of the present invention, incubating the mixture, and then performing polyacrylamide gel electrophoresis. Detection can be performed by examining changes in the molecular weight and the like of the radiolabeled protein using such techniques.
- radiolabeled influenza virus can be prepared by the method described below. First, 1 x 10 6 cells Zm1 were seeded in a cell culture flask and the cell line MD CK (American Type Culture Collection (hereinafter referred to as "ATC Cj") CCL-34) was obtained from a dog kidney cell line. Incubate the cells at 37 ° C in the presence of 95% CO2 and 95% air at 37 ° C.
- MD CK American Type Culture Collection
- P BS (I) Dulbecco's phosphate buffered saline
- ACC VR— an influenza virus
- MEM-BA serum albumin
- the cells [3 H] - Darukosamin with (DuPont / New Englander Randonukurea one research pro ducts Co.) virus envelope protein incorporated may labeled compounds added with 1 m of 1 in MEM- BA and the like, 5% carbon dioxide And in the presence of 95% air at 37 ° C for 12 to 16 hours. After culturing, collect the culture supernatant and centrifuge at 2,500 rpm for 10 minutes. Collect the supernatant and centrifuge with a 30% sucrose solution dissolved in a 10 mM Tris-HCl ( ⁇ 7.4) solution containing 0.1 M sodium chloride and I mM EDTA (hereinafter referred to as “ ⁇ ”). Layer on tube.
- radiolabeled Sendai virus also uses LLC-1 MK2 (ATCC CCL-7) instead of MDCK as a host cell, and uses Sendai virus (ATCC VR-1) instead of influenza virus. 05) can be used.
- the radiolabeled virus thus prepared is reacted with the protein of the present invention, for example, at 37 ° C. for 3 to 12 hours in lO OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5). After separating the reaction products by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, perform fluorography to detect the radiolabeled bands before and after the reaction. Can be.
- as a substrate Boc- Gin- Ala- Arg- MCA
- the protein of the present invention was prepared at 37 ° C and 3 ° C in a reaction solution containing 0.1 mM of the synthetic peptide and 10 OmM tris-hydrochloride (pH 7.5) using the synthetic peptide represented by After incubation for 0 min, the production of 7-amino-4-methylcoumarin (7-amino-4-methylcoumarin), a degradation product of the synthetic peptide, is quantified using a fluorometer or the like (excitation wavelength: 370 nm, detection: By measuring the wavelength at 460 nm, the protease activity of the protein of the present invention can be measured.
- the method for detecting the protease activity of the protein of the present invention is not limited to these methods, and it is also possible to use other substrates that can cleave the protein of the present invention in a limited manner.
- Whether the viral coat protein cleaved into the protein of the present invention by the above method has the activity of fusing to the animal cell membrane can be determined, for example, by incorporating a radiolabeled compound in advance into erythrocytes isolated from animal peripheral blood.
- a test sample such as a synthesized compound or a secondary metabolite of a microorganism may coexist during a substrate cleavage reaction, and the test sample inhibits a protease activity of the protein of the present invention. By examining whether or not to do so, it is possible to evaluate or screen for a virus infection preventive agent.
- a substance having a high activity of specifically inhibiting the protease activity of the protein of the present invention and a low activity of inhibiting the activity of other proteolytic enzymes is used to prevent a new type of viral infection. It can be expected to be effective as an agent.
- the protein of the present invention can be used as a novel protease for limited cleavage of the protein.
- a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae is preferable, and further, hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus is more preferable.
- the limited cleavage activity of the coat protein possessed by the protein of the present invention is used.
- the N-terminal amino acid sequence of the protein of the present invention purified as described above was determined using an automatic protein amino acid sequencer (for example, Model 492, manufactured by PerkinElmer Japan, Inc., Applied Biosystems). Can be determined.
- an automatic protein amino acid sequencer for example, Model 492, manufactured by PerkinElmer Japan, Inc., Applied Biosystems.
- cDNA is synthesized using this as a type III, and from there, cDNA encoding the protein of the present invention is obtained.
- the animal cells serving as the source of the mRNA are preferably cells in porcine lung tissue, but cells or tissues that can be isolated from mammals, or other animal cell lines may be used. it can.
- guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method guanidine thiocyanate hot phenol method, guanidine hydrochloride method, etc. can be used, but guanidine acid thiocyanate phenol / mouth mouth form method
- (d T) Adsorb mRNA to the probe, capture the mRNA using streptavidin-bonded paramagnetic particles with streptavidin immobilized, and elute the mRNA after washing. Can be purified. Alternatively, a method in which mRNA is adsorbed onto an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified may be employed. Further, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. In order to confirm that the mRNA obtained as described above encodes a protein having virus-activating protease activity, it is necessary to translate mRNA into a protein and examine the enzyme activity. A method such as identifying the protein using an antibody specific to the protein can be used.
- mRNA can be injected into oocytes of Xenopus laevis and translated (Gardon, j. B. et al. (1972) Nature 233, 177-182), or available cell-free translation systems such as erythroid Ya co wheat germ system (Schleif, RF and Wensink, PC (1981):. "Practical methods in Molecular Biology", Springer - Verlag, NY) 0 was also obtained by the above method After converting single-stranded cDNA with reverse transcriptase using mRNA as type II, double-stranded cDNA can be synthesized from the single-stranded cDNA. The method includes the S1 nuclease method (Efstratiadis, A. et al.
- a plasmid vector may be used in addition to a lambda phage vector.
- any of the following various methods can be used. Can be adopted.
- PCR PCR
- type I DNA cDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription from mRNA of cells producing the protein of the present invention can be used.
- the DNA fragment prepared in this manner is labeled with 32 P, 35 S, or biotin, etc., and is used as a probe for cDNA library or genomic library by plaque hybridization or colony hybridization. Perform the screening in step 1 to select the desired clone.
- Plasmid self-replicating in which cDNA obtained as described above is inserted into an expression vector
- Transformants can be used to transform animal cell hosts with plasmids that contain the transcriptional promoter region, or can be integrated into the chromosome of animal cells.
- Antibody which specifically binds to the protein of the present invention, or measures the virus-activating protease activity in the culture supernatant or cell extract, and a secondary antibody against the antibody
- the strain having cDNA encoding the protein of the present invention is selected by detecting the presence of the protein of the present invention using the method described above.
- Commonly used cell lines such as COS and CHO can be used as animal cell hosts.However, in order to facilitate detection of the protein of the present invention as a foreign gene product, the host itself must be used under certain culture conditions. Preferably, the cells do not produce the protein of the present invention.
- cDNA obtained from the transformed strain is plotted on a nitrocellulose filter or a nylon filter to produce the protein of the present invention.
- the mRNA bound to the cDNA is dissociated and recovered.
- the recovered mRNA is translated into a protein by a protein translation system (for example, injection into oocytes of African alfalfa, or a cell-free system such as reticulocyte lysate or wheat germ of egrets), and the virus activity of the protein is carried out.
- the target strain is selected by examining the activating protease activity or by detecting using an antibody against a protein having the virus activating protease activity.
- the DNA encoding the protein of the present invention can be collected from the target transformant obtained as described above by a known method (Maniatis, T. et al. (1982): “Molecular Cloning A Laboratory”). Mannual “Cold Spring Harbor Laboratory, NY” (This can be performed. For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out a cDNA region from the plasmid DNA. Determination of the nucleotide sequence of the DNA obtained in this manner can be performed, for example, by the Maxa, AM and Gilbert, W. (1980): “Methods in Enzymology” 65, 499-559) or M13.
- Escherichia coli strain E.co 1 ip TC 32-l 5A SANK 7 229 8 is the industrial technology of 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, dated August 19, 1990. It has been deposited internationally with the National Institute of Bioscience and Biotechnology and has the accession number FERM BP-6646. Therefore, the gene encoding the protein of the present invention can be obtained from the strain.
- the fragment containing the gene encoding the protein of the present invention, cloned as described above, can be transformed into another prokaryotic or eukaryotic host cell by incorporating it into an appropriate vector DNA.
- prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. (Baci l lus subti lis).
- the host cells are transformed with a plasmid vector containing replicons or origins of replication from species compatible with the host and regulatory sequences.
- the vector is preferably a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
- K12 strain and the like are often used as Escherichia coli, and pBR322 or pUC-based plasmid is generally used as a vector, but not limited thereto, and various known Both strains and vectors can be used.
- trp tryptophan
- lac ratatoose
- tac tryptophan 'lactose
- lipoprotein lpp
- any promoter can be used for production of the protein of the present invention.
- Bacillus subtilis for example, 207-25 strain is preferable, and as a vector, p TUB 228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) or the like is used. It is not limited to this. Extracellular secretory expression is also possible by ligating a DN ⁇ sequence that encodes the signal peptide sequence of ⁇ -amylase of Bacillus subtilis as a promoter.
- Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast.
- vertebrate cells include monkey C ⁇ S cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCCCRL-165) and Chinese 'hamster ovary cells (CHO cells, ATCCCCL-61) deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, A. (1980) Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) and the like are often used, but are not limited thereto.
- a vertebrate cell expression promoter one having a promoter located upstream of a gene to be normally expressed, an RNA splice site, a polyadullation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. May have a replication origin if necessary.
- An example of the expression vector is p SV 2 dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) having the initial promoter of SV40.
- the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in the COS cell, and has a transcription promoter and a transcription termination.
- the expression vector is prepared by the following method: getylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), and calcium phosphate-DNA coprecipitation method ( Graham, F. Shi and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse drilling (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845)
- the cells can be incorporated into cells, and thus desired transformed cells can be obtained.
- a vector capable of expressing the neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and p SV 2-neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341)
- pRSVneo Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY
- p SV 2-neo Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341
- insect cells are used as host cells, cell lines derived from ovarian cells of Spodoptera frugiperda (S f — 9 or S f — 21) of Lepidoptera, Noctuidae,
- High Five cells derived from Trichoplusia ni egg cells (Wickham, TJ et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396) is often used as a host cell, and the baculo-mouth virus transfer vector uses the polyhedrin protein promoter of the autographa nucleopolyhedrovirus (AcNPV) as a vector.
- AcNPV autographa nucleopolyhedrovirus
- VL1392 / 1393 is frequently used (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors.Applied Biochemistry and
- yeast is generally well known.
- yeast of the genus Saccharomyces for example, baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable.
- expression vectors for eukaryotic microorganisms such as the yeast include, for example, a promoter for an alcohol dehydrogenase gene.
- a secretory signal sequence for ⁇ -fatase of yeast and the cleavage site of ⁇ X2 protease in petroleum yeast are located at the N-terminal side. It is known that activated tryptase is secreted into the medium by tether expression (Andrew, and Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131).
- the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the protein of the present invention intracellularly or extracellularly.
- the medium to be obtained can be appropriately selected from those commonly used depending on the host cell used.
- RPMI164 medium or Dulbecco's modified Eagle medium hereinafter referred to as “DMEM”.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
- serum components such as fetal serum as needed
- the recombinant protein produced in the cells of the transformant or extracellularly by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical properties and chemical properties of the protein. it can.
- Examples of the method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, and the like. Examples include various liquid chromatography such as chromatography (HPLC), dialysis, and combinations thereof. Further, by adding histidine consisting of 6 residues to the recombinant protein to be expressed, it is possible to efficiently purify the protein with a nickel affinity column. By combining the above methods, the protein of the present invention can be easily produced in high yield and high purity in large quantities.
- the amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing be used. It is not necessary to have all of the amino acid sequences of, for example, a partial sequence thereof, as long as it shows a virus-activating protease activity, those amino acid sequences are also included in the protein of the present invention. . Further, DNAs encoding the protein are also included in the present invention.
- a protein having a virus-activating protease activity examples include a protein consisting of 245 amino acids having an isoleucine residue at amino acid number 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as the N-terminus.
- a DNA encoding the protein can also be exemplified as the DNA in the present invention.
- it is a DNA consisting of a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 91 to 825 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
- eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism, as is known from the interferon gene (see, for example, Ni shi, T. et al. (1985) J. Biochem.
- All such proteins are included in the present invention as long as they have virus-activating protease activity. Further, all DNAs encoding these proteins and having the same nucleotide sequence are also included in the present invention. Such various DNAs of the present invention can be prepared, for example, by the phosphite triester method based on information on the protein having the virus-activating protease activity.
- the codon corresponding to the desired amino acid may be selected arbitrarily. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used. (Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174). Further, partial modification of these nucleotide sequence codons may be carried out by a conventional method using a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification.
- site-specific mutagenesis using a primer consisting of nucleotides site-specific mutagenes is / Mark, DF et al. (1984) Pro Natl. Acad. ⁇ Ci. USA 81, 5662-5666).
- site-specific mutagenes is / Mark, DF et al. (1984) Pro Natl. Acad. ⁇ Ci. USA 81, 5662-5666.
- a method in which DNA is trimmed from the end using exonuclease Ba131 (Kishimoto Toshimitsu et al.
- cassette mutation method Toshimitsu Kishimoto, “Newborn Chemistry Laboratory Lecture 2 • Nucleic Acid III Recombinant DNA Technology” 242-251) There is a monkey.
- Whether or not a certain DNA hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in nucleotide Nos. 91 to 85 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is determined by, for example, random primer method (Anal Biochem., 132: 6013 (1983)) and the nick translation method (Maniatis, T. et al. (1982) in "Molecular oning A Laboratory Mannua”) and old Spring Harbor.
- DNA used for hybridization is adsorbed on a known method, for example, a nitrogen film or a nylon film, and solidified by heating or irradiation with ultraviolet light.
- the membrane is then immersed in a prehybridization solution containing, for example, 6 XSSC, 5% Denhardt's solution and 0.1% sodium dodecyl sulfate (hereinafter “SDS”) at 55 ° C. Keep warm for at least 4 hours.
- SDS sodium dodecyl sulfate
- Examples of the antibody that specifically binds to the protein of the present invention include a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention.
- the method for obtaining the monoclonal antibody is as described below. In the production of monoclonal antibodies, the following working steps are generally required. That is,
- myeloma preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma");
- the protein of the present invention or a part thereof prepared by the method described above can be used. Furthermore, since the primary structure of the protein of the present invention has been elucidated by the present invention, a partial peptide of the protein of the present invention is chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art, and this is used as an antigen. You can also. (b) Preparation of antibody-producing cells
- the antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or Rimiyodiban, and the animal is immunized as an immunogen.
- an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or Rimiyodiban
- a mouse is most preferably used as an experimental animal, but is not limited thereto.
- the method of immunogen administration for mouse immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or several times at appropriate intervals (preferably at intervals of 1 to 5 weeks). Thereafter, the antibody titer to the antigen in the serum of the immunized animal is measured, and the effect of the subsequent operation can be enhanced by using the animal having a sufficiently high antibody titer as a source of the antibody-producing cells. Generally, it is preferable to use antibody-producing cells derived from an animal 3 to 5 days after the final immunization for subsequent cell fusion.
- the methods for measuring antibody titer used herein include radioisotope immunoassay (hereinafter referred to as "RIA”), solid-phase enzyme immunoassay (hereinafter referred to as "ELISA”), and fluorescent antibody
- RIA radioisotope immunoassay
- ELISA solid-phase enzyme immunoassay
- fluorescent antibody There are various well-known techniques such as the reactive hemagglutination method and the passive hemagglutination method.
- the RIA method or the ELISA method is more suitable in terms of detection sensitivity, rapidity, accuracy, and possibility of automation. is there.
- the measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method.
- the purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid surface on which the antigen is not adsorbed is exposed to a protein irrelevant to the antigen, for example, periplasmic albumin (hereinafter referred to as “ After washing the surface, the sample is contacted with a serially diluted sample (for example, mouse serum) as the first antibody, and the monoclonal antibody in the sample is bound to the antigen.
- a serially diluted sample for example, mouse serum
- an antibody against an enzyme-labeled mouse antibody is added as a second antibody to bind to the mouse antibody.
- a substrate of the enzyme is added, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured, thereby obtaining an antibody titer. Is calculated.
- mice As myeloma, cell lines generally obtained from mice, for example, 8-azaguanine-resistant mice (derived from BALB / c) myeloma strain P3X63Ag8U.1 (P3-111) and elton, DE et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3 / NSI / l_Ag4-1 (NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], Sp2 / 0—Agl4 (SP-2) [Shulman, M. et al.
- DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
- a normal medium eg, an ASF104 medium containing 10% FCS Ajinomoto subcultured Co., Ltd.
- Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any part of an individual, such as spleen, lymph node, peripheral blood, or a combination thereof as appropriate. Splenocytes are most commonly used. After the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is excised from a mouse having a predetermined antibody titer, and spleen cells as antibody-producing cells are prepared. Currently, the most commonly used means for fusing the spleen cells with the myeloma obtained in step (c) is polyethylene glycol, which has relatively low cytotoxicity and simple fusion. This is a method using a file. This method includes, for example, the following procedure.
- the spleen cells and myeloma are thoroughly washed with a serum-free medium (eg, RPMI 164) or phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”), and the ratio of spleen cells to myeloma is 5: 1 to 10: Mix to about 1 and centrifuge. After removing the supernatant and thoroughly loosening the precipitated cell group, 1 ml of 50% (w / v) serum-free medium containing polyethylene glycol (molecular weight: 1,000 to 4,000) is added dropwise with stirring. Then, slowly add 10 ml of serum-free medium and centrifuge.
- a serum-free medium eg, RPMI 164
- PBS phosphate buffered saline
- HAT normal medium
- HAT hypoxanthine / aminopterin ′ thymidine
- IL-12 mouse interleukin-12
- the myeloma cell is an 8-azaguanine-resistant strain, that is, a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) -deficient strain
- HGPRT hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase
- the unfused myeloma cell and the myeloma cell are fused. Cells cannot survive in HAT containing media.
- fusion cells between antibody-producing cells or hybridomas between antibody-producing cells and myeloma cells can survive, but a fusion cell between antibody-producing cells has a life span.
- the hybridomas can be selected.
- replace the medium with a medium in which aminopterin has been removed from the HAT medium hereinafter referred to as “HT medium”.
- HT medium a medium in which aminopterin has been removed from the HAT medium
- a part of the culture supernatant is collected, and the antibody titer is measured, for example, by ELISA.
- the method using an 8-azaguanine-resistant cell line has been described above. Cell strains can also be used depending on the method of selecting the hybridoma, in which case the composition of the medium used will also vary.
- the Cloung method includes a limiting dilution method in which a single well of a plate is diluted so that one hybridoma is contained therein, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a microagar method.
- a method of removing and culturing individual cells by a duplicater and a ⁇ Sotak port '' that separates one cell by a cell sorter are available, but the limiting dilution method is simple and often used.
- the cloned hybridomas are cultured by replacing the medium with HT medium and normal medium.
- Large-scale cultivation is performed by rotary culture using large culture bottles or spinner culture.
- a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained.
- ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by growing the hybridoma in the peritoneal cavity of a mouse of the same strain (for example, BALB / c) or a Nu / Nu mouse. Can be.
- a commercially available monoclonal antibody purification kit for example, MabTrapGil kit; manufactured by Pharmacia
- the monoclonal antibody thus obtained has a high antigen specificity to the protein of the present invention.
- the Octel method is simple, but requires concentration when the concentration of monoclonal antibody is low.
- the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and the antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as the secondary antibodies. It is possible to identify the isotypes and subclasses of As a simpler method, a commercially available identification kit (for example, mouse type kit; manufactured by Biorad) can be used.
- the thus obtained monoclonal antibody of the present invention can be used for detection, separation and purification of the protein of the present invention utilizing its specificity.
- FIG. 1 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of purified protease.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of a Sendai virus coat protein cleavage product using a purified protease.
- FIG. 3 is a construction diagram of a recombinant baculovirus expression vector.
- FIG. 4 is a diagram showing the activity of a recombinant protein to cleave a synthetic peptide substrate.
- FIG. 5 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide electrophoresis of a cut product of an influenza virus and Sendai virus coat protein by a recombinant protein.
- Pigs obtained from the Tokushima Municipal Meat Center are decapitated by decapitation, and fresh pig lungs from which fat has been removed are cut into approximately 1 cm squares using scissors.
- 20 Og weight 0.1 25 ⁇ lM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 5M sodium chloride and 1mM EDTA (pH 7.5) Suspend uniformly in 2 liters, 1000 x Xg, 15 min, 4 ° C And centrifuged. The precipitate obtained after centrifugation is resuspended in 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing an equal volume of 1 M sodium chloride and 1% triton X-114, and the solution is added again.
- the mixture was centrifuged at 00 X g for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant was collected.
- the supernatant is passed through Benzamidine Sepharose 6B (Pharmacia, column size ⁇ 24 x 60 mm, bed volume 25 m1), and 5 OmM potassium phosphate containing 0.5 M sodium chloride Wash the column with buffer (pH 7.5) and then with 5 OmM sodium acetate buffer (pH 7.5) containing 0.5 M sodium chloride, then wash with 25 mM benzamidine and 0.5 M chloride. Elution was carried out with 5 O mM sodium acetate buffer (pH 7.5) containing sodium.
- MEM Minimum essential medium 1 m 1 per 1 X 1 containing 1 0% ⁇ shea serum 0 6 L
- the culture flask was tilted every 10 to 15 minutes, and the virus solution was spread over the entire bottom surface in the flask. Thereafter, the cells are washed 5 times with MEM-BA, and [ 3 H] -labeled 1-dalcosamine (DuPont / New-England Nuclear Research Products) 3.7 ml of MEM containing 7 MB q BA was placed in a flask and cultured at 37 ° C. for 12 to 16 hours in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. After the culture, the culture solution was collected and subjected to centrifugation at 250 rpm at 4 ° C. for 10 minutes.
- the centrifuged supernatant was layered in a centrifuge tube (13 PA tube ( ⁇ 1.5 x 9.6 cm, manufactured by Hitachi, Ltd.)) containing an NTE solution containing 30% sucrose. After filling the vacant portion with NTE, ultracentrifugation was performed at 390 rpm at 60 ° C for 60 minutes, and the precipitate was adjusted to 100 000 dpm / j1.
- the suspension in NTE was used as a 3 H-labeled Sendai virus sample 1 ⁇ l of the 3 H-labeled Sendai virus and the protein purified in Example 1 (10 to 30 ⁇ g / m 2).
- Vero cells (ATCC No. CRL—15686) confluently grown in a cell culture dish with a diameter of 100 mm in MEM containing 0.42% serum albumin ) Is infected with influenza virus A / P RZ8 / 34 at moi of about 10. Incubate at 37 DC for 6 hours in 95% air with 5% carbon dioxide. After culturing, the cells are collected from the Petri dish, washed well with PBS containing 0.4% 2% serum albumin (hereinafter referred to as “PBS-BA”) at 4 ° C, 3000 rpm, and centrifugation for 5 minutes.
- PBS-BA PBS containing 0.4% 2% serum albumin
- HA0 influenza virus coat protein Magglutinin 0
- Example 3 DNA cloning
- the N-terminal amino acid sequence of the protein purified in Example 1 was analyzed using a gas-phase automatic protein amino acid sequencer (Model 492, manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
- poly (A) + RNA Isolation of poly (A) + RNA was performed by extraction of total RNA by guanidine acid thiocyanate phenol-chloroform method, a biotinylated oligo (dT) probe and avidin-immobilized magnet particles (polyATtract mRNA isolation system, The purification was performed by poly (A) + RNA purification using Promega. Specifically, the following procedure was performed. Minipigs weighing 38 kg (CSK Research Park Co., Ltd.) were anesthetized, and the lungs were immediately removed after removal of the lungs and frozen in liquid nitrogen.
- the lysate was centrifuged at 12000 ⁇ g at 4 ° C. for 15 minutes, and the aqueous phase was recovered. 8 volumes of isopropanol were added and stirred, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. This was centrifuged at 12,000 X g at 4 ° C for 10 minutes, and the recovered precipitate was stirred with 75% ethanol, and then centrifuged at 7500 X g at 4 ° C for 5 minutes to collect the precipitate. The obtained precipitate was dissolved in distilled water to obtain an amount equivalent to about 4.4 mg of the total RNA of the miniature pig lung.
- RNA solution (equivalent to 2.6 mg as RNA, 2.43 ml) obtained in this way was heated at 65 ° C for 10 minutes, and then a 50 pmo1 / ⁇ 1 biotinylated oligo (d T) Probes Add 10 ⁇ l and 60 1 of 20 XSSC (3-sodium chloride, 0.3-sodium citrate, ⁇ -7.0), mix gently, and let stand to room temperature. Then, streptavidin-immobilized magnet particles equilibrated with 0.5 XSSC were added, and poly (A) + RN ⁇ was bound by binding of biotin-streptavidin. Captured by magnet particles.
- the preparation of the cDNA library was performed using a ZAP-cDNA synthesis kit manufactured by Stratagene. That is, the poly (A) + RNA (equivalent to 5 ⁇ g) prepared in 2) above and 75 units of Moroni murine leukemia virus-derived reverse transcriptase were added to a reaction mixture of 501 (1X first strand buffer, 0 ⁇ l). Reaction at 37 ° C for 1 hour in 6 mM dATP, dGTP, dTTP, 0.3 mM 5-methyl dCTP, 2.8 ⁇ g Xhol linker primer (attached to the kit) I let it.
- reaction solution 451 add 20 / X1 buffer solution for second strand synthesis, 6 ⁇ l dNT ⁇ mixture for second strand synthesis (1 OmM dATP, dGTP, dTTP, 26 mM dCTP ), 1 1 4 1 sterile water, 2 1 [ 32 P] d GTP (29.6 TB q / mmol), add 3 units of ribonuclease H and 100 units of DNA polymerase I (or more (All attached to the kit) and reacted at 16 ° C for 2.5 hours.
- ethanol precipitation After washing the precipitate in step 1, it was dried under reduced pressure (hereinafter, the same operation is referred to as “ethanol precipitation”).
- the obtained precipitate was dissolved in 9 ⁇ l of Eco RI adapter solution (0.4 ⁇ g / ⁇ 1) by allowing to stand at 4 ° C for 30 minutes or more.
- a buffer solution, 10 mM rATP, 4 units / ⁇ 4 DNA ligase (attached to the kit) was added, and the mixture was allowed to react at 4 ° C. for 2 days, whereby an EcoRI adapter was linked.
- the ligase was then inactivated by heating at 70 ° C for 30 minutes.
- the reaction solution is returned to room temperature, and 11 of 10X ligase buffer, 2 ⁇ l of 10 mM rATP, 6 ⁇ l of distilled water, 1 ⁇ l ⁇ 4 polynucleotide kinase (10 units / 1, (Attached to the kit), and react at 37 ° C for 30 minutes.
- the T4 polynucleotide kinase was inactivated by heating for minutes.
- add 3 1 1 1 (40 units /; ul, attached to the kit) of 3 / ⁇ 1 supplementary buffer solution for 281 Xho I reaction and add the buffer at 37 ° C. Digested for 5 hours.
- the eluate was collected at 1 ⁇ , the sixth and seventh fractions were combined, phenol / chloroform extraction was performed, and then ethanol precipitation was performed. Dissolve the resulting precipitate in 3.5 ⁇ l of sterile water, and add 1 ⁇ l of Uni-ZAP XR vector (equivalent to 1 / g as DNA, attached to kit) to 2.5 ⁇ l, ⁇ 5 ⁇ l of 10 X ligase buffer, 0.5 ⁇ l of 1 mM rATP (pH 7.5), 0.5 / zl of T4 DNA ligase (4 units // ⁇ ) ) (Attached to the kit) and reacted at 4 ° C for 2 days.
- a packaging reaction was performed by adding the whole reaction solution (5 ⁇ l) to Gigapack III Gold Packaging Extract Extract (attached to the kit) and keeping the mixture at 22 ° C for 2 hours. Then, add 500 mM 1 and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, hereinafter referred to as “SM buffer”) containing 100 mM sodium chloride, 8 mM magnesium sulfate, and 0.01% gelatin. After adding 1 ⁇ l of form, the mixture was gently mixed and centrifuged to obtain a supernatant (primary library), which was stored at 4 ° C. Next, the titer of the obtained primary library was determined by the method described below. First, the E.
- the titer of the primary library obtained was 1.37 ⁇ 1 ⁇ 6 plaque formation Units (hereinafter referred to as “pfu”). Since the primary library one is generally unstable, 1 X 1 0 a 6 pfu equivalent of primary library one to recover what was amplified by infecting again E.coli in a manner similar to that described above, mini-pig lung c DNA library Got one.
- r represents g or a
- y represents t or c
- n represents a or c or g or t, respectively.
- the phosphoramidite method (Matteucci, MD and Carut hers, MH (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191).
- Oligonucleotide synthesis was performed using an automatic DNA synthesizer (Model 392, PerkinElmer Japan Applied Biosystems) according to the manual. After the synthesis, the oligonucleotide is cleaved from the support and deprotected, and the oligonucleotide is purified from the recovered solution using a cartridge for oligonucleotide purification (Perkin Elmer I. Japan Applied Biosystems). did. Oligonucleotides eluted from the cartridge with 20% acetonitrile were freeze-dried and powdered, dissolved in distilled water, and stored frozen at 120 ° C until use.
- nucleotide sequence encodes a part of the N-terminal amino acid sequence (amino acid numbers 2 to 40 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) obtained in 1) above.
- the plasmid derived from the clone obtained in 6) above was digested with the restriction enzyme Ec0RI, and the inserted DNA fragment (132 bp) was digested with an oligolabeling kit (Pharmacia). 32 P-labeled (Feinberg, AP and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6). Next, micro spin filled with gel filtration resin Unincorporated nucleotides were removed using a 3b column (Probe 'Quant G-50 microcolumn; manufactured by Pharmacia).
- the plaque-transferred nitrocellulose filter prepared in 7) above was washed with 2 OmM 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES), 0.8 M sodium chloride, 50% deionized formamide, 0% After incubation in a solution containing denatured salmon sperm DNA at 5% 303 and 100 g / m1 at 37 ° C for 2 hours (prehybridization), the cells were labeled with 32 P. added probe a 1 X 1 0 6 cp mZ filter first and so as, 37. For 12 to 18 hours (hybridization).
- PPES 1,4-piperazinediethanesulfonic acid
- a transformed Escherichia coli strain having a plasmid (PTC32-28) was inserted into the pBluescript phagemid vector and the desired cDNA was inserted. Obtained.
- These phagemid DNAs were digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to examine the length of the target cDNA.
- the target cDNA of both clones consisted of about 1. lkbp, and had a restriction enzyme XhoI cleavage site at about 400 bp from the 5 ′ end.
- This nucleotide sequence has an open reading frame consisting of 275 amino acids starting with methionine (hereinafter referred to as " ⁇ RF") and an untranslated region at the 3 'end of the ORF. Had a poly (A) chain. Furthermore, a homology search was performed on the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the ORF against the GenBank and EMBL DNA databases and the SWISS-PLOT protein database.
- the amino acid sequence encoded by the ORF of SEQ ID NO: 1 is derived from human mast cell tryptase (Miller, JS et. Al. (1990) J. Clin.
- the cDNA obtained in Example 3 was expressed to obtain a soluble protein.
- a region encoding a GP67 secretion signal sequence, a region encoding a six-residue histidine for affinity purification hereinafter referred to as "histidine 'tag"
- histidine 'tag a region encoding a six-residue histidine for affinity purification
- Plasmid DN ApTad VGP TC32 was extracted from the obtained transformant, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was confirmed.
- pTadvGPTC32 was digested with restriction enzymes BglII and EcoRI, and an 876 bp fragment containing the full length of the imported cDNA was isolated.
- Baculowi Lus transfer vector pAcGP67-B (Pharmingen) is digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI, dephosphorylated with allyl phosphatase, and then T4 DNA ligase.
- pGPTC32 plasmid DN DN was isolated from the resulting transformant, and this plasmid was named pGPTC32.
- pGPTC32 and Baculovirus DNA Baculovirus DNA (Baculogold: Pharmingen) were transfected into Sf9 cells (Invitrogen) to produce a recombinant baculovirus. That is, 3 ⁇ g of pGPTC32 and 0.5 ⁇ g of Bakuguchi Gold DNA were mixed, left at room temperature for 5 minutes, and then mixed with 1 ml of Transfection Buffer B (Pharmingen). ) was added.
- the culture supernatant containing the recombinant baculovirus was collected, and the cells were removed by centrifugation at 100 rpm at 4 ° C for 5 minutes. From this supernatant, a clone of the recombinant baculovirus expressing the desired protease was isolated by plaque formation. That is, 1.5 ⁇ 10 6 Sf9 cells were seeded on a tissue culture dish of 35 mm in diameter. After the cells were adsorbed to the dish (after 1 hour), the medium was removed, and 3 ml of TNM was newly added. — FH medium was added.
- the 1 0 3 to 1 0 5-fold serial dilutions of transfected Hue Kushiyon supernatant containing the recombinant baculovirus was prepared by TNM- FH medium, adding them diluted virus solution 1 0 0 1 the cell suspension Then, the cells were cultured at 27 ° C for 1 hour. Next, the supernatant was removed, and a solution in which equal amounts of 2% agarose (Agar plaque 'plus' agarose: manufactured by Pharmingen) and TNM-FH medium were mixed (pre-melted to obtain 45%) And kept at room temperature for 20 minutes to harden the agar mouth.
- 2% agarose Agar plaque 'plus' agarose: manufactured by Pharmingen
- TNM-FH medium was overlaid on agarose medium having different dilution ratios, and cultured at 27 ° C. for 4 to 5 days. After culturing, add 1 ml of 0.3% neutral red (Sigma) solution, cultivate at 27 for 3 hours, remove the overlaid medium, and place the dish upside down. Cultured 1 ⁇ . The viable cells are stained by this procedure, and the parts (plaques) from which the virus-infected cells have been killed and stained are removed using sterile Pasteur pipettes and agarose medium, and 500 ⁇ l of TNM-FH medium is added.
- the virus was eluted from the agarose medium by transferring it to a tube and leaving it at 4 ° C for 1 hour.
- the cloned recombinant baculovirus by repeatedly infecting S f 9 cells, to obtain a virus solution having a high ⁇ Irusuka number (1. 4 X 1 0 8 plaque forming units Zm 1 or higher).
- the protein contained in the band (1) contained the amino acid sequence immediately after the GP67 secretion signal sequence in the amino acid sequence encoded by the DNA inserted into pGPTC32: Ala-Asp-Leu -Gly-Ser (amino acid numbers 1 to 5 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing).
- the mature recombinant protein (10 ng) obtained in 2) above and 0.1 mM synthetic peptide substrate (Boc-Gin-Ala-Arg-MCA) were added to a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0). 4) and 0.5 mg gZml in a solution containing dextran sulfate. After incubation at room temperature for 0 to 30 minutes, 7-amino 4-methylcoumarin, a product of cleavage of the synthetic peptide substrate, was quantified using a fluorometer (excitation wavelength: 370 nm; detection wavelength: 460 nm). As a result, an increase in fluorescence was observed over time, confirming that the recombinant protein obtained in 2) above had protease activity (FIG. 4).
- Radiolabeled influenza virus and Sendai virus were prepared by the following method.
- Canine kidney-derived cell line MDCK (ATCC CCL-34) 1 ⁇ 10 6 cells / m 1 were seeded on a tissue culture dish (0.10 cm) and incubated in the presence of 5% CO 2 and 95% air. The cells were cultured at 7 ° C. Was washed with minimum essential medium the cells containing 0.2 1% ⁇ shea serum albumin (MEM- BA), aseptically prepared influenza virus (ATCC VR- 9 5, 1 0 7 plaque forming units
- radiolabeled Sendai virus is also used for influx using host cells and LLC-MK2 (ATCC CCL-17). It was prepared by using Sendai virus (ATCC VR-105) instead of Lenza virus. 1 ⁇ l of the radiolabeled virus solution prepared in this way and the mature recombinant protein obtained in 2) above were combined with 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and 0.5 mg / m After mixing in a solution containing 1 dextran sulfate (20 ⁇ l) and incubating at 37 ° C for 12 hours, the reaction products were separated by 13% SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
- the present invention provides a novel protease useful for searching for a virus infectious disease preventive agent and a novel test method for a viral infectious disease preventive agent using the protease.
- the present invention is useful for searching for a prophylactic agent for a viral infection such as influenza.
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Abstract
Novel proteins characterized by having a virus activation protease activity and DNAs encoding these proteins. More particularly, a protein characterized by containing in its molecule the amino acid sequence represented by the 1- to 245-positions in SEQ ID NO:2 in Sequence Listing and having a virus activation protease activity; or a protein characterized by containing in its molecule an amino acid sequence derived from the above amino acid sequence by addition, deletion or substitution of one or more amino acids and having a virus activation protease activity. Tests with the use of the activities of these proteins make it possible to search for preventives for viral infections such as influenza.
Description
明 細 書 Specification
新規プ口テア一ゼ及び該プ口テアーゼをコードする D N A [技術分野] TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel protease and a DNA encoding the protease.
本発明は、 ィンフルェンザウィルスのへマグルチニンあるいはセンダイウィル スの F蛋白質等のオルソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属する ウィルスの外被蛋白質を限定的に切断し、 ウィルスに感染性を付与する新規なプ 口テアーゼ、 該プロテアーゼをコードする D N A、 該 D N Aを含むことからなる 組換え D N Aベクタ一、 該組換え D N Aベクターで形質転換せしめた宿主、 該プ 口テアーゼの製造方法および該プロテアーゼの用途に関する。 The present invention relates to a novel virus which imparts infectivity to a virus belonging to the orthomyxoviridae or paramyxoviridae family, such as hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus, which cleaves the virus in a limited manner. The present invention relates to a protease, a DNA encoding the protease, a recombinant DNA vector comprising the DNA, a host transformed with the recombinant DNA vector, a method for producing the protease, and uses of the protease.
[背景技術] [Background technology]
オルソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するインフルエンザ ウィルスやセンダイウィルスは宿主細胞内で増殖し、 その子孫ウィルスを細胞外 へと放出するが、 その子孫ウィルスの外被蛋白質、 例えばインフルエンザウィル スのへマグルチニンやセンダイウィルスの F蛋白質は、 放出後は前駆体の形で存 在しており、 そのままでは宿主の細胞膜との融合を起こさないため子孫ウィルス は感染性を有しない。 これらの外被蛋白質が宿主由来のプロテアーゼに限定的に 切断され、 宿主細胞膜と融合することにより、 初めて子孫ウィルスは宿主細胞へ の感染性を獲得することができる [Scheid, A. and Choppin, P. W. (1974) Virology, 57, 475-490、 Boycott, R. et al . (1994) Virology, 203, 313 - 318] 。 このようなプロテアーゼを、 ウィルスに感染性を付与することからウイ ルス活性化プロテアーゼともいう。 これまでに、 ラッ ト細気管支上皮のクララ細 胞よりセンダイウィルスを活性化するウィルス活性化プロテアーゼが精製されて いる (Kido, H. , (1992) Journal of Biological Chemi stry, 26, 13573- 13579) 。 しかしながら、 このプロテアーゼの一次構造は明らかにされていな レヽ。 上記プロテアーゼ活性を阻害する物質は、 新しいタイプのウィルス感染症予防
剤となり得ると考えられる。 しかしながら、 ラッ トは通; Influenza viruses and Sendai viruses belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae multiply in host cells and release their progeny virus out of the cell. Magglutinin and Sendai virus F protein exist in a precursor form after release and do not fuse with the host cell membrane as they are, so progeny viruses are not infectious. For the first time, progeny viruses can acquire infectivity to host cells when these coat proteins are cleaved exclusively by host-derived proteases and fuse with the host cell membrane [Scheid, A. and Choppin, PW (1974) Virology, 57, 475-490; Boycott, R. et al. (1994) Virology, 203, 313-318]. Such a protease is also called a virus-activating protease because it imparts infectivity to a virus. To date, a virus-activating protease that activates Sendai virus has been purified from Clara cells of rat bronchiolar epithelium (Kido, H., (1992) Journal of Biological Chemistry, 26, 13573-13579). . However, the primary structure of this protease has not been elucidated. The above substances that inhibit protease activity are a new type of virus infection prevention It is thought that it can be an agent. However, the rat communicates;
ルスに感染しないので、 上記ラッ ト由来ウィルス活性化プロテアーゼとインフル ェンザウィルスが自然感染する動物であるヒ ト、 ブタ、 ゥマ、 ァザラシ、 ミン ク、 クジラ等のウィルス活性化プロテアーゼとの関連は不明であった。 したがつ て、 ヒ ト用のウィルス感染症予防剤の探索手段としてより好ましく利用できるよ う、 ィンフルェンザウィルスの自然宿主動物からウィルス活性化プロテア一ゼを 精製し、 また該プロテア一ゼをコ一ドする遺伝子を得ることが望まれていた。 Since the virus is not infected with the virus, the relationship between the above-mentioned rat-derived virus-activating protease and virus-activating proteases such as humans, pigs, horses, seals, mink, and whales that are naturally infected with the influenza virus is unknown. there were. Therefore, the virus-activating protease was purified from natural influenza virus host animals, and the protease was purified so as to be more preferably used as a means for searching for a human virus infectious disease preventive agent. It was desired to obtain a gene to be loaded.
[発明の開示] [Disclosure of the Invention]
本発明は、 分子中に配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1から 245に示され るアミノ酸配列を含み、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有することを特徴と する蛋白質、 または、 分子中に該アミノ酸配列の一つもしくは二つ以上のァミノ 酸が付加、 欠失もしくは置換されているアミノ酸配列からなり、 ウィルス活性化 プロテアーゼ活性を有することを特徴とする蛋白質に関する。 好ましくは、 該蛋 白質は分子中に配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 245に示されるアミ ノ酸配列を含み、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有するものである。 該ウイ ルス活性化プロテアーゼ活性により切断され得る基質は、 好ましくは、 オルソミ クソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの外被蛋白質 (特 に好ましくは、 ィンフルェンザウィルスのへマグルチニンまたはセンダイウィル スの F蛋白質) であることを特徴とするものである。 さらに本発明の蛋白質は、 ィンフルェンザウィルスが自然感染し得る動物由来であることが好ましい。 本発 明の蛋白質として最も好適なものは、 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 245に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質または形質転換大腸菌 E. c o 1 i p TC 3 2 - l 5A SANK 7 2 2 9 8 (F E RM B P— 646 6) が保持するプラスミ ドに揷入されている DN Aにコードされるアミノ酸配列を有 する蛋白質である。 本発明はまた、 上記ゥィルス活性化プロテア一ゼ活性を有する蛋白質をコード する DNAに関する。 好ましくは、 本発明の DNAは、 分子中に配列表の配列番
号 1のヌクレオチド番号 1から 8 28に示されるヌクレオチド配列を含む DN A、 または該 DNAとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 ウィルス 活性化プロテア一ゼ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むこ とを特徴とする DN Aである。 さらに、 該 DNAにコードされるアミノ酸配列か らなる蛋白質のウィルス活性化プロテア一ゼ活性により切断され得る基質がオル ソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの外被蛋白質 (特に好ましくは、 ィンフルェンザウィルスのへマグルチニンまたはセンダイゥ ィルスの F蛋白質) であることが好ましい。 本発明の DNAと して最も好適なも のは、 分子中に配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1から 8 28に示される ヌクレオチド配列からなる DNAまたは形質転換大腸菌 E. c o l i p T C 3 2 - 1 5 A SANK 7 2 2 9 8 (F ERM B P— 646 6) が保持するプ ラスミ ドに挿入されている DN Aである。 本発明はさらに、 上記 DNAを含む組換え DN Aベクタ一および該組換え DN Aベクタ一で形質転換された宿主細胞に関する。 そのような形質転換宿主細胞と しては、 平成 1 0 (1 99 8) 年 8月 1 9日付けで日本国茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号の工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託された、 大腸菌 E. c o l i p TC 3 2- 1 5A SANK 7 2 298 (受託番号 F E RM B P- 646 6) を挙げることができる。 その他、 本発明は、 上記ウィルス活性化プロテア一ゼ活性を有する蛋白質の製造 方法および該蛋白質と特異的に結合する抗体に関する。 The present invention relates to a protein comprising, in a molecule thereof, an amino acid sequence represented by amino acids Nos. 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, and having a virus-activating protease activity; or The present invention relates to a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted, and having a virus-activating protease activity. Preferably, the protein contains an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the molecule, and has a virus-activating protease activity. The substrate that can be cleaved by the virus-activating protease activity is preferably a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae (particularly preferably, the hemagglutinin of influenza virus or the FGF of Sendai virus). (Protein). Furthermore, the protein of the present invention is preferably derived from an animal that can be naturally infected with influenza virus. The most preferred protein of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a transformed E. coli E.co1ipTC32-l5A SANK72. 298 (FERMBP-6466) is a protein having an amino acid sequence encoded by DNA inserted into the plasmid carried by FERMBP-6466. The present invention also relates to a DNA encoding a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity. Preferably, the DNA of the present invention contains the sequence number of the sequence listing in the molecule. No. 1 comprising a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 828 of nucleotide No. 1 or a nucleotide sequence which hybridizes with the DNA under stringent conditions and encodes a protein having a virus-activating protease activity This is the feature of this DNA. Further, a substrate which can be cleaved by a virus-activating protease activity of a protein consisting of an amino acid sequence encoded by the DNA is a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae (particularly preferably, Influenza virus (hemagglutinin or Sendai virus F protein) is preferred. Most preferred as the DNA of the present invention is a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in the molecule of SEQ ID NO: 1 from nucleotide number 1 to 828 in the molecule or transformed E. colip TC32-1. 5 A SANK 7 2 2 9 8 (F ERM BP—6466) This is the DNA inserted in the plasmid held. The present invention further relates to a recombinant DNA vector containing the above DNA and a host cell transformed with the recombinant DNA vector. As such a transformed host cell, the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, dated August 19, 1999 (Heisei 19) Escherichia coli E. colip TC32- 15A SANK 72298 (Accession No. FERMBP-6646) deposited internationally. In addition, the present invention relates to a method for producing a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity, and an antibody that specifically binds to the protein.
さらに、 本発明は、 化合物または組成物試料のウィルス感染症予防剤としての 効果を試験する方法であって、 上記ウィルス活性化プロテア一ゼ活性を有する蛋 白質、 該蛋白質が特異的に切断する基質および被検試料を共存させ、 次いで該蛋 白質による基質の切断を該被検試料が阻害する活性を検出することを特徴とする 方法、 および該方法のための上記ウィルス活性化プ口テア一ゼ活性を有する蛋白 質の使用に関するものである。
すなわち、 本発明は、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有する新規蛋白質、 該蛋白質をコードする D N A、 D N Aを含む組換えべクタ一、 該ベクターで形質 転換された宿主細胞、 該蛋白質の製造方法および用途、 ならびに該蛋白質と特異 的に結合する抗体を提供するものである。 本発明者らはィンフルェンザウィルスの自然宿主であるブタよりウィルス活性 化プロテアーゼ活性を有する新規蛋白質を精製し、 この新規蛋白質がウイルス活 性化プロテアーゼ活性を有することを確認、した。 さらに、 本発明者らはこの新規 蛋白質をコードする c D N Aをクローニングし、 この新規蛋白質の全一次構造を 解明することに成功し、 本発明を完成させた。 本発明において、 「ウィルス活性化プロテア一ゼ活性」 とは、 ウィルス外被蛋 白質中の特定の構造を認識して、 その認識部位でのみ (一分子中に認識部位が複 数存在する場合はそれぞれの位置で) 該外被蛋白質を切断することにより、 該外 被蛋白質に動物細胞膜への融合活性を発現せしめ、 結果としてウィルスを宿主に 感染可能な状態にする活性をいう。 ここにいう 「ウィルス」 とは、 好適にはオル ソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスであり、 より 好適にはィンフルェンザウィルスまたはセンダイウィルスである。 また本発明の 蛋白質が有するウイルス活性化プ口テア一ゼ活性により切断される基質として好 適なものは、 その切断により宿主細胞との膜融合活性を発現することを特徴とす るオルソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの外被 蛋白質であり、 より好適にはィンフルェンザウィルスのへマグルチニンまたはセ ンダイウィルスの F蛋白質であるが、 本発明はこれらに限定されない。 本発明の蛋白質は、 例えば、 動物肺等の組織や培養動物細胞株から、 オルソミク ソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの外被蛋白質を限定切 断する活性を有する蛋白質を、 公知の蛋白質単離精製手段を組合せて単離精製する ことにより得ることができる。 本発明の蛋白質を分離精製するための出発材料とし
ては、 インフルエンザウイルスが自然感染し得る哺乳動物の肺、 特にブタ肺の組織 が好適であるが、 本発明はこれに限定されず、 インフルエンザウイルスが自然感染 し得る哺乳動物から分離できる他の細胞または他の組織、 もしくはィンフルェンザ ウィルスが自然感染し得る哺乳動物から樹立された細胞株を使用することもでき る。 具体的には、 例えばブタ肺を出発材料とした場合、 以下に記載する方法等によ り本発明の蛋白質を得ることができる。 まず、 肺組織 2 0 0 g重量あたり 2 リ ツ トルの 0. 1 5M 塩化ナトリウムおよび 1 mM エチレンジァミン四酢酸 (以 下 「EDTA」 いう) を含む 2 5 mM リン酸カリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) 中で均一に懸濁し、 遠心分離する。 遠心後の沈殿を当量の 1 M 塩化ナトリウム および 1 %トリ トン X— 1 1 4を含む 2 5 mM リン酸カリゥム緩衝液 (p H 7. 5) に再懸濁し、 再度遠心して得られた上清について、 ァフィ二ティ一クロ マトグラフィー樹脂べンザミジンセファロース 6 B (フアルマシア社製) カラム を使用したァフィ二ティークロマトグラフィーを行って分画し、 後述する方法に よってオルソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの 外被蛋白質を限定的に切断する活性を有する画分を回収する。 上記のようにして得られた本発明の蛋白質がウィルス活性化プロテアーゼ活性 を有するか否かは、 例えば放射標識したウィルスを本発明の蛋白質と混合してィ ンキュベーシヨンした後、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動等の手法を用いて、 放射標識された蛋白質の分子量等の変化を調べることにより検出することができ る。 具体的には例えば、 放射標識ィンフルェンザウイルスは以下に記載する方法に より調製できる。 まずィヌ腎由来細胞株 MD CK (アメリカン · タイプ 'カルチ ヤー . コレクション (以下 「ATC Cj とレヽう) C C L一 34) 1 X 1 06個細 胞 Zm 1 を細胞培養用フラスコに蒔き、 5%炭酸ガスと 9 5%空気存在下、 3 7°Cでー晚培養する。 この細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (以下 「P
B S (一) 」 という) 、 または、 0. 2 1 %のゥシ血清アルブミンを含む最小必 須培地 (以下 「MEM— BA」 という) で洗浄し、 無菌的に調製したインフルェ ンザウィルス (ATCC VR— 9 5、 1 07プラーク形成単位 Zm 1 ) 0. 5 m 1 を細胞に添加することにより感染させ、 5%炭酸ガスと 9 5%空気存在下、 3 7。Cで 60分静置する (その間、 1 0乃至 1 5分毎に培養用フラスコを傾斜さ せ、 ウィルス液をフラスコ全般に行き渡らせる) 。 その後、 細胞を MEM— BA で 5回洗浄する。 この細胞を [3H] —ダルコサミン (デュポン/ニューイング ランドヌクレア一リサーチプロダク ト社) 等のウィルス外被蛋白質に取り込まれ 得る標識化合物を添加した 1 m 1 の MEM— B A中で、 5%炭酸ガスと 9 5 %空 気存在下、 3 7°Cで 1 2乃至 1 6時間培養する。 培養後、 培養液上清を集め、 2 500 r p mで 1 0分間、 冷却遠心を行う。 上清を回収して、 0. 1M 塩化ナ トリ ウムおよび I mM EDTAを含む 1 0mM トリスー塩酸 (ρΗ 7· 4) 溶液 (以下 「ΝΤΕ」 という) に溶解した 30%ショ糖溶液を入れた遠心チュ一 ブに重層する。 遠心チューブ上部の空いた部分を NT Εで満たし、 3 9000 r p mで 6 0分間冷却超遠心を行う。 回収した沈殿を あたり l O O O O O d pmとなるように NTEで懸濁し、 標識ィンフルェンザウィルスを得る。 また、 放射標識センダイウィルスも、 上記と同様の方法において、 宿主細胞と して MDCKの代りに L L C一 MK 2 (ATCC CC L— 7) を用い、 インフ ルェンザウィルスの代りにセンダイウィルス (ATCC VR— 1 05) を用い ることにより調製することができる。 このようにして調製された放射標識ウィルスと、 本発明の蛋白質とを、 例え ば、 l O OmM トリスー塩酸緩衝液 (p H 7. 5) 中、 3 7°Cで、 3乃至 1 2 時間反応させ、 SD Sポリアク リルアミ ドゲル電気泳動により反応産物を分離し た後、 フルォログラフィーを行って反応前後の放射標識されたバンドを検出 '比 較することにより、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を調べることができる。 また、 例えば基質として :
Boc- Gin- Ala- Arg- MCA Furthermore, the present invention relates to a method for testing the effect of a compound or composition sample as a prophylactic agent for viral infection, comprising: a protein having the above-mentioned virus-activating protease activity; a substrate capable of specifically cleaving the protein. And a test sample, and then detecting the activity of the test sample to inhibit cleavage of the substrate by the protein, and the virus-activated protease for the method. It relates to the use of proteins having activity. That is, the present invention provides a novel protein having a virus-activating protease activity, a DNA encoding the protein, a recombinant vector containing the DNA, a host cell transformed with the vector, a method for producing the protein, and a use thereof. And an antibody that specifically binds to the protein. The present inventors purified a novel protein having a virus-activating protease activity from pig, which is a natural host of influenza virus, and confirmed that the novel protein had a virus-activating protease activity. Further, the present inventors have cloned cDNA encoding the novel protein, succeeded in elucidating the entire primary structure of the novel protein, and completed the present invention. In the present invention, the term “virus-activating protease activity” refers to the recognition of a specific structure in a viral coat protein and the recognition of the specific structure only at that recognition site (when a plurality of recognition sites exist in one molecule, (At each position) refers to the activity of cleaving the coat protein to cause the coat protein to express a fusion activity to animal cell membranes, and consequently bring the virus into a state capable of infecting a host. As used herein, the “virus” is preferably a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae, and more preferably is influenza virus or Sendai virus. Also preferred as a substrate that is cleaved by the virus-activated protease activity of the protein of the present invention is an orthomyxovirus characterized by expressing a membrane fusion activity with a host cell by the cleavage. However, the present invention is not limited thereto, but is not limited to hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus. The protein of the present invention includes, for example, a protein having an activity of restricting the coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae from a tissue such as animal lung or a cultured animal cell line, to a known protein. It can be obtained by performing isolation and purification using a combination of separation and purification means. As a starting material for separating and purifying the protein of the present invention For example, a lung of a mammal to which the influenza virus can naturally infect, particularly a tissue of a pig lung, is suitable, but the present invention is not limited thereto, and other cells that can be isolated from a mammal to which the influenza virus can naturally infect. Alternatively, other tissues or cell lines established from mammals that can be naturally infected with the influenza virus can be used. Specifically, for example, when pig lung is used as a starting material, the protein of the present invention can be obtained by the method described below. First, a 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 liters of 0.15 M sodium chloride and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as “EDTA”) per 200 g of lung tissue. 5) Suspend uniformly in, and centrifuge. The precipitate after centrifugation was resuspended in 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing an equivalent amount of 1 M sodium chloride and 1% triton X-114, and centrifuged again. The supernatant is fractionated by affinity chromatography using affinity chromatography resin Benzamidine Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia) column, and is subjected to the method described later in Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae. A fraction having an activity of cleaving the coat protein of a virus belonging to the viridae is collected. Whether the protein of the present invention obtained as described above has a virus-activating protease activity is determined by, for example, mixing a radiolabeled virus with the protein of the present invention, incubating the mixture, and then performing polyacrylamide gel electrophoresis. Detection can be performed by examining changes in the molecular weight and the like of the radiolabeled protein using such techniques. Specifically, for example, radiolabeled influenza virus can be prepared by the method described below. First, 1 x 10 6 cells Zm1 were seeded in a cell culture flask and the cell line MD CK (American Type Culture Collection (hereinafter referred to as "ATC Cj") CCL-34) was obtained from a dog kidney cell line. Incubate the cells at 37 ° C in the presence of 95% CO2 and 95% air at 37 ° C. Dulbecco's phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “P BS (I) ”) or an influenza virus (ATCC VR—) that has been washed with a minimum essential medium containing 0.2% of serum albumin (hereinafter referred to as“ MEM-BA ”) and prepared aseptically. 9 5, 1 0 7 plaque forming units Zm 1) 0. 5 m 1 infected by adding to the cells, 5% carbon dioxide and 95% air presence, 3 7. Incubate at C for 60 minutes (during this, tilt the culture flask every 10 to 15 minutes to allow the virus solution to spread throughout the flask). Then, wash the cells 5 times with MEM-BA. The cells [3 H] - Darukosamin with (DuPont / New Englander Randonukurea one research pro ducts Co.) virus envelope protein incorporated may labeled compounds added with 1 m of 1 in MEM- BA and the like, 5% carbon dioxide And in the presence of 95% air at 37 ° C for 12 to 16 hours. After culturing, collect the culture supernatant and centrifuge at 2,500 rpm for 10 minutes. Collect the supernatant and centrifuge with a 30% sucrose solution dissolved in a 10 mM Tris-HCl (ρΗ7.4) solution containing 0.1 M sodium chloride and I mM EDTA (hereinafter referred to as “ΝΤΕ”). Layer on tube. Fill the empty space at the top of the centrifuge tube with NT II, and perform refrigerated ultracentrifugation at 39,000 rpm for 60 minutes. The recovered precipitate is suspended in NTE so that the concentration per lOOOO dpm is obtained to obtain labeled influenza virus. In the same manner as described above, radiolabeled Sendai virus also uses LLC-1 MK2 (ATCC CCL-7) instead of MDCK as a host cell, and uses Sendai virus (ATCC VR-1) instead of influenza virus. 05) can be used. The radiolabeled virus thus prepared is reacted with the protein of the present invention, for example, at 37 ° C. for 3 to 12 hours in lO OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5). After separating the reaction products by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, perform fluorography to detect the radiolabeled bands before and after the reaction. Can be. Also, for example, as a substrate: Boc- Gin- Ala- Arg- MCA
(Bocは N— tert—ブトキシカルボニル (N- tert- butoxycarbonyl) を、 M C Aは. 4ーメチノレクマリ ノレー 7一アミ ド (4-methylcoumaryl-7-amide) をそれぞれ表 す。 (株) ペプチド研究所製) で表される合成ペプチドを使用し、 本発明の蛋白 質を 0 . 1 mM 上記合成ペプチドおよび 1 0 O mM トリスー塩酸 (p H 7 . 5 ) を含む反応液中で、 3 7 °C、 3 0分間インキュベーションした後、 合成ぺプ チドの分解産物である 7—アミノー 4ーメチルクマリン (7 - amino - 4 - methylcoumarin) の生成を蛍光光度計等を用いて定量する (励起波長 3 7 0 n m、 検出波長 4 6 0 n m) ことにより、 本発明の蛋白質のプロテアーゼ活性を測 定することができる。 ただし、 本発明の蛋白質のプロテア一ゼ活性検出方法はこれらの方法に限定さ れず、 本発明の蛋白質が限定的に切断し得る他の基質を使用することも可能であ る。 上記の方法で本発明の蛋白質に切断させたウィルス外被蛋白質が、 動物細胞 膜に融合する活性を有するか否かは、 例えば、 動物末梢血から分離した赤血球に 予め放射標識化合物を取り込ませておき、 上記方法で切断させたウィルス外被蛋 白質 (放射標識していないものを用いる) の存在下でこの赤血球を生理的塩濃度 の溶媒中でィンキュベーションしてから、 遠心後の上清の放射活性を測定して、 外被蛋白質の赤血球膜への融合に伴って漏出する放射標識化合物の量を調べるこ と等により確認することができる。 また、 上記のプロテア一ゼ活性検出方法において、 合成された化合物や微生物 の二次代謝産物等の被検試料を基質切断反応時に共存させ、 該被検試料が本発明 の蛋白質のプロテアーゼ活性を阻害するか否かを調べることにより、 ウィルス感 染症予防剤の評価またはスクリーニングが可能である。 特に、 本発明の蛋白質の プロテアーゼ活性を特異的に阻害する活性が高く、 他の蛋白質分解酵素の活性を 阻害する活性が低いような物質については、 新しいタイプのウィルス感染症予防
剤としての薬効が期待できる。 さらに、 本発明の蛋白質は、 新規なプロテアーゼとして蛋白質の限定的切断に 用いることができる。 この限定的な切断のための基質としてはオルソミクソウイ ルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィルスの外被蛋白質が好適であ り、 さらにィンフルェンザウィルスのへマグルチニンまたはセンダイウィルスの F蛋白質がより好適であるが、 これらに限定されない。 例えば、 これらのウィル スに対するワクチンの開発過程において、 上記外被蛋白質の特定の一部分のみを 抗原として使用する場合に、 本発明の蛋白質が有する上記外被蛋白質の限定的切 断活性を利用することができる。 上記のようにして精製された本発明の蛋白質の N末端アミノ酸配列の決定は、 自動蛋白質アミノ酸配列決定装置 (例えば、 パーキンエルマ一ジャパン 'ァプラ ィ ドバイオシステムズ社製モデル 4 9 2 ) を用いて決定することができる。 次に、 本発明の蛋白質をコードする D N Aは、 例えば、 哺乳類細胞などから m R N Aを調製した後、 これを铸型として c D N Aを合成し、 その中から本発明の 蛋白質をコードする c D N Aを公知の方法によりスクリーユングすることにより 得ることができる。 この m R N Aの供給源となる動物細胞は、 本発明において は、 ブタ肺組織中の細胞が好適であるが、 哺乳動物から分離できる細胞または組 織、 あるいは他の動物細胞株を使用することもできる。 m R N Aの抽出にあたっては、 チォシアン酸グァニジン ·塩化セシウム超遠心 法、 チォシアン酸グァニジン 'ホッ トフエノール法、 グァニジン塩酸法なども採 用しうるが、 酸性チォシアン酸グァニジン · フエノール ' ク口口ホルム法(Boc stands for N-tert-butoxycarbonyl, and MCA stands for 4-methylcoumaryl-7-amide. Peptide Research Laboratories, Inc.) The protein of the present invention was prepared at 37 ° C and 3 ° C in a reaction solution containing 0.1 mM of the synthetic peptide and 10 OmM tris-hydrochloride (pH 7.5) using the synthetic peptide represented by After incubation for 0 min, the production of 7-amino-4-methylcoumarin (7-amino-4-methylcoumarin), a degradation product of the synthetic peptide, is quantified using a fluorometer or the like (excitation wavelength: 370 nm, detection: By measuring the wavelength at 460 nm, the protease activity of the protein of the present invention can be measured. However, the method for detecting the protease activity of the protein of the present invention is not limited to these methods, and it is also possible to use other substrates that can cleave the protein of the present invention in a limited manner. Whether the viral coat protein cleaved into the protein of the present invention by the above method has the activity of fusing to the animal cell membrane can be determined, for example, by incorporating a radiolabeled compound in advance into erythrocytes isolated from animal peripheral blood. After incubating the erythrocytes in a solvent with physiological salt concentration in the presence of the viral coat protein (using no radiolabel) cleaved by the above method, It can be confirmed by measuring the radioactivity of the serum and examining the amount of radiolabeled compound that leaks out upon fusion of the coat protein to the erythrocyte membrane. In the above-described method for detecting protease activity, a test sample such as a synthesized compound or a secondary metabolite of a microorganism may coexist during a substrate cleavage reaction, and the test sample inhibits a protease activity of the protein of the present invention. By examining whether or not to do so, it is possible to evaluate or screen for a virus infection preventive agent. In particular, a substance having a high activity of specifically inhibiting the protease activity of the protein of the present invention and a low activity of inhibiting the activity of other proteolytic enzymes is used to prevent a new type of viral infection. It can be expected to be effective as an agent. Further, the protein of the present invention can be used as a novel protease for limited cleavage of the protein. As a substrate for this limited cleavage, a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae is preferable, and further, hemagglutinin of influenza virus or F protein of Sendai virus is more preferable. However, it is not limited to these. For example, in the process of developing a vaccine against these viruses, when only a specific part of the coat protein is used as an antigen, the limited cleavage activity of the coat protein possessed by the protein of the present invention is used. Can be. The N-terminal amino acid sequence of the protein of the present invention purified as described above was determined using an automatic protein amino acid sequencer (for example, Model 492, manufactured by PerkinElmer Japan, Inc., Applied Biosystems). Can be determined. Next, for the DNA encoding the protein of the present invention, for example, after preparing mRNA from mammalian cells or the like, cDNA is synthesized using this as a type III, and from there, cDNA encoding the protein of the present invention is obtained. It can be obtained by screening by a known method. In the present invention, the animal cells serving as the source of the mRNA are preferably cells in porcine lung tissue, but cells or tissues that can be isolated from mammals, or other animal cell lines may be used. it can. For the extraction of mRNA, guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate hot phenol method, guanidine hydrochloride method, etc. can be used, but guanidine acid thiocyanate phenol / mouth mouth form method
(Chomczynski, P. and Sacchi, Ν·, (1987) Anal. Biochem. , 162, 156 - 159) が好適である。 真核細胞の細胞質に存在する m R N Αの多くは、 その 3 ' 末端にポリ (A ) 配
列を持つことが知られているので、 この特徴を利用してピオチン化したオリゴ(Chomczynski, P. and Sacchi, Ν ·, (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159). Most of the mRNA present in the cytoplasm of eukaryotic cells has a poly (A) site at its 3 'end. It is known to have an array, so this feature is used to
(d T) プローブに mRN Aを吸着させ、 さらにス トレプトアビジンを固定化し た常磁性粒子に、 ピオチン ストレプトアビジン間の結合を利用して mRNAを 捕捉し洗浄操作の後、 mRNAを溶出することにより精製することができる。 ま た、 オリゴ (d T) セルロースカラムに mRNAを吸着させて、 次にこれを溶出 して精製する方法も採用し得る。 さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、 mR N Aをさらに分画することもできる。 上記のごとく して得られた mRNAがウィルス活性化プロテア一ゼ活性を有す る蛋白質をコ一ドするものであることを確認するためには、 mRN Aを蛋白質に 翻訳させ酵素活性を調べるか、 該蛋白質に特異的な抗体を用いてその蛋白質を同 定する等の方法を用いることができる。 例えば、 アフリカッメガエル (Xenopus laevis) の卵母細胞に mRNAを注入して翻訳させることができ (Gardon, j. B. et al. (1972) Nature 233, 177-182)、 あるいは、 ゥサギ網状赤血球系ゃコ ムギ胚芽系といった無細胞翻訳系を利用できる (Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981): " Practical Methods in Molecular Biology " , Springer - Verlag, NY. )0 また、 上記方法で得た mRNAを铸型として、 逆転写酵素を用いて一本鎖 c D N Aを合成した後、 この一本鎖 c D N Aから二本鎖 c DN Aを合成することがで きる。 その方法としては、 S 1ヌクレアーゼ法 (Efstratiadis, A. et al. (d T) Adsorb mRNA to the probe, capture the mRNA using streptavidin-bonded paramagnetic particles with streptavidin immobilized, and elute the mRNA after washing. Can be purified. Alternatively, a method in which mRNA is adsorbed onto an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified may be employed. Further, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. In order to confirm that the mRNA obtained as described above encodes a protein having virus-activating protease activity, it is necessary to translate mRNA into a protein and examine the enzyme activity. A method such as identifying the protein using an antibody specific to the protein can be used. For example, mRNA can be injected into oocytes of Xenopus laevis and translated (Gardon, j. B. et al. (1972) Nature 233, 177-182), or available cell-free translation systems such as erythroid Ya co wheat germ system (Schleif, RF and Wensink, PC (1981):. "Practical methods in Molecular Biology", Springer - Verlag, NY) 0 was also obtained by the above method After converting single-stranded cDNA with reverse transcriptase using mRNA as type II, double-stranded cDNA can be synthesized from the single-stranded cDNA. The method includes the S1 nuclease method (Efstratiadis, A. et al.
(1976) Cell 7, 279-288)、 Land法 (Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251 - 2266)、 0. Joon Yoo法 (Yoo, 0. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049 - 1053) なども採用し得るが、 本発明の目的には Okayama- Berg法 (Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170)が好適である。 次に、 得られた c DNA断片をラムダファ一ジベクターに揷入し自己複製させ ることにより c DN A断片を持つ組換えファージを安定に保持し、 増幅させるこ
とができる。 例えば、 ラムダファージ λ Z A P I I (ス トラタジーン社製) を用 いる場合、 宿主大腸菌 X L 1— B 1 u e M R F ' 株や J M 1 0 9株にプラーク を作らせ、 それらのプラークの 5—ブロモー 4一クロロー 3—インドリル一 j8— D—ガラク トピラノシド (5 - Brotno- 4-chloro - 3 - indolyl- /3 - D- galactopyranoside ( X— g a 1 ) ) 代謝による発色の有無から組換え体を選別 することができる。 なお、 ベクターとしては、 ラムダ系のファージベクター以外 に、 プラスミ ドベクタ一も用いることができる。 上記のようにして得られる組換えファージから、 目的のウィルス活性化プロテ ァーゼ活性を有する蛋白質をコードする c D N Aを有するクロ一ンを選別する方 法としては、 例えば以下に示す各種方法のいずれかを採用できる。 (1976) Cell 7, 279-288), Land method (Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251-2266), 0. Joon Yoo method (Yoo, 0. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049-1053), but for the purpose of the present invention, the Okayama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170) are preferred. Next, the obtained cDNA fragment is inserted into a lambda phage vector and allowed to self-replicate, whereby the recombinant phage having the cDNA fragment is stably retained and amplified. Can be. For example, when lambda phage λ ZAPII (Stratagene) is used, host E. coli XL1-B1ueMRF 'and JM109 strains form plaques, and the plaques of 5-bromo-4-chloro- 3—Indolyl j8—D—Galactopyranoside (5-Brotno-4-chloro-3-indolyl- / 3-D-galactopyranoside (X—ga1)) It is possible to select recombinants based on the presence or absence of color development by metabolism. it can. As a vector, a plasmid vector may be used in addition to a lambda phage vector. As a method for selecting a clone having a cDNA encoding a protein having a desired virus-activating protein activity from the recombinant phage obtained as described above, for example, any of the following various methods can be used. Can be adopted.
( 1 ) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法: 目的の 蛋白質のアミノ酸配列の全部、 または一部が解明されている場合 (該配列は、 複 数個連続した特異的配列であれば、 目的の蛋白質のどの部分でもよい) 、 該アミ ノ酸配列をコ一ドするオリゴヌクレオチドを合成し (コ ドンの縮重のあるアミノ 酸に対しては、 使用頻度の高いコ ドンを用いても、 または考えられるコ ドンを組 み合わせて複数個のヌクレオチド配列を合成してもよく、 また後者の場合、 イノ シンを含ませてその種類を減らすこともできる) 、 これを3 2 P、 3 5 Sまたはビ ォチン等で標識したものをプローブとして、 組換えファージ D N Aを変性固定し た二トロセルロースフィルタ一またはナイロンフィルターとハイブリダイズさ せ、 得られた陽性クローンを検索して、 これを選択する。 (1) Screening method using a synthetic oligonucleotide probe: When all or part of the amino acid sequence of the target protein has been elucidated (if the sequence is a specific sequence consisting of a plurality of consecutive Any oligonucleotide may be used to encode the amino acid sequence (for amino acids with degenerate codons, use of frequently used codons or may be synthesized a plurality of nucleotide sequences codon that is by combining seen, also in the latter case, it is also possible to reduce the type moistened with Ino Shin), which 3 2 P, 3 5 S or Using the probe labeled with biotin or the like as a probe, the recombinant phage DNA was hybridized with a denaturated and fixed nitrocellulose filter or nylon filter, and the resulting positive Search for a sex clone and select it.
( 2 ) ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いるスクリーニング 法: 目的の蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、 該 アミノ酸配列の N末端側の一部に対応するセンス鎖と、 同じく C末端側の一部に 対応するアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを合成し、 ポリメラ一ゼ連鎖反応(2) Screening method using a probe prepared by polymerase chain reaction: When the whole or part of the amino acid sequence of the target protein has been elucidated, a sense strand corresponding to the N-terminal part of the amino acid sequence is Similarly, an antisense strand oligonucleotide corresponding to a part of the C-terminal side was synthesized, and the polymerase chain reaction was performed.
(以下 「P C R」 という。 Saiki, R. K. et al. (1988) Sci ence 239, 487 - 491 参照) を行い、 目的の蛋白質をコードする D N A断片を増幅する。 ここで用いる
铸型 DNAとしては、 本発明の蛋白質を産生する細胞の mRN Aより逆転写反応 にて合成した c DNA、 またはゲノム DNAを用いることができる。 このように して調製した DNA断片を、 32 P、 35 Sまたはピオチン等で標識し、 これをプ ローブとして用いたプラークハイブリダィゼーションまたはコロニーハイブリダ ィゼーションによる c DNAライブラリ一やゲノムライブラリ一のスクリーニン グを実施して、 目的のクローンを選択する。 (Hereinafter referred to as “PCR”; see Saiki, RK et al. (1988) Science 239, 487-491) to amplify the DNA fragment encoding the target protein. Used here As type I DNA, cDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription from mRNA of cells producing the protein of the present invention can be used. The DNA fragment prepared in this manner is labeled with 32 P, 35 S, or biotin, etc., and is used as a probe for cDNA library or genomic library by plaque hybridization or colony hybridization. Perform the screening in step 1 to select the desired clone.
(3) 他の動物細胞株でウィルス活性化プロテア一ゼ活性を有する蛋白質を産生 させてスクリ一ユングする方法: 前記のようにして得た c DN Aを発現ベクター に挿入したプラスミ ド (自己複製可能で、 転写プロモ一ター領域を含むプラスミ ド、 もしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミ ドのいずれも使用 できる) で動物細胞宿主を形質転換し、 それら c DNAにコードされた蛋白質を産 生させ、 その培養上清または細胞抽出物中の、 ウィルス活性化プロテア一ゼ活性を 測定するか、 または、 本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体、 および該抗体に対 する二次抗体を用いて、 本発明の蛋白質の存在を検出することにより、 本発明の蛋 白質をコードする c DNAを有する株を選択する。 なお、 動物細胞宿主としては C OSや CHO等の汎用される細胞株を使用できるが、 外来遺伝子産物としての本発 明の蛋白質の検出を容易にするため、 宿主自体は一定の培養条件下で本発明の蛋白 質を産生しない細胞であることが好ましい。 (3) Screening method by producing a protein having virus-activating protease activity in another animal cell line and screening: Plasmid (self-replicating) in which cDNA obtained as described above is inserted into an expression vector Transformants can be used to transform animal cell hosts with plasmids that contain the transcriptional promoter region, or can be integrated into the chromosome of animal cells. Antibody which specifically binds to the protein of the present invention, or measures the virus-activating protease activity in the culture supernatant or cell extract, and a secondary antibody against the antibody The strain having cDNA encoding the protein of the present invention is selected by detecting the presence of the protein of the present invention using the method described above. Commonly used cell lines such as COS and CHO can be used as animal cell hosts.However, in order to facilitate detection of the protein of the present invention as a foreign gene product, the host itself must be used under certain culture conditions. Preferably, the cells do not produce the protein of the present invention.
(4) セレクティブ .ハイブリダィゼーシヨン . トランスレーションの系を用 いる方法: 形質転換株から得られる c DN Aを、 ニトロセルロースフィルター またはナイロンフィルターなどにプロッ トし、 本発明の蛋白質の産生能を有する 組織または細胞から抽出した niRNAをハイブリダィズさせた後、 c DNAに結 合した mRNAを解離させ、 回収する。 回収した mRNAを、 蛋白質翻訳系 (例 えば、 アフリカッメガエルの卵母細胞への注入や、 ゥサギ網状赤血球ライゼート や、 コムギ胚芽などの無細胞系) で蛋白質に翻訳させ、 その蛋白質のウィルス活 性化プロテアーゼ活性を調べるか、 または、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を 有する蛋白質に対する抗体を用いて検出し、 目的の株を選択する。
上記のようにして得られた目的の形質転換株からの本発明の蛋白質をコ—ドす る DNAの採取は、 公知の方法 (Maniatis, T. et al. (1982) : " Molecular Cloning A Laboratory Mannual " Cold Spring Harbor Laboratory, NY) (こ ¾: ヽ 実施できる。 例えば、 細胞よりプラスミ ド DN Aに相当する画分を分離し、 該プ ラスミ ド DNAより c DN A領域を切り出すことにより行い得る。 このようにして得られる DNAのヌクレオチド配列の決定は、 例えば、 マキサ ムーギルバートの化学修飾法 (Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) : "Methods in Enzymology" 65, 499-559) や M13ファージを用いるジデォキシヌク レオチド鎖終結法 (Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276) な どにより行うことができる。 また、 ラジオアイソ トープの代わりに蛍光色素を用 いた自動 DNA配列解析装置 (例えば、 パーキンエルマ一 · ジャパン ·アプライ ドバイオシステムズ社製モデル 3 73 A等) を使用することもできる。 なお、 本発明の蛋白質として最も好適なものをコードする c DNAが挿入され たプラスミ ドを保持する形質転換大腸菌株 E. c o 1 i p TC 32- l 5A SANK 7 229 8は、 平成 1 0 (1 9 9 8) 年 8月 1 9 日付けで日本国茨城 県つくば市東 1丁目 1番 3号の工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託さ れ、 受託番号 FERM B P— 646 6が付されている。 したがって、 本発明の 蛋白質をコードする遺伝子は、 該菌株から取得することが可能である。 上記のようにしてクローン化された、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子を含 む断片は、 適当なベクタ一 DNAに組み込むことにより、 他の原核生物、 または 真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。 さらにこれらのベクターに 適当なプロモータ一、 および形質発現に関わる配列を導入することにより、 それ ぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。 原核細胞の宿主としては、 例えば、 大腸菌 (Escherichia coli) や枯草菌
(Baci l lus subti l i s) などが挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内 で形質転換させるには、 宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点 と、 調節配列を含んでいるプラスミ ドベクターで宿主細胞を形質転換させる。 ま た、 ベクターとしては、 形質転換細胞に表現形質 (表現型) の選択性を付与する ことができる配列を有するものが好ましい。 ' 例えば、 大腸菌としては K 1 2株などがよく用いられ、 ベクタ一としては、 一 般に p B R 3 2 2や p U C系のプラスミ ドが用いられるが、 これらに限定され ず、 公知の各種菌株、 およびベクターがいずれも使用できる。 プロモーターとしては、 大腸菌においては、 トリプトファン (trp) プロモー ター、 ラタ トース (lac) プロモーター、 トリプトファン ' ラク トース (tac) プ ロモ—ター、 リポプロテイン (l pp) プロモーター、 ポリペプチド鎖伸張因子 TU (4) Method using selective hybridization / translation system: cDNA obtained from the transformed strain is plotted on a nitrocellulose filter or a nylon filter to produce the protein of the present invention. After hybridizing the niRNA extracted from the tissue or cell having the above, the mRNA bound to the cDNA is dissociated and recovered. The recovered mRNA is translated into a protein by a protein translation system (for example, injection into oocytes of African alfalfa, or a cell-free system such as reticulocyte lysate or wheat germ of egrets), and the virus activity of the protein is carried out. The target strain is selected by examining the activating protease activity or by detecting using an antibody against a protein having the virus activating protease activity. The DNA encoding the protein of the present invention can be collected from the target transformant obtained as described above by a known method (Maniatis, T. et al. (1982): "Molecular Cloning A Laboratory"). Mannual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY" (This can be performed. For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out a cDNA region from the plasmid DNA. Determination of the nucleotide sequence of the DNA obtained in this manner can be performed, for example, by the Maxa, AM and Gilbert, W. (1980): "Methods in Enzymology" 65, 499-559) or M13. It can be performed by the dideoxynucleotide chain termination method using phage (Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276), etc. In addition, an automatic method using a fluorescent dye instead of radioisotope DNA sequence analyzer (for example, Perkin-L It is also possible to use Model 373 A manufactured by Japan Applied Biosystems, Inc. It is also possible to use a transformation having a plasmid into which cDNA encoding the most suitable protein of the present invention has been inserted. Escherichia coli strain E.co 1 ip TC 32-l 5A SANK 7 229 8 is the industrial technology of 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, dated August 19, 1990. It has been deposited internationally with the National Institute of Bioscience and Biotechnology and has the accession number FERM BP-6646. Therefore, the gene encoding the protein of the present invention can be obtained from the strain. The fragment containing the gene encoding the protein of the present invention, cloned as described above, can be transformed into another prokaryotic or eukaryotic host cell by incorporating it into an appropriate vector DNA. In addition, these By introducing a sequence involved in appropriate promoter primary, and the gene expression into compactors, it is possible to express genes in their respective hosts. Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. (Baci l lus subti lis). To transform the gene of interest into these host cells, the host cells are transformed with a plasmid vector containing replicons or origins of replication from species compatible with the host and regulatory sequences. Further, the vector is preferably a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells. 'For example, K12 strain and the like are often used as Escherichia coli, and pBR322 or pUC-based plasmid is generally used as a vector, but not limited thereto, and various known Both strains and vectors can be used. In Escherichia coli, tryptophan (trp) promoter, ratatoose (lac) promoter, tryptophan 'lactose (tac ) promoter, lipoprotein ( lpp) promoter, polypeptide chain elongation factor TU
(tufB) プロモーター等が挙げられ、 どのプロモーターも本発明の蛋白質の産生 に使用することができる。 枯草菌としては、 例えば 2 0 7— 2 5株が好ましく、 ベクターとしては p TUB 2 2 8 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) などが用いられる 、 これに限定されるものではない。 プロモーターとしては、 枯草菌の α—アミラーゼのシグナルぺプチド配列をコ 一ドする D N Α配列を連結することにより、 菌体外での分泌発現も可能となる。 (tufB) promoter and the like, and any promoter can be used for production of the protein of the present invention. As Bacillus subtilis, for example, 207-25 strain is preferable, and as a vector, p TUB 228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) or the like is used. It is not limited to this. Extracellular secretory expression is also possible by ligating a DNΑ sequence that encodes the signal peptide sequence of α -amylase of Bacillus subtilis as a promoter.
真核細胞の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 酵母などの細胞が含まれ、 脊椎動 物細胞としては、 例えば、 サルの細胞である C〇 S細胞 (Gluzman, Y. (1981) Cel l 23, 175-182、 A T C C C R L— 1 6 5 0 ) やチャイニーズ 'ハムスター 卵巣細胞 (C H O細胞、 A T C C C C L— 6 1 ) のジヒ ドロ葉酸還元酵素欠損 株 (Urlaub, G. and Chasin, し A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) 等がよく用いられているが、 これらに限定されない。
脊椎動物細胞の発現プロモーターと しては、 通常発現しようとする遺伝子の上 流に位置するプロモーター、 RN Aのスプライス部位、 ポリアデュル化部位、 お よび転写終結配列等を有するものを使用でき、 さらにこれは必要により複製起点 を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 S V40の初期プロモータ一を 有する p SV 2 d h f r (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) 等が挙げられるが、 これに限定されない。 宿主細胞として、 CO S細胞を用いる場合を例に挙げると、 発現ベクターと し ては、 SV40複製起点を有し、 CO S細胞において自立増殖が可能であり、 さ らに、 転写プロモーター、 転写終結シグナル、 および RN Aスプライス部位を具 えたものを用いることができる。 該発現べクタ一は、 ジェチルアミノエチル (D EAE) —デキス トラン法 (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、 リン酸カルシウム一 D N A共沈殿法 (Graham, F. し and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456 - 457) 、 および電気パルス 穿孔法 (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) などにより COS細 胞に取り込ませることができ、 かく して所望の形質転換細胞を得ることができ る。 また、 宿生細胞として CHO細胞を用いる場合には、 発現ベクターと共に、 抗生物質 G 4 1 8耐性マーカーとして機能する n e o遺伝子を発現し得るベクタ 一、 例えば p RSVn e o (Sambrook, J. et al. (1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY) や p SV 2 - n e o (Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) などをコ . トランスフエタ トし、 G 4 1 8耐性のコロニーを選択する ことにより、 本発明の蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができ る。 昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 鱗翅類ャガ科の Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞 (S f — 9または S f — 2 1) や Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast. Examples of vertebrate cells include monkey C〇S cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCCCRL-165) and Chinese 'hamster ovary cells (CHO cells, ATCCCCL-61) deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, A. (1980) Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) and the like are often used, but are not limited thereto. As a vertebrate cell expression promoter, one having a promoter located upstream of a gene to be normally expressed, an RNA splice site, a polyadullation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. May have a replication origin if necessary. An example of the expression vector is p SV 2 dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) having the initial promoter of SV40. However, it is not limited to this. For example, when a COS cell is used as the host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in the COS cell, and has a transcription promoter and a transcription termination. Signals and those with an RNA splice site can be used. The expression vector is prepared by the following method: getylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), and calcium phosphate-DNA coprecipitation method ( Graham, F. Shi and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse drilling (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) The cells can be incorporated into cells, and thus desired transformed cells can be obtained. When CHO cells are used as host cells, a vector capable of expressing the neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and p SV 2-neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) By transforming the cells and selecting a G418-resistant colony, a transformed cell stably producing the protein of the present invention can be obtained. When insect cells are used as host cells, cell lines derived from ovarian cells of Spodoptera frugiperda (S f — 9 or S f — 21) of Lepidoptera, Noctuidae,
Trichoplusia niの卵細胞由来 High Five細胞 (Wickham, T. J. et al, (1992)
Bi otechnol. Prog. I : 391 - 396) などが宿主細胞としてよく用いられ、 バキュ口 ウィルス トランスファ一ベクタ一としてはォートグラファ核多角体ウィルス (A c N P V ) のポリへドリン蛋白質のプロモーターを利用した p V L 1 3 9 2 / 1 3 9 3がよく用いられる (Kidd, I. M. and V. C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and High Five cells derived from Trichoplusia ni egg cells (Wickham, TJ et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396) is often used as a host cell, and the baculo-mouth virus transfer vector uses the polyhedrin protein promoter of the autographa nucleopolyhedrovirus (AcNPV) as a vector. VL1392 / 1393 is frequently used (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors.Applied Biochemistry and
Biotechnology 42, 137-159)。 この他にも、 バキュロウィルスの P 1 0や同塩基 性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。 さらに、 A c N P V のエンベロープ表面蛋白質 G P 6 7の分泌シグナル配列を目的蛋白質の N末端側 に繋げることにより、 組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能で ある (Zheiei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。 真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、 酵母が一般によく知られてお り、 その中でもサッカロミセス属酵母、 例えばパン酵母 Saccharomyces cerevi siaeや石油酵母 Pichia pastori sが好ましい。 該酵母などの真核微生物の 発現べクタ一としては、 例えば、 アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモータ一Biotechnology 42, 137-159). In addition, vectors using the promoter of baculovirus P10 or the same basic protein can also be used. Furthermore, it is possible to express the recombinant protein as a secreted protein by connecting the secretory signal sequence of the envelope surface protein GP67 of Ac NPV to the N-terminal side of the target protein (Zheiei Wang, et al. 1998) Biol. Chem., 379, 167-174). As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known. Among them, yeast of the genus Saccharomyces, for example, baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as the yeast include, for example, a promoter for an alcohol dehydrogenase gene.
(Bennetzen, J. し and Hal l, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018 - 3025) や酸性フォスファタ一ゼ遺伝子のプロモーター (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5) などを好ましく利用できる。 ま た、 分泌型蛋白質として発現させる場合には、 分泌シグナル配列と宿主細胞の持 つ内在性プ口テアーゼあるいは既知のプロテァーゼの切断部位を N末端側に持つ 組換え体として発現することも可能である。 例えば、 トリプシン型セリンプロテ ァーゼのヒ トマス ト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、 N末端側 に酵母の αファタターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つ Κ Ε X 2プロテア一 ゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、 活性型トリプターゼが培地中に分 泌されることが知られている (Andrew, し Niles, et al . (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131)。 上記のようにして得られる形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該 培養により細胞内、 または細胞外に本発明の蛋白質が産生される。 該培養に用い
1ら られる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選 択でき、 例えば、 上記 C O S細胞であれば、 R P M I 1 6 4 0培地やダルベッコ 改変イーグル培地 (以下 「D M E M」 とレ、う) などの培地に、 必要に応じゥシ胎 児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。 上記培養により、 形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質 は、 該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法 により分離 ·精製することができる。 該方法としては、 具体的には例えば、 通常 の蛋白沈殿剤による処理、 限外濾過、 分子ふるいクロマトグラフィー (ゲル濾 過) 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフイエティ 一クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー (H P L C ) などの各種液 体クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組合せなどを例示できる。 また、 発現 させる組換え蛋白質に 6残基からなるヒスチジンを繫げることにより、 ニッケル ァフィ二ティーカラムで効率的に精製することができる。 上記方法を組み合わせ ることにより容易に高収率、 高純度で本発明の蛋白質を大量に製造できる。 このようにして本発明の D N Aを利用して、 遺伝子工学的手法により得られる 物質が、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を発現するためには、 必ずしも配列表 の配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 4 5のアミノ酸配列の全てを有するものであ る必要はなく、 例えばその部分配列であって、 それがウィルス活性化プロテア一 ゼ活性を示す限り、 それらのアミノ酸配列もまた本発明の蛋白質に包含される。 また、 該蛋白質をコードする D N Aも本発明に含まれる。 このようなウィルス活性化プロテアーゼ活性を有する蛋白質としては、 配列表 の配列番号 2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号 1のイソロイシン残基を N 末端とする 2 4 5個のアミノ酸からなる蛋白質を例示できる。 また、 該蛋白質を コードする D N Aも本発明における D N Aとして例示することができる。 好適に は、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 9 1から 8 2 5で示されるヌクレオ チド配列からなる D N Aである。
一般に真核生物の遺伝子は、 ィンタ一フエロン遺伝子などで知られているよう に、 多型現象 (polymorphi sm) を示すと考えられ (例えば、 Ni shi , T. et al. (1985) J. Biochem. 97, 153- 159を参照) 、 この多型現象によって、 一個または それ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、 ヌクレオチド配列の置換はあつ てもアミノ酸は全く変わらない場合もある。 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 — 3 0から 2 4 5に示されるアミノ酸配列からなる本発明の蛋白質の前駆体、 あ るいは同アミノ酸番号 1から 2 4 5に示されるアミノ酸配列からなる本発明の蛋 白質の成熟体のアミノ酸配列中の、 一つもしくは二つ以上の部位において、 一つ もしくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、 付加、 挿入もしくは置換されている蛋 白質でも、 ウィルス活性化プロテア一ゼ活性を有することが多い [天然型のアミ ノ酸配列が置換したァミノ酸配列を有する蛋白質が、 天然型蛋白質と同等の活性 を有する例として、 例えば、 インターロイキン 2 ( I L - 2 ) 遺伝子のシスティ ンに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して 得られた蛋白質が、 I L一 2活性を保持することが知られている。 (Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433) ] 。 それらの蛋白質は、 ウィルス活性 化プロテアーゼ活性を有する限り、 全て本発明に含まれる。 また、 これらの蛋白 質をコードする、 同効のヌクレオチド配列からなる D N Aも全て本発明に含まれ る。 このような各種の本発明の D N Aは、 上記ウィルス活性化プロテア一ゼ活性を 有する蛋白質の情報に基づいて、 例えばホスフアイ ト · トリエステル法 (Bennetzen, J. Shi and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) and the promoter of the acid phosphatase gene (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA 80, 1-5) can be preferably used. When expressed as a secretory protein, it can also be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and an endogenous protease of a host cell or a cleavage site for a known protease at the N-terminal side. is there. For example, in a system in which a trypsin-type serine protease human mast cell tryptase is expressed in petroleum yeast, a secretory signal sequence for α-fatase of yeast and the cleavage site of 石油 X2 protease in petroleum yeast are located at the N-terminal side. It is known that activated tryptase is secreted into the medium by tether expression (Andrew, and Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131). The transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the protein of the present invention intracellularly or extracellularly. Used for the culture The medium to be obtained can be appropriately selected from those commonly used depending on the host cell used. For example, in the case of the above COS cells, RPMI164 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”) A medium obtained by adding serum components such as fetal serum as needed can be used. The recombinant protein produced in the cells of the transformant or extracellularly by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical properties and chemical properties of the protein. it can. Examples of the method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, and the like. Examples include various liquid chromatography such as chromatography (HPLC), dialysis, and combinations thereof. Further, by adding histidine consisting of 6 residues to the recombinant protein to be expressed, it is possible to efficiently purify the protein with a nickel affinity column. By combining the above methods, the protein of the present invention can be easily produced in high yield and high purity in large quantities. In order for the substance obtained by the genetic engineering technique using the DNA of the present invention to express the virus-activating protease activity in this manner, it is not always necessary that the amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing be used. It is not necessary to have all of the amino acid sequences of, for example, a partial sequence thereof, as long as it shows a virus-activating protease activity, those amino acid sequences are also included in the protein of the present invention. . Further, DNAs encoding the protein are also included in the present invention. Examples of such a protein having a virus-activating protease activity include a protein consisting of 245 amino acids having an isoleucine residue at amino acid number 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as the N-terminus. . Further, a DNA encoding the protein can also be exemplified as the DNA in the present invention. Preferably, it is a DNA consisting of a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 91 to 825 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In general, eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism, as is known from the interferon gene (see, for example, Ni shi, T. et al. (1985) J. Biochem. 97, 153-159), but the polymorphism may result in the substitution of one or more amino acids, or the substitution of a nucleotide sequence may not change the amino acids at all. Amino acid number of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing—a precursor of the protein of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by 30 to 245, or a book consisting of the amino acid sequence represented by the same amino acid number of 1 to 245 A virus in which one or more amino acid residues are deleted, added, inserted or substituted at one or more sites in the amino acid sequence of the mature form of the protein of the present invention Activated protease activity is often present [Examples of a protein having an amino acid sequence in which a natural amino acid sequence is substituted have the same activity as a natural protein include, for example, interleukin 2 (IL- 2) It is known that a protein obtained by converting a nucleotide sequence corresponding to a cystine of a gene into a nucleotide sequence corresponding to serine retains IL-12 activity. (Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433)]. All such proteins are included in the present invention as long as they have virus-activating protease activity. Further, all DNAs encoding these proteins and having the same nucleotide sequence are also included in the present invention. Such various DNAs of the present invention can be prepared, for example, by the phosphite triester method based on information on the protein having the virus-activating protease activity.
(Hunkapi ller, M. et al. (1984) Nature 310, 105-111) などの常法に従い、 核酸の化学合成により製造することもできる。 なお、 所望のアミノ酸に対応するコ ドンは、 その選択も任意でよく、 例えば利 用する宿主のコ ドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。 (Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174) 。 さらに、 これらヌクレオチ ド配列のコ ドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードする合成オリゴ
ヌクレオチドからなるプライマーを利用した、 部位特異的変異導入法 (site specific mutagenes is/Mark, D. F. et al. (1984) Pro Natl. Acad. ^ci. USA 81, 5662-5666) などに従うことができる。 また、 任意の一つもしくは二つ 以上のァミノ酸残基を欠失させた改変体を作製するためには、 ェキソヌクレア一 ゼ B a 1 3 1等を用いて DN Aを末端から削る方法 (岸本 利光ら "続生化学実 験講座 1 ·遺伝子研究法 I I " 335-354)、 カセッ ト変異法 (岸本 利光、 "新生 化学実験講座 2 ·核酸 I I I組換え DNA技術 " 242-251) などに従うことがで さる。 また、 ある DN Aが配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 9 1から 8 2 5に 示されるヌクレオチド配列からなる DN Aとハイブリダィズするか否かは、 例え ば目的とする DNAをランダムプライマー法 (Anal. Biochem. , 132: 6013 (1983)) やニック トランスレーション法 (Maniatis, T. et al. (1982) in " Molecular し丄 oning A Laboratory Mannua丄 " し old Spring Harbor (Hunkapiller, M. et al. (1984) Nature 310, 105-111) and the like, and can also be produced by chemical synthesis of nucleic acid. The codon corresponding to the desired amino acid may be selected arbitrarily. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used. (Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174). Further, partial modification of these nucleotide sequence codons may be carried out by a conventional method using a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification. Site-specific mutagenesis using a primer consisting of nucleotides (site-specific mutagenes is / Mark, DF et al. (1984) Pro Natl. Acad. ^ Ci. USA 81, 5662-5666). In addition, in order to prepare a modified form in which one or two or more amino acid residues are deleted, a method in which DNA is trimmed from the end using exonuclease Ba131 (Kishimoto Toshimitsu et al. Follow the “Seismic Chemistry Laboratory Lecture 1 · Genetic Research Method II” 335-354), cassette mutation method (Toshimitsu Kishimoto, “Newborn Chemistry Laboratory Lecture 2 • Nucleic Acid III Recombinant DNA Technology” 242-251) There is a monkey. Whether or not a certain DNA hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in nucleotide Nos. 91 to 85 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is determined by, for example, random primer method (Anal Biochem., 132: 6013 (1983)) and the nick translation method (Maniatis, T. et al. (1982) in "Molecular oning A Laboratory Mannua") and old Spring Harbor.
Laboratory, NY. ) 等に従い、 [a— 32P] d C T P等で標識したプローブを用 いてハイブリダィゼ一ションを行い調べることができる。 ハイブリダィゼーショ ンに用いる DN Aは、 公知の方法、 例えばニ トロセルロース膜やナイロン膜等に 吸着させ、 加熱あるいは紫外線照射により固相化させる。 次いで、 その膜を例え ば 6 X S S C、 5% デンハート (Denhardt) 溶液および 0. 1 % ドデシル硫 酸ナトリウム (以下 「SD S」 という) を含むプレハイブリダィゼーシヨン溶液 に浸し、 5 5 °Cで 4時間以上保温する。 その後、 先に作成した標識プローブを同 様のプレハイプリダイゼ一ション溶液に最終比活性 1 X 1 06 c p m/m 1 とな るように加え、 60°Cでー晚保温する。 膜を 5 7°Cで 5分間洗浄する操作を 5回 繰り返し、 さらに 5 7 °Cで 20分間洗浄後、 オートラジオグラフィーを行うこと により、 ハイブリダィズしたか否かを判定することができる。 この方法を利用し て、 各種動物細胞由来の c DN Aライブラリ一から、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 9 1から 8 2 5に示されるヌクレオチド配列からなる DNAとハイ ブリダィズする c DNAを単離することができる。 (Maniatis, T. et al. (1982) in " Molecular し丄 on ng A Laboratory Mannua丄 " し old Spring Harbor
Laboratory, NY. ) 。 また、 本発明の蛋白質と特異的に結合する抗体の例として、 本発明の蛋白質と 特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、 その取得方法 は、 以下に記載する通りである。 モノクローナル抗体の製造にあたっては、 一般に下記のような作業工程が必要 である。 すなわち、 Laboratory, NY.), Etc., and can be examined by performing hybridization using a probe labeled with [a- 32 P] d CTP or the like. DNA used for hybridization is adsorbed on a known method, for example, a nitrogen film or a nylon film, and solidified by heating or irradiation with ultraviolet light. The membrane is then immersed in a prehybridization solution containing, for example, 6 XSSC, 5% Denhardt's solution and 0.1% sodium dodecyl sulfate (hereinafter “SDS”) at 55 ° C. Keep warm for at least 4 hours. Then, in addition to so that Do a final specific activity 1 X 1 0 6 cpm / m 1 labeled probe prepared in the same way the pre-High Priestess die peptidase one Deployment solution above, 60 ° C De晚incubated. The operation of washing the membrane at 57 ° C for 5 minutes is repeated 5 times, and after washing at 57 ° C for 20 minutes, autoradiography can be performed to determine whether hybridization has occurred. Using this method, a cDNA hybridizing with a DNA consisting of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 91 to 825 of SEQ ID NO: 1 from a cDNA library derived from various animal cells can be obtained. Can be isolated. (Maniatis, T. et al. (1982) in "Molecule on ng A Laboratory Mannua""old Spring Harbor Laboratory, NY.). Examples of the antibody that specifically binds to the protein of the present invention include a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention. The method for obtaining the monoclonal antibody is as described below. In the production of monoclonal antibodies, the following working steps are generally required. That is,
( a ) 抗原として使用する生体高分子の精製、 (a) purification of a biopolymer used as an antigen,
( b ) 抗原を動物に注射することにより免疫した後、 血液を採取しその抗体価を 検定して脾臓摘出の時期を決定してから、 抗体産生細胞を調製する工程、 (b) immunizing the animal by injecting the antigen with the antigen, collecting blood, assaying the antibody titer, determining the timing of splenectomy, and preparing antibody-producing cells;
( c ) 骨髄腫細胞 (以下 「ミエローマ」 という) の調製、 (c) preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma");
( d ) 抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、 (d) cell fusion between antibody-producing cells and myeloma,
( e ) 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマ群の選別、 (e) selection of a group of hybridomas producing the desired antibody,
( f ) 単一細胞クローンへの分割 (クローニング) 、 (f) Split into single cell clones (cloning),
( g ) 場合によっては、 モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリ ド 一マの培養、 またはハイブリ ドーマを移植した動物の飼育、 (g) In some cases, culture of hybridomas to produce large quantities of monoclonal antibodies, or breeding animals transplanted with hybridomas,
( h ) このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、 およびその認 識特異性の検討、 あるいは標識試薬と しての特性の検定、 (h) Examination of the physiological activity of the monoclonal antibody thus produced and its recognition specificity, or assay of the properties as a labeling reagent,
等である。 以下、 モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、 該抗体の 作製法はこれに制限されず、 例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマ を使用することもできる。 And so on. Hereinafter, a method for preparing a monoclonal antibody will be described in detail along the above steps, but the method for preparing the antibody is not limited thereto. For example, antibody-producing cells other than spleen cells and myeloma can also be used.
( a ) 抗原の精製 (a) Purification of antigen
抗原としては、 前記したような方法で調製した本発明の蛋白質またはその一部 を使用することができる。 さらに、 本発明により本発明の蛋白質の一次構造が明 らかにされたので、 当業者に周知の方法を用いて、 本発明の蛋白質の部分ぺプチ ドを化学合成し、 これを抗原として使用することもできる。
( b ) 抗体産生細胞の調製 As the antigen, the protein of the present invention or a part thereof prepared by the method described above can be used. Furthermore, since the primary structure of the protein of the present invention has been elucidated by the present invention, a partial peptide of the protein of the present invention is chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art, and this is used as an antigen. You can also. (b) Preparation of antibody-producing cells
工程 (a ) で得られた抗原と、 フロインドの完全または不完全アジュバント、 ま たは力リミヨゥバンのような助剤とを混合し、 免疫原として実験動物に免疫する。 実験動物としては、 マウスが最も好適に用いられるが、 これに限定されない。 The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or Rimiyodiban, and the animal is immunized as an immunogen. A mouse is most preferably used as an experimental animal, but is not limited thereto.
' マウス免疫の際の免疫原投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈内注射、 皮内 注射、 筋肉内注射いずれでもよいが、 皮下注射または腹腔内注射が好ましい。 免疫は、 一回、 または、 適当な間隔で (好ましくは 1週間から 5週間間隔で) 複数回繰返し行なうことができる。 その後、 免疫した動物の血清中の抗原に対す る抗体価を測定し、 抗体価が十分高くなつた動物を抗体産生細胞の供給原として 用いれば、 以後の操作の効果を高めることができる。 一般的には、 最終免疫後 3 〜5日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。 ここで用いられる抗体価の測定法としては、 放射性同位元素免疫定量法 (以下 「R I A法」 とレ、う) 、 固相酵素免疫定量法 (以下 「E L I S A法」 とレ、う) 、 蛍光抗体法、 受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、 検出感 度、 迅速性、 正確性、 および操作の自動化の可能性などの観点から、 R I A法ま たは E L I S A法がより好適である。 本発明における抗体価の測定は、 例えば E L I S A法によれば、 以下に記載す るような手順により行うことができる。 まず、 精製または部分精製した抗原を E L I S A用 9 6穴プレート等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着していな い固相表面を抗原と無関係なタンパク質、 例えばゥシ血清アルブミン (以下 「B S A」 とレ、う) により覆い、 該表面を洗浄後、 第一抗体として段階希釈した試料 (例えばマウス血清) に接触させ、 上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結 合させる。 さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加え てマウス抗体に結合させ、 洗浄後該酵素の基質を加え、 基質分解に基づく発色に よる吸光度の変化等を測定することにより、 抗体価を算出する。
(c) ミエローマの調製工程 'The method of immunogen administration for mouse immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or several times at appropriate intervals (preferably at intervals of 1 to 5 weeks). Thereafter, the antibody titer to the antigen in the serum of the immunized animal is measured, and the effect of the subsequent operation can be enhanced by using the animal having a sufficiently high antibody titer as a source of the antibody-producing cells. Generally, it is preferable to use antibody-producing cells derived from an animal 3 to 5 days after the final immunization for subsequent cell fusion. The methods for measuring antibody titer used herein include radioisotope immunoassay (hereinafter referred to as "RIA"), solid-phase enzyme immunoassay (hereinafter referred to as "ELISA"), and fluorescent antibody There are various well-known techniques such as the reactive hemagglutination method and the passive hemagglutination method.The RIA method or the ELISA method is more suitable in terms of detection sensitivity, rapidity, accuracy, and possibility of automation. is there. The measurement of the antibody titer in the present invention can be performed, for example, by the following procedure according to the ELISA method. First, the purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid surface on which the antigen is not adsorbed is exposed to a protein irrelevant to the antigen, for example, periplasmic albumin (hereinafter referred to as “ After washing the surface, the sample is contacted with a serially diluted sample (for example, mouse serum) as the first antibody, and the monoclonal antibody in the sample is bound to the antigen. Further, an antibody against an enzyme-labeled mouse antibody is added as a second antibody to bind to the mouse antibody.After washing, a substrate of the enzyme is added, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured, thereby obtaining an antibody titer. Is calculated. (c) Myeloma preparation process
ミエローマとしては、 一般的にはマウスから得られた株化細胞、 例えば 8—ァ ザグァニン耐性マウス (BALB/c由来) ミエローマ株 P3X63Ag8U.1(P3- 111) し elton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)] 、 P3/NSI /l_Ag4- 1 (NS- 1) [Kohler, G. et al. European J. Immu nology, 6, 511-519 (1976) ] 、 Sp2 /0— Agl4 (SP— 2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)] 、 P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)] 、 P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495 - 497 (1975)] などを用いることが好ま しい。 これらの細胞株は、 適当な培地、 例えば 8—ァザグァニン培地 [RPM I 一 1 640培地にグルタミン、 2—メルカプトエタノール、 ゲンタマイシン、 お よびゥシ胎児血清 (以下 「F C S」 という) を加えた培地に 8—ァザグァニンを カロえた培地] 、 イスコフ改変ダルベッコ培地 (Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium ;以下 「 I MDM」 とレ、う) 、 またはダルベッコ改変イーグル培地 As myeloma, cell lines generally obtained from mice, for example, 8-azaguanine-resistant mice (derived from BALB / c) myeloma strain P3X63Ag8U.1 (P3-111) and elton, DE et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3 / NSI / l_Ag4-1 (NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], Sp2 / 0—Agl4 (SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, JF et al. J. Immunology, 123, 1548 -1550 (1979)] and P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. and Harris, AW Nature, 256, 495-497 (1975)]. These cell lines are grown in an appropriate medium, for example, 8-azaguanine medium [RPM I 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (FCS)]. 8-Azaguanine-containing medium], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as "I MDM"), or Dulbecco's Modified Eagle Medium
(Dulbecco' s Modified Eagle Medium;以下 「DMEM」 とレ、う) で継代培養す るが、 細胞融合の 3乃至 4 日前に正常培地 [例えば、 1 0% F C Sを含む AS F 1 04培地 (味の素 (株) 社製) ] で継代培養し、 融合当日に 2 X 1 07以上 の細胞数を確保しておく。 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; hereafter referred to as “DMEM”), but 3-4 days before cell fusion, a normal medium [eg, an ASF104 medium containing 10% FCS Ajinomoto subcultured Co., Ltd.)], set aside 2 X 1 0 7 or more cell number day of fusion.
(d) 細胞融合 (d) Cell fusion
抗体産生細胞は、 形質細胞、 およびその前駆細胞であるリンパ球であり、 これ は個体のいずれの部位から得てもよく、 一般には脾、 リンパ節、 末梢血、 または これらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、 脾細胞が最も一般的 に用いられる。 最終免疫後、 所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部 位、 例えば脾臓を摘出し、 抗体産生細胞である脾細胞を調製する。 この脾細胞と 工程 (c) で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行わ れているのは、 細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコ一
ルを用いる方法である。 この方法は、 例えば以下の手順よりなる。 脾細胞とミエローマとを無血清培地 (例えば RPM I 1 64 0) 、 またはリン 酸緩衝生理食塩液 (以下 「PB S」 という) でよく洗浄し、 脾細胞とミエローマ の細胞数の比が 5 : 1〜 1 0 : 1程度になるように混合し、 遠心分離する。 上清 を除去し、 沈澱した細胞群をよくほぐした後、 撹拌しながら 1 m 1の 50% (w / v) ポリエチレングリコール (分子量 1 000〜4000) を含む無血清培地 を滴下する。 その後、 1 0m l の無血清培地をゆつく りと加えた後遠心分離す る。 再び上清を捨て、 沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン · アミノプテリン ' チミジン (以下 「HAT」 という) 液およびマウスインターロイキン一 2 (以下 「 I L一 2」 という) を含む正常培地 (以下 「HAT培地」 とレ、う) 中に懸濁し て培養用プレート (以下 「プレート」 とレ、う) の各ゥエルに分注し、 5% 炭酸 ガス存在下、 3 7°Cで 2週間程度培養する。 途中適宜 HAT培地を補う。 Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any part of an individual, such as spleen, lymph node, peripheral blood, or a combination thereof as appropriate. Splenocytes are most commonly used. After the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is excised from a mouse having a predetermined antibody titer, and spleen cells as antibody-producing cells are prepared. Currently, the most commonly used means for fusing the spleen cells with the myeloma obtained in step (c) is polyethylene glycol, which has relatively low cytotoxicity and simple fusion. This is a method using a file. This method includes, for example, the following procedure. The spleen cells and myeloma are thoroughly washed with a serum-free medium (eg, RPMI 164) or phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”), and the ratio of spleen cells to myeloma is 5: 1 to 10: Mix to about 1 and centrifuge. After removing the supernatant and thoroughly loosening the precipitated cell group, 1 ml of 50% (w / v) serum-free medium containing polyethylene glycol (molecular weight: 1,000 to 4,000) is added dropwise with stirring. Then, slowly add 10 ml of serum-free medium and centrifuge. The supernatant was discarded again, and the precipitated cells were placed in a normal medium (hereinafter referred to as “HAT”) containing an appropriate amount of hypoxanthine / aminopterin ′ thymidine (hereinafter referred to as “HAT”) solution and mouse interleukin-12 (hereinafter referred to as “IL-12”). Medium) and dispensed into each well of a culture plate (hereafter referred to as “plate”) and cultured at 37 ° C for about 2 weeks in the presence of 5% carbon dioxide. . Supplement the HAT medium as needed.
(e) ハイプリ ドーマ群の選択 (e) Selection of Hypri-Dorma group
上記ミエローマ細胞が、 8—ァザグァニン耐性株である場合、 すなわち、 ヒポ キサンチン · グァニン · ホスホリボシルトランスフェラーゼ (HGPRT) 欠損 株である場合、 融合しなかった該ミエロ一マ細胞、 およびミエローマ細胞どう し の融合細胞は、 HAT含有培地中では生存できない。 一方、 抗体産生細胞どう し の融合細胞、 あるいは、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイプリ ドーマは生 存することができるが、 抗体産生細胞どう しの融合細胞には寿命がある。 従つ て、 HAT含有培地中での培養を続けることによって、 抗体産生細胞とミエ口一 マ細胞とのハイプリ ドーマのみが生き残り、 結果的にハイプリ ドーマを選択する ことができる。 コロニー状に生育してきたハイブリ ドーマについて、 HAT培地からアミノプ テリンを除いた培地 (以下 「HT培地」 という) への培地交換を行う。 以後、 培 養上清の一部を採取し、 例えば、 E L I S A法により抗体価を測定する。 以上、 8—ァザグァニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、 その他の細
胞株もハイプリ ドーマの選択方法に応じて使用することができ、 その場合使用す る培地組成も変化する。 When the myeloma cell is an 8-azaguanine-resistant strain, that is, a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) -deficient strain, the unfused myeloma cell and the myeloma cell are fused. Cells cannot survive in HAT containing media. On the other hand, fusion cells between antibody-producing cells or hybridomas between antibody-producing cells and myeloma cells can survive, but a fusion cell between antibody-producing cells has a life span. Therefore, by continuing the culture in the HAT-containing medium, only the hybridomas of the antibody-producing cells and the myeoma cells survive, and as a result, the hybridomas can be selected. For the hybridomas that have grown into colonies, replace the medium with a medium in which aminopterin has been removed from the HAT medium (hereinafter referred to as “HT medium”). Thereafter, a part of the culture supernatant is collected, and the antibody titer is measured, for example, by ELISA. The method using an 8-azaguanine-resistant cell line has been described above. Cell strains can also be used depending on the method of selecting the hybridoma, in which case the composition of the medium used will also vary.
( f ) クロー二 (f) Claw
工程 (b ) の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、 特異的抗体を 産生することが判明したハイプリ ドーマを、 別のプレートに移しクローユングを 行う。 このクロ一ユング法としては、 プレートの 1 ゥエルに 1個のハイプリ ドー マが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、 軟寒天培地中で培養しコロニ 一を回収する軟寒天法、 マイクロマ二ュピレ一ターによって 1個づつの細胞を取 り出し培養する方法、 セルソ一ターによって 1個の細胞を分離する 「ソータク口 ーン」 などが挙げられるが、 限界希釈法が簡便でありよく用いられる。 抗体価の認められたゥエルについて、 例えば限界希釈法によるクローニングを 2〜4回繰返し、 安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクロ一ナル抗 体産生ハイプリ ドーマ株として選択する。 By measuring the antibody titer in the same manner as described in the step (b), the hybridoma that has been found to produce a specific antibody is transferred to another plate and clawed. The Cloung method includes a limiting dilution method in which a single well of a plate is diluted so that one hybridoma is contained therein, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a microagar method. A method of removing and culturing individual cells by a duplicater and a `` Sotak port '' that separates one cell by a cell sorter are available, but the limiting dilution method is simple and often used. Can be With respect to the wells for which the antibody titer is recognized, for example, cloning by the limiting dilution method is repeated 2 to 4 times, and those having a stable antibody titer are selected as the monoclonal antibody-producing hybridoma strain of the present invention.
( g ) ハイプリ ドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製 (g) Preparation of monoclonal antibody by hybridoma culturing
クローニングを完了したハイプリ ドーマは、 培地を H T培地から正常培地に換 えて培養される。 大量培養は、 大型培養瓶を用いた回転培養、 あるいはスピナ一 培養で行われる。 この大量培養における上清を、 ゲル濾過等、 当業者に周知の方 法を用いて精製することにより、 本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクロ一 ナル抗体を得ることができる。 また、 同系統のマウス (例えば、 上記の B A L B / c ) 、 あるいは N u / N uマウスの腹腔内で該ハイブリ ドーマを増殖させるこ とにより、 本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。 精製の簡便な方法としては、 市販のモノクローナル抗体精製キッ ト (例えば、 M A b T r a p G ilキッ ト ; フアルマシア社製) 等を利用することもできる。 かく して得られるモノクローナル抗体は、 本発明の蛋白質に対して高い抗原特 異性を有する。 The cloned hybridomas are cultured by replacing the medium with HT medium and normal medium. Large-scale cultivation is performed by rotary culture using large culture bottles or spinner culture. By purifying the supernatant in this large-scale culture using a method known to those skilled in the art such as gel filtration, a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained. In addition, ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by growing the hybridoma in the peritoneal cavity of a mouse of the same strain (for example, BALB / c) or a Nu / Nu mouse. Can be. As a simple purification method, a commercially available monoclonal antibody purification kit (for example, MabTrapGil kit; manufactured by Pharmacia) can be used. The monoclonal antibody thus obtained has a high antigen specificity to the protein of the present invention.
( h ) モノクローナル抗体の検定
かく して得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定 は以下のように行うことができる。 まず、 同定法としてはォクテルロニー (h) Monoclonal antibody assay The determination of the isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be performed as follows. First, as an identification method,
(Ouchterlony) 法、 E L I S A法、 または R I A法が挙げられる。 ォクテル口 ニー法は簡便ではあるが、 モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が 必要である。 一方、 E L I S A法または R I A法を用いた場合は、 培養上清をそ のまま抗原吸着固相と反応させ、 さらに第二次抗体として各種ィムノグロプリン アイソタイプ、 サブクラスに対応する抗体を用いることにより、 モノクローナル 抗体のアイソタイプ、 サブクラスを同定することが可能である。 また、 さらに簡 便な方法として、 市販の同定用のキッ ト (例えば、 マウスタイパーキッ ト ;バイ ォラッ ド社製) 等を利用することもできる。 さらに、 タンパク質の定量は、 フォ一リンロウリー法、 および 2 8 0 n mにお ける吸光度 [ 1 . 4 ( O D 2 8 0 ) =ィムノグロブリン 1 m g Z m 1 ] より算出 する方法により行うことができる。 このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、 その特異性を利用し た本発明の蛋白質の検出や分離精製に用いることができる。 (Ouchterlony) method, ELISA method, or RIA method. The Octel method is simple, but requires concentration when the concentration of monoclonal antibody is low. On the other hand, when the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and the antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as the secondary antibodies. It is possible to identify the isotypes and subclasses of As a simpler method, a commercially available identification kit (for example, mouse type kit; manufactured by Biorad) can be used. Furthermore, protein quantification can be performed by the Folin-Lowry method and a method of calculating from the absorbance at 280 nm [1.4 (OD280) = immunoglobulin 1 mg Zm1]. . The thus obtained monoclonal antibody of the present invention can be used for detection, separation and purification of the protein of the present invention utilizing its specificity.
[図面の簡単な説明] [Brief description of drawings]
図 1は、 精製プロテアーゼの S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動の結果を 示す図である。 FIG. 1 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of purified protease.
図 2は、 精製プロテアーゼによるセンダイウィルス外被蛋白質切断物の S D S ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動の結果を示す図である。 FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of a Sendai virus coat protein cleavage product using a purified protease.
図 3は、 組換えバキュロウィルス発現ベクターの構築図である。 FIG. 3 is a construction diagram of a recombinant baculovirus expression vector.
図 4は、 組換え蛋白質による合成べプチド基質切断活性を示した図である。 図 5は、 組換え蛋白質によるインフルエンザウイルス、 センダイウィルス外皮 蛋白質切断物の S D Sポリアクリルアミ ド電気泳動の結果を示した図である。 FIG. 4 is a diagram showing the activity of a recombinant protein to cleave a synthetic peptide substrate. FIG. 5 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide electrophoresis of a cut product of an influenza virus and Sendai virus coat protein by a recombinant protein.
[発明を実施するための最良の形態]
以下に実施例を挙げて、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに 限定されない。 実施例 1. プロテア一ゼの精製 [Best Mode for Carrying Out the Invention] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1. Purification of protease
ブタ (徳島市立食肉センターより入手) を断頭により脱血し、 脂肪等を取り除 いた新鮮ブタ肺をはさみを用いて約 1 c m角に細断したもの 2 0 O g重量当た り 0. 1 5M 塩化ナトリウムおよび 1 mM E D TAを含む2 5 πlM リン酸 カリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) 2 リッ トル中で均一に懸濁し、 1 0 0 0 0 X g、 1 5分、 4 °Cで遠心分離した。 遠心後の沈殿を等量の当量の 1 M 塩化ナトリウ ムおよび 1 % トリ トン X— 1 1 4を含む 2 5 mM リン酸カリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) に再懸濁し、 再度 l 0 0 0 0 X g、 1 5分、 4 °Cで遠心分離し、 上清 を回収した。 この上清を、 ベンザミジンセファロース 6 B (フアルマシア社製、 カラムサイズ ø 2 4 X 6 0 mm、 ベッ ドボリューム 2 5 m 1 ) に通し、 0. 5 M 塩化ナトリウムを含む 5 O mM リン酸カリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) 、 次いで 0. 5 M 塩化ナトリウムを含む 5 O mM 酢酸ナトリウム緩衝液 ( p H 7. 5 ) でカラムを洗浄した後、 2 5 mM ベンザミジンおよび 0 , 5 M 塩化ナトリ ゥムを含む 5 O mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) で溶出した。 この溶 出液を 0. 1 5 M 塩化ナトリウムを含む 2 5 mM リン酸カリウム緩衝液 (p H 7. 5 ) に対して透析した (スぺク トラポア社製の透析チューブ (6 0 0 0— 8 0 0 0カッ ト) を用い、 4°Cでー晚透析) 。 透析終了後、 透析チューブ内液を 氷浴中で限外濾過することにより濃縮した (限外濾過膜として YM— 1 0 (アミ コン社製) を使用した) 。 このようにして精製された蛋白質を還元条件下で S D S—ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動 (1 0— 2 0 %グラジェントゲルを使用) により解析した結果、 約 3 2 k D aに相当する位置に単一のバンドが検出された (図 1 ) 。 実施例 2. プロテアーゼ活性の検出 Pigs (obtained from the Tokushima Municipal Meat Center) are decapitated by decapitation, and fresh pig lungs from which fat has been removed are cut into approximately 1 cm squares using scissors. 20 Og weight 0.1 25 πlM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 5M sodium chloride and 1mM EDTA (pH 7.5) Suspend uniformly in 2 liters, 1000 x Xg, 15 min, 4 ° C And centrifuged. The precipitate obtained after centrifugation is resuspended in 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing an equal volume of 1 M sodium chloride and 1% triton X-114, and the solution is added again. The mixture was centrifuged at 00 X g for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant was collected. The supernatant is passed through Benzamidine Sepharose 6B (Pharmacia, column size ø24 x 60 mm, bed volume 25 m1), and 5 OmM potassium phosphate containing 0.5 M sodium chloride Wash the column with buffer (pH 7.5) and then with 5 OmM sodium acetate buffer (pH 7.5) containing 0.5 M sodium chloride, then wash with 25 mM benzamidine and 0.5 M chloride. Elution was carried out with 5 O mM sodium acetate buffer (pH 7.5) containing sodium. This eluate was dialyzed against 25 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.15 M sodium chloride (dialysis tubing manufactured by Spectra, Inc.). Dialysis at 4 ° C using 800 cuts). After completion of the dialysis, the solution in the dialysis tube was concentrated by ultrafiltration in an ice bath (YM-10 (manufactured by Amicon) was used as an ultrafiltration membrane). The protein purified in this way was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (using a 10-20% gradient gel) under reducing conditions. As a result, a position corresponding to about 32 kDa was obtained. A single band was detected (Fig. 1). Example 2. Detection of protease activity
1 0 %ゥシ血清を含む最小必須培地 (MEM) 1 m 1 あたり 1 X 1 06個の L
L C -MK 2 (AT C C C C L— 7 ) 細胞を直径 3 5 mmの培養用シャーレ ( 住友ベークライ ト社製) に蒔き、 5 %炭酸ガスと 9 5 %空気存在下、 3 7°Cで一 晚培養した。 細胞を P B S (—) または MEM— B Aで洗い、 無菌的に調製した センダイウィルス (AT C C V R— 1 0 5、 感染力価: m.0. i. = 1 0) 0. 5 m 1 を細胞に添加することにより感染させ、 5 %炭酸ガスと 9 5 %空気存在下、 3 7°Cで 6 0分静置した。 その間、 1 0乃至 1 5分毎に培養用フラスコを傾斜さ せ、 ウィルス液をフラスコ内底面全般に行き渡らせた。 その後、 細胞を MEM— B Aで細胞を 5回洗浄してから、 [3H] 標識一ダルコサミン (デュポン/二ュ —イングランドヌクレアーリサーチプロダク ト社製) 3. 7 MB qを含む l m l の MEM— B Aをフラスコ内に入れて、 5 %炭酸ガスと 9 5 %空気存在下、 3 7 °Cで 1 2乃至 1 6時間培養した。 培養後、 培養液を回収し、 2 5 0 0 r p m、 4°Cで 1 0分間冷却遠心を行った 。 遠心上清を 3 0 %ショ糖を含む N T E溶液を入れた遠心チューブ (1 3 P Aチ ユーブ ( φ 1 . 5 X 9. 6 c m、 日立製作所製) 内に積層し、 さらに遠心チュー ブ上部の空いた部分を NT Eで満たしてから、 3 9 0 0 0 r p m、 4°Cで 6 0分 間超遠心を行った。 沈殿物を 1 j 1あたり 1 0 0 0 0 0 d p mとなるように NT Eで懸濁したものを、 3H—標識センダイウィルス試料とした。 この3 H—標識 センダイウィルス 1 μ 1 と実施例 1で精製した蛋白質 (1 0乃至 3 0 μ g /mMinimum essential medium (MEM) 1 m 1 per 1 X 1 containing 1 0% © shea serum 0 6 L Seed LC-MK2 (AT CCCCL-7) cells into a 35 mm diameter culture dish (Sumitomo Bakelite) and culture at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. did. Wash cells with PBS (-) or MEM-BA and aseptically prepare Sendai virus (AT CCVR-105, infectious titer: m.0.i. = 10) 0.5 ml to cells The cells were infected by the addition, and allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. During this time, the culture flask was tilted every 10 to 15 minutes, and the virus solution was spread over the entire bottom surface in the flask. Thereafter, the cells are washed 5 times with MEM-BA, and [ 3 H] -labeled 1-dalcosamine (DuPont / New-England Nuclear Research Products) 3.7 ml of MEM containing 7 MB q BA was placed in a flask and cultured at 37 ° C. for 12 to 16 hours in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. After the culture, the culture solution was collected and subjected to centrifugation at 250 rpm at 4 ° C. for 10 minutes. The centrifuged supernatant was layered in a centrifuge tube (13 PA tube (φ1.5 x 9.6 cm, manufactured by Hitachi, Ltd.)) containing an NTE solution containing 30% sucrose. After filling the vacant portion with NTE, ultracentrifugation was performed at 390 rpm at 60 ° C for 60 minutes, and the precipitate was adjusted to 100 000 dpm / j1. The suspension in NTE was used as a 3 H-labeled Sendai virus sample 1 μl of the 3 H-labeled Sendai virus and the protein purified in Example 1 (10 to 30 μg / m 2).
1 ) 5〜 1 0 μ 1 を、 1 0 0 mM トリスー塩酸緩衝液 ( p H 7. 5 ) 中で、 終 容量 2 0 μ 1 として混合し、 3 7°C、 2時間反応させ、 反応物は 1 0— 2 0 %の アクリルアミ ドの濃度勾配を持つ S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により 分離した後、 ゲルのフルォログラフィーを行って分離されたバンドを検出した ( 図 2 ) 。 図 2のレーン 1 では切断前のセンダイウィルスの外被蛋白質 F 0のバン ド、 レーン 2では実施例 1で精製したプロテアーゼにより切断された F 1 と F 2 のバンドがそれぞれ検出された。 レーン 2において 2本のバンドのみが検出され ることから、 実施例 1で得られた蛋白質はセンダイウィルスの外被蛋白質を特定 の 1 ケ所のみで限定的に切断することが確認された。
また、 センダイウィルスの代りにインフルエンザウイルス、 しし〇ー^11: 2の 代りに MDCK細胞を用いて調製した標識インフルエンザウイルスを基質として 上記と同様の実験を行った結果、 実施例 1で得られた蛋白質はィンフルェンザゥ ィルスの外被蛋白質を特定の 1ケ所のみで限定的に切断することが確認された。 試験例. 動物細胞膜への融合活性の検定 1) Mix 5 to 10 μl in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to a final volume of 20 μl and react at 37 ° C for 2 hours. After separation by SDS polyacrylamide gel electrophoresis with a concentration gradient of 10 to 20% acrylamide, the separated bands were detected by fluorography of the gel (Fig. 2). In FIG. 2, a band of the coat protein F0 of Sendai virus before cleavage was detected in lane 1, and a band of F 1 and F 2 cleaved by the protease purified in Example 1 were detected in lane 2, respectively. Since only two bands were detected in lane 2, it was confirmed that the protein obtained in Example 1 cleaved the Sendai virus coat protein only at one specific site. In addition, the same experiment as above was performed using a labeled influenza virus prepared using MDCK cells instead of Sendai virus instead of influenza virus and Shishu ^ 11: 2 as a substrate. It was confirmed that the resulting protein cleaved the envelope protein of Influenza virgils only at one specific site. Test example. Assay of fusion activity to animal cell membrane
1 ) 標識赤血球の調製: 血液 9容に対し、 抗凝固剤としてアツシド · シト レート .デキス トロ—ス (Acid Citrate Dextrose) 力 1容となるようにヒ ト末 梢血を採血し、 氷冷した P B Sを用い、 4°C、 300◦ r pmで 5分間遠心する ことにより、 赤血球をよく洗浄する。 沈殿を回収して約 5 0%濃度の赤血球濃度 になるように PB Sで希釈した後、 へマトクリ ッ ト遠心機 (マイルス三共株式会 社製コンプール Ml 1 00) で赤血球濃度を正確に測定する。 20%赤血球1. 2m 1 に対し、 C h r 0 m i um 5 1 (アマシャム社製 C S J 1 1、 以下、 「5 1) Preparation of labeled erythrocytes: 9 volumes of blood were collected from human peripheral blood so that it had 1 volume of acid citrate Dextrose as an anticoagulant, and cooled on ice. Wash erythrocytes thoroughly by centrifugation at 300 ° rpm for 5 minutes at 4 ° C in PBS. After collecting the precipitate and diluting it with PBS to a red blood cell concentration of about 50%, accurately measure the red blood cell concentration with a hematocrit centrifuge (Miles Sankyo K.K. . Chr 0 mium 5 1 (Amersham CSJ 11; hereinafter, `` 5
1 C r」 とレ、う) を 1 0◦ μ 1加え、 3 7°Cで 6 ◦乃至 90分保温する。 P B S で遠心洗浄した後、 2%赤血球濃度になるように P B Sで希釈する。 1 Cr ”and add 10 ° μ1 and incubate at 37 ° C for 6 ° to 90 minutes. After washing by centrifugation with PBS, dilute with PBS to 2% erythrocyte concentration.
2) インフルエンザウイルス HA 0発現細胞の調製: 0. 42%ゥシ血清 アルブミンを含む MEM中で直径 1 00mmの細胞培養シャーレにコンフルェン トに増殖させた V e r o細胞 (ATCC番号 C R L— 1 5 8 6 ) にィンフルェ ンザウィルス A/P RZ8/34を m.o. i約 1 0で感染させる。 5%炭酸ガス一 9 5%空気中で 3 7DCで 6時間培養する。 培養後、 細胞をシャーレから回収し、 0. 4 2%ゥシ血清アルブミンを含む P B S (以下 「P B S— BA」 という) で 4°C、 3000 r pm、 5分間の遠心条件でよく洗浄し、 最後に 1 m 1の P B S —B A中に懸濁し、 インフルエンザウイルスの外被蛋白質へマグルチニン 0 (以 下 「HA0」 という) を細胞表面に発現している細胞を調製し、 一 20°Cで保存 する。 使用前には解凍し、 超音波処理により、 細胞を破壊する。 2) Preparation of influenza virus HA0 expressing cells: Vero cells (ATCC No. CRL—15686) confluently grown in a cell culture dish with a diameter of 100 mm in MEM containing 0.42% serum albumin ) Is infected with influenza virus A / P RZ8 / 34 at moi of about 10. Incubate at 37 DC for 6 hours in 95% air with 5% carbon dioxide. After culturing, the cells are collected from the Petri dish, washed well with PBS containing 0.4% 2% serum albumin (hereinafter referred to as “PBS-BA”) at 4 ° C, 3000 rpm, and centrifugation for 5 minutes. Finally, suspend cells in 1 ml of PBS-BA and prepare cells expressing influenza virus coat protein Magglutinin 0 (hereinafter referred to as “HA0”) on the cell surface and store at 20 ° C. I do. Thaw before use and disrupt cells by sonication.
3 ) H A 0発現細胞の限定切断: 実施例 1で得られる蛋白質標品 1 50 1に、 HA 0発現細胞 1 0 μ 1 を 50mMトリス—塩酸緩衝液 (p H 7. 5) 中
で終量 200 μ 1 となるように混和し、 3 7 °Cで 3時間乃至 24時間保温する。 3) Limited cleavage of HA0-expressing cells: In the protein preparation 1501 obtained in Example 1, 10 μl of HA0-expressing cells was added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Mix to a final volume of 200 μl and incubate at 37 ° C for 3 to 24 hours.
4) 赤血球溶血反応: 上記 3) で得られる、 限定的に切断した HAO発現 細胞 1 00 /i l と、 PB S— BA 900 μ 1 とを混合した後、 上記 1 ) で得ら れる51 C r標識赤血球 50 μ 1 を添加し、 氷上で 1 0分間静置する。 これを 4°C、 6000 r pmで 3分間遠心してから、 上清を除去する。 沈殿に 0. 4 2%ゥシ血清アルブミン、 0. 1 5M 塩化ナトリウムを含む 0. 1M 酢酸ナ トリゥム溶液 (pH 5. 0) を 500 1加える。 沈殿の赤血球を軽く攪拌し、 3 7。 で 30分保温した後、 4 °C、 6 000 r p mで 3分間遠心し、 上清 400 μ 1 を採取して、 その放射活性をガンマカウンター (パッカードジャパン社製力 ゥンターコブラ 5 003型) を用いて測定する。 ΗΑ0発現細胞の代わりに、 1 %トリ トン X— 1 00を添加した場合の放射活性を 1 00%、 同じく PB S— Β Αを添加した場合の放射活性を 0%として、 試料の動物細胞膜への融合活性を 評価する。 このようにして、 実施例 1で得られる蛋白質が HA 0を特定の場所で 切断し、 動物細胞膜への融合活性を発現させることを確認する。 実施例 3. c DNAクローニング 4) Erythrocyte hemolysis: After mixing 100 / il of the restricted HAO-expressing cells obtained in 3) above with 900 μl of PBS-BA, 51 Cr obtained in 1) above Add 50 µl of labeled erythrocytes and leave on ice for 10 minutes. Centrifuge at 6000 rpm for 3 minutes at 4 ° C, then remove the supernatant. To the precipitate, add 500 1 of 0.1M sodium acetate solution (pH 5.0) containing 0.4% 2% serum albumin and 0.15M sodium chloride. Gently agitate the precipitated red blood cells, 37. After incubating for 30 minutes at 4 ° C, centrifuge at 6000 rpm for 3 minutes, collect 400 µl of the supernatant, and measure the radioactivity using a gamma counter (Packard Japan Co., Ltd. Intercobra Model 5003). Measure. Assuming 100% radioactivity when 1% Triton X-100 is added instead of 0-expressing cells and 0% radioactivity when PBS-— is also added to the sample animal cell membrane To evaluate the fusion activity. In this way, it is confirmed that the protein obtained in Example 1 cleaves HA0 at a specific location and expresses a fusion activity to animal cell membranes. Example 3.c DNA cloning
1 ) N末端アミノ酸配列の解析 1) Analysis of N-terminal amino acid sequence
実施例 1で精製された蛋白質の N末端アミノ酸配列を、 気相自動蛋白質ァミノ 酸配列決定装置 (モデル 4 92、 パーキンエルマ一ジャパン ·アプライ ドバイオ システムズ社製) を用いて解析した結果、 配列表の配列番号 3に示されるァミノ 酸配列が得られた。 The N-terminal amino acid sequence of the protein purified in Example 1 was analyzed using a gas-phase automatic protein amino acid sequencer (Model 492, manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
2) ミニブタ肺からのポリ (A) +RNAの抽出 2) Extraction of poly (A) + RNA from lungs of miniature pigs
ポリ (A) +RNAの単離は、 酸性チォシアン酸グァニジン ' フエノール · ク ロロホルム法による全 RN Aの抽出およびピオチン化オリゴ (d T) プローブと アビジン固定化マグネッ ト粒子 (polyATtract mRNA単離システム、 プロメ ガ社製) を利用したポリ (A) +RNAの精製操作により実施した。 具体的には 、 以下の手順で行なった。
体重 38 k gのミニブタ ( (株) C SKリサーチパーク) を麻酔し、 肺を摘出 後直ちに液体窒素中で凍結させた。 肺組織 5 gを液体窒素で冷却しつつ木製ハン マーにて破砕した後、 肺破砕粉末を 6 Om 1の酸性チォシアン酸グァニジン · フ エノール溶液 ( I SOGEN、 (株) 二ツボンジーン社製) の入ったホモジナイ ザ一容器に移した。 この容器を氷上にて冷却しつつ、 ホモジナイザー用攪拌機 ( (株) 井内盛栄堂製) を用いて 5000 r pmで組織を磨り潰しつつ攪拌するこ とにより組織を破砕溶解した。 この肺組織溶解液を室温に 5分間静置後、 0. 2 容のクロロホルムを添加し激しく撹拌してから再び室温に 5分間静置した。 この 溶解液を 1 2000 X g、 4°Cで 1 5分間遠心した後、 水相を回収し、 ◦. 8容 のイソプロパノールを加え撹拌してから、 室温に 1 0分間静置した。 これを 1 2 000 X g、 4 °Cで 1 0分間遠心し、 回収した沈殿に 7 5%エタノールを加え撹 拌後、 7 500 X g、 4°Cで 5分間遠心して沈殿を回収した。 得られた沈殿を蒸 留水に溶解し、 ミニブタ肺の全 RN A約 4. 4 mg相当分を得た。 このようにして得られた全 RNA溶液 (RNAとして 2. 6mg相当、 2. 4 3m l ) を 6 5°Cで 1 0分間加熱した後、 50 p m o 1 / μ 1のピオチン化オリ ゴ ( d T) プローブ 1 0 μ 1および 6 0 1の 20 X S S C ( 3 Μ 塩化ナトリ ゥム、 0. 3Μ クェン酸ナトリウム、 ρΗ 7. 0) を加え、 穏やかに混合した 後、 室温になるまで静置することによりポリ (A) +RNAと結合させ、 0. 5 X S S Cで平衡化したス トレプトアビジン固定化マグネッ ト粒子を加えてビォチ ン Ζス トレプトアビジンの結合によりポリ (A) +RN Αをマグネッ ト粒子に捕 捉した。 このものを容器の外からマグネッ トスタンドを接触させて粒子を容器外 壁に固定した状態で溶液を交換する操作により、 マグネッ ト粒子に捕捉されたポ リ (A) +RNAを 1. 5m lの 0. 1 X S S Cで洗浄する操作を 4回繰り返し た後、 最終的に粒子を l m 1の蒸留水に懸濁することにより、 ポリ (A) +RN Aを溶出回収した。 このような操作により 8. のポリ (A) +RNAを得 た。
3) c DN Aライブラリーの作製 Isolation of poly (A) + RNA was performed by extraction of total RNA by guanidine acid thiocyanate phenol-chloroform method, a biotinylated oligo (dT) probe and avidin-immobilized magnet particles (polyATtract mRNA isolation system, The purification was performed by poly (A) + RNA purification using Promega. Specifically, the following procedure was performed. Minipigs weighing 38 kg (CSK Research Park Co., Ltd.) were anesthetized, and the lungs were immediately removed after removal of the lungs and frozen in liquid nitrogen. After 5 g of lung tissue was crushed with a wooden hammer while cooling with liquid nitrogen, the crushed lung powder was placed in a solution of 6 Om 1 of guanidine acid thiocyanate / phenol solution (ISOGEN, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). And transferred to a homogenizer container. While cooling this container on ice, the tissue was crushed and dissolved by grinding and stirring the tissue at 5000 rpm using a homogenizer stirrer (manufactured by Inuchi Seieido Co., Ltd.). After leaving the lung tissue lysate at room temperature for 5 minutes, 0.2 volume of chloroform was added, stirred vigorously, and left again at room temperature for 5 minutes. The lysate was centrifuged at 12000 × g at 4 ° C. for 15 minutes, and the aqueous phase was recovered. 8 volumes of isopropanol were added and stirred, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. This was centrifuged at 12,000 X g at 4 ° C for 10 minutes, and the recovered precipitate was stirred with 75% ethanol, and then centrifuged at 7500 X g at 4 ° C for 5 minutes to collect the precipitate. The obtained precipitate was dissolved in distilled water to obtain an amount equivalent to about 4.4 mg of the total RNA of the miniature pig lung. The total RNA solution (equivalent to 2.6 mg as RNA, 2.43 ml) obtained in this way was heated at 65 ° C for 10 minutes, and then a 50 pmo1 / μ1 biotinylated oligo (d T) Probes Add 10 μl and 60 1 of 20 XSSC (3-sodium chloride, 0.3-sodium citrate, ρ-7.0), mix gently, and let stand to room temperature. Then, streptavidin-immobilized magnet particles equilibrated with 0.5 XSSC were added, and poly (A) + RN て was bound by binding of biotin-streptavidin. Captured by magnet particles. By exchanging the solution while the particles are fixed to the outer wall of the container by contacting the magnet stand from the outside of the container, the poly (A) + RNA trapped by the magnet particles is reduced to 1.5 ml. After repeating the operation of washing with 0.1 XSSC four times, poly (A) + RNA was finally eluted and recovered by suspending the particles in 1 ml of distilled water. By such an operation, poly (A) + RNA of step 8 was obtained. 3) Preparation of cDNA library
c DNAライブラリーの作製はス トラタジーン社製の ZAP— c DNA合成キ ッ トを用いて行なった。 すなわち、 上記 2) で調製したポリ (A) +RNA (5 μ g相当) および 75単位のモロニ一マウス白血病ウィルス由来逆転写酵素を 5 0 1 の反応液 (1 Xファース トス トランド緩衝液、 0. 6mM dAT P、 d GTP、 d TT P、 0. 3 mM 5—メチル d C T P、 2. 8 μ g Xh o l リ ンカープライマー (以上キッ トに添付) ) 中で 3 7°C、 1時間反応させた。 この 反応液 45 1に、 20 /X 1のセカンドス トランド合成用緩衝液、 6 μ 1のセカ ンドス トランド合成用 d NT Ρ混合液 ( 1 OmM dAT P、 dGTP、 d TT P、 26 mM d CTP)、 1 1 4 1の滅菌水、 2 1 [32P] d GTP (2 9. 6 TB q/mmo l ) を加え、 さらに 3単位のリボヌクレア一ゼ Hおよび 1 00単位の DNAポリメラーゼ I (以上全てキッ トに添付) を添加し、 1 6°Cで 2. 5時間反応させた。 反応終了後直ちに氷上に移し、 23 / lのブランティン グ d NT P混合液 (2. 5 mM d ATP、 d GTP, d TTP、 d CTP) と 5単位のクローンド P f u DNAポリメラ一ゼ (キッ トに添付) を加え 7 2°C で 30分間反応を行った後、 フエノール/クロ口ホルム (1 : 1、 vZv) を加 え激しく撹拌した後、 遠心して水相を回収した。 さらに、 等量のクロ口ホルムを 加え、 再度遠心して水相を回収した。 このものに 0. 1容 (2 0 μ 1 ) の 3M 酢酸ナトリウムと 2倍容 (400 1 ) のエタノールを加えよく混合してから、 — 20°Cでー晚冷却した後、 遠心して沈殿を集め、 70% エタノール 50〇 μThe preparation of the cDNA library was performed using a ZAP-cDNA synthesis kit manufactured by Stratagene. That is, the poly (A) + RNA (equivalent to 5 μg) prepared in 2) above and 75 units of Moroni murine leukemia virus-derived reverse transcriptase were added to a reaction mixture of 501 (1X first strand buffer, 0 μl). Reaction at 37 ° C for 1 hour in 6 mM dATP, dGTP, dTTP, 0.3 mM 5-methyl dCTP, 2.8 μg Xhol linker primer (attached to the kit) I let it. In this reaction solution 451, add 20 / X1 buffer solution for second strand synthesis, 6 μl dNT Ρ mixture for second strand synthesis (1 OmM dATP, dGTP, dTTP, 26 mM dCTP ), 1 1 4 1 sterile water, 2 1 [ 32 P] d GTP (29.6 TB q / mmol), add 3 units of ribonuclease H and 100 units of DNA polymerase I (or more (All attached to the kit) and reacted at 16 ° C for 2.5 hours. Immediately after the reaction is completed, transfer to ice and mix with 23 / l of the dNTP mixed solution (2.5 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP) and 5 units of cloned Pfu DNA polymerase (KIT). The reaction was carried out at 72 ° C for 30 minutes, phenol / chloroform (1: 1, vZv) was added, the mixture was stirred vigorously, and the aqueous phase was collected by centrifugation. Furthermore, an equal volume of black-mouthed form was added, and the mixture was centrifuged again to collect the aqueous phase. Add 0.1 volume (20 μ 1) of 3M sodium acetate and 2 volumes (400 1) of ethanol to the mixture, mix well, then cool at -20 ° C, centrifuge and precipitate. Collect, 50% μ of 70% ethanol
1で沈殿を洗った後、 減圧乾燥した (以下、 同様の操作を 「エタノール沈殿」 と レヽう) 。 得られた沈殿を 9 μ 1の E c o R Iアダプター溶液 (0. 4 μ g/μ 1 ) に 4 °Cで 30分間以上静置することにより溶解し、 各 1 ;u 1の 1 0 Xリガーゼ 緩衝液、 1 0mM r ATP、 4単位/ μ ΐ Τ 4 DNAリガーゼ (以上キッ 卜に添付) を加え、 4°Cで 2日間反応させることにより、 E c o R Iアダプター を連結させた。 次いで 70°C、 30分間加熱することにより リガーゼを不活化し た。 反応液を室温に戻し、 1 1の 1 0 Xリガーゼ緩衝液、 2 μ 1の 1 0 mM r AT P、 6 μ 1の蒸留水、 1 μ 1 Τ 4ポリヌクレオチドキナーゼ ( 1 0単位 / 1 , キッ トに添付) を加え、 3 7°Cで 30分間反応させた後、 70°Cで 30
分間加熱することにより T 4ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。 反応液を 室温に戻した後、 28 1 X h o I反応用補足緩衝液、 3 /^ 1の 11 0 1 (4 0単位/; u l、 キッ トに添付) を加え 3 7°Cで 1. 5時間消化した。 5 μ 1の 1 Μ 塩化ナトリウムおよび 1 00 mM EDTAを含有する 2 0 OmM トリス 一塩酸緩衝液 (pH 7. 5、 以下 「1 0xS T E緩衝液」 とレ、う) と 1 2 5 μ 1 のエタノールを加え、 一 20°Cでー晚冷却した。 次に、 全量を遠心 (1 2000 X g、 4°C、 6 0分間) して沈殿を回収後、 減圧乾燥し、 1 4;u lの l X STE 緩衝液に溶解した。 この溶液に 3. 5 μ 1の染色液 (キッ ト添付) を加えてから 、 セファロース C L— 2 Βゲル濾過カラム (キッ ト添付) に加えた。 溶出液を 1 ◦ Ο μ ΐずつ分取し、 6番目と 7番目のフラクションをまとめ、 フエノール/ク ロロホルム抽出を行った後、 エタノール沈殿を行なった。 得られた沈殿を 3. 5 μ ΐの滅菌水に溶解し、 うち 2. 5 μ 1に対して 1 μ 1の Un i — ZAP X R ベクター (DNAとして 1 / g相当、 キッ ト添付) 、 ◦. 5 μ 1 の 1 0 Xリガー ゼ緩衝液、 0. 5 μ 1の 1 ◦ mM r ATP (p H 7. 5) 、 0. 5 /z lの T4 DNAリガ一ゼ (4単位/ /μ ΐ ) (以上キッ トに添付) を加え、 4°Cで 2日間 反応させた。 この反応溶液全量 (5 μ 1 ) を、 ギガパック I I I ゴールド パッ ケージングエキス トラク ト (キッ ト添付) に添加したものを、 2 2°Cで 2時間保 温することによりパッケージング反応を行なった。 その後、 この反応液に 1 00 mM 塩化ナトリウム、 8mM 硫酸マグネシウムおよび 0. 0 1 % ゼラチン を含む 5 OmM トリスー塩酸緩衝液 (p H 7. 5、 以下 「 S M緩衝液」 という ) 500 μ 1および 20 μ 1のクロ口ホルムを加え穏やかに混合した後、 遠心し て上清液 (プライマリーライブラリー) を得、 4 °Cにて保存した。 次いで、 得られたプライマリーライブラリーのタイターを以下に記載する方法 により決定した。 まず、 大腸菌 X L— 1 B l u e MRF' 株を 1 0mM 硫 酸マグネシウムおよび 0. 2% マルト一スを含む L B培地 ( 1 0 gの塩化ナト リゥム、 1 0 gのバク ト トリプトンおよび 5 gの酵母エキスを水 1 リ ッ トルに溶 解、 p H 7. 0に調整した培地) 中、 3 7°Cで培養した。 対数増殖期に、 遠心し て大腸菌体を回収し、 6 00 nmの吸光度 (OD 600) が 0. 5となるように 1
O mM 硫酸マグネシウム溶液を加えて懸濁した。 上記プライマリーライブラリ 一液 1 1または0. 1 μ 1 を、 2 0 0 / 1 の大腸菌懸濁液と混合し、 3 7°C で 1 5分間保温した後、 4 8 °Cに保温した軟寒天培地を加え、 滅菌済プラスチッ クシャーレに播種した。 このものを 3 7°Cで 6乃至 8時間培養後、 プラークを計 数することにより、 力価を算出した結果、 得られたプライマリーライブラリ一の 力価は 1 . 3 7 X 1 ◦ 6プラーク形成単位 (以下 「p f u」 とレ、う) であった。 プライマリーライブラリ一は一般に不安定であるので、 1 X 1 06 p f u相当の プライマリーライブラリ一を上述と同様の方法で再度大腸菌に感染させて増幅し たものを回収し、 ミ二ブタ肺 c DNAライブラリ一を得た。 After washing the precipitate in step 1, it was dried under reduced pressure (hereinafter, the same operation is referred to as “ethanol precipitation”). The obtained precipitate was dissolved in 9 μl of Eco RI adapter solution (0.4 μg / μ 1) by allowing to stand at 4 ° C for 30 minutes or more. A buffer solution, 10 mM rATP, 4 units / μΐ4 DNA ligase (attached to the kit) was added, and the mixture was allowed to react at 4 ° C. for 2 days, whereby an EcoRI adapter was linked. The ligase was then inactivated by heating at 70 ° C for 30 minutes. The reaction solution is returned to room temperature, and 11 of 10X ligase buffer, 2 μl of 10 mM rATP, 6 μl of distilled water, 1 μlΤ4 polynucleotide kinase (10 units / 1, (Attached to the kit), and react at 37 ° C for 30 minutes. The T4 polynucleotide kinase was inactivated by heating for minutes. After returning the reaction solution to room temperature, add 3 1 1 1 (40 units /; ul, attached to the kit) of 3 / ^ 1 supplementary buffer solution for 281 Xho I reaction, and add the buffer at 37 ° C. Digested for 5 hours. 20 μl of 20 mM Tris-HCl buffer containing 5 μl of 1Μ sodium chloride and 100 mM EDTA (pH 7.5, hereafter referred to as “10xS TE buffer”) and 125 μl of Ethanol was added and the mixture was cooled at -20 ° C. Next, the whole amount was centrifuged (12000 × g, 4 ° C., 60 minutes) to collect the precipitate, which was then dried under reduced pressure and dissolved in 14; ul of 1 × STE buffer. To this solution was added 3.5 μl of a staining solution (attached to the kit), and then to a Sepharose CL-2Β gel filtration column (attached to the kit). The eluate was collected at 1 μμΐ, the sixth and seventh fractions were combined, phenol / chloroform extraction was performed, and then ethanol precipitation was performed. Dissolve the resulting precipitate in 3.5 µl of sterile water, and add 1 µl of Uni-ZAP XR vector (equivalent to 1 / g as DNA, attached to kit) to 2.5 µl, ◦ 5 μl of 10 X ligase buffer, 0.5 μl of 1 mM rATP (pH 7.5), 0.5 / zl of T4 DNA ligase (4 units // μΐ) ) (Attached to the kit) and reacted at 4 ° C for 2 days. A packaging reaction was performed by adding the whole reaction solution (5 μl) to Gigapack III Gold Packaging Extract Extract (attached to the kit) and keeping the mixture at 22 ° C for 2 hours. Then, add 500 mM 1 and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, hereinafter referred to as “SM buffer”) containing 100 mM sodium chloride, 8 mM magnesium sulfate, and 0.01% gelatin. After adding 1 μl of form, the mixture was gently mixed and centrifuged to obtain a supernatant (primary library), which was stored at 4 ° C. Next, the titer of the obtained primary library was determined by the method described below. First, the E. coli XL-1 Blue MRF 'strain was transformed into an LB medium containing 10 mM magnesium sulfate and 0.2% maltose (10 g sodium chloride, 10 g bactotryptone and 5 g yeast). The extract was dissolved in 1 liter of water and cultured at 37 ° C in a medium adjusted to pH 7.0. During the logarithmic growth phase, the E. coli cells were collected by centrifugation, and the absorbance at 600 nm (OD600) was adjusted to 0.5. O mM magnesium sulfate solution was added to suspend. Mix 1 1 or 0.1 μl of the above primary library with 200/1 E. coli suspension, incubate at 37 ° C for 15 minutes, and then incubate at 48 ° C. The medium was added, and the cells were seeded on a sterilized plastic petri dish. After culturing this at 37 ° C for 6 to 8 hours, the plaque was counted and the titer was calculated.As a result, the titer of the primary library obtained was 1.37 × 1 ◦ 6 plaque formation Units (hereinafter referred to as “pfu”). Since the primary library one is generally unstable, 1 X 1 0 a 6 pfu equivalent of primary library one to recover what was amplified by infecting again E.coli in a manner similar to that described above, mini-pig lung c DNA library Got one.
4 ) ミニブタ肺 c D NAライブラリーを有するファージ DN Aの抽出 上記 3 ) で作製したミニブタ肺 c DNAライブラリーファ一ジ溶液およびラム ダファージ DNA抽出キッ ト (ウイザード ラムダ プレップス DNA精製シ ステム、 プロメガ社製) を用いて、 以下に記載する方法によりファージ DNAの 抽出を行なった。 まず、 SM緩衝液中のファージ溶液 (2. 5 X 1 09 p f u/ m l ) 1 5 m lに 6 0 μ 1のヌクレアーゼ混合液 (各 2 5 0 // 1のリボ ヌクレアーゼ Αおよびデォキシリボヌクレーゼ I、 キッ トに添付) を加え、 3 7 °Cで 1 5分間インキュベーションした。 次に、 6 m lのファージ沈殿剤 (キッ ト 添付) を加え、 穏やかに混和し、 氷上に 3 0分間静置した。 l O O O O X gで 1 0分間遠心し、 得られた沈殿を 7 5 0 ^ 1のファージ緩衝液 (キッ ト添付) に十 分に懸濁し、 遠心分離後、 上清を回収することにより不溶性の残渣を除去した。 この溶液を精製用レジン (キッ ト添付) と混合し、 8 0 %イソプロパノールで洗 浄後、 1 5 0 1 の蒸留水でファージ D NAを溶出した。 以上の操作により、 5 g相当のファージ DN Aを得た。 4) Extraction of phage DNA having minipig lung cDNA library Minipig lung cDNA library phage solution and lambda phage DNA extraction kit (Wizard Lambda Preps DNA Purification System, Promega) Was used to extract phage DNA by the method described below. First, the phage solution of SM buffer (2. 5 X 1 0 9 pfu / ml) 1 5 ml to 6 0 mu 1 nuclease mixture (each 2 5 0 // 1 of ribonuclease Α and Dokishiribonu (Clease I, attached to the kit) and incubated at 37 ° C for 15 minutes. Next, 6 ml of a phage precipitant (attached to the kit) was added, mixed gently, and left on ice for 30 minutes. l Centrifuge with OOOOX g for 10 minutes, suspend the resulting precipitate sufficiently in 750 ^ 1 phage buffer (attached to the kit), centrifuge, and collect the supernatant to recover the insoluble residue. Was removed. This solution was mixed with a purification resin (attached to the kit), washed with 80% isopropanol, and then phage DNA was eluted with 1501 distilled water. By the above operation, phage DNA equivalent to 5 g was obtained.
5 ) P C Rプライマーの合成 上記 1 ) で得られた N末端アミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に基づ き、 以下の混合オリゴヌクレオチドプライマ一 :
5' - gtnggnggna argargc -3' (TCN4 :配列表の配列番号 4) ;および 5'- arnacccayt gnggrtg -3' (T CNR 4 :配列表の配列番号 5) 5) Synthesis of PCR primers Based on the nucleotide sequence deduced from the N-terminal amino acid sequence obtained in 1) above, the following mixed oligonucleotide primers: 5'-gtnggnggna argargc-3 '(TCN4: SEQ ID NO: 4 in the sequence listing); and 5'-arnacccayt gnggrtg-3' (T CNR4: SEQ ID NO: 5 in the sequence listing)
(上記配列中、 rは gまたは aを、 yは tまたは cを、 nは aまたは cまたは gまたは tを それぞれ表す) のそれぞれをホスホアミダイ ト法 (Matteucci, M. D. and Carut hers, M. H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185- 3191参照) で化学合成した 。 オリゴヌクレオチド合成は、 自動 DN A合成機 (モデル 3 9 2、 パーキンエル マ一 . ジャパン .アプライ ドバイオシステムズ社製) を用いて、 そのマニュアル に従って行なった。 合成終了後、 オリゴヌクレオチドを支持体から開裂させ脱保 護を行い、 回収した溶液からオリゴヌクレオチド精製用カートリ ッジ (パーキン エルマ一 . ジャパン ·アプライ ドバイオシステムズ社製) を用いてオリゴヌクレ ォチドを精製した。 20%ァセトニトリルでカートリ ッジから溶出されたオリゴ ヌクレオチドを凍結乾燥して粉末状にしたものを蒸留水に溶解し、 使用するまで 一 20°Cで凍結保存した。 (In the above sequence, r represents g or a, y represents t or c, and n represents a or c or g or t, respectively). The phosphoramidite method (Matteucci, MD and Carut hers, MH (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191). Oligonucleotide synthesis was performed using an automatic DNA synthesizer (Model 392, PerkinElmer Japan Applied Biosystems) according to the manual. After the synthesis, the oligonucleotide is cleaved from the support and deprotected, and the oligonucleotide is purified from the recovered solution using a cartridge for oligonucleotide purification (Perkin Elmer I. Japan Applied Biosystems). did. Oligonucleotides eluted from the cartridge with 20% acetonitrile were freeze-dried and powdered, dissolved in distilled water, and stored frozen at 120 ° C until use.
6) P CRによる c DNA断片の増幅 6) PCR amplification of cDNA fragments
上記 3) で調製したミニブタ肺 c DN A由来ファージライブラリーより抽出し た DNA l O O n gと、 上記 5 ) で調製したオリゴヌクレオチドプライマ一 T CN4および TCNR4 各 3. 2 μ M、 ならびに d AT P、 d GT P、 d CT P、 d TTP各 200 μΜ (ジーンアンプ試薬キッ ト (パーキンエルマ一 ' ジャ パン 'アプライ ドバイオシステムズ社製) に添付。 以下において同じ) 、 4mM 塩化マグネシウム、 1 OmM トリス—塩酸 (p H 8. 3) 、 50 mM 塩化 カリウム、 1. 2 5単位の T a q D N Aポリメラーゼからなる 50 μ 1の反応 液を調製した。 この反応液を 94 °Cで 5分間加熱した後、 94 °Cで 30秒、 6 3 °Cで 30秒、 7 2 °Cで 1分の温度サイクルで 40サイクル繰り返してから、 72 °Cで 5分間保温した (ジーンアンプ P C Rシステム 9 700 (パーキンエルマ一 • ジャパン ·アプライ ドバイオシステムズ社製) を使用。 以下において同じ) 。 この反応液を 5%アク リルアミ ドゲル電気泳動で解析した結果、 目的とする 1 1 6 b pに近い大きさの DNA断片のバンドが観察された。 このバンド内の DNA 断片をゲルより電気溶出法により回収し、 T/ Aクロ一ユング法 (Clark, J. M.
et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16:9677 - 9686) により p T— a d vベクタ 一 (アドバンテージ P C Rクローユングキッ ト (クロンテック社製) に添付) に 連結し、 大腸菌 TOP 1 O F' 株 (キッ トに添付) に導入した。 得られた形質転換株 1 4クローンより、 プラスミ ド DN Aを抽出し、 揷入 DN Aについてジデォキシヌクレオチド鎖終結法によりヌクレオチド配列を決定した 。 その結果、 得られたヌクレオチド配列は、 上記 1 ) で得られた N末端アミノ酸 配列の一部 (配列表の配列番号 3のアミノ酸番号 2〜40) をコードするもので めつに。 The DNA extracted from the mini-pig lung cDNA phage library prepared in 3) above and 3.2 μM each of the oligonucleotide primers T CN4 and TCNR4 prepared in 5) above and d ATP , DGTP, dCTP, dTTP 200 μΜ each (attached to GeneAmp Reagent Kit (PerkinElmer-I Japan Applied Biosystems). Same in the following), 4 mM magnesium chloride, 1 OmM Tris —A 50 μl reaction mixture consisting of hydrochloric acid (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, and 1.25 units of Taq DNA polymerase was prepared. After heating the reaction at 94 ° C for 5 minutes, repeat the temperature cycle at 94 ° C for 30 seconds, 63 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute, and then at 72 ° C. Incubated for 5 minutes (using GeneAmp PCR System 9700 (PerkinElmer • Japan Applied Biosystems). Same below). The reaction solution was analyzed by 5% acrylamide gel electrophoresis. As a result, a target DNA fragment band having a size close to 116 bp was observed. The DNA fragments in this band were recovered from the gel by electroelution and analyzed by the T / A cross-Jung method (Clark, JM et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16: 9677-9686), ligated into pT-adv vector-1 (attached to Advantage PCR Closing Kit (Clontech)), and transformed into E. coli TOP1 OF 'strain (Kittech). (Attached to the project). Plasmid DNA was extracted from the resulting 14 clones, and the nucleotide sequence of the inserted DNA was determined by the dideoxynucleotide chain termination method. As a result, the obtained nucleotide sequence encodes a part of the N-terminal amino acid sequence (amino acid numbers 2 to 40 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) obtained in 1) above.
7) プラークハイブリダィゼーション用フィルターの調製 7) Preparation of filter for plaque hybridization
上記 3) で得られたミニブタ肺 c DNAライブラリーのうち、 2 X 1 0eプラ ーク相当の DNAをニ トロセルロースフィルター (ス トラタジーン社製) に固定 した。 すなわち、 ミニブタ肺 c DNAライブラリ一を有するファージの感染した 大腸菌を直径 1 5 cmのプレートあたり 5 X 1 04個のプラークが形成されるよ うに分散させた。 ニ トロセルロースフィルタ一はプレートに乗せて、 ファージプ ラークを移しとつた後、 1 8 Gの注射針で 3力所穴を空け印を付けた。 室温で 2 分間放置した後、 フィルターを剥がし、 アルカリ溶液 (0. 5 N 水酸化ナトリ ゥムおよび 1. 5M 塩化ナトリウム) 中に 2分間、 次いで中和溶液 (1. 5M 塩化ナトリウムを含む 0. 5M トリスー塩酸 (pH8. 0) ) 中に 5分間、 さらに洗浄液 (2 33〇を含む0. 2M トリスー塩酸 (p H 7. 5) ) 中に 30秒間浸した後、 室温で 2時間風乾させた。 風乾後のフィルタ一はさらに 80 °Cにて 2時間加温してプラークを固相化させた。 From the mini-pig lung cDNA library obtained in 3) above, DNA equivalent to 2 × 10 e plaques was immobilized on a nitrocellulose filter (Stratagene). That is, Escherichia coli infected with the phage having the mini swine lung cDNA library was dispersed so that 5 × 10 4 plaques were formed per 15 cm diameter plate. The nitrocellulose filter was placed on the plate, the phage plaque was transferred, and then three holes were made with an 18 G injection needle to mark. After leaving at room temperature for 2 minutes, remove the filter and place in an alkaline solution (0.5 N sodium hydroxide and 1.5 M sodium chloride) for 2 minutes, then neutralize solution (0.5 M sodium chloride containing 0.5 M sodium chloride). After immersing in 5M Tris-HCl (pH 8.0)) for 5 minutes and further in a washing solution (0.2 M Tris-HCl (pH 7.5) containing 233〇) for 30 seconds, it was air-dried at room temperature for 2 hours. . After air drying, the filter was further heated at 80 ° C. for 2 hours to solidify the plaque.
8) プローブの作製およびハイブリダィゼーション 8) Preparation and hybridization of probe
上記 6) で得られたクローン由来のプラスミ ドを制限酵素 E c 0 R Iで消化し て得られた挿入 DNA断片 (1 3 2 b p) をオリゴラベリングキッ ト (フアルマ シァ社製) を使用して32 P標識した (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1 983) Anal. Biochem. 132, 6) 。 次にゲル濾過用樹脂を充填したマイクロスピン
3b カラム (プローブ ' クアント G— 50マイクロカラム ; フアルマシア社製) を用 いて、 取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。 一方、 上記 7) で調製したプラーク転写済ニ トロセルロースフィルターを、 2 OmM 1, 4—ピぺラジンージエタンスルフォン酸 (P I P E S) 、 0. 8M 塩化ナトリウム、 50% 脱イオンホルムアミ ド、 0. 5% 303ぉょび1 00 g/m 1の変性サケ*** DNAを含む溶液中で、 3 7°C、 2時間インキュ ベーシヨンを行なった (プレハイブリダィゼーシヨン) 後、 32 P標識したプロ ーブを 1 X 1 06 c p mZフィルタ一となるよう添加し、 37。じで 1 2乃至 1 8 時間インキュベーションした (ハイブリダィゼーシヨン) 。 その後、 フィルター を 1 X S S C、 0. 1 % SD Sを含む溶液中で室温で 30分間、 さらに 0. 1 X S S C、 0. 1 % S D Sを含む溶液中で 43 °Cで 3 ◦分間洗浄してから、 ォ 一トラジオグラフィーを行なった。 その結果、 1次スク リーニングで 1 4個の陽 性クローンを得た。 上述の方法を繰り返すことにより、 最終的に 2個の陽性クロ ーンを得た。 個々の陽性クローンについて、 ZAP c DNA合成キッ ト (スト ラタジーン社製) に添付されたヘルパーファージ (ExAssist) と共に大腸菌 SO L R株に共感染させることにより、 目的の c DN Aを含む p B 1 u e s c r i p tファージミ ドベクターへの切り出しを行った。 以上の操作により、 p B l u e s c r i p tファージミ ドベクターに目的の c DNAが挿入されたプラスミ ド ( P TC 3 2— 2八ぉょび 丁じ 3 2— 1 5 A) を保持する形質転換大腸菌株を得 た。 これらファージミ ド DN Aについて制限酵素 E c o R Iおよび X h o I消化 を行って、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を実施し、 目的の c DNAの長さを 調べた。 その結果 2クローンとも目的の c DNAは約 1. l k b pからなり、 5 ' 末端側から約 400 b pの位置に制限酵素 Xh o I切断部位を有していた。 The plasmid derived from the clone obtained in 6) above was digested with the restriction enzyme Ec0RI, and the inserted DNA fragment (132 bp) was digested with an oligolabeling kit (Pharmacia). 32 P-labeled (Feinberg, AP and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6). Next, micro spin filled with gel filtration resin Unincorporated nucleotides were removed using a 3b column (Probe 'Quant G-50 microcolumn; manufactured by Pharmacia). On the other hand, the plaque-transferred nitrocellulose filter prepared in 7) above was washed with 2 OmM 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES), 0.8 M sodium chloride, 50% deionized formamide, 0% After incubation in a solution containing denatured salmon sperm DNA at 5% 303 and 100 g / m1 at 37 ° C for 2 hours (prehybridization), the cells were labeled with 32 P. added probe a 1 X 1 0 6 cp mZ filter first and so as, 37. For 12 to 18 hours (hybridization). Then, wash the filter in a solution containing 1 XSSC and 0.1% SDS for 30 minutes at room temperature, and further in a solution containing 0.1 XSSC and 0.1% SDS at 43 ° C for 3 ◦ minutes. Autoradiography was performed. As a result, 14 positive clones were obtained in the first screening. By repeating the above procedure, two positive clones were finally obtained. Each positive clone was co-infected with the helper phage (ExAssist) attached to the ZAP cDNA synthesis kit (Stratagene) to the E. coli SOLR strain to obtain pB1uescript containing the desired cDNA. Excision into a phagemid vector was performed. By the above procedure, a transformed Escherichia coli strain having a plasmid (PTC32-28) was inserted into the pBluescript phagemid vector and the desired cDNA was inserted. Obtained. These phagemid DNAs were digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to examine the length of the target cDNA. As a result, the target cDNA of both clones consisted of about 1. lkbp, and had a restriction enzyme XhoI cleavage site at about 400 bp from the 5 ′ end.
9) ヌクレオチド配列の決定 9) Determination of nucleotide sequence
上記 8) で得られた陽性クローンが保持するプラスミ Kp TC 3 2— 2Afc び p TC 3 2— 1 5 Aに揷入されている c DN Aの全ヌクレオチド配列をジデォ キシヌクレオチド鎖終結法により決定した。 なお、 一部の配列は全自動 DNA配
列解析装置 (モデル 3 7 3 A、 (株) パーキンエルマ一 · ジャパン ·アプライ ド バイオシステムズ社製) を使用して解析した。 その結果、 丁〇 3 2— 2 ぉょ び p T C 3 2— 1 5 Aは 1 06 5 b pの同一の配列 (配列表の配列番号 1 ) を有 していた。 このヌクレオチド配列は、 メチォニンで始まる 27 5残基のアミノ酸 からなるオープン . リーディング · フレーム (以下 「〇RF」 とレ、う) を有し、 また、 その OR Fの 3 ' 末端側の非翻訳領域にポリ (A) 鎖を有していた。 さら に、 このヌクレオチド配列、 および ORFにコードされているアミノ酸配列につ いて、 G e n B a n kおよび EMB Lの D N Aデータベースならびに S W I S S 一 P LOTプロティンデータベースに対して相同性検索を行った結果、 配列表の 配列番号 1の ORFにコードされるアミノ酸配列 (配列表の配列番号 2のァミノ 酸番号 1から 24 5) はヒ トマス ト細胞トリプターゼ (Miller, J. S. et. al. (1990) J. Clin. Invest. 86 864-870) と 74 %の相同性を有しているものの、 新規な蛋白質であることが判明した。 なお、 上記 c DN Aが挿入されたプラスミ ド p TC 3 2— 1 5 Aを保持する形 質転換大腸菌株 E. c o l i p TC 3 2 - l 5A SANK 722 98は、 平成 1 0年 8月 1 9日付けで日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の工業技術 院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、 受託番号 FERM B P— 64 6 6 が付された。 実施例 4. 組換え体の発現 The entire nucleotide sequence of cDNA inserted into the plasmid KpTC32-2Afc and pTC32-2-15A retained by the positive clone obtained in 8) above was determined by the dideoxynucleotide chain termination method. did. Some sequences are fully automated DNA The analysis was performed using a column analyzer (Model 373A, manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems). As a result, it was found that 324-2 and pTC32-15A had the same sequence of 1065 bp (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). This nucleotide sequence has an open reading frame consisting of 275 amino acids starting with methionine (hereinafter referred to as "〇RF") and an untranslated region at the 3 'end of the ORF. Had a poly (A) chain. Furthermore, a homology search was performed on the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the ORF against the GenBank and EMBL DNA databases and the SWISS-PLOT protein database. The amino acid sequence encoded by the ORF of SEQ ID NO: 1 (amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) is derived from human mast cell tryptase (Miller, JS et. Al. (1990) J. Clin. Invest 86 864-870), which was 74% homologous, but was found to be a novel protein. The transformed E. colip TC32-l5A SANK 722 98 carrying the plasmid pTC32-15A into which the above-mentioned cDNA was inserted was obtained on August 19, 1998. As of date, it has been internationally deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Tsukuba-Higashi 1-3-1, Ibaraki, Japan, under the accession number FERM BP-64666. Example 4. Expression of recombinant
1 ) 組換えバキュロウィルスの作製 1) Preparation of recombinant baculovirus
バキュロウィルス ·昆虫細胞発現系を利用して、 実施例 3で得られた c DN A を発現させ、 可溶性蛋白質を得た。 まず、 ポリヘドリンプロモーターの下流に、 G P 6 7分泌シグナル配列をコードする領域、 ァフィ二ティ一精製用の 6残基の ヒスチジン (以下 「ヒスチジン ' タグ」 とレ、う) をコードする領域、 次にェンテ 口キナーゼの切断部位をコードする領域に続き、 配列表の配列番号 2のアミノ酸 番号 1から 245に示すアミノ酸配列をコ一ドする c DN A領域を有し、 該 c D N Aを発現させるためのバキュ口ウィルス トランスファーべクターを構築した (
図 3 上記ベクター作製のために、 以下のオリゴヌクレオチドプライマ一: Using the baculovirus / insect cell expression system, the cDNA obtained in Example 3 was expressed to obtain a soluble protein. First, downstream of the polyhedrin promoter, a region encoding a GP67 secretion signal sequence, a region encoding a six-residue histidine for affinity purification (hereinafter referred to as "histidine 'tag"), Next, following the region encoding the cleavage site of the oral kinase, it has a cDNA region encoding the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and expresses the cDNA. Virus transfer vector for Figure 3 To prepare the above vector, the following oligonucleotide primers:
0 一 agatctcacc atcatcatca tcattcggac gacgatgaca agatcgtggg cggaaaggaa gc -3' (32 S B g 1 I I :配列表の配列番号 6) ;および 0 agatctcacc atcatcatca tcattcggac gacgatgaca agatcgtggg cggaaaggaa gc-3 '(32SBg1II: SEQ ID NO: 6 in Sequence Listing); and
0 - gaattctcag gactccctgg ggatacactg -3 0-gaattctcag gactccctgg ggatacactg -3
(3 2 RE c o R I :配列表の配列番号 7 ) (32 RE co RI: SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing)
を合成した。 次いで、 上記実施例 3で得られた p TC 3 2— 1 5 Aを铸型として、 LA P CRキッ ト ·バ一ジョン 2. 1 (宝酒造 (株) 社製) を用いた PC R反応を行な つた。 すなわち、 l n gの p TC 3 2— 1 5 Aプラスミ ド DNAと、 オリゴヌク レオチドプライマ一 (3 2 S B g l I Iおよび 3 2 RE c o R I ) 各 0. 2 μΜ 、 400 μ Μの d NT Ρおよび 2. 5 mM 塩化マグネシウムを含む 1 X L A P CR緩衝液、 0. 05単位の LA T a q DNAポリメラーゼ (以上キッ ト に添付) からなる 50 μ 1の反応液を調製した。. この反応液を 94 °Cで 2分間加 熱した後、 98 °Cで 30秒、 6 8 °Cで 1分の 2段階の温度サイクルを 30サイク ル繰り返してから、 72°Cで 5分間保温した (ジーンアンプ P C Rシステム 9 7 00 (パーキンエルマ一 · ジャパン 'アプライ ドバイオシステムズ社製) を使用 ) 。 この反応液を 5 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で解析した結果、 目的と する 8 76 b pに近い大きさの DNA断片のバンドが観察された。 このバンド内 の DNA断片をゲルより電気溶出法により回収し、 TZAクローユング法により p T— a d vベクター (アドバンテージ P C Rクロ一ニングキッ ト (クロンテツ ク社製) に添付) に連結し、 大腸菌 TOP 1 O F' 株 (キッ トに添付) に導入し た。 得られた形質転換株よりプラスミ ド DN A p T a d V G P TC 3 2を抽出 し、 挿入断片のヌクレオチド配列を確認した。 次に、 p T a d v G PTC 3 2を制限酵素 B g 1 I Iおよび E c o R Iで消化 し、 揷入 c DNA全長を含む 8 76 b pの断片を単離した。 一方、 バキュロウィ
ルス トランスファーべクタ一 p A c G P 6 7— B (ファーミンジェン社製) を制 限酵素 B a mH Iおよび E c o R Iで消化しアル力リフォスファターゼで脱リン 酸化した後、 T 4 DNAリガーゼを用いた反応により上記 8 7 6 b p断片を組み 込んだ。 このものをコンビテント大腸菌 DH 5 αに導入し、 得られた形質転換株 よりプラスミ ド DN Αを単離し、 このプラスミ ドを p G P T C 3 2と命名した。 次いで、 組換えバキュロウィルス作製のため、 p G P T C 3 2とバキュロウィ ルス D NA (バキュロゴールド : ファーミンジェン社製) を S f 9細胞 (インビ トロジェン社製) にコ ' トランスフエク トした。 すなわち、 3 μ gの p G P T C 3 2と 0. 5 μ gのバキュ口ゴールド D NAを混合し、 室温に 5分間置いた後、 1 m 1のトランスフエクシヨン緩衝液 B (ファーミンジェン社製) を加えた。 2 X 1 06個の S f 9細胞を 6 O mmの組織培養用シャーレにまき、 細胞がシヤー レに接着した後 (1時間後) 、 培地を除き、 1 m 1 のトランスフエクシヨン緩衝 液 Aを加えた。 これに上記のトランスフエクション緩衝液 Bと DN A溶液との混 合液を滴下した。 このものを 2 7 °Cで 4時間培養後、 トランスフエクション溶液 を除去し、 3 m l のTNM— F H培地 (ファーミンジェン社製) で細胞を 1回洗 浄し、 新たに TNM— F H培地 3 m 1 を加え、 2 7 °Cで 4日間培養した。 培養後 、 組換えバキュロウィルスを含む培養上清液を回収し、 1 0 0 0 r p m、 4°Cで 5分間遠心することにより細胞を除いた。 この上清液から目的のプロテア一ゼを 発現する組換えバキュロウィルスのクローンをプラーク形成法により単離した。 すなわち、 1 . 5 X 1 06の S f 9細胞を直径 3 5 mmの組織培養用シャーレに 蒔き、 細胞がシャーレに吸着した後 (1時間後) 、 培地を除き、 新たに 3 m l の TNM— F H培地を加えた。 一方、 組換えバキュロウィルスを含むトランスフエ クシヨン上清液の 1 03乃至 1 05倍の希釈系列を TNM— F H培地で作製し、 それら希釈ウィルス液 1 0 0 1 を細胞懸濁液に添加して、 2 7°Cで 1時間培養 した。 次いで、 上清を除き、 2 %ァガ口一ス (ァガープラーク 'プラス'ァガロー ス : ファーミンジェン社製) と T NM— F H培地とを等量混ぜ合わせた溶液 (予 め融解して 4 5 °Cに保温しておく) を加え、 2 0分間室温で放置することにより ァガ口一スを固めた。 このようにして作製された、 トランスフエクシヨン上清液
の希釈倍率がそれぞれ異なるァガロース培地上に、 1. 5m l のTNM—FH培 地を重層し、 2 7 °Cで 4乃至 5 日間培養した。 培養後、 0. 3%のニュートラル レッ ド (シグマ社製) 溶液を 1 m 1添加し、 2 7 で 3時間培養した後、 重層し た培地を除去して、 シャーレを上下逆さまの状態にして 1晚培養した。 この操作 により生細胞が染色されるので、 ウィルス感染細胞が死滅して染色が抜けた部分 (プラーク) を滅菌パスツールピペッ トでァガロース培地ごとく り抜いて、 50 0 μ 1の TNM— FH培地が入ったチューブに移し、 4 °Cにてー晚放置すること により、 ァガロース培地からウィルスを溶出させた。 このようにクローン化した 組換えバキュロウィルスを S f 9細胞に繰り返し感染させることにより、 高いゥ ィルスカ価 (1. 4 X 1 08プラーク形成単位 Zm 1以上) を有するウィルス液 を得た。 Was synthesized. Next, the PCR reaction using LA PCR Kit Version 2.1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was performed using pTC32-15A obtained in Example 3 above as Form II. It went. That is, lng of pTC32-15A plasmid DNA and oligonucleotide primers (32 SB glII and 32 REcoRI) 0.2 μΜ and 400 μΜ dNTΡ and 2. A 50 μl reaction solution was prepared consisting of 1 XLAP CR buffer containing 5 mM magnesium chloride and 0.05 units of LA Taq DNA polymerase (attached to the kit). After heating this reaction solution at 94 ° C for 2 minutes, a two-step temperature cycle of 98 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 cycles, and then at 72 ° C for 5 minutes. Incubated (using GeneAmp PCR System 9700 (PerkinElmer Japan, Applied Biosystems)). The reaction solution was analyzed by 5% polyacrylamide gel electrophoresis, and as a result, a band of a target DNA fragment having a size close to 876 bp was observed. The DNA fragment in this band was recovered from the gel by electroelution, ligated to the pT-adv vector (attached to Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)) by the TZA closing method, and E. coli TOP 1 OF ' Introduced to the stock (attached to the kit). Plasmid DN ApTad VGP TC32 was extracted from the obtained transformant, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was confirmed. Next, pTadvGPTC32 was digested with restriction enzymes BglII and EcoRI, and an 876 bp fragment containing the full length of the imported cDNA was isolated. Meanwhile, Baculowi Lus transfer vector pAcGP67-B (Pharmingen) is digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI, dephosphorylated with allyl phosphatase, and then T4 DNA ligase. The above-mentioned 8776 bp fragment was integrated by the reaction using This was introduced into competent Escherichia coli DH5α, a plasmid DN DN was isolated from the resulting transformant, and this plasmid was named pGPTC32. Next, pGPTC32 and Baculovirus DNA (Baculogold: Pharmingen) were transfected into Sf9 cells (Invitrogen) to produce a recombinant baculovirus. That is, 3 μg of pGPTC32 and 0.5 μg of Bakuguchi Gold DNA were mixed, left at room temperature for 5 minutes, and then mixed with 1 ml of Transfection Buffer B (Pharmingen). ) Was added. 2 × 10 6 Sf9 cells were spread on a 6-mm tissue culture dish, and after the cells had adhered to the dishes (after 1 hour), the medium was removed and 1 ml of transfection buffer was removed. A was added. The mixture of the above-mentioned transfection buffer B and the DNA solution was added dropwise thereto. After culturing the cells at 27 ° C for 4 hours, remove the transfection solution, wash the cells once with 3 ml of TNM-FH medium (manufactured by Pharmingen), and renew the TNM-FH medium. 3 ml was added, and the cells were cultured at 27 ° C for 4 days. After the culture, the culture supernatant containing the recombinant baculovirus was collected, and the cells were removed by centrifugation at 100 rpm at 4 ° C for 5 minutes. From this supernatant, a clone of the recombinant baculovirus expressing the desired protease was isolated by plaque formation. That is, 1.5 × 10 6 Sf9 cells were seeded on a tissue culture dish of 35 mm in diameter. After the cells were adsorbed to the dish (after 1 hour), the medium was removed, and 3 ml of TNM was newly added. — FH medium was added. Meanwhile, the 1 0 3 to 1 0 5-fold serial dilutions of transfected Hue Kushiyon supernatant containing the recombinant baculovirus was prepared by TNM- FH medium, adding them diluted virus solution 1 0 0 1 the cell suspension Then, the cells were cultured at 27 ° C for 1 hour. Next, the supernatant was removed, and a solution in which equal amounts of 2% agarose (Agar plaque 'plus' agarose: manufactured by Pharmingen) and TNM-FH medium were mixed (pre-melted to obtain 45%) And kept at room temperature for 20 minutes to harden the agar mouth. Transfection supernatant thus prepared Then, 1.5 ml of TNM-FH medium was overlaid on agarose medium having different dilution ratios, and cultured at 27 ° C. for 4 to 5 days. After culturing, add 1 ml of 0.3% neutral red (Sigma) solution, cultivate at 27 for 3 hours, remove the overlaid medium, and place the dish upside down. Cultured 1 晚. The viable cells are stained by this procedure, and the parts (plaques) from which the virus-infected cells have been killed and stained are removed using sterile Pasteur pipettes and agarose medium, and 500 μl of TNM-FH medium is added. The virus was eluted from the agarose medium by transferring it to a tube and leaving it at 4 ° C for 1 hour. Thus the cloned recombinant baculovirus by repeatedly infecting S f 9 cells, to obtain a virus solution having a high © Irusuka number (1. 4 X 1 0 8 plaque forming units Zm 1 or higher).
2) 昆虫細胞での発現 2) Expression in insect cells
2 X 1 07個の High Five細胞 (インビトロジェン社製) を組織培養用フラス コ (培養面積 1 7 5 cm2) に蒔き、 上記 1 ) で作製した組換えバキュ口ウィル スを含む溶液を添加し (感染力価: m. o. i . = 5) 、 2 7 °Cで 4日間培養し た後、 培養上清を回収した。 陰性対照として p A c G P 6 7— Bとバキュロゴ一 ノレ ド DNAとをコ. トランスフヱク トして得られた組換えバキュ口ウィルス感染 細胞の培養上清を同様の方法で回収した。 培養上清の一部 (1 m l ) を濃縮した ものについて、 SD S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 (ゲル濃度 1 2%) に よる解析を実施した。 その結果、 p G PTC 3 2とバキュ口ゴールド DNAとを コ- トランスフユク トして得られた組換えバキュロウィルス感染細胞の培養上清 のレーンのみに、 約 3 5 k D a相当の位置に濃いバンドが検出された。 次に同バ ンドを P VDF膜に転写し、 N末端アミノ酸配列を解析した。 その結果、 同バン ド內に含まれる蛋白質は、 p GPTC 3 2に挿入された DN Aにコードされるァ ミノ酸配列において、 G P 6 7分泌シグナル配列直後にあるアミノ酸配列: Ala-Asp-Leu-Gly-Ser (配列表の配列番号 8のアミノ酸番号 1から 5) で始まっていた。 上記 SD S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動の結果は目的の 蛋白質 (ヒスチジン . タグとェンテロキナーゼ切断配列を含む) の分子量とほぼ
合致していたので、 このバンドが p GPTC 3 2の発現産物であることが確認さ れた。 次に、 ヒスチジン · タグを利用したァフィ二ティ一精製、 および余分な N末端 側アミノ酸配列のェンテロキナーゼによる切断除去を行った。 まずァフィ二ティ 一精製は、 TALONメタルァフィ二ティーレジン (商標名 : クロンテック社製 ) を用いて行った。 上記の方法で得られた組換えバキュロウィルス感染細胞の培 養上清 4 Om l を 2 OmM トリスー塩酸緩衝液 ( p H 8. 0) 、 1 00 mM 塩化ナトリゥムを含む溶液に対して透析した後、 同溶液で予め平衡化した T A L ONメタルァフィ二ティーレジン (ベッ ドボリューム 0. 5m l ) を加え、 50 m 1容遠心チューブ中で 20分間室温で混合した後、 700 X g、 2分間遠心し 上清を除いた。 この後 1 Om 1の 2 OmM トリスー塩酸緩衝液 ( p H 8. 0) 、 1 0 OmM塩化ナトリウムを含む溶液でレジンを 3回洗浄し、 500 μ 1の 2 OmM トリスー塩酸緩衝液 (p H 8. 0) 、 1 00 mM 塩化ナトリウム、 1 0 OmM イミダゾールを含む溶液により溶出した。 このようにして、 40m l の培養上清から 1 80 μ gの組換え蛋白質が得られた。 この蛋白質からヒスチジ ン ' タグを除去するため、 組換えェンテロキナーゼキッ ト (ノバジェン社製) を 用いたェンテロキナーゼ反応を行なった。 すなわち、 上記組換え蛋白質を含む溶 出液 50 / l (蛋白質量 28. 4 μ g) をェンテロキナーゼ切断用緩衝溶液 (2 0 mM トリ ス—塩酸緩衝液 (p H 7. 4) 、 5 OmM 塩化ナトリウム、 2 m M 塩化カルシウム、 0. 5m g/m l デキス トラン硫酸 (平均分子量 50万 ) ) に対して透析した後、 0. 5単位の組換えェンテロキナーゼを添加し、 2 1 °Cでー晚インキュベーションした。 この操作により、 ヒスチジン ' タグが除去さ れた成熟体組換え蛋白質を得た。 2 X 1 0 7 single High Five cells (Invitrogen) were plated in tissue culture flasks (culture area 1 7 5 cm 2), a solution containing the recombinant Vacu port Virus prepared in the above 1) Then, the cells were cultured at 27 ° C for 4 days, and the culture supernatant was recovered. As a negative control, the culture supernatant of the cells infected with the recombinant baculovirus obtained by transfecting pAcGP67-B with baculologinole DNA was recovered in the same manner. A portion (1 ml) of the culture supernatant was concentrated and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration: 12%). As a result, only in the lane of the culture supernatant of the recombinant baculovirus-infected cells obtained by co-transfection of pGPTC32 and baculoguchi gold DNA, a position corresponding to about 35 kDa was obtained. A dark band was detected. Next, the band was transferred to a PVDF membrane, and the N-terminal amino acid sequence was analyzed. As a result, the protein contained in the band (1) contained the amino acid sequence immediately after the GP67 secretion signal sequence in the amino acid sequence encoded by the DNA inserted into pGPTC32: Ala-Asp-Leu -Gly-Ser (amino acid numbers 1 to 5 of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). The results of the above-mentioned SDS-polyacrylamide gel electrophoresis show that the molecular weight of the target protein (including histidine tag and enterokinase cleavage sequence) is almost the same. As a result, the band was confirmed to be an expression product of pGPTC32. Next, affinity purification using a histidine tag was performed, and excess N-terminal amino acid sequence was cleaved and removed by enterokinase. First, affinity purification was performed using TALON metal affinity resin (trade name: manufactured by Clontech). After dialyzing 4 Oml of the culture supernatant of the recombinant baculovirus-infected cells obtained by the above method against a solution containing 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 100 mM sodium chloride, Add TALON metal affinity resin (bed volume 0.5 ml) pre-equilibrated with the same solution, mix in a 50 ml 1 centrifuge tube for 20 minutes at room temperature, and centrifuge at 700 X g for 2 minutes. The supernatant was removed. Thereafter, the resin is washed three times with a solution containing 1 Om 1 of 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 10 OmM sodium chloride, and 500 μl of 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 8 .0), 100 mM sodium chloride and 100 OmM imidazole. In this way, 180 μg of the recombinant protein was obtained from 40 ml of the culture supernatant. To remove the histidine 'tag from this protein, an enterokinase reaction was performed using a recombinant enterokinase kit (Novagen). That is, 50 / l of the eluate containing the above-mentioned recombinant protein (28.4 μg of protein) was mixed with a buffer solution for enterokinase cleavage (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 OmM chloride). After dialysis against sodium, 2 mM calcium chloride and 0.5 mg / ml dextran sulfate (average molecular weight 500,000)), add 0.5 units of recombinant enterokinase, and heat at 21 ° C. Incubate. By this operation, a mature recombinant protein from which the histidine 'tag was removed was obtained.
3) 合成ペプチド基質に対する切断活性 3) Cleavage activity for synthetic peptide substrates
上記 2) において得られた成熟体組換え蛋白質 (1 0 n g) と 0. I mMの合 成ペプチド基質 (Boc- Gin- Ala- Arg- MCA) を、 20 mM トリスー塩酸緩衝液 ( p H 7. 4) および 0. 5 m gZm l デキス トラン硫酸を含む溶液中で混合し
、 室温で 0から 30分間インキュベートした後、 合成ペプチド基質の切断反応産 物である 7 -ァミノー 4—メチルクマリンを蛍光光度計を用いて定量した (励起 波長 3 70 nm ;検出波長 460 nm) 。 その結果、 時間経過に伴い蛍光の増加 が観察され、 上記 2) で得られた組換え蛋白質がプロテアーゼ活性を有すること が確認された (図 4) 。 The mature recombinant protein (10 ng) obtained in 2) above and 0.1 mM synthetic peptide substrate (Boc-Gin-Ala-Arg-MCA) were added to a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0). 4) and 0.5 mg gZml in a solution containing dextran sulfate. After incubation at room temperature for 0 to 30 minutes, 7-amino 4-methylcoumarin, a product of cleavage of the synthetic peptide substrate, was quantified using a fluorometer (excitation wavelength: 370 nm; detection wavelength: 460 nm). As a result, an increase in fluorescence was observed over time, confirming that the recombinant protein obtained in 2) above had protease activity (FIG. 4).
4) ウィルス外皮蛋白質に対する切断活性 4) Cleavage activity against viral coat protein
放射標識ィンフルェンザウィルスおよびセンダイウィルスは以下に示す方法に より調製した。 ィヌ腎由来細胞株 MDCK (ATCC CCL— 34) 1 X 1 0 6個細胞/ m 1 を組織培養用シャーレ (0 1 0 cm) に蒔き、 5 %炭酸ガスと 9 5%空気存在下、 3 7 °Cでー晚培養した。 この細胞を 0. 2 1 %のゥシ血清アル ブミンを含む最小必須培地 (MEM— BA) で洗浄してから、 無菌的に調製した インフルエンザウイルス (ATCC VR— 9 5、 1 07プラーク形成単位 Radiolabeled influenza virus and Sendai virus were prepared by the following method. Canine kidney-derived cell line MDCK (ATCC CCL-34) 1 × 10 6 cells / m 1 were seeded on a tissue culture dish (0.10 cm) and incubated in the presence of 5% CO 2 and 95% air. The cells were cultured at 7 ° C. Was washed with minimum essential medium the cells containing 0.2 1% © shea serum albumin (MEM- BA), aseptically prepared influenza virus (ATCC VR- 9 5, 1 0 7 plaque forming units
1 ) 0. 5m 1 を加えてウィルスを感染させ、 5%炭酸ガスと 9 5%空気存在下 、 3 7°Cで 60分静置した (その間、 1 0乃至 1 5分毎に培養用フラスコを傾斜 させ、 ウィルス液をフラスコ全般に行き渡らせた) 。 その後、 細胞を 5m l の M EM— B Aで 5回洗浄した後、 [3H] 標識した N—ァセチルダルコサミン (デ ュボン/ニューィングランドヌクレア一リサーチプロダク ト社) 500 X C iを 添加した 3 m 1の MEM— B A中で、 5 %炭酸ガスと 9 5 %空気存在下、 3 7 °C で 1 6時間培養した。 培養後、 培養上清を集め、 2500 r pmでl 0分間冷却 遠心を行って上清を回収し、 0. 1M 塩化ナトリウムおよび 1 mM EDTA を含む 1 0mM トリスー塩酸 (pH 7. 4 ) 溶液 (N T E ) に溶解した 30 % ショ糖溶液を入れた遠心チューブに重層した。 遠心チューブ上部の空いた部分 を NTEで満たし、 3 9000 r p mで 6 0分間、 4 °Cにて超遠心を行った。 回 収した沈殿を、 1 μ 1 あたりの放射活性が 1 000◦ 0 d pmとなるように NT Eで懸濁して、 標識ィンフルェンザウィルス試料を得た。 また、 放射標識センダイウィルスも、 上記と同様の方法において、 宿主細胞と こ L LC— MK2 (ATCC CCL一 7) を用い、 インフ
ルェンザウィルスの代りにセンダイウィルス (ATCC VR— 1 05) を用い ることにより調製した。 このようにして調製した放射標識ウィルス液 1 μ 1 と、 上記 2) で得られた成 熟体組換え蛋白質とを 2 OmM トリスー塩酸緩衝液 (p H 7. 4) および 0. 5m g/m 1 デキス トラン硫酸を含む溶液中 (20 μ 1 ) で混合し、 3 7°Cで 1 2時間インキュベートしてから、 1 3% SD Sポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動により反応産物を分離した。 泳動後のゲルを 25%のイソプロパノールおよ び 1 0%の酢酸を含む水溶液中で 30分間インキュベートし、 さらに増感液 (ァ ンプリファイ : アマシャム社製) 中で 30分間インキュベートした。 このゲルの フルォログラフィーを行って、 反応前後の放射標識されたバンドを検出した (図 5) 。 図 5のレーン 1では切断前のインフルエンザウイルス外皮蛋白質へマグル チニンのバンド (HA0) が検出されているが、 レーン 2および 3では添加した 成熟体組換え蛋白質の量 (レーン 2 : 1. 7 8、 レーン3 : 8. 3 / g) に依 存してィンフルェンザウィルス HA。が限定切断されていた。 センダイウィルス についても同様にレーン 4で切断前の融合蛋白質 F。が成熟体組換え蛋白質添加 により (レーン 5 : 1. 7 μ g、 レーン 6 : 8. 3 μ g) 、 限定的に切断を受け ることが確認された。 1) Add 0.5m1 to infect the virus, and incubate at 37 ° C for 60 minutes in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. (During this, culture flasks every 10 to 15 minutes The virus solution was spread over the entire flask.) Thereafter, the cells are washed 5 times with 5 ml of MEM-BA, and [ 3 H] -labeled N-acetyldarcosamine (Dubon / New England Nuclear Research Products) 500 XCi is added. The cells were cultured at 37 ° C. for 16 hours in 3 ml of MEM-BA in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air. After culturing, collect the culture supernatant, perform centrifugation at 2,500 rpm for 10 minutes, collect the supernatant, and recover a 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) solution containing 0.1 M sodium chloride and 1 mM EDTA ( This was overlaid on a centrifuge tube containing a 30% sucrose solution dissolved in NTE). The empty part at the top of the centrifuge tube was filled with NTE, and ultracentrifuged at 39,000 rpm for 60 minutes at 4 ° C. The collected precipitate was suspended in NTE so that the radioactivity per 1 μl was 1 000 0 dpm to obtain a labeled influenza virus sample. In the same manner as described above, radiolabeled Sendai virus is also used for influx using host cells and LLC-MK2 (ATCC CCL-17). It was prepared by using Sendai virus (ATCC VR-105) instead of Lenza virus. 1 μl of the radiolabeled virus solution prepared in this way and the mature recombinant protein obtained in 2) above were combined with 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and 0.5 mg / m After mixing in a solution containing 1 dextran sulfate (20 μl) and incubating at 37 ° C for 12 hours, the reaction products were separated by 13% SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The gel after electrophoresis was incubated for 30 minutes in an aqueous solution containing 25% isopropanol and 10% acetic acid, and further incubated for 30 minutes in a sensitizing solution (Amplify: manufactured by Amersham). Fluorography of this gel was performed to detect radiolabeled bands before and after the reaction (Figure 5). In FIG. 5, in lane 1, a band of maglutinin (HA 0 ) was detected in the influenza virus coat protein before cleavage, but in lanes 2 and 3, the amount of added mature recombinant protein (lane: 1.7 8 , Lane 3: 8.3 / g) depending on influenza virus HA. Was limited cut. Similarly for Sendai virus, the fusion protein F before cleavage in lane 4. Was confirmed to undergo limited cleavage by addition of the mature recombinant protein (lane 5: 1.7 μg, lane 6: 8.3 μg).
[産業上の利用の可能性] [Possibility of industrial use]
以上述べたごとく、 本発明により、 ウィルス感染症予防剤の探索に有用な新規 プロテァーゼおよび該プ口テアーゼを使用したウイルス感染症予防剤の新規試験 方法が提供された。 本発明は、 インフルエンザ等、 ウィルス感染症予防剤の探索 に有用である。
INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the present invention provides a novel protease useful for searching for a virus infectious disease preventive agent and a novel test method for a viral infectious disease preventive agent using the protease. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful for searching for a prophylactic agent for a viral infection such as influenza.
Claims
1. 分子中に配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 245に示されるァ ミノ酸配列を含み、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有することを特徴とする 蛋白質、 または、 分子中に該アミノ酸配列の一つもしくは二つ以上のアミノ酸が 付加、 欠失もしくは置換されているアミノ酸配列からなり、 ウィルス活性化プロ テア一ゼ活性を有することを特徴とする蛋白質。 1. a protein comprising, in a molecule thereof, an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having a virus-activating protease activity; or A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted or substituted, and having a virus-activating protease activity.
2. 分子中に配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1から 245に示されるァ ミノ酸配列を含み、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有することを特徴とする 請求の範囲第 1項記載の蛋白質。 2. The protein according to claim 1, wherein the molecule comprises an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and has a virus-activating protease activity.
3. ウィルス活性化プロテアーゼ活性が、 オルソミクソウィルス科またはパ ラミクソウィルス科に属するウィルスの外被蛋白質を基質とするものであること を特徴とする、 請求の範囲第 1項または第 2項記載の蛋白質。 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the virus-activating protease activity uses a coat protein of a virus belonging to the family Orthomyxoviridae or Paramyxoviridae as a substrate. Protein.
4. ウィルス活性化プロテア一ゼ活性が、 インフルエンザウイルスのへマグ ルチニンまたはセンダイウィルスの F蛋白質を基質とするものであることを特徴 とする、 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載の蛋白質。 4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the virus-activating protease activity is based on influenza virus hemagglutinin or Sendai virus F protein as a substrate. The protein according to any one of the above.
5. インフルエンザウイルスが自然感染し得る動物より得ることができるこ とを特徴とする、 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一つに記載の蛋白質。 5. The protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein can be obtained from an animal to which the influenza virus can be naturally infected.
6. 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 245に示されるアミノ酸配 列からなる蛋白質。 6. A protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
7. 形質転換大腸菌 E. c o l i p TC 3 2- 1 5A SANK 722 9 8 (F E RM B P— 646 6) が保持するプラスミ ドに挿入されている DN Aにコードされる蛋白質。 7. A DNA-encoded protein inserted into the plasmid carried by transformed E. coli IPTC 32-1-15A SANK 722 98 (FERMBP-64666).
8. 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白質をコ一ドす る D N A。 8. A DNA encoding the protein according to any one of claims 1 to 7.
9. 分子中に配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1から 8 28に示され るヌクレオチド配列を含む DNA。 9. DNA containing a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 828 of SEQ ID NO: 1 in the molecule.
1 0. 請求の範囲第 9項記載の DN Aとス トリンジェン卜な条件下でハイブ リダイズし、 ウィルス活性化プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするヌク レオチド配列を含むことを特徴とする DNA。
10. A DNA, which hybridizes with the DNA of claim 9 under stringent conditions and comprises a nucleotide sequence encoding a protein having a virus-activating protease activity.
1 1. 請求の範囲第 1 0項記載の DN Aであって、 該 DNAにコードされる ァミノ酸配列からなる蛋白質のウイルス活性化プ口テアーゼ活性により切断され 得る基質がオルソミクソウィルス科またはパラミクソウィルス科に属するウィル スの外被蛋白質であることを特徴とする DN A。 11. The DNA according to claim 10, wherein the substrate capable of being cleaved by a virus-activating protease activity of a protein comprising an amino acid sequence encoded by the DNA is an orthomyxoviridae or a parasite. DNA, which is a viral coat protein belonging to the Myxoviridae family.
1 2. 請求の範囲第 1 0項または第 1 1項記載の DN Aであって、 該 DNA にコードされるァミノ酸配列からなる蛋白質のウイルス活性化プロテァーゼ活性 により切断され得る基質がィンフルェンザウィルスのへマグルチニンまたはセン ダイウィルスの F蛋白質であることを特徴とする DNA。 12. The DNA according to claim 10 or 11, wherein the substrate capable of being cleaved by a virus-activating proteinase activity of a protein comprising an amino acid sequence encoded by the DNA is influenza virus. DNA characterized in that it is a hemagglutinin or Sendai virus F protein.
1 3. 形質転換大腸菌 E. c o l i p TC 3 2 - l 5A SANK 7 2 29 8 (F E RM B P— 646 6 ) が保持するプラスミ ドに挿入されている D N A。 1 3. DNA inserted into the plasmid carried by the transformed E. coli TC32-l5A SANK72228 (FERMBP-64666).
1 4. 請求の範囲第 8項乃至第 1 3項のいずれか一つに記載の DNAを含む 組換え DN Aベクター。 1 4. A recombinant DNA vector comprising the DNA according to any one of claims 8 to 13.
1 5. 形質転換大腸菌 E. c o l i p TC 3 2 - l 5A SANK 72 29 8 (FERM B P— 646 6 ) に保持されることを特徴とする、 請求の範 囲第 1 4項記載の組換え DN Aベクタ一。 1 5. The recombinant DNA according to claim 14, wherein the recombinant DNA is retained in transformed E. colip TC32-l5A SANK 72298 (FERM BP-6466). Vector one.
1 6. 発現べクタ一であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 4項記載の組 換え D N Aベクター。 1 6. The recombinant DNA vector according to claim 14, which is an expression vector.
1 7. 請求の範囲第 1 4項乃至第 1 6項のいずれか一つに記載の組換え DN Aベクターで形質転換された宿主細胞。 1 7. A host cell transformed with the recombinant DNA vector according to any one of claims 14 to 16.
1 8. 形質転換大腸菌 E. c o l i p TC 32 - l 5A SANK 72 29 8 (FERM B P— 646 6 ) であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 7項記載の宿主細胞。 1 8. The host cell according to claim 17, which is a transformed Escherichia coli E. colip TC32-l5A SANK 72298 (FERM BP-64666).
1 9. 請求の範囲第 1 6項に記載の組換え DN Aベクタ一で形質転換された 宿主細胞。 1 9. A host cell transformed with the recombinant DNA vector of claim 16.
20. 請求の範囲第 1 9項記載の宿主細胞を、 ウィルス活性化プロテア一ゼ 活性を有する蛋白質の産生が可能な条件下で培養し、 次いで、 該培養物よりウイ ルス活性化プロテアーゼ活性を有する蛋白質を回収することを特徴とする、 ウイ ルス活性化プロテアーゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
20. The host cell according to claim 19 is cultured under conditions capable of producing a protein having a virus-activating protease activity, and then the host cell has a virus-activating protease activity from the culture. A method for producing a protein having a virus-activating protease activity, comprising recovering the protein.
2 1 . 下記の ( i ) 乃至 ( i i i ) の工程を含む、 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白質の製造方法: 21. The method for producing a protein according to any one of claims 1 to 7, comprising the following steps (i) to (iii):
( i ) ベンザミジンを含まない溶媒に溶解させた請求の範囲第 1項乃至第 7項 のいずれか一つに記載の蛋白質を含む材料の抽出物を、 置換基と してベンザミジ ンを有するァフィ二ティークロマトグラフィー榭脂に吸着させる ; (i) An extract having the protein containing the protein according to any one of claims 1 to 7 dissolved in a solvent not containing benzamidine, wherein the extract has benzamidine as a substituent. Adsorbed to tea chromatography fat;
( i i ) ( i ) の樹脂をべンザミジンを含まない溶媒で洗浄する ; (ii) washing the resin of (i) with a benzamidine-free solvent;
( i i i ) ( i i ) で洗浄された樹脂から、 ベンザミジンを含む溶媒でウィル ス活性化プロテアーゼ活性を有する蛋白質を溶出させる。 (ii) From the resin washed in (ii), a protein having virus-activating protease activity is eluted with a solvent containing benzamidine.
2 2 . 化合物または組成物試料のウィルス感染症予防剤としての効果を試験 する方法であって、 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白 質、 該蛋白質が特異的に切断する基質および被検試料を共存させ、 次いで該蛋白 質による基質の切断を該被検試料が阻害する活性を検出することを特徴とする方 法。 22. A method for testing the effect of a compound or composition sample as a prophylactic agent for a viral infection, wherein the protein according to any one of claims 1 to 7 is characterized in that the protein is specific. A method comprising: coexisting a substrate to be cleaved selectively and a test sample; and then detecting an activity of the test sample to inhibit cleavage of the substrate by the protein.
2 3 . 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白質、 該蛋白 質が特異的に切断する基質および被検試料を共存させ、 次いで該蛋白質による基 質の切断を該被検試料が阻害する活性を検出することを特徴とする、 化合物また は組成物試料のウィルス感染症予防剤としての効果を試験する方法のための、 請 求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白質の使用。 23. The protein according to any one of claims 1 to 7, a substrate that specifically cleaves the protein, and a test sample are allowed to coexist, and then cleavage of the substrate by the protein is performed. Claims 1 to 7 for a method for testing the effect of a compound or composition sample as a prophylactic agent for a viral infection, characterized by detecting an activity inhibited by the test sample. Use of the protein according to any one of the above items.
2 4 . 請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか一つに記載の蛋白質と特異的 に結合する抗体。
24. An antibody that specifically binds to the protein according to any one of claims 1 to 7.
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