WO2000010607A1 - Produits preventifs ou therapeutiques de la pancreatite contenant des antagonistes de il-6 comme substance active - Google Patents

Produits preventifs ou therapeutiques de la pancreatite contenant des antagonistes de il-6 comme substance active Download PDF

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WO2000010607A1
WO2000010607A1 PCT/JP1999/004533 JP9904533W WO0010607A1 WO 2000010607 A1 WO2000010607 A1 WO 2000010607A1 JP 9904533 W JP9904533 W JP 9904533W WO 0010607 A1 WO0010607 A1 WO 0010607A1
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antibody
antibody against
inflammation
therapeutic agent
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Akihiro Funakoshi
Kyoko Miyasaka
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for inflammation containing interleukin-6 (IL-6) antagonist as an active ingredient.
  • IL-6 interleukin-6
  • I-6 is a site-powered insulin also termed B cell stimulating factor 2 (BSF2) or Interflon / 32.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), and subsequently It has been revealed that it is a multifunctional site that affects cell function (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). I-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the I-6 receptor for a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967). -981, Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-82 8).
  • the IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly consisting of its extracellular region, in addition to the membrane-bound type expressed through the cell membrane and expressed on the cell membrane.
  • the other is gpl30, a membrane protein with a molecular weight of approximately 130 kD involved in nonligand-binding signal transduction.
  • 1-6 and ⁇ -6 receptors are I-6 / I-6 By forming a receptor complex and then binding to gpl30, the biological activity of 1L-6 is transmitted intracellularly (Taga, T. et al., Cell (198 9) 58, 573-581 ).
  • -6 Antagonist is a substance that inhibits the transmission of biological activity of 1L-6. So far, antibodies against 1L-6 (anti-IL-6 antibody), antibodies against 6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibodies against gpl30 (anti-gpl30 antibody), IL-6 variants, IL-6 -6 or 1L-6 receptor partial peptides are known.
  • Pancreatitis is an inflammatory disease that causes autolysis in knee tissue due to enzyme activation.
  • a comparison of the amount of 1L-6 produced by peripheral blood mononuclear cells between patients with acute inflammation and healthy subjects shows that they are significantly higher in patients with acute knee inflammation, and that acute acute inflammation has been associated with systemic complications.
  • blood levels of 1 to 6 were higher in severe cases of patients with acute tengitis, and they responded earlier than other parameters, thus predicting the severity of inflammation. (Inagaki, T. et al., Pancreas , 14, 1-8, 1997) o
  • the present invention aims to provide a preventive or therapeutic agent for spleenitis which does not have the above-mentioned disadvantages.
  • the present invention provides (1) a prophylactic or therapeutic agent for inflammation comprising IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the present invention also provides (2) a prophylactic or therapeutic agent for Tengitis containing an antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also provides (3) an agent for preventing or treating optic inflammation, which comprises a monoclonal antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also provides (4) a prophylactic or therapeutic agent for inflammation comprising a monoclonal antibody against human IL-6 receptor as an active ingredient.
  • Monoclonal antibodies to the human IL-6 receptor are preferably PM-1 antibodies.
  • the present invention also provides (5) a prophylactic or therapeutic agent for osteoarthritis, comprising a monoclonal antibody against mouse Pelle 6 receptor as an active ingredient.
  • the monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor is preferably the MR161 antibody.
  • the present invention also provides (6) an agent for preventing or treating knee inflammation, which comprises a recombinant antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • Recombinant antibodies to the IL-6 receptor preferably have a human antibody constant region (C region).
  • the present invention also provides (7) a prophylactic or therapeutic agent for inflammation containing a chimeric antibody or humanized antibody against 1L-6 receptor as an active ingredient. It is intended to provide a prophylactic or therapeutic agent for inflammation, comprising a modified PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides (9) an agent for preventing or treating acute inflammation or chronic armitis, which comprises the IL-6 antagonist according to any of (1) to (8) as an active ingredient.
  • Acute or chronic knee inflammation is, for example, severe or mild knee inflammation.
  • the present invention also provides (10) an agent for suppressing renal edema in osteoarthritis, which comprises, as an active ingredient, the 6-antagonist described in (1) to (8).
  • the present invention further provides (11) an agent for suppressing Teng edema in inflammation, comprising an antibody against the IL-6 receptor according to any one of (3) to (8) as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows that 6-transgenic jejunic mice increased their knee weight as a result of Teng edema due to administration of cellulain compared to normal mice. is there.
  • FIG. 2 is a graph showing that administration of an anti-1L-6 receptor antibody suppresses it.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of the tissue of a knee in which acute mucositis was induced by administering cellulane to a normal mouse, and is a photograph substituted for a drawing showing the morphology of an organism.
  • Figure 3 is a photomicrograph of the tissue of a Teng gland that developed acute Tengitis by administering cellulin to a 6-transgenic mouse, and is a drawing substitute photograph showing the morphology of the organism.
  • Fig. 4 is a micrograph of the tissue of the liver when acute transflammation is induced by administering cellulane to 6-transgenic jenic mice and MR16-1 is administered. It is a substitute photograph. Compared to the normal mouse cell line-induced inflammation in Fig. 2, the cell line-induced inflammation in the 6-transgenic mice shown in Fig. 3 was worse (ie, interstitial edema and inflammation). In contrast, in FIG. 4, exacerbation is suppressed by administration of the anti-IL-6 receptor antibody MR16-1 in FIG.
  • FIG. 5 shows that the increase in rat weight in IL-6 transgenic mice induced by LPS and cellulin administration is suppressed by administration of anti-I-6 receptor antibody.
  • the 1L-6 antagonist used in the present invention is not limited in its origin, type and shape, as long as it exhibits a prophylactic or therapeutic effect on inflammation or an inhibitory effect on spleen edema in spleenitis.
  • IL-6 antagonist is a substance that blocks signal transduction by IL-6 and inhibits biological activity of I-6.
  • the IL-6 antagonist preferably inhibits binding to any of the 6, IL-6 receptor and gpl30. It is a substance that has harmful effects.
  • examples of the IL-6 antagonist include an anti-IL-6 antibody, an anti-IL-6 receptor antibody, an anti-gpl30 antibody, a modified IL-6, a modified soluble IL-6 receptor or 1L-6 Or a partial peptide of one or six receptors and a low-molecular substance having the same activity as these.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • mammalian-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to 1L-6, this antibody inhibits the binding of I-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of IL-6 biological activity into cells.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st edition). The General Meeting of the Immunological Society of Japan, Academic Records (1991) 21, 166).
  • a hybridoma producing an anti-1 antibody can be basically produced as follows using a known technique. That is, I-6 is used as a sensitizing antigen, and immunized with the same according to a usual immunization method, and the obtained immunized cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and the normal It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method.
  • an anti-IL-6 antibody may be prepared as follows.
  • human 1 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies is Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688. It can be obtained by using the obtained IL-6 gene Z amino acid sequence.
  • the target 1L-6 protein After inserting the gene sequence of IL-6 into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target 1L-6 protein can be isolated from the host cell or from the culture supernatant.
  • the purified protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of the L-6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. is there. By binding to the IL-6 receptor, this antibody inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of IL-6 biological activity into cells.
  • Such antibodies include the MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928) and the PM-1 antibody ( ⁇ rata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • a particularly preferred antibody is the PM-1 antibody.
  • the PM-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as PM-1 by the National Institute of Bioscience and Human-Technology (Tsukuba-Higashi 1-3-1-3, Ibaraki Prefecture) as a PM-1 in July 1990. On October 10, it was deposited internationally under FERM BP-2998 under the Budapest Treaty.
  • the MR16-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as Rat-mouse hybridoma MR16-1 by the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) as a rat-mouse hybridoma MR16-1. On March 13, 1999, it was internationally deposited under FERM BP-5875 under the Budapest Treaty.
  • An anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, the IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen, and immunization is carried out according to the usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the usual screening method.
  • an anti-1L-6 receptor antibody can be prepared as follows.
  • human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is described in European Patent Application Publication No. EP 325474, and mouse IL-6 receptor is described in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579.
  • Soluble IL-6 receptor antibody consists essentially of the extracellular region of the IL-6 receptor bound to the cell membrane, and lacks the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. And is different from the membrane-bound 1L-6 receptor.
  • the IL-6 receptor protein any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein is extracted from the host cell or the culture supernatant. Purification may be performed by a known method, and the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen. In addition, IL-6 receptor Expressing cells or fusion proteins of 1L-6 receptor protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. There is. This antibody, by binding to gpl30, inhibits the binding of the I6 / IL-6 receptor complex to gpl30, blocking the transmission of 1L-6 biological activity into cells.
  • Examples of such antibodies include the AM64 antibody (JP-A-3-219894), the 4B11 antibody and the 2H4 antibody (US 5571513), the B-S12 antibody, and the B-P8 antibody (JP-A-8-291199). .
  • An anti-gpl30 monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method described above.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • gpl30 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies, Obtained by using the Zamino acid sequence of the gpl30 gene disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the gpl30 gene sequence After inserting the gpl30 gene sequence into a known expression vector and transforming an appropriate host cell, purify the desired gpl30 protein from the host cell or culture supernatant by a known method. Then, the purified gpl30 receptor protein may be used as a sensitizing antigen. Alternatively, a cell expressing gpl30 or a fusion protein of SP130 protein and another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents such as mice, rats, and hamsters are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in a suitable amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and a normal adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, is optionally added to the appropriate amount.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion include spleen cells in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known in various cell lines, for example, P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550)
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Minorestin et al. (Kohler. G. and Milstein,
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used to enhance the fusion efficiency. It can be used in addition.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, 10 times that of the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture medium, MEM culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, and other ordinary culture medium used for this kind of cell culture can be used. Yes, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cell and the myeloma cell are mixed well in the culture medium, and a PEG solution preliminarily heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is used.
  • the solution is usually added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to mix the desired fused cells (high Pre-doma) is formed.
  • a cell fusion agent or the like that is not preferable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in an ordinary selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culture in the HAT culture medium is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks. Then, a conventional limiting dilution method is performed, and screening and cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed.
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen protein or an antigen-expressing cell, and a sensitized B lymphocyte is immunized.
  • a human myeloma cell for example, U266, a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or an antigen-expressing cell can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • an antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having a human antibody gene receptor to obtain a desired human antibody according to the method described above (International). Patent Application Publication Nos. W093 / 12227, W092 / 03918, W094 / 02602, W094 / 25585, W096 / 34096, and W096 / 33735).
  • the hybridomas producing monoclonal antibodies produced in this way can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. And it is possible.
  • a method of culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining a culture supernatant thereof, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith Injection, proliferation and ascites are used. 33
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • preparation of anti-I 6 receptor antibody-producing hybridomas can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • the Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Tsukuba, Higashi, Ibaraki Prefecture) announced on July 10, 2002 that the country was designated as FERM BP-2998 based on the Budapest Treaty.
  • the newly deposited PM-1 antibody-producing hybrid is injected into the abdominal cavity of a BALB / c mouse to obtain ascites, and the PM-1 antibody is purified from the ascites.
  • the PM-1 antibody can be purified from the culture supernatant.
  • an antibody gene is cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique.
  • Recombinant antibodies may be used (see, eg, Borrebaeck CAK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACM1LLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, for example, a hybridoma. Isolation of mRNA can be performed by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Comczynski, P. et al., Anal. Prepare total RNA according to Biochem. (1987) 162, 156-159) and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). In addition, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). Can be.
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using the AMV Reverse Transcri- tase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like. 5'-Amp li FINDER for cDNA synthesis and amplification
  • 5'-RACE method using RACE Kit (Clontech) and PCR (Froh man, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 899 8-9002; Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • a recombinant vector is prepared from this, and a desired recombinant vector is prepared by introducing a colony to Escherichia coli or the like to select a colony.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into the expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • a host cell can be transformed with this expression vector to express an antibody.
  • a gene artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans is reduced.
  • Recombinant antibodies for example, Chimeric antibodies and humanized antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is a DN encoding the antibody V region obtained as described above.
  • A can be obtained by ligating A to DNA encoding the C region of a human antibody, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 125023; (See Application Publication No. W0 92-19759). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • plasmids containing DNA encoding the V regions of the L chain and H chain of the Chimera PM-1 antibody are named pPM-k3 and pPM-hi, respectively, and E. coli harboring these plasmids Has been deposited under the Budapest Treaty with the National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited on 11 February 1991 as NC 1MB 40366 and NC 1 MB40362, respectively.
  • the humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, in which the complementarity-determining regions (CDRs) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, are transplanted into the complementarity-determining regions of the human antibody.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • the general method of gene recombination is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a DNA sequence designed to link (FR; framework region) is synthesized by PCR from several oligonucleotides created to have overlapping portions at the ends. The resulting DNA is ligated to DNA encoding the human C region, then incorporated into an expression vector, and then introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, ensure that the complementarity determining regions of the reshaped human antibody form the appropriate antigen-binding site. Amino acids in the framework region of the antibody variable region may be substituted
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • Examples of the human antibody C region include Ca, and for example, Cyl, Cr2, Ca3, or Cy4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • Chimeric antibodies consist of the variable regions of antibodies derived from mammals other than human and C regions derived from human antibodies, and humanized antibodies comprise the complementarity-determining regions of antibodies derived from mammals other than human and human antibodies. It is composed of a framework region and a homologous region from which the antigenicity in a human body has been reduced, and is thus useful as an antibody used in the present invention.
  • Preferred specific examples of the humanized antibody used in the present invention include a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • it is expressed by a useful useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal functionally linked to its 3 'downstream, or a vector containing it.
  • a useful useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal functionally linked to its 3 'downstream, or a vector containing it.
  • a promoter a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be mentioned.
  • promoters that can be used for the expression of antibodies used in the present invention—retroviruses, polymavirus, adenovirus, stains, etc.
  • a motor with a virus port such as ANNO INNORES 40 (SV40)-Z Enhancer-
  • ANNO INNORES 40 (SV40)-Z Enhancer- A promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as (HEF1a) may be used.
  • the method of Mulligan et al. (Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114) and the HEFla promoter / enhancer are used. This can be easily performed by following the method of Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • a useful promoter commonly used a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked and expressed.
  • examples of the promoter include a 1 acZ promoter and an araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASBB J. (1992) 6, 2422-2427),
  • the araB promoter the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used as the signal sequence for antibody secretion when E. coli periplasm is produced. . After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see, eg, W096 / 30394).
  • the expression vector was selected as a selection marker, such as the aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, and E. coli. It can contain the xanthinguanine phosphoribonuclease (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, for example, CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., and (2) amphibian cells, for example, African toad frog oocytes, Alternatively, (3) insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • Known plant cells are cells derived from Nicotiana tapa'cum (Nicotiana ta bacum), which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces genus, for example, Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, for example, Aspergillus genus, for example, Aspergillus niger (Aspergillus niger) are known.
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. In addition, by transferring the cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity of an animal, etc., the antibody can be obtained in vivo. May be produced.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When using animals, there are production systems using mammals and insects.
  • an antibody gene is introduced into such an animal or plant, and the antibody is produced and recovered in the animal or plant.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat 3-casein, to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic Nigga or the progeny of the goat that has received the embryo. Hormones may optionally be used in Transgenic X-nickas to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from Transgenics. (Ebert, K.M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702) ⁇
  • the baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted is infected to the silkworm, and a desired antibody is obtained from a body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This terrier is infected with octopus, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibacterial activity is obtained from the leaves of this tobacco.
  • octopus for example, Nicotiana tabacum
  • the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to prepare the host. May be co-transformed, or the host may be transformed by incorporating DNA encoding the H and L chains into a single expression vector (International Patent Application Publication No. WO 94-11523). See).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2 , Fv, or single chain Fv (scFv) in which an F chain and an F chain are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papine or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector. And expressed in a suitable host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better,. & Horwitz, AH Methods in Enzymolog y (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Lamoy i, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, RB et al., TI BTECH (1991) 9, 132-137).
  • an enzyme such as papine or pepsin
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are connected via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv It may be from any of the listed ones.
  • the peptide linker connecting the V regions for example, an arbitrary single-chain peptide consisting of amino acid residues 12 to 19 is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region.
  • a portion of the DNA encoding the desired amino acid sequence is amplified by PCR using a pair of primers defining both ends, and then a portion of the peptide linker is also encoded. It can be obtained by combining and amplifying DNA and a pair of primers that define both ends of the DNA to be linked to the H and L chains, respectively.
  • expression vectors containing them and hosts transformed with the expression vectors can be obtained according to a conventional method.
  • the scFv can be obtained using the host according to a conventional method.
  • antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and produced by a host.
  • the “antibody” in the claims of the present application also includes fragments of these antibodies.
  • modified antibodies antibodies conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography. Columns used for affinity chromatography Examples thereof include a protein A column and a protein G column. Examples of the carrier used for the protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF and the like. In addition, the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • the present invention can be achieved by appropriately selecting and combining chromatographic graphs, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, etc. other than the above-mentioned chromatographic graphs.
  • the antibody used in the step can be separated and purified.
  • the chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration. These chromatographies can be applied to HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Also, reverse phase HPLC (reverse phase HP LC) may be used.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure the absorbance at 280 nm, and calculate 1 mg / ml as 1.350D.
  • the measurement can be performed as follows. That is, 100/1 goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1M bicarbonate buffer (PH9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc), and the mixture was added at 4 ° C. Incubate overnight with to fix the antibody.
  • the modified IL-6 used in the present invention is a substance having an activity of binding to the I6 receptor and not transmitting the biological activity of -6. That is, the IL-6 variant competitively binds IL-6 to the IL-6 receptor, but does not transmit the biological activity of IL-6, and thus blocks signal transduction by 1-6.
  • the IL-6 variant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • I-6 which is the source of the I-6 variant, may be of any origin, but is preferably human IL-6 in consideration of antigenicity and the like.
  • the amino acid sequence of 1 L-6 can be obtained using a known molecular modeling program, for example, WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (199 0) 8, 52-56). This is done by predicting its secondary structure and evaluating its effect on the overall substituted amino acid residue.
  • the vector containing the nucleotide sequence encoding the human IL-6 gene is designated as type II, and the amino acid is determined by a conventional PCR method.
  • a gene encoding a modified IL-6 can be obtained. This may be incorporated into an appropriate expression vector, if necessary, to obtain a modified IL-6 according to the method for expressing, producing and purifying the recombinant antibody.
  • the IL-6 partial peptide or the -6 receptor partial peptide used in the present invention has a binding activity with 1L-6 receptor or I6, respectively, and has a biological activity of IL-6.
  • a substance that does not transmit activity That is, the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide binds to the IL-6 receptor or IL-6, and captures these to bind to the IL-6 1L-6 receptor. Specifically inhibits the binding of I do. As a result, since it does not transmit the biological activity of 1L-6, it blocks signal transduction by I-6.
  • IL-6 partial peptide or iL-6 receptor partial peptide is a region of the amino acid sequence of -6 or IL-6 receptor involved in the binding of 1L-6 to IL-6 receptor. It is a peptide consisting of a part or all of the amino acid sequence. Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • an IL-6 partial peptide or an IL-6 receptor partial peptide is!
  • the region involved in the binding of receptor 6 to IL-6 receptor is identified, and the amino acid sequence of part or all of It can be prepared by any available method, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence coding for a desired peptide is incorporated into an expression vector, and It can be obtained according to methods for expression, production and purification of a recombinant antibody.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction of the peptide chain from the support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluormethanesulfonic acid can be usually used in the BQC method, and TFA can be used in the Fmoc method.
  • TFA can be used in the Fmoc method.
  • Boc method for example, the above-mentioned protective peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisol. Next, the protecting group is eliminated and the peptide is cleaved from the support to recover the peptide.
  • the crude peptide is obtained by freeze-drying.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction of a peptide chain from a support can be carried out, for example, in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying to HPLC.
  • the elution may be carried out under optimal conditions using a water-acetitol-based solvent usually used for protein purification.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and freeze-dried.
  • the peptide fraction thus purified is identified by mass spectrometry molecular weight analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • IL-6 partial peptide and the IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098, and U.S. Pat. I have.
  • the IL-6 signal transduction inhibitory activity of the IL-6 antagonist used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, 1L- 6 dependent cell MH60. BSF2 was cultured, to which was added 1 Les 6, 3 H- Ji of 1L- 6-dependent cell in the coexistence of the same time IL- 6 A Ntagonisu DOO What is necessary is to measure the uptake of the medium. Further, by culturing U266 is 1L-6 receptor-expressing cells, was added 1 2 5 1 labeled I doctor 6, at the same time IL- 6 A down Ri by the addition of Tagonisu bets, measuring one 25 1-labeled IL-6 bound to IL-6 receptor-expressing cells.
  • Atsushi system in addition to the group in which IL-6 antagonist is present, a negative control group containing no IL-6 antagonist is set, and the results obtained in both cases are compared. -1L-6 inhibitory activity of gonist can be evaluated.
  • an osteomyelitis inducer for example, celeline was excessively administered, and an animal that developed ⁇ inflammation was administered with the gonist at 1 ⁇ 6 g of the present invention.
  • the edema-suppressing effect can be achieved by evaluating the improvement in the weight of the organ.
  • Another effect of the present invention is an effect of preventing knee inflammation or an effect of preventing recurrence of inflammation.
  • the method of administering cellulane to an animal to induce inflammation may be, for example, in accordance with the method described in Examples below.
  • the animal that induces T. inflammation may be an animal that is usually used in an experiment, such as a mouse or a rat.
  • anti-I 6 receptor antibody As shown in the Examples below, the administration of anti-I 6 receptor antibody was found to suppress knee weight and improve knee edema in experimental animals that developed inflammation.
  • IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibody were shown to have a therapeutic effect on inflammation.
  • the treatment target in the present invention is a mammal.
  • the mammal to be treated is preferably a human.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be administered orally or parenterally systemically or locally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solution, etc. can be selected, and the appropriate administration method depends on the patient's age and symptoms You can choose the law.
  • the effective dose is selected from the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg body weight at one time. Alternatively, a dose of 1-1000 mg per patient, preferably 5-50 m can be chosen
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the administration route.
  • Such carriers and additives are water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, vinyloxyvinyl polymer, carboxy.
  • HSA human serum albumin
  • mannitol mannitol
  • sorbitol sorbitol
  • lactose lactose
  • surfactant acceptable as a pharmaceutical additive Stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and a surfactant acceptable as a pharmaceutical additive.
  • the additives to be used are selected from the above or in combination according to the dosage form, and are not limited thereto.
  • B6-hi6 transgenic mice or B6 mice were dissolved in physiological saline, and 50 g / kg was intraperitoneally administered to the mice 7 times every 1 hour, at which time the anti-mouse 1 receptor 6 receptor monoclonal antibody was administered.
  • MR16-1 was administered at a dose of 1 mg / mouse via the tail vein of mice immediately before the first administration of cellulin.
  • the antibody solvent (PES) was used for control. Eight hours later, the mice were euthanized, and then Teng weight, serum amylase, and Tung histology were observed.
  • Figure 1 shows the knee weight / weight.
  • Figures 2 to 4 show the histological images of the kidney.
  • the serum amylase starch (bull starch) method was used for the measurement.
  • the tissue image of the tongue organ was prepared under paraffin block, stained with hematoxylin eosin (HE), and observed under a microscope.
  • HE hematoxylin eosin
  • 6-transgenic mice Compared to littermates (normal mice), 6-transgenic mice showed increased spleen weight induced by the administration of cellulin.
  • anti-IL-6 receptor monoclonal antibody was observed in a mouse model of celeline-induced acute knee inflammation, indicating that IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibody were By suppressing the action of IL-6, it is useful for treating acute optic inflammation, reducing its severity and preventing its onset.
  • mice were intraperitoneally administered 50 g / kg of the cellulin (caerulein, manufactured by Kyowa Hakko) seven times every hour.
  • LPS (1 ipopolysaccharide, Sigma) was administered at the same time as the first cellulin administration to cause severe Tengitis. 1 mgZkg was administered intraperitoneally.
  • MR16-1 LPS (1 ipopolysaccharide, Sigma) was administered at the same time as the first cellulin administration to cause severe Tengitis. 1 mgZkg was administered intraperitoneally.
  • MR16-1 lmg / mouse was administered from the mouse tail vein 10 minutes before the first cellulin administration.
  • the antibody solvent (PBS) was used for control. Eight hours later, the mice were euthanized and the spleen weight was measured. Figure 5 shows the knee weight and Z weight.
  • IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibody inhibited the action of 1L-6 and caused severe injury. It is useful for treating acute inflammation, reducing its severity and preventing its onset.
  • Soluble IL-6 receptor was prepared by PCR. Plasmid pBSF2R.236 was digested with restriction enzyme SphI to obtain I6 receptor cDNA, which was introduced into mpl8 (Amersham). Using a synthetic oligo-primer designed to introduce a stop codon into the I6 receptor cDNA, PCR was performed using an in vitro mitogenesis system (Amersham). Mutations were introduced into the IL-6 receptor cDNA by the method described above. By this operation, a stop codon was introduced at the position of amino acid 345, and a cDNA encoding a soluble IL-6 receptor was obtained.
  • soluble IL-6 receptor cDNA In order to express the soluble IL-6 receptor cDNA in CH0 cells, it was ligated with plasmid pSV (Pharmacia) to obtain plasmid PSVL344.
  • the soluble IL-6 receptor cDNA cut with HindIII-SalI was inserted into a plasmid pECEdhfr containing dhfr cDNA, to obtain a CH0 cell expression plasmid pECEdhfr344.
  • 10 fig of the plasmid pECEdhfr344 was transferred to the dhfr-CHO cell line DXB-11 (Urla ub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Transfection was performed by the phosphate sedimentation method (Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751).
  • Transfected CH0 cells were purified from nucleosides containing ImM glumin, 10% dialyzed FCS, lOOU / ml penicillin and 100 ⁇ / ml streptomycin a The cells were cultured in the MEM selective culture medium for 3 weeks.
  • the selected CH0 cells were screened by limiting dilution to obtain a single CH0 cell clone.
  • the CH0 cell clone was expanded with a methotrexate at a concentration of 20 nM to 200 nM to obtain a human soluble 1L-6 receptor-producing CH0 cell line 5E27.
  • the CH0 cell line 5E27 was cultured in Iscove's modified Dulbecco's medium (1MDM, Gibco) containing 5% FBS.
  • the culture supernatant was collected, and the concentration of soluble Ile6 receptor in the culture supernatant was measured by ELISA. As a result, it was confirmed that soluble IL-6 receptor was present in the culture supernatant.
  • Reference Example 2 Preparation of anti-human IL-6 antibody
  • mice were immunized with 10 g of recombinant 1.6 (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (198 8) 17, 41) together with complete Freund's adjuvant. This was continued weekly until anti-IL-6 antibodies could be detected in the serum. Immune cells were excised from local lymph nodes and fused with myeloma cell line P3U1 using polyethylene glycol 1500. The method of Oi et al. Using a HAT culture solution with Hypridoma (Selective Methods in Ce11u1ar Immunology, WH Freeman and Co., San Francisco, 351,
  • the hybridoma producing the anti-human 1L-6 antibody was subjected to IL-6 binding assay as described below.
  • flexible 96 A hole microphone plate (Dynatech Laboratories, Inc., A1 exandria, VA) was added to a 0.1 M carbonate-hydrogen carbonate mild ifr solution (100 ⁇ 1 goat anti-mouse in pH 9.
  • the plate was coated with Ig (10 ILL 1 / ml, Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) overnight at 4 ° C, and the plate contained 1002 1% 1% serum albumin (BSA).
  • the cells were treated with PBS at room temperature for 2 hours.
  • hybridoma culture supernatant was added to each well and incubated at 4 ° C overnight. Washing the plates, 2000 cpm / 0.5 ng / well and the 1 25 1 labeled set replaceable 1L-6 so added to each well, Ganmakau printer scratch radioactivity of each well after washing (Beckma n Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Out of 216 hybridoma clones, 32 hybridoma clones were positive for IL-6 binding assay. With the power of these clones, a stable MH166. BSF2 was finally obtained.
  • the anti-IL-6 antibody MH166 produced by the hybridoma has an IgG1 subtype.
  • BSF2 cells was dispensed so minute a 1 x 10 ⁇ / 200 1 / well, to which was added a sample containing MH166 antibody were cultured for 48 hours, 0.5 fi Ci / well of 3 H Ji Mi Jin (New After adding England Nuclear, Boston, MA), the culture was continued for another 6 hours.
  • the cells were placed on a glass filter paper and processed with an automatic harvester (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). Egret anti-IL-6 antibody was used as a control.
  • Sepharose prepared by the method of Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), in which the anti-I6 receptor antibody MT18 was activated by CNBr. 1L-6 receptor (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828) was bound to Rose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscat away, NJ) according to the attached formulation. Purified.
  • ImM p-paraaminophenol methanesulfonyl fluoride containing 1 digitonin (manufactured by Wako Chemicals), 10 mM triethanolamine (pH 7.8) and 0.15 M NaCl was prepared from the human myeloma cell line U266.
  • the cells were solubilized with Nordrochloride (manufactured by Wako Chemicals) (digitonin buffer) and mixed with MT18 antibody bound to Sepharose 4B beads. Thereafter, the beads were washed six times with digitonin buffer to obtain partially purified IL-6 receptor for immunization.
  • mice were immunized four times every 10 days with the above partially purified IL-6 receptor obtained from 3 ⁇ 10 9 U266 cells, and then a hybridoma was prepared by a conventional method.
  • the binding activity to the IL-6 receptor of the hybridoma culture supernatant from the growth positive well was examined by the following method. 5 ⁇ 10 7 U266 cells were labeled with 35 S-methionine (2.5 mCi) and solubilized with the above digitonin buffer.
  • solubilized U266 cells are mixed with 0.018 ml of MT18 antibody conjugated to Sepharose 4B beads, then washed six times with digitonin buffer, and 0.25 ml of digitonin buffer (pH 3.4) main Chi Onin labeled - - 6 receptor was drained and neutralized with 1M Tris of 0.025ml (pH 7.4) 35 S by.
  • hybridoma culture supernatant 0.05 ml of the hybridoma culture supernatant was mixed with 0.01 ml of Protein G Sepharose (Pharmacia). After washing, Sepharose was incubated with 0.005 ml of the 35 S-labeled IL-6 receptor solution prepared above. Immunoprecipitated substances were analyzed by SDS-PAGE and reacted with IL-6 receptor. The culture supernatant of the hybridoma was examined. As a result, a reaction-positive hybrid macroclone PM-1 was established. Antibodies produced from hybridoma PM-1 have an IgGl type subtype.
  • the activity of the antibody produced by hybridoma PM-1 to inhibit the binding of IL-6 to the human IL-6 receptor was examined using a human myeloma cell line U266.
  • Human recombinant I-6 was prepared from Escherichia coli (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 445), and the Volton-Hunter reagent (New Englan d Nuclear, Boston, MA, USA). ) by the 1 25 I-labeled (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981).
  • Monoclonal antibodies against the mouse-6 receptor were prepared by the method described in Sai to, T. et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.
  • CH0 cells that produce mouse soluble I6 receptor are cultured in IMDM medium containing 10 CS, and anti-mouse IL-6 receptor antibody RS12 (see Saito, T. et al above) is purified from the culture supernatant using Affigel. Purify mouse soluble IL-6 receptor using affinity column immobilized on 10 gels (Biorad) and
  • mice soluble IL-6 receptor 50 zg was mixed with Freund's complete adjuvant and injected into the abdomen of a Wistar rat. Two weeks later, the mice were boosted with incomplete Freund's adjuvant. On the 45th day Spleen cells were collected, and 2 ⁇ 10 8 cells were fused with 1 ⁇ 10 7 mouse myeloma cells P3U1 and 50% PEG1500 (manufactured by Boehringer Mannheim) in a conventional manner, and then cultured in HAT medium. Hypri-doma was screened.
  • the neutralizing activity of the antibody produced by this hybridoma in the signaling of mouse IL-6 was determined using MH60.
  • BSF2 cells (Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). 3 H thymidine was taken up. MH60.
  • BSF cells were prepared in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / 200 ⁇ 1 / well. The plates in the 10 pg / ml of mouse IL-6 and MR16 -1 antibody or RS12 antibody 12.3 ⁇ 1000ng / ml added 37 ° C, after cultured for at 44 53 ⁇ 4C0 2, 3 H of L ⁇ Ci / Uweru Thymidine was added. Four hours later, 3 H thymidine incorporation was measured. As a result, the MR16-1 antibody suppressed the uptake of 3 H-thymidine by MH60.
  • B SF2 cells The neutralizing activity of the antibody produced by this hybridoma
  • IL-6 antagonist such as an anti-IL-6 receptor antibody has a therapeutic effect on inflammation. Therefore, 1L-6 Antagoni Sto was found to be useful as a therapeutic agent for acute inflammation

Description

明 細 書
I L一 6 アンタゴニス 卜を有効成分と して含有する膝炎の予防又は 治療剤 発明の分野
本発明はィ ンタ一ロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを有効成分 と して含有する脖炎の予防又は治療剤に関する。 背景技術
Iし- 6は B 細胞刺激因子 2 (BSF2)あるいはイ ンタ一フ ロ ン /32 と も呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 B リ ンパ球系細胞の活 性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al. , Nat ure (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を及 ぼす多機能サイ ト力イ ンであることが明らかになった （ Ak i r a， S. et al. , Adv. in Immunology (1993) 54， 1-78) 。 Iい 6は、 T リ ン パ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （Lotz， M. e t al. , J. Exp. Med. ( 1988) 167， 1253-1258) 。
IL-6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL- 6が結合する分子量約 80kDの リガン ド結合性蛋白 質の Iい 6受容体である （Taga， T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 1 66, 967-981, Yamasaki, K. et al.， Science (1987) 241, 825-82 8)。 IL-6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型 の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体と しても存 在する。
もう一つは、 非リガン ド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 1い 6と ^ -6受容体は Iい 6/ Iい 6受 容体複合体を形成し、 次いで gpl30 と結合するこ とにより、 1L-6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga， T. et al. , Cell (198 9) 58, 573-581) 。
- 6ア ンタゴニス トは、 1L-6の生物学的活性の伝達を阻害する物 質である。 これまでに、 1L- 6に対する抗体 （抗 IL- 6抗体） 、 1レ 6受 容体に対する抗体 （抗 1L-6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gpl30 抗体） 、 IL- 6改変体、 IL- 6又は 1L-6受容体部分ペプチ ド等が 知られている。
抗 IL- 6受容体抗体に関しては、 いく つかの報告がある （Novic D. et al. , Hybridoma (1991) 10， 137-146 、 Huang, Y. W. et al .， Hybridoma (1993) 12, 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95- 09873 、 フ ラ ンス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM-1 (Hirata, Y. et al. , J , Immunol. (1989) 143, 2900-2906) の相捕性決定領域 （CDR; com 1 emen tar i t y determining re ion ) ヒ 卜抗体へ移植" る こ とに よ り得られたヒ ト型化 PM-1抗体が知られている （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 ) 。
脖炎 （pancreatitis) は、 脖酵素活性化により膝組織内において 自己消化を生ずる炎症性疾患である。 これまでに、 急性脬炎患者と 健常人の末梢血単核球の 1L-6産生量を比較すると、 急性膝炎患者で 有意に高いことや、 全身性の合併症を発症している急性滕炎につい て、 合併症の認められない症例と比較すると、 末梢血単核球からの IL-6産生が高値であることが報告されている （de Beaux A. C. et a 1. , Brit. J. Surgery, 83, 1071-5, 1996) 。 また、 血中 1い 6値は 、 急性滕炎患者の重症例で、 より高値を示すと共に、 他のパラメ一 ターに比較し早期に反応するこ とから、 脖炎の重症度を予測するた めの指標になると考えられてきた （ Inagaki, T. et al. , Pancreas ， 14, 1-8, 1997 ) o
これまで急性滕炎では、 IL- 1及び TNF が病態と深く 関係するこ と が示唆されており、 両サイ トカイ ンに対する受容体を欠く マウスで は重症化せず、 死亡率も著し く 減少するこ とが報告されている （De nham, W. et al. , Gastroenterology, 113, 1741-6, 1997) 。 さ ら に、 それらの阻害剤を用いた滕炎の治療の試みが動物モデルを用い てなされている （Norman, J. et al. , Surgery, 117, 648-655, 19 95、 Hughes, C. B. et al. , American J. Surgery, 171, 274-280, 1996，， Norman, J. et al. , Surgery, 120, 515-521, 1996 ) 。
しかしながら、 これまでに膝炎において抗 IL-6受容体抗体等の！L - 6ァンタゴニス トを用い IL-6の生物学的活性を特異的に抑制する試 みはなされておらず、 抗 I L- 6受容体抗体等の 1レ6アンタゴニス 卜が 滕炎に治療効果を示すことは知られていなかった。 発明の開示
本発明は、 前記の欠点を有さない脾炎の予防又は治療剤を提供し よう とする ものである。
すなわち、 本発明は、 （ 1 ) IL- 6ア ンタゴニス トを有効成分と し て含有する脖炎の予防又は治療剤を提供する。
本発明はまた、 （ 2 ) IL- 6受容体に対する抗体を有効成分と して 含有する滕炎の予防又は治療剤を提供する。
本発明はまた、 （ 3 ) IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体を 有効成分と して含有する眸炎の予防又は治療剤を提供する。
本発明はまた、 （ 4 ) ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ロ一ナル抗 体を有効成分と して含有する脬炎の予防又は治療剤を提供する。 ヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体は、 好ま し く は PM- 1抗体 である。 本発明はまた、 （ 5 ) マウス ίレ 6受容体に対するモノ ク ローナル 抗体を有効成分と して含有する膝炎の予防又は治療剤を提供する。 マウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体は、 好ま し く は MR16 1抗体である。
本発明はまた、 （ 6 ) IL- 6受容体に対する組換え型抗体を有効成 分と して含有する膝炎の予防又は治療剤を提供する。 IL- 6受容体に 対する組換え型抗体は、 好ま し く はヒ 卜抗体定常領域 （C 領域） を 有する。
本発明はまた、 （ 7 ) 1L-6受容体に対するキメ ラ抗体又はヒ 卜型 化抗体を有効成分と して含有する脖炎の予防又は治療剤を提供する 本発明はまた、 （ 8 ) ヒ ト型化 PM-1抗体を有効成分と して含有す る脖炎の予防又は治療剤を提供する。
本発明はまた、 （ 9 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) に記載の IL- 6ア ンタゴ 二ス トを有効成分と して含有する急性脬炎又は慢性膊炎の予防又は 治療剤を提供する。 急性膝炎又は慢性膝炎は、 例えば重症膝炎又は 軽症膝炎である。
本発明はまた、 （ 1 0 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) に記載の Iい 6ア ンタ ゴニス 卜を有効成分と して含有する膝炎における脖臓浮腫抑制剤を 提供する。
本発明はさ らに、 （ 1 1 ) 前記 （ 3 ) 〜 （ 8 ) に記載の IL-6受容 体に対する抗体を有効成分と して含有する脖炎における滕臓浮腫抑 制剤を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 Iい 6ト ラ ンス ジエニッ クマウスが正常マウ スに比べて、 セルレイ ン投与により滕浮腫の結果膝臓重量が増すこ とを示す図で ある。 また、 抗 1L- 6受容体抗体の投与によりそれが抑制されるこ と を示す図である。
図 2 は、 正常マウスにセルレイ ンを投与して急性膝炎を発生させ た膝臓の組織の顕微鏡写真であり、 生物の形態を表わす図面代用写 真である。
図 3 は、 Iい 6ト ラ ンス ジエニ ッ ク マウ スにセルレイ ンを投与して 急性滕炎を発生させた滕臓の組織の顕微鏡写真であり、 生物の形態 を表す図面代用写真である。
図 4 は、 Iい 6ト ラ ンス ジエニッ クマウスにセルレイ ンを投与して 急性滕炎を発生させると共に MR16-1を投与した場合の脖臓の組織の 顕微鏡写真であり、 生物の形態を表す図面代用写真である。 図 2 に おける正常マウ スでのセルレイ ン誘導滕炎に比べて、 図 3 における Iい 6トラ ンス ジ ニッ クマウスでのセルレイ ン誘導塍炎が增悪して おり （すなわち、 間質の浮腫、 炎症性細胞の浸潤の増加） 、 これに 対して、 図 4 においては抗 IL- 6受容体抗体 MR16-1の投与により増悪 が抑制されている。
図 5 は、 LPS およびセルレイ ン投与により惹起された IL- 6トラ ン ス ジヱニ ッ ク マウ スにおける滕臓重量の増加が、 抗 Iし- 6受容体抗体 の投与により抑制されるこ とを示す図である。 発明の実施の形態
本発明で使用される 1L- 6ア ンタゴニス トは、 脖炎の予防又は治療 効果、 又は脾炎における脖臓浮腫抑制効果を示すものであれば、 そ の由来、 種類および形状を問わない。
IL-6ア ンタ ゴニス ト は、 IL- 6による シグナル伝達を遮断し、 Iい 6 の生物学的活性を阻害する物質である。 IL- 6ア ンタゴニス トは、 好 ま し く は 1レ6、 IL- 6受容体及び gpl30 のいずれかの結合に対する阻 害作用を有する物質である。 IL- 6ア ンタゴニス 卜と しては、 例えば 抗 IL- 6抗体、 抗 IL- 6受容体抗体、 抗 gpl30 抗体、 IL- 6改変体、 可溶 性 IL- 6受容体改変体あるいは 1L- 6又は 1い 6受容体の部分べプチ ドぉ よび、 これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗 IL- 6抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ロ ーナル又はモノ ク ローナル抗体と して得ることができる。 本発明で 使用される抗 IL - 6抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ローナル 抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と しては、 ハ イブリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現べク ターで形質転換した宿主に産生される もの がある。 この抗体は 1L- 6と結合する こ とによ り 、 Iし- 6の IL- 6受容体 への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断す る O
このよ う な抗体と しては、 MH166 (Matsuda, T. et al. , Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) や SK2 抗体 （Sato, K. et al. , 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（1991) 21, 166) 等が挙げら レる。
抗 1レ 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用 し 、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 Iし- 6を感作抗原と して 使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リ 一二ング法により、 モノ ク 口 一ナルな抗体産生細胞をスク リ ーニングするこ とによって作製できる。
具体的には、 抗 IL- 6抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト 1レ6は、 Eur. J . Biochem (1987) 168, 543-550 、 J. Immunol. (1988) 140, 1534 -1541 、 あるいは Agr. Biol. Chem. ( 1990) 54, 2685-2688 に開示 された IL- 6遺伝子 Zァ ミ ノ酸配列を用いるこ とによって得られる。
IL- 6の遺伝子配列を公知の発現べク ター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目 的の 1L- 6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 1レ 6蛋白質を感作 抗原と して用いればよい。 また、 ！L-6蛋白質と他の蛋白質との融合 蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。
本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク口ーナル又はモノ ク ロ一ナル抗体と して得るこ とができる。 本 発明で使用される抗 IL-6受容体抗体と して、 特に哺乳動物由来のモ ノ ク ローナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク 口一ナル抗体 と しては、 ハイプリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べク タ一で形質転換した宿主に産 生される ものがある。 この抗体は Iし- 6受容体と結合するこ とにより 、 IL- 6の IL-6受容体への結合を阻害して IL 6の生物学的活性の細胞 内への伝達を遮断する。
このような抗体と しては、 MR16- 1抗体 （Tamura, T. et al. Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90， 11924-11928)、 PM- 1抗体 （Ηί rata, Y. et al. , J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64- 7 抗体あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759)などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好ま し い抗体と して PM-1抗体が挙げられる。
なお、 PM- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM- 1と して、 工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号 ) に、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブダぺス ト条約に 基づき国際寄託されている。 また、 MR16- 1 抗体産生ハイプリ ドー マ細胞株は、 Rat-mouse hybridoma MR16- 1と して、 工業技術院生命 工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 3 月 13日に、 FERM BP- 5875と してブダぺス 卜条約に基づき国際 寄託されている。
抗 IL- 6受容体モ ノ ク ロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的 には公知技術を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 IL- 6受容体を感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にし たがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公 知の親細胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ロ —ナルな抗体産生細胞をスク リ ーニングすることによって作製でき る。
具体的には、 抗 1L-6受容体抗体を作製するには次のよう にすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト IL- 6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス IL- 6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された IL- 6受容体遺伝子 Zァ ミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
1レ6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現している ものと細胞膜より 離脱しているもの （可溶性 Iい 6受容体） （Yasukawa, K. et al. , J . Bioc em. (1990) 108, 673-676) との二種類がある。 可溶性 IL-6 受容体抗体は細胞膜に結合している IL- 6受容体の実質的に細胞外領 域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と 細胞内領域が欠損している点で膜結合型 1L- 6受容体と異なつている 。 IL- 6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作 製の感作抗原と して使用されう る限り、 いずれの IL- 6受容体を使用 してもよい。
- 6受容体の遺伝子配列を公知の発現べク ター系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中 から目的の IL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL - 6 受容体蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 IL- 6受容体を 発現している細胞や 1L- 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質 を感作抗原と して用いてもよい。
ヒ ト ！ぃ 6受容体をコー ドする cDNAを含むプラス ミ ド plBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. coli) は、 平成元年 （1989年） 1 月 9 日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に、 HB101- PIBIBSF2R と して、 受 託番号 FERM BP-2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて いる。
本発明で使用される抗 gpl30 抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ローナル又はモノ ク ロ一ナル抗体と して得ることができる。 本発明 で使用される抗 gpl 30 抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ロ一 ナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナル抗体と しては 、 ハイプリ ド一マに産生される もの、 および遺伝子工学的手法によ り抗体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産生される ものがある。 この抗体は gpl30 と結合するこ とにより、 Iい 6/IL - 6 受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して 1L-6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する。
このような抗体と しては、 AM64抗体 （特開平 3- 219894) 、 4B11抗 体および 2H4 抗体 （US 5571513) B-S12 抗体および B- P8抗体 （特開 平 8- 291199) などが挙げられる。
抗 gpl30 モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には 公知技術を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 gpl3 0 を感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によ って公知の親細 胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ロ一ナル抗 体産生細胞をスク リ 一ニングするこ とによつて作製できる。
具体的には、 モノ ク ローナル抗体を作製するには次のよう にすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30 遺伝子 Zア ミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
gpl30 の遺伝子配列を公知の発現べク タ一系に挿入して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から 目的の gpl30 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 gpl30 受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や SP130 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま し く 、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は 、 皮下に注射することにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えば、 フロイ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4-21日毎 に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用することができる。
このよう に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ ェ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550)
1 o 、 P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immuno 1 og y (1978) 81, 1-7) 、 NS- 1 (Kohler. G. and Mi lstein, C. Eur. J . Immunol. (1976) 6， 511-519 ) 、 MPC-11 (Margul ies. D. H. et al. , Cell (1976) 8, 405-415 ) 、 SP2/0 (Shulman, . et al. , Nature (1978) 276, 269-270 ) 、 FO (de St. Groth, S. F. et a 1. , J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge ， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133 ) 等が適宜使用される。 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミ ノレスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Mi lstein,
C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行う ことが できる。
より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポ リ エチ レ ングリ コール （ PEG ) 、 センダイ ウ ィ ルス （ HV J ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チルスル ホキシ ド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞と ミ エローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エローマ 細胞に対して免疫細胞を 10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融合 に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に 好適な RPMI 1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養に 用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用すること もできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000- 6000 程度の PEG 溶液を通常、 30-60 % (w/v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ とによりハイプリ ドーマ の生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ド一マは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 ア ミ ノ プテリ ンおよびチ ミ ジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ ー ニングおよびク ローニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を i n v i t r oで所望の抗原蛋白質又は抗原発現 細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミ エロ一マ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所 望のヒ 卜抗体を得るこ と もできる （特公平 1 - 59878 参照） 。 さ らに 、 ヒ ト抗体遺伝子のレバ一 卜 リ 一を有する ト ラ ンスジヱニ ッ ク動物 に抗原又は抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗 体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93/1 2227 、 W0 92/ 03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/3373 5 参照） 。
このよ う にして作製されるモノ ク 口一ナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。
当該ハイブリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され 33 る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 Iい 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3- 139293に開示された方法により行う ことができる。 工業技術院生 命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平 成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された PM- 1抗体産生ハイブリ ド一マを BALB/cマゥスの腹腔内 に注入して腹水を得、 この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、 本 ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば、 10%ゥ シ胎児血清、 5 %M -Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RPMI 1640培地、 ハイ プリ ドーマ SFM 培地 （G1BC0- BRL 製） 、 PFHM- II 培地 （GIBCO- BRL 製） 等で培養し、 その培養上清から PM-1抗体を精製する方法で行う ことができる。
本発明には、 モノ ク ロ ーナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベク ターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いる こ とができる （例えば、 Borrebaeck C. A. K. and Larric k J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACM1LLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えばハイプリ ド —マから、 抗体の可変 （V ) 領域をコ一 ドする mRNAを単離する。 mR NAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジ ン超遠心法 （Chirgwin ， J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 (C omczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Ki t (Pharmacia製） 等を使用 して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purif icati on Kit (Pharmacia 製） を用いるこ とにより mRNAを直接調製するこ とができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcri tase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および增幅を行うには 5' -Amp li FINDER
RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' - RACE 法 （Froh man, M. A. et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 899 8-9002 ； Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用するこ とができる。 得られた PCR 産物から目的 とする DNA 断片を精製し、 ベク ター DNA と連結する。 さ らに、 これ より組換えベク ターを作成し、 大腸菌等に導人してコロニーを選択 して所望の組換えべクタ一を調製する。 目的とする DNA の塩基配列 を公知の方法、 例えば、 デォキシ法により確認する。
目的とする抗体の V 領域をコー ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコ一 ドする DNA と連結し、 これを 発現べク タ一へ組み込む。 又は、 抗体の V 領域をコ一ドする DNA を 、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベク ターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のよう に抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハ ンサ一、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 本発明では、 ヒ 卜に対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べク タ —に組み込んで宿主に導入し産生させるこ とによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 ることができる。
例えば、 キメ ラ PM-1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドは、 各々 pPM- k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラス ミ ドを有する大腸菌は、 National Col lections of Indust rial and Marine Bacteria Limitedに、 1991年 2 月 11日 に、 各々 NC 1MB 40366 及び NC 1 MB40362と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託 されている。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体と も称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR ) をヒ ト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域
(FR; framework region) を連結するよ うに設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ 卜 钪体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現べク タ一に組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成する ものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のア ミ ノ酸を置換してもよい
(Sato, . et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851 -856) 。
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域と しては、 Cァが挙げられ、 例えば、 C y l 、 C r 2 、 Cァ 3 又は C y 4 を使用することができる。 また、 抗体又はそ の産生の安定性を改善するために、 ヒ 卜抗体 C 領域を修飾してもよ い。
キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域と ヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域およびじ 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性が低下しているため、 本発 明に使用される抗体と して有用である。
本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 ヒ ト型化 PM-1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モータ一、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポ リ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベク タ一により発 現させることができる。 例えばプロモータ一 Zェンハ ンサ一と して は、 ヒ トサイ ト メ ガロウ ィ ルス前期プロモータ一/ェンハ ンサ一 （ human cytomegalovirus immediate early promo ter/ enhancer ) を 挙げるこ とができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ —夕一 Zェンハ ンサ一と して、 レ ト ロ ゥ イ ノレス、 ポ リ オ一マウ ィ ル ス、 アデノ ウ イ ルス、 シ ミ ア ンゥ イ ノレス 40 (SV 40)等のウ ィ ルスプ 口モータ— Zェンハンサ—ゃヒ トェロ ンゲーシ ヨ ンフ ァ ク タ— 1 ひ (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモータ一/ェンハ ンサ一を 用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモータ一 Zェンハ ンサ一を使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Mulligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277， 1 08-114) 、 また、 HEFlaプロモーター/ェンハ ンサ一を使用する場 合、 Mi zushima らの方法 (Mi zushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322 ) に従えば容易に実施することがで きる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモータ一と しては、 1 acZプロモ一 夕一、 araBプロモータ一を挙げるこ とができる。 lacZプロモータ一 を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward, E. S. et al. , Nature (19 89) 341, 544-546 ； Ward, E. S. et al. FASBB J. (1992) 6， 2422 -2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （Be tter, M. et al. Science (1988) 240, 1041 - 1043 ) に従えばよい o
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei, S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379-4383) を使用すればよい。 ペリブラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フ ォール ド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリオ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ノレ ス、 ゥシパピローマウィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いること ができ、 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現べ ク タ一は選択マーカ一と して、 ア ミ ノ グリ コ シ ドホスホ トラ ンスフ エ ラ—ゼ (APH ) 遺伝子、 チ ミ ジ ンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌 キサンチ ングァニンホスホ リ ボンル ト ラ ンスフ ェ ラ一ゼ （ Ecogpt) 遺伝子、 ジ ヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができ る。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vi troの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を 用いる産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば 、 CH0 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa、 Veroなど、 （2) 両生類細胞、 例えば、 アフ リ カッメ ガエル卵母細胞 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 などが知られ ている。 植物細胞と しては、 ニコチアナ · タパ 'クム （Nicotiana ta bacum)由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミ セス （Saccharomyce s ) 属、 例えばサッカロ ミ セス · セレピシェ ( Sacchar omy ces cere visiae) 、 糸状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギルス · 二ガー （Aspergillus niger ) などが知ら れている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養するこ とにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640, IMDMを使用する ことができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用すること もできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すこ と によ り、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シなどを 用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App 1 i cat ions, 1993 ) 。 また、 昆虫と しては、 カイ コを用いることが できる。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、 動物又は植物の体 内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ 3カゼ イ ンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子 の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が挿入さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジェ ニ ッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 ト ラ ン スジエニッ クャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモ ンを トラ ンス ジ Xニッ クャギに使用 しても よい。 (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699-70 2 ) ο
また、 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウィルスをカイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望の抗体 を得る （Maeda, S. et al. , Nature (1985) 315, 592-594) 。 さ ら に、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター 、 例えば pMON 530に挿入し、 このべク タ一を Agrobacter ium tumef a ciens のようなバクテリ アに導入する。 このノく クテリ アをタ ノく コ 、 例えば Ni cot i ana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗 体を得る （Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 2 4， 131-138) o
上述のよ うに in vitro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H 鎖） 又は軽鎖 （L 鎖） をコ— ドする DNA を別々 に発現ベク ターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現ベク ターに 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し ては、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fv又は H 鎖とし 鎖の Fvを適当な リ ンカーで 連結させたシ ングルチヱイ ン Fv (scFv) が挙げられる。
具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシ ンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコー ドする遺伝 子を構築し、 これを発現べク タ一に導入した後、 適当な宿主細胞で 発現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152， 2968 - 2976、 Better, . & Horwi tz, A. H. Methods in Enzymolog y (1989) 178, 476-496 、 Plueckthun, A. & Skerra， A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、 Lamoy i, E.， Methods in E nzymology (1989) 121, 652-663 、 Rousseaux, J. et al. , Metho ds in Enzymology (1989) 121， 663-669、 Bird, R. B. et al. , TI BTECH (1991) 9, 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結するこ とにより得 られる。 この s cF Vにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ン力一、 好ま しく は、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S . et ai.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85, 5879-5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ペプチ ドリ ンカ一と しては、 例えばア ミ ノ酸 12- 19 残基からなる任 意の一本鎖ぺプチ ドが用いられる。
s cFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖又は、 H 鎖 V 領域をコ 一 ドする DNA 、 および L 鎖又は、 L 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA を铸 型と し、 それらの配列のうちの所望のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする DN A 部分を、 その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR 法により 増幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコー ドする DNA お よびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるように規定するプライ マ一対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 s cFvをコー ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現べク タ一、 および該発現べク タ一により形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 s cFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 させ、 宿主により産生させるこ とができる。 本願特許請求の範囲で いう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物と して、 ポ リ エチ レ ングリ コール （PEG ) 等の各種 分子と結合した抗体を使用すること もできる。 本願特許請求の範囲 でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような 抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことに よって得ることができる。 これらの方法はこの分野においてすでに 確立されている。
前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフ ィ二ティ 一ク ロマ 卜 グラフ ィ 一により行う ことがで きる。 ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ トグラフ ィ 一に用いるカラムと しては 、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる 。 プロテイ ン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0 R0S 、 Sepharose F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタ ンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよ く 、 何ら限定され る ものではない。
例えば、 上記ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラフ ィ 一以外のク ロマ ト グラ フ ィ 一、 フ ィ ルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組 み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製するこ とがで きる。 ク ロマ トグラフ ィ ーと しては、 例えば、 イオン交換ク ロマ ト グラフ ィ 一、 疎水ク ロマ トグラフィ ー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これらのク ロマ トク、'ラフ ィ 一は HPLC (High performance liquid ch romatography) に適用 し得る。 また、 逆相 HPLC ( reverse phase HP LC) を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA 等によ り行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB S (-)で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 35 0D と して算出する。 また、 ELISA による場合は以下のように測 定するこ とができる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （PH9.6 ) で 1 〃 g/mlに希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG0製） 100 / 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cで一晩イ ンキュベー シ ョ ン し、 抗体を固 相化する。 ブロ ッ キングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト G (CAPPEL 製） 100〃 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベー シ ョ ンする。 洗浄後、 5000倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト Ig G (BIO SOURCE製） 100 // 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュべ一 卜する。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベー シ ョ ンの後、 MICR0P LATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用される IL-6改変体は、 Iい 6受容体との結合活性を有 し、 且つ - 6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL - 6 改変体は IL- 6受容体に対し IL-6と競合的に結合するが、 IL- 6の生物 学的活性を伝達しないため、 1レ6による シグナル伝達を遮断する。
IL-6改変体は、 IL - 6のァ ミ ノ酸配列のァ ミ ノ酸残基を置換するこ とにより変異を導入して作製される。 Iい 6改変体のもととなる Iし- 6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ま し く はヒ ト IL- 6である。
具体的には、 1 L-6のァ ミ ノ酸配列を公知の分子モデリ ングプログ ラム、 たとえば、 WHATIF (Vriend et al. , J. Mol. Graphics (199 0) 8, 52-56 ) を用いてその二次構造を予測し、 さ らに置換される ァ ミ ノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。 適切な置換ァ ミ ノ酸残基を決定した後、 ヒ 卜 IL- 6遺伝子をコ一 ドす る塩基配列を含むベク タ一を铸型と して、 通常行われる PCR 法によ りア ミ ノ酸が置換されるように変異を導入することにより、 IL- 6改 変体をコー ドする遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発 現ベク ターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて IL-6改変体を得ることができる。
Iい 6改変体の具体例と しては、 Brakenhoff et al. , J. Biol. Ch em. (1994) 269， 86-93 、 及び Savino et al. , EMBO J. (1994) 13 ， 1357-1367 、 WO 96-18648 、 W096- 17869に開示されている。
本発明で使用される IL- 6部分べプチ ド又は - 6受容体部分べプチ ドは、 各々 1L-6受容体あるいは Iい 6との結合活性を有し、 且つ IL - 6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL-6部分べプチ ド 又は IL- 6受容体部分べプチ ドは IL- 6受容体又は IL- 6に結合し、 これ らを捕捉することにより IL- 6の 1L- 6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 1L- 6の生物学的活性を伝達しないため、 Iし- 6によ る シグナル伝達を遮断する。
IL- 6部分べプチ ド又は iL-6受容体部分べプチ ドは、 - 6又は IL - 6 受容体のァ ミ ノ酸配列において 1L- 6と IL- 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のァ ミ ノ酸配列からなるぺプチ ドである。 この ようなペプチ ドは、 通常 1 0 ~ 8 0、 好ま し く は 2 0〜 5 0 、 より 好ま し く は 2 0〜 4 0個のア ミ ノ酸残基からなる。
IL- 6部分べプチ ド又は IL-6受容体部分べプチ ドは、 ！レ6又は - 6 受容体のァ ミ ノ酸配列において、 1レ6と IL- 6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その一部又は全部のァ ミ ノ酸配列を通常知られる 方法、 例えば遺伝子工学的手法又はペプチ ド合成法により作製する ことができる。
1L-6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドを遺伝子工学的手 法により作製するには、 所望のぺプチ ドをコ一 卜"する DNA 配列を発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて得ることができる。
1L-6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドをぺプチ ド合成法 により作製するには、 ぺプチ ド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いるこ とができる。
具体的には、 続医薬品の開発第 1 4巻ペプチ ド合成 監修矢島治 明廣川書店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法と しては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しょう とする ペプチ ドの C 末端に対応するア ミ ノ酸を結合させ、 - ア ミ ノ基及 び側鎖官能基を適切な保護基で保護したァ ミ ノ酸を C 末端から Ν 末 端方向の順番に 1 ア ミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合した ア ミ ノ酸又はべプチ ドの - ア ミ ノ基の該保護基を脱離させる反応 を交互に繰り返すことにより、 ペプチ ド鎖を伸長させる方法が用い られる。 固相ペプチ ド合成法は、 用いられる保護基の種類により Bo c 法と Fmoc法に大別される。
このよ う にして目的とするペプチ ドを合成した後、 脱保護反応及 びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応をする。 ぺプチ ド鎖との切断 反応には、 BQC 法ではフ ッ化水素又は ト リ フルォロメ タ ンスルホン 酸を、 又 Fmoc法では TFA を通常用いることができる。 Boc 法では、 例えばフ ッ化水素中で上記保護べプチ ド樹脂をァニソール存在下で 処理する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチ ド を回収する。 これを凍結乾燥することにより、 粗ペプチ ドが得られ る。 一方、 Fmoc法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護 反応及びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応を行う こ とができる。 得られた粗ペプチ ドは、 HPLCに適用することにより分離、 精製す ることができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水- ァセ 卜二 ト リル系溶媒を使用 して最適条件下で行えばよい。 得られたク ロマ ト グラ フ ィ 一のプロ フ ア イルの ピーク に該当する画 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このようにして精製したぺプチ ド画分について、 マススペク トル分析による分子量解析、 ア ミ ノ酸 組成分析、 又はア ミ ノ酸配列解析等により同定する。
IL- 6部分べプチ ド及び IL-6受容体部分べプチ ドの具体例は、 特開 平 2-188600、 特開平 7- 324097、 特開平 8- 311098及び米国特許公報 US 5210075に開示されている。
本発明で使用される IL- 6ァンタ ゴニス 卜の IL- 6シグナル伝達阻害 活性は、 通常用いられる方法により評価するこ とができる。 具体的 には、 1L- 6依存性細胞 MH60. BSF2 を培養し、 これに 1レ 6を添加し、 同時に IL- 6ア ンタゴニス トを共存させることにより 1L- 6依存性細胞 の 3H-チ ミ ジ ン取込みを測定すればよい。 また、 1L-6受容体発現細 胞である U266を培養し、 1 2 51 標識 Iい 6を添加し、 同時に IL- 6ア ン タゴニス トを加えることによ り、 IL-6受容体発現細胞に結合した 1 251 標識 IL-6を測定する。 上記ア ツセィ系において、 IL-6ア ンタ ゴ ニス トを存在させる群に加え I L- 6ア ンタゴニス 卜を含まない陰性コ ン ト ロール群をおき、 両者で得られた結果を比較すれば IL- 6ア ン夕 ゴニス トの 1L-6阻害活性を評価することができる。
本発明の効果を確認するには、 膝炎誘発剤、 例えばセルレイ ンを 過剰投与して脖炎を発症した動物に本発明で使用される 1レ6アン夕 ゴニス トを投与し、 膝臓の浮腫抑制効果ゃ腌臓の重量改善を評価す るこ とにより行う こ とができる。 また、 本発明の他の効果と して、 膝炎の予防効果又は脖炎の再発防止効果がある。
塍炎を誘導するためにセルレイ ンを動物に投与する方法は、 例え ば後述の実施例に記載の方法に従えばよい。 また、 滕炎を誘導する 動物と しては、 通常実験に用いられる動物でよ く 、 例えばマウス、 ラ ッ トなどを用いるこ とができる。
後述の実施例に示されるように、 抗 Iレ 6受容体抗体の投与により 、 脖炎を発症した実験動物において、 膝臓重量の抑制及び膝臓の浮 腫の改善が認められたことから、 抗 IL-6受容体抗体等の IL- 6ア ンタ ゴニス トは脖炎治療効果を有することが示された。
本発明における治療対象は哺乳動物である。 治療対象の哺乳動物 は、 好ま し く はヒ トである。
本発明の予防又は治療剤は、 経口的にまたは非経口的に全身ある いは局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの静脈内注 射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐薬、 注腸、 経口性腸溶 剤などを選択することができ、 患者の年齢、 症状によ り適宜投与方 法を選択するこ とができる。 有効投与量は、 一回につき体重 1 kgあ たり 0.01 mg から 100 mgの範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 1〜1000 mg 、 好ま し く は 5〜50 m の投与量を選ぶことができる 本発明の予防又は治療剤は、 投与経路次第で医薬的に許容される 担体や添加物を共に含むものであってもよい。 このような担体およ び添加物の例と して、 水、 医薬的に許容される有機溶媒、 コラーゲ ン、 ポ リ ビニルアルコール、 ポ リ ビニルピロ リ ドン、 力ルボキシ ビ 二ルポ リ マ一、 カルボキシメ チルセルロースナ ト リ ウム、 ポ リ ア ク リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキス ト ラ ン、 カルボキシメ チルスターチナ ト リ ウム、 ぺク チ ン、 メ チルセル口一 ス、 ェチルセルロース、 キサンタ ンガム、 アラ ビアゴム、 カゼイ ン 、 ゼラチ ン、 寒天、 ジグリ セ リ ン、 プロ ピレ ングリ コール、 ポ リ エ チ レ ングリ コール、 ワセ リ ン、 ノ、。ラ フ ィ ン、 ステア リ ノレアルコール
、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （HSA ) 、 マンニ トール、 ソ ルビ トール、 ラ ク ト一ス、 医薬添加物と して許容される界面活性剤 などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて上記の中か ら適宜あるいは組合せて選択される力く、 これらに限定される もので はない。
実施例
以下、 実施例、 参考例および実験例により本発明を具体的に説明 するが、 本発明はこれらに限定される ものではない。
実施例 1 .
B6- hiい 6ト ラ ンスジヱニ ッ クマウ ス又は B6マウス （hiい 6 ト ラ ン スジエニッ クマウスの同腹子) （Clinical Immunology and Immuno pathology, vol.82, 117-124, 1997) (こセノレレイ ン (caerulein 、 協和発酵製） を生理食塩水に溶解し、 5 0 g/kgを 1 時間おきに 7 回、 マウスに腹腔内投与した。 このとき、 抗マウ ス 1レ 6受容体モノ ク ロナ一ル抗体 MR16- 1は、 最初のセルレイ ン投与の直前に、 1 mg/m ouseをマウス尾静脈より投与した。 コ ン ト ロールには抗体の溶媒 （PES ) を用いた。 8時間後に、 マ ウスを安楽死後、 滕重量、 血清中ア ミ ラーゼ、 及び滕臓組織像を観 察した。 膝重量/体重を図 1 に示す。 腌臓組織像を図 2〜 4 に示す 。 尚、 血清ア ミ ラーゼョ一 ドデンプン （ブル一スターチ） 法を用い て測定した。 滕臓組織像はパラフ ィ ンブロ ッ クを作成後、 へマ 卜キ シ リ ンェォ ジ ン （H E ) にて染色後、 顕微鏡下にて観察した。
Iい 6卜ラ ンスジヱニッ クマウスはその同腹子 （正常マウス） に比 して、 セルレイ ン投与により誘導される脾臓重量がさ らに上昇して いた。
また、 肉眼的な観察でも、 浮腫が進行しており膊炎が進行してい た。 1い 6ト ラ ンスジェニ ッ ク マウスに MR16-1を投与する こ とによ り 、 そのセルレイ ン投与で誘導される脬重量の上昇が抑制された。 組 織学的に、 Iい 6ト ラ ンスジヱニッ クマウス群 （図 3 ) と正常マウス 群 （図 2 ) を比較すると、 正常マウスの方が浮腫などの面積が狭く 、 好中球の浸潤等により侵されている領域が狭かった。 これは、 MR 16 - 1を投与することにより、 改善が見られた （図 4 ) 。 したがって 、 セルレイ ン誘導急性膝炎マウスモデルにおいて、 抗 IL- 6受容体モ ノ ク 口一ナル抗体の効果が認められたことにより、 抗 IL- 6受容体抗 体等の IL-6アンタゴニス トは、 IL-6の作用を抑制することで、 急性 眸炎の治療、 重症度の軽減及び発症予防に有用である。
実施例 2.
B6- hiい 6ト ラ ンスジヱニ ッ クマウス又は B6マウス （hiい 6 ト ラ ン スジエニッ クマウスの同腹子） （Clinical Immunology and Immuno pathology, vol.82, 117-124, 1997) に、 生理食塩水に溶解したセ ルレイ ン （caerulein 、 協和発酵製） 50〃 g/kgを 1 時間おきに 7回 、 マウスに腹腔内投与した。 また、 重症滕炎を惹起するため、 最初 のセルレイ ン投与と同時に LPS (1 ipopolysaccharide, Sigma社製） 1 mgZkgを腹腔内投与した。 抗マウス IL-6受容体モノ ク ローナル抗 体 MR16-1は、 最初のセルレイ ン投与の 1 0分前に、 l mg/mouseをマ ウス尾静脈より投与した。 コ ン ト ロールには抗体の溶媒 （PBS ) を 用いた。 8 時間後に、 マウスを安楽死後、 脾重量の測定をおこなつ た。 膝重量 Z体重を図 5 に示す。
IL-6ト ラ ンスジヱニッ クマウスに重症膝炎を惹起した場合、 MR16 - 1を投与することにより、 著しい改善効果が見られた。 したがって 、 セルレイ ンと LPS によ り誘導される重症急性滕炎マウスモデルに おいて、 抗 IL-6受容体抗体等の IL- 6アンタゴニス トは、 1L-6の作用 を抑制することで、 重症急性脖炎の治療、 重症度の軽減および発症 予防に有用である。
参考例 1 . ヒ ト可溶性 IL- 6受容体の調製
Yamasakiらの方法 (Yamasaki, K. et al. , Science (1988) 241, 825-828) に従い得られた IL-6受容体をコー ドする cDNAを含むプラ ス ミ ド pBSF2R.236を用いて、 PCR 法により可溶性 IL-6受容体を作成 した。 プラス ミ ド pBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 Iい 6受 容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に揷入した。 Iい 6受容体 cDNAにス ト ップコ ドンを導入するようにデザィ ンした合成ォリ ゴプ ライ マ一を用いて、 イ ンビ ト ロ ミ ュ一タ ジエネ シスシステム （ Amer sham製） により、 PCR 法で IL- 6受容体 cDNAに変異を導入した。 この 操作によりス ト ップコ ドンがア ミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 IL-6受容体をコ一ドする cDNAが得られた。
可溶性 IL- 6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラス ミ ド pSV (Pharmacia製） と連結させ、 プラス ミ ド PSVL344 を得た。 dhfr の cDNAを含むプラス ミ ド pECEdhfrに Hind III- Sal Iで切断した可溶 性 IL-6受容体 cDNAを揷入し、 CH0 細胞発現プラス ミ ド pECEdhfr344 を得た。 10 fi g のプラ ス ミ ド pECEdhfr344 を dh f r - CHO細胞株 DXB- 11 (Urla ub, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-42 20) へカノレシゥムフ ォ スフ ェ イ ト沈降法 （Chen, C. et al. , Mol. Cell. Biol. (1987) 7， 2745-2751 ) によ り、 卜 ラ ンスフ ヱ ク ト し た。 ト ラ ンスフ エ ク ト した CH0 細胞を ImM グル夕 ミ ン、 10% 透析 FC S 、 lOOU/ml のペニシ リ ンおよび 100〃 /ml のス ト レプ トマイ シ ン を含むヌ ク レオシ ド不含 a MEM 選択培養液で 3 週間培養した。
選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リ ーニングし、 単一の CH 0 細胞ク ローンを得た。 この CH0 細胞ク ロ一ンを 20nM〜 200nM の濃 度のメ ト ト レキセ一 トで增幅し、 ヒ ト可溶性 1L- 6受容体産生 CH0 細 胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイ スコ―ブ改変ダ ルべコ培養液 （ 1MDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回収し、 培養上清中の可溶性 Iレ 6受容体の濃度を ELISA にて測定した。 その 結果、 培養上清中には可溶性 IL-6受容体が存在するこ とが確認され 参考例 2. 抗ヒ ト IL- 6抗体の調製
10 g の組換型 1い 6 (Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (198 8) 17, 41 ) をフ ロイ ン ト完全ア ジュバン ト と と もに BALB/cマウス を免疫し、 血清中に抗 IL-6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを 続けた。 局部の リ ンパ節から免疫細胞を摘出し、 ポ リエチレングリ コール 1500を用いてミ エローマ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイプリ ドーマを HAT 培養液を用いる 0iらの方法 （Selective Methods in C e 11 u 1 ar Immunology, W. H. Freeman and Co. , San Francisco, 351,
1980 ) に従って選択し、 抗ヒ ト - 6抗体を産生するハィブリ ドー マを樹立した。
抗ヒ ト 1 L- 6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のようにして I L - 6結合ア ツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポ リ ビニル製の 96 穴マイ ク 口プレ一 卜 (Dynatech Laboratories, Inc. 製， A 1 exandr i a, VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩 ifr液 ( pH 9.りソ 中で 100〃 1 のャギ抗マウ ス Ig (10 ILL 1/ml, Cooper Biomedical, I nc製 Malvern, PA) により 4 °Cで一晩コー ト した。 次いで、 プレー トを 100 2 1 の 1 %ゥ シ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS により 室温で 2 時間処理した。
これを PBS で洗浄した後、 100〃 1 のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにて一晩イ ンキュベー ト した。 プレー トを洗浄し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるように 1 251 標識組換型 1L-6を各穴 へ添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウ ンタ一 （Beckma n Gamma 9000, Beckman Instruments, Ful ler ton, CA) で測定した 。 216 ハイブリ ドーマク ロー ンのう ち 32のハイブリ ドーマク ロー ン が I L- 6結合アツセィにより陽性であった。 これらのク ローンのな力、 で最終的に安定な MH166. BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが産生 する抗 IL-6抗体 MH166 は I gGl 型のサブタイプを有する。
ついで、 Iい 6依存性マウスハイプリ ドーマク ローン MH60. BSF2 を 用いて MH166 抗体によるハイプリ ドーマの増殖に関する中和活性を 調べた。 MH60. BSF2 細胞を 1 x 10^ /200 1 /穴となるように分注し 、 これに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 0.5 fi Ci/ 穴の 3H チ ミ ジン （New England Nuclear, Boston, MA ) を加 えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフィ ルタ一ぺーパ —上におき、 自動ハーべスター （Labo Mash Science Co.， Tokyo, Japan ) で処理した。 コ ン ト ロールと してゥサギ抗 IL- 6抗体を用い た。
その結果、 MH166 抗体は IL-6により誘導される MH60. BSF2 細胞の 3H チ ミ ジ ンの取込みを容量依存的に阻害した。 このこ とより、 MH 166 抗体は Iレ6の活性を中和するこ とが明らかとなった。 参考例 3. 抗ヒ ト - 6受容体抗体の調製
Hirataらの方法 （Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143， 2900-2906 ) によ り作成した抗 Iい 6受容体抗体 MT18を CNBrによ り活 性化させたセフ ァ ロ一ス 4B (Pharmacia Fine Chemicals製， Piscat away, NJ) と添付の処方にしたがって結合させ、 1L- 6受容体 （Yama saki, K. et al. , Science (1988) 241, 825-828) を精製した。 ヒ ト ミ エロ一マ細胞株 U266を 1 ジギ トニ ン （Wako Chemicals製） ， 10 mMト リエタノ一ルァ ミ ン （pH 7.8) および 0.15M NaClを含む ImM p- パラア ミ ノ フ ヱニルメ タ ンスルフ ォニルフルオラィ ドノヽィ ドロ ク ロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギ トニン緩衝液） で可溶化し、 セフ ァ ロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合した。 その後、 ビ一 ズをジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫するための部分精製 IL - 6 受容体と した。
BALB/cマウスを 3 X 109 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL-6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL-6受容体への結合活性を調べた。 5 X 107 個の U266細胞を 35S —メ チォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギ トニン緩衝液で可 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセフ ァ ロース 4Bビー ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギ トニン緩衝液 （pH3.4 ) により 35 S —メ チ ォニン標識 - 6受容体を流出させ、 0.025ml の 1M Tris (pH 7.4) で中和した。
0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セフ ァ ロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セフ ァ ロースを上 記で調製した 0.005ml の 35 S 標識 IL- 6受容体溶液とと もにイ ンキュ ベ一 卜 した。 免疫沈降物質を SDS-PAGEで分析し、 IL- 6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ドーマク ロー ン PM- 1を樹立した。 ハイブリ ド一マ PM- 1から産生さ れる抗体は、 IgGl 型のサブタイプを有する。
ハイブリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL- 6受容体に対する IL - 6の結合阻害活性をヒ ト ミエロ一マ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組換型 Iい 6を大腸菌より調製し （Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (1988) 17, 4 45) 、 ボル ト ン一ハンター試薬 （New Englan d Nuclear, Boston, MA ) により 1 25 I 標識した （Taga, T. et al . , J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 ) 。 4 x 105 個の U266細胞 を 1 時間、 70 (v/v ) のハイプリ ドーマ PM-1の培養上清および 14 OOOcpmの 1 25 I 標識 Iい 6とと もに培養した。 70〃 1 のサンプルを 4 00 1 のマイ ク ロフユ一ジポ リエチレンチューブに 300〃 1 の FCS 上に重層 し、 遠心の後、 細胞上の放射活性を測定した。
その結果、 ハイプリ ドーマ ΡΜ- 1が産生する抗体は、 IL-6の IL- 6受 容体に対する結合を阻害することが明らかとなつた。
参考例 4. 抗マウス 1L- 6受容体抗体の調製
Sai to, T. et al. , J. Immunol. (1991) 147, 168-173 に記載の 方法により、 マウス - 6受容体に対するモノ ク ロ一ナル抗体を調製 した。
マゥス可溶性 Iい 6受容体を産生する CH0 細胞を 10 CSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清から抗マウス IL- 6受容体抗体 RS12 ( 上記 Saito, T. et al 参照） を Affigel 10ゲル （Biorad製） に固定 したァフィ二ティ 一カラムを用いてマウス可溶性 IL- 6受容体を精製 し 7<— o
得られたマウス可溶性 IL- 6受容体 50 z g をフロイ ン ト完全ァジュ バン ドと混合し、 ウ ィ スターラ ッ トの腹部に注射した。 2 週間後か らはフロイ ン ト不完全アジュバン ドで追加免疫した。 45日目にラ ッ ト脾臓細胞を採取し、 2 X 108 個を 1 X 107 個のマウス ミ エローマ 細胞 P3U1と 50% の PEG1500 (Boehringer Mannheim 製） をもちいて 常法により細胞融合させた後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リ ーニングした。
ゥサギ抗ラ ッ 卜 IgG 抗体 （Cappel製） をコー ト したプレー トにハ イブリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウス可溶性 IL- 6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL- 6受容体抗体およびアルカ リ フ ォスフ ァターゼ標識ヒッジ抗ゥサギ IgG による ELISA 法によりマウ ス可溶性 IL- 6受容体に対する抗体を産生するハイブリ ドーマをスク リ ーニングした。 抗体の産生が確認されたハイプリ ド一マク ローン は 2 回のサブスク リ ーニングを行い、 単一のハイブリ ド一マク ロ一 ンを得た。 このクローンを MR16- 1と名付けた。
このハイプリ ドーマが産生する抗体のマウス IL-6の情報伝達にお ける中和活性を MH60. BSF2 細胞 （Matsuda, T. et al. , J. Immunol . (1988) 18, 951 -956) を用いた 3H チ ミ ジ ンの取込みで調べた。 96ゥエルプレ一 トに MH60. BSF 細胞を 1 X 104 個/ 200〃 1/ゥ エルと なるように調製した。 このプレー トに 10pg/ml のマウス IL-6と MR16 -1抗体又は RS12抗体を 12.3〜 1000ng/ml 加えて 37°C、 5¾C02 で 44時 間培養した後、 l〃 Ci/ ゥヱルの 3H チ ミ ジ ンを加えた。 4 時間後 に 3H チ ミ ジ ンの取込みを測定した。 その結果 MR16- 1抗体は MH60. B SF2 細胞の 3H チ ミ ジン取込みを抑制した。
したがって、 ハイプリ ドーマ MR16-1が産生する抗体は、 IL- 6の IL -6受容体に対する結合を阻害するこ とが明らかとなつた。 産業上の利用可能性
本発明により、 抗 IL- 6受容体抗体等の IL- 6ァンタゴニス トが脖炎 の治療効果を有することが示された。 したがって、 1L-6アンタゴニ ス トは急性脖炎等の治療剤と して有用であることが明らかにされた

Claims

請 求 の 範 囲
I . イ ンタ一ロイキン- 6 ( IL-6) ア ンタ ゴニス トを有効成分と し て含有する脖炎の予防又は治療剤。
2. IL- 6ア ンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体であることを 特徴とする請求項 1 記載の予防又は治療剤。
3. IL- 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するモノ ク ローナ ル抗体であることを特徴とする請求項 2 に記載の予防又は治療剤。
4. IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ロ ーナル抗体であるこ とを特徴とする請求項 3 に記載の予防又は治療 剤。
5. IL- 6受容体に対する抗体がマウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体であることを特徴とする請求項 3 に記載の予防又は治 療剤。
6. IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴と する請求項 2 〜 5 のいずれか 1 項に記載の予防又は治療剤。
7. ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が PM- 1抗体であ ることを特徴とする請求項 4 に記載の予防又は治療剤。
8. マウス IL- 6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が MR16-1抗体 であるこ とを特徴とする請求項 5 に記載の予防又は治療剤。
9. IL- 6受容体に対する抗体が Iレ 6受容体に対するキメ ラ抗体又 はヒ ト型化抗体であることを特徴とする請求項 2 〜 4 のいずれか 1 項に記載の予防又は治療剤。
1 0. IL-6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体であ ることを特徴とする請求項 9 に記載の予防又は治療剤。
I I . 腌炎が、 急性腌炎である、 請求項 1 〜 1 0のいずれか 1 項 に記載の予防又は治療剤。
1 2. IL- 6ア ンタゴニス トを有効成分と して含有する膝炎におけ る脖臓浮腫抑制剤。
1 3. IL- 6受容体に対する抗体を有効成分と して含有する脖炎に おける滕臓浮腫抑制剤。
1 4. 脬炎の予防又は治療のための方法であって、 膝炎の予防又 は治療のために有効な量のイ ンタ一ロイキン- 6 ( - 6) アンタゴニ ス トを予防又は治療を必要とする患者に投与することを含んで成る 方法。
1 5. IL- 6ア ンタゴニス トが IL-6受容体に対する抗体であること を特徴とする請求項 i 4記載の予防又は治療方法。
1 6. IL- 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノ ク ロ 一 ナル抗体であることを特徴とする請求項 1 5 に記載の予防又は治療 方法。
1 7. IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体であることを特徴とする請求項 1 6 に記載の予防又は 治療方法。
1 8. IL-6受容体に対する抗体がマウ ス 1L- 6受容体に対するモ ノ ク ロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 1 6 に記載の予防又 は治療方法。
1 9. IL- 6受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴 とする請求項 1 5 に記載の予防又は治療方法。
2 0. ヒ ト IL- 6受容体に対するモノ クロ一ナル抗体が PM- 1抗体で あることを特徴とする請求項 1 7 に記載の予防又は治療方法。
2 1. マウ ス IL-6受容体に対するモノ ク ロ ーナル抗体力く MR16-1抗 体であることを特徴とする請求項 1 8 に記載の予防又は治療方法。
2 2. IL- 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するキメ ラ抗体 又はヒ ト型化抗体であることを特徴とする請求項 1 5 に記載の予防 又は治療方法。
2 3. IL- 6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM-1抗体であ ることを特徴とする請求項 2 2 に記載の予防又は治療方法。
2 4. 膝炎が、 急性脖炎である、 請求項 1 4 に記載の予防又は治 療方法。
2 5. 脬炎における脖臓浮腫の抑制方法において、 脬臓浮腫の抑 制のために有効な量の IL- 6ァンタゴニス トを、 脖臓浮腫の抑制を必 要とする患者に投与することを含んで成る方法。
2 6. 脖炎における脖臓浮腫の抑制方法において、 脬臓浮腫の抑 制のために有効な量の 1レ6受容体に対する抗体を、 滕臓浮腫の抑制 を必要とする患者に投与するこ とを含んで成る方法。
2 7. 滕炎の予防又は治療剤の製造のためのイ ンタ一ロイキン- 6 ( IL-6) ア ンタゴニス トの使用。
2 8. Iい 6ア ン夕ゴニス トが IL-6受容体に対する抗体であるこ と を特徴とする請求項 2 7記載の使用。
2 9. IL-6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するモノ ク ロ一 ナル抗体であることを特徴とする請求項 2 8 に記載の使用。
3 0. IL-6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体であることを特徴とする請求項 2 9 に記載の使用。
3 1 . IL- 6受容体に対する抗体がマウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体であることを特徴とする請求項 2 9 に記載の使用。
3 2. IL- 6受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴 とする請求項 2 8〜 3 1 のいずれか 1 項に記載の使用。
3 3. ヒ 卜 IL- 6受容体に対するモノ クローナル抗体が PM- 1抗体で あることを特徴とする請求項 3 0 に記載の使用。
3 4. マウス IL- 6受容体に対するモノ ク 口一ナル抗体が MR16- 1抗 体であることを特徴とする請求項 3 1 に記載の使用。
3 5. I L- 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体 又はヒ ト型化抗体であることを特徴とする請求項 2 8 〜 3 0 のいず れか 1 項に記載の使用。
3 6„ IL - 6受容体に対する ヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体であ ることを特徴とする請求項 3 5 に記載の使用。
3 7 · 膝炎が、 急性脖炎である、 請求項 2 7 〜 3 6 のいずれか 1 項に記載の使用。
3 8. 膝炎における脖臓浮腫の抑制剤の製造のための IL-6ア ン夕 ゴニス ト使用。
3 9. 脖炎における膝臓浮腫の抑制剤の製造のための IL- 6受容体 に対する抗体の使用。
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