WO1998048836A1 - Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant - Google Patents

Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant Download PDF

Info

Publication number
WO1998048836A1
WO1998048836A1 PCT/FR1998/000875 FR9800875W WO9848836A1 WO 1998048836 A1 WO1998048836 A1 WO 1998048836A1 FR 9800875 W FR9800875 W FR 9800875W WO 9848836 A1 WO9848836 A1 WO 9848836A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
helicobacter
use according
compound
urease
derived
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000875
Other languages
French (fr)
Inventor
Bruno Guy
Jean Haensler
Original Assignee
Merieux Oravax
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9705608A external-priority patent/FR2762787B1/en
Application filed by Merieux Oravax filed Critical Merieux Oravax
Priority to AU76584/98A priority Critical patent/AU750379B2/en
Priority to EP98924360A priority patent/EP0979100A1/en
Priority to JP54668498A priority patent/JP2002505665A/en
Priority to BR9809381-9A priority patent/BR9809381A/en
Priority to CA002287976A priority patent/CA2287976A1/en
Publication of WO1998048836A1 publication Critical patent/WO1998048836A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K2039/106—Vibrio; Campylobacter; Not used, see subgroups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Definitions

  • Anû-Helicobacter vaccine composition comprising a Thl type adjuvant
  • the present invention relates to the particular use of a vaccine preparation intended to induce in a mammal, a protective immune response against a pathogenic organism infecting mucous membranes, in particular against the Helicobacter bacteria.
  • Helicobacter is a bacterial genus characterized by gram negative spiral bacteria. Several species colonize the gastrointestinal tract of mammals. We cite in particular H. pylori, H. heilmanii, H. felis and H. mustelae. Although H. pylori is the species most commonly associated with human infections, in some rare cases, H. heilmanii and H. felis have been isolated from humans. A Helicobacter type bacterium, Gastrospirillum hominis has also been described in humans.
  • Helicobacter infects more than 50% of the adult population in developed countries and almost 100% of that of developing countries; making it one of the predominant infectious agents worldwide.
  • H. pylori is found exclusively to date on the surface of the stomach lining in humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Furthermore, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H. pylori.
  • a variant of these methods consists in carrying out a primary immunization by the systemic route before administering the antigen by the nasal route.
  • the antigen most often a bacterial lysate or a purified protein, is combined with an appropriate adjuvant such as cholera toxin (CT) or heat-labile toxin (LT) of E. coli.
  • CT cholera toxin
  • LT heat-labile toxin
  • the humoral response which is observed is predominantly of the IgA type. This indicates that there was a local immune response.
  • IgA indicates the implementation of a response from T-helper type 2 lymphocytes (Th2 response).
  • T-helper lymphocytes by a particular antigen makes it possible to obtain different sub-populations of T-helper cells, characterized by different synthesis profiles of cyto ines.
  • Thl cells in particular selectively produce interleukin-2 (IL-2) and interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), while Th2 cells preferably secrete IL-4, -5, and -10 .
  • IL-2 interleukin-2
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Thl cells preferably secrete IL-4, -5, and -10 .
  • cytokines these two types of T-helper cells have distinct roles: Thl cells promote cell-mediated immunity ia an inflammatory response, while Th2 cells stimulate the humoral response IgA, IgE and certain subclasses of IgG.
  • cytokines produced by mouse Thl cells can stimulate the antibody response and in particular that IFN- ⁇ induces an IgG2a response.
  • a pharmaceutical composition which comprises an immunogenic agent derived from Helicobacter and at least one compound (capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against Helicobacter) selected among:
  • lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines, provided that these lipids are not presented in the form of liposomes when said composition does not contain saponin or glycolipopeptide of formula (I); and
  • R ′ represents a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and comprising from 1 to 50 carbon atoms, preferably 1 to 20 carbon atoms,
  • X represents -CH 2 -, -O- or -NH-
  • R 2 represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and comprising from 1 to 50 carbon atoms, preferably 1 to 20 carbon atoms,
  • R 3 , R 4 and R 5 each represent, independently of one another, a hydrogen atom or an acyl-CO-R 6 residue, in which R 6 represents an alkyl residue having from 1 to 10 atoms carbon,
  • R 7 represents a hydrogen atom, a C r C 7 alkyl group, hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, mercaptomephyl, 2- (methylthio) -ethyl, 3-aminopropyl, 3-ureido-propyl, 3-guanidylpropyl, 4- aminobutyl, carboxymethyl, carbamoylmethyl, 2-carboxethyl, 2-carbamoylethyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, 3-indolylmethyl or 4-imidazolylmethyl,
  • R 8 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 9 represents a hydrogen atom, an acetyl, benzoyl, trichloracetyl, trifluoroacetyl, methoxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl group, and
  • R 7 and R 8 can, when taken together, represent a group
  • a method for preventing or treating an infection promoted by a microorganism capable of infecting the gastro-duodenal mucosa of a mammal eg, a Helicobacter infection according to which the mammal is administered systemically, in one or more times , a composition containing at least one immunogenic agent derived from said microorganism eg from Helicobacter and at least one compound capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against eg, Helicobacter .
  • Thl T-helper 1
  • a method for preventing or treating an infection promoted by a microorganism capable of infecting the gastro-duodenal mucosa of a mammal, eg a Helicobacter infection according to which a composition is administered to the mammal, in one or more times containing at least one immunogenic agent derived from said microorganism eg from Helicobacter and at least one compound selected from the compounds (i) to (iii) mentioned above, and by which an Thl type immune response is induced against eg d 'Helicobacter.
  • Th1 response useful for the purposes of the present invention can be demonstrated by estimating the relative importance of the Th1 response with respect to the Th2 response, by comparing for example the levels of IgG2a and IgGl induced in mice against Helicobacter, which respectively demonstrate the implementation of the Th1 and Th2 responses.
  • the Thl response that one seeks is generally accompanied by a Th2 response.
  • the Th2 response should not be significantly predominant compared to the Th1 response.
  • the levels of IgG2a and IgG1 induced in mice can be assessed in a conventional manner using an ELISA test, provided that the tests used for each of the two sub-isotypes are of the same sensitivity and in particular that the anti-IgG2a and anti-IgG 1 antibodies have the same affinity.
  • the amounts of IgG2a and IgG1 can in particular be measured using an ELISA test identical or similar to that described below.
  • the wells of a polycarbonate ELISA plate are coated with 100 ⁇ l of a bacterial extract of Helicobacter e.g. H. pylori at approximately 10 ⁇ g / ml in carbonate buffer.
  • the ELISA plate is incubated for 2 hours at 37 ° C and then overnight at 4 ° C.
  • the plate is washed with PBS buffer (phosphate buffered saline) containing 0.05% of Tween 20 (PBS / Tween buffer).
  • the wells are saturated with 250 ⁇ l of PBS containing 1% bovine serum albumin in order to prevent the non-specific binding of the antibodies.
  • the plate After one hour of incubation at 37 ° C, the plate is washed with PBS / Tween buffer.
  • the plate is incubated for 90 minutes at 37 ° C, washed and evaluated according to standard procedures. For example, a goat anti-IgG2a or anti-mouse IgG1 antibody coupled to an enzyme such as peroxidase is used. Incubation in the presence of this antibody is continued for 90 minutes at 37 ° C.
  • the plate is washed and the reaction is developed with the appropriate substrate (for example O-phenyldiamine dihydrochloride when the enzyme used is peroxidase).
  • the reaction is evaluated by colorimetry (by measuring the absorbance by spectrophotometry).
  • the titer of the antiserum in IgG2a or in IgG1 corresponds to the reverse of the dilution giving an absorbance of 1.5 to 490 nm.
  • Th1 response useful for the purposes of the present invention is marked by a ratio of ELISA titers IgG2a: IgG1 in mice which must be greater than 1/100, 1/50 or 1/20, advantageously greater than 1 / 10, preferably greater than 1/3, most preferably, greater than 1/2, 5 or 10.
  • this ratio is around 1, we then speak of a mixed Thl / Th2 response or balanced.
  • the ratio is greater than or equal to 5
  • Th1 (or Th2) response in mice is predictive of a Th1 (or Th2) response in humans. Although it is easier to assess the type of response in mice, it can also be done in humans by measuring the levels of cytokines specific for the Th1 response on the one hand and on the other hand the response Th2, which are subsequently induced. Thl and Th2 responses can be evaluated directly in humans relative to each other based on the specific cytokine levels of the two response types (see above) eg, based on the IFN- ⁇ / IL-4.
  • the ELISA titer which reflects the amount of IgG2a, must be equal to or greater than 10,000, preferably equal to or greater than 100,000, of particularly preferably equal to or greater than 1,000,000; this then means that the Thl response is significant.
  • the mammal for which the pharmaceutical composition or method is intended is advantageously a primate, preferably a human.
  • Saponins useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Pat. No. 5,057,540 with reference not to their structures but to the fractions in which they are present after fractionation of an aqueous extract of the bark of Quillaja saponaria Molina, by high pressure liquid chromatography (HPLC) and low pressure chromatography on silica.
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • QA-7, QA-17, QA-18 and QA-21 also known as QS-21.
  • QS-21 is known to be an adjuvant which promotes the induction of an immune response mainly of the Thl type. We then speak of Thl type adjuvant.
  • Cationic lipids useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Patent No. 5,283,185.
  • mention is made of cholesteryl-3 ⁇ -carboxyl-amido-ethylenetrimethylammonium iodide 1- dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl carboxylate iodide, cholesteryl-3 ⁇ -carboxyamidoethyleneamine iodide, cholesteryl-3 ⁇ -oxysyccinamidoethylenetrimethylammonium iodide, l-dimethylamino-3- iodide trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3 ⁇ -oxysuccinate, iodide of 2 - [(2- trimethylammonio) -ethylmethylamino] ethyl-cholesteryl-3 ⁇ -oxysuccinate, 3 ⁇ - [N- (polyethyleneimine) -carbamoyl] cholesterol,
  • DC-chol (or its saline form) is known to be an adjuvant which promotes the induction of a balanced balanced response of the Thl / Th2 type. We then speak of a Thl / Th2 or Thl + Th2 type adjuvant.
  • cationic lipids can be used in dispersion or else put in the form of liposomes.
  • Liposomes can be produced as described in US Pat. No. 5,283,185, by combining the cationic lipids with a neutral phospholipid e.g., phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine.
  • Glycolipopeptides useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Patent No. 4,855,283 and EP 206,037. These are in particular glycolipids of general formula (I) in which a sugar residue is a 2-amino-2-deoxy-D-glucose or 2-amino-2-deoxy-D-galactose residue.
  • the 2-amino group of the amino sugar can be linked to glycine, sarcosine, hippuric acid, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, ornithine, citrulline, arginine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, phenylalanine, tyrosine, proline, tryptophan or histidine in D or L form or with aminocarboxylic acids such as ocaminobutyric acid, cc-aminovaleranic acid, cc-aminocaproic acid or oc acid
  • glycolipopeptides are cited: N- (2-glycinamido-2-deoxy- ⁇ -deoxy- ⁇ -D-glucopyranosyl) -N-dodecyldodecanoyl- amide, N- (2-glycinamido-2-deoxy- ⁇ - D-glucopyranosyl) -N-dodecyl-actadecanoylamide, N- (2-glycinamido-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranosyl) -N-tetradecyl-dodecanoylamide, N- (2-L-alaninamido-2deoxy- ⁇ -D- glucopyranosyl) -N-dodecyl-dodecanoylamide, N- (2-D-alanimamido-2deoxy- ⁇ -D-glucopyranosyl) -N-dodecyl-octadecanoyl
  • a composition according to the invention may contain one or more previously mentioned compounds.
  • two compounds are used; (a) one being selected from saponins purified from an extract of Quillaja saponaria and (b) the other being selected (i) either from cationic lipids or a salt thereof, said lipids being inhibitors weak in protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 atoms carbon, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines, (ii) or from the glycolipeptides of formula (I).
  • the mixtures QS21 + DC-Chol and QS-21 + Bay RI 005 are cited.
  • adjuvants capable of promoting a Thl type immune response that is to say adjuvants of the Thl or Thl / Th2 type
  • Thl type immune response that is to say adjuvants of the Thl or Thl / Th2 type
  • adjuvants of the Thl or Thl / Th2 type exist in the prior art from which the person skilled in the art is able to select the one that best suits their needs.
  • liposomes are mentioned in particular; ISCOMS; microspheres; protein chochleates; vesicles formed from nonionic surfactants; dispersions of cationic amphiphiles in water; oil / water emulsions; muramidyldipeptide (MDP) and its derivatives such as glucosyl muramidyldipeptide (GMDP), threonyl-MDP, murametide and murapalmitine; as well as various other compounds such as the monophosphoryl-lipid A (MPLA) major lipopolysaccharide of the wall of a bacterium, for example of E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimiirium or Shigella ⁇ exneri; algan-glucan; gamma-inulin; calcitriol and loxoribine.
  • MDP muramidyldipeptide
  • GMDP glucosyl muramidyldipeptide
  • GMDP glu
  • Liposomes useful for the purposes of the present invention can be selected in particular from pH-sensitive liposomes such as those formed by mixing cholesterol hemisuccinate (CH ⁇ MS) and dioleyl phosphatidyl ethanolamine (DOPE); liposomes containing cationic lipids known for their fusiogenic properties, such as 3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) - carbamoyl) cholesterol (DC-chol) and its equivalents described in US Patent No.
  • pH-sensitive liposomes such as those formed by mixing cholesterol hemisuccinate (CH ⁇ MS) and dioleyl phosphatidyl ethanolamine (DOPE); liposomes containing cationic lipids known for their fusiogenic properties, such as 3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) - carbamoyl) cholesterol (DC-chol) and its equivalents described in US Patent No.
  • ISCOMs useful for the purposes of the present invention can be selected in particular from those composed of QuilA or QS-21 associated with cholesterol and optionally also with a phospholipid such as phosphatidylcholine. These are particularly interesting for the formulation of lipid antigens.
  • Microspheres useful for the purposes of the present invention can in particular be formed from compounds such as polylactide-co-glycolide (PLAGA), alginate, chitosan, polyphosphazene and many other polymers.
  • PLAGA polylactide-co-glycolide
  • alginate alginate
  • chitosan alginate
  • polyphosphazene polyphosphazene
  • Protein chochleates useful for the purposes of the present invention can in particular be selected from those formed from cholesterol and optionally from an additional phospholipid such as phosphatidylcholine. These are especially advantageous for the formulation of lipid antigens.
  • Vesicles formed from nonionic surfactants useful for the purposes of the present invention can in particular be formed by a mixture of 1-monopalmitoyl glycerol of cholesterol and of dicetylphosphate. They are an alternative to conventional liposomes and can be used for the formulation of all the immuno - , gt> è v -nes agents mentioned.
  • Oil / water emulsions useful for the purposes of the present invention can in particular be selected from MF59 (Biocin-Chiron), SAF1 (Syntex) and the montanides ISA51 and ISA720 (Seppic).
  • the immunogenic agent derived from Helicobacter is advantageously selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a peptide and a polypeptide of Helicobacter in purified form.
  • a preparation of inactivated bacteria can be obtained according to conventional methods well known to those skilled in the art.
  • a dose of inactivated bacteria or lysate cell, suitable for prophylactic or therapeutic purposes can be determined by those skilled in the art and depends on a number of factors such as the individual for whom the vaccine is intended, eg, age, of the antigen itself likewise, the route and mode of administration, the presence / absence or the type of adjuvant, as can be determined by those skilled in the art. In general, it is indicated that an appropriate dose is from about 50 ⁇ g to 1 mg to about 1 mg, of lysate.
  • a peptide or a polypeptide derived from Helicobacter can be purified from Helicobacter or obtained by the techniques of genetic engineering or even by chemical synthesis. The latter method is advantageous in the case of peptides.
  • Any chain of amino acids whose size is less than about 50 amino acids is called a "peptide".
  • polypeptide is used which is also interchangeable with the term "protein”.
  • a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention can be identical or similar to that existing under natural conditions. It is similar in that it is capable of inducing an immune response of the same nature but it may include certain structural variations such as for example a mutation, the addition of a residue of lipid nature or else be in the form of a peptide. or fusion polypeptide.
  • a dose of the peptide or of the polypeptide, suitable for prophylactic or therapeutic purposes can be determined by a person skilled in the art and depends on a certain number of factors such as the individual for whom the vaccine is intended, eg, age, the antigen itself, the route and mode of administration, the presence / absence or type of adjuvant, as can be determined by those skilled in the art. Generally, it is indicated that an appropriate dose is from about 10 ⁇ g to about 1 mg, preferably about 100 ⁇ g.
  • the immunogenic agent derived from Helicobacter can be any Helicobacter polypeptide eg, from H. pylori. It can in particular be a polypeptide present in the cytoplasm, a polypeptide of the internal or external membrane or a polypeptide secreted in the external medium.
  • Helicobacter polypeptides have already been described in the literature, either by reference to their amino acid sequence deduced from the sequence of the corresponding cloned or identified gene, or by reference to a purification process which makes it possible to obtain them in the form isolated from the rest of their natural environment.
  • polypeptides are also described in WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 and WO 96/33220.
  • a polypeptide useful for the purposes of the present invention may be identical or similar to one of those cited in the reference insofar as it is capable of promoting an immune response against Helicobacter. Provided this latter condition is met, the immunogenic agent can also be a peptide derived from a polypeptide cited in reference.
  • a polypeptide selected from the UreA and UreB subunits of Helicobacter urease is used (see WO 90/4030).
  • they are used both, combined in the form of apoenzyme of urease or also in multimeric form (see WO 96/33732).
  • a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention may contain one or more immunogenic agents.
  • an advantageous composition can comprise UreA and UreB e.g., in the form of an apoenzyme, as well as one or more other polypeptides in particular selected from those mentioned above.
  • a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention may also contain compounds other than the immunogenic agent itself and the adjuvant of the Thl or Thl / Th2 type; the nature of these compounds depending to a certain extent on the nature of the immunogenic agent, inactivated bacteria, cell lysate, peptide or polypeptide.
  • a composition can also comprise an adjuvant capable of promoting the induction of a Th2 type immune response, e.g. an aluminum compound such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate or aluminum hydroxy phosphate. This can be advantageous in the case where the adjuvant useful for the purposes of the present invention is a Thl type adjuvant such as QS-21.
  • the therapeutic or prophylactic effectiveness of a method or use according to the invention can be evaluated according to standard methods eg, by measuring the induction of an immune response or the induction of therapeutic or protective immunity in using eg, the mouse / H. felis model and the procedures described in
  • H. felis can be replaced in the mouse model by another species of Helicobacter.
  • the efficacy of an immunogenic agent derived from H. pylori is preferably evaluated in a mouse model using a strain of H. pylori adapted to the mouse. Efficacy can be determined by comparing the degree of infection in the gastric tissue (by measuring urease activity, bacterial load, or gastritis status) to that of a control group. There is a therapeutic or protective effect when the infection is reduced compared to the control group.
  • a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention can be manufactured in a conventional manner.
  • it can be formulated with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, e.g., water or saline.
  • a pharmaceutically acceptable diluent or carrier e.g., water or saline.
  • the diluent or carrier can be selected depending on the mode and route of administration and according to standard pharmaceutical practices. Appropriate carriers or diluents as well as what is essential for the development of a pharmaceutical composition are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference book in this field.
  • compositions useful for these purposes can be used to treat or prevent i.a. Helicobacter infections and therefore gastroduodenal diseases associated with these infections, including acute, chronic or atrophic gastritis, peptic ulcers e.g., gastric or duodenal ulcers.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be administered in a conventional manner, in particular by the mucous route, eg by the ocular, oral route, eg buccal or gastric, pulmonary, intestinal, rectal, vaginal or urinary route, or by the systemic route, in particular parenteral, eg, intravenous, intramuscular route. , intradermal, intraepidermal and subcutaneous.
  • parenteral eg, intravenous, intramuscular route. , intradermal, intraepidermal and subcutaneous.
  • a site of administration is preferably chosen located under the diaphragm of an individual.
  • the dorsolumbar region constitutes, for example, a suitable site of administration, in particular for the intraepidermal, intramuscular, intradermal and subcutaneous routes; the latter being chosen preferably by the intravenous route.
  • the operation which consists in administering a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention can be repeated one or more times, preferably at least twice, leaving a certain time interval between each administration; interval which is of the order of the week or the month. Its precise determination is within the reach of those skilled in the art and may vary depending on various factors such as the nature of the immunogenic agent, the age of the individual, etc.
  • the vaccination protocol is implemented using the same route of administration during the primary immunization and boosters. In this case, we speak for example of strict system administration.
  • a method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route is defined as a method which does not involve a route of administration other than the systemic route.
  • a method in which the immunogenic agent is administered by the systemic route and by the mucous route does not meet the definition given above.
  • a method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route must be understood as a method in which the immunogenic agent is administered by a systemic route excluding any other route, in particular the mucosal route.
  • a vaccination scheme which consists in administering the urease apoenzyme in combination with QS-21, DC-chol or one of their equivalents, three times by subcutaneous route, in the dorso-lumbar region with an interval of two to four weeks between each administration.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention can be a simple step forming part of a more elaborate vaccination protocol.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention may be preceded or followed by the administration of a pharmaceutical composition containing an immunogenic agent derived from Helicobacter chosen independently from those listed above or from others such as a vaccine vector or a DNA molecule; but not containing QS-21, DC-chol or one of their equivalents; these can then be replaced by a whole other adjuvant; the two compositions can be administered by identical or different routes.
  • Immunogens other than those described above and which can be used in a multistage vaccination protocol comprising an administration step involving a medicament useful for the purposes of the present invention or a composition according to the present invention can be selected from a polynucleotide molecule, in particular a DNA molecule comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell; or alternatively a vaccine vector comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell (if it is a viral vector) or in a prokaryote (if it is a bacterial vector).
  • the DNA molecule can advantageously be a plasmid which is unable both to replicate and to integrate substantially in the genome of a mammal.
  • the coding sequence cited above is placed under the control of a promoter allowing expression in a mammalian cell.
  • This promoter can be ubiquitous or specific for a tissue.
  • ubiquitous promoters mention is made of the early promoter of Cytomegalovirus (described in US Patent No. 4,168,062) and the promoter of Rous sarcoma virus (described in Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5: 281 ).
  • the desmin promoter (Li et al, Gene (1989) 78: 244443; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268: 10403) is a selective promoter which allows expression in muscle cells and also in cells. skin.
  • a specific promoter of muscle cells is for example the promoter of the myosin or dystrophin gene.
  • plasmids which can be used for the purposes of the present invention are described i.a., in WO 94/21797 and Hartikka et al, Human Gene Therapy (1996) 7: 1205.
  • the nucleotide molecule e.g. the DNA molecule can be formulated or not.
  • the choice of formulation is very varied.
  • the DNA can simply be diluted in a physiologically acceptable solution with or without a carrier. When the latter is present, it can be isotonic or weakly hypertonic and have low ionic strength. For example, these conditions can be fulfilled with a sucrose solution e.g. 20%.
  • the polynucleotide can be combined with agents which promote entry into the cell. It can be (ii) a chemical agent which modifies cell permeability, such as bupivacaine (see for example WO 94/16737) or (ii) an agent which associates with the polynucleotide and acts as a vehicle facilitating the transport of the polynucleotide .
  • the latter may in particular be cationic polymers e.g. polylysine or a polyamine e.g. derivatives of spermine (see WO 93/18759). They can also be fusogenic peptides e.g. GALA or Gramicidine S (see WO 93/19768) or even peptides derived from viral fusion proteins.
  • Anionic or neutral lipids have been known for a long time as being able to serve as transport agents, for example in the form of liposomes, to a large number of compounds including polynucleotides. A detailed description of these liposomes, their constituents and their manufacturing processes is for example provided by Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).
  • Cationic lipids are also known and commonly used as transport agents for polynucleotides.
  • Lipofectin I also known under the name of DOTMA (N- [l- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleyloxy ) -3- (trimethylammonio) propane), DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) and cholesterol derivatives such as DC-chol (3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) ) -carbamoyl) cholesterol).
  • Cationic lipids are preferably used with a neutral lipid such as DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) as for example that is described in WO 90/1 1092.
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • Gold or tungsten microparticles can also be used as transport agents, as described in WO 91/359, WO 93/17706 and Tang et al, Nature (1992) 356: 152.
  • the polynucleotide is precipitated on the microparticles in the presence of calcium chloride and spermidine then the whole is administered by high-speed jet in the dermis or in the epidemic, using a device without a needle such as those described in US Pat. Nos. 4,945,050 and No. 5,015,580 and WO 94/24243.
  • the amount of DNA that can be used to vaccinate an individual depends on a number of factors such as for example the strength of the promoter used to express the antigen, the immunogenicity of the product expressed, the condition of the mammal to which is intended for administration (eg, weight, age, and general health), mode of administration and type of formulation.
  • a dose suitable for prophylactic or therapeutic use in an adult of the human species is from approximately 1 ⁇ g to approximately 5 mg, preferably from approximately 10 ⁇ g to approximately 1 mg, and very particularly preferably from about 25 ⁇ g to about 500 ⁇ g.
  • vaccine vectors there are vaccine vectors.
  • the vectors of viral origin are in particular adenoviruses and poxviruses.
  • An example of a vector derived from an adenovirus as well as a method for constructing a vector capable of expressing a DNA molecule coding for a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention are described in US Patent No. 4,920,209.
  • Poxviruses which can also be used are, for example, vaccinia and canarypox viruses. They are described respectively in US patents Nos.
  • Poxviruses capable of expressing a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention can be obtained by homologous recombination as described in Kieny et al, Nature (1984) 312: 163, so that the DNA fragment encoding for the peptide or the polypeptide is placed under conditions suitable for its expression in mammalian cells.
  • a bacterial vector such as the Biliated Bacillus of Calmette-Guérin can also be considered.
  • the dose of a viral vector intended for prophylactic or therapeutic purposes can be from approximately 1x10 4 to approximately 1x10 ] , advantageously from approximately 1x10 7 to approximately 1x10 10 , preferably from approximately lxl 0 7 to approximately lxlO 9 units forming plates per kilogram.
  • bacterial vectors there are in particular Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus and Streptococcus.
  • Non-toxic mutant strains of Vibrio cholerae which may be useful as a live vaccine are described in Mekalanos et al, Nature (1983) 306: 551 and US Patent No.
  • the DNA sequence coding for a peptide or polypeptide ⁇ Helicobacter can be inserted into the bacterial genome or else remain in the free state, carried by a plasmid.
  • a DNA molecule or a vaccine vector can comprise a sequence coding for any polypeptide or peptide described above.
  • a DNA molecule, preferably a viral vaccine vector can also comprise a sequence coding for a cytokine, for example a lymphokine such as interleukin-2 or -12, under the control of elements suitable for expression in a cell. mammal.
  • An alternative to this option also consists in adding to a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention comprising a DNA molecule or a vector, another molecule or viral vector coding for a cytokine.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition intended for treating or preventing a Helicobacter infection which comprises for consecutive administration: (i) a first product containing (a) an immunogenic agent derived from Helicobacter independently selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a Helicobacter peptide and polypeptide in purified form, and (b) a compound capable of promoting the induction of an immune response from type Thl and (ii) a second product containing an immunogenic agent derived from Helicobacter independently selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a peptide and a polypeptide of Helicobacter in purified form, a DNA molecule comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control role of the elements necessary for its expression and a vaccine vector comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements
  • Figure 1 refers to Example 1 and presents the levels of urease activity after challenge, measured 4 hrs after the sacrifice of the mice having received 3 times, on D0, D28 and D56: (a) a urease preparation approximately 80% encapsulated in DC-chol liposomes, in the dorso-lumbar muscles; or (b) an urease preparation adjuvanted by cholera toxin, intragastrically. Experiments (c) and (d) correspond respectively to the positive and negative controls.
  • Figure 2 refers to Example 1 and presents the levels of urease activity after challenge, measured 4 hrs after the sacrifice of the mice having received 3 times, on D0, D28 and D56: (a) a urease preparation adjuvanted by cholera toxin, intragastrically or (b) a urease preparation adjuvanted by PCPP, subcutaneously in the left posterior sub-lumbar region; or (c) a urease preparation adjuvanted with QS-21, subcutaneously in the lower back. Experiments (c) and (d) correspond respectively to the positive and negative controls.
  • Figure 3 shows the amounts of serum immunoglobulins induced in monkeys subjected to immunization protocols described in Example 2, and expressed as ELISA titer.
  • a control group comprising 4 monkeys and three test groups are formed, each of the test groups comprising 8 monkeys; each test group is divided into two subgroups of 4 monkeys, one receiving only the preparation
  • Group 1 and read corresponds to the administration protocol [nasal + intragastric, 4 times];
  • group 2 and 2u corresponds to the administration protocol [intramuscular, 4 times];
  • group 1 and read corresponds to the administration protocol [nasal + intragastric, intramuscular, nasal + intragastric, intramuscular].
  • the ELISA titer is measured three times: a first time, on D0 (white stripe), a second time on D42 (gray stripe), a third time on D78 (black stripe).
  • Figure 4 shows the quantities of serum immunoglobulins induced in mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, and expressed in ELISA titer.
  • O indicates the ELISA titer in IgG2a and indicates the titer
  • mice Two control groups (positive and negative controls), four test groups (A1 to A4) as well as a reference group (LT) are formed; each of the groups including 10 mice. Measurements of the quantities of serum immunoglobulins are carried out for only 5 of the 10 mice.
  • the mice of groups A1 to A4 received doses of 10 ⁇ g of urease subcutaneously in the left posterior sub-lumbar part, in the presence of QS-21 (Al), Bay R1005 (A2), DC-chol ( A3) or PCPP (A4).
  • the reference group mice received doses of 40 ⁇ g of urease orally in the presence of the heat-labile protein of E. coli.
  • FIG. 5 shows the levels of urease activity measured in the stomach mucosa, at DO550 4 hours after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed.
  • the groups are as described for Figure 4.
  • FIG. 6 shows the levels of urease activity measured in the stomach mucosa, at DO550 24 hours after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed.
  • the groups are as described for Figure 4.
  • FIG. 7 shows the bacterial load measured in the stomach mucosa, after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed.
  • the groups are as described for Figure 4.
  • Figures 8A and 8B show the urease activity (Fig. 6A) evaluated after 4 hrs (OD at 550 nm) with the Jatrox test (Procter & Gamble) and the bacterial load (Fig. 6B) in mice infected with H.
  • mice 6/8 week old Swiss female mice were supplied by Janvier (France). For the duration of the experiment, sterilized equipment was used; the cages were protected by "isocaps"; the mice were fed filtered water and irradiated food.
  • mice received 3 doses of the same product; each dose 28 days apart (days 0, 28 and 56).
  • the administration of the product was carried out by the nasal route (up to 50 ⁇ l on awake mice), by oral route (300 ⁇ 1 in 0.2 M NaHC ⁇ 3 by gastric gavage), or by subcutaneous route (300 ⁇ l under the skin of the neck or under the skin on the left side of the lumbar region).
  • an intramuscular inoculation was performed (50 ⁇ l) in the dorsolumbar muscles of the anesthetized mice.
  • 10 ⁇ g of urease were administered by nasal, subcutaneous or intramuscular route, and 40 ⁇ g by oral route.
  • 400 ⁇ g of cells were administered subcutaneously or orally.
  • the apoenzyme of H urease. pylori was expressed in E. coli and purified as described in Example 5 of WO96 / 31235. In the following text to designate this apoenzyme, the simple term urease is used.
  • DC-chol liposomes containing urease are prepared as follows: First, in order to obtain a dry lipid film containing 100 mg of DC-chol (R-Gene Therapeutics) and 100 mg of DOPC (dioleylphosphatidylcholine) ( Avanti Polar Lipids), these products are mixed in powder form in approximately 5 ml of chloroform. The solution is allowed to evaporate in vacuo using a rotary evaporator. The film thus obtained on the walls of the container is dried under high vacuum for at least 4 hrs. In parallel, 20 mg of a urease lyophilisate and 100 mg of sucrose are diluted in 13.33 ml of 20 mM Hepes buffer, pH 7.2.
  • the lyophilisate is taken up in an appropriate volume of water or buffer and the suspension is purified on a discontinuous gradient of sucrose (steps of 0, 30 and 60%) so as to obtain a preparation in which the amount of encapsulated urease is greater than approximately 70% of the total amount of urease.
  • Cholera toxin is used as a mucosal adjuvant at a rate of 10 ⁇ g / dose of urease or of bacterial preparation.
  • QS-21 (Cambridge Biosciences) is used as an adjuvant at a rate of 15 ⁇ g / dose of urease.
  • PCPP Polyphosphazene
  • mice Two weeks after the second booster, the mice were subjected to gastric gavage with 300 ⁇ l of a suspension of an H. strain. pylori adapted to the mouse, the ORV2002 strain (1 x 10 7 live bacteria in 200 ⁇ l of PBS; OD 550 of approximately 0.5). A group having received no antigen back and serving as a control is tested the same.
  • mice were sacrificed by rupture of the cervical vertebrae.
  • the stomachs were removed to assess urease activity and to do histological analyzes.
  • Urease activity was evaluated after 4 and 24 hours (OD at 550 nm) with the Jatrox test, Procter & Gamble) and after 24 hours the number of mice still negative (OD less than 0.1) was noted.
  • the ELISPOTs were performed according to Mega et al, J. Immunol. (1992) 148: 2030.
  • the plates were coated with an extract of H. proteins. pylori at a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the cells thus digested were filtered after each step using 70 ⁇ m filters (Falcon), then washed 3 times in a solution of RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 5% of fetal calf serum (FCS), and incubated in the same solution for at least 4 hours in plates covered with nitrocellulose (Millipore) (100 ⁇ l / well, 4 wells). For each half of the stomach, 1 to 3, 10 5 cells are obtained (large cells and macrophages were not counted).
  • Biotinylated IgA and the streptavidin-biotinylated peroxidase complex were from Amersham.
  • the spots were revealed under the action of the AEC substrate (Sigma) and as soon as the plates were dry, they were counted under a microscope (magnification 16 or 40X).
  • the mean values corresponding to the number of spots (spots) of IgA in four wells were calculated and expressed as the number of spots / 10 6 cells.
  • Figure 1 shows that a urease preparation encapsulated in DC-chol liposomes gives as good results as those obtained in the standard reference experiment.
  • Figure 2 shows that an urease preparation adjuvanted by QS-21 gives as good results as those obtained in the standard reference experiment.
  • this figure shows that the results obtained using PCPP as an adjuvant are much worse than those obtained with QS-21. This is explained by the fact that the PCPP preferentially induces with the urease a Th2 type response while the QS-21 with the urease induces a balanced Th1 / Th2 response; as shown in the table below.
  • experiments (a) to (e) whose results in terms of urease activity 4 hrs after the mice have been sacrificed are shown in FIG. 2 and it is indicated that the number of mice which are still negative for urease activity 24 hrs after being sacrificed is respectively (a) 1/8, (b) 0/8, (c) 5/8, (d) 0/8 and (e) 10/10. This is in accordance with what was concluded in the paragraph previously; namely that experiment (c) leads to results similar to those obtained during the standard reference experiment.
  • the table below presents the quantities of serum IgA, IgG1 and IgG2a induced during the experiments whose results in terms of urease activity are reported in Figures 1 and 2 as well as the number of mice whose urease activity is characterized by an OD less than 0.1 after 4 and 24 hrs after sacrifice.
  • the amounts of IgA, IgG 1 and IgG2a are expressed as ELISA titer.
  • Example 1A Insofar as there is a cross-reactivity between the GPLOs and H. pylori, it was chosen to use a preparation of inactivated H. pylori bacteria, as described in Example 1A, alone or in combination with urease recombinant prepared according to the method referenced in Example 1A.
  • DC-chol E. toxin heat-labile. coli (LT) (Sigma) or the cholera toxin B (CTB) subunit (Pasteur Mérieux sera & vaccines) was used as a mucosal adjuvant while DC-chol was used as a parenteral adjuvant.
  • DC-chol powder is simply rehydrated by an antigen preparation. The doses used are as follows:
  • Biopsies, urease test and bacteriological / histological study A biopsy was performed on each of the monkeys before and after immunization (one month after the third booster). From the biopsies, a urease test and a histological study were carried out.
  • Urease activity is evaluated using the Jatrox kit (Procter & Gamble). The importance of this activity is estimated as follows, decreasingly: level 3, pink coloration appearing during the first 10 minutes; level 2, pink coloration appearing between 10 and 30 minutes after the addition of the reagents; level 1, pink coloring appearing between 30 min and 4 hrs and level 0, weak or non-existent coloring after 4 hrs.
  • the table below relates to the bacterial load which, before and after immunization, is assessed using two tests: (i) by evaluating urease activity and (ii) by carrying out a histological study.
  • the results relating thereto are presented in columns 3 to 6.
  • the last three columns indicate for each group (control, 1, 2 or 3) the number of monkeys for which the bacterial load remains unchanged after immunization (_>) according to the two tests; or appears less (it) or increased (TJ) in at least one of the two tests, the other test indicating a stationary bacterial load.
  • the results of the two tests go in the same direction, the upward or downward arrow is double.
  • this table reveals that in the group having been subjected to a strict mucosal immunization protocol, the results are substantially identical to those obtained with the negative control group.
  • an immunization protocol by mixed mucosal and intramuscular route or by the strict intramuscular route, a marked reduction in the bacterial load is observed.
  • an adjuvant such as DC-chol, capable of promoting a balanced Thl and Th2 response, in order to obtain a protective effect.
  • the immunization conditions enabling the desired effect to be obtained include the use of the targeted parenteral route in the sub-diaphragmatic region or that of a Thl adjuvant.
  • mice 6/8 week old Swiss female mice were supplied by Janvier (France). For the duration of the experiment, sterilized equipment was used; the cages were protected by "isocaps"; the mice were fed filtered water and irradiated food. Administration protocol
  • mice received 3 doses of the same product; each dose 21 days apart (days 0, 21 and 42).
  • the administration of the product was carried out orally (300 ⁇ l in 0.2 M NaHCO ⁇ by gastric gavage), or by subcutaneous route (300 ⁇ l under the skin on the left side of the lumbar region).
  • Ten ⁇ g of urease was administered subcutaneously and 40 ⁇ g orally.
  • the apoenzyme of H urease. pylori was expressed in E. coli and purified as described in Example 5 of WO96 / 31235. In the following text to designate this apoenzyme, the simple term urease is used.
  • E. toxin heat-labile. coli (Sigma) is used as a mucosal adjuvant at a rate of 1 ⁇ g / dose of urease.
  • QS-21 (Cambridge Biosciences) is used as an adjuvant at a rate of 15 ⁇ g / dose of urease.
  • Bay RI 005 (Bayer) is used as an adjuvant at a rate of 400 ⁇ g / dose of urease.
  • DC-chol (R-Gene Therapeutics) is used as an adjuvant at a rate of 65 ⁇ g / dose of urease.
  • PCPP Polyphosphazene
  • mice Four weeks after the second booster, the mice were subjected to gastric gavage with 300 ⁇ l (3 x 10 6 live bacteria) of a suspension of a strain of H. pylori adapted to mice and resistant to Streptomycin, the strain ORV2001. A group having received no dose of antigen and serving as a control is likewise tested.
  • test suspension is prepared as follows: H. pylori is cultured on Muller- ⁇ inton agar (Difco) containing 5% sheep blood (bioMérieux) (medium
  • M ⁇ A which contains the following antibiotics from Sigma: Trimethoprim 5 ⁇ g / ml,
  • the culture dishes are incubated for 3 days at 37 ° C. under microaerophilic conditions (Anaerocult C, Merck).
  • This culture is harvested to inoculate a bottle provided with vents of 75 cm 2 (Costar) containing 50 ml of Brucella broth supplemented with 5% fetal calf serum and with the abovementioned antibiotics.
  • the bottle is incubated under micro aerophilic conditions, with gentle shaking for 24 hours.
  • the suspension is then diluted in Brucella broth to give an OD of 0.1 to 550 nm (or 10 7 CFU / ml).
  • mice were sacrificed by rupture of the cervical vertebrae.
  • the stomachs were removed to evaluate the urease activity and the bacterial load by quantitative culture.
  • a longitudinal quarter of the stomach (antrum + corpus) is used for each of the tests.
  • Urease activity was evaluated after 4 and 24 hours (OD at 550 nm) with the Jatrox test, Procter & Gamble) and after 24 hours the number of mice still negative (OD less than 0.1) was noted.
  • the mucosa of a quarter of the stomach of each mouse is placed in the Portagem medium of bioMérieux and then within two hours, transferred to the culture chamber.
  • the sample is then homogenized using a Dounce homogenizer (Wheaton, Millville USA) containing 1 ml of Brucella medium (Brucella broth) and diluted in series to 10 ⁇ 3 .
  • the ELISA analyzes were carried out according to the standard protocol (the biotinylated conjugates and streptavidin peroxidase came from Amersham and the OPD substrate from Sigma).
  • the plates were coated with H pylori extracts (5 ⁇ g / ml) in carbonate buffer.
  • a mouse control serum directed against the extract of H. pylori was introduced in each experiment.
  • the titer corresponds to the inverse of the dilution giving an OD of 1.5 to 490 nm.
  • Serum response As shown in Figure 4, after three immunizations, all mice immunized subcutaneously show a significant serum IgG response.
  • IgG 1 IgG2a ratios
  • the PCPP induces a predominant response of the Th2 type (high IgG1 level, low IgG2a level).
  • Bay RI 005 and DC-chol induce a more balanced Thl / Th2 response.
  • QS-21 induces a predominant Thl-type response.
  • the main difference between the four groups of mice A1 to A4 lies in their IgG2a titers, the IgG l titers all being similar.
  • Post-test protection Figures 5 to 7 show that the level of protection in groups A1 and A2 is similar to or even better than that observed in the reference group (LT). These are the groups that received the urease doses in the presence of QS-21 and Bay RI 005 respectively.
  • Group A3 DC-chol
  • group A4 PCPP
  • SC subcutaneous
  • OF1 mice were infected with 10 6 plaque-forming colonies (cfu) of the H. strain. pylori ORV2001. After one month, it was verified that the infection was well established by randomly sacrificing 10/100 mice and testing urease activity on a quarter of the entire stomach. The results being all positive, we then immunized mice (10 per group) 3 times at 3 weeks apart, either subcutaneously using 10 ⁇ g of recombinant urease adjuvant with 15 ⁇ g of QS21 (Aquila) or 400 ⁇ g of Bay R1005 adjuvant (Bayer), or orally using 40 ⁇ g of urease mixed with 1 ⁇ g of LT.
  • immunization was performed either in the neck, to reach the lymph nodes in the upper region of the body, or in the lumbar region, to reach the abdominal lymph nodes.
  • Ten mice were left uninfected and unimmunized (negative control), while mice in the positive control group received saline, QS21 or Bay adjuvant subcutaneously (lumbar region).
  • mice Performing histopathology on these same mice did not reveal any greater gastritis compared to the controls.
  • protected mice had a high serum level of the two isotypes IgGl and IgG2, which is representative of a balanced Th2 / Thl response.
  • mice immunized subcutaneously in the lumbar region had the highest serum IgA levels, demonstrating a mucosal response.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

The invention concerns the use of an immunogenic agent derived from Helicobacter, associated with an adjuvant such as QS-21, DC-chol or Bay R1005, for making a pharmaceutical composition designed to induce an immune response of the T helper 1 type (Th1), for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal.

Description

Composition vaccinale anû-Helicobacter comprenant un adjuvant de type Thl Anû-Helicobacter vaccine composition comprising a Thl type adjuvant
La présente invention a pour objet l'usage particulier d'une préparation vaccinale destinée à induire chez un mammifère, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un organisme pathogène infectant des muqueuses, notamment à l'encontre des bactéries Helicobacter.The present invention relates to the particular use of a vaccine preparation intended to induce in a mammal, a protective immune response against a pathogenic organism infecting mucous membranes, in particular against the Helicobacter bacteria.
Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien qu'H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Helicobacter, Gastrospirillum hominis a également été décrite chez l'homme.Helicobacter is a bacterial genus characterized by gram negative spiral bacteria. Several species colonize the gastrointestinal tract of mammals. We cite in particular H. pylori, H. heilmanii, H. felis and H. mustelae. Although H. pylori is the species most commonly associated with human infections, in some rare cases, H. heilmanii and H. felis have been isolated from humans. A Helicobacter type bacterium, Gastrospirillum hominis has also been described in humans.
Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement ; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.Helicobacter infects more than 50% of the adult population in developed countries and almost 100% of that of developing countries; making it one of the predominant infectious agents worldwide.
H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.H. pylori is found exclusively to date on the surface of the stomach lining in humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Furthermore, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H. pylori.
Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à Helicobacter.It therefore seems highly desirable to develop a vaccine to prevent or treat Helicobacter infections.
A ce jour, plusieurs protéines à! Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et la méthode de vaccination qui est couramment préconisée consiste à délivrer l'antigène au niveau de la muqueuse gastrique, c'est-à-dire à l'endroit même où la réponse immune est souhaitée. Pour ce faire, l'administration par voie orale a donc été retenue. autre que la muqueuse gastrique ; tel que par exemple la muqueuse nasale ou rectale (WO 96/31235). Des lymphocytes stimulés par l'antigène en un territoire muqueux dit inducteur peuvent migrer et circuler de manière sélective pour aller induire une réponse immunitaire en d'autres territoires muqueux, dits effecteurs.To date, several proteins to! Helicobacter have already been proposed as a vaccine antigen and the vaccination method which is commonly recommended consists of delivering the antigen to the gastric mucosa, that is to say to the very place where the immune response is desired. To do this, oral administration was therefore chosen. other than the gastric mucosa; such as for example the nasal or rectal mucosa (WO 96/31235). Lymphocytes stimulated by the antigen in a so-called inducing mucous territory can migrate and circulate selectively to induce an immune response in other mucous territories, known as effectors.
Une variante de ces méthodes consiste à effectuer une primo-immunisation par voie systémique avant d'administrer l'antigène par voie nasale.A variant of these methods consists in carrying out a primary immunization by the systemic route before administering the antigen by the nasal route.
Pour administration par voie muqueuse, l'antigène, le plus souvent un lysat bactérien ou une protéine purifiée, est associé à un adjuvant approprié comme la toxine cholérique (CT) ou la heat-labile toxine (LT) d'E. coli.For mucosal administration, the antigen, most often a bacterial lysate or a purified protein, is combined with an appropriate adjuvant such as cholera toxin (CT) or heat-labile toxin (LT) of E. coli.
Lorsque l'administration par voie muqueuse est mise en oeuvre, la réponse humorale que l'on observe, est de manière prédominante de type IgA. Ceci indique bien qu'il y a eu une réponse immunitaire locale.When mucosal administration is carried out, the humoral response which is observed is predominantly of the IgA type. This indicates that there was a local immune response.
Certains auteurs ont pensé très tôt qu'il existait une bonne corrélation entre une forte réponse de type IgA et un effet protecteur (Czinn et al, Vaccine (1993) _ : 637). D'autres ont émis un avis plus réservé (Bogstedt et al, Clin. Εxp. Immunol. (1996) 105 : 202). Bien qu'il n'existe pas à ce jour de véritable certitude concernant ce sujet, l'induction d'anticorps qui soient notamment de type IgA, apparaît quoi qu'il en soit souhaitable pour la plupart des auteurs.Some authors thought very early on that there was a good correlation between a strong IgA-type response and a protective effect (Czinn et al, Vaccine (1993) _: 637). Others have expressed a more reserved opinion (Bogstedt et al, Clin. Εxp. Immunol. (1996) 105: 202). Although there is to date no real certainty concerning this subject, the induction of antibodies which are in particular of the IgA type, appears whatever is desirable for most of the authors.
De manière générale, l'apparition des IgA témoigne de la mise en oeuvre d'une réponse de la part des lymphocytes T-helper de type 2 (réponse Th2).In general, the appearance of IgA indicates the implementation of a response from T-helper type 2 lymphocytes (Th2 response).
En effet, la stimulation des lymphocytes T-helper par un antigène particulier permet d'obtenir différentes sous-populations de cellules T-helper, caractérisées par des profils de synthèse de cyto ines différents.Indeed, the stimulation of T-helper lymphocytes by a particular antigen makes it possible to obtain different sub-populations of T-helper cells, characterized by different synthesis profiles of cyto ines.
Les cellules Thl produisent notamment de manière sélective l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron-γ (IFN-γ), tandis que les cellules Th2 sécrètent de préférence l'IL-4, -5, et -10. En raison de leur production différentiée de cytokines, ces deux types de cellules T-helper ont des rôles distincts : les cellules Thl favorisent l'immunité à médiation cellulaire i.a. une réponse de type inflammatoire, tandis que les cellules Th2 stimulent la réponse humorale de type IgA, IgE et de certaines sous- classes d'IgG. On sait aussi que les cytokines produites par des cellules Thl de souris peuvent stimuler la réponse anticorps et en particulier que l'IFN-γ induit une réponse IgG2a.Thl cells in particular selectively produce interleukin-2 (IL-2) and interferon-γ (IFN-γ), while Th2 cells preferably secrete IL-4, -5, and -10 . Due to their differentiated production of cytokines, these two types of T-helper cells have distinct roles: Thl cells promote cell-mediated immunity ia an inflammatory response, while Th2 cells stimulate the humoral response IgA, IgE and certain subclasses of IgG. We also know that cytokines produced by mouse Thl cells can stimulate the antibody response and in particular that IFN-γ induces an IgG2a response.
Ainsi, des différentes études de l'art antérieur, émerge l'opinion selon laquelle l'induction d'une réponse Th2 caractérisée par l'apparition d'IgA est indispensable, sinon suffisante, afin d'obtenir un effet protecteur.Thus, from various studies of the prior art, the opinion emerges that the induction of a Th2 response characterized by the appearance of IgA is essential, if not sufficient, in order to obtain a protective effect.
De manière surprenante, on a maintenant découvert que, même si une réponse Th2 ne nuit pas, il est aussi nécessaire d'induire une forte réponse Thl. En effet, des résultats expérimentaux démontrent maintenant qu'un effet protecteur peut être corrélé plus aisément avec une réponse Thl qu'avec une réponse Th2.Surprisingly, we have now discovered that, even if a Th2 response does not harm, it is also necessary to induce a strong Th1 response. Indeed, experimental results now demonstrate that a protective effect can be correlated more easily with a Th1 response than with a Th2 response.
Contrairement à ce qui était initialement recherché (D'Elios et al, J. Immunol. (1997) 158 : 962), la présente demande révèle donc l'importance d'induire une réponse Thl de type inflammatoire au moment de l'immunisation, sans laquelle on ne peut observer d'effet protecteur.Contrary to what was initially sought (D'Elios et al, J. Immunol. (1997) 158: 962), the present application therefore reveals the importance of inducing an Thl response of the inflammatory type at the time of immunization, without which no protective effect can be observed.
On peut parvenir à induire une réponse Thl à l'encontre ^Helicobacter en jouant sur un certain nombre de facteurs, comme par exemple le type d'adjuvant. On a en effet mis en évidence qu'en utilisant certains adjuvants on peut obtenir un taux de protection similaire ou supérieur à celui observé lorsque l'on utilise la voie muqueuse et des adjuvants tels que les toxines bactériennes.One can manage to induce a Thl response against ^ Helicobacter by playing on a certain number of factors, such as for example the type of adjuvant. It has indeed been demonstrated that by using certain adjuvants it is possible to obtain a protection rate similar or greater than that observed when the mucosal route is used and adjuvants such as bacterial toxins.
En conséquence, la présente invention a pour objetConsequently, the subject of the present invention is
(a) L'usage conjoint d'un agent immunogène dérivé d 'Helicobacter et d'un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T- helper 1 (Thl) à l'encontre ^Helicobacter, dans la fabrication d'un médicament destiné à être administrée par voie systémique pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter.(a) The joint use of an immunogenic agent derived from Helicobacter and a compound capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against ^ Helicobacter, in the manufacture of a medicament intended to be administered systemically to prevent or treat a Helicobacter infection.
(b) Une composition pharmaceutique qui comprend un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et au moins un composé (capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T-helper 1 (Thl) à l'encontre d'Helicobacter) sélectionné parmi :(b) A pharmaceutical composition which comprises an immunogenic agent derived from Helicobacter and at least one compound (capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against Helicobacter) selected among:
(i) des saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria ; (ii) des lipides cationiques ou un sel de ces derniers ; lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires, à condition que ces lipides ne soient pas présentés sous forme de liposomes lorsque ladite composition ne contient pas de saponine ni de glycolipopeptide de formule (I) ; et(i) saponins purified from an extract of Quillaja saponaria; (ii) cationic lipids or a salt thereof; said lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines, provided that these lipids are not presented in the form of liposomes when said composition does not contain saponin or glycolipopeptide of formula (I); and
(iii) des glycolipopeptides de formule (I) :(iii) glycolipopeptides of formula (I):
dans laquelle :
Figure imgf000006_0001
in which :
Figure imgf000006_0001
R' représente un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone, de préférence 1 à 20 atomes de carbone,R ′ represents a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and comprising from 1 to 50 carbon atoms, preferably 1 to 20 carbon atoms,
X représente -CH2-, -O- ou -NH-,X represents -CH 2 -, -O- or -NH-,
R2 représente un atome d'hydrogène ou un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone,de préférence 1 à 20 atomes de carbone,R 2 represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and comprising from 1 to 50 carbon atoms, preferably 1 to 20 carbon atoms,
R3, R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste acyl-CO-R6, dans lequel R6 représente un reste alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone,R 3 , R 4 and R 5 each represent, independently of one another, a hydrogen atom or an acyl-CO-R 6 residue, in which R 6 represents an alkyl residue having from 1 to 10 atoms carbon,
R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en CrC7, hydroxyméthyle, 1-hydroxyéthyle, mercaptoméphyle, 2- (méthylthio)-éthyle, 3-aminopropyle, 3-uréido-propyle, 3- guanidylpropyle, 4-aminobutyle, carboxyméthyle, carbamoylméthyle, 2-carboxéthyle, 2-carbamoyléthyle, benzyle, 4-hydroxybenzyle, 3-indolylméthyle ou 4- imidazolylméthyle,R 7 represents a hydrogen atom, a C r C 7 alkyl group, hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, mercaptomephyl, 2- (methylthio) -ethyl, 3-aminopropyl, 3-ureido-propyl, 3-guanidylpropyl, 4- aminobutyl, carboxymethyl, carbamoylmethyl, 2-carboxethyl, 2-carbamoylethyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, 3-indolylmethyl or 4-imidazolylmethyl,
R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, etR 8 represents a hydrogen atom or a methyl group, and
R9 représente un atome d'hydrogène, un groupe acétyle, benzoyle, trichloracétyle, trifluoracétyle, méthoxycarbonyle, t- butyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, etR 9 represents a hydrogen atom, an acetyl, benzoyl, trichloracetyl, trifluoroacetyl, methoxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl group, and
R7 et R8 peuvent, quand ils sont pris ensemble, représenter un groupeR 7 and R 8 can, when taken together, represent a group
-CH7-CH7-CH->-.-CH 7 -CH 7 -CH- > -.
(c) L'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'au moins un composé sélectionné parmi les composés (i) à (iii) cités ci dessus, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique capable d'induire une réponse immune de type T-helper 1 (Thl) à l'encontre d'Helicobacter ; et(c) The use of an immunogenic agent derived from Helicobacter and of at least one compound selected from the compounds (i) to (iii) mentioned above, in the manufacture of a pharmaceutical composition capable of inducing T-helper 1 (Thl) immune response against Helicobacter; and
(d) Une méthode pour prévenir ou traiter une infection promue par un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g., une infection à Helicobacter, selon laquelle on administre au mammifère par voie systémique, en une ou plusieurs fois, une composition contenant au moins un agent immunogène dérivé dudit microorganisme e.g. d'Helicobacter et au moins un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T-helper 1 (Thl) à l'encontre e.g., d'Helicobacter.(d) A method for preventing or treating an infection promoted by a microorganism capable of infecting the gastro-duodenal mucosa of a mammal eg, a Helicobacter infection, according to which the mammal is administered systemically, in one or more times , a composition containing at least one immunogenic agent derived from said microorganism eg from Helicobacter and at least one compound capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against eg, Helicobacter .
(e) Une méthode pour prévenir ou traiter une infection promue par un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g., une infection à Helicobacter, selon laquelle on administre au mammifère, en une ou plusieurs fois, une composition contenant au moins un agent immunogène dérivé dudit microorganisme e.g. d'Helicobacter et au moins un composé sélectionné parmi les composés (i) à (iii) cités ci dessus, et par laquelle une réponse immunitaire de type Thl est induite à l'encontre e.g. d'Helicobacter.(e) A method for preventing or treating an infection promoted by a microorganism capable of infecting the gastro-duodenal mucosa of a mammal, eg a Helicobacter infection, according to which a composition is administered to the mammal, in one or more times containing at least one immunogenic agent derived from said microorganism eg from Helicobacter and at least one compound selected from the compounds (i) to (iii) mentioned above, and by which an Thl type immune response is induced against eg d 'Helicobacter.
On peut mettre en évidence l'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention en estimant l'importance relative de la réponse Thl par rapport à la réponse Th2, en comparant par exemple les taux d'IgG2a et d'IgGl induits chez la souris à l'encontre d'Helicobacter, qui témoignent respectivement de la mise en oeuvre des réponses Thl et Th2. En effet, la réponse Thl que l'on recherche est généralement accompagnée d'une réponse Th2. Néanmoins, on considère que la réponse Th2 ne doit pas être significativement prédominante par rapport à la réponse Thl . Les taux d'IgG2a et d'IgGl induits chez la souris peuvent être appréciés de manière conventionnelle à l'aide d'un test ELISA, à condition que les tests utilisés pour chacun des deux sous isotypes soient de même sensibilité et en particulier que les anticorps anti-IgG2a et anti-IgG 1 soient de même affinité.The induction of a Th1 response useful for the purposes of the present invention can be demonstrated by estimating the relative importance of the Th1 response with respect to the Th2 response, by comparing for example the levels of IgG2a and IgGl induced in mice against Helicobacter, which respectively demonstrate the implementation of the Th1 and Th2 responses. Indeed, the Thl response that one seeks is generally accompanied by a Th2 response. However, it is considered that the Th2 response should not be significantly predominant compared to the Th1 response. The levels of IgG2a and IgG1 induced in mice can be assessed in a conventional manner using an ELISA test, provided that the tests used for each of the two sub-isotypes are of the same sensitivity and in particular that the anti-IgG2a and anti-IgG 1 antibodies have the same affinity.
Les quantités d'IgG2a et d'IgGl peuvent être notamment mesurées à l'aide d'un test ELISA identique ou similaire à celui décrit ci-après. Les puits d'une plaque ELISA en polycarbonate sont enduits avec 100 μl d'un extrait bactérien d'Helicobacter e.g. H. pylori à environ 10 μg/ml dans du tampon carbonate. La plaque ELISA est incubée 2 heures à 37°C puis une nuit à 4°C. La plaque est lavée avec du tampon PBS (phosphate buffer saline) contenant 0.05 % de Tween 20 (tampon PBS / Tween). Les puits sont saturés avec 250 μl de PBS contenant 1 % de sérum albumine bovine afin d'empêcher la liaison non-spécifique des anticorps. Après une heure d'incubation à 37°C, la plaque est lavée avec le tampon PBS / Tween. L'antisérum prélevé chez la souris, un certain nombre de jours après que cette dernière ait reçu la composition destinée à l'induction d'une réponse immune de type Thl à l'encontre d'Helicobacter, est dilué en série dans du tampon PBS / Tween. 100 μl des dilutions sont ajoutés dans les puits. La plaque est incubée 90 minutes à 37°C, lavée et évaluée selon des procédures standard. Par exemple, on utilise un anticorps de chèvre anti-IgG2a ou anti-IgGl de souris couplé à une enzyme telle que la peroxydase. L'incubation en présence de cet anticorps est poursuivie 90 minutes à 37°C. On lave la plaque puis la réaction est développée avec le substrat approprié (par exemple de l'O-phenyldiamine dihydrochloride lorsque l'enzyme utilisée est la peroxydase). La réaction est évaluée par colorimétrie (en mesurant l'absorbance par spectrophotométrie). Le titre de l'antisérum en IgG2a ou en IgG l correspond à l'inverse de la dilution donnant une absorbance de 1,5 à 490 nm.The amounts of IgG2a and IgG1 can in particular be measured using an ELISA test identical or similar to that described below. The wells of a polycarbonate ELISA plate are coated with 100 μl of a bacterial extract of Helicobacter e.g. H. pylori at approximately 10 μg / ml in carbonate buffer. The ELISA plate is incubated for 2 hours at 37 ° C and then overnight at 4 ° C. The plate is washed with PBS buffer (phosphate buffered saline) containing 0.05% of Tween 20 (PBS / Tween buffer). The wells are saturated with 250 μl of PBS containing 1% bovine serum albumin in order to prevent the non-specific binding of the antibodies. After one hour of incubation at 37 ° C, the plate is washed with PBS / Tween buffer. The antiserum taken from the mouse, a certain number of days after the latter has received the composition intended for the induction of an immune response of the Th1 type against Helicobacter, is diluted in series in PBS buffer. / Tween. 100 μl of the dilutions are added to the wells. The plate is incubated for 90 minutes at 37 ° C, washed and evaluated according to standard procedures. For example, a goat anti-IgG2a or anti-mouse IgG1 antibody coupled to an enzyme such as peroxidase is used. Incubation in the presence of this antibody is continued for 90 minutes at 37 ° C. The plate is washed and the reaction is developed with the appropriate substrate (for example O-phenyldiamine dihydrochloride when the enzyme used is peroxidase). The reaction is evaluated by colorimetry (by measuring the absorbance by spectrophotometry). The titer of the antiserum in IgG2a or in IgG1 corresponds to the reverse of the dilution giving an absorbance of 1.5 to 490 nm.
L'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention est marquée par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgGl chez la souris qui doit être supérieur à 1/100, 1/50 ou 1/20, avantageusement supérieur à 1/10, de préférence supérieur à 1/3, de manière tout à fait préférée, supérieur à 1/2, 5 ou 10. Lorsque ce rapport est aux alentours de 1, on parle alors de réponse Thl / Th2 mixte ou équilibrée. Lorsque le rapport est supérieur ou égal à 5, on peut alors parler de réponse Thl prépondérante.The induction of a Th1 response useful for the purposes of the present invention is marked by a ratio of ELISA titers IgG2a: IgG1 in mice which must be greater than 1/100, 1/50 or 1/20, advantageously greater than 1 / 10, preferably greater than 1/3, most preferably, greater than 1/2, 5 or 10. When this ratio is around 1, we then speak of a mixed Thl / Th2 response or balanced. When the ratio is greater than or equal to 5, we can then speak of a preponderant Thl response.
L'obtention d'une réponse Thl (ou Th2) chez la souris est prédictive d'une réponse Thl (ou Th2) chez l'homme. Bien qu'il soit plus facile d'évaluer le type de réponse chez la souris, on peut le faire également chez l'homme en mesurant les taux des cytokines spécifiques de la réponse Thl d'une part et d'autre part de la réponse Th2, qui sont induites subséquemment. Les réponses Thl et Th2 peuvent être évaluées directement chez l'homme l'une par rapport à l'autre sur la base des taux de cytokines spécifiques des deux types de réponse (voir ci-dessus) e.g., sur la base du rapport IFN-γ / IL-4.Obtaining a Th1 (or Th2) response in mice is predictive of a Th1 (or Th2) response in humans. Although it is easier to assess the type of response in mice, it can also be done in humans by measuring the levels of cytokines specific for the Th1 response on the one hand and on the other hand the response Th2, which are subsequently induced. Thl and Th2 responses can be evaluated directly in humans relative to each other based on the specific cytokine levels of the two response types (see above) eg, based on the IFN- γ / IL-4.
Alternativement, si la méthode de dosage décrite ci-dessus est mise en oeuvre, on peut prévoir que le titre ELISA qui reflète la quantité d'IgG2a, doit être égal ou supérieur à 10 000, de préférence égal ou supérieur à 100 000, de manière particulièrement préférée égal ou supérieur à 1 000 000 ; ceci signifie alors que la réponse Thl est significative.Alternatively, if the assay method described above is used, it can be provided that the ELISA titer, which reflects the amount of IgG2a, must be equal to or greater than 10,000, preferably equal to or greater than 100,000, of particularly preferably equal to or greater than 1,000,000; this then means that the Thl response is significant.
Le mammifère auquel est destinée la composition pharmaceutique ou la méthode est avantageusement un primate, de préférence un humain.The mammal for which the pharmaceutical composition or method is intended is advantageously a primate, preferably a human.
Des saponines utiles aux fins de la présente invention sont notamment décrites dans le brevet US N° 5,057,540 par référence non à leurs structures mais aux fractions dans lesquelles elles sont présentes après fractionnement d'un extrait aqueux de l'écorce de Quillaja saponaria Molina, par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie à basse pression sur silice. En particulier on cite les fractions QA-7, QA-17, QA-18 et QA-21 aussi dénommée QS-21. L'usage de cette dernière est particulièrement avantageux. Le QS-21 est connu pour être un adjuvant qui favorise l'induction d'une réponse immune majoritairement de type Thl . On parle alors d'adjuvant de type Thl .Saponins useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Pat. No. 5,057,540 with reference not to their structures but to the fractions in which they are present after fractionation of an aqueous extract of the bark of Quillaja saponaria Molina, by high pressure liquid chromatography (HPLC) and low pressure chromatography on silica. In particular, the fractions QA-7, QA-17, QA-18 and QA-21, also known as QS-21, are cited. The use of the latter is particularly advantageous. QS-21 is known to be an adjuvant which promotes the induction of an immune response mainly of the Thl type. We then speak of Thl type adjuvant.
Des lipides cationiques utiles aux fins de la présente invention sont notamment décrits dans le brevet US N° 5,283,185. A titre d'exemple, on cite le iodure de cholesteryl-3β-carboxyl-amido-ethylenetrimethylammonium, le iodure de 1- dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl carboxylate, le iodure de cholesteryl-3β-carboxyamidoethyleneamine, le iodure de cholesteryl-3β- oxysyccinamidoethylenetrimethylammonium, le iodure de l-dimethylamino-3- trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinate, le iodure de 2-[(2- trimethylammonio)-ethylmethylamino] ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinate, le 3β-[N- (polyethyleneimine)-carbamoyl] cholestérol, et le 3β [N-(N', N'- dimethylaminoethane) carbamoyl] cholestérol (DC-chol) ou un sel de ce dernier. Le DC-chol (ou sa forme saline) est connu pour être un adjuvant qui favorise l'induction d'une réponse équilibrée mixte de type Thl / Th2. On parle alors d'adjuvant de type Thl / Th2 ou Thl + Th2.Cationic lipids useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Patent No. 5,283,185. By way of example, mention is made of cholesteryl-3β-carboxyl-amido-ethylenetrimethylammonium iodide, 1- dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl carboxylate iodide, cholesteryl-3β-carboxyamidoethyleneamine iodide, cholesteryl-3β-oxysyccinamidoethylenetrimethylammonium iodide, l-dimethylamino-3- iodide trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinate, iodide of 2 - [(2- trimethylammonio) -ethylmethylamino] ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinate, 3β- [N- (polyethyleneimine) -carbamoyl] cholesterol, and 3β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DC-chol) or a salt thereof. DC-chol (or its saline form) is known to be an adjuvant which promotes the induction of a balanced balanced response of the Thl / Th2 type. We then speak of a Thl / Th2 or Thl + Th2 type adjuvant.
Ces lipides cationiques peuvent être utilisés en dispersion ou bien mis sous forme de liposomes. Des liposomes peuvent être réalisés comme cela est décrit dans le brevet US N° 5,283,185, en associant les lipides cationiques avec un phospholipide neutre e.g., la phosphatidylcholine ou la phosphatidylethanolamine.These cationic lipids can be used in dispersion or else put in the form of liposomes. Liposomes can be produced as described in US Pat. No. 5,283,185, by combining the cationic lipids with a neutral phospholipid e.g., phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine.
Des glycolipopeptides utiles aux fins de la présente invention sont notamment décrits dans le brevet US N° 4,855,283 et EP 206,037. Il s'agit en particulier des glycolipides de formule générale (I) dans laquelle un reste de sucre est un reste 2- amino-2-désoxy-D-glucose ou 2-amino-2-désoxy-D-galactose. Le groupe 2-amino de l'amino-sucre peut être lié à la glycine, la sarcosine, l'acide hippurique, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la serine, la thréonine, la cystéine, la méthionine, l'ornithine, la citrulline, l'arginine, l'acide aspartique, l'asparagine, l'acide glutamique, la glutamine, la phénylalanine, la tyrosine, la proline, le tryptophane ou l'histidine sous forme D ou L ou avec des acides aminocarboxyliques comme l'acide oc- aminobutyrique, l'acide cc-aminovalérianique, l'acide cc-aminocaproïque ou l'acide ocGlycolipopeptides useful for the purposes of the present invention are described in particular in US Patent No. 4,855,283 and EP 206,037. These are in particular glycolipids of general formula (I) in which a sugar residue is a 2-amino-2-deoxy-D-glucose or 2-amino-2-deoxy-D-galactose residue. The 2-amino group of the amino sugar can be linked to glycine, sarcosine, hippuric acid, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, ornithine, citrulline, arginine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, phenylalanine, tyrosine, proline, tryptophan or histidine in D or L form or with aminocarboxylic acids such as ocaminobutyric acid, cc-aminovaleranic acid, cc-aminocaproic acid or oc acid
-aminoheptanoïque sous forme D ou sous forme L.-aminoheptanoic in D form or in L form.
Plus particulièrement, on cite les glycolipopeptides suivants : N-(2-glycinamido-2-déoxy-β-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyldodecanoyl- amide, N-(2-glycinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyl-actadecanoylamide, N-(2-glycinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-tetradecyl-dodecanoylamide, N-(2-L-alaninamido-2deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyl-dodecanoylamide, N-(2-D-alanimamido-2deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyl-octadecanoylamide, N-(2-L-phenylalaninamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyl-octadecanoyl- amide, N-(2-L-valinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoylamide, N-(2-L-valinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-octadecyl-tetradecanoylamide, N-(2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-dodecyl-dodecanoylamide, N-(2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005), et N-(2-sarcosinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-N-octadecyl-dodecanoylamide.More particularly, the following glycolipopeptides are cited: N- (2-glycinamido-2-deoxy-β-deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-dodecyldodecanoyl- amide, N- (2-glycinamido-2-deoxy-β- D-glucopyranosyl) -N-dodecyl-actadecanoylamide, N- (2-glycinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-tetradecyl-dodecanoylamide, N- (2-L-alaninamido-2deoxy-β-D- glucopyranosyl) -N-dodecyl-dodecanoylamide, N- (2-D-alanimamido-2deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-dodecyl-octadecanoylamide, N- (2-L-phenylalaninamido-2-deoxy-β-D- glucopyranosyl) -N-dodecyl-octadecanoyl- amide, N- (2-L-valinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-octadecyldodecanoylamide, N- (2-L-valinamido-2-deoxy-β- D-glucopyranosyl) -N-octadecyl-tetradecanoylamide, N- (2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-dodecyl-dodecanoylamide, N- (2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) -N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005), and N- (2-sarcosinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) - N-octadecyl-dodecanoylamide.
Une composition selon l'invention peut contenir un ou plusieurs composés précédemment cités. Selon un mode avantageux, on utilise deux composés ; (a) l'un étant sélectionné parmi les saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria et (b) l'autre étant sélectionné (i) soit parmi des lipides cationiques ou un sel de ces derniers, lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires, (ii) soit parmi les glycolipeptides de formule (I). A titre d'exemple on cite les mélanges QS21 + DC-Chol et QS-21 + Bay RI 005.A composition according to the invention may contain one or more previously mentioned compounds. According to an advantageous mode, two compounds are used; (a) one being selected from saponins purified from an extract of Quillaja saponaria and (b) the other being selected (i) either from cationic lipids or a salt thereof, said lipids being inhibitors weak in protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 atoms carbon, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines, (ii) or from the glycolipeptides of formula (I). By way of example, the mixtures QS21 + DC-Chol and QS-21 + Bay RI 005 are cited.
D'autres adjuvants capable de favoriser une réponse immune de type Thl (c'est-à-dire des adjuvants de type Thl ou Thl / Th2) existent dans l'état de la technique parmi lesquels l'homme du métier est capable de sélectionner celui qui correspond le mieux à ses besoins. A titre indicatif, on cite notamment les liposomes ; les ISCOMS ; les microsphères ; les chochléates protéiques ; les vésicules formées de surfactants non-ioniques ; les dispersions d'amphiphiles cationiques dans de l'eau ; les émulsions huile/eau ; le muramidyldipeptide (MDP) et ses dérivés tels que le glucosyl muramidyldipeptide (GMDP), le thréonyl-MDP, le murametide et la murapalmitine ; ainsi que divers autres composés tels que le monophosphoryl-lipide A (MPLA) lipopolysaccharide majeur de la paroi d'une bactérie, par exemple d'E. coli, de Salmonella minnesota, de Salmonella typhimiirium ou de Shigella βexneri ; l'algane-glucane ; la gamma-inuline ; le calcitriol et la loxoribine.Other adjuvants capable of promoting a Thl type immune response (that is to say adjuvants of the Thl or Thl / Th2 type) exist in the prior art from which the person skilled in the art is able to select the one that best suits their needs. As an indication, liposomes are mentioned in particular; ISCOMS; microspheres; protein chochleates; vesicles formed from nonionic surfactants; dispersions of cationic amphiphiles in water; oil / water emulsions; muramidyldipeptide (MDP) and its derivatives such as glucosyl muramidyldipeptide (GMDP), threonyl-MDP, murametide and murapalmitine; as well as various other compounds such as the monophosphoryl-lipid A (MPLA) major lipopolysaccharide of the wall of a bacterium, for example of E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimiirium or Shigella βexneri; algan-glucan; gamma-inulin; calcitriol and loxoribine.
Des liposomes utiles aux fins de le présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi des liposomes pH-sensibles tels que ceux formés par mélange de d'hémisuccinate de cholestérol (CHΕMS) et de dioleyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE) ; des liposomes contenant des lipides cationiques reconnus pour leurs propriétés fusiogènes, tels que le 3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)- carbamoyl) cholestérol (DC-chol) et ses équivalents décrits dans le brevet US N° 5,283,185 et WO 96/14831 ou un sel de ceux-ci, le bromure de dimethyldioctadecylammonium (DDAB) et les composés BAY décrits dans EP 91645 et EP 206 037, par exemple le Bay R1005 (N-(2-desoxy-2-L-leucylamino- bétâ-D-glucopyranosyl)-N-octadecyl dodecanoylamide acétate ; et des liposomes contenant du MTP-PE, un dérivé lipophile du MDP (muramidyldipeptide). Ces liposomes sont utiles pour adjuvanter tous les agents immunogènes cités.Liposomes useful for the purposes of the present invention can be selected in particular from pH-sensitive liposomes such as those formed by mixing cholesterol hemisuccinate (CHΕMS) and dioleyl phosphatidyl ethanolamine (DOPE); liposomes containing cationic lipids known for their fusiogenic properties, such as 3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) - carbamoyl) cholesterol (DC-chol) and its equivalents described in US Patent No. 5,283,185 and WO 96/14831 or a salt thereof, dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and the BAY compounds described in EP 91645 and EP 206,037, for example Bay R1005 (N- (2-desoxy-2-L-leucylamino-beta-D-glucopyranosyl) -N-octadecyl dodecanoylamide acetate; and liposomes containing MTP-PE, a lipophilic derivative MDP (muramidyldipeptide) These liposomes are useful for adjuvanting all the immunogenic agents mentioned.
Des ISCOMs utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi les ceux composés de QuilA ou de QS-21 associé à du cholestérol et éventuellement aussi à un phospholipide tel que la phosphatidylcholine. Ceux ci sont particulièrement intéressants pour la formulation des antigènes lipides.ISCOMs useful for the purposes of the present invention can be selected in particular from those composed of QuilA or QS-21 associated with cholesterol and optionally also with a phospholipid such as phosphatidylcholine. These are particularly interesting for the formulation of lipid antigens.
Des microsphères utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment formés à partir de composés tels que le polylactide-co-glycolide (PLAGA), l'alginate, le chitosan, le polyphosphazène et de nombreux autres polymères.Microspheres useful for the purposes of the present invention can in particular be formed from compounds such as polylactide-co-glycolide (PLAGA), alginate, chitosan, polyphosphazene and many other polymers.
Des chochléates protéiques utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnés parmi ceux formés à partir de cholestérol et éventuellement d'un phospholipide additionnel tel que la phosphatidylcholine Ceux-ci sont surtout intéressants pour la formulation des antigènes lipides.Protein chochleates useful for the purposes of the present invention can in particular be selected from those formed from cholesterol and optionally from an additional phospholipid such as phosphatidylcholine. These are especially advantageous for the formulation of lipid antigens.
Des vésicules formées de surfactants non-ioniques utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment formées par un mélange de 1-monopalmitoyl glycérol de cholestérol et de dicetylphosphate. Elles sont une alternative aux liposomes classiques et peuvent être utilisées pour la foπnulation de tous les agents immuno -,gt>èv-nes cités.Vesicles formed from nonionic surfactants useful for the purposes of the present invention can in particular be formed by a mixture of 1-monopalmitoyl glycerol of cholesterol and of dicetylphosphate. They are an alternative to conventional liposomes and can be used for the formulation of all the immuno - , gt> è v -nes agents mentioned.
Des émulsions huile/eau utiles aux fins de la présente invention peuvent être notamment sélectionnées parmi le MF59 (Biocine-Chiron), le SAF1 (Syntex) et les montanides ISA51 et ISA720 (Seppic).Oil / water emulsions useful for the purposes of the present invention can in particular be selected from MF59 (Biocin-Chiron), SAF1 (Syntex) and the montanides ISA51 and ISA720 (Seppic).
L'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est avantageusement sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée.The immunogenic agent derived from Helicobacter is advantageously selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a peptide and a polypeptide of Helicobacter in purified form.
Aux fins de la présente invention, une préparation de bactéries inactivées peut être obtenue selon des méthodes conventionnelles bien connues de l'homme de l'art. Il en est de même d'un lysat bactérien. Une dose de bactéries inactivées ou de lysat cellulaire, appropriée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, peut être déterminée par l'homme de l'art et dépend d'un certain nombre de facteurs tel que l'individu auquel est destiné le vaccin e.g., âge, de l'antigène lui-même, de la voie et du mode d'administration, de la présence/absence ou du type d'adjuvant, ainsi que cela peut être déterminé par l'homme de l'art. D'une manière générale, on indique qu'une dose appropriée est d'environ 50 μg à 1 mg à environ 1 mg, de lysat.For the purposes of the present invention, a preparation of inactivated bacteria can be obtained according to conventional methods well known to those skilled in the art. The same is true of a bacterial lysate. A dose of inactivated bacteria or lysate cell, suitable for prophylactic or therapeutic purposes, can be determined by those skilled in the art and depends on a number of factors such as the individual for whom the vaccine is intended, eg, age, of the antigen itself likewise, the route and mode of administration, the presence / absence or the type of adjuvant, as can be determined by those skilled in the art. In general, it is indicated that an appropriate dose is from about 50 μg to 1 mg to about 1 mg, of lysate.
Un peptide ou un polypeptide dérivé d'Helicobacter peut être purifié à partir d'Helicobacter ou obtenu par les techniques du génie génétique ou bien encore par synthèse chimique. Ce dernier procédé est avantageux dans le cas des peptides. On appelle "peptide" toute chaîne d'acides aminés dont la taille est inférieure à environ 50 acides aminés. Lorsque la taille est supérieure, on utilise le terme de "polypeptide" qui est aussi interchangable avec le terme "protéine". Un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à celui existant dans les conditions naturelles. Il est similaire en ce qu'il est capable d'induire une réponse immune de la même nature mais il peut comporter certaines variations structurelles comme par exemple une mutation, l'adjonction d'un résidu de nature lipidique ou bien être sous forme de peptide ou de polypeptide de fusion.A peptide or a polypeptide derived from Helicobacter can be purified from Helicobacter or obtained by the techniques of genetic engineering or even by chemical synthesis. The latter method is advantageous in the case of peptides. Any chain of amino acids whose size is less than about 50 amino acids is called a "peptide". When the size is greater, the term "polypeptide" is used which is also interchangeable with the term "protein". A peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention can be identical or similar to that existing under natural conditions. It is similar in that it is capable of inducing an immune response of the same nature but it may include certain structural variations such as for example a mutation, the addition of a residue of lipid nature or else be in the form of a peptide. or fusion polypeptide.
Une dose du peptide ou du polypeptide, appropriée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, peut être déterminée par l'homme de l'art et dépend d'un certain nombre de facteurs tel que l'individu auquel est destiné le vaccin e.g., âge, de l'antigène lui-même, de la voie et du mode d'administration, de la présence/absence ou du type d'adjuvant, ainsi que cela peut être déterminé par l'homme de l'art. D'une manière générale, on indique qu'une dose appropriée est d'environ 10 μg à environ.1 mg, de préférence à environ 100 μg.A dose of the peptide or of the polypeptide, suitable for prophylactic or therapeutic purposes, can be determined by a person skilled in the art and depends on a certain number of factors such as the individual for whom the vaccine is intended, eg, age, the antigen itself, the route and mode of administration, the presence / absence or type of adjuvant, as can be determined by those skilled in the art. Generally, it is indicated that an appropriate dose is from about 10 μg to about 1 mg, preferably about 100 μg.
L'agent immunogène dérivé d'Helicobacter peut être n'importe quel polypeptide d'Helicobacter e.g., d'H. pylori. Il peut notamment s'agir d'un polypeptide présent dans le cytoplasme, d'un polypeptide de la membrane interne ou externe ou d'un polypeptide sécrété dans le milieu extérieur. De nombreux polypeptides d'Helicobacter ont déjà été décrits dans la littérature, soit par référence à leur séquence d'acides aminés déduites de la séquence du gène correspondant clone ou identifié, soit par référence à un procédé de purification qui permet de les obtenir sous forme isolée du reste de leur environnement naturel. A titre indicatif, on cite en particulier les document suivants : WO 94/26901 and WO 96/34624 (HspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (HpaA), WO 93/181 150 (cytotoxine), WO 95/27506 et Hazell et al, J. Gen. Microbiol. (1991 ) L37 : 57 (catalase), FR 2 724 936 (récepteur membranaire de la lactoferrine humaine), WO 96/41880 (AlpA), EP 752 473 (FibA) and O'Toole et al, J. Bact. (1991) 173 : 505 (TsaA). D'autres polypeptides sont aussi décrits dans WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 et WO 96/33220. Un polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à l'un de ceux cités en référence dans la mesure où il est capable de promouvoir une réponse immune à l'encontre d'Helicobacter. A condition de remplir cette dernière condition, l'agent immunogène peut aussi être un peptide dérivé d'un polypeptide cité en référence.The immunogenic agent derived from Helicobacter can be any Helicobacter polypeptide eg, from H. pylori. It can in particular be a polypeptide present in the cytoplasm, a polypeptide of the internal or external membrane or a polypeptide secreted in the external medium. Many Helicobacter polypeptides have already been described in the literature, either by reference to their amino acid sequence deduced from the sequence of the corresponding cloned or identified gene, or by reference to a purification process which makes it possible to obtain them in the form isolated from the rest of their natural environment. As an indication, the following documents are cited in particular: WO 94/26901 and WO 96/34624 (HspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (HpaA), WO 93/181 150 (cytotoxin), WO 95/27506 and Hazell et al, J. Gen. Microbiol. (1991) L37: 57 (catalase), FR 2 724 936 (membrane receptor for human lactoferrin), WO 96/41880 (AlpA), EP 752 473 (FibA) and O'Toole et al, J. Bact. (1991) 173: 505 (TsaA). Other polypeptides are also described in WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 and WO 96/33220. A polypeptide useful for the purposes of the present invention may be identical or similar to one of those cited in the reference insofar as it is capable of promoting an immune response against Helicobacter. Provided this latter condition is met, the immunogenic agent can also be a peptide derived from a polypeptide cited in reference.
De manière avantageuse, on utilise un polypeptide sélectionné parmi les sous- unités UreA et UreB de l'uréase d'Helicobacter (voir WO 90/4030). De préférence, on les utilise toutes les deux, associées en forme d'apoenzyme de l'uréase ou encore sous forme multimérique (voir WO 96/33732).Advantageously, a polypeptide selected from the UreA and UreB subunits of Helicobacter urease is used (see WO 90/4030). Preferably, they are used both, combined in the form of apoenzyme of urease or also in multimeric form (see WO 96/33732).
Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut contenir un unique agent immunogène ou plusieurs. Par exemple une composition avantageuse peut comprendre UreA et UreB e.g., sous forme d'apoenzyme, ainsi que un ou plusieurs autres polypeptides notamment sélectionnés parmi ceux cités ci- avant.A pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention may contain one or more immunogenic agents. For example, an advantageous composition can comprise UreA and UreB e.g., in the form of an apoenzyme, as well as one or more other polypeptides in particular selected from those mentioned above.
Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut en outre contenir des composés autres que l'agent immunogène lui-même et l'adjuvant de type Thl ou Thl/Th2 ; la nature de ces composés dépendant dans une certaine mesure de la nature de l'agent immunogène, bactéries inactivées, lysat cellulaire, peptide ou polypeptide. Par exemple une composition peut aussi comprendre un adjuvant capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Th2 e.g. un composé d'aluminium tel que l'aluminium hydroxide, l'aluminium phosphate ou l'aluminium hydroxy phosphate. Ceci peut être avantageux dans le cas où l'adjuvant utile au fins de la présente invention est un adjuvant de type Thl tel que le QS-21.A pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention may also contain compounds other than the immunogenic agent itself and the adjuvant of the Thl or Thl / Th2 type; the nature of these compounds depending to a certain extent on the nature of the immunogenic agent, inactivated bacteria, cell lysate, peptide or polypeptide. For example, a composition can also comprise an adjuvant capable of promoting the induction of a Th2 type immune response, e.g. an aluminum compound such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate or aluminum hydroxy phosphate. This can be advantageous in the case where the adjuvant useful for the purposes of the present invention is a Thl type adjuvant such as QS-21.
L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'une méthode ou d'un usage selon l'invention peut être évaluée selon des méthodes standard e.g., en mesurant l'induction d'une réponse immune ou l'induction d'une immunité thérapeutique ou protectrice en utilisant e.g., le modèle souris / H. felis et les procédures décrits dansThe therapeutic or prophylactic effectiveness of a method or use according to the invention can be evaluated according to standard methods eg, by measuring the induction of an immune response or the induction of therapeutic or protective immunity in using eg, the mouse / H. felis model and the procedures described in
Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (1995) 7 : 303 ou Lee et al, J. Infect. Dis. (1995) J 2 : 161. L'homme de l'art s'avisera que H. felis peut être remplacé dans le modèle souris par une autre espèce d'Helicobacter. Par exemple, l'efficacité d'un agent immunogène dérivé d'H. pylori est de préférence évalué dans un modèle souris metant en oeuvre une souche d'H. pylori adaptée à la souris. L'efficacité peut être déterminée en comparant le degré d'infection dans le tissu gastrique (en mesurant l'activité uréase, la charge bactérienne ou l'état de la gastrite) à celui d'un groupe contrôle. Il y a effet thérapeutique ou effet protecteur lorsque l'infection est réduite par comparaison au groupe contrôle.Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (1995) 7: 303 or Lee et al, J. Infect. Say. (1995) J 2: 161. Those skilled in the art will realize that H. felis can be replaced in the mouse model by another species of Helicobacter. For example, the efficacy of an immunogenic agent derived from H. pylori is preferably evaluated in a mouse model using a strain of H. pylori adapted to the mouse. Efficacy can be determined by comparing the degree of infection in the gastric tissue (by measuring urease activity, bacterial load, or gastritis status) to that of a control group. There is a therapeutic or protective effect when the infection is reduced compared to the control group.
Une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, elle peut être formulée avec un diluent ou un porteur acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g., de l'eau ou une solution saline. En général, le diluent ou le porteur peut être sélectionné en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Des porteurs ou des diluents appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine.A pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention can be manufactured in a conventional manner. In particular, it can be formulated with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, e.g., water or saline. In general, the diluent or carrier can be selected depending on the mode and route of administration and according to standard pharmaceutical practices. Appropriate carriers or diluents as well as what is essential for the development of a pharmaceutical composition are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference book in this field.
Les méthodes selon l'invention ainsi que les compositions utiles à ces fins peuvent être mises en oeuvre pour traiter ou prévenir i.a. les infections à Helicobacter et par conséquent, les maladies gastroduodénales associées à ces infections, y compris les gastrites aiguës, chroniques ou atrophiques, les ulcères peptiques e.g., les ulcères gastriques ou duodénaux.The methods according to the invention as well as the compositions useful for these purposes can be used to treat or prevent i.a. Helicobacter infections and therefore gastroduodenal diseases associated with these infections, including acute, chronic or atrophic gastritis, peptic ulcers e.g., gastric or duodenal ulcers.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée de manière conventionnelle notamment par voie muqueuse e.g., par voie oculaire, orale e.g. buccale ou gastrique, pulmonaire, intestinale, rectale, vaginale ou urinaire ou par voie systémique, notamment parentérale e.g., intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intraepidermique et sous-cutanée. De préférence, on utilise la voie parentérale. Lorsque la voie parentérale est mise en oeuvre, on choisit de préférence un site d'administration situé sous le diaphragme d'un individu. La région dorso- lombaire constitue par exemple un site d'administration approprié, notamment pour les voies intraépidermiques, intramusculaire, intradermique et sous-cutanée ; ces dernières étant choisies de préférence à la voie intraveineuse. Afin d'obtenir un effet protecteur ou thérapeutique, l'opération qui consiste à administrer une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention peut être répétée une ou plusieurs fois, de préférence au moins deux fois, en laissant un certain intervalle de temps entre chaque administration ; intervalle qui est de l'ordre de la semaine ou du mois. Sa détermination précise est à la portée de l'homme du métier et peut varier en fonction de divers facteurs tels que la nature de l'agent immunogène, l'âge de l'individu, etc.A pharmaceutical composition according to the invention can be administered in a conventional manner, in particular by the mucous route, eg by the ocular, oral route, eg buccal or gastric, pulmonary, intestinal, rectal, vaginal or urinary route, or by the systemic route, in particular parenteral, eg, intravenous, intramuscular route. , intradermal, intraepidermal and subcutaneous. Preferably, the parenteral route is used. When the parenteral route is used, a site of administration is preferably chosen located under the diaphragm of an individual. The dorsolumbar region constitutes, for example, a suitable site of administration, in particular for the intraepidermal, intramuscular, intradermal and subcutaneous routes; the latter being chosen preferably by the intravenous route. In order to obtain a protective or therapeutic effect, the operation which consists in administering a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention can be repeated one or more times, preferably at least twice, leaving a certain time interval between each administration; interval which is of the order of the week or the month. Its precise determination is within the reach of those skilled in the art and may vary depending on various factors such as the nature of the immunogenic agent, the age of the individual, etc.
Selon un mode particulier, le protocole de vaccination est mis en oeuvre en utilisant la même voie d'administration lors de la primo-immunisation et des rappels. Dans ce cas là, on parle par exemple d'administration systemique stricte.According to a particular mode, the vaccination protocol is implemented using the same route of administration during the primary immunization and boosters. In this case, we speak for example of strict system administration.
"Une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systemique stricte" est définie comme une méthode ne mettant pas en jeu de voie d'administration autre que la voie systemique. Par exemple, une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systemique et par voie muqueuse, ne répond pas à la définition énoncée ci-avant. En d'autres termes, "une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systemique stricte" doit être comprise comme une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systemique à l'exclusion de toute autre voie, notamment la voie muqueuse."A method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route" is defined as a method which does not involve a route of administration other than the systemic route. For example, a method in which the immunogenic agent is administered by the systemic route and by the mucous route does not meet the definition given above. In other words, "a method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route" must be understood as a method in which the immunogenic agent is administered by a systemic route excluding any other route, in particular the mucosal route.
A titre illustratif non-limitatif, on évoque un schéma de vaccination qui consiste à administrer l'apoenzyme de l'uréase en association avec le QS-21, le DC- chol ou un de leurs équivalents, trois fois par voie sous-cutanée, dans la région dorso-lombaire avec un intervalle de deux à quatre semaines entre chaque administration.By way of non-limiting illustration, a vaccination scheme is mentioned which consists in administering the urease apoenzyme in combination with QS-21, DC-chol or one of their equivalents, three times by subcutaneous route, in the dorso-lumbar region with an interval of two to four weeks between each administration.
On peut aussi prévoir que l'administration d'une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être une simple étape faisant partie d'un protocole de vaccination plus élaboré. Par exemple, une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être précédée ou suivie de l'administration d'une composition pharmaceutique contenant un agent immunogène dérivé d'Helicobacter choisi de manière indépendante parmi ceux énoncés ci-avant ou parmi d'autres tels qu'un vecteur vaccinal ou une molécule d'ADN ; mais ne contenant pas de QS-21, de DC- chol ou un de leurs équivalents ; ceux-ci pouvant alors être remplacé par un tout autre adjuvant ; les deux compositions pouvant être administrées par des voies identiques ou différentes.It can also be envisaged that the administration of a pharmaceutical composition according to the present invention can be a simple step forming part of a more elaborate vaccination protocol. For example, a pharmaceutical composition according to the present invention may be preceded or followed by the administration of a pharmaceutical composition containing an immunogenic agent derived from Helicobacter chosen independently from those listed above or from others such as a vaccine vector or a DNA molecule; but not containing QS-21, DC-chol or one of their equivalents; these can then be replaced by a whole other adjuvant; the two compositions can be administered by identical or different routes.
A titre illustratif non-limitatif, on évoque les protocoles suivants :By way of non-limiting illustration, the following protocols are mentioned:
- Une primo-immunisation par voie systemique, avec l'apoenzyme de l'uréase en présence de QS-21, suivie de deux rappels avec l'apoenzyme de l'uréase en présence de QS-21 ou de LT par voie muqueuse ; et- A primary immunization by systemic route, with the urease apoenzyme in the presence of QS-21, followed by two boosters with the urease apoenzyme in the presence of QS-21 or LT by the mucous route; and
- Une primo-immunisation par voie systemique, avec un poxvirus codant pour UreA et UreB suivie de deux rappels avec l'apoenzyme de l'uréase en présence de QS-21, par voie systemique ou muqueuse.- A primary immunization by systemic route, with a poxvirus encoding UreA and UreB followed by two boosters with the urease apoenzyme in the presence of QS-21, by systemic or mucous route.
Des agents immunogènes autres que ceux décrits ci-avant et pouvant être utilisés dans un protocole de vaccination multi-étapes comprenant une étape d'administration mettant en jeu un médicament utile aux fins de la présente invention ou une composition selon la présente invention, peuvent être sélectionnés parmi une une molécule polynucléotidique, notamment une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère ; ou bien encore un vecteur vaccinal comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère (si il s'agit d'un vecteur viral) ou chez un procaryote (si il s'agit d'un vecteur bactérien).Immunogens other than those described above and which can be used in a multistage vaccination protocol comprising an administration step involving a medicament useful for the purposes of the present invention or a composition according to the present invention, can be selected from a polynucleotide molecule, in particular a DNA molecule comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell; or alternatively a vaccine vector comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell (if it is a viral vector) or in a prokaryote (if it is a bacterial vector).
La molécule d'ADN peut avantageusement être un plasmide qui est incapable à la fois de se répliquer et de s'intégrer de manière substantielle dans le génome d'un mammifère. La séquence codante citée ci-dessus est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dans une cellule de mammifère. Ce promoteur peut être ubiquitaire ou spécifique d'un tissu. Parmi les promoteurs ubiquitaires, on cite le promoteur précoce du Cytomegalovirus (décrit dans le brevet US n° 4,168,062) et le promoteur du virus du sarcome de Rous (décrit dans Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5 : 281). Le promoteur desmine (Li et al, Gène (1989) 78 : 244443 ; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268 : 10403) est un promoteur sélectif permet l'expression dans les cellules musculaires et aussi dans les cellules de la peau. Un promoteur spécifique des cellules musculaires est par example le promoteur du gène de la myosine ou de la dystrophine. Des vecteurs
Figure imgf000018_0001
The DNA molecule can advantageously be a plasmid which is unable both to replicate and to integrate substantially in the genome of a mammal. The coding sequence cited above is placed under the control of a promoter allowing expression in a mammalian cell. This promoter can be ubiquitous or specific for a tissue. Among the ubiquitous promoters, mention is made of the early promoter of Cytomegalovirus (described in US Patent No. 4,168,062) and the promoter of Rous sarcoma virus (described in Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5: 281 ). The desmin promoter (Li et al, Gene (1989) 78: 244443; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268: 10403) is a selective promoter which allows expression in muscle cells and also in cells. skin. A specific promoter of muscle cells is for example the promoter of the myosin or dystrophin gene. Vectors
Figure imgf000018_0001
plasmidiques que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention sont décrits i.a., dans WO 94/21797 et Hartikka et al, Human Gène Therapy (1996) 7 : 1205.plasmids which can be used for the purposes of the present invention are described i.a., in WO 94/21797 and Hartikka et al, Human Gene Therapy (1996) 7: 1205.
Dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention, la molécule nucléotidique e.g. la molécule d'ADN peut être formulée ou non. Le choix de la formulation est très varié. L'ADN peut être simplement dilué dans une solution acceptable d'un point de vue physiologique avec ou sans porteur. Lorsque ce dernier est présent, il peut être isotonique ou faiblement hypertonique et avoir basse force ionique. Par exemple, ces conditions peuvent être remplies par une solution de sucrose e.g. à 20 %.In a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention, the nucleotide molecule e.g. the DNA molecule can be formulated or not. The choice of formulation is very varied. The DNA can simply be diluted in a physiologically acceptable solution with or without a carrier. When the latter is present, it can be isotonic or weakly hypertonic and have low ionic strength. For example, these conditions can be fulfilled with a sucrose solution e.g. 20%.
De manière alternative, le polynucléotide peut être associé avec des agents qui favorise l'entrée dans la cellule. Ce peut être (ii) un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire, telle que la bupivacaine (voir par exemple WO 94/16737) ou (ii) un agent s'associant au polynucléotide et agissant en tant que véhicule facilitant le transport du polynucléotide. Ce dernier peut être notamment des polymères cationiques e.g. de la polylysine ou une polyamine e.g. des dérivés de la spermine (voir WO 93/18759). Ce peut être également des peptides fusogéniques e.g. du GALA ou de la Gramicidine S (voir WO 93/19768) ou bien encore des peptides dérivés des protéines de fusion virales.Alternatively, the polynucleotide can be combined with agents which promote entry into the cell. It can be (ii) a chemical agent which modifies cell permeability, such as bupivacaine (see for example WO 94/16737) or (ii) an agent which associates with the polynucleotide and acts as a vehicle facilitating the transport of the polynucleotide . The latter may in particular be cationic polymers e.g. polylysine or a polyamine e.g. derivatives of spermine (see WO 93/18759). They can also be fusogenic peptides e.g. GALA or Gramicidine S (see WO 93/19768) or even peptides derived from viral fusion proteins.
Il peut aussi s'agir de lipides anioniques ou cationiques. Les lipides anioniques ou neutres sont connus depuis longtemps comme pouvant servir d'agents de transport, par exemple sous forme de liposomes, à un grand nombre de composés y compris les polynucléotides. Une description détaillée de ces liposomes, de leurs constituants et de leurs procédés de fabrication est par exemple fournit par Liposomes : A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).It can also be anionic or cationic lipids. Anionic or neutral lipids have been known for a long time as being able to serve as transport agents, for example in the form of liposomes, to a large number of compounds including polynucleotides. A detailed description of these liposomes, their constituents and their manufacturing processes is for example provided by Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).
Les lipides cationiques sont aussi connus et communément utilisés comme agents de transport pour les polynucléotides. On cite par exemple la LipofectinI aussi connue sous le nom de DOTMA (N-[l-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N- trimethylammonium chloride), le DOTAP (l ,2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio) propane), le DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), le DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) et les dérivés du cholestérol tel que le DC-chol (3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-carbamoyl) cholestérol). Une description de ces lipides est fournie par EP 187,702, WO 90/1 1092, le brevet US N° 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 et le brevet US N° 5,527,928. Les lipides cationiques sont utilisés de préférence avec un lipide neutre tel que le DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) comme par exemple cela est décrit dans WO 90/1 1092.Cationic lipids are also known and commonly used as transport agents for polynucleotides. We quote for example Lipofectin I also known under the name of DOTMA (N- [l- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleyloxy ) -3- (trimethylammonio) propane), DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) and cholesterol derivatives such as DC-chol (3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) ) -carbamoyl) cholesterol). A description of these lipids is provided by EP 187,702, WO 90/1 1092, US Patent No. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 and US Patent No. 5,527,928. Cationic lipids are preferably used with a neutral lipid such as DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) as for example that is described in WO 90/1 1092.
Des microparticules d'or ou de tungstène peuvent aussi être utilisées comme agents de transport, tel que c'est décrit dans WO 91/359, WO 93/17706 et Tang et al, Nature (1992) 356 : 152. Dans ce cas là, le polynucléotide est précipité sur les microparticules en présence de chlorure de calcium et de spermidine puis l'ensemble est administré par jet à haute vitesse dans le derme ou dans l'épidémie, à l'aide d'un appareil sans aiguille tel que ceux décrits dans les brevets US N° 4,945,050 et N° 5,015,580 et WO 94/24243.Gold or tungsten microparticles can also be used as transport agents, as described in WO 91/359, WO 93/17706 and Tang et al, Nature (1992) 356: 152. In this case there , the polynucleotide is precipitated on the microparticles in the presence of calcium chloride and spermidine then the whole is administered by high-speed jet in the dermis or in the epidemic, using a device without a needle such as those described in US Pat. Nos. 4,945,050 and No. 5,015,580 and WO 94/24243.
La quantité d'ADN qui peut être utilisée pour vacciner un individu dépend d'un certains nombre de facteurs tels que par exemple la force du promoteur utilisé afin d'exprimer l'antigène, l'immunogénicité du produit exprimé, la condition du mammifère auquel est destinée l'administration (e.g., le poids l'âge, et l'état de santé général), le mode d'administration et le type de formulation. En général une dose appropriée à un usage prophylactique ou thérapeutique chez un adulte de l'espèce humaine est d'environ 1 μg à environ 5 mg, de préférence d'environ 10 μg à environ 1 mg, et de manière tout particulièrement préférée d'environ 25 μg à environ 500 μg.The amount of DNA that can be used to vaccinate an individual depends on a number of factors such as for example the strength of the promoter used to express the antigen, the immunogenicity of the product expressed, the condition of the mammal to which is intended for administration (eg, weight, age, and general health), mode of administration and type of formulation. In general, a dose suitable for prophylactic or therapeutic use in an adult of the human species is from approximately 1 μg to approximately 5 mg, preferably from approximately 10 μg to approximately 1 mg, and very particularly preferably from about 25 μg to about 500 μg.
Parmi les agents immunogènes cités précédemment, on trouve les vecteurs vaccinaux. Parmi les vecteurs d'origine virale on trouve notamment les adénovirus et les poxvirus. Un exemple de vecteur dérivé d'un adénovirus ainsi qu'une méthode pour construire un vecteur capable d'exprimer une molécule d'ADN codant pour un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention sont décrits dans le brevet US N° 4,920,209. Des poxvirus qui peuvent être utilisés de même, sont par exemple les virus de la vaccine et du canarypox. Us sont décrits de manière respective dans les brevets US N° 4,722,848 et 5,364,773 (voir aussi e.g., Tartaglia et al, Virology (1992) 188 : 217 et Taylor et al, Vaccine (1995) 13 : 539). Des poxvirus capable d'exprimer un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peuvent être obtenus par recombinaison homologue tel que décrit dans Kieny et al, Nature (1984) 312 : 163, de manière à ce que le fragment d'ADN codant pour le peptide ou le polypeptide soit placé dans des conditions appropriées à son expression dans des cellules de mammifères. Un vecteur bactérien tel que le Bacille bilié de Calmette-Guérin peut être aussi envisagé. D'une manière générale, la dose d'un vecteur viral destinée à des fins prophylactiques ou thérapeutiques peut être d'environ lxlO4 à environ lxlOI ], de manière avantageuse d'environ lxlO7 à environ lxlO10, de préférence d'environ lxl 07 à environ lxlO9 unités formant plaques per kilogram.Among the immunogenic agents mentioned above, there are vaccine vectors. Among the vectors of viral origin are in particular adenoviruses and poxviruses. An example of a vector derived from an adenovirus as well as a method for constructing a vector capable of expressing a DNA molecule coding for a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention are described in US Patent No. 4,920,209. Poxviruses which can also be used are, for example, vaccinia and canarypox viruses. They are described respectively in US patents Nos. 4,722,848 and 5,364,773 (see also eg, Tartaglia et al, Virology (1992) 188: 217 and Taylor et al, Vaccine (1995) 13: 539). Poxviruses capable of expressing a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention can be obtained by homologous recombination as described in Kieny et al, Nature (1984) 312: 163, so that the DNA fragment encoding for the peptide or the polypeptide is placed under conditions suitable for its expression in mammalian cells. A bacterial vector such as the Biliated Bacillus of Calmette-Guérin can also be considered. In general, the dose of a viral vector intended for prophylactic or therapeutic purposes can be from approximately 1x10 4 to approximately 1x10 ] , advantageously from approximately 1x10 7 to approximately 1x10 10 , preferably from approximately lxl 0 7 to approximately lxlO 9 units forming plates per kilogram.
Parmi les vecteurs bactériens, on cite notamment Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus et Streptococcus. Des souches mutantes non-toxiques de Vibrio cholerae qui peuvent être utiles comme vaccin vivant, sont décrites dans Mekalanos et el, Nature (1983) 306 : 551 et le brevet US N° 4,882,278 (souche dans laquelle une partie substantielle de la région codant pour chacun des deux allèles ctxA a été délétée de manière à ce qu'aucune toxine fonctionnelle ne puisse être produite) ; WO 92/1 1354 ( souche dans laquelle le locus irgA est inactivé par mutation ; cette mutation peut être combinée dans une même souche avec des mutations ctxA) ; at WO 94/1533 (mutant obtenu par délétion à qui il manque des séquences fontionnelles ctxA et attRSl). Ces souches peuvent être modifiées génétiquement afin d'exprimer des antigènes hétérologues tel que décrit dans WO 94/19482.Among the bacterial vectors, there are in particular Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus and Streptococcus. Non-toxic mutant strains of Vibrio cholerae which may be useful as a live vaccine are described in Mekalanos et al, Nature (1983) 306: 551 and US Patent No. 4,882,278 (strain in which a substantial part of the region coding for each of the two ctxA alleles has been deleted so that no functional toxins can be produced); WO 92/1 1354 (strain in which the irgA locus is inactivated by mutation; this mutation can be combined in the same strain with ctxA mutations); at WO 94/1533 (mutant obtained by deletion which lacks functional sequences ctxA and attRSl). These strains can be genetically modified in order to express heterologous antigens as described in WO 94/19482.
Des souches atténuées de Salmonella typhimu um modifiées génétiquement ou non pour l'expression recombinante d'antigènes hétérologues, ainsi que leurs usage en tant que vaccins sont décrits dans Nakayama et al, BioTechnology (1988) 6 : 693 et WO 92/1 1361.Attenuated strains of Salmonella typhimu um genetically modified or not for the recombinant expression of heterologous antigens, as well as their use as vaccines are described in Nakayama et al, BioTechnology (1988) 6: 693 and WO 92/1 1361.
D'autres bactéries utiles en tant que vecteurs vaccinaux sont décrits dans High et al, EMBO (1992) 1 1 : 1991 et Sizemore et al, Science (1995) 270 : 299 (Shigella flexnerï) ; Medaglini et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92 : 6868Other bacteria useful as vaccine vectors are described in High et al, EMBO (1992) 11: 1991 and Sizemore et al, Science (1995) 270: 299 (Shigella flexneri); Medaglini et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 6868
(Streptococcus gordoniî) ; et Flynn J.L. Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I) : 31 ,(Streptococcus gordoniî); and Flynn J.L. Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31,
WO 88/6626, WO 90/0594, WO 91/13157, WO 92/1796 et WO 92/21376 (Bacille de Calmette Guerin).WO 88/6626, WO 90/0594, WO 91/13157, WO 92/1796 and WO 92/21376 (Bacille de Calmette Guerin).
Dans les vecteurs bactériens la séquence d'ADN codant pour un peptide ou polypeptide ^Helicobacter peut être insérée dans le génome bactérien ou bien rester à l'état libre, portée par un plas ide.In bacterial vectors the DNA sequence coding for a peptide or polypeptide ^ Helicobacter can be inserted into the bacterial genome or else remain in the free state, carried by a plasmid.
De même une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal peuvent comporter une séquence codant pour n'importe quel polypeptide ou peptide décrit ci-dessus. Une molécule d'ADN, de préférence un vecteur vaccinal viral peut aussi comporter une séquence codant pour une cytokine, par exemple une lymphokine telle que l'interleukine-2 ou -12, sous le contrôle d'éléments appropriés pour expression dans une cellule de mammifère. Une alternative à cette option consiste aussi à ajouter dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention comprenant une molécule d'ADN ou un vecteur, une autre molécule ou vecteur viral codant pour une cytokine.Likewise, a DNA molecule or a vaccine vector can comprise a sequence coding for any polypeptide or peptide described above. A DNA molecule, preferably a viral vaccine vector, can also comprise a sequence coding for a cytokine, for example a lymphokine such as interleukin-2 or -12, under the control of elements suitable for expression in a cell. mammal. An alternative to this option also consists in adding to a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention comprising a DNA molecule or a vector, another molecule or viral vector coding for a cytokine.
D'une manière générale, l'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique destinée à traiter ou à prévenir une infection à Helicobacter qui comprend pour administration consécutive : (i) un premier produit contenant (a) un agent immunogène dérivé d'Helicobacter sélectionné de manière indépendante, parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée, et (b) un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type Thl et (ii) un deuxième produit contenant un agent immunogène dérivé d'Helicobacter sélectionné de manière indépendante, parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée, une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression et un vecteur vaccinal comportant une séquence codant pour un peptide ou un polypeptide d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; de préférence à condition que, lorsqu'un premier produit contient un peptide ou un polypeptide et un deuxième produit contient une molécule d'ADN ou un vecteur vaccinal, ladite séquence codante de la molécule d'ADN ou du vecteur vaccinal code pour le peptide ou polypeptide contenu dans le premier produit.In general, the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition intended for treating or preventing a Helicobacter infection which comprises for consecutive administration: (i) a first product containing (a) an immunogenic agent derived from Helicobacter independently selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a Helicobacter peptide and polypeptide in purified form, and (b) a compound capable of promoting the induction of an immune response from type Thl and (ii) a second product containing an immunogenic agent derived from Helicobacter independently selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a peptide and a polypeptide of Helicobacter in purified form, a DNA molecule comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control role of the elements necessary for its expression and a vaccine vector comprising a sequence coding for a Helicobacter peptide or polypeptide placed under the control of the elements necessary for its expression; preferably provided that when a first product contains a peptide or a polypeptide and a second product contains a DNA molecule or a vaccine vector, said coding sequence of the DNA molecule or of the vaccine vector codes for the peptide or polypeptide contained in the first product.
Dans la description ci-avant on s'est essentiellement référé aux infections à Helicobacter et aux moyens de les combattre en prévention et en prophylaxie.In the description above, we mainly referred to Helicobacter infections and the means of combating them in prevention and prophylaxis.
Néanmoins, on doit comprendre que les principes et méthodes énoncés ci-avant peuvent s'appliquer mutatis mutandis à toute autre infection induite par un microorganisme quelconque dont le siège est l'estomac le duodénum ou l'intestin.Nevertheless, it should be understood that the principles and methods set out above can apply mutatis mutandis to any other infection induced by any microorganism whose seat is the stomach, the duodenum or the intestine.
On précise en outre que tous les documents publiés et cités dans la présente demande sont incorporés par référence. L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.It is further specified that all the documents published and cited in the present application are incorporated by reference. The invention is illustrated below with reference to the following figures.
La Figure 1 se réfère à l'Exemple 1 et présente les niveaux d'activité uréase après épreuve, mesurée 4 hrs après le sacrifice des souris ayant reçues par 3 fois, à J0, J28 et J56 : (a) une préparation d'uréase encapsulée à environ 80 % dans des liposomes DC-chol, dans les muscles dorso-lombaires ; ou (b) une préparation d'uréase adjuvantée par de la toxine cholérique, par voie intragastrique. Les expériences (c) et (d) correspondent respectivement aux témoins positifs et négatifs.Figure 1 refers to Example 1 and presents the levels of urease activity after challenge, measured 4 hrs after the sacrifice of the mice having received 3 times, on D0, D28 and D56: (a) a urease preparation approximately 80% encapsulated in DC-chol liposomes, in the dorso-lumbar muscles; or (b) an urease preparation adjuvanted by cholera toxin, intragastrically. Experiments (c) and (d) correspond respectively to the positive and negative controls.
La Figure 2 se réfère à l'Exemple 1 et présente les niveaux d'activité uréase après épreuve, mesurée 4 hrs après le sacrifice des souris ayant reçues par 3 fois, à J0, J28 et J56 : (a) une préparation d'uréase adjuvantée par de la toxine cholérique, par voie intragastrique ou (b) une préparation d'uréase adjuvantée par du PCPP, par voie sous-cutanée dans la partie sous-lombaire postérieure gauche ; ou (c) une préparation d'uréase adjuvantée par du QS-21 , par voie sous-cutanée dans le bas du dos. Les expériences (c) et (d) correspondent respectivement aux témoins positifs et négatifs.Figure 2 refers to Example 1 and presents the levels of urease activity after challenge, measured 4 hrs after the sacrifice of the mice having received 3 times, on D0, D28 and D56: (a) a urease preparation adjuvanted by cholera toxin, intragastrically or (b) a urease preparation adjuvanted by PCPP, subcutaneously in the left posterior sub-lumbar region; or (c) a urease preparation adjuvanted with QS-21, subcutaneously in the lower back. Experiments (c) and (d) correspond respectively to the positive and negative controls.
La Figure 3 présente les quantités d'immunoglobulines sériques induites chez les singes soumis à des protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 2, et exprimées en titre ELISA. Un groupe contrôle comprenant 4 singes et trois groupes test sont formés, chacun des groupes test comprenant 8 singes ; chaque groupe test est divisé en deux sous-groupes de 4 singes, l'un recevant uniquement la préparationFigure 3 shows the amounts of serum immunoglobulins induced in monkeys subjected to immunization protocols described in Example 2, and expressed as ELISA titer. A control group comprising 4 monkeys and three test groups are formed, each of the test groups comprising 8 monkeys; each test group is divided into two subgroups of 4 monkeys, one receiving only the preparation
H. pylori inactivée (1, 2 et 3) et l'autre recevant la préparation H. pylori inactivée et de l'uréase recombinante (lu, 2u et 3u). Le groupe 1 et lu correspond au protocole d'administration [nasal + intragastrique, 4 fois] ; le groupe 2 et 2u correspond au protocole d'administration [intramusculaire, 4 fois] ; le groupe 1 et lu correspond au protocole d'administration [nasal + intragastrique, intramusculaire, nasal + intragastrique, intramusculaire]. Le titre ELISA est mesuré trois fois : une première fois, à J0 (bande blanche), une deuxième fois à J42 (bande grise), une troisième fois à J78 (bande noire).H. pylori inactivated (1, 2 and 3) and the other receiving the preparation H. pylori inactivated and recombinant urease (lu, 2u and 3u). Group 1 and read corresponds to the administration protocol [nasal + intragastric, 4 times]; group 2 and 2u corresponds to the administration protocol [intramuscular, 4 times]; group 1 and read corresponds to the administration protocol [nasal + intragastric, intramuscular, nasal + intragastric, intramuscular]. The ELISA titer is measured three times: a first time, on D0 (white stripe), a second time on D42 (gray stripe), a third time on D78 (black stripe).
La Figure 4 présente les quantités d'immunoglobulines sériques induites chez les souris soumises aux protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 3, et exprimées en titre ELISA. O indique le titre ELISA en IgG2a et indique le titreFigure 4 shows the quantities of serum immunoglobulins induced in mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, and expressed in ELISA titer. O indicates the ELISA titer in IgG2a and indicates the titer
ELISA en IgGl. Deux groupes contrôle (témoins positif et négatif), quatre groupes test (Al à A4) ainsi qu'un groupe de référence (LT) sont formés ; chacun des groupes comprenant 10 souris. Les mesures des quantités d'immunoglobulines sériques sont effectuées pout seulement 5 souris parmi les dix. Les souris des groupes Al à A4 ont reçues des doses de 10 μg d'uréase par voie sous cutanée dans la partie sous-lombaire postérieure gauche, en présence de QS-21 (Al), Bay R1005 (A2), DC-chol (A3) ou de PCPP (A4). Les souris du groupe de référence ont reçues des doses de 40 μg d'uréase par voie orale en présence de la protéine heat-labile d'E. coli.ELISA in IgGl. Two control groups (positive and negative controls), four test groups (A1 to A4) as well as a reference group (LT) are formed; each of the groups including 10 mice. Measurements of the quantities of serum immunoglobulins are carried out for only 5 of the 10 mice. The mice of groups A1 to A4 received doses of 10 μg of urease subcutaneously in the left posterior sub-lumbar part, in the presence of QS-21 (Al), Bay R1005 (A2), DC-chol ( A3) or PCPP (A4). The reference group mice received doses of 40 μg of urease orally in the presence of the heat-labile protein of E. coli.
La Figure 5 présente les taux d'activité uréase mesurés au niveau de la muqueuse stomacale, à DO550 4 heures après que les souris soumises aux protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 3, aient été sacrifiées. Les groupes sont tels que décrits pour la Figure 4.FIG. 5 shows the levels of urease activity measured in the stomach mucosa, at DO550 4 hours after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed. The groups are as described for Figure 4.
La Figure 6 présente les taux d'activité uréase mesurés au niveau de la muqueuse stomacale, à DO550 24 heures après que les souris soumises aux protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 3, aient été sacrifiées. Les groupes sont tels que décrits pour la Figure 4.FIG. 6 shows the levels of urease activity measured in the stomach mucosa, at DO550 24 hours after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed. The groups are as described for Figure 4.
La Figure 7 présente la charge bactérienne mesurée au niveau de la muqueuse stomacale, après que les souris soumises aux protocoles d'immunisation décrits dans l'Exemple 3, aient été sacrifiées. Les groupes sont tels que décrits pour la Figure 4.FIG. 7 shows the bacterial load measured in the stomach mucosa, after the mice subjected to the immunization protocols described in Example 3, have been sacrificed. The groups are as described for Figure 4.
Les Figures 8A et 8B présentent l'activité uréase (Fig. 6A) évaluée après 4 hrs (OD à 550 nm) avec le Jatrox test (Procter & Gamble) et la charge bactérienne (Fig. 6B) chez des souris infectées par H. pylori et ensuite soumises à différents traitements A-H [A : LT + uréase par voie orale ; B : QS21 + uréase, par voie parentérale, au niveau du cou ; C : QS21 + uréase, par voie parentérale, dans la région lombaire ; D : QS21 seul par voie sous-cutanée, dans la région lombaire ; E : Bay RI 005 + uréase, par voie parentérale, au niveau du cou ; F : Bay RI 005 + uréase par voie parentérale, dans la région lombaire ; G : Bay RI 005 seul, par voie sous- cutanée dans la région lombaire (contrôle) ; H : solution saline par voie sous-cutanée dans la région lombaire (contrôle positif)] I représente le contrôle négatif. Exemple 1 : Etudes d'immunisation chez la sourisFigures 8A and 8B show the urease activity (Fig. 6A) evaluated after 4 hrs (OD at 550 nm) with the Jatrox test (Procter & Gamble) and the bacterial load (Fig. 6B) in mice infected with H. pylori and then subjected to various HA treatments [A: LT + oral urease; B: QS21 + urease, parenterally, in the neck; C: QS21 + urease, parenterally, in the lumbar region; D: QS21 alone subcutaneously, in the lumbar region; E: Bay RI 005 + urease, parenterally, at the neck; F: Bay RI 005 + parenteral urease, in the lumbar region; G: Bay RI 005 alone, subcutaneously in the lumbar region (control); H: saline subcutaneously in the lumbar region (positive control)] I represents the negative control. EXAMPLE 1 Immunization Studies in Mice
1A - Matériel et méthodes1A - Materials and methods
SourisMouse
Des souris femelles Swiss de 6/8 semaines ont été fournies par Janvier (France). Pendant toute la durée de l'expérience on a utilisé du matériel stérilisé ; les cages étaient protégées par des "isocaps" ; les souris ont été nourries avec de l'eau filtrée et des aliments irradiés.6/8 week old Swiss female mice were supplied by Janvier (France). For the duration of the experiment, sterilized equipment was used; the cages were protected by "isocaps"; the mice were fed filtered water and irradiated food.
Protocole d'administrationAdministration protocol
Lors de chaque expérience, les souris ont reçues 3 doses du même produit ; chaque dose à 28 jours d'intervalle (les jours 0, 28 et 56). L'administration du produit a été effectuée par voie nasale (jusqu'à 50 μl sur les souris éveillées), par voie orale (300 μ 1 en 0,2 M NaHCθ3 par gavage gastrique), ou par voie sous-cutanée (300 μl sous la peau du cou ou sous la peau du côté gauche de la région lombaire). Dans certains cas, une inoculation intramusculaire a été effectuée (50 μl) dans les muscles dorso- lombaires des souris anesthésiées. 10 μg d'uréase ont été administrés par voie nasale, sous cutanée ou intramusculaire, et 40 μg par voie orale. En ce qui concerne la préparation bactérienne inactivée, 400 μg de cellules ont été administrés par voie sous cutanée ou par voie orale.During each experiment, the mice received 3 doses of the same product; each dose 28 days apart (days 0, 28 and 56). The administration of the product was carried out by the nasal route (up to 50 μl on awake mice), by oral route (300 μ 1 in 0.2 M NaHCθ3 by gastric gavage), or by subcutaneous route (300 μl under the skin of the neck or under the skin on the left side of the lumbar region). In some cases, an intramuscular inoculation was performed (50 μl) in the dorsolumbar muscles of the anesthetized mice. 10 μg of urease were administered by nasal, subcutaneous or intramuscular route, and 40 μg by oral route. As regards the inactivated bacterial preparation, 400 μg of cells were administered subcutaneously or orally.
Antigènes et adjuvantsAntigens and adjuvants
L'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori a été exprimée dans E. coli et purifiée comme cela a été décrit dans l'exemple 5 de WO96/31235. Dans la suite du texte pour désigner cette apoenzyme, on emploie le simple terme d'uréase.The apoenzyme of H urease. pylori was expressed in E. coli and purified as described in Example 5 of WO96 / 31235. In the following text to designate this apoenzyme, the simple term urease is used.
Des liposomes DC-chol contenant de l'uréase sont préparés comme suit : Tout d'abord, afin d'obtenir un film lipidique sec contenant 100 mg de DC-chol (R-Gene Therapeutics) et 100 mg de DOPC (dioleylphosphatidylcholine) (Avanti Polar Lipids), on mélange ces produits sous forme de poudre dans environ 5 ml de chloroforme. On laisse la solution s'évaporer sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le film ainsi obtenu sur les parois du récipient est séché sous vide poussé pendant au moins 4 hrs. En parallèle, 20 mg d'un lyophilisât d'uréase et 100 mg de sucrose sont dilués dans 13.33 ml de tampon Hepes 20 mM pH 7.2. Dix ml de cette préparation (qui contient 1.5 mg d'uréase et 0.75 % de sucrose) est filtrée sur filtre Millex 0.220 μm, puis utilisée pour réhydrater le film lipidique. La suspension est mise sous agitation pendant 4 hrs puis soit extrudée (10 passages sur membrane de polycarbonate 0.2 μm) ou microfluidisée (10 passages sous une pression de 500 kPa dans un micro fluidiseur Y10 de Micro fluidics Co). Dans la suspension de liposomes ainsi obtenue le taux d'uréase encapsulée est de 10 à 60 %. Cette suspension est lyophilisée après avoir ajusté la concentration en sucrose à 5 % (on ajoute 425 mg de sucrose pour 10 ml). Avant utilisation, le lyophilisât est repris par un volume d'eau ou de tampon approprié et la suspension est purifiée sur un gradient discontinu de sucrose (paliers de 0, 30 et 60 %) de manière à obtenir une préparation dans laquelle la quantité d'uréase encapsulée est supérieure à 70 % environ par rapport à la quantité totale d'uréase.DC-chol liposomes containing urease are prepared as follows: First, in order to obtain a dry lipid film containing 100 mg of DC-chol (R-Gene Therapeutics) and 100 mg of DOPC (dioleylphosphatidylcholine) ( Avanti Polar Lipids), these products are mixed in powder form in approximately 5 ml of chloroform. The solution is allowed to evaporate in vacuo using a rotary evaporator. The film thus obtained on the walls of the container is dried under high vacuum for at least 4 hrs. In parallel, 20 mg of a urease lyophilisate and 100 mg of sucrose are diluted in 13.33 ml of 20 mM Hepes buffer, pH 7.2. Ten ml of this preparation (which contains 1.5 mg of urease and 0.75% sucrose) is filtered 0.220 μm Millex, then used to rehydrate the lipid film. The suspension is stirred for 4 hrs then either extruded (10 passages on 0.2 μm polycarbonate membrane) or microfluidized (10 passages under a pressure of 500 kPa in a Y10 micro-fluidizer from Micro fluidics Co). In the liposome suspension thus obtained, the level of encapsulated urease is from 10 to 60%. This suspension is lyophilized after adjusting the sucrose concentration to 5% (425 mg of sucrose per 10 ml is added). Before use, the lyophilisate is taken up in an appropriate volume of water or buffer and the suspension is purified on a discontinuous gradient of sucrose (steps of 0, 30 and 60%) so as to obtain a preparation in which the amount of encapsulated urease is greater than approximately 70% of the total amount of urease.
La toxine cholérique est utilisée comme adjuvant mucosal à raison de 10 μg / dose d'uréase ou de préparation bactérienne.Cholera toxin is used as a mucosal adjuvant at a rate of 10 μg / dose of urease or of bacterial preparation.
Le QS-21 (Cambridge Biosciences) est utilisé comme adjuvant à raison de 15 μg / dose d'uréase.QS-21 (Cambridge Biosciences) is used as an adjuvant at a rate of 15 μg / dose of urease.
Le polyphosphazène (PCPP) (Virus Research Institute) est utilisé comme adjuvant à raison de 100 μg / dose d'uréase.Polyphosphazene (PCPP) (Virus Research Institute) is used as an adjuvant at a rate of 100 μg / dose of urease.
EpreuveTest
Deux semaines après le deuxième rappel, les souris ont été soumises à un gavage gastrique avec 300 μl d'une suspension d'une souche d'H. pylori adaptée à la souris, la souche ORV2002 (1 x 107 bactéries vivantes dans 200 μl de PBS ; DO550 de 0.5 environ). Un groupe n'ayant reçu aucune dos d'antigène et servant de contrôle est éprouvé de même.Two weeks after the second booster, the mice were subjected to gastric gavage with 300 μl of a suspension of an H. strain. pylori adapted to the mouse, the ORV2002 strain (1 x 10 7 live bacteria in 200 μl of PBS; OD 550 of approximately 0.5). A group having received no antigen back and serving as a control is tested the same.
Analyse de l'épreuve Quatre semaines après l'épreuve, les souris ont été sacrifiées par rupture des vertèbres cervicales. Les estomacs ont été prélevés pour évaluer l'activité uréase et faire des analyses histologiques. L'activité uréase a été évaluée après 4 et 24 heures (DO à 550 nm) avec le Jatrox test, Procter & Gamble) et après 24 heures le nombre de souris encore négatives (DO inférieure à 0,1) a été relevé. Mesure de réponse anticorps locale par ELISPOT (glandes salivaires et estomac).Analysis of the test Four weeks after the test, the mice were sacrificed by rupture of the cervical vertebrae. The stomachs were removed to assess urease activity and to do histological analyzes. Urease activity was evaluated after 4 and 24 hours (OD at 550 nm) with the Jatrox test, Procter & Gamble) and after 24 hours the number of mice still negative (OD less than 0.1) was noted. Measurement of local antibody response by ELISPOT (salivary glands and stomach).
Les ELISPOT ont été exécutés conformément à Mega et al, J. Immunol. ( 1992) 148 : 2030. Les plaques ont été enduites d'un extrait de protéines d'H. pylori à une concentration de 50 μg/ml.The ELISPOTs were performed according to Mega et al, J. Immunol. (1992) 148: 2030. The plates were coated with an extract of H. proteins. pylori at a concentration of 50 μg / ml.
Pour tester la réponse anticorps au niveau de l'estomac nous avons modifié la méthode comme suit : La moitié de l'estomac a été coupée en morceau de 1 m2 avec un appareil automatique pour couper les tissus humains (Me Illwain Laboratories, Gilford, UK) et la digestion effectuée avec de la Dispase (2 mg/ml, Boeringher Mannheim) dans 2 ml d'une solution de Joklil modifiée à laquelle ont été ajoutés 10 % de sérum de cheval (Gibco), de la glutamine et des antibiotiques. Quatre digestions d'une 1/2 heure ont été exécutées à 37° C avec brassage doux. Les cellules ainsi digérées ont été filtrées après chaque étape à l'aide de filtres 70 μm (Falcon), puis lavées 3 fois dans une solution de RPMI 1640 (Gibco) complémentée à 5 % de de sérum de veau foetal (FCS), et incubées dans la même solution pendant au moins 4 heures dans des plaques recouvertes de nitrocellulose (Millipore) (100 μl/puits, 4 puits). Par moitié d'estomac, on obtient entre 1 et 3, 105 cellules (les cellules de grande taille et les macrophages n'ont pas été comptées).To test the antibody response in the stomach, we modified the method as follows: Half of the stomach was cut into 1 m 2 pieces with an automatic device to cut human tissue (Me Illwain Laboratories, Gilford, UK) and digestion carried out with Dispase (2 mg / ml, Boeringher Mannheim) in 2 ml of a modified Joklil solution to which 10% horse serum (Gibco), glutamine and antibiotics have been added . Four 1/2 hour digests were performed at 37 ° C with gentle stirring. The cells thus digested were filtered after each step using 70 μm filters (Falcon), then washed 3 times in a solution of RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 5% of fetal calf serum (FCS), and incubated in the same solution for at least 4 hours in plates covered with nitrocellulose (Millipore) (100 μl / well, 4 wells). For each half of the stomach, 1 to 3, 10 5 cells are obtained (large cells and macrophages were not counted).
L'IgA biotinylée et le complexe streptavidine - peroxydase biotinylée provenaient d'Amersham. Les spots ont été révélés sous l'action du substrat AEC (Sigma) et dès que les plaques sont sèches, ils ont été comptés sous un microscope (grossissement 16 ou 40X). Les valeurs moyennes correspondant au nombre de taches (spots) d'IgA dans quatre puits ont été calculées et exprimées comme le nombre de taches/106 cellules.Biotinylated IgA and the streptavidin-biotinylated peroxidase complex were from Amersham. The spots were revealed under the action of the AEC substrate (Sigma) and as soon as the plates were dry, they were counted under a microscope (magnification 16 or 40X). The mean values corresponding to the number of spots (spots) of IgA in four wells were calculated and expressed as the number of spots / 10 6 cells.
Analyse de la réponse par ELISA Les analyses par ELISA ont été exécutées conformément au protocole standard (les conjugués biotinylés et la streptavidine peroxydase provenaient de chez Amersham et le substrat OPD (O-phenyldiamine dihydrochloride) de chez Sigma). Les plaques étaient enduites d'extraits H. pylori (5 μg/ml) dans du tampon carbonate. Un sérum de contrôle de souris dirigé contre l'extrait d'H. pylori a été introduit dans chaque expérience. Le titre correspond à l'inverse de la dilution donnant une DO de 1,5 à 490 nm. 1B - RésultatsAnalysis of the response by ELISA The analyzes by ELISA were carried out in accordance with the standard protocol (the biotinylated conjugates and streptavidin peroxidase came from Amersham and the substrate OPD (O-phenyldiamine dihydrochloride) from Sigma). The plates were coated with H. pylori extracts (5 μg / ml) in carbonate buffer. A mouse control serum directed against the extract of H. pylori was introduced in each experiment. The titer corresponds to the inverse of the dilution giving an OD of 1.5 to 490 nm. 1B - Results
Les résultats sont présentés dans les Figures 1 et 2 décrites ci-avant et commentées comme suit :The results are presented in Figures 1 and 2 described above and commented as follows:
Avant tout commentaires au sujet des Figures 1 et 2, on note que ces figures présentent les résultats obtenus avec l'antigène utilisé adjuvante par de la toxine cholérique et administré par voie intragastrique. Cette expérience est dite expérience de référence standard dans la mesure où l'association de l'art antérieur CT / IG est celle qui donne les meilleurs résultats à ce jour.Before commenting on Figures 1 and 2, it should be noted that these figures present the results obtained with the antigen used as an adjuvant by cholera toxin and administered by the intragastric route. This experiment is called standard reference experiment insofar as the combination of the prior art CT / IG is that which gives the best results to date.
La Figure 1 montre qu'une préparation d'uréase encapsulée dans des liposomes DC- chol donne d'aussi bons résultats que ceux obtenus dans l'expérience de référence standard.Figure 1 shows that a urease preparation encapsulated in DC-chol liposomes gives as good results as those obtained in the standard reference experiment.
De plus, on fait référence aux expériences (a) à (d) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 1 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 5/10, (b) 4/10, (c) 0/10 et (d) 10/10. Ceci est en accord avec ce qui a été conclu au paragraphe précédemment ; à savoir que l'expérience (a) conduit à des résultats similaires à ceux obtenus lors de l'expérience de référence standard.In addition, reference is made to experiments (a) to (d), the results of which in terms of urease activity 4 hrs after the mice have been sacrificed are shown in FIG. 1 and it is indicated that the number of mice which are still negative for urease activity 24 hrs after being sacrificed is (a) 5/10, (b) 4/10, (c) 0/10 and (d) 10/10 respectively. This is in accordance with what was concluded in the previous paragraph; namely that experiment (a) leads to results similar to those obtained during the standard reference experiment.
La Figure 2 montre qu'une préparation d'uréase adjuvantée par le QS-21 donne d'aussi bons résultats que ceux obtenus dans l'expérience de référence standard. De plus, cette figure montre que les résultats que l'on obtient en utilisant le PCPP à titre d'ajuvant sont beaucoup moins bons que ceux obtenus avec le QS-21. Ceci s'explique dans la mesure où le PCPP induit préférentiellement avec l'uréase une réponse de type Th2 tandis que le QS-21 avec l'uréase induit une réponse équilibrée Thl/Th2 ; ainsi que cela est démontré dans le tableau ci après.Figure 2 shows that an urease preparation adjuvanted by QS-21 gives as good results as those obtained in the standard reference experiment. In addition, this figure shows that the results obtained using PCPP as an adjuvant are much worse than those obtained with QS-21. This is explained by the fact that the PCPP preferentially induces with the urease a Th2 type response while the QS-21 with the urease induces a balanced Th1 / Th2 response; as shown in the table below.
De plus, on fait référence aux expériences (a) à (e) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 2 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 1/8, (b) 0/8, (c) 5/8, (d) 0/8 et (e) 10/10. Ceci est en accord avec ce qui a été conclu au paragraphe précédemment ; à savoir que l'expérience (c) conduit à des résultats similaires à ceux obtenus lors de l'expérience de référence standard.In addition, reference is made to experiments (a) to (e) whose results in terms of urease activity 4 hrs after the mice have been sacrificed are shown in FIG. 2 and it is indicated that the number of mice which are still negative for urease activity 24 hrs after being sacrificed is respectively (a) 1/8, (b) 0/8, (c) 5/8, (d) 0/8 and (e) 10/10. This is in accordance with what was concluded in the paragraph previously; namely that experiment (c) leads to results similar to those obtained during the standard reference experiment.
Le tableau ci-après présente les quantités d'IgA, IgGl et IgG2a sériques induites lors des expériences dont les résultats en termes d'activité uréase sont reportés dans les Figures 1 et 2 ainsi que le nombre de souris dont l'activité uréase est caractérisée par une DO inférieure à 0.1 après 4 et 24 hrs après sacrifice. Les quantités d'IgA, IgG l et IgG2a sont exprimées en titre ELISA.The table below presents the quantities of serum IgA, IgG1 and IgG2a induced during the experiments whose results in terms of urease activity are reported in Figures 1 and 2 as well as the number of mice whose urease activity is characterized by an OD less than 0.1 after 4 and 24 hrs after sacrifice. The amounts of IgA, IgG 1 and IgG2a are expressed as ELISA titer.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0001
Les résultats présentés dans le tableau ci-avant montrent que lorsque la voie sous- cutanée est employée (ainsi qu'un adjuvant approprié pour cette voie), le taux d'anticorps sérique est important ; ce qui n'est pas le cas après usage de la voie intragastrique (et de l'adjuvant qui est approprié à cette voie). De plus, ces résultats montrent que lorsque l'on utilise le DC-chol ou le QS-21 , on obtient un fort taux d'IgG2a, comparable au taux d'IgGl en ordre de grandeur. Ceci indique que ces adjuvants ont la capacité d'induire non seulement une réponse Th2, mais aussi une réponse Thl . Par contre, lorsque l'on utilise le PCPP, le taux d'IgG2a obtenu est nettement plus faible que le taux d'IgGl . On en conclut que ce dernier adjuvant induit essentiellement une réponse Th2 et ne peut donc pas être un adjuvant utile aux fins de la présente invention. Exemple 2 : Etudes d'immunisation chez les singesThe results presented in the table above show that when the subcutaneous route is used (as well as an appropriate adjuvant for this route), the level of serum antibody is high; which is not the case after use of the intragastric route (and of the adjuvant which is suitable for this route). In addition, these results show that when using DC-chol or QS-21, a high level of IgG2a is obtained, comparable to the level of IgG1 in order of magnitude. This indicates that these adjuvants have the capacity to induce not only a Th2 response, but also a Th1 response. On the other hand, when using PCPP, the level of IgG2a obtained is clearly lower than the level of IgG1. It is concluded that the latter adjuvant essentially induces a Th2 response and therefore cannot be a useful adjuvant for the purposes of the present invention. Example 2 Immunization Studies in Monkeys
2A - Matériel et méthodes2A - Materials and methods
SingesMonkeys
Vingt huit singes (Macaca fascicularis) âgés de 2 ans et originaires de l'île Maurice ont été utilisés dans cette étude. Avant de sousmettre les singes aux différents protocoles d'immunisation décrits ci-après, une biopsie a révélé que la plupart d'entre eux étaient infectés de manière chronique par des organismes proches de Gastrospirillum hominis (GHLO) ou de H. heilmanii.Twenty-eight 2-year-old monkeys (Macaca fascicularis) from Mauritius were used in this study. Before submitting the monkeys to the various immunization protocols described below, a biopsy revealed that most of them were chronically infected with organisms close to Gastrospirillum hominis (GHLO) or H. heilmanii.
Protocoles d'administrationAdministration protocols
Puisque presque tous les singes étaient infectés par des GHLO, on a décidé de tester l'efficacité de différents protocoles en thérapie. Trois protocoles ont été mis en oeuvre, tels que résumés dans le tableau ci après :Since almost all monkeys were infected with GHLO, it was decided to test the effectiveness of different therapy protocols. Three protocols have been implemented, as summarized in the table below:
Groupe J0 J21 J42 J63Group J0 J21 J42 J63
1 et lu IN + IG IN + IG IN + IG IN + IG1 and read IN + IG IN + IG IN + IG IN + IG
2 et 2u IM IM IM IM2 and 2u IM IM IM IM
3 et 3u IM IN + IG IM IN + IG3 and 3u IM IN + IG IM IN + IG
On précise que l'administration par voie intramusculaire a été effectuée dans les muscles dorso-lombaires.It is specified that the intramuscular administration was carried out in the dorso-lumbar muscles.
Antigènes et adjuvantsAntigens and adjuvants
Dans la mesure où il existe une réactivité croisée entre les GPLO et H. pylori, on a choisit d'utiliser une préparation de bactéries H. pylori inactivées, telle que décrite dans l'exemple 1A, seule ou en combinaison avec de l'uréase recombinante préparée selon la méthode référencée dans l'exemple 1A.Insofar as there is a cross-reactivity between the GPLOs and H. pylori, it was chosen to use a preparation of inactivated H. pylori bacteria, as described in Example 1A, alone or in combination with urease recombinant prepared according to the method referenced in Example 1A.
La heat-labile toxine d'E. coli (LT) (Sigma) ou la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) (Pasteur Mérieux sérums & vaccins) a été utilisé comme adjuvant mucosal tandis que le DC-chol a été utilisé comme adjuvant parentéral. De la poudre de DC-chol est simplement réhydratée par une préparation d'antigène. Les doses utilisées sont comme suit :E. toxin heat-labile. coli (LT) (Sigma) or the cholera toxin B (CTB) subunit (Pasteur Mérieux sera & vaccines) was used as a mucosal adjuvant while DC-chol was used as a parenteral adjuvant. DC-chol powder is simply rehydrated by an antigen preparation. The doses used are as follows:
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0001
Biopsies, test uréase et étude bactériologique / histologique On a effectué une biopsie sur chacun des singes avant et après immunisation (un mois après le troisième rappel). A partir des biopsies, un test uréase et une étude histologique ont été mis en oeuvre.Biopsies, urease test and bacteriological / histological study A biopsy was performed on each of the monkeys before and after immunization (one month after the third booster). From the biopsies, a urease test and a histological study were carried out.
L'activité uréase est évaluée en utilisant le kit Jatrox (Procter & Gamble). L'importance de cette activité est estimée comme suit, de manière décroissante : niveau 3, coloration rose apparaissant au cours des 10 premières minutes ; niveau 2, coloration rose apparaissant entre 10 et 30 minutes après l'adjonction des réactifs; niveau 1, coloration rose apparaissant entre 30 min et 4 hrs et niveau 0, coloration faible ou inexistante après 4 hrs.Urease activity is evaluated using the Jatrox kit (Procter & Gamble). The importance of this activity is estimated as follows, decreasingly: level 3, pink coloration appearing during the first 10 minutes; level 2, pink coloration appearing between 10 and 30 minutes after the addition of the reagents; level 1, pink coloring appearing between 30 min and 4 hrs and level 0, weak or non-existent coloring after 4 hrs.
Les études histologiques ont été réalisées à partir de biopsies fixées dans du formol et la charge bactérienne quantifiée comme suit : absence de bactéries (0) ; quelques bactéries de type Helicobacter (0,5) ; d'assez nombreuses bactéries (1) ; de nombreuses bactéries (2) ; de très nombreuses bactéries (3). Une différence d'un niveau (de 1 à 2 par exemple) correspond à un nombre 5 fois plus important de bactéries.The histological studies were carried out using biopsies fixed in formalin and the bacterial load quantified as follows: absence of bacteria (0); some Helicobacter type bacteria (0.5); quite a number of bacteria (1); many bacteria (2); numerous bacteria (3). A difference of one level (from 1 to 2 for example) corresponds to a 5 times higher number of bacteria.
Analyse de la réponse par test ELISAResponse analysis by ELISA test
Un test ELISA est mis en oeuvre comme décrit dans l'exemple 1 A.An ELISA test is carried out as described in Example 1 A.
2B - Résultats2B - Results
Le tableau ci-dessous est relatif à la charge bactérienne qui, avant et après immunisation, est appréciée à l'aide de deux tests : (i) en évaluant l'activité uréase et (ii) en effectuant une étude histologique. Les résultats y afférant sont présentés dans les colonnes 3 à 6. Les trois dernières colonnes indiquent pour chaque groupes (contrôle, 1, 2 ou 3) le nombre de singes pour lesquels la charge bactérienne reste inchangée après immunisation ( _>) d'après les deux tests ; ou apparaît moindre (il) ou accrue (TJ) dans au moins un des deux tests, l'autre test indiquant une charge bactérienne stationnaire. Lorsque les résultats des deux tests vont dans le même sens, la flèche ascendante ou descendante est double.The table below relates to the bacterial load which, before and after immunization, is assessed using two tests: (i) by evaluating urease activity and (ii) by carrying out a histological study. The results relating thereto are presented in columns 3 to 6. The last three columns indicate for each group (control, 1, 2 or 3) the number of monkeys for which the bacterial load remains unchanged after immunization (_>) according to the two tests; or appears less (it) or increased (TJ) in at least one of the two tests, the other test indicating a stationary bacterial load. When the results of the two tests go in the same direction, the upward or downward arrow is double.
Figure imgf000031_0001
Ainsi, ce tableau révèle que dans le groupe ayant été soumis à un protocole d'immunisation par la voie muqueuse stricte, les résultats sont sensiblement identiques à ceux obtenus avec le groupe contrôle négatif. Par contre, dans les groupes ayant été soumis à un protocole d'immunisation par voie mixte muqueuse et intramusculaire ou par la voie intramusculaire stricte, on observe une nette réduction de la charge bactérienne. Ceci met en lumière l'importance des conditions d'immunisation et en particulier de l'adjuvant utilisé ; et en conséquence, on recommende l'usage d'un adjuvant tel que le DC-chol, capable de favoriser une réponse Thl et Th2 équilibrée, afin d'obtenir un effet protecteur.
Figure imgf000031_0001
Thus, this table reveals that in the group having been subjected to a strict mucosal immunization protocol, the results are substantially identical to those obtained with the negative control group. On the other hand, in the groups having been subjected to an immunization protocol by mixed mucosal and intramuscular route or by the strict intramuscular route, a marked reduction in the bacterial load is observed. This highlights the importance of the immunization conditions and in particular of the adjuvant used; and therefore, we recommend the use of an adjuvant such as DC-chol, capable of promoting a balanced Thl and Th2 response, in order to obtain a protective effect.
Ces résultats sont à mettre en perspective avec d'autres résultats relatifs aux taux d'anticorps sériques qui sont présentés dans la Figure 3. Cette figure montre que que le schéma d'immunisation par voie muqueuse stricte (1 et lu) conduit à des résultats très similaires à ceux du groupe contrôle négatif. Par contre, le schéma d'immunisation par voie mixte muqueuse et intramusculaire (2 et 2u) et mieux encore le schéma d'immunisation par voie intramusculaire stricte (3 et 3u), permet d'induire des taux d'anticorps nettement supérieurs à ceux du groupe contrôle.These results are to be put in perspective with other results relating to the levels of serum antibodies which are presented in Figure 3. This figure shows that the strict mucosal immunization scheme (1 and read) leads to results very similar to those of the negative control group. On the other hand, the immunization scheme by mixed mucosal and intramuscular route (2 and 2u) and better still the strict intramuscular immunization scheme (3 and 3u), makes it possible to induce antibody levels significantly higher than those of the control group.
Ainsi, une réponse sérique importante peut être corrélée à un effet protecteur, tandis qu'a contrario, une faible réponse est liée à l'absence d'effet protecteur. Les conditions d'immunisation permettant d'obtenir l'effet désiré (réponse sérique importante et effet protecteur) inclut l'usage de la voie parentérale ciblée dans la région sous-diaphragmatique ou celui d'un adjuvant Thl .Thus, an important serum response can be correlated with a protective effect, while on the contrary, a weak response is linked to the absence of protective effect. The immunization conditions enabling the desired effect to be obtained (significant serum response and protective effect) include the use of the targeted parenteral route in the sub-diaphragmatic region or that of a Thl adjuvant.
Exemple 3 : Autres études d'immunisation chez la sourisEXAMPLE 3 Other Immunization Studies in Mice
3A - Matériel et méthodes3A - Materials and methods
SourisMouse
Des souris femelles Swiss de 6/8 semaines ont été fournies par Janvier (France). Pendant toute la durée de l'expérience on a utilisé du matériel stérilisé ; les cages étaient protégées par des "isocaps" ; les souris ont été nourries avec de l'eau filtrée et des aliments irradiés. Protocole d'administration6/8 week old Swiss female mice were supplied by Janvier (France). For the duration of the experiment, sterilized equipment was used; the cages were protected by "isocaps"; the mice were fed filtered water and irradiated food. Administration protocol
Lors de chaque expérience, les souris ont reçues 3 doses du même produit ; chaque dose à 21 jours d'intervalle (les jours 0, 21 et 42). L'administration du produit a été effectuée par voie orale (300 μl en 0,2 M NaHCOβ par gavage gastrique), ou par voie sous-cutanée (300 μl sous la peau du côté gauche de la région lombaire). Dix μg d'uréase ont été administrés sous cutanée et 40 μg par voie orale.During each experiment, the mice received 3 doses of the same product; each dose 21 days apart (days 0, 21 and 42). The administration of the product was carried out orally (300 μl in 0.2 M NaHCOβ by gastric gavage), or by subcutaneous route (300 μl under the skin on the left side of the lumbar region). Ten μg of urease was administered subcutaneously and 40 μg orally.
Antigènes et adjuvantsAntigens and adjuvants
L'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori a été exprimée dans E. coli et purifiée comme cela a été décrit dans l'exemple 5 de WO96/31235. Dans la suite du texte pour désigner cette apoenzyme, on emploie le simple terme d'uréase.The apoenzyme of H urease. pylori was expressed in E. coli and purified as described in Example 5 of WO96 / 31235. In the following text to designate this apoenzyme, the simple term urease is used.
La heat-labile toxine d'E. coli (Sigma) est utilisée comme adjuvant mucosal à raison de 1 μg / dose d'uréase.E. toxin heat-labile. coli (Sigma) is used as a mucosal adjuvant at a rate of 1 μg / dose of urease.
Le QS-21 (Cambridge Biosciences) est utilisé comme adjuvant à raison de 15 μg / dose d'uréase.QS-21 (Cambridge Biosciences) is used as an adjuvant at a rate of 15 μg / dose of urease.
Le Bay RI 005 (Bayer) est utilisé comme adjuvant à raison de 400 μg / dose d'uréase.Bay RI 005 (Bayer) is used as an adjuvant at a rate of 400 μg / dose of urease.
Le DC-chol (R-Gene Therapeutics) est utilisé comme adjuvant à raison de 65 μg / dose d'uréase.DC-chol (R-Gene Therapeutics) is used as an adjuvant at a rate of 65 μg / dose of urease.
Le polyphosphazene (PCPP) (Virus Research Institute) est utilisé comme adjuvant à raison de 100 μg / dose d'uréase.Polyphosphazene (PCPP) (Virus Research Institute) is used as an adjuvant at a rate of 100 μg / dose of urease.
EpreuveTest
Quatre semaines après le deuxième rappel, les souris ont été soumises à un gavage gastrique avec 300 μl (3 x 106 bactéries vivantes) d'une suspension d'une souche d'H. pylori adaptée à la souris et résistante à la Streptomycine, la souche ORV2001. Un groupe n'ayant reçu aucune dose d'antigène et servant de contrôle est éprouvé de même.Four weeks after the second booster, the mice were subjected to gastric gavage with 300 μl (3 x 10 6 live bacteria) of a suspension of a strain of H. pylori adapted to mice and resistant to Streptomycin, the strain ORV2001. A group having received no dose of antigen and serving as a control is likewise tested.
La suspension d'épreuve est préparée comme suit : H. pylori est cultivée sur agar Muller-Ηinton (Difco) contenant 5 % de sang de mouton (bioMérieux) (milieuThe test suspension is prepared as follows: H. pylori is cultured on Muller-Ηinton agar (Difco) containing 5% sheep blood (bioMérieux) (medium
MΗA) qui contient les antibiotiques suivants de chez Sigma : Triméthoprim 5 μg/ml,MΗA) which contains the following antibiotics from Sigma: Trimethoprim 5 μg / ml,
Vancomycine 10 μg/ml, Polymixine B 1.3 μg/ml, Amphotéricine 5 μg/ml et Streptomycine 50 μg/ml. Les boîtes de culture sont incubées pendant 3 jours à 37°C dans des conditions de microaérophilie (Anaerocult C, Merck). Cette culture est récoltée pour ensemenser un flacon pourvu d'évents de 75 cm2 (Costar) contenant 50 ml de Brucella broth complementé par 5 % de sérum de veau foetal et par les antibiotiques sus-nommés. Le flacon est incubé dans des conditions de micro aérophilie, sous agitation douce pendant 24 hours. La suspension est alors diluée en Brucella broth pour donner une DO de 0,1 à 550 nm (soit 107 CFU/ml).Vancomycin 10 μg / ml, Polymixin B 1.3 μg / ml, Amphotericin 5 μg / ml and Streptomycin 50 μg / ml. The culture dishes are incubated for 3 days at 37 ° C. under microaerophilic conditions (Anaerocult C, Merck). This culture is harvested to inoculate a bottle provided with vents of 75 cm 2 (Costar) containing 50 ml of Brucella broth supplemented with 5% fetal calf serum and with the abovementioned antibiotics. The bottle is incubated under micro aerophilic conditions, with gentle shaking for 24 hours. The suspension is then diluted in Brucella broth to give an OD of 0.1 to 550 nm (or 10 7 CFU / ml).
Analyse de l'épreuve Quatre semaines après l'épreuve, les souris ont été sacrifiées par rupture des vertèbres cervicales. Les estomacs ont été prélevés pour évaluer l'activité uréase et la charge bactérienne par culture quantitative. Un quart longitudinal de l'estomac (antrum + corpus) est utilisé pour chacun des tests. L'activité uréase a été évaluée après 4 et 24 heures (DO à 550 nm) avec le Jatrox test, Procter & Gamble) et après 24 heures le nombre de souris encore négatives (DO inférieure à 0,1) a été relevé.Analysis of the test Four weeks after the test, the mice were sacrificed by rupture of the cervical vertebrae. The stomachs were removed to evaluate the urease activity and the bacterial load by quantitative culture. A longitudinal quarter of the stomach (antrum + corpus) is used for each of the tests. Urease activity was evaluated after 4 and 24 hours (OD at 550 nm) with the Jatrox test, Procter & Gamble) and after 24 hours the number of mice still negative (OD less than 0.1) was noted.
Evaluation de l'infection par culture quantitative d'H. pyloriEvaluation of infection by quantitative culture of H. pylori
Au moment où les souris sont sacrifiées, la muqueuse d'un quart de l'estomac de chaque souris est disposée dans le milieu Portagem de bioMérieux puis dans les deux heures qui suivent, transférée en chambre de culture. L'échantillon est alors homogénéisé en utilisant un homogénéisateur de Dounce (Wheaton, Millville USA) contenant 1 ml de milieu Brucella (Brucella broth) et dilué en série jusqu'à 10~3. Cent μl de chaque dilution (10°, 10_ 1, 10"- et 10~3) sont répandus dans des boîtes de Pétri contenant du milieu MΗA supplémenté par les antibiotiques sus-nommés, pour culture à 37°C dans des conditions de microaérophilie pendant 4 ou 5 jours. On décompte alors le nombre de bactéries viables. H pylori est identifiée par sa morphologie révélée par une coloration de Gram et par des réactions positives à des tests uréase, catalase et oxidase.When the mice are sacrificed, the mucosa of a quarter of the stomach of each mouse is placed in the Portagem medium of bioMérieux and then within two hours, transferred to the culture chamber. The sample is then homogenized using a Dounce homogenizer (Wheaton, Millville USA) containing 1 ml of Brucella medium (Brucella broth) and diluted in series to 10 ~ 3 . One hundred μl of each dilution (10 °, 10 _ 1 , 10 " - and 10 ~ 3 ) are spread in Petri dishes containing MΗA medium supplemented with the above-mentioned antibiotics, for culture at 37 ° C under conditions of microaerophilia for 4 or 5 days, counting the number of viable bacteria, H pylori is identified by its morphology revealed by Gram staining and by positive reactions to urease, catalase and oxidase tests.
Analyse de la réponse par ELISAResponse analysis by ELISA
Les analyses par ELISA ont été exécutées conformément au protocole standard (les conjugués biotinylés et la streptavidine peroxydase provenaient de chez Amersham et le substrat OPD de chez Sigma). Les plaques étaient enduites d'extraits H pylori (5 μg/ml) dans du tampon carbonate. Un sérum de contrôle de souris dirigé contre l'extrait d'H. pylori a été introduit dans chaque expérience. Le titre correspond à l'inverse de la dilution donnant une DO de 1 ,5 à 490 nm. 3B - RésultatsThe ELISA analyzes were carried out according to the standard protocol (the biotinylated conjugates and streptavidin peroxidase came from Amersham and the OPD substrate from Sigma). The plates were coated with H pylori extracts (5 μg / ml) in carbonate buffer. A mouse control serum directed against the extract of H. pylori was introduced in each experiment. The titer corresponds to the inverse of the dilution giving an OD of 1.5 to 490 nm. 3B - Results
Avant tout commentaires au sujet des Figures 4 à 7, on note que ces figures présentent les résultats obtenus avec l'antigène utilisé adjuvante par de la LT et administré par voie intragastrique. Cette expérience est dite expérience de référence standard dans la mesure où l'association de l'art antérieur LT / IG est celle qui donne les meilleurs résultats à ce jour.Before any comments on Figures 4 to 7, it is noted that these figures present the results obtained with the antigen used adjuvant by LT and administered intragastrically. This experiment is called standard reference experiment insofar as the combination of the prior art LT / IG is that which gives the best results to date.
Réponse sérique Comme montré dans la Figure 4, après trois immunisations, toutes les souris immunisées par voie sous-cutanée présentent une réponse sérique importante en IgG. Sur la base des rapports IgG l :IgG2a, on remarque que le PCPP induit une réponse prédominante de type Th2 (fort taux IgGl, faible taux IgG2a). Le Bay RI 005 et le DC-chol induisent une réponse plus équilibrée de type Thl / Th2. Enfin le QS-21 induit une réponse prédominante de type Thl. En fait, la différence principale entre les quatre groupes de souris Al à A4 réside dans leurs titres IgG2a, les titres IgG l étant tous similaires.Serum response As shown in Figure 4, after three immunizations, all mice immunized subcutaneously show a significant serum IgG response. On the basis of the IgG 1: IgG2a ratios, it is noted that the PCPP induces a predominant response of the Th2 type (high IgG1 level, low IgG2a level). Bay RI 005 and DC-chol induce a more balanced Thl / Th2 response. Finally, QS-21 induces a predominant Thl-type response. In fact, the main difference between the four groups of mice A1 to A4 lies in their IgG2a titers, the IgG l titers all being similar.
Protection après épreuve Les Figures 5 à 7 montrent que le niveau de protection dans les groupes Al et A2 est similaire à ou même meilleur que celui observé dans le groupe de référence (LT). ILs s'agit des groupes ayant reçues les doses d'uréase en présence du QS-21 et du Bay RI 005 respectivement. Le groupe A3 (DC-chol) présente un niveau de protection légèrement moindre. Par contre, dans le groupe A4 (PCPP), il n'est pas possible de mettre en évidence un effet protecteur important. On note que les résultats présentés dans les Figures 5 à 7 sont consistents entre eux.Post-test protection Figures 5 to 7 show that the level of protection in groups A1 and A2 is similar to or even better than that observed in the reference group (LT). These are the groups that received the urease doses in the presence of QS-21 and Bay RI 005 respectively. Group A3 (DC-chol) has a slightly lower level of protection. On the other hand, in group A4 (PCPP), it is not possible to demonstrate a significant protective effect. Note that the results presented in Figures 5 to 7 are consistent with each other.
Lorsque l'on met en parallèle les résultats présentés dans la Figure 4 d'une part et les Figures 5 à 7 d'autre part, on est en droit de conclure que l'usage d'un adjuvant capable d'induire une réponse Thl ou Thl / Th2 (QS-21, Bay R1005 ou DC-chol) favorise la mise en place d'un effet protecteur ; contrairement à l'usage d'un adjuvant de type Th2 (PCPP). Exemple 4 : Traitement d'une infection à H. pylori chez la sourisWhen we compare the results presented in Figure 4 on the one hand and Figures 5 to 7 on the other, we are entitled to conclude that the use of an adjuvant capable of inducing a Thl response or Thl / Th2 (QS-21, Bay R1005 or DC-chol) promotes the establishment of a protective effect; unlike the use of a Th2 type adjuvant (PCPP). EXAMPLE 4 Treatment of an H. pylori Infection in Mice
Nous avons comparé l'efficacité de l'immunisation par voie sous-cutanée (SC) par rapport à la voie mucosale afin de soigner une infection à H. pylori dans un modèle de souris.We compared the effectiveness of subcutaneous (SC) immunization versus the mucosal route to treat H. pylori infection in a mouse model.
Des souris OF1 ont été infectées avec 106 colonies formant plaques (cfu) de la souche d'H. pylori ORV2001. Après un mois, on a vérifié que l'infection était bien établie en sacrifiant au hasard 10/100 souris et en testant l'activité uréase sur un quart de la totalité de l'estomac. Les résultats étant tous positifs, nous avons alors immunisé des souris (10 par groupe) 3 fois à 3 semaines d'intervalle, soit par voie sous-cutanée en utilisant 10 μg d'uréase recombinante adjuvée avec 15 μg de QS21 (Aquila) ou 400 μg d'adjuvant Bay R1005 (Bayer), soit par voie orale en utilisant 40 μg d'uréase mélangée à 1 μg de LT. Pour chacun des deux adjuvants administrés par voie parentérale, l'immunisation a été réalisée soit dans le cou, afin d'atteindre les ganglions lymphatiques de la région supérieure du corps, soit dans la région lombaire afin d'atteindre les ganglions lymphatiques abdominaux. Dix souris ont été laissées non-infectées et non-immunisées (contrôle négatif), alors que les souris du groupe contrôle positif ont reçu une solution saline, du QS21 ou de l'adjuvant Bay par voie sous-cutanée (région lombaire).OF1 mice were infected with 10 6 plaque-forming colonies (cfu) of the H. strain. pylori ORV2001. After one month, it was verified that the infection was well established by randomly sacrificing 10/100 mice and testing urease activity on a quarter of the entire stomach. The results being all positive, we then immunized mice (10 per group) 3 times at 3 weeks apart, either subcutaneously using 10 μg of recombinant urease adjuvant with 15 μg of QS21 (Aquila) or 400 μg of Bay R1005 adjuvant (Bayer), or orally using 40 μg of urease mixed with 1 μg of LT. For each of the two adjuvants administered parenterally, immunization was performed either in the neck, to reach the lymph nodes in the upper region of the body, or in the lumbar region, to reach the abdominal lymph nodes. Ten mice were left uninfected and unimmunized (negative control), while mice in the positive control group received saline, QS21 or Bay adjuvant subcutaneously (lumbar region).
Un mois après la troisième immunisation, toutes les souris ont été sacrifiées et les estomacs prélevés afin d'évaluer l'étendue de la colonisation en mesurant l'activité de l'uréase (10/10 souris furent analysées dans chaque groupe) ainsi qu'en effectuant une culture quantitative (5/10 souris furent analysées). Les Figures 6A (test portant sur l'uréase) et 6B (culture) montrent que chez les souris immunisées avec l'uréase adjuvée avec du QS21 par voie sous-cutanée dans la région lombaire, l'infection avait quasiment disparu (4/5 souris étaient négatives en culture quantitative). Les souris immunisées avec l'uréase par voie sous-cutanée dans le cou, en présence de QS21 et les souris recevant l'uréase plus de la LT par voie orale présentaient une diminution de l'infection de 10 à 100 par rapport aux souris non-immunisées. L'adjuvant Bay avait induit une diminution identique, plus prononcée chez les souris immunisées dans la région lombaire.One month after the third immunization, all the mice were sacrificed and the stomachs removed in order to assess the extent of colonization by measuring the activity of urease (10/10 mice were analyzed in each group) as well as by carrying out a quantitative culture (5/10 mice were analyzed). Figures 6A (urease test) and 6B (culture) show that in mice immunized with urease adjuvanted with QS21 subcutaneously in the lumbar region, the infection had almost disappeared (4/5 mice were negative in quantitative culture). Mice immunized with urease subcutaneously in the neck, in the presence of QS21 and mice receiving urease plus LT by the oral route showed a decrease in infection of 10 to 100 compared to mice not -immunized. The Bay adjuvant induced an identical decrease, more pronounced in the immunized mice in the lumbar region.
La réalisation d'une histopathologie sur ces mêmes souris n'a pas révélé de gastrite plus importante par rapport aux contrôles. Comme nous l'avions observé dans notre précédente étude prophylactique (Exemple 1), les souris protégées présentaient un taux sérique élevé des deux isotypes IgGl et IgG2, ce qui est représentatif d'une réponse équilibrée Th2/Thl . De plus, les souris immunisées par voie sous-cutanée dans la région lombaire présentaient les plus hauts niveaux sériques en IgA, ce qui démontre une réponse mucosale.Performing histopathology on these same mice did not reveal any greater gastritis compared to the controls. As we observed in our previous prophylactic study (Example 1), protected mice had a high serum level of the two isotypes IgGl and IgG2, which is representative of a balanced Th2 / Thl response. In addition, mice immunized subcutaneously in the lumbar region had the highest serum IgA levels, demonstrating a mucosal response.
Ces résultats indiquent que l'immunisation systemique ciblée est capable de guérir une infection à H. pylori acquise chez une souris, et que l'utilisation d'adjuvants induisant une réponse mucosale équilibrée de type Thl/Th2 est souhaitable afin d'atteindre ce but. These results indicate that targeted systemic immunization is capable of curing an infection with H. pylori acquired in a mouse, and that the use of adjuvants inducing a balanced mucosal response of the Thl / Th2 type is desirable in order to achieve this goal. .

Claims

RevendicationsClaims
1. Une composition pharmaceutique qui comprend un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et au moins un composé sélectionné parmi :1. A pharmaceutical composition which comprises an immunogenic agent derived from Helicobacter and at least one compound selected from:
(i) des saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria ;(i) saponins purified from an extract of Quillaja saponaria;
(ii) des lipides cationiques ou un sel de ces derniers ; lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires ; à condition que ces lipides ne soient pas présentés sous forme de liposomes lorsque ladite composition ne contient pas de saponine ni de glycolipopeptide de formule (I) ; et(ii) cationic lipids or a salt thereof; said lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines; provided that these lipids are not presented in the form of liposomes when said composition does not contain saponin or glycolipopeptide of formula (I); and
(iii) des glycolipopeptides de formule (I) :(iii) glycolipopeptides of formula (I):
dans laquelle
Figure imgf000038_0001
in which
Figure imgf000038_0001
R1 représente un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone,R 1 represents a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and containing from 1 to 50 carbon atoms,
X représente -CH2-, -O- ou -NH-,X represents -CH 2 -, -O- or -NH-,
R- représente un atome d'hydrogène ou un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone, R3, R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste acyl-CO-R6, dans lequel R6 représente un reste alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone,R- represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and comprising from 1 to 50 carbon atoms, R 3 , R 4 and R 5 each represent, independently of one another, a hydrogen atom or an acyl-CO-R 6 residue, in which R 6 represents an alkyl residue having from 1 to 10 atoms carbon,
R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C,-C7, hydroxyméthyle, 1-hydroxyéthyle, mercaptoméphyle, 2- (méthylthio)-éthyle, 3-aminopropyle, 3-uréido-propyle, 3- guanidylpropyle, 4-aminobutyle, carboxyméthyle, carbamoylméthyle, 2-carboxéthyle, 2-carbamoyléthyle, benzyle, 4-hydroxybenzyle, 3-indolylméthyle ou 4- imidazolylméthyle,R 7 represents a hydrogen atom, a C 7 -C 7 alkyl group, hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, mercaptomephyl, 2- (methylthio) -ethyl, 3-aminopropyl, 3-ureido-propyl, 3-guanidylpropyl, 4 -aminobutyl, carboxymethyl, carbamoylmethyl, 2-carboxethyl, 2-carbamoylethyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, 3-indolylmethyl or 4-imidazolylmethyl,
R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, etR 8 represents a hydrogen atom or a methyl group, and
R9 représente un atome d'hydrogène, un groupe acétyle, benzoyle, trichloracétyle, trifluoracétyle, méthoxycarbonyle, t- butyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, etR 9 represents a hydrogen atom, an acetyl, benzoyl, trichloracetyl, trifluoroacetyl, methoxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl group, and
R7 et R8 peuvent, quand ils sont pris ensemble, représenter un groupe
Figure imgf000039_0001
R 7 and R 8 can, when taken together, represent a group
Figure imgf000039_0001
2. Une composition selon la revendication 1, qui comprend au moins deux composés ; un premier composé étant sélectionné parmi les saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria et un deuxième composé étant sélectionné parmi des lipides cationiques ou un sel de ces derniers ; lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires.2. A composition according to claim 1, which comprises at least two compounds; a first compound being selected from saponins purified from an extract of Quillaja saponaria and a second compound being selected from cationic lipids or a salt thereof; said lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines.
Une composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le composé est une saponine qui est la fraction QS-21 purifiée à partir d'un extrait de Quillaja saponaria. A composition according to claim 1 or 2, wherein the compound is a saponin which is the QS-21 fraction purified from an extract of Quillaja saponaria.
4. Une composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le composé est un lipide cationique mis sous forme de dispersion.4. A composition according to claim 1 or 2, wherein the compound is a cationic lipid in the form of a dispersion.
5. Une composition selon la revendication 1 , 2 ou 4, dans laquelle le composé est un lipide cationique qui est le 3-bêta-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)- carbamoyl) cholestérol (DC-chol) ou un sel de celui-ci.5. A composition according to claim 1, 2 or 4, in which the compound is a cationic lipid which is 3-beta- (N- (N ', N'-dimethylaminoethane) - carbamoyl) cholesterol (DC-chol) or a salt of it.
6. Une composition selon la revendication 1, dans laquelle le composé est un glycolipopeptide qui est le N-(2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)- N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005).6. A composition according to claim 1, in which the compound is a glycolipopeptide which is N- (2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) - N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005).
7. Une composition selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle l'agent immunogène dérivé d' Helicobacter est sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée.7. A composition according to one of claims 1 to 6, in which the immunogenic agent derived from Helicobacter is selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a cell lysate of Helicobacter, a peptide and a polypeptide of Helicobacter under purified form.
8. Une composition selon la revendication 7, dans laquelle l'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est la sous-unité UreB ou UreA de l'uréase •d'Helicobacter.8. A composition according to claim 7, in which the immunogenic agent derived from Helicobacter is the UreB or UreA subunit of Helicobacter urease.
9. Une composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'agent immunogène est dérivé d Helicobacter pylori.9. A composition according to one of claims 1 to 8, in which the immunogenic agent is derived from Helicobacter pylori.
10. L'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'au moins un composé sélectionné parmi :10. The use of an immunogenic agent derived from Helicobacter and at least one compound selected from:
(i) des saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria ;(i) saponins purified from an extract of Quillaja saponaria;
(ii) des lipides cationiques ou un sel de ces derniers ; lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires ; à condition que ces lipides ne soient pas présentés sous forme de liposomes lorsque ladite composition ne contient pas de saponine ni de glycolipopeptide de formule (I) ; et (iii) des glycolipopeptides de formule (I)(ii) cationic lipids or a salt thereof; said lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines; provided that these lipids are not presented in the form of liposomes when said composition does not contain saponin or glycolipopeptide of formula (I); and (iii) glycolipopeptides of formula (I)
dans laquelle
Figure imgf000041_0001
in which
Figure imgf000041_0001
R1 représente un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone,R 1 represents a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and containing from 1 to 50 carbon atoms,
X représente -CH2-, -O- ou -NH-,X represents -CH 2 -, -O- or -NH-,
R2 représente un atome d'hydrogène ou un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone,R 2 represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated alkyl residue one or more times and containing from 1 to 50 carbon atoms,
R3, R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste acyl-CO-R6, dans lequel R6 représente un reste alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone,R 3 , R 4 and R 5 each represent, independently of one another, a hydrogen atom or an acyl-CO-R 6 residue, in which R 6 represents an alkyl residue having from 1 to 10 atoms carbon,
R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C,-C7, hydroxyméthyle, 1-hydroxyéthyle, mercaptoméphyle, 2- (méthylthio)-éthyle, 3-aminopropyle, 3-uréido-propyle, 3- guanidylpropyle, 4-aminobutyle, carboxyméthyle, carbamoylméthyle, 2-carboxéthyle, 2-carbamoyléthyle, benzyle, 4-hydroxybenzyle, 3-indolylméthyle ou 4- imidazolylméthyle,R 7 represents a hydrogen atom, a C 7 -C 7 alkyl group, hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, mercaptomephyl, 2- (methylthio) -ethyl, 3-aminopropyl, 3-ureido-propyl, 3-guanidylpropyl, 4 -aminobutyl, carboxymethyl, carbamoylmethyl, 2-carboxethyl, 2-carbamoylethyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl, 3-indolylmethyl or 4-imidazolylmethyl,
R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, etR 8 represents a hydrogen atom or a methyl group, and
R9 représente un atome d'hydrogène, un groupe acétyle, benzoyle, trichloracétyle, trifluoracétyle, méthoxycarbonyle, t- butyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, et R7 et R8 peuvent, quand ils sont pris ensemble, représenter un groupe
Figure imgf000042_0001
R 9 represents a hydrogen atom, an acetyl, benzoyl, trichloracetyl, trifluoroacetyl, methoxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl group, and R 7 and R 8 can, when taken together, represent a group
Figure imgf000042_0001
dans la fabrication d'une composition pharmaceutique capable d'induire une réponse immune de type T-helper 1 (Thl) à l'encontre d! Helicobacter.in the manufacture of a pharmaceutical composition capable of inducing an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against! Helicobacter.
1. L'usage selon la revendication 10, d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'au moins deux composés ; un premier composé étant sélectionné parmi les saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria et un deuxième composé étant sélectionné parmi des lipides cationiques ou un sel de ces derniers ; lesdits lipides étant des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et possédant une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison sélectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe aminé cationique sélectionné parmi les aminés primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires.1. The use according to claim 10, of an immunogenic agent derived from Helicobacter and of at least two compounds; a first compound being selected from saponins purified from an extract of Quillaja saponaria and a second compound being selected from cationic lipids or a salt thereof; said lipids being weak inhibitors of protein kinase C and having a structure which includes a lipophilic group derived from cholesterol, a linking group selected from carboxyamides and carbamoyls, a spacer arm consisting of a linear alkyl chain, branched or not, from 1 to 20 carbon atoms, and a cationic amino group selected from primary, secondary, tertiary and quaternary amines.
12. L'usage selon la revendication 10 ou 1 1, dans lequel le composé est une saponine qui est la fraction QS-21 purifiée à partir d'un extrait de Quillaja saponaria.12. The use according to claim 10 or 1 1, wherein the compound is a saponin which is the QS-21 fraction purified from an extract of Quillaja saponaria.
13. L'usage selon la revendication 10 ou 1 1, dans lequel le composé est un lipide cationique mis sous forme de dispersion.13. The use according to claim 10 or 1 1, wherein the compound is a cationic lipid in the form of dispersion.
14. L'usage selon la revendication 10, 1 1 ou 13, dans lequel le composé est le 3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-carbamoyl) cholestérol (DC-chol) ou un sel de celui-ci.14. The use according to claim 10, 1 1 or 13, wherein the compound is 3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) -carbamoyl) cholesterol (DC-chol) or a salt of this one.
15. L'usage selon la revendication 10, dans lequel le composé est un glycolipopeptide qui est le N-(2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)- N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005).15. The use according to claim 10, in which the compound is a glycolipopeptide which is N- (2-L-leucinamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl) - N-octadecyl-dodecanoylamide (Bay RI 005) .
16. L'usage selon l'une des revendications 10 à 15, dans lequel la réponse immune de type Thl est mesurée chez la souris et est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgGl supérieur ou égal à 1 : 100 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgA supérieur ou égal à 1 : 100. 16. The use according to one of claims 10 to 15, in which the Thl type immune response is measured in mice and is characterized either (i) by a ratio of ELISA IgG2a: IgGl titers greater than or equal to 1: 100 or (ii) by a ratio of ELISA IgG2a: IgA titers greater than or equal to 1: 100.
17. L'usage selon la revendication 16, dans lequel la réponse immune de type Thl est mesurée chez la souris et est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgGl supérieur ou égal à 1 : 10 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgA supérieur ou égal à 1 : 10.17. The use according to claim 16, in which the Th1 type immune response is measured in mice and is characterized either (i) by a ratio of ELISA IgG2a: IgGl titers greater than or equal to 1: 10 or (ii) by a ratio of ELISA IgG2a: IgA titers greater than or equal to 1: 10.
18. L'usage selon la revendication 17, dans lequel la réponse immune de type Th l est mesurée chez la souris et est caractérisée soit (i) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgGl supérieur ou égal à 1 : 2 ou (ii) par un rapport des titres ELISA IgG2a : IgA supérieur ou égal à 1 : 2.18. The use according to claim 17, in which the Th 1 type immune response is measured in mice and is characterized either (i) by a ratio of ELISA IgG2a: IgGl titers greater than or equal to 1: 2 or (ii ) by a ratio of ELISA IgG2a: IgA titers greater than or equal to 1: 2.
19. L'usage selon l'une des revendications 10 à 18, dans lequel l'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est sélectionné parmi une préparation de bactéries Helicobacter inactivées, un lysat cellulaire d'Helicobacter, un peptide et un polypeptide d'Helicobacter sous forme purifiée.19. The use according to one of claims 10 to 18, in which the immunogenic agent derived from Helicobacter is selected from a preparation of inactivated Helicobacter bacteria, a Helicobacter cell lysate, a Helicobacter peptide and polypeptide in purified form.
20. L'usage selon la revendication 19, dans lequel l'agent immunogène dérivé d'Helicobacter est la sous-unité UreB ou UreA de l'uréase d'Helicobacter.20. The use according to claim 19, wherein the immunogenic agent derived from Helicobacter is the UreB or UreA subunit of Helicobacter urease.
21. L'usage selon l'une des revendications 10 à 20, dans lequel l'agent immunogène est dérivé d'Helicobacter pylori.21. The use according to one of claims 10 to 20, in which the immunogenic agent is derived from Helicobacter pylori.
22. L'usage selon l'une des revendications 10 à 21, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systemique.22. The use according to one of claims 10 to 21, wherein the pharmaceutical composition is intended to be administered systemically.
23. L'usage selon la revendication 22, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systemique stricte.23. The use according to claim 22, wherein the pharmaceutical composition is intended to be administered by strict systemic route.
24. L'usage selon la revendication 22 ou 23, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systemique dans la partie d'un mammifère, notamment d'un primate située sous son diaphragme.24. The use according to claim 22 or 23, wherein the pharmaceutical composition is intended to be administered systemically in the part of a mammal, in particular a primate located under its diaphragm.
25. L'usage selon l'une des revendications 22 à 24, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par voie systemique dans la région dorso-lombaire d'un mammifère, notamment d'un primate. 25. The use according to one of claims 22 to 24, wherein the pharmaceutical composition is intended to be administered systemically in the dorso-lumbar region of a mammal, in particular a primate.
26. L'usage selon l'une des revendications 22 à 25, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée par une voie systemique sélectionnée parmi la voie sous-cutanée, la voie intramusculaire et la voie intradermique.26. The use according to one of claims 22 to 25, wherein the pharmaceutical composition is intended to be administered by a systemic route selected from the subcutaneous route, the intramuscular route and the intradermal route.
27. L'usage selon l'une des revendications 10 à 26, dans lequel la composition pharmaceutique est destinée à être administrée deux ou trois fois par voie systemique au cours d'un même traitement, afin de prévenir ou de traiter une infection à Helicobacter.27. The use according to one of claims 10 to 26, in which the pharmaceutical composition is intended to be administered two or three times systemically during the same treatment, in order to prevent or treat a Helicobacter infection. .
28. L'usage conjoint d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T- helper 1 (Thl) à l'encontre d'Helicobacter, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie systemique pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter. 28. The joint use of an immunogenic agent derived from Helicobacter and a compound capable of promoting the induction of an immune response of the T-helper 1 (Thl) type against Helicobacter, in the manufacture of a pharmaceutical composition intended to be administered systemically to prevent or treat a Helicobacter infection.
PCT/FR1998/000875 1997-04-30 1998-04-30 Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant WO1998048836A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU76584/98A AU750379B2 (en) 1997-04-30 1998-04-30 Anti-helicobacter vaccine composition comprising a Th1 adjuvant
EP98924360A EP0979100A1 (en) 1997-04-30 1998-04-30 ANTI-$i(HELICOBACTER) VACCINE COMPOSITION COMPRISING A TH1 ADJUVANT
JP54668498A JP2002505665A (en) 1997-04-30 1998-04-30 Anti-Helicobacter vaccine composition containing Th1-type adjuvant
BR9809381-9A BR9809381A (en) 1997-04-30 1998-04-30 Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1-type adjuvant
CA002287976A CA2287976A1 (en) 1997-04-30 1998-04-30 Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR97/05608 1997-04-30
FR9705608A FR2762787B1 (en) 1997-04-30 1997-04-30 ANTI-HELICOBACTER VACCINE COMPOSITION COMPRISING A TH1 ADJUVANT
FR97/15732 1997-12-08
FR9715732 1997-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998048836A1 true WO1998048836A1 (en) 1998-11-05

Family

ID=26233513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1998/000875 WO1998048836A1 (en) 1997-04-30 1998-04-30 Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0979100A1 (en)
JP (1) JP2002505665A (en)
KR (1) KR20010020418A (en)
AU (1) AU750379B2 (en)
BR (1) BR9809381A (en)
CA (1) CA2287976A1 (en)
WO (1) WO1998048836A1 (en)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001345A2 (en) * 1998-07-03 2000-01-13 Aventis Pasteur Use of an amphipathic compound for providing an adjuvant to a subunit vaccine
WO2001035899A2 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Axxima Pharmaceuticals Ag Inhibitors of helicobacter pylori induced gastrointestinal diseases
WO2001076625A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Astrazeneca Ab Iscom polypeptide delivery system
WO2001076623A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Astrazeneca Ab Iscom polypeptide delivery system for helicobacter pylori antigens
WO2002005845A1 (en) * 2000-07-05 2002-01-24 Merieux Oravax Immunological combinations for prophylaxis and therapy of helicobacter pylori infection
US6849409B2 (en) 2000-10-16 2005-02-01 Axxima Pharmaceuticals Ag Cellular kinases involved in Cytomegalovirus infection and their inhibition
JP2010180249A (en) * 2001-04-04 2010-08-19 Nordic Vaccine Technology As Polynucleotide binding complex comprising sterol and saponin
US10456459B2 (en) * 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012171914A (en) * 2011-02-22 2012-09-10 Kao Corp Gip increase inhibitor
HUE054422T2 (en) * 2015-07-20 2021-09-28 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0206037A2 (en) * 1985-06-20 1986-12-30 Bayer Ag Carbamates and ureas of N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl) amide, method for their preparation and their pharmaceutical use
WO1988009336A1 (en) * 1987-05-29 1988-12-01 Cambridge Bioscience Corporation Saponin adjuvant
WO1993005162A1 (en) * 1991-08-28 1993-03-18 The University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1995022987A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-31 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
WO1996031235A1 (en) * 1995-04-07 1996-10-10 Pasteur-Merieux Serums & Vaccins Composition for inducing a mucosal immune response

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0206037A2 (en) * 1985-06-20 1986-12-30 Bayer Ag Carbamates and ureas of N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl) amide, method for their preparation and their pharmaceutical use
WO1988009336A1 (en) * 1987-05-29 1988-12-01 Cambridge Bioscience Corporation Saponin adjuvant
WO1993005162A1 (en) * 1991-08-28 1993-03-18 The University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1995022987A1 (en) * 1994-02-23 1995-08-31 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
WO1996031235A1 (en) * 1995-04-07 1996-10-10 Pasteur-Merieux Serums & Vaccins Composition for inducing a mucosal immune response

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D'ELIOS ET AL: "T HELPER 1 EFFECTOR CELLS SPECIFIC FOR HELICOBACTER PYLORI IN THE GASTRIC ANTRUM OF PATIENTS WITH PEPTIC ULCER DISEASE", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 158, 15 January 1997 (1997-01-15), pages 962 - 967, XP002052384 *
MOHAMMADI ET AL: "HELICOBACTER-SPECIFIC CELL-MEDIATED IMMUNE RESPONSES DISPLAY A PREDOMINANT TH1 PHENOTYPE AND PROMOTE A DELAYED-TYPE HYPERSENSITIVITY RESPONSE IN THE STOMACHS OF MICE", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 156, 1996, pages 4729 - 4738, XP002052383 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001345A2 (en) * 1998-07-03 2000-01-13 Aventis Pasteur Use of an amphipathic compound for providing an adjuvant to a subunit vaccine
WO2000001345A3 (en) * 1998-07-03 2000-02-24 Pasteur Merieux Serums Vacc Use of an amphipathic compound for providing an adjuvant to a subunit vaccine
WO2001035899A2 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Axxima Pharmaceuticals Ag Inhibitors of helicobacter pylori induced gastrointestinal diseases
WO2001035899A3 (en) * 1999-11-19 2001-12-13 Axxima Pharmaceuticals Ag Inhibitors of helicobacter pylori induced gastrointestinal diseases
WO2001076625A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Astrazeneca Ab Iscom polypeptide delivery system
WO2001076623A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Astrazeneca Ab Iscom polypeptide delivery system for helicobacter pylori antigens
WO2002005845A1 (en) * 2000-07-05 2002-01-24 Merieux Oravax Immunological combinations for prophylaxis and therapy of helicobacter pylori infection
US6849409B2 (en) 2000-10-16 2005-02-01 Axxima Pharmaceuticals Ag Cellular kinases involved in Cytomegalovirus infection and their inhibition
JP2010180249A (en) * 2001-04-04 2010-08-19 Nordic Vaccine Technology As Polynucleotide binding complex comprising sterol and saponin
US10456459B2 (en) * 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions

Also Published As

Publication number Publication date
CA2287976A1 (en) 1998-11-05
BR9809381A (en) 2000-07-04
EP0979100A1 (en) 2000-02-16
KR20010020418A (en) 2001-03-15
AU750379B2 (en) 2002-07-18
JP2002505665A (en) 2002-02-19
AU7658498A (en) 1998-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BE1022345B1 (en) USPA2 PROTEIN CONSTRUCTS AND USES THEREOF
EP0765170A1 (en) Composition for inducing a mucosal immune response
BE1024361B1 (en) IMMUNOGENIC COMPOSITION
JP2005514388A (en) Outer membrane vesicles from gram-negative bacteria and use as vaccines
KR101566847B1 (en) Use of glycosylceramides for enhancing the immune response to antigens
JP6916820B2 (en) Immunogen and its screening method
WO1998048836A1 (en) Anti-helicobacter vaccine composition comprising a th1 adjuvant
US9119803B2 (en) Carious tooth vaccine and preparation method
EP1150707B1 (en) USE OF AN OmpA ENTEROBACTERIUM PROTEIN ASSOCIATED WITH THE ELAGIGILTV PEPTIDE FOR TREATING MELANOMAS
AU751433B2 (en) Anti-(helicobacter) vaccine composition for use by the subdiaphragmatic systemic route, and combined mucosal/parenteral immunization method
FR2762787A1 (en) Helicobacter-derived immunogen for use as vaccine
EP3057981B1 (en) Therapeutic cancer vaccine based on stress proteins rendered immunogenic
FR2762788A1 (en) Use of immunogenic agent derived from Helicobacter
EP1292333B1 (en) Adjuvant composition comprising fha protein or fragment of fha protein in free form
JPH11240844A (en) Oral administration of pneumococcus antigen
CZ361799A3 (en) Use of immunogenic substance derived from bacterium of the Helicobacter strain and prevention or treatment method of infections caused by those bacteria
US20160120971A1 (en) Immunogenic composition comprising neisseria meningitidis macrophage infectivity potentiator protein and methods for using them
MXPA99009915A (en) Anti-helicobacter
FR2790959A1 (en) USE OF BACTERIAL MEMBRANE FRACTIONS WITH ADJUVANT EFFECT, PROCESSES FOR THEIR PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME
FR2805163A1 (en) USE OF A ZWITTERGENT TYPE DETERGENT FOR THE PREPARATION OF A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR NASAL ADMINISTRATION
FR2806913A1 (en) USE OF ALIPHATIC QUATERNARY AMMONIUMS AS ADJUVANT IN A MUCOSAL ADMINISTRATIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION
Claassen et al. Production, characterization and control of a Neisseria mellillgitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine
Parmar Development and characterization of a liposomal subunit vaccine against Neisseria Gonorrhoeae
FR2790961A1 (en) USE OF A COMPOSITION COMPRISING KLEBSIELLA PNEUMONIAE PROTEOGLYCANS, AND BACTERIAL RIBOSOMAL RIBOSOMES OR RNA FOR THE TREATMENT AND / OR PREVENTION OF PERIODONTAL DISEASES
FR2692148A1 (en) Use of lipophilic muramyl peptide MDP:DD:GPD - in vaccines against HIV and tumours

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GE HU IL IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK TJ TM TR TT UA UG US UZ VN

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 76584/98

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998924360

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2287976

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2287976

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019997010042

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998924360

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09403967

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1019997010042

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 76584/98

Country of ref document: AU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998924360

Country of ref document: EP

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 1019997010042

Country of ref document: KR