WO2000006725A1 - Method for diagnosing hereditary diseases by using semaphorin w gene - Google Patents

Method for diagnosing hereditary diseases by using semaphorin w gene Download PDF

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WO2000006725A1
WO2000006725A1 PCT/JP1999/004120 JP9904120W WO0006725A1 WO 2000006725 A1 WO2000006725 A1 WO 2000006725A1 JP 9904120 W JP9904120 W JP 9904120W WO 0006725 A1 WO0006725 A1 WO 0006725A1
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semaphorin
disease
mutation
genetic
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Toru Kimura
Jeffrey Adam Encinas
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Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing a genetic disease using a semaphorin W gene. More specifically, the present invention provides a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome, or a method for determining the gene type of a semaphorin W gene carried in an individual, or Semaphorin in the diagnostic or determining method
  • the present invention relates to a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in a W gene, and a therapeutic agent for a genetic disease containing a semaphorin W gene as an active ingredient.
  • adenosine deaminase deficiency is known to be an immune disease caused by a mutation in the adenosine deaminase gene. Therefore, the onset can be suppressed by replacement of adenosine deaminase or bone marrow transplantation as replacement therapy, and in the future, by applying gene therapy, the onset can be suppressed for a lifetime.
  • genetic diagnosis of parents allows them to know in advance whether their newborn child may have the disease and prepare for treatment. Therefore, finding the causative gene of a so-called genetic disease, which is surely caused by genetic factors, is extremely important in medical practice, and it is necessary to diagnose the disease or the possibility of its development, and even to treat it. It is also possible, and its industrial utility is extremely high.
  • semaphorin W is a novel semaphorin cloned by the present inventors (WO 98 / 1562S pamphlet), but its location on the chromosome of semaphorin W and its association with genetic diseases and the like are not discussed. , Has not been revealed at all.
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing a genetic disease using a semaphorin W gene. That is, the present invention provides a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene, a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual, or the method for diagnosis or determination.
  • An object of the present invention is to provide a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene, and a therapeutic agent for a genetic disease containing the semaphorin W gene as an active ingredient.
  • the present inventors have identified a novel neurite outgrowth inhibitor, semaphorin W (WO 98/15628).
  • the present inventors have now accurately determined the chromosomal location of the human and mouse semaphorin W gene using the radiation hybridization method, and compared them with known genetic diseases and mutations. As a result, they found that in mice, this semaphorin W gene maps to the same position as a genetic disease called mnd2, for which the causative gene has not yet been identified.
  • mapping of the human semaphorin W gene on the chromosome revealed that it was present on the short arm 2pl3 of chromosome 2.
  • 2 P 13 of the 2 short arm of chromosome a variety of genetic diseases, i.e. Parkinson's disease, Alstrom syndrome, limb-girdle muscular resist opening buoy one 2 B-type, Miyoshi distal muscular dystrophy, neuroblastoma, bar one Kit lymphoid fl., Colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, cleft palate, cleft lip, chronic linno leukemia, keratocystoma, and multiple congenital malformations. It is the position where it is locked.
  • the mouse 'semaphorin w gene is considered to be a causative gene of a genetic disease called mnd2 as described above and also a causative gene of a similar genetic disease in humans, Also, it was concluded that the semaphorin W gene is a causative gene of a genetic disease, and specifically, is a causative gene of a genetic disease mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2 as described above.
  • the semaphorin W gene is also a causative gene for various genetic diseases.
  • the position of the semaphorin W gene on the chromosome is determined for the first time in the present invention, and it is clarified that the semaphorin W is a causative gene for the genetic disease as described above. It has become possible to provide methods for diagnosis and treatment, as well as a method for raising breeding efficiency in model animals with genetic diseases.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for diagnosing a genetic disease which comprises analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome;
  • Genetic diseases include Parkinson's disease, Alstroem syndrome, limb-girdle muscular dystrophy, oral type 1B, Miyoshi-type distal muscular dystrophy, neuroblastoma, Baikit's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, The method of (1) or (2), wherein the method is selected from schizophrenia, cleft palate / cleft lip, chronic lymphocytic leukemia, keratocytoma or multiple congenital malformations;
  • a therapeutic agent for a genetic disease comprising at least a part of the semaphorin W gene as an active ingredient
  • the diagnosis method is a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome.
  • the diagnostic method also diagnoses the possibility of developing a genetic disease.
  • the ⁇ semaphorin W gene '' includes all exons of mammalian semaphorin W such as human, rat, mouse, etc., and all introns and transcription regulatory regions sandwiched therebetween, transcription termination site, etc. Semaphorin Refers to all regions that control the structure and expression control of the w gene.
  • the semaphorin w gene is a causative gene for a genetic disease, but it has once been revealed that it is a causative gene for a genetic disease.
  • the total length of the semaphorin W gene exceeds tens of thousands of nucleotides. It takes time to analyze the entire base sequence. Therefore, it is actually more efficient to use the stepwise method as shown below. That is, as a first step, the nucleotide sequence of the semaphorin w gene of one healthy patient is determined.
  • a known human semaphorin W cDNA can be obtained from a human chromosomal DNA such as the YAC library (Research Genetics, USA) or the BAC library (Research Genetics, USA).
  • a human chromosomal DNA such as the YAC library (Research Genetics, USA) or the BAC library (Research Genetics, USA).
  • FERM BP-6089 Depositary institution: 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute; Deposit Date: Heisei (August 29, 9) Screening may be performed by a conventional method using as a probe.
  • the gene can be obtained by requesting Genome Systems, Inc. in the United States after setting appropriate primers.
  • ⁇ 5 -agcatccctgactctcat-3 (Torumi system U number: 17)
  • 5 '-tagggggaagccctgatt-3' Toromi column number: 18
  • 5 '-cagaaagcagttctgatt-3' 3 primers (SEQ ID NO: 19) were set and 547 bp by PCR using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • Semaphorin W was obtained by requesting Genome Systems, Inc., etc., to conduct screening using the appearance of a band and the appearance of a 523 bp band by PCR using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 as an index. Gene can be easily obtained.
  • the gene is amplified by PCR for some sequences of about 500 to 2000 bases in some patients and healthy people, and for each fragment, for example, We analyzed whether there is a difference between the gene of a patient and a healthy person by the RFLP method, the PCR method, the SSCP method, or the enzymatic cleavage method of a mutant base pair, which is one of the genetic diagnosis methods described in detail below.
  • the entire nucleotide sequence of the region where the difference was found may be determined. This makes it possible to determine exactly what kind of mutation is strictly and easily. Such methods are generally well known and
  • detection of this mutation site can be performed as follows. That is, chromosomal DNA extracted from a part of a subject's tissue, blood, etc. by a standard method is used as a test sample.
  • the reagent for mutation detection used in such diagnosis is, for example, a DNA or RNA having a part of the sequence of the semaphorin W gene and a DNA or RNA that can be analyzed for the presence or absence of a mutation in the semaphorin Wit gene. Any NA or RNA May be selected as appropriate at the discretion of those skilled in the art.
  • the DNA can be used as a PCR primer or a probe for hybridization, and the RNA can be used as a probe for hybridization (the DNA and RNA will be described later).
  • a “genetic disease” diagnosed by analyzing a mutation in the semaphorin W gene refers to a disease in which the semaphorin W gene (a gene located on the semaphorin W gene) is the causative gene. Point. That is, in humans, it refers to a genetic disease that is mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2, and specifically includes a genetic disease that causes abnormalities in the nervous system, muscle, or immune system.
  • Parkinson's disease Alstroem syndrome, limb girdle muscular dystrophy type 2B, Miyoshi type distal muscular dystrophy, neuroblastoma, Burkitt's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, palate Cleft Z cleft lip, chronic Rinno ,. It is selected from diseases that map to 2p13 on the short arm of chromosome 2, such as leukemia, keratokeratomas, or multiple congenital malformations. Among them, Parkinson's disease and Alstroem syndrome are preferable from the viewpoint of mapping in more detail. From another viewpoint, a human genetic disease corresponding to mnd2 in mice can be mentioned.
  • mnd2 diseases that cause abnormalities in nerves, muscles or the immune system, and in which the causative gene is mapped to the same position as the semaphorin W gene.
  • the diagnostic method of the present invention it is possible to diagnose not only the onset of the genetic disease as described above but also the possibility of the future onset of the genetic disease.
  • the semaphorin W gene may also be a causative gene for various genetic diseases.
  • diseases that cause semaphorin W as a causative gene That is, for a disease in which the causative gene is mapped at the same position as the semaphorin W gene, diagnosis can be performed based on the method for identifying a mutation in the semaphorin W gene and the method for detecting the mutation as described above. it can.
  • the present invention further provides a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene.
  • semaphorin W gene genotype means a homozygote (-/-) that has a semaphorin w gene mutation in both alleles and a heterozygote that has a semaphorin w gene mutation in one of the alleles. (+/-) and wild-type (+ / +)
  • V refers to any genotype.
  • model animals with genetic mutations is widely used in disease research and drug development.
  • One major problem is that often homozygous mutants are difficult to subculture, so they are usually passaged by heterozygotes, and homozygotes are selected from them for experiments. Then the method of using it is taken. However, it is often difficult to select homozygotes in young individuals, which greatly hinders research using such mutant animals.
  • the causative gene of the mutation is found, the genotype can be easily detected by analyzing the gene by a known method such as PCR, and the efficiency of breeding can be greatly improved. Since the present invention revealed that semaphorin W was the causative gene of mnd2, the genotype of mnd2 mouse could be easily determined by analyzing the semaphorin W gene, Can be quickly and efficiently selected.
  • the semaphorin W gene mutant animals include not only mnd2 mice, but also diseases that cause abnormalities in the nerves, muscles, or immune system as described above, and have the same causative gene as the semaphorin W gene. Have a disease that maps to a location Mutant animals are included.
  • the present invention also provides a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene in the above-described diagnostic methods and genotype determination methods. As described above, once a mutation site in the semaphorin W gene is identified, DNA or RNA for detecting the mutation can be easily selected by a conventional method.
  • DNA that is a part of the semaphorin W gene and that is capable of analyzing the mutation of the semaphorin W gene can be used as a probe in a diagnosis method based on a dimension.
  • an RNA corresponding to a DNA consisting of a part of the semaphorin Wit gene can be used, and the RNA can be used as a probe for hybridization.
  • the semaphorin W gene is, for example, in the case of human, the human semaphorin W is compared to the human chromosome DNA YAC library 1 (Research Genetics, USA) or BAC library 1 (Research The Genetics, USA).
  • Cloning can be performed by screening using cDNA (described in WO 98/15628 pamphlet, accession number: FEM BP-6089) as a probe by a conventional method. Further, as described above, if appropriate primers such as SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 19 are set, the semaphorin W gene can be easily obtained by requesting Genome Systems, Inc. can do.
  • cDNA of semaphorin W is also a DNA consisting of a part of the semaphorin W gene, a part of the cDNA can be used as the DNA for mutation analysis of the present invention.
  • the nucleotide sequence of cDNA (human and rat) is described in WO 98/15628 pamphlet, and the human is deposited under accession number: FERM BP-6089.
  • FERM BP-6089 accession number
  • cDNA of semaphorin W can be easily obtained based on the nucleotide sequence.
  • the DNA for mutation analysis of the present invention can be appropriately prepared by a conventional method such as DNA synthesis. Whether or not these DNAs are DNAs that can analyze mutations in the semaphorin W gene can be determined by the method for identifying a site having the mutation described above (Current Protocols in Human Genetics (1998) Edt. Boyle et al. John Wiley & Sons, Inc.) and the method of detecting the mutation site.
  • DNA for mutation analysis of the present invention include the following.
  • CXGZGXC a change in the number of three-base repeating sequences
  • the DNA for mutation analysis of the present invention include a DNA probe or primer capable of detecting the mutation of the number of the CTG or leucine.
  • the present invention further provides a therapeutic agent for a genetic disease, which comprises at least a part of the semaphorin W gene as an active ingredient. That is, since the semaphorin W gene is a causative gene of a genetic disease, it can be used for treating the genetic disease.
  • a retrovirus for example, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, a simbis virus, or the like, may be used as the DNA virus or the RNA virus of the present invention.
  • a method of incorporating and introducing DNA There is a method of incorporating and introducing DNA.
  • a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a vaccinia virus and the like is particularly preferable.
  • DNA vaccine method direct injection of the expression plasmid into the muscle
  • liposomal method lipofectin method
  • microinjection method phosphoric acid / residue method
  • electoral poration method phosphoric acid / residue method
  • DNA vaccine method and the ribosome method are preferred.
  • the in vivo method When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate route depending on the disease, symptom, and the like for the treatment. For example, it can be administered to a vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and the like.
  • it When administered by the in vivo method, for example, it may be in the form of a liquid preparation or the like, but it is generally prepared as an injection containing the DNA of the present invention as an active ingredient.
  • a carrier may be added.
  • liposome or membrane-fused ribosome such as Sendai virus (HVJ) -ribosome
  • liposomes such as a suspending agent, a cryogen, and a centrifugal concentrated cryogen are used.
  • a pharmaceutical preparation In the form of a pharmaceutical preparation.
  • the content of the DNA of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, etc., and usually 0.000001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg of the present invention.
  • the DNA of the invention is administered once every few days to several months.
  • FIG. 1 shows the frame map of chromosome 6 of the mouse in which the semaphorin W gene is present and the position of the semaphorin W gene (Semaw).
  • rat semaphorin W cDNA of the C57BL / 6 BAC genomic library of the U.S. Genome System Co., Ltd. No. 1 or SEQ ID NO: 2) was used as a probe, and 2) a mouse genomic DNA library was screened using the PCR screening service of the 129 / SVJ BAC genomic library.
  • the nucleotide sequences of the DNAs of these clones were determined using a Perkin-Elmera ⁇ ⁇ type 377 DNA sequencer. The reaction was performed using a prism dye termination kit (PerkinElmer). From the nucleotide sequence analysis results, it was confirmed that these clones definitely contained the semaphorin W gene.
  • the human semaphorin W gene maps to a position on the chromosome at 2 ⁇ 13.
  • the principle of conserved synteny (DeBry et al.
  • the region containing the human semaphorin W gene is located on chromosome 6 in mice. Further detailed location of the semaphorin W gene was determined as follows. In the case of mouse, since a framework for a marker sequence required for mapping has not yet been prepared, a frame of this region on chromosome 6 was prepared as follows. Using the various primers contained in Map Pairs Microsatellite Marker-1 (US Research's Genetics) to perform PCR on a T31 radiation hybrid panel (U.S.A. Research Genetics) and performing PCR on the results The Map 'Manager QT (Manly,
  • mice semaphorin W gene has two microsatellite markers. It was found to be located between D6Mit71 and D6Mit9, at 122.4cR from D6Mit71 and 59.9cR from D6Mit9. To determine the location of this gene in more detail, it is known from the Mouse-Genome Database http: // www. Informatics, jax.org/ that it is located near the location of the semaphorin W gene previously determined. There are six microsatellite cameras, namely D6Mit4, D6M6, D6Mit70,
  • D6Mit99, D6Mitl89, and D6M189 were examined by PCR for the presence of each of the four mouse semaphorin W chromosomal DNA clones obtained in Example 1. As a result, it was revealed that D4M189 was present in all four clones, and that D6Mit89 and D6Mit70 were both present in one clone, and that both markers and the mouse semaphorin W gene were identical on the BAC clone. (About 150 kb).
  • each clone contains the human semaphorin W gene! / Can be determined by generating a 520 bp fragment.
  • the human semaphorin W gene was expressed as 2
  • the marker sequence of chromosome short arm WI5987 revealed that it was located at the position 5.87cR on the centromere side, that is, at position 2pl3 of the chromosome 2 short arm.
  • Mouse semaphorin W cDNA was obtained by RT-PCR using 129 / SVJ mouse mRNA as type II as follows.
  • RNA was prepared from mouse brain by the usual method, and the obtained RNA is Using dT latex beads (Takara Shuzo), mRNA was prepared according to the protocol attached to the product.
  • l // g mRNA into type III, using a Superscript II cDNA synthesis system (manufactured by Gibco), according to the attached protocol, oligo dT-DNA and three synthetic primers, 5 '"GCCATAGCAGAGGGCTACAG-3' (sequence Nos .: 14), 5'-GAAGGCACACACAGCAGAAA-3 '(SEQ ID NO: 15), 5'-CTCACMTMCCCCGCACTT-3,
  • SEQ ID NO: 16 was used as a primer to synthesize cDNA. Subsequently, in order to obtain mouse semaphorin WcDNA, the cDNA synthesized above was transformed into type III, and PCR was performed using various synthetic primers under the same conditions as above. In order to further obtain a sequence at the 3 'end, the 3' RACE method was used. The obtained fragment was excised from the gel after agarose gel electrophoresis by a usual method, purified, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 1.
  • the determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • PCR primers are prepared for the semaphorin W gene mutation site and the site where the mutation is not observed as follows.
  • the sequence of the primer at the position where the mutation is recognized is the same between the mutant gene and the wild-type gene! /, So that the region is at the 5 'end of the primer and the different region is at the 3' end of the primer, and two types, one with the sequence of the wild-type gene (a) and one with the sequence of the mutant gene (a) Make it.
  • a primer having a wild-type sequence at a position where no mutation is observed as the third primer-( ⁇ ) is set at a position a suitable distance from the two primers.
  • genomic DNA is prepared from blood according to a standard method and used as a test sample. This genomic DNA is divided into two parts, A and B. A uses the primers (a) and (B), and B uses the primers (a) and ( ⁇ ). Perform PCR on the subject.
  • the amplified fragment obtained is subjected to agarose gel electrophoresis, and a band is detected by staining with bromide medium.
  • a band is detected by staining with bromide medium.
  • a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual, or the method for semaphorin W
  • the present invention can provide DNA or RNA which can be used for analyzing the presence or absence of a gene mutation, and a therapeutic agent for a genetic disease containing a semaphorin W gene as an active ingredient.

Abstract

A method for diagnosing hereditary diseases by analyzing the occurrence of mutation in semaphorin W gene, or a method for determining the genotype of semaphorin W gene carried by an individual; a DNA or an RNA usable in analyzing the occurrence of mutation in semaphorin W gene in the diagnosis method or the determination method described above; and a remedy for hereditary diseases containing semaphorin W gene as the active ingredient.

Description

明 細 書 セマフォリン W遺伝子を用いた遺伝疾患の診断方法 技術分野  Description Method for diagnosing genetic diseases using semaphorin W gene
本発明は、 セマフォリン W遺伝子を用いた遺伝疾患の診断方法に関する。 さら に詳しくは、 本発明は、 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析す ることによる遺伝疾患の診断方法又は個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺 伝子型の決定方法、 あるいは前記診断方法または決定方法においてセマフォリン The present invention relates to a method for diagnosing a genetic disease using a semaphorin W gene. More specifically, the present invention provides a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome, or a method for determining the gene type of a semaphorin W gene carried in an individual, or Semaphorin in the diagnostic or determining method
W遺伝子の変異の有無を解析するために使用され得る D N Aまたは R N A、 さら にはセマフォリン W遺伝子を有効成分とする遺伝疾患の治療剤に関する。 The present invention relates to a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in a W gene, and a therapeutic agent for a genetic disease containing a semaphorin W gene as an active ingredient.
背景技術 Background art
多くの疾患が遺伝的素因によってひき起こされることが知られているが、 最近 そのいくつかについて、 原因となる遺伝子変異が明らかにされている。 このよう な遺伝子の変異が分かることによって、 疾患の発症の機構が明らかになるのみで はなく、 治療、 予防、 診断にも大きく役立つ。 たとえばアデノシンデァミナーゼ 欠損症は、 アデノシンデァミナ一ゼ遺伝子の変異によって引き起こされる免疫疾 患であることが知られているが、 早期に遺伝子に変異があることが明らかになる と、 出生直後から、 補充療法としてアデノシンデァミナーゼの補充や骨髄移植を 行うことにより発症を押さえたり、 さらに将来的には遺伝子治療を施すことで、 生涯に渡って発症を抑制することができるようになる。 更に、 両親に対して遺伝 子診断を施すことで、 生まれて来る子供が疾患を持つ可能性があるかどうかをあ らかじめ知り、 治療の準備をするなどの対処ができるようになる。 そのため、 遺 伝的な要因で引き起こされることが確実であるいわゆる遺伝疾患の原因遺伝子を 見い出すことは、 医療上極めて重要なことであり、 疾患の診断または発症の可能 性の診断、 さらには治療をも可能とするものであり、 産業上の有用性も極めて高 い。  It is known that many diseases are caused by genetic predisposition, but recently some of them have been identified as the causative genetic mutation. Knowing these gene mutations will not only elucidate the mechanism of disease development, but will also be of great use in treatment, prevention and diagnosis. For example, adenosine deaminase deficiency is known to be an immune disease caused by a mutation in the adenosine deaminase gene. Therefore, the onset can be suppressed by replacement of adenosine deaminase or bone marrow transplantation as replacement therapy, and in the future, by applying gene therapy, the onset can be suppressed for a lifetime. In addition, genetic diagnosis of parents allows them to know in advance whether their newborn child may have the disease and prepare for treatment. Therefore, finding the causative gene of a so-called genetic disease, which is surely caused by genetic factors, is extremely important in medical practice, and it is necessary to diagnose the disease or the possibility of its development, and even to treat it. It is also possible, and its industrial utility is extremely high.
遺伝疾患のうち、 その原因遺伝子が 2番染色体短腕の 2 p 1 3の位置にマップ されるものが数多く知られている。 すなわち、 パーキンソン病 （Nat. Genet. (1998) 18, no. 3, 262—265、 Ann. Neurol. (1998) 44， no. 3, Suppl 1, S53— 57) 、 ァルス トレーム症候群 (Hum. Mol. Genet. (1997) 6, no. 2， 213- 219、 Genomics (1998) 53, no. 3, 359-364) 、 肢帯型筋ジストロフィー 2 B型 (Genomics (1996) 33， 46-52)、 三好型遠位型筋ジストロブイ一（日本臨床（1997) 55, no. 12, 106-110)、 神経芽腫 (J. Pathol. (1997) 181, no. 4, 394-400, Br. J. Cancer (1988) 58, no. 3, 287-291) 、 バーキットリンパ腫（Cancer Genet. Cytogenet. (1986) 20， no. 1-2, 95 - 99、 There are many known genetic diseases in which the causative gene is mapped to the position of 2p13 on the short arm of chromosome 2. Parkinson's disease (Nat. Genet. (1998) 18, no. 3, 262—265, Ann. Neurol. (1998) 44, no. 3, Suppl 1, S53—57), Treme syndrome (Hum. Mol. Genet. (1997) 6, no. 2, 213-219, Genomics (1998) 53, no. 3, 359-364), limb girdle muscular dystrophy type 2B (Genomics (1996) 33 , 46-52), Miyoshi-type distal muscular dystrophy (Japanese clinical (1997) 55, no. 12, 106-110), neuroblastoma (J. Pathol. (1997) 181, no. 4, 394-) 400, Br. J. Cancer (1988) 58, no. 3, 287-291), Burkitt's lymphoma (Cancer Genet. Cytogenet. (1986) 20, no. 1-2, 95-99,
Virology (1993) 195, no. 1, 248 - 251、 Nature (1982) 298, no. 5873, 474-476, Cancer Res. (1985) 45, no. l lPt2， 5593- 5597)、 結腸腺癌 (Anticancer Res. (1994) 14, no. 1A， 109-112)、 甲状腺腫 (Am. J. Hum. Genet. (1998) 63， no. 2, 625-637)、 精神*** 病（Mol. Psychiatry (1998) 3, no. 6， 521-527)、 口蓋裂 Z***裂（CI in. Genet. (1998) 54, no. 1, 65-69, Genomics (1998) 50, no. 3. 299—305、 Genomics (1998) 54， no. 2， 231- Virology (1993) 195, no. 1, 248-251, Nature (1982) 298, no. 5873, 474-476, Cancer Res. (1985) 45, no. LPt2, 5593-5597), colon adenocarcinoma ( Anticancer Res. (1994) 14, no. 1A, 109-112), goiter (Am. J. Hum. Genet. (1998) 63, no. 2, 625-637), schizophrenia (Mol. Psychiatry (Mol. 1998) 3, no. 6, 521-527), cleft palate, cleft lip (CI in. Genet. (1998) 54, no. 1, 65-69, Genomics (1998) 50, no. 3. 299—305 , Genomics (1998) 54, no. 2, 231-
240、 Eur. J. Hum. Genet. (1994) 2, no. 3, 159-165)、 慢性リンパ性白血病 (Leukemia (1991) 5, no. 8, 719 - 722、 Oncogene (1992) 7, no. 5, 961-970)、 角化棘細胞腫 (Cancer Genet. Cytogenet. (1989) 39, no. 2, 227- 232)あるいは多発性先天性奇形 (Clin. Genet. (1998) 54, no. 1, 65-69, J. Med. Genet. (1994) 31, no. 1, 72- 73、 J. Med. Genet. (1993) 30， no. 7, 604— 606、 Ann. Genet. (1992) 35, no. 2, 117 - 120、 Clin. Genet.240, Eur.J.Hum.Genet. (1994) 2, no.3, 159-165), chronic lymphocytic leukemia (Leukemia (1991) 5, no.8, 719-722, Oncogene (1992) 7, no 5, 961-970), keratokeratoma (Cancer Genet. Cytogenet. (1989) 39, no. 2, 227-232) or multiple congenital malformations (Clin. Genet. (1998) 54, no. 1, 65-69, J. Med. Genet. (1994) 31, no. 1, 72-73, J. Med. Genet. (1993) 30, no. 7, 604—606, Ann. Genet. (1992) ) 35, no. 2, 117-120, Clin. Genet.
(1997) 52, no. 1, 6卜 62、 Hum. Genet. (1987) 75， no. 4, 333—338、 Am. J. Med. Genet. (1995) 57, no. 3, 403-409, J. Med. Genet. (1985) 22, no. 5, 401-405) などの原因遺伝 子が当該 2 p l 3の位置にマップされている。 一方セマフォリン Wは、 本発明者 らによりクローニングされた新規なセマフォリンであるが （国際公開第 98/1562S 号パンフレット） 、 該セマフォリン Wの染色体上の位置や遺伝疾患との関連など については、 何ら明らかにされていない。 (1997) 52, no. 1, 6 and 62, Hum. Genet. (1987) 75, no. 4, 333-338, Am. J. Med. Genet. (1995) 57, no. 3, 403-409 , J. Med. Genet. (1985) 22, no. 5, 401-405), etc., are mapped to the 2 pl 3 position. On the other hand, semaphorin W is a novel semaphorin cloned by the present inventors (WO 98 / 1562S pamphlet), but its location on the chromosome of semaphorin W and its association with genetic diseases and the like are not discussed. , Has not been revealed at all.
発明の開示 Disclosure of the invention
本発明は、 セマフォリン W遺伝子を用いた遺伝疾患の診断方法を提供すること を目的とする。 すなわち本発明は、 セマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析す ることによる遺伝疾患の診断方法又は個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺 伝子型の決定方法、 あるいは前記診断方法または決定方法においてセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析するために使用され得る D N Aまたは R N A、 さら にはセマフォリン W遺伝子を有効成分とする遺伝疾患の治療剤を提供することを 目的とする。 本発明者らはこれまでに、 新規な神経突起伸長抑制因子であるセマフォリン W を同定している （国際公開第 98/15628号パンフレット）。 このたび発明者らは、 ヒト及びマウスのセマフォリン W遺伝子の染色体上の位置をラジェーシヨンハイ ブリツド法を用いて正確に決定し、 既知の遺伝疾患、 突然変異との比較を行った。 その結果、 マウスにおいてはこのセマフォリン W遺伝子は、 未だその原因遺伝子 は未同定である mnd2 と呼ばれる遺伝疾患と同じ位置にマップされることを見い 出した。 更にセマフォリン Wの染色体遺伝子をクローニングし詳しく解析したと ころ、 mnd2と全く同じ位置にあると考えられているマイクロサテライトマ一力一 D6Mitl89及び D6Mit70が、 セマフォリン W遺伝子上に存在することも明らかとな つた。 従って、 mnd2の原因遺伝子はセマフォリン W遺伝子であること、 すなわち mnd2の発症の原因はセマフォリン W遺伝子の変異であると結論された。 An object of the present invention is to provide a method for diagnosing a genetic disease using a semaphorin W gene. That is, the present invention provides a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene, a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual, or the method for diagnosis or determination. An object of the present invention is to provide a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene, and a therapeutic agent for a genetic disease containing the semaphorin W gene as an active ingredient. The present inventors have identified a novel neurite outgrowth inhibitor, semaphorin W (WO 98/15628). The present inventors have now accurately determined the chromosomal location of the human and mouse semaphorin W gene using the radiation hybridization method, and compared them with known genetic diseases and mutations. As a result, they found that in mice, this semaphorin W gene maps to the same position as a genetic disease called mnd2, for which the causative gene has not yet been identified. Furthermore, cloning of the semaphorin W chromosomal gene and detailed analysis revealed that microsatellite macromolecules D6Mitl89 and D6Mit70, which are thought to be located at exactly the same position as mnd2, are present on the semaphorin W gene. And came. Therefore, it was concluded that the causative gene of mnd2 was the semaphorin W gene, that is, the cause of the onset of mnd2 was a mutation of the semaphorin W gene.
次にヒ トのセマフォリン W遺伝子を染色体上にマップした結果、 2番染色体の 短腕 2pl3に存在することが明らかになった。 当該 2番染色体短腕の 2P13は、 種々 の遺伝疾患、 すなわちパーキンソン病、 アルストレーム症候群、 肢帯型筋ジスト 口ブイ一 2 B型、 三好型遠位型筋ジストロフィー、 神経芽腫、 バ一キットリンパ fl重、 結腸腺癌、 甲状腺腫、 精神***病、 口蓋裂 Z***裂、 慢性リンノ 性白血病、 角化棘細胞腫、 さらには多発性先天性奇形といつた遺伝疾患の原因遺伝子がマッ プされている位置である。 この事実と、 前記の如くマウス 'セマフォリン w遺伝 子は mnd2と呼ばれる遺伝疾患の原因遺伝子と考えられ、 ヒトにおいても同様の遺 伝疾患の原因遺伝子であると考えられること等を考え合わせ、 ヒトにおいてもセ マフォリン W遺伝子は遺伝疾患の原因遺伝子であり、 具体的には、 前記の如き 2 番染色体短腕の 2 p 1 3にマップされる遺伝疾患の原因遺伝子であると結論され た。 Next, mapping of the human semaphorin W gene on the chromosome revealed that it was present on the short arm 2pl3 of chromosome 2. 2 P 13 of the 2 short arm of chromosome a variety of genetic diseases, i.e. Parkinson's disease, Alstrom syndrome, limb-girdle muscular resist opening buoy one 2 B-type, Miyoshi distal muscular dystrophy, neuroblastoma, bar one Kit lymphoid fl., Colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, cleft palate, cleft lip, chronic linno leukemia, keratocystoma, and multiple congenital malformations. It is the position where it is locked. Considering this fact and the fact that the mouse 'semaphorin w gene is considered to be a causative gene of a genetic disease called mnd2 as described above and also a causative gene of a similar genetic disease in humans, Also, it was concluded that the semaphorin W gene is a causative gene of a genetic disease, and specifically, is a causative gene of a genetic disease mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2 as described above.
なお、 多くの遺伝疾患の例で知られているように、 ある遺伝子において遺伝子 の変異の位置や変異の仕方が複数ある場合があり （Human Mutations (1995) 5, 1- 22) 、 それぞれの変異によって異なる症状、 異なる疾患が引き起こされる。 これ はすなわち、 一つの遺伝子が種々の遺伝疾患の原因遺伝子となっていることを意 味している。 従ってセマフォリン W遺伝子も、 種々の遺伝疾患の原因遺伝子とな つていることが考えられ得る。 以上のように、 本発明において初めて、 セマフォリン W遺伝子の染色体上の位 置が決定され、 前記の如き遺伝疾患の原因遺伝子であることが明らかとなり、 こ の知見により初めて、 これらの遺伝子疾患の診断 ·治療方法、 さらには遺伝疾患 モデル動物における飼育の効率ィ匕の方法の提供が可能となった。 As is known in many cases of genetic diseases, there are cases where there are multiple positions and ways of mutation in a gene (Human Mutations (1995) 5, 1-22). Different symptoms and different illnesses are caused. This means that one gene is a causative gene for various genetic diseases. Therefore, it can be considered that the semaphorin W gene is also a causative gene for various genetic diseases. As described above, the position of the semaphorin W gene on the chromosome is determined for the first time in the present invention, and it is clarified that the semaphorin W is a causative gene for the genetic disease as described above. It has become possible to provide methods for diagnosis and treatment, as well as a method for raising breeding efficiency in model animals with genetic diseases.
本発明は、 以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。  The present invention has been completed based on the above findings.
すなわち本発明は、  That is, the present invention
( 1 ) 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析することを特徵と する、 遺伝疾患の診断方法、  (1) a method for diagnosing a genetic disease, which comprises analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome;
(2) 遺伝疾患がヒ トの 2番染色体短腕の 2 p 13にマップされる疾患である、 前記 （1) 記載の診断方法、  (2) The diagnostic method according to (1), wherein the genetic disease is a disease mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2 of human.
(3) 遺伝疾患が、 パーキンソン病、 アルストレーム症候群、 肢帯型筋ジスト 口フィ一 2 B型、 三好型遠位型筋ジストロフィー、 神経芽腫、 バ一キットリンパ 腫、 結腸腺癌、 甲状腺腫、 精神***病、 口蓋裂/***裂、 慢性リンパ性白血病、 角化棘細胞腫又は多発性先天性奇形より選択される、 前記 (1) または （2) 記 載の診断方法、  (3) Genetic diseases include Parkinson's disease, Alstroem syndrome, limb-girdle muscular dystrophy, oral type 1B, Miyoshi-type distal muscular dystrophy, neuroblastoma, Baikit's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, The method of (1) or (2), wherein the method is selected from schizophrenia, cleft palate / cleft lip, chronic lymphocytic leukemia, keratocytoma or multiple congenital malformations;
(4) 遺伝疾患が、 パーキンソン病及び Z又はアルストレーム症候群である、 前記 （3) 記載の診断方法、  (4) The diagnostic method according to (3), wherein the genetic disease is Parkinson's disease and Z or Alstroem syndrome.
(5) 遺伝疾患が、 マウスの mn d 2に相当するヒ 卜の遺伝疾患である、 前記 (1) または （2) 記載の診断方法、  (5) The diagnostic method according to (1) or (2), wherein the genetic disease is a human genetic disease corresponding to mnd2 of a mouse.
(6) 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析することを特徴と する、 個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺伝子型の決定方法、  (6) a method for determining the genotype of a semaphorin W gene possessed by an individual, characterized by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene on the chromosome;
(7) 個体が mn d 2マウスである、 前記 （6) 記載の決定方法、  (7) The method according to (6), wherein the individual is an mn d2 mouse,
(8) セマフォリン W遺伝子の一部よりなる DNAまたは RNAであって、 力、 つ前記 （1) 〜 （5) いずれか記載の診断方法、 あるいは前記 （6) または  (8) A DNA or RNA comprising a part of the semaphorin W gene, wherein the diagnostic method according to any one of (1) to (5), or (6) or
(7) 記載の決定方法においてセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析するた めに使用され得る DNAまたは RNA、  (7) DNA or RNA that can be used to analyze the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene in the determination method described above,
(9) セマフォリン W遺伝子の少なくとも一部を有効成分として含有する、 遺 伝疾患の治療剤、 ならびに  (9) a therapeutic agent for a genetic disease, comprising at least a part of the semaphorin W gene as an active ingredient; and
(10) 遺伝疾患が前記 (2) 〜 （5) いずれ力、記載の遺伝疾患である、 前記 ( 9 ) 記載の治療剤、 に関する。 (10) the genetic disease described in any one of (2) to (5) above, (9) The therapeutic agent according to (9).
本発明において診断方法とは、 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無 を解析することによる、 遺伝疾患の診断方法である。 該診断方法は、 遺伝疾患を 発症する可能性をも診断するものである。  In the present invention, the diagnosis method is a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in a semaphorin W gene on a chromosome. The diagnostic method also diagnoses the possibility of developing a genetic disease.
ここで 「セマフォリン W遺伝子」 とは、 ヒ ト、 ラット、 マウス等、 哺乳動物の セマフォリン Wの全てのェキソン、 またその間に挟まれる全てのイントロン及び 転写調節領域、 転写終結部位などを含む、 セマフォリン w遺伝子の構造や発現制 御を司どる全ての領域を指す。  Here, the `` semaphorin W gene '' includes all exons of mammalian semaphorin W such as human, rat, mouse, etc., and all introns and transcription regulatory regions sandwiched therebetween, transcription termination site, etc. Semaphorin Refers to all regions that control the structure and expression control of the w gene.
本発明において初めて、 セマフォリン w遺伝子が遺伝疾患の原因遺伝子である ことが明らかにされたことは前述の通りであるが、 このように遺伝疾患の原因遺 伝子であることがひとたび明らかになれば、 該原因遺伝子のどこに変異が生じて いるかを同定することは当業者にとって容易なことである。 すなわち、 セマフォ リン w遺伝子において変異を有する部位の同定は、 病気の患者と健常人との遺伝 子配列を単純に比較することにより行うことができる。 その際、 何人もの健常人 と患者について全長の塩基配列を決定する方法もあるが、 転写調節領域や全ての ェクソン一イントロンを含むセマフォリン W遺伝子の全長は数万塩基をこえるの で、 何人もの全塩基配列を解析するのは時間を要する。 従って、 実際には以下に 示すような段階的な方法をとる方がより効率的である。 つまり、 まず前段階とし て、 一人の患者カゝ健常人のセマフォリン w遺伝子の塩基配列を決定する。 ここで セマフォリン W遺伝子全長のクローンを得るには、 ヒト染色体 DNAの YACライプラ リ一(米国リサーチ ·ジエネティックス社)や BACライブラリー（米国リサーチ ·ジ エネティックス社）に対し、 公知のヒ トセマフオリン W cDNA (国際公開第 98/156 28号パンフレツトに記載、 受託番号： FERM BP- 6089 (寄託機関：茨城県つくば市 東 1丁目 1番 3号、工業技術院生命工学工業技術研究所；寄託日 ：平成 9年 8月 29日）） をプローブにして常法によりスクリーニングを行えば良い。 また現在では、 適当 なプライマーさえ設定すれば、後は米国ゲノム ·システムズ社等に依頼すること により当該遺伝子を入手することができる。 具体的にセマフォリン W遺伝子の場 合はヽ 5 -agcatccctgactctcat-3 (酉己歹 U番号： 17)、 5' -tagggggaagccctgatt-3' (酉己 列番号： 18)、 5' -cagaaagcagttctgatt-3' (配列番号： 19)の 3つのプライマーを 設定し、配列番号： 17と配列番号： 18のプライマーを用いた PCRによる 547bpの バンドの出現、 および、 配列番号： 17と配列番号： 19のプライマーを用いた P C Rによる 523bpのバンドの出現を指標にしたスクリーニングを先の米国ゲノム · システムズ社等に依頼することにより、 セマフォリン Wの遺伝子を容易に入手す ることができる。 As described above, for the first time in the present invention, it has been revealed that the semaphorin w gene is a causative gene for a genetic disease, but it has once been revealed that it is a causative gene for a genetic disease. For example, it is easy for those skilled in the art to identify where the mutation occurs in the causative gene. That is, the site having a mutation in the semaphorin w gene can be identified by simply comparing the gene sequences of a diseased patient and a healthy person. At that time, there is a method to determine the full-length nucleotide sequence of many healthy people and patients.However, the total length of the semaphorin W gene, including the transcription regulatory region and all exon-introns, exceeds tens of thousands of nucleotides. It takes time to analyze the entire base sequence. Therefore, it is actually more efficient to use the stepwise method as shown below. That is, as a first step, the nucleotide sequence of the semaphorin w gene of one healthy patient is determined. Here, in order to obtain a full-length clone of the semaphorin W gene, a known human semaphorin W cDNA can be obtained from a human chromosomal DNA such as the YAC library (Research Genetics, USA) or the BAC library (Research Genetics, USA). (Described in International Publication No. WO 98/156 No. 28, Pan fret, Accession number: FERM BP-6089 (Depositary institution: 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute; Deposit Date: Heisei (August 29, 9) Screening may be performed by a conventional method using as a probe. At present, the gene can be obtained by requesting Genome Systems, Inc. in the United States after setting appropriate primers. Specifically, in the case of the semaphorin W gene, ヽ 5 -agcatccctgactctcat-3 (Torumi system U number: 17), 5 '-tagggggaagccctgatt-3' (Toromi column number: 18), 5 '-cagaaagcagttctgatt-3' 3 primers (SEQ ID NO: 19) were set and 547 bp by PCR using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18. Semaphorin W was obtained by requesting Genome Systems, Inc., etc., to conduct screening using the appearance of a band and the appearance of a 523 bp band by PCR using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 as an index. Gene can be easily obtained.
次に、 この決定された塩基配列の情報を基にして、 何人かの患者や健常人につ いて、 およそ 500- 2000塩基の短い配列ごとに遺伝子を PCRで増幅し、 個々の断片 について、例えば以下に詳述する遺伝子診断方法の一種である RFLP法、 PCR法、 SSCP法、 あるいは変異塩基対の酵素的切断法などによつて患者と健常人との遺伝 子に違いがないかを解析し、 違いが見つかった領域について、 第三段階として、 その全塩基配列を決定すればよい。 これによつてどのような変異であるかを厳密 かつ容易に決定できる。 この様な方法は一般に広く知られており、 成書  Next, based on the information of the determined base sequence, the gene is amplified by PCR for some sequences of about 500 to 2000 bases in some patients and healthy people, and for each fragment, for example, We analyzed whether there is a difference between the gene of a patient and a healthy person by the RFLP method, the PCR method, the SSCP method, or the enzymatic cleavage method of a mutant base pair, which is one of the genetic diagnosis methods described in detail below. As a third step, the entire nucleotide sequence of the region where the difference was found may be determined. This makes it possible to determine exactly what kind of mutation is strictly and easily. Such methods are generally well known and
(Current Protocols in Human Genetics (1998) , Edt. Boyie et al. John wiley & Sons, Inc. ) にも詳しく述べられている。  (Current Protocols in Human Genetics (1998), Edt. Boyie et al. John wiley & Sons, Inc.).
以上のようにしてセマフォリン W遺伝子における変異部位が同定されれば、 こ の変異部位の検出、 すなわちセマフォリン Wを原因遺伝子とする遺伝疾患の診断 は、 以下のようにして行うことができる。 すなわち、 常法によって被験者の組織 の一部や血液などから取り出した染色体 DNAを被験サンプルとし、 例えば RFLP法 If a mutation site in the semaphorin W gene is identified as described above, detection of this mutation site, that is, diagnosis of a genetic disease having semaphorin W as a causative gene, can be performed as follows. That is, chromosomal DNA extracted from a part of a subject's tissue, blood, etc. by a standard method is used as a test sample.
(J. Clinical Investigation (1985) 76, 1283-1285) 、 PCR法 (PCR 2: A (J. Clinical Investigation (1985) 76, 1283-1285), PCR (PCR 2: A
Practical Approach (eds. M. J. McPherson, et. al. ) 1995, IRL Oxford) 、 SSCP法 (PNAS (1989) 86, 2766-2770)、 直接シ一ケンス法（Science (1988) 239, 487-491、Practical Approach (eds. M.J.McPherson, et.al.) 1995, IRL Oxford), SSCP method (PNAS (1989) 86, 2766-2770), direct sequence method (Science (1988) 239, 487-491,
Nature (1987) 330, 384-386)、 変異塩基対の化学的切断法 （PNAS (1988) 85, 4397 - 4401) 、 DGGE法 (Methods in Enzymology (1987) 155, 501-527) , 変異塩基対の酵素 的切断法 (In Genomic Analysis : A Practical Approach (ed. K. Davies) 95- 139, IRL Oxford) 、 あるいはハイプリダイゼーシヨン法 （Br. J. Haematology (1990) 75, 73-77) などの公知の種々の方法を用いて診断を行うことができる。 具 体的には、 実施例 6に記載の方法が挙げられる。 Nature (1987) 330, 384-386), Chemical cleavage of mutant base pairs (PNAS (1988) 85, 4397-4401), DGGE method (Methods in Enzymology (1987) 155, 501-527), Mutant base pairs Genomic Analysis: A Practical Approach (ed. K. Davies) 95-139, IRL Oxford) or the Hybridization Method (Br. J. Haematology (1990) 75, 73-77) The diagnosis can be performed using various known methods. Specifically, the method described in Example 6 can be used.
このような診断において用いる変異検出用の試薬は、 例えばセマフォリン W遺 伝子の配列の一部を有する D N Aまたは R N Aであって、 かつセマフォリン Wit 伝子の変異の有無が解析できるような D NAまたは R N Aであれば如何なるもの であっても良く、 当業者の裁量で適宜選択される。 該 D NAは、 PCRプライマー あるいはハイブリダィゼーシヨン用のプローブとして、 また該 R NAはハイブリ ダイゼーシヨン用のプローブとして、 それぞれ用いることができる （該 D NA、 R N Aについては後述する） 。 The reagent for mutation detection used in such diagnosis is, for example, a DNA or RNA having a part of the sequence of the semaphorin W gene and a DNA or RNA that can be analyzed for the presence or absence of a mutation in the semaphorin Wit gene. Any NA or RNA May be selected as appropriate at the discretion of those skilled in the art. The DNA can be used as a PCR primer or a probe for hybridization, and the RNA can be used as a probe for hybridization (the DNA and RNA will be described later).
ここで、 セマフォリン W遺伝子の変異を解析することにより診断される 「遺伝 疾患」 とは、 すなわちセマフォリン W遺伝子 （セマフォリン W遺伝子上に位置す る遺伝子） を原因遺伝子とするような疾患を指す。 すなわち、 ヒ トにおいては 2 番染色体短腕の 2 p 1 3にマップされる遺伝疾患を指し、 具体的には神経系、 筋 肉または免疫系に異常をきたす遺伝疾患などが挙げられる。 より具体的には、 パ —キンソン病、 アルストレーム症候群、 肢帯型筋ジストロフィー 2 B型、 三好型 遠位型筋ジストロフィー、 神経芽腫、 バーキットリンパ腫、 結腸腺癌、 甲状腺腫、 精神***病、 口蓋裂 Z***裂、 慢性リンノ、。性白血病、 角化棘細胞腫、 又は多発性 先天性奇形といった、 2番染色体短腕の 2 p 1 3にマップされる疾患から選択さ れる。 このうち、 より詳細にマッピングされているとう観点から、 パーキンソン 病及ぴ 又はアルストレーム症候群が好ましい。 また別の観点からは、 マウスの mnd2に相当するヒ トの遺伝疾患が挙げられる。 さらに、 その他の神経、 筋肉また は免疫系に異常をきたす疾患であって、 力つその原因遺伝子がセマフォリン W遺 伝子と同じ位置にマップされるような疾患が挙げられる。 またマウスの場合は mnd2が挙げられ、 さらに神経、 筋肉または免疫系に異常をきたす疾患であって、 かつその原因遺伝子がセマフォリン W遺伝子と同じ位置にマップされるような疾 患も挙げられる。  Here, a “genetic disease” diagnosed by analyzing a mutation in the semaphorin W gene refers to a disease in which the semaphorin W gene (a gene located on the semaphorin W gene) is the causative gene. Point. That is, in humans, it refers to a genetic disease that is mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2, and specifically includes a genetic disease that causes abnormalities in the nervous system, muscle, or immune system. More specifically, Parkinson's disease, Alstroem syndrome, limb girdle muscular dystrophy type 2B, Miyoshi type distal muscular dystrophy, neuroblastoma, Burkitt's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, palate Cleft Z cleft lip, chronic Rinno ,. It is selected from diseases that map to 2p13 on the short arm of chromosome 2, such as leukemia, keratokeratomas, or multiple congenital malformations. Among them, Parkinson's disease and Alstroem syndrome are preferable from the viewpoint of mapping in more detail. From another viewpoint, a human genetic disease corresponding to mnd2 in mice can be mentioned. In addition, other disorders that cause abnormalities in the nerves, muscles, or immune system, such as those in which the culprit gene is mapped to the same location as the semaphorin W gene. In the case of mice, mnd2 can be mentioned, and furthermore, diseases that cause abnormalities in nerves, muscles or the immune system, and in which the causative gene is mapped to the same position as the semaphorin W gene.
本発明の診断方法においては、 以上の如き遺伝疾患の発症のみならず、 該遺伝 疾患の将来の発症の可能性をも診断することができる。  In the diagnostic method of the present invention, it is possible to diagnose not only the onset of the genetic disease as described above but also the possibility of the future onset of the genetic disease.
なお、 多くの遺伝疾患の例で知られているように、 ある遺伝子において遺伝子 の変異の位置や変異の仕方が複数ある場合があり （Human Mutations (1995) 5, 1- 22) 、 それぞれの変異によって異なる症状、 異なる疾患が引き起こされる。 これ はすなわち、 一つの遺伝子が種々の遺伝疾患の原因遺伝子となっていることを意 味している。 従ってセマフォリン W遺伝子も、 種々の遺伝疾患の原因遺伝子とな つている可能性がある。 このような、 セマフォリン Wを原因遺伝子とする疾患、 すなわちセマフォリン W遺伝子と同じ位置にその原因遺伝子がマップされるよう な疾患であれば、 前記の如きセマフォリン W遺伝子における変異の同定方法およ び変異の検出方法に基づき、 診断を行うことができる。 As is known in many cases of genetic diseases, there are cases where there are multiple positions and ways of mutation in a gene (Human Mutations (1995) 5, 1-22). Different symptoms and different illnesses are caused. This means that one gene is a causative gene for various genetic diseases. Therefore, the semaphorin W gene may also be a causative gene for various genetic diseases. Such diseases that cause semaphorin W as a causative gene, That is, for a disease in which the causative gene is mapped at the same position as the semaphorin W gene, diagnosis can be performed based on the method for identifying a mutation in the semaphorin W gene and the method for detecting the mutation as described above. it can.
本発明においてはさらに、 セマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析すること による、 個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺伝子型を決定する方法をも提 供する。 ここで 「セマフォリン W遺伝子の遺伝子型」 とはすなわち、 セマフォリ ン wの遺伝子変異を対立遺伝子の双方に有しているホモ接合体 （-/-) 、 片方に 有しているへテロ接合体 （+/-) 、 および双方共に有していない野性型 （+/+) の The present invention further provides a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene. Here, the term “semaphorin W gene genotype” means a homozygote (-/-) that has a semaphorin w gene mutation in both alleles and a heterozygote that has a semaphorin w gene mutation in one of the alleles. (+/-) and wild-type (+ / +)
V、ずれかの遺伝子型を指す。 V, refers to any genotype.
一般に、 病気の研究や医薬品の開発などにおいて遺伝子変異を持つモデル動物 を利用することは広く行われている。 し力、し、 一つの大きな問題として、 突然変 異体のホモ接合体は継代飼育が困難な場合が多く、 通常へテロ接合体で継代し、 実験にはその中からホモ接合体を選びだして使用すると言う方法が取られる。 し かしながら、 幼若個体においてホモ接合体の選抜は困難なことが多く、 これがこ の種の変異動物を用いた研究の大きな妨げになっている。 もし突然変異の原因遺 伝子が明らかになれば、 その遺伝子を PCR等の既知の方法によって解析すること で遺伝子型を容易に検出でき、 飼育の大幅な効率化がはかれる。 本発明によりセ マフオリン Wが mnd2の原因遺伝子であることが明らかになったことから、 mnd2マ ウスの遺伝子型の決定はセマフォリン W遺伝子の解析により容易に行うことがで き、 従ってホモ接合体の選抜を迅速に効率良く行うことができる。  Generally, the use of model animals with genetic mutations is widely used in disease research and drug development. One major problem is that often homozygous mutants are difficult to subculture, so they are usually passaged by heterozygotes, and homozygotes are selected from them for experiments. Then the method of using it is taken. However, it is often difficult to select homozygotes in young individuals, which greatly hinders research using such mutant animals. If the causative gene of the mutation is found, the genotype can be easily detected by analyzing the gene by a known method such as PCR, and the efficiency of breeding can be greatly improved. Since the present invention revealed that semaphorin W was the causative gene of mnd2, the genotype of mnd2 mouse could be easily determined by analyzing the semaphorin W gene, Can be quickly and efficiently selected.
さらにヒトに対しても、 このようなセマフォリン Wの遺伝子型の決定を行うこ とにより、 将来の遺伝疾患の発症の可能性を知ることができ、 子供ができた際に は、 生まれてくる子供が疾患を持つ可能性があるかどうかを予め知ることも可能 となる。 本発明の決定方法においては、 このような発症の可能性をも知ることが できる。  Furthermore, by determining the genotype of semaphorin W in humans, it is possible to know the possibility of developing a genetic disease in the future and to be born when a child is born It will also be possible to know beforehand whether a child may have a disease. In the determination method of the present invention, the possibility of such onset can also be known.
具体的な遺伝子型の決定方法は、 前記の診断方法と同様にして行うことができ る。 なお、 セマフォリン W遺伝子の変異動物としては、 mnd2マウスのみならず、 先に述べたように神経、 筋肉または免疫系に異常をきたす疾患であって、 その原 因遺伝子がセマフォリン W遺伝子と同じ位置にマップされるような疾患を有する 変異動物が挙げられる。 A specific method for determining the genotype can be performed in the same manner as the above-described diagnostic method. In addition, the semaphorin W gene mutant animals include not only mnd2 mice, but also diseases that cause abnormalities in the nerves, muscles, or immune system as described above, and have the same causative gene as the semaphorin W gene. Have a disease that maps to a location Mutant animals are included.
本発明においてはまた、 前記の如き診断方法や遺伝子型の決定方法において、 セマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析するために使用され得る D NAまたは R N Aをも提供するものである。 前述の如く、 セマフォリン W遺伝子における変 異部位がひとたび同定されれば、 後は常法により、 当該変異を検出する D NAま たは R N Aを容易に選定することができる。  The present invention also provides a DNA or RNA that can be used for analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene in the above-described diagnostic methods and genotype determination methods. As described above, once a mutation site in the semaphorin W gene is identified, DNA or RNA for detecting the mutation can be easily selected by a conventional method.
具体的には、 セマフォリン W遺伝子の一部よりなる D NAであって、 力っセマ フォリン W遺伝子の変異が解析できるような D N Aが挙げられ、 P C Rに基づく 診断方法においてはプライマーとして、 またハイブリダィゼーシヨンに基づく診 断方法においてはプローブとして使用することができる。 またセマフォリン Wit 伝子の一部よりなる D N Aに対応する R NAも使用可能であり、 該 R N Aはハイ ブリダィゼーション用のプローブとして用いることができる。 ここでセマフォリ ン W遺伝子は、 例えばヒ トの場合、 ヒ ト染色体 D NAの YACライブラリ一 （米国 リサーチ .ジェネティックス社） あるいは BACライブラリ一 （米国リサーチ .ジ エネティックス社） に対し、 ヒ トセマフォリン Wの cDNA (国際公開第 98/15628号 パンフレツ卜に記載、 受託番号： FE M BP-6089) をプローブにして常法によりス クリーニングを行うことで、 クローニングすることができる。 また前記したよう に、 配列番号： 17〜配列番号： 19のような適当なプライマーさえ設定すれば、 後 は米国ゲノム ·システムズ社等に依頼することにより、 当該セマフォリン W遺伝 子を容易に入手することができる。  Specific examples include DNA that is a part of the semaphorin W gene and that is capable of analyzing the mutation of the semaphorin W gene. It can be used as a probe in a diagnosis method based on a dimension. Also, an RNA corresponding to a DNA consisting of a part of the semaphorin Wit gene can be used, and the RNA can be used as a probe for hybridization. Here, the semaphorin W gene is, for example, in the case of human, the human semaphorin W is compared to the human chromosome DNA YAC library 1 (Research Genetics, USA) or BAC library 1 (Research The Genetics, USA). Cloning can be performed by screening using cDNA (described in WO 98/15628 pamphlet, accession number: FEM BP-6089) as a probe by a conventional method. Further, as described above, if appropriate primers such as SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 19 are set, the semaphorin W gene can be easily obtained by requesting Genome Systems, Inc. can do.
またセマフォリン Wの cDNAも、 セマフォリン W遺伝子の一部よりなる D NAで あるため、 該 cD N Aの一部を本発明の変異解析用の D N Aとして使用すること ができる。 cDNA (ヒトおよびラット） については国際公開第 98/15628号パンフレ ットにその塩基配列が記載されており、 ヒトについては受託番号： FERM BP - 6089 として寄託がなされている。 またマウスについては本明細書の配列表にその塩基 配列が記載されている。 従って該塩基配列に基づきセマフォリン Wの cDNAを容易 に入手することができる。 このようにしてクローニングされた染色体 D N Aまた は cDNAの配列情報を利用して、 例えば DNA合成などの常法により、 本発明の変異 解析用の D N Aを適宜調製することができる。 これらの DN Aが、 セマフォリン W遺伝子の変異を解析できる DN Aであるか 否かは、 前記した変異を有する部位の同定方法 （Current Protocols in Human Genetics (1998) Edt. Boyle et al. John Wiley & Sons, Inc. ) および変異部位の 検出方法により決定することができる。 Further, since the cDNA of semaphorin W is also a DNA consisting of a part of the semaphorin W gene, a part of the cDNA can be used as the DNA for mutation analysis of the present invention. The nucleotide sequence of cDNA (human and rat) is described in WO 98/15628 pamphlet, and the human is deposited under accession number: FERM BP-6089. For the mouse, its nucleotide sequence is described in the sequence listing of this specification. Therefore, cDNA of semaphorin W can be easily obtained based on the nucleotide sequence. Using the sequence information of the chromosomal DNA or cDNA cloned in this way, the DNA for mutation analysis of the present invention can be appropriately prepared by a conventional method such as DNA synthesis. Whether or not these DNAs are DNAs that can analyze mutations in the semaphorin W gene can be determined by the method for identifying a site having the mutation described above (Current Protocols in Human Genetics (1998) Edt. Boyle et al. John Wiley & Sons, Inc.) and the method of detecting the mutation site.
本発明の変異解析用の DN Aの具体例としては、 例えば以下のものが挙げられ る。  Specific examples of the DNA for mutation analysis of the present invention include the following.
すなわち遺伝疾患において、 CXGZGXCという 3塩基の繰り返し配列の数 の変化が、 その遺伝疾患の原因となっている例が多く知られているが  That is, in genetic diseases, there are many known cases in which a change in the number of three-base repeating sequences called CXGZGXC causes the genetic disease.
(Ann. Rev. Neurosci. (1997) 19, 79— 107) 、 マウス、 ラットおよびヒ トのセマフォ リン Wの塩基配列を比較すると、 マウスの塩基配列に存在する 6個の CTGが、 ラットでは 5個、 ヒ トでは 3個となっており、 進化の過程でこの CTGの数が変わ つたことが明らかとなった。 これはすなわち、 当該 CTGの繰り返し部分はその 数が変化し易い箇所であることを意味している。 従って、 セマフォリン Wにおけ るこの C T Gの数の変化、 あるいは該 CTGによりコードされるァミノ酸配列上 のロイシンの数の変化が、 遺伝疾患の原因となっているとも考えられる。 よって 本発明の変異解析用の DN Aの具体例として、 当該 CTGまたはロイシンの数の 変異を検出できるような DNAプローブあるいはプライマー等が挙げられる。 具 体的には、 マウスにおいては、 5' ~CCTCCGGTCTCTCTCTTC-3' (配列番号： 3)、 5' - CGAGGTTCTGGGCACCGA-3' (配列番号： 4 ) などが挙げられ、 ヒ トにおいては 5'- CCTACAGCCTCGCCCTTC-3' (配列番号： 5 ) 、 5' -CGAGGTTCTGGGCACCGA-3' (配列番 号： 6) などが挙げられる。 このプライマ一を用いて、 例えば後述の実施例に記 載された条件で PCRを行うことによって、 当該 CTGまたはロイシンの数の変 異を検出することができる。  (Ann. Rev. Neurosci. (1997) 19, 79–107), and comparing the nucleotide sequences of mouse, rat and human semaphorin W, the six CTGs present in the mouse In humans and humans, the number was 3, indicating that the number of CTGs changed during evolution. This means that the repeated portion of the CTG is a place where the number is likely to change. Therefore, it is considered that the change in the number of CTG in semaphorin W or the change in the number of leucine in the amino acid sequence encoded by the CTG may cause a genetic disease. Accordingly, specific examples of the DNA for mutation analysis of the present invention include a DNA probe or primer capable of detecting the mutation of the number of the CTG or leucine. Specific examples include 5 'to CCTCCGGTCTCTCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 3) and 5'-CGAGGTTCTGGGCACCGA-3 '(SEQ ID NO: 4) in mice, and 5'-CCTACAGCCTCGCCCTTC in humans. -3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-CGAGGTTCTGGGCACCGA-3' (SEQ ID NO: 6) and the like. Using this primer, for example, by performing PCR under the conditions described in Examples described later, the change in the number of the CTG or leucine can be detected.
また、 後述の実施例で用いられた各種プライマーも、 具体例として考えられる。 本発明においてはさらに、 セマフォリン W遺伝子の少なくとも一部を有効成分 として含有する、 遺伝疾患の治療剤をも提供するものである。 すなわち、 セマフ ォリン W遺伝子は遺伝疾患の原因遺伝子であるため、 当該遺伝疾患を治療するた めに使用することができる。  Various primers used in the examples described later are also considered as specific examples. The present invention further provides a therapeutic agent for a genetic disease, which comprises at least a part of the semaphorin W gene as an active ingredient. That is, since the semaphorin W gene is a causative gene of a genetic disease, it can be used for treating the genetic disease.
セマフォリン Wの cDNAの塩基配列は既に報告されており （国際公開第 98/15628 号パンフレツトに記載、 受託番号： FERM BP-6089) 、 また先に記載したように染 色体 D N Aも容易に入手できるため、 これらの D N Aを遺伝子治療に用いること が可能である。 また、 遺伝子治療の目的で遺伝子を導入する方法も良く知られて いる (日経サイエンス 1994年 4月号、 20-45頁、月刊薬事 36 (1)、 23-48 (1994)、 実 験医学増刊 12 (15)、 1994) 。 The nucleotide sequence of the cDNA for semaphorin W has already been reported (WO 98/15628). No. Ref. No. FERM BP-6089), and as described above, chromosomal DNA can be easily obtained, so that these DNAs can be used for gene therapy. It is also well known how to introduce genes for the purpose of gene therapy (Nikkei Science April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs 36 (1), 23-48 (1994), extra edition of experimental medicine) 12 (15), 1994).
実際に D NAを投与し細胞内に導入する方法としては、 ウィルスベクターによ る方法およびその他の方法のレ、ずれの方法も適用することができる。  As a method of actually administering DNA and introducing it into cells, a method using a viral vector and other methods can be applied.
ウィルスベクターによる方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノウィル ス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスゥ ィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の D NAウィルス又は R NAウイ ルスに本発明の D NAを組み込んで導入する方法が挙げられる。 この中で、 レト ロウィルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルス等を用 いた方法が特に好ましい。  As a method using a viral vector, for example, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, a simbis virus, or the like, may be used as the DNA virus or the RNA virus of the present invention. There is a method of incorporating and introducing DNA. Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a vaccinia virus and the like is particularly preferable.
その他の方法としては、 発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 （D N A ワクチン法） 、 リポソ一ム法、 リポフエクチン法、 マイクロインジェクション法、 リン酸力/レシゥム法、 エレク ト口ポレーシヨン法等が挙げられ、 特に D NAワク チン法、 リボソーム法が好ましい。  Other methods include direct injection of the expression plasmid into the muscle (DNA vaccine method), liposomal method, lipofectin method, microinjection method, phosphoric acid / residue method, and electoral poration method. Particularly, the DNA vaccine method and the ribosome method are preferred.
本発明の D N Aを実際に医薬として作用させるには、 D N Aを直接体内に導入 する in vivo法、 およぴヒトからある種の細胞を採集し体外で D N Aを該細胞 に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある （日経サイエンス， 1994年 4月 号， 20- 45頁、 月刊薬事， 36 (1) , 23-48 (1994)、 実験医学増刊， 12 (15) , (1994)、 およびこれらの引用文献等） 。 in vivo法がより好ましい。  In order for the DNA of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the DNA is directly introduced into the body, or a method in which certain cells are collected from a human, and the DNA is introduced into the cells outside the body, and the cells are transferred into the body There is an ex vivo method (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15), (1994), And their references). In vivo methods are more preferred.
in vivo法により投与する場合は、 治療目的の疾患、 症状等に応じた適当な 投与経路により投与され得る。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等に投 与することができる。 in vivo法により投与する場合は、 例えば、 液剤等の製 剤形態をとりうるが、 一般的には有効成分である本発明の D N Aを含有する注射 剤等とされ、 必要に応じて、 慣用の担体を加えてもよい。 また、 本発明の D NA を含有するリポソ—ムまたは膜融合リボソーム （センダイウィルス （HV J ) ― リボソーム等） においては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリポソ一 ム製剤の形態とすることができる。 When administered by the in vivo method, it can be administered by an appropriate route depending on the disease, symptom, and the like for the treatment. For example, it can be administered to a vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and the like. When administered by the in vivo method, for example, it may be in the form of a liquid preparation or the like, but it is generally prepared as an injection containing the DNA of the present invention as an active ingredient. A carrier may be added. In addition, in the liposome or membrane-fused ribosome (such as Sendai virus (HVJ) -ribosome) containing DNA of the present invention, liposomes such as a suspending agent, a cryogen, and a centrifugal concentrated cryogen are used. In the form of a pharmaceutical preparation.
製剤中の本発明の D N Aの含量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等によ り適宜調整することができるが、 通常、 0. 0001mg〜100mg、 好ましくは 0. 001mg〜 10mgの本発明の D N Aを、 数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。  The content of the DNA of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, etc., and usually 0.000001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg of the present invention. Preferably, the DNA of the invention is administered once every few days to several months.
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 セマフォリン W遺伝子の存在するマウスの 6番染色体のフレームヮ一 クマップとセマフォリン W遺伝子 （S e m a w) の位置を示す。  FIG. 1 shows the frame map of chromosome 6 of the mouse in which the semaphorin W gene is present and the position of the semaphorin W gene (Semaw).
発明を実施するための最良の形旗 Best shape flag for carrying out the invention
一般的な分子生物学的操作については成書 （Maniatisら編集 Molecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Press, 1989年、 あるいは Ansubelらに よって編纂された Current Protocols in Molecular Biology, 1987年、 John Wiley&Sons, 及び、 東京大学医化学研究所制癌研究部編纂の細胞学実験プロトコ ール、 1991年、 など） に詳しく述べられている。 また、 ラジェ一シヨンハイブリ ッド法の原理およびそれを利用したフレームワークマップの作製、 目的遺伝子の マッピングの実際の方法は公知の文献 （リーチ達による Genetics 1995年、 33卷、 63- 99頁、 または、 ベントリ一達による Current opinion in Genetics and Development 1995年、 5卷 3号、 328- 334頁、 など） に述べられている。 なお、 本 発明は以下に述べる方法に限定されることなく、 本発明の分野での通常の範囲の 変更ができることはいうまでもな！/、。  General molecular biology procedures are described in a compilation (Maniatis et al., Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Press, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, compiled by Ansubel et al., 1987, John Wiley & Sons, And the cytology experiment protocol compiled by the Cancer Research Division of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 1991, etc.). In addition, the principle of the radiation hybrid method, the preparation of a framework map using the method, and the actual method of mapping the target gene are described in the known literature (Leach et al., Genetics 1995, 33, 63-99, Or, the current opinion in Ventry et al., 1995, Vol. 3, No. 3, pp. 328-334). It is needless to say that the present invention is not limited to the method described below, and can be changed in a normal range in the field of the present invention! / ,.
実施例 1 Example 1
マウスセマフォリン W遺伝子のクローニング Cloning of mouse semaphorin W gene
セマフォリン W遺伝子を含むマウスのゲノム DNAクローンを得るために、 1)米国 ゲノムシステム社の C57BL/6 BACゲノムライブラリーの、 ラットセマフオリン W cDNA (国際公開第 98/15628号パンフレッ トの配列番号： 1あるいは配列番号： 2 に記載） をプローブにしたスクリーニング、 及び、 2 ) 129/SVJ BACゲノムライ プラリーの PCRスクリーユングサービスを利用したマウスゲノム DNAライブラリ一 のスクリーニングを行った。 なお 2)のスクリーニングは、 セマフォリン W遺伝子 の cDNA配列の一部の配列からなる 2つのプライマー、 5' -AGGCTGACTCCTATCTCA-3' (配列番号： 7 ) 、 および 5， - MGATGCTATCCCGTGCA-3' (配列番号： 8 ) を用いて 94°C- 20 sec, 60°C- 30sec， 72。C- 40secを 35回くり返す条件で行った。 In order to obtain a mouse genomic DNA clone containing the semaphorin W gene, 1) rat semaphorin W cDNA of the C57BL / 6 BAC genomic library of the U.S. Genome System Co., Ltd. No. 1 or SEQ ID NO: 2) was used as a probe, and 2) a mouse genomic DNA library was screened using the PCR screening service of the 129 / SVJ BAC genomic library. In the screening of 2), two primers consisting of a part of the cDNA sequence of the semaphorin W gene, 5′-AGGCTGACTCCTATCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 7), and 5, −MGATGCTATCCCGTGCA-3 ′ (SEQ ID NO: : 8) 94 ° C-20 sec, 60 ° C-30 sec, 72. C-40sec was repeated 35 times.
スクリーニングの結果、 前記 1)のスクリーニングからは 3クローンが、 また前 記 2)のスクリーニングからは 1クローンが単離された。  As a result of the screening, 3 clones were isolated from the above 1) screening, and 1 clone was isolated from the above 2) screening.
これらクローンの有する DNAの塩基配列の決定は、 パ一キンエルマ一ネ ±ϋの 377 型 DNAシーケンサ一を用いて行った。 なお、 反応にはプリズムダイターミネーシ ヨンキット （パーキンエルマ一社製） を用いた。 塩基配列の解析結果から、 これ らのクローンが間違いなくセマフォリン W遺伝子を含むことを確認した。  The nucleotide sequences of the DNAs of these clones were determined using a Perkin-Elmera ± ϋ type 377 DNA sequencer. The reaction was performed using a prism dye termination kit (PerkinElmer). From the nucleotide sequence analysis results, it was confirmed that these clones definitely contained the semaphorin W gene.
実施例 2 Example 2
マゥス型セマフォリン W遺伝子のマッビング Mouse-type semaphorin W gene mapping
以下の実施例 4に示すように、 ヒトのセマフォリン W遺伝子は、 染色体上 2 ρ13の位置にマップされる。 コンサーブドシンテニ一の原理 （DeBryら、  As shown in Example 4 below, the human semaphorin W gene maps to a position on the chromosome at 2 ρ13. The principle of conserved synteny (DeBry et al.
Genomics (1996) 33, 337-351) に基づいてヒトとマウスとの染色体の比較を行うと、 上記のヒ トのセマフォリン W遺伝子を含む領域は、 マウスでは 6番染色体上に存 在する。 更に詳しいセマフォリン W遺伝子の位置を、 以下のようにして決定した。 マウスの場合はマッピングに必要なマーカ一配列のフレームワークが未だ作製 されていないため、 まず次のようにして、 6番染色体上のこの領域のフレームヮ —クを作製した。 マップペアーズマイクロサテライトマーカ一 （米国リサーチ' ジエネティックス社） に含まれる種々のプライマーを用いて T31ラジェ一ション ハイブリッドパネル （米国リサーチ ·ジエネティックス社） を铸型にして PCRを 行い、 その結果をコンピュータ一プログラム、 マップ'マネージャー QT (Manly,Based on Genomics (1996) 33, 337-351), comparing the chromosomes of humans and mice, the region containing the human semaphorin W gene is located on chromosome 6 in mice. Further detailed location of the semaphorin W gene was determined as follows. In the case of mouse, since a framework for a marker sequence required for mapping has not yet been prepared, a frame of this region on chromosome 6 was prepared as follows. Using the various primers contained in Map Pairs Microsatellite Marker-1 (US Research's Genetics) to perform PCR on a T31 radiation hybrid panel (U.S.A. Research Genetics) and performing PCR on the results The Map 'Manager QT (Manly,
Cudmore Jr. , Abstructs of the 11th Mouse Genome Conference, St. Cudmore Jr., Abstructs of the 11th Mouse Genome Conference, St.
Petersburg, FL. (1997) ) を用いて解析した。 こうして得られたマイクロサテラ ィトマ一力一の相互の位置を詳しく比較することで、 フレームワークマップが得 られた （図 1 ) 。 続いてマウス型セマフォリン W遺伝子のマッピングを行うため に 2個のプライマ一 mWl (5， - CTGACTGGGTCGTGTGCTAA-3' ) (配列番号： 9 ) と rW4Petersburg, FL. (1997)). By comparing the mutual positions of the microsatellite forces obtained in this way in detail, a framework map was obtained (Fig. 1). Subsequently, two primers, mWl (5, -CTGACTGGGTCGTGTGCTAA-3 ') (SEQ ID NO: 9) and rW4, were used to map the mouse semaphorin W gene.
(5' -ACCGACGTAAAGTGTGTG-3' ) (配列番号： 1 0 ) を作製し、 これらを用いて以 下の条件で T31ラジェーシヨンハイブリッドパネルの DNAを铸型にして PCRを行い、 結果をコンピュータープログラム、 マップ ·マネ一ジャー QTを用いて解析した。 その結果、 マウス型セマフォリン W遺伝子は、 2つのマイクロサテライトマーカ 一 D6Mit71と D6Mit9との間に位置し、 D6Mit71より 122. 4cR、 D6Mit9より 59. 9cRの 位置に存在することが明らかになった。 更に詳しくこの遺伝子の位置を決定する ために、 先に決定されたセマフォリン W遺伝子の位置の近傍に存在していること Mouse-Genome Database http : //www. informatics, jax. org/により知られてい る 6個のマイクロサテライトマ一力一、 すなわち D6Mit4、 D6M 6、 D6Mit70、(5'-ACCGACGTAAAGTGTGTG-3 ') (SEQ ID NO: 10) was prepared, and PCR was carried out using these under the following conditions using the DNA of the T31 projection hybrid panel as type III, and the results were subjected to a computer program. , Map Manager Analyzed using QT. As a result, the mouse semaphorin W gene has two microsatellite markers. It was found to be located between D6Mit71 and D6Mit9, at 122.4cR from D6Mit71 and 59.9cR from D6Mit9. To determine the location of this gene in more detail, it is known from the Mouse-Genome Database http: // www. Informatics, jax.org/ that it is located near the location of the semaphorin W gene previously determined. There are six microsatellite cameras, namely D6Mit4, D6M6, D6Mit70,
D6Mit99、 D6Mitl89、 D6M 189の各々について、 実施例 1で得られた 4つのマ ウス型セマフォリン Wの染色体 DNAクローン上に存在しているかどうかを PCRを用 いて調べた。 その結果、 4つのクローンの全てに D6M 189が、 うち 1つのクロー ンには D6Mitl89と D6Mit70両方が存在していることが明らかになり、 両マーカー とマウス型セマフォリン W遺伝子とがおなじ BACクローン上 （約 150kb) に存在し ていることが明らかになった。 Each of D6Mit99, D6Mitl89, and D6M189 was examined by PCR for the presence of each of the four mouse semaphorin W chromosomal DNA clones obtained in Example 1. As a result, it was revealed that D4M189 was present in all four clones, and that D6Mit89 and D6Mit70 were both present in one clone, and that both markers and the mouse semaphorin W gene were identical on the BAC clone. (About 150 kb).
実施例 3 Example 3
遺伝子地図とラジエーションハイブリッド地図の比較 Comparison of genetic map and radiation hybrid map
セマフォリン W遺伝子が存在している D6Mit71と D6MU9との間の遺伝地図を解析 した結果、 運動神経変性を起こす突然変異である mnd2が存在していることが分か つた (Jonesり、 Genomics (1993) 16, 669-677, Mouse-Genome Database http: //www. inforniatics. jax. org/) 。 この mnd2は、 D6Mit71から 3. 5cM， D6Mit9 からは 2. OcMの位置に存在している （Jonesら、 Genomics (1993) 16, 669-677, Mouse-Genome Database http : //www. informatics. jax. org/) 。 この相対 位置 は、 実施例 2で明らかにしたセマフォリン W遺伝子の相対的位置 （D6M 71より Analysis of the genetic map between D6Mit71 and D6MU9, where the semaphorin W gene is present, showed that mnd2, a mutation that causes motor neuron degeneration, was present (Jones et al., Genomics (1993). ) 16, 669-677, Mouse-Genome Database http: // www. Inforniatics. Jax. Org /). This mnd2 is located at 3.5cM from D6Mit71 and 2.OcM from D6Mit9 (Jones et al., Genomics (1993) 16, 669-677, Mouse-Genome Database http: // www. Informatics. Jax .org /). This relative position is based on the relative position of the semaphorin W gene identified in Example 2 (from D6M71).
122. 4cR、 D6Mit9より 59. 9cRの位置） に等しい位置である。 また、 mnd2は遺伝地 図上で、 マイクロサテライトマ一力一である D6Mitl89と D6Mit7と同じ位置にある ことが知られている （Jonesら、 Genomics (1993) 16， 669—677、 Mouse-Genome Database http : //www. inrormatics. jax. org/) 0 122.4cR, 59.9cR from D6Mit9). It is also known that mnd2 is located on the genetic map at the same position as the microsatellite markers D6Mitl89 and D6Mit7 (Jones et al., Genomics (1993) 16, 669-677, Mouse-Genome Database). http: //www.inrormatics.jax.org/) 0
以上の結果を総合すると、 セマフォリン W遺伝子は mnd2とは染色体上の同じ位 置に存在しており、 セマフォリン Wが mnd2の原因遺伝子であると結論された。 実施例 4  Summarizing the above results, it was concluded that semaphorin W gene is located at the same position on the chromosome as mnd2, and that semaphorin W is the causative gene of mnd2. Example 4
ヒ ト型セマフォリン W遺伝子のマッビング  Mapping of human semaphorin W gene
ジーンプリッジ 4ラジェーシヨンハイプリッドパネル （米国リサーチ ·ジエネ ティックス社） の DNAを铸型にして、 ヒト型セマフォリン W cDNA (国際公開第 98/15628号パンフレツトの配列番号： 4、配列番号： 5、配列番号： 10に記載） の 3 '端塩基配列を基に作製したプライマー、 hW2 : 5' -AGCATCCCTGACTCTCAT-3' (配列 番号： 1 1 ) と hW4: 5' - CAGAAAGCAGTTCTGATT-3' (配列番号： 1 2 ) を用いて、 94。C- 30sec、 50°C-30sec, 72。C- 30secの条件で PCRを行った。 GenePridge 4 Lagesion Hybrid Panel (US Research 3 ′ end base of human semaphorin W cDNA (described in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10 of WO 98/15628 pamphlet) Using primers prepared based on the sequence, hW2: 5'-AGCATCCCTGACTCTCAT-3 '(SEQ ID NO: 11) and hW4: 5'-CAGAAAGCAGTTCTGATT-3' (SEQ ID NO: 12) 94. C-30sec, 50 ° C-30sec, 72. PCR was performed under the condition of C-30 sec.
各クローンにヒト型セマフォリン W遺伝子が含まれて!/、るかどうかは 520bp断片 が生じることで判別できる。 この結果をマサチュセッッ工科大学ホワイ トヘッド 研究所ゲノム研究用サービス （http :〃丽- genome, wi. mit. edu/)のコンピュータ プログラムを用いて解析することにより、 ヒ ト型セマフォリン W遺伝子は、 2番 染色体短腕のマーカー配列 WI5987から動原体側に 5. 87cRの位置、 すなわち 2番染 色体短腕の 2pl3の位置に在ることが明らかになった。 また、 先のプライマー hW4 の代わりに hW10 : 5' -TAGGGGGAAGCCCTGATT-3' (配列番号： 1 3 ) を用いた場合も 同じ結果が得られ （この場合 PCRで生じるバンドは 543bpになる） 、 この解析が正 しいことが確認できた。  Whether or not each clone contains the human semaphorin W gene! / Can be determined by generating a 520 bp fragment. By analyzing the results using the computer program of the Massachusetts Institute of Technology Whitehead Research Institute Genome Research Service (http: 〃 丽 -genome, wi. Mit. Edu /), the human semaphorin W gene was expressed as 2 The marker sequence of chromosome short arm WI5987 revealed that it was located at the position 5.87cR on the centromere side, that is, at position 2pl3 of the chromosome 2 short arm. The same result was obtained when hW10: 5'-TAGGGGGAAGCCCTGATT-3 '(SEQ ID NO: 13) was used instead of the primer hW4 (in this case, the band generated by PCR was 543 bp). Was confirmed to be correct.
このセマフォリン W遺伝子のラジエーションマッビングの結果をヒ トの遺伝解 析の結果と比較した結果、 パーキンソン病、 アルストレーム症候群、 肢帯型筋ジ スト口フィ一 2 B型、 三好型遠位型筋ジストロフィー、 神経芽腫、 バーキットリ ンパ腫、 結腸腺癌、 甲状腺腫、 精神***病、 口蓋裂 Z***裂、 慢性リンパ性白血 病、 角化棘細胞腫、 多発性先天性奇形の原因遺伝子がマッピングされた位置に、 セマフォリン Wがマッピングされることが明らかになった。  Comparison of the results of the radiation mapping of the semaphorin W gene with the results of human genetic analysis revealed that Parkinson's disease, Alstroem syndrome, limb girdle muscular dystrophy type 1 B type, and Miyoshi type distal type Genes mapping for muscular dystrophy, neuroblastoma, Burkitt's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, cleft palate Z, cleft lip, chronic lymphocytic leukemia, keratoaplasia, and multiple congenital malformations It was revealed that semaphorin W was mapped to the position.
実施例 5 Example 5
セマフォリン W cDNAクローニング Semaphorin W cDNA cloning
ヒトおよぴラットのセマフォリン W cDNAについては既にクロ一ニングされてお り、 それらの塩基配列およびァミノ酸配列は、 国際公開第 98/15628号パンフレッ トの配列表に記載されている。 またヒトについては受託番号： FERM BP - 6089とし て寄託がなされている。  Human and rat semaphorin W cDNAs have already been cloned, and their nucleotide sequences and amino acid sequences are described in the sequence listing of WO 98/15628 pamphlet. The human has been deposited under accession number: FERM BP-6089.
マウス型セマフォリン W cDNAは、 以下のようにして 129/SVJマウス mRNAを铸型 にして RT-PCRを行うことにより得た。  Mouse semaphorin W cDNA was obtained by RT-PCR using 129 / SVJ mouse mRNA as type II as follows.
まず、 マウス脳から全 RNAを通常の方法で調製し、 得られた RNAを材料に、 オリ ゴ dTラテックスビーズ （宝酒造） を用いて製品に添付されたプロトコールに従つ て mRNAを調製した。 l // gの mRNAを铸型にしてスーパースクリプト IIcDNA合成シス テム （ギブコ社製） を用いて、 添付のプロトコールに従ってオリゴ dT-DNAと 3種 の合成プライマー、 5' "GCCATAGCAGAGGGCTACAG- 3' (配列番号： 1 4 ) 、 5' - GAAGGCACACACAGCAGAAA-3' (配列番号： 1 5 ) 、 5' - CTCACMTMCCCCGCACTT- 3，First, total RNA is prepared from mouse brain by the usual method, and the obtained RNA is Using dT latex beads (Takara Shuzo), mRNA was prepared according to the protocol attached to the product. l // g mRNA into type III, using a Superscript II cDNA synthesis system (manufactured by Gibco), according to the attached protocol, oligo dT-DNA and three synthetic primers, 5 '"GCCATAGCAGAGGGCTACAG-3' (sequence Nos .: 14), 5'-GAAGGCACACACAGCAGAAA-3 '(SEQ ID NO: 15), 5'-CTCACMTMCCCCGCACTT-3,
(配列番号： 1 6 ) をプライマーに用いて cDNAを合成した。 つづいてマウスセマ フォリン WcDNAを得るために、 上記で合成された cDNAlOngを铸型にし、 種々の合 成プライマーを用いて、 上記と同様の条件で PCRを行った。 更に 3 '端側の配列を 得るためには 3'RACE法を用いた。 得られた断片は通常の方法でァガ口一スゲル電 気泳動の後ゲルから切り出し精製し、 実施例 1と同様の方法により塩基配列を決 定した。 (SEQ ID NO: 16) was used as a primer to synthesize cDNA. Subsequently, in order to obtain mouse semaphorin WcDNA, the cDNA synthesized above was transformed into type III, and PCR was performed using various synthetic primers under the same conditions as above. In order to further obtain a sequence at the 3 'end, the 3' RACE method was used. The obtained fragment was excised from the gel after agarose gel electrophoresis by a usual method, purified, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 1.
決定された塩基配列を配列番号： 1に、 またァミノ酸配列を配列番号： 2に、 それぞれ示す。  The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
実施例 6 Example 6
セマフォリン W遺伝子を用いた遺伝疾患の診断 Diagnosis of genetic diseases using semaphorin W gene
セマフォリン W遺伝子の変異のある場所と変異の認められない場所に対し、 以 下のように PCRプライマーを作る。 このとき変異の認められる位置ではプライマ 一の位置は、 変異遺伝子と野生型遺伝子との間で配列が等し！/、領域がプライマー の 5'端に、 異なる領域が 3'端にくるようにし、 野生型遺伝子の配列を持つもの (ァ） と変異型遺伝子の配列を持つもの （ィ） との 2種を作製する。 さらに第 3 番目のプライマーとして変異の認められない位置に野生型の配列を持つプライマ ― (ゥ） を、 先の 2つのプライマーと適当な距離離れた位置に設定する。 このと き野生型の遺伝子を铸型にして PCRを行うと、 プライマー （ァ） 、 （ゥ） を用い た場合にのみバンドが検出可能であり、 変異型遺伝子 DNAを用いた場合にはプラ イマ一 （ィ） 、 （ゥ） を用いた場合にのみバンドが検出できる。 PCRの条件とし ては、 94。C- 20sec, 60。C- 30sec， 72。C- 40secを 3 5回程度くり返すとよい。 実際の診断には以下のように行う。 まず、 血液より常法に従ってゲノム DNAを 調製し被検体とする。 このゲノム DNAを A, B 2つに分け、 Aは （ァ） と （ゥ） のプ ライマーを用いて、 Bは （ィ） と （ゥ） のプライマ一を用いてそれぞれ上記の条 件で PCRを行う。 得られた増幅断片を、 ァガロースゲル電気泳動に付し、 臭化工 チジゥムで染色することによりバンドの検出を行う。 その結果、 Aサンプルから のみバンドが検出された場合は、 この被検体が疾患遺伝子を有しない、 Bサンプ ルからのみバンドが検出された場合は疾患遺伝子のホモ接合体、 A， B両サンプル 力 バンドが検出された場合は疾患遺伝子のヘテロ接合体であると診断できる。 産業上の利用の可能性 PCR primers are prepared for the semaphorin W gene mutation site and the site where the mutation is not observed as follows. In this case, the sequence of the primer at the position where the mutation is recognized is the same between the mutant gene and the wild-type gene! /, So that the region is at the 5 'end of the primer and the different region is at the 3' end of the primer, and two types, one with the sequence of the wild-type gene (a) and one with the sequence of the mutant gene (a) Make it. Furthermore, a primer having a wild-type sequence at a position where no mutation is observed as the third primer-(ゥ) is set at a position a suitable distance from the two primers. In this case, when the wild-type gene is subjected to PCR with type III, a band can be detected only when the primers (a) and (ゥ) are used, and when the mutant gene DNA is used, the primer is detected. Bands can be detected only when (i) and (ii) are used. PCR conditions are 94. C-20 sec, 60. C-30sec, 72. C-40sec should be repeated about 35 times. The actual diagnosis is performed as follows. First, genomic DNA is prepared from blood according to a standard method and used as a test sample. This genomic DNA is divided into two parts, A and B. A uses the primers (a) and (B), and B uses the primers (a) and (ゥ). Perform PCR on the subject. The amplified fragment obtained is subjected to agarose gel electrophoresis, and a band is detected by staining with bromide medium. As a result, when the band was detected only from the A sample, the subject did not have the disease gene, and when the band was detected only from the B sample, the homozygote of the disease gene was used. When a band is detected, it can be diagnosed as a heterozygote of the disease gene. Industrial applicability
本発明により、 セマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析することによる遺伝 疾患の診断方法または個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺伝子型の決定方 法、 あるいは前記診断方法または決定方法においてセマフォリン W遺伝子の変異 の有無を解析するために使用され得る D N Aまたは RNA、 さらにはセマフォリ ン W遺伝子を有効成分とする遺伝疾患の治療剤などを提供することができる。  According to the present invention, a method for diagnosing a genetic disease by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene, a method for determining the genotype of the semaphorin W gene retained in an individual, or the method for semaphorin W The present invention can provide DNA or RNA which can be used for analyzing the presence or absence of a gene mutation, and a therapeutic agent for a genetic disease containing a semaphorin W gene as an active ingredient.

Claims

請 求 の 範 囲 1 . 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析することを特徴とす る、 遺伝疾患の診断方法。 Scope of Claim 1. A method for diagnosing a genetic disease, characterized by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene on a chromosome.
2 . 遺伝疾患がヒトの 2番染色体短腕の 2 p 1 3にマップされる疾患である、 請求項 1記載の診断方法。  2. The diagnostic method according to claim 1, wherein the genetic disease is a disease mapped to 2p13 on the short arm of chromosome 2 in humans.
3 . 遺伝疾患が、 パーキンソン病、 アルストレ一ム症候群、 肢帯型筋ジストロ フィー 2 B型、 三好型遠位型筋ジストロフィー、 神経芽腫、 バーキットリンパ腫、 結腸腺癌、 甲状腺腫、 精神***病、 口蓋裂 ロ唇裂、 慢性リンパ性白血病、 角化 棘細胞腫又は多発性先天性奇形より選択される、 請求項 1または 2記載の診断方 法。  3. Genetic disorders include Parkinson's disease, Alstroem syndrome, limb girdle muscular dystrophy type 2B, Miyoshi distal muscular dystrophy, neuroblastoma, Burkitt's lymphoma, colon adenocarcinoma, goiter, schizophrenia, The diagnostic method according to claim 1 or 2, wherein the method is selected from cleft palate, cleft lip, chronic lymphocytic leukemia, keratinoma and multiple congenital malformations.
4 . 遺伝疾患が、 パーキンソン病及び Z又はアルストレーム症候群である、 請 求項 3記載の診断方法。  4. The diagnostic method according to claim 3, wherein the genetic disease is Parkinson's disease and Z or Alstroem syndrome.
5 . 遺伝疾患が、 マウスの m n d 2に相当するヒ トの遺伝疾患である、 請求項 1または 2記載の診断方法。  5. The diagnostic method according to claim 1, wherein the genetic disease is a human genetic disease corresponding to mnd2 in mice.
6 . 染色体上のセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析することを特徴とす る、 個体の保持するセマフォリン W遺伝子の遺伝子型の決定方法。  6. A method for determining the genotype of an individual's semaphorin W gene, characterized by analyzing the presence or absence of a mutation in the semaphorin W gene on a chromosome.
7 . 個体が m n d 2マウスである、 請求項 6記載の決定方法。  7. The method according to claim 6, wherein the individual is an mnd2 mouse.
8 . セマフォリン W遺伝子の一部よりなる D NAまたは R N Aであって、 かつ 請求項 1〜 5 、ずれか記載の診断方法、 あるいは請求項 6または 7記載の決定方 法においてセマフォリン W遺伝子の変異の有無を解析するために使用され得る D NAまたは R NA。  8. A DNA or RNA comprising a part of the semaphorin W gene, wherein the DNA or RNA is a semaphorin W gene in the diagnostic method according to any one of claims 1 to 5, or the determination method according to claim 6 or 7. DNA or RNA that can be used to analyze for the presence or absence of the mutation.
9 . セマフォリン W遺伝子の少なくとも一部を有効成分として含有する、 遺伝 疾患の治療剤。  9. A therapeutic agent for genetic diseases, comprising at least a part of the semaphorin W gene as an active ingredient.
1 0 . 遺伝疾患が請求項 2〜 5レ、ずれか記載の遺伝疾患である、 請求項 9記載 の治療剤。  10. The therapeutic agent according to claim 9, wherein the genetic disease is the genetic disease described in any one of claims 2 to 5.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1998015628A1 (en) * 1996-10-09 1998-04-16 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Novel semaphorin gene: semaphorin w

Patent Citations (1)

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WO1998015628A1 (en) * 1996-10-09 1998-04-16 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Novel semaphorin gene: semaphorin w

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