WO1998039437A1 - Novel apoptosis-related dnas - Google Patents

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WO1998039437A1
WO1998039437A1 PCT/JP1998/000905 JP9800905W WO9839437A1 WO 1998039437 A1 WO1998039437 A1 WO 1998039437A1 JP 9800905 W JP9800905 W JP 9800905W WO 9839437 A1 WO9839437 A1 WO 9839437A1
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apoptosis
seq
polypeptide
cells
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PCT/JP1998/000905
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Inventor
Yoshiyuki Sakaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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    • G—PHYSICS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a DNA involved in apoptosis, a polypeptide encoded by the DNA, and an antibody recognizing the polypeptide.
  • Apoptosis refers to cell death in which cells that are no longer needed or have become abnormally self-destruct because the tissue retains its normal shape and function in the living body. For example, removal of unwanted cells during morphogenesis of developing tissues and organs and formation of neural networks, removal of old cells when cells in each tissue are replaced by new cells, elimination of immune cells that react to themselves, Apoptosis works to remove virus-infected cells.
  • Apoptotic cells are characterized by the accumulation of chromatin in the nucleus. The cells themselves contract and die, and are eliminated by phagocytic cells without inflammation. At this time, chromatin DNA is fragmented, and a ladder-like pattern is observed upon electrophoresis.
  • Apoptosis is cell death that is necessary for the body tissue to maintain its normal form and function, and is strictly controlled by various genes in the body. Therefore, it is considered that the abnormalities in the control have a great effect on the living body.
  • Nerve cells are strictly controlled by proliferation, elongation, and apoptosis from the developmental stage, and it is thought that the control forms a nerve network by nerve cells. Nerve cells cease to proliferate after differentiation, but survive for a long time. In recent years, it has been known that apoptosis is also involved in many pathological cell deaths in nerve cells. For example, neuronal necrosis due to cerebral ischemia In addition, death of a large number of nerve cells due to apoptosis has been observed along with necrosis [Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 16, 186 (1996), Stroke, 26, 1252 (1995)].
  • Alzheimer's disease [Experimental Neurology, 133-225 (1995)]
  • Parkinson's disease [Journal of Neurological Sciences, 137, 120 (1996)]
  • Huntington's chorea [Experimental Neurology, 133, 265 (1995), Neuro report, 6, 1053 (1995), Journal of Neuroscience, 1_5, 3775 (1995)]
  • Amyotrophic lateral sclerosis [Neuropathology and Applied Neurobiology, 21, 498 (1995)], etc., report that apoptosis occurs in nerve cells.
  • Amyloid ⁇ -peptide which accumulates in cells in Alzheimer's disease and is thought to be deeply involved in the pathogenesis, causes neuronal cell death, and cell death by this amyloid / peptide is also apoptosis [Pro Natl Acad. Sci. USA, 90, 7951 (1993)], and neuronal cell death due to human immunodeficiency virus (HIV) infection has also been reported to be due to apoptosis [American Journal of Pathology, 146, 1121 (1995), Acta Neuropathologies, 91, 169 (1996)].
  • HIV human immunodeficiency virus
  • bc 1 B cell lymphoma / leukemia-2 gene, science, 258, 302 (1992), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4533 (1993)] has an inhibitory effect on apoptosis It is a protein gene that is thought to be involved in morphogenesis during ontogeny. This gene was found to be overexpressed in various cancer cells, and has become a target for anticancer drug development. Genta has shown that the use of the be1-2 antisense-oligoDNA can inhibit the growth of human colon cancer in animal studies. Dictionary, Nikkei Business Publications, 1995).
  • p53 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7525 (1994)] arrests the cell cycle. In addition to controlling the cell cycle by this activity, it is thought to act to stop the cycle of cells damaged by radiation, drugs and the like, and to induce apoptosis. It is thought that if p53 becomes abnormal, the damaged cells will proliferate as they are, causing cancer. The mechanism of apoptosis induction of p53 is not yet known.
  • the present invention provides a novel DNA involved in apoptosis, a method for obtaining the DNA, a recombinant vector comprising the DNA and a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant vector into a host, and a transformant.
  • a method for producing a novel polypeptide encoding the above-mentioned DNA, and the novel polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, the DNA, the polypeptide, a reagent for detecting apoptosis using the antibody, and a detection method The present invention relates to suppression of apoptosis using the above DNA, polypeptide, and antibody, and diagnosis, prevention, and treatment of a disease associated with apoptosis.
  • the DNA of the present invention is a DNA involved in apoptosis.
  • Gene monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) gene, aldolase C gene, ⁇ -tubulin gene, represented by SEQ ID NOS: 1-8 And a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to a colony of a hybridized DNA using a DNA having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8 as a probe.
  • the SSC solution at a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution at a concentration of 1 times) Can be identified by washing the filter with 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) at 65 ° C.
  • the hybridizable DN is a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8, and preferably 80% or more. DNAs having homology, and more preferably DNA having homology of 95% or more can be mentioned.
  • the DNA of the present invention also includes oligonucleotides having a partial sequence of DNA involved in apoptosis and antisense oligonucleotides.
  • the oligonucleotide for example, the same sequence as the base sequence of consecutive 5 to 60 residues, preferably 10 to 40 residues in the base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8
  • an antisense-oligonucleotide for example, an antisense-oligonucleotide of the oligonucleotide.
  • the nucleotide include a nucleotide having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 22 to 52, and the like.
  • polypeptide of the present invention examples include the polypeptide encoded by the above-described DNA of the present invention. Specifically, pi1, MCP-1 and aldolase C are exemplified. , "Tubulin, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or an amino acid of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Peptides having an amino acid sequence in which at least one amino acid in the sequence has been substituted, deleted or added, and having an activity relating to apoptosis can be mentioned.
  • Peptides having an amino acid sequence in which at least one amino acid in the amino acid sequence of the polypeptide has been substituted, deleted or added, and which has an activity involved in apoptosis are described in Molecular loning, A Laboratory Manual, Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Pro Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409. (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Pro Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc. Can be.
  • the antibodies of the present invention include antibodies that recognize the above-mentioned polypeptides.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • mRNA whose expression level fluctuates in the cells is identified by the differential display method, and c mRNA corresponding to the mRNA is identified.
  • any animal cell culturing method can be used.
  • neurons examples include human neuroblastoma cells, and preferably, SH—S Y 5 Y [Cancer Res., 33, 2643 (1973)].
  • a medium for culturing animal cells As a medium for culturing animal cells, a commonly used RPMI 164 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium can be used.
  • Culturing is carried out under conditions such as normal 5% C0 2 presence.
  • the culture temperature is preferably 35 to 37, and the culture time is usually 3 to 7 days.
  • the neuroblastoma cell line SH-SY5Y 100% fetal calf serum, 100 units 111 1 penicillin, 100 / gZml strebtomycin were used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the cultured neuroblastoma cells are differentiated into nerve cells.
  • a differentiation inducer such as retinoid is used for differentiation of cells.
  • SH-SY5Y cultured above As a method for differentiating the nerve cells, specifically, SH-SY5Y cultured above is used. . 1 to 5 X 1 0 4 pieces / footsteps planted cm 2 diameter 1 0 cm Petri dish for cell culture to a density 1 0-3 0 hours of culture in the same manner as described above, all-trans form retinoic acid [Sigma] can be added in an amount of 2 to 20 M, and further cultured for 5 to 10 days to differentiate the cells into nerve cells. -Inducing the differentiated cells to induce apoptosis using an apoptosis inducer.
  • a method for inducing apoptosis 0.1 to 10 M of colchicine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to the differentiated cells, and the cells are cultured for 5 to 90 hours in the same manner as described above.
  • a method for inducing apoptosis can be exemplified.
  • apoptosis is induced in the cells means that DNA is extracted and purified from the cells by a conventional method, and the DNA is subjected to agarose gel electrophoresis, whereby fragmentation of the DNA occurs. It can be confirmed by observation.
  • RNA is extracted from each of these cells.
  • Methods for preparing total RNA from neural cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], the AGPC method [Experimental Medicine, 1937 (1991) 3]. And so on.
  • Fast-Track-mRNA 'isolation-kit [Fast T rack mRNA Isolation Kit; manufactured by Invitrogen), and Quick'Prep * mRNA / Purification Kit (Quick Prep mRNA Purification Kit; manufactured by Pharmacia).
  • MRNA can also be prepared directly from cells.
  • -CDNA is synthesized from each of the RNAs extracted from the nerve cells collected over time using an anchor primer in a conventional manner, and then the 5 'end of each cDNA is Perform PCR using the fluorescently labeled anchor primer and any primer to amplify cDNA.
  • An anchor primer is a primer obtained by adding an adenine, guanine, or cytosine oligonucleotide, excluding thymidine, at the 3 ′ end to an oligo dT sequence associated with the 3 ′ end poly A sequence of mRNA.
  • gT 15 MA (mixture of SEQ ID NO 1 0 ⁇ 1 2)
  • gT 15 MA ( mixture of SEQ ID NO: 1 3 ⁇ 1 5)
  • gT 15 MT ( mixture of SEQ ID NO: 1 6 ⁇ 1 8)
  • gT 15 MG , gT 15 MC (Mixtures of SEQ ID NOS: 19 to 21).
  • Fluorescent labeling can be performed by a conventional method using fluorescin / isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC).
  • Optional primers are oligonucleotides that can amplify many types of cDNA sequences and obtain a large number of amplified cDNA fragments in a single reaction.
  • Operon 'Technologies Technologies 0 PA-1 to 20; OPB-1 to 20; OPC-1 to 20; OPD-1 to 20 and the like.
  • the optional primer preferably has a length of about 10 bases.
  • Each of the above-mentioned cDNAs amplified by the PCR is electrophoresed on a polyacrylamide gel, and the amount of fluorescence of the resulting band is measured using a fluoroimager for each.
  • the cDNA is amplified by PCR or the like.
  • the amplified DNA fragment is used as it is or after digestion with an appropriate restriction enzyme or the like and integrated into a vector by a conventional method.
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Pro Natl. Acad. Sci. USA , 74, 5463 (1977)] or 373 A.
  • the nucleotide sequence of the DNA is determined by analysis using a nucleotide sequence analyzer such as DNA Sequencer (manufactured by Perkin Elmer).
  • Examples of the vector incorporating the amplified DNA fragment include pBluescript KS (+) (manufactured by Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene Strategies, 5, 6264 (1992)], pT7Blue [manufactured by Novagen], pCR II [manufactured by Invitrodin, Biotechnology, 9, 657 (1991)]
  • nucleotide sequence determined in this way can be determined overnight by searching base sequence databases such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as biast. This can be confirmed by the fact that there is no nucleotide sequence showing obvious homology, which is considered to be identical to the nucleotide sequence in one copy.
  • Examples of the DNA having the novel base sequence obtained as described above include DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and the like.
  • Escherichia coli DH5a / pG27T containing plasmid pG27TI having DNA
  • Plasmid pC46-5 having DNA having a sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • Escherichia coli DH5 «/ pC46-5 or Escherichia coli DH5a / containing plasmid C55-3-1 containing DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 4 C 5 5—3—1 are FE RM BP—584 3, FE RM BP—5844, F ERM B P-584 5 and F ERM BP—584 6,
  • the DNA obtained by the above method is a partial DNA fragment of cDNA corresponding to mRNA whose expression varies due to apoptosis, the following (1), (2) or (3) ) Can be used to obtain the full-length cDNA.
  • the full-length cDNA can be obtained.
  • the following describes a method for preparing a cDNA library.
  • Methods for preparing DNA libraries include Molecular Cloning, 2nd Edition and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereafter referred to as Current Protocols' In 'Molecular'). Or a commercially available kit, such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and And Plasmid Cloning [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning; Gibco BRL) or Zap-1 cDNA, synthesis kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, Stratagene). In addition, there is a commercially available cDNA library itself, such as a human brain cDNA library from Clontech, which can be used.
  • Any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as a closing vector for preparing a DNA library as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain.
  • ZAP Express [Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Rese arch, 17, 9494 (1989)], A zap II (Stratagene) GtlO, stll (DN A Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)), Lambda BlueMid (clo ExCell (Pharmacia), pT7T3 18U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) 3) Can be given.
  • any microorganism belonging to Escherichia coli can be used. Specifically, Escherichia cojj XLl-Blue MRF '[Stratagene, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 (Science, 222, 778 (1983)), Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] and Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • the selection of cDNA clones from a single cDNA library includes colony hybridization using isotopic or fluorescently labeled probes, plaque hybridization hybridization (molecular), and cloning. 2nd edition).
  • the desired DNA can be obtained from the selected clone by a conventional method.
  • cDNA is synthesized from mRNA by the above-described method, and the cDNA is added to both ends of the cDNA, and PCR is performed with a primer based on the nucleotide sequence of the adapter and the nucleotide sequence of the amplified fragment.
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • 3' RACE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)) can obtain the desired DNA.
  • the nucleotide sequence of DNA obtained by these methods can be determined by the above-described nucleotide sequence determination method.
  • the novelty of the sequence can also be confirmed by the method described above.
  • Examples of the DNA having a novel nucleotide sequence confirmed by the method include DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8.
  • the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer.
  • the DNA synthesizer include a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the Thoho phosphite method, and a DNA synthesizer m0de1 392 manufactured by Perkin Elmer Inc. using the phosphoramidite method. I can give it.
  • an oligonucleotide having a partial sequence of DNA involved in apoptosis and an antisense oligonucleotide can be prepared by a conventional method or a DNA synthesizer.
  • oligonucleotide or the antisense oligonucleotide for example, in a part of the nucleotide sequence of mRNA to be detected, a sense primer corresponding to a 5 ′ terminal nucleotide sequence and a nucleotide sequence at a 3 ′ terminal corresponding to a nucleotide sequence at a 5 ′ terminal side And the like.
  • the base corresponding to peracyl in mRNA is thymidine in the oligonucleotide primer.
  • the sense primer and the antisense primer are oligonucleotides whose melting temperature (Tm) and the number of bases thereof do not extremely change, and preferably have a base number of 10 to 40 bases.
  • An oligonucleotide having a partial sequence of DNA involved in apoptosis or an antisense oligonucleotide for example, a nucleotide having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 22 to 52 Can be done.
  • derivatives of the nucleotide can also be used, and examples thereof include a methyl derivative of the nucleotide and a phosphotiotate derivative o.
  • a recombinant vector having an apoptosis-related DNA inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector is constructed, and the recombinant vector is introduced into a host cell to express the polypeptide of the present invention.
  • a transformant can be obtained.
  • any one that can express the gene of interest such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, can be used.
  • those which can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position capable of transcribing apoptosis-related DNA are used.
  • apoptosis-related gene expression vectors can replicate autonomously in prokaryotes, as well as promoters, ribosome binding sequences, apoptosis-related genes, It is preferably composed of a transcription termination sequence.
  • a gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors include pBT ⁇ 2, pBTacl, and pBTac2 (all manufactured by Principle Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pGEX (manufactured by Pharmacia), and pSE280 (invitrogen).
  • PGEMEX-1 manufactured by Promega
  • pQE-8 manufactured by QIAGEN
  • pET-3 manufactured by Novazidin
  • pKYPIO Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]
  • pLSAl [Aglic. Biol.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as Escherichia coli.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as t ⁇ promoter (Ptrp), iac promoter, PL promoter, PR promoter, PSE promoter, T7 promoter, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter Etc.
  • Ptrp t ⁇ promoter
  • iac promoter iac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • PSE promoter T7 promoter
  • SP01 promoter SP02 promoter
  • penP promoter Etc penP promoter Etc.
  • the ribosomal binding sequence it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 5 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Corynebacterium, Brevipacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, etc., such as Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2. -Blue, Escherichia col i DH1, Escherichia col ⁇ MC1000, Escherichia col i KY 3276, Escherichia col i W1485, Escher icnia col i JM109> Escherichia col H B101, Escherichia col i No.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the above host cells.
  • a method using calcium ions [Pr0 Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-2483942
  • the electroporation method [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)].
  • YEP13 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19 pHS15 and the like
  • YEP13 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19 pHS15 and the like
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • Examples of the Hyodorou EQ vesicle include saccharomyces erev ⁇ _ae, Schizosaccharomvces Dombe, Kluyveromyces lactis Tr lchosporon potlulans ⁇ Schwann iomyces ailuvius and the like.
  • any method for introducing the recombinant DNA any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • electroporation method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)], Suferoplus Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)] and the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
  • an expression vector such as pAGElO 7 (JP-A 3-22979), pAS3-3 (JP-A-2-227075), P CDM8 [Nature, 329, 840, (1987) ], (manufactured by Lee Nbitorojen Co.) pcDNAI / Amp, pREP4 (manufactured by Invitrogen) , PAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the immediate-early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), the early promoter of SV40 or the meta- Examples thereof include a promoter of a mouth protein, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, and an SR "promoter.
  • An enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter. .
  • Examples of the host cells include human cells such as Namalwa cells, monkey cells such as COS cells, Chinese hamster cells such as CH0 cells, and HBT5637 (JP-A-63-299). Can be given.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used so long as it is a method for introducing the DNA into animal cells.
  • an electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] ]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the ribofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and the like.
  • the recombinant gene transfer vector and Baculovirus were co-transfected into insect cells to obtain recombinant viruses in the culture supernatant of insect cells, and the recombinant viruses were further infected with insect cells to obtain the present invention.
  • the polypeptide can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Examples of the baculovirus include viruses that infect night insects such as Atographa, Californi, Nuclea, Polyhedrosis, and virus (Autographa cal l fornica nuclear polyhedros is virus).
  • S f 9 is an ovarian cell of Spodoptera f rugiperda
  • S f 2- 1 Bactetrachloride
  • High 5 manufactured by Invitrogen
  • Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene introduction vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular. Cloning, 2nd edition.
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed by yeast, animal cells or insect cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention is produced. it can.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium can efficiently culture the transformants.
  • Any carbon source may be used as long as the organism can assimilate it, such as glucose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch hydrolyzate containing these.
  • Carbohydrates such as pulverized products, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells, and digests thereof can be used.
  • Inorganic substances include potassium (II) phosphate, potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. Can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the cultivation temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the cultivation time is usually 16 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • isopropyl-1,3-D-thiogalactobyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the promoter.
  • Monoacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Culture is usually p H 6-8, 1 to 7 days row also under such 30 ⁇ 40 ° C, 5% C 0 2 presence, during the culturing, if necessary kanamycin, the antibiotic penicillin such O Can be added to the medium
  • Examples of a medium for culturing the transformant obtained by using insect cells as a host include commonly used TNM-FH medium (Pharaingen), Sf-900II SFM medium (Gibco BRL), ExCell 400 ExCel 140 (both manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) and the like can be used.
  • Cultivation is usually carried out at pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method may be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a dissolved state in a cell, after completion of the culture, the cell is recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press. Then, the cells are disrupted using a mantongaulin homogenizer, a dynomill, or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary enzyme isolation and purification method is used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method is used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent.
  • the cells When the polypeptide is expressed as an insoluble form in cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged. After recovering the polypeptide by a method, the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide modifier. The lysate is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturing agent or diluted so that the concentration of the polypeptide denaturing agent does not denature the polypeptide. After the structure is formed, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative of the polypeptide of the present invention or its modified sugar can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
  • the polypeptide expressed by the above method may be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tB0c method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tB0c method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Kuwawa Trading Advanced ChemTech, USA
  • Perkin-Elmer Japan Perkin-Elmer, USA
  • Pharmacia Biotech PharmaciaBiotech, Sweden
  • Aroka Protein Technologylnstrument ttM, USA
  • Kurabo US Synthecei, USA
  • It can also be synthesized using peptide synthesizers such as l-Vega, Japan Perceptive Limited (made by PerSeptive, USA) and Shimadzu Corporation.
  • Plasma is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and it is determined that the serum reacts with the antigen used for immunization by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin 1976 Year, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin 1976 Year, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].
  • Serum was obtained from a heron, goat, mouse, rat or hamster whose serum showed a sufficient antibody titer to the antigen used for immunization, and 40-50% saturated ammonium sulfate was obtained from the serum.
  • Purified antibodies can be obtained by standard methods such as salting out method using PEG, sedimentation method using DEP-Sepharose column, protein A-column, and chromatographic method using gel filtration column. .
  • the spleen cells of the animal immunized by the above method and the myeoma cells of the mouse are fused to produce a hybridoma, and the ability to culture the hybridoma is applied to the animal. Is transformed into ascites tumor, and the culture solution or ascites is collected to produce a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention.
  • the mRNA expression level depends on the amount of the hybridized probe according to the label of the probe.For example, the amount of radioactivity in the case of 32 P labeling, the amount of fluorescence in the case of fluorescent labeling It can be measured by measuring.
  • the amplified fragment can be measured by staining the amplified fragment with a DNA-specific fluorescent stain such as ethidium bromide ⁇ cyber green ⁇ and measuring the amount of fluorescence.
  • a DNA-specific fluorescent stain such as ethidium bromide ⁇ cyber green ⁇
  • RNA / DNA antisense 'oligonucleotide
  • RNA / DNA antisense 'oligonucleotide
  • polypeptide of the present invention can be obtained using the DNA described in 1. and the method described in 2.
  • an antibody can be produced by the method described in 3.
  • a polypeptide associated with apoptosis can be detected using the antibody described in 3.
  • Specific examples include the ELISA method using a microtiter plate, a fluorescent antibody method, and a detection method using an estanblot method.
  • the antibody described in 3. can be used for immunohistological staining of test nerve cells.
  • Apoptosis-related proteins derived from test nerve cells or normal nerve cells Quality is detected using the antibody described in 3., the amount of the protein in both cells is measured and compared, and a quantitative change is examined to detect apoptosis in the test nerve cells. be able to.
  • the antibody described above can be used for diseases involving suppression of apoptosis and apoptosis.
  • diseases involving suppression of apoptosis and apoptosis include, for example, diseases involved in the progressive decrease of nerve cells, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • the antibody can be used for diagnosis and treatment of apoptosis-related cancer.
  • Example 1 Differential display of neurons that induced apoptosis
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, supplemented with 10% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin, and 100 / g / ml streptomycin.
  • DMEM manufactured by Nissui Seiyaku
  • hypotonic lysate [5 OmM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris—HC and pH 8.0), 1 OmM sodium diethylenetetraminetetraacetate (EDTA), 0.3% triton (T riton) X—100] was added and left in water for 30 minutes to lyse the cells.
  • the cell lysate was centrifuged at 27,000 ⁇ g for 20 minutes to separate into a chromatin fraction (precipitate) and a low molecular weight DNA fraction (supernatant).
  • the DNA was dissolved in TE buffer [1 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mM EDTA], and subjected to 1.2% agarose gel electrophoresis.
  • RNAs were obtained. The specific method of acquisition was in accordance with the reagent protocol.
  • RNA was treated with ribonuclease-free deoxyribonuclease (Promega) to decompose and remove contaminating DNA.
  • RNA precipitation After extracting the RNA with phenol-chloroform, ethanol precipitation (precipitating and collecting RNA by adding 1/10 volume of 2M NaC to the aqueous layer and adding 2 volumes of ethanol). Purify and treat with 0.1% getyl pyrocarbonate (DE PC) Dissolved in distilled water. The solution can be stored at 180 ° C if necessary. .
  • RNA 2 5 g, 5 'end of Furuoresei N'i Sochioshiane preparative (hereinafter abbreviated as FITC) (a mixture of SEQ ID NO: 1 0-1 2) anchor primer g T 15 MA fluorescently labeled with, g T 15 MT (SEQ Mixture of numbers 13 to 15 ), gT15MG
  • cDNA preparation solution 80 ⁇ l of TE buffer was added to the reaction stop solution to obtain a cDNA preparation solution.
  • the preparation can be stored at 120 ° C. if necessary.
  • PCR device PHC-3 manufactured by Techne
  • heat at 94 ° C for 3 minutes and then heat at 95 ° C for 15 seconds, 40 ° C for 2 minutes, Twenty-five cycles were performed with a reaction step consisting of 1 minute at 2 ° C as one cycle, and finally PCR was performed at 72 ° C for 5 minutes.
  • One of the above four types of fluorescent-labeled anchor primers is used.
  • One of the optional primers is OPA-1-20, OPB-1-20, OPB manufactured by Operon's Technologies.
  • One of the 80 types of C—1 to 20 and OPD—1 to 20 is selected for use in the reaction, and by combining each of them, a total of 320 types of reactions are combined into one type of c. Performed for DNA.
  • the band fluorescence obtained on the gel after the electrophoresis was measured and output as an image. Based on the band measurement results obtained, the band whose fluorescence intensity fluctuated over time due to colchicine treatment (that is, the band corresponding to mRNA whose expression level fluctuated over time due to colchicine treatment) ) was picked up.
  • the total number of detected bands was about 200000, and some variation was observed in about 26.3, which is about 1.3% of the total.
  • Example 1- (3) the sample 561 used for polyacrylamide gel electrophoresis was similarly placed on a polyacrylamide gel (200 ⁇ 330 ⁇ 0.35 mm) containing 7 ⁇ urea, After electrophoresis at 1,500 V for 12 hours in TBE buffer, the band was amplified by measuring the fluorescence with Vistra Fluorlmager SI (manufactured by Molecular Dynamics). Was detected, and the image was output in full size.
  • Vistra Fluorlmager SI manufactured by Molecular Dynamics
  • the output image was combined with the gel, and a gel corresponding to the fluctuating band was cut out.
  • DNA was extracted from the gel by a conventional method, and the DNA was subjected to PCR in the same manner as in Example 1- (3) to amplify DNA.
  • the scale of the reaction was 501, and the combination of anchor primer and optional primer used for amplification of each band was used.
  • the amplified DNA was used for PCR fragment cloning vector pT7B1ueT—vector.
  • the PCR fragment was cut with Ec0RV and processed so that T was added to the 3 'end of both strands so that the PCR fragment could be directly cloned into the Ec0RV site (Novagen).
  • a DNA / ligation kit (Takara Shuzo).
  • transform Escherichia coli DH5a manufactured by Gibco BRL
  • Apply the transformant to LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, The cells were cultured at 37 ° C for 1 ⁇ .
  • Plasmid DNA was isolated from the grown transformant colonies by the alkaline SDS method (Molecular 'Cloning, 2nd edition).
  • the nucleotide sequence of the amplified DNA incorporated into the plasmid DNA was determined using SQ-5500 DNA Sequencer (manufactured by Hitachi, Ltd.) or 373 A. DNA Sequencer (manufactured by PerkinElmer). Were determined.
  • the specific reagents and methods for nucleotide sequence determination are as follows: SQ-5500 DNA sequencer, Thermosequenase.Premixed.Cycle-sequencing kit; Thermo Sequenase pre-mixed cycle sequencing kit; mersham, Inc.) and used a PRISM Dye primer cycle sequencing kit (PRISM Dye primer sequencing kit; No. 1 Kinelma) in the DNA sequencer. The test was performed according to the instructions attached to the kit.
  • Example 2 Detection of mRNA whose expression fluctuates due to apoptosis induction by RT-PCR
  • Example 1 In the Differential 'display of Example 1, for one type of mRNA whose expression level was thought to fluctuate due to apoptosis induction, the fluctuation was compared with a part of the DNA obtained in Example 1. Oligonucleotides and antisense oligonucleotides containing gene-specific 5 'sense primers and 3' Used as a primer, ⁇ 1?
  • RNA obtained in Example 1 was converted into a kit using a single-stranded cDNA synthesis kit, a superscript preamplification system-11 (manufactured by Gibco 81 ⁇ ). Was synthesized using the oligo dT primer attached to the kit. Specific reagents and methods followed the instructions attached to the kit.
  • the single-stranded cDNA 21A is then ligated with 50 Md NTP, a gene-specific 5 'sense primer, and a 3' antisense primer to 10
  • PCR buffer containing 1 unit of polymerase Gene Taq heat at 94 ° C for 3 minutes, and then start at 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • This reaction step was performed 17 to 25 cycles as one cycle, and finally PCR was performed in which the reaction was performed at 72 for 5 minutes.
  • the nucleotide sequences of the gene-specific 5'-side sense primer and 3'-side antisense primer used were described in the column labeled RT-PCR in Table 2 using the SEQ ID NO in the sequence listing.
  • the primer was chemically synthesized by a conventional method based on the DNA obtained in Example 1 and involved in apoptosis.
  • the DNA amplified by the above PCR is subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and then stained with 0.01% Cyber Green I (SYBR Green I; manufactured by Molecular Probes), and the amount of the amplified fragment is measured using a fluoroimager or UV. Detection was performed using a transilluminator, and the relative expression level of mRNA was determined.
  • Cyber Green I SYBR Green I; manufactured by Molecular Probes
  • the amplified fragment of C38-1-1 had a base sequence corresponding to positions 14464 to 1847 of the base sequence of SEQ ID NO: 7.
  • This base sequence is composed of a group of ESTs (expressed sequence tag; EST) which are considered to be the same gene as the cDNA including access number AA 0 1 9 4 3 4 in the base sequence database Gen Bank.
  • EST expressed sequence tag
  • the 3'-end and 5'-end nucleotide sequence information of many cDNA clones in the cDNA library was collected including duplications). No match was found in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
  • the amplified G27TI fragment had a nucleotide sequence corresponding to the nucleotide positions from 235 to 266 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. This nucleotide sequence was consistent with the ESTs of access numbers N485593 and N40685 in the base sequence database GenBank (both are considered to be the same gene's cDNA). . There was no match in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
  • nucleotide sequence of the amplified fragment of C46-5 is shown in SEQ ID NO: 3
  • nucleotide sequence of the amplified fragment of C55-3-1 is shown in SEQ ID NO: 4. In both cases, no matching sequence was found in the base sequence database G EnBan k.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of the C25-1-2 amplified fragment. This nucleotide sequence was consistent with a group of ESTs considered to be cDNAs of the same gene including access number W76643 in the nucleotide sequence database GEnBank. There was no match in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
  • the nucleotide sequence of the amplified fragment of G6 is shown in SEQ ID NO: 6. This nucleotide sequence was consistent with a group of ESTs considered to be cDNAs of the same gene, including accession number N51230 in the nucleotide sequence database GenBank.
  • the portion considered to be the 3 'end of G6 or EST (1933 to 42nd 2nd) is composed of the human Mab_21 gene in GenBank [Human Molecular Genetics, 5, 607 (1996). 5 'untranslated region of cDNA (7th to 23rd position). But this matches The portions are at the 3 'and 5' ends of the cDNA, and both cDNAs may not be derived from the same gene.
  • p i1 is a calcium-binding protein and binds to annexin II (annexinII) p36 to form a heterotetramer.
  • Annexin II complex is a protein that is phosphorylated by the protein kinase PKC in a calcium-dependent manner and is bound to the membrane, and is involved in secretion by exostosis of chromaffin cells in the adrenal gland. (Journal of Cell Biology, 114, 1135 (1191)) In relation to neurons, NGF was administered to cell line PC12 and differentiated into neurons.
  • MCP-1 is one of the chemokines, has an activity to induce chemotaxis to monocytes via receptors, and is thought to be involved in macrophage accumulation during inflammation .
  • MCP-1 is one of the chemokines, has an activity to induce chemotaxis to monocytes via receptors, and is thought to be involved in macrophage accumulation during inflammation .
  • the amplified fragment of C78-3-3 was obtained from human aldolase C gene [Nucieic Acids Res.,
  • Aldolase is an enzyme that degrades curtose 1,6-phosphate in the glycolysis system. Is a brain-specific type. No association with apoptosis has been reported.
  • Hepatic tubulin is a protein that forms tubulin together with tubulin and polymerizes to form microtubules. It has been reported that drugs such as colchicine that bind to tubulin and prevent microtubule formation induce apoptosis in cells [Cancer Letters, 23, 307 (1984), Experimental Cell Rese arch, 198, 367. (1992)] However, changes in the expression of ⁇ - tubulin associated with apoptosis have not been reported.
  • the nucleotide sequence of C38-1_1 was identical to a certain EST (Access No. AA019434) in GenBank, which was a cDNA clone (human). This is the base sequence at the 3 'side of the retinal cDNA clone 3 6 2 93 2), and the base sequence of the EST (accession number AA 018893) at the 5' side of the same clone can be obtained from the database.
  • EST acces No. AA019434
  • the 5 'specific sense primer shown in SEQ ID NO: 44 based on the base sequence of AA 018893 and the 3' specific antisense primer shown in SEQ ID NO: 45 based on the base sequence of C38-1-1-1 PCR was performed on SH-SY5Y cDNA using the sense primer in the same manner as in Example 2.
  • Plasmid DNA was prepared from the transformant in the same manner as in Example 1, and the nucleotide sequence of the cDNA was determined. The obtained nucleotide sequence was 157 It had a second base. From this nucleotide sequence and the nucleotide sequence of C38-1-1-1, the nucleotide sequence of cDNA of C38-1-1-1 shown in SEQ ID NO: 7 was obtained.
  • RACE shows G 27 TI shown in SEQ ID NOs: 48 and 49 A specific sense primer was used.
  • Plasmid DNA was isolated from each clone according to a known method (Molecular 'Cloning 2nd edition), and its nucleotide sequence was analyzed using 7-daza-1d GTP.
  • Lab station, thermosequenase, labeled primer, and cycle sequence Labstaion l'hermo Sequenase label led primer cycle sequenc ing kit with 7-deaza-dGTP; manufactured by Amersham Co., Ltd.] using the dideoxy-chain and yuichi-mination method [Prol. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]. Decided more. The specific method followed the instructions attached to the kit.
  • G27TI-specific antisense primer shown in SEQ ID NO: 5-0 based on the base sequence near the 5 'end of the clone obtained by 5'-RACE
  • 5'-RACE was performed again in the same manner.
  • the cDNA sequence of G27TI cDNA shown in SEQ ID NO: 53 was obtained from the nucleotide sequence of each clone. However, this nucleotide sequence contained only a very short 0RF of 68 amino acids or less, and was considered to be a nucleotide sequence corresponding to a part on the 3 'side of full-length cDNA.
  • the power of comparing the homology with the base sequence database GenBank for this entire base sequence, and none of those showing homology were found in the database.
  • a novel DNA involved in apoptosis a method for obtaining the DNA, a recombinant vector comprising the DNA and a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant vector into a host, and a transformant
  • the present invention can also provide a method for diagnosing, preventing, and treating a disease involving apoptosis and an apoptotic inhibitor using the DNA, polypeptide, or antibody described above.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human Cell line: neuroblastoma SH—SY5Y
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: double strand
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Lys Glu lie Ser Gly His Thr Ser Gly lie Lys Lys Ala Leu Trp Cys
  • Ser Glu Asp Lys Gin lie Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr Val Arg Leu
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human
  • Tissue type brain
  • ATCACACGCC CACATACTGC AGTGTGGGAG TAGATTGGTA CGTACTGAGC ACTTAGAAAC 2520
  • Organism name human
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA-sequence
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA Array
  • Sequence length 20-Sequence type: Nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA-sequence
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA Array
  • Sequence length 20-Sequence type: Nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid.
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA Array
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name human

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Abstract

Novel apoptosis-related DNAs; methods for obtaining these DNAs; recombinant vectors consisting of the DNAs and vectors; transformants obtained by transferring the recombinant vectors into hosts; processes for producing novel polypeptides encoded by the above DNAs with the use of the transformants; the novel polypeptides; antibodies recognizing these polypeptides; reagents and methods for detecting apoptosis with the use of the above DNAs, polypeptides and antibodies; drugs for inhibiting apoptosis with the use of the above DNAs, polypeptides and antibodies; and methods for diagnosing, preventing or treating diseases in which apoptosis participates with the use of the above DNAs, polypeptides and antibodies.

Description

明 細 書  Specification
新規アポトーシス関連 D N A 技術分野  New apoptosis-related DNA
本発明は、 アポトーシスに関与する D N A、 該 D N Aのコードするポリべプチ ドおよび該ポリべプチドを認識する抗体に関する。  The present invention relates to a DNA involved in apoptosis, a polypeptide encoded by the DNA, and an antibody recognizing the polypeptide.
背景技術 Background art
アポトーシスは生体において組織が通常の形態や機能を保持していくために、 不要となった、 あるいは異常を起こした細胞が自ら自己破壊を起こす細胞死を意 味する。 例えば、 発生期の組織や器官の形態形成および神経ネッ トワーク形成時 の不要な細胞の除去、 各組織の細胞が新しい細胞に交替する際の古い細胞の除去、 自己に反応する免疫細胞の排除、 ゥィルス感染細胞の除去等にはアポト—シスが 働いている。  Apoptosis refers to cell death in which cells that are no longer needed or have become abnormally self-destruct because the tissue retains its normal shape and function in the living body. For example, removal of unwanted cells during morphogenesis of developing tissues and organs and formation of neural networks, removal of old cells when cells in each tissue are replaced by new cells, elimination of immune cells that react to themselves, Apoptosis works to remove virus-infected cells.
アポトーシスを起こした細胞は核でのクロマチンの凝縮が起こることが特徴的 であり、 細胞自身も収縮して死に、 炎症を起こさずに貪食細胞に除去される。 こ の際クロマチン D N Aが断片化し、 電気泳動にかけ梯子状のパターンが観察され る。  Apoptotic cells are characterized by the accumulation of chromatin in the nucleus. The cells themselves contract and die, and are eliminated by phagocytic cells without inflammation. At this time, chromatin DNA is fragmented, and a ladder-like pattern is observed upon electrophoresis.
アポトーシスは生体の組織が通常の形態や機能を保持していくために必要な細 胞死であり、 生体内の種々の遺伝子によって厳密に制御されている。 従って、 該 制御の異常による生体への影響は多大であると考えられている。  Apoptosis is cell death that is necessary for the body tissue to maintain its normal form and function, and is strictly controlled by various genes in the body. Therefore, it is considered that the abnormalities in the control have a great effect on the living body.
神経細胞は、 発生段階より、 増殖、 伸長およびアポトーシスによる厳密な制御 を受けており、 該制御により、 神経細胞による神経ネッ トワークが形成されると 考えられている。 神経細胞は、 分化後には増殖が停止するが、 生存は長期に渡つ て維持される。 近年になって、 神経細胞における多くの病理的な細胞死にもアポ ト一シスが関与することが知られてきた。 例えば、 脳虚血による神経細胞の壊死 において、 ネクローシスとともに、 アポトーシスによる多数の神経細胞の死が観 察されている [Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 16, 186 (19 96)、 Stroke, 26, 1252 (1995)] 。 また、 進行的に神経細胞が脱落減少していく ような疾患、 例えば、 アルツハイマー病 [Experimental Neurology, 133- 225 ( 1995)] 、 パーキンソン病 [Journal of Neurological Sciences, 137, 120 (199 6)〕 、 ハンチン ト ン舞踏病 [Experimental Neurology, 133, 265 (1995)、 Neuro report, 6, 1053 (1995)、 Journal of Neuroscience, 1_5, 3775 (1995)] 、 筋萎 縮性側索硬化症 [Neuropathology and Applied Neurobiology, 21, 498 (1995) 〕 等において、 神経細胞にアポトーシスが起きていることが報告されている。 アルツハイマー病で細胞に蓄積し、 病態に深く関与していると考えられている アミロイ ド βぺプチドは神経細胞死を引き起こすが、 このアミロイ ド/?ぺプチド による細胞死もアポトーシスであり 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7951 ( 1993)〕 、 ヒ ト免疫不全症ウ ィルス （H I V) 感染による神経細胞死もアポトー シスによるものであると報告されている [American Journal of Pathology, 146, 1121 (1995)、 Acta Neuropathologies, 91, 169 (1996)〕 。 Nerve cells are strictly controlled by proliferation, elongation, and apoptosis from the developmental stage, and it is thought that the control forms a nerve network by nerve cells. Nerve cells cease to proliferate after differentiation, but survive for a long time. In recent years, it has been known that apoptosis is also involved in many pathological cell deaths in nerve cells. For example, neuronal necrosis due to cerebral ischemia In addition, death of a large number of nerve cells due to apoptosis has been observed along with necrosis [Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 16, 186 (1996), Stroke, 26, 1252 (1995)]. In addition, diseases in which neurons are progressively lost, such as Alzheimer's disease [Experimental Neurology, 133-225 (1995)], Parkinson's disease [Journal of Neurological Sciences, 137, 120 (1996)], Huntington's chorea [Experimental Neurology, 133, 265 (1995), Neuro report, 6, 1053 (1995), Journal of Neuroscience, 1_5, 3775 (1995)], Amyotrophic lateral sclerosis [Neuropathology and Applied Neurobiology, 21, 498 (1995)], etc., report that apoptosis occurs in nerve cells. Amyloid β-peptide, which accumulates in cells in Alzheimer's disease and is thought to be deeply involved in the pathogenesis, causes neuronal cell death, and cell death by this amyloid / peptide is also apoptosis [Pro Natl Acad. Sci. USA, 90, 7951 (1993)], and neuronal cell death due to human immunodeficiency virus (HIV) infection has also been reported to be due to apoptosis [American Journal of Pathology, 146, 1121 (1995), Acta Neuropathologies, 91, 169 (1996)].
神経細胞のアポトーシスを制御する遺伝子とその機構については、 神経細胞に 実験的にアポト一シスを誘導することによりいく らか解明されてきた。  The genes controlling neuronal apoptosis and their mechanisms have been elucidated somewhat by experimentally inducing apoptosis in neurons.
例 は、 b c 1 — 〔B cell lymphoma / leukemia- 2 gene、 science, 258, 3 02 (1992)、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4533 (1993)〕 はアポトーシスを 抑制する働きを持つ蛋白の遺伝子であり、 個体発生の際の形態形成などにも関与 していると考えられている。 多様なガン細胞で該遺伝子が過剰発現されているこ とがわかり， 抗ガン剤開発の標的となっている。 該 b e 1 — 2のアンチセンス - オリゴ DN Aを用いることによ り、 動物実験でヒ トの結腸ガンの成長を抑止させ ることができることを米国 Genta社は証明している （日経バイォ最新用語辞典、 日経 B P社 1 9 9 5年） 。  For example, bc 1 — [B cell lymphoma / leukemia-2 gene, science, 258, 302 (1992), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4533 (1993)] has an inhibitory effect on apoptosis It is a protein gene that is thought to be involved in morphogenesis during ontogeny. This gene was found to be overexpressed in various cancer cells, and has become a target for anticancer drug development. Genta has shown that the use of the be1-2 antisense-oligoDNA can inhibit the growth of human colon cancer in animal studies. Dictionary, Nikkei Business Publications, 1995).
p 53 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91， 7525 (1994)] は細胞周期を止め る活性を有する力 該活性による細胞周期の制御に加え、 放射線、 薬剤などによ る傷を受けた細胞の周期を停止させたり、 アポトーシスを引き起こさせるのに働 いていると考えられている。 p 53が異常をきたすと損傷を受けた細胞がそのま ま増殖することとなり、 ガンが発生すると考えられている。 p 5 3のアポトーシ ス誘導機構はまだ知られていない。 p53 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7525 (1994)] arrests the cell cycle. In addition to controlling the cell cycle by this activity, it is thought to act to stop the cycle of cells damaged by radiation, drugs and the like, and to induce apoptosis. It is thought that if p53 becomes abnormal, the damaged cells will proliferate as they are, causing cancer. The mechanism of apoptosis induction of p53 is not yet known.
また、 CuZZnスーパーォキシドジスムターゼの発現の抑制によ りアポトーシス が誘導されたことによる、活性酸素のアポトーシスへの関与〔Prcx:. Natl. Acad. In addition, apoptosis was induced by suppressing the expression of CuZZn superoxide dismutase, so that active oxygen contributes to apoptosis (Prcx: Natl. Acad.
Sci. USA, 91, 6384 (1994)〕 、 NG F (nerve growth factor) 等の神経栄養 因子の欠乏、 カリウムィオンの欠乏または Cu/Znスーパーォキシドジスムタ一 ゼの発現の抑制によつておこる神経細胞のアポト一シスの情報伝達の下流におけ る I C E unterleukin-1 converting enzyme) の関与 [Proc. Natl. Acad. Sci.Sci. USA, 91, 6384 (1994)], deficiency of neurotrophic factors such as NGF (nerve growth factor), deficiency of potassium ion, or suppression of Cu / Zn superoxide dismutase expression. Involvement of ICE unterleukin-1 converting enzyme) downstream of neuronal apoptosis signaling [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93, 5635 (1996)] に関する報告がある。 しかしながら、 これらの分子に よるアポトーシス誘因の情報伝達機構は解明されていない。 USA, 93, 5635 (1996)]. However, the signaling mechanism of these molecules to induce apoptosis has not been elucidated.
アポトーシスが関与していると考えられる疾患の診断、 予防、 治療のために、 アポトーシスに関与する DN A等の解明が望まれている。 本発明はこれらの課題 に対し有用である。 発明の開示  In order to diagnose, prevent and treat diseases in which apoptosis is considered to be involved, elucidation of DNA and the like involved in apoptosis is desired. The present invention is useful for these problems. Disclosure of the invention
本発明は、 アポトーシスに関与する新規 DNA、 該 DN Aの取得方法、 該 DN Aとべクターからなる組み換えべクター、 該組み換えべクターを宿主に導入して 得られる形質転換体、 該形質転換体を用いた上記 DN Aのコ— ドする新規ポリぺ プチドの製造法並びに該新規ポリペプチド、 該ポリペプチドを認識する抗体、 上 記 DNA、 ポリペプチド、 抗体を用いたアポトーシスの検出用試薬並びに検出法、 および、 上記 DNA、 ポリペプチド、 抗体を用いたアポト一シスの抑制並びにァ ポトーシスの関与する疾患の診断、 予防、 治療に関する。  The present invention provides a novel DNA involved in apoptosis, a method for obtaining the DNA, a recombinant vector comprising the DNA and a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant vector into a host, and a transformant. A method for producing a novel polypeptide encoding the above-mentioned DNA, and the novel polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, the DNA, the polypeptide, a reagent for detecting apoptosis using the antibody, and a detection method The present invention relates to suppression of apoptosis using the above DNA, polypeptide, and antibody, and diagnosis, prevention, and treatment of a disease associated with apoptosis.
本発明の DNAは、 アポトーシスに関与する DNAであり、 例えば、 p 1 1遺 伝子、 単球走化†生蛋白— 1 (monocyte chemoattractant protein- 1：以下、 MC P— 1 と略す） 遺伝子、 アルドラ一ゼ C遺伝子、 αチューブリ ン遺伝子、 配列番 号 1〜8で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有する DNA、 および、 該 D N Aとス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリダィズする D N Aをあげることが できる。 The DNA of the present invention is a DNA involved in apoptosis. Gene, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) gene, aldolase C gene, α-tubulin gene, represented by SEQ ID NOS: 1-8 And a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions.
上記の 「ス トリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」 とは、 配列 番号 1〜 8で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有する DN Aをプローブ として、 コロニー 'ノヽィブリダィゼーシヨ ン法、 プラーク 'ノヽィブリダィゼーシ ョン法あるいはサザンプロッ トハイプリダイゼ一ション法等を用いることにより 得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNA を固定化したフ ィ ルタ一を用いて、 0. 7〜 1. 0Mの N a C l存在下、 6 5 °C でハイプリダイゼ一シヨ ンを行った後、 0. 1倍〜 2倍濃度の S S C溶液 （ 1倍 濃度の S S C溶液の組成は、 1 50 mM塩化ナトリウム、 1 5 mMクェン酸ナト リウムょりなる） を用い、 65 °C条件下でフィ ルターを洗浄することにより同定 できる D N Aをあげることができる。  The above-mentioned "DNA that hybridizes under stringent conditions" refers to a colony of a hybridized DNA using a DNA having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8 as a probe. Means the DNA obtained by using the hybridization method or the Southern blot hybridization method, and more specifically, using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. After performing the hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, the SSC solution at a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution at a concentration of 1 times) Can be identified by washing the filter with 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) at 65 ° C.
ノヽィフ'リ 夕、'ィセー ン ョ ン i 、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , beco nd Edit ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキユラ 一 .クローニング 第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、 DNA Clonin 1： Core Techniques, A Practi cal Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等 lこ言己車 されてレ、る 方法に準じて行うことができる。 ハイプリダイズ可能な DN Αとして具体的には、 配列番号 1〜 8で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なく とも 6 0 %以 上の相同性を有する DN A、 好ましくは 80 %以上の相同性を有する DN A、 更 に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する DNAをあげることができる。  Noifu Ri-Yu, I-Iseon i, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, bend edit ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as "Molekiura I. Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. be able to. Specifically, the hybridizable DN is a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8, and preferably 80% or more. DNAs having homology, and more preferably DNA having homology of 95% or more can be mentioned.
更に、 本発明の DNAとして、 アポトーシスに関与する DNAの一部の配列を 有するオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス . ォリゴヌクレオチドも含まれる。 該オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 配列番号 1〜 8で表される塩基配列から 選ばれる塩基配列中の連続した 5〜 6 0残基、 好ましくは 1 0〜 4 0残基の塩基 配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、アンチセンス - オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 該オリゴヌクレオチドのアンチセンス - ォ リゴヌクレオチドをあげることができる。 該ヌクレオチドとして、 例えば、 配列 番号 22〜 52で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するヌクレオチド 等をあげることができる。 Furthermore, the DNA of the present invention also includes oligonucleotides having a partial sequence of DNA involved in apoptosis and antisense oligonucleotides. As the oligonucleotide, for example, the same sequence as the base sequence of consecutive 5 to 60 residues, preferably 10 to 40 residues in the base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8 And an antisense-oligonucleotide, for example, an antisense-oligonucleotide of the oligonucleotide. Examples of the nucleotide include a nucleotide having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 22 to 52, and the like.
本発明のポリべプチドと して、 上述の本発明の DN Aによ りコ一ドされるポリ ぺプチドをあげることができ、 具体的には、 p i 1、 M C P— 1、 アルドラ一ゼ C, "チューブリン、 配列番号 9で表せられるアミ ノ酸配列から選ばれるァミノ 酸配列を有するポリべプチド、 あるいは配列番号 9で表されるァミノ酸配列から 選ばれるアミノ酸配列を有するポリぺプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のァ ミノ酸が置換、 欠失または付加したァミノ酸配列を有し、 かつアポトーシスに関 与する活性を有するペプチド等をあげることができる。  Examples of the polypeptide of the present invention include the polypeptide encoded by the above-described DNA of the present invention. Specifically, pi1, MCP-1 and aldolase C are exemplified. , "Tubulin, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or an amino acid of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Peptides having an amino acid sequence in which at least one amino acid in the sequence has been substituted, deleted or added, and having an activity relating to apoptosis can be mentioned.
ポリべプチドのアミノ酸配列のうち一個以上のァミノ酸が置換、 欠失または付 加したァミノ酸配列を有し、 かつアポトーシスに関与する活性を有するペプチド は、 Molecular し loning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucle ic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Pro Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 ( 1985)等に記載の方法に準じて調製することができる。  Peptides having an amino acid sequence in which at least one amino acid in the amino acid sequence of the polypeptide has been substituted, deleted or added, and which has an activity involved in apoptosis are described in Molecular loning, A Laboratory Manual, Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Pro Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409. (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Pro Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc. Can be.
本発明の抗体は、 上述のポリべプチドを認識する抗体をあげることができる。 以下、 本発明を詳細に説明する。 発明を実施するための最良の形態 The antibodies of the present invention include antibodies that recognize the above-mentioned polypeptides. Hereinafter, the present invention will be described in detail. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. アポトーシスに関与する DN Aの調製  1. Preparation of DNA involved in apoptosis
神経細胞のアポトーシス誘導時における mRN Aの発現の変動に注目し、 ディ ファ レンシャル ' ディ スプレイ法 〔FEBS Letters, 351, 231 (1994)〕 を利用し、 - アポトーシスに関与する DN Aを調製する。  Paying attention to the fluctuation of mRNA expression during the induction of apoptosis in nerve cells, using the differential 'display method [FEBS Letters, 351, 231 (1994)],-prepare DNA involved in apoptosis.
即ち、 培養し、 分化させた神経細胞にアポトーシスを誘導した際に、 該細胞中 における発現量が変動する m R N Aを、 ディ ファ レンシャル . ディスプレイ法に よ り特定し、 該 mRN Aに対応する c DN Aを調製する。  That is, when apoptosis is induced in cultured and differentiated nerve cells, mRNA whose expression level fluctuates in the cells is identified by the differential display method, and c mRNA corresponding to the mRNA is identified. Prepare DNA.
以下、 該方法について述べる。  Hereinafter, the method will be described.
神経細胞の培養法としては、 動物細胞培養法であればいずれも用いることがで きる。  As the method for culturing nerve cells, any animal cell culturing method can be used.
神経細胞としてはヒ ト神経芽細胞腫系細胞をあげることができ、 好ましくは、 S H—S Y 5 Y [Cancer Res.， 33, 2643 (1973)〕 をあげることができる。  Examples of the neurons include human neuroblastoma cells, and preferably, SH—S Y 5 Y [Cancer Res., 33, 2643 (1973)].
動物細胞を培養する培地と しては、 一般に使用されている R PM I 1 64 0培 地、 Eagl eの M E M培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用 いることができる。  As a medium for culturing animal cells, a commonly used RPMI 164 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium can be used.
培養は、 通常 5 %C02存在下等の条件下で行う。 培養温度は 3 5〜 3 7でが よ く、 培養時間は、 通常 3〜 7日間である。 Culturing is carried out under conditions such as normal 5% C0 2 presence. The culture temperature is preferably 35 to 37, and the culture time is usually 3 to 7 days.
培養方法と して具体的には、 神経芽細胞腫セルライン S H— S Y 5 Yを、 1 0 % 子牛胎児血清、 1 00単位 111 1 ペニシリ ン、 1 0 0 / gZm l ス ト レブ トマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM : 日水製薬製） を 用い、 3 7°C、 5 %C 02の条件で、 該細胞が 80〜 1 0 0 %コンフルェン トな 状態になるまで培養する方法を例示することができる。 As a specific culture method, the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, 100% fetal calf serum, 100 units 111 1 penicillin, 100 / gZml strebtomycin were used. added Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM: manufactured by Nissui Seiyaku) was used, at 3 7 ° C, 5% C 0 2 conditions, method of culturing until the cells became 80-1 0 0% Konfuruen preparative conditions Can be exemplified.
該培養した神経芽細胞腫細胞を神経細胞に分化させる。 細胞の分化にはレチノ ィ ド等の分化誘導剤を用いる。  The cultured neuroblastoma cells are differentiated into nerve cells. For differentiation of cells, a differentiation inducer such as retinoid is used.
該神経細胞の分化の方法として具体的には、 上記で培養した S H— S Y 5 Yを 1〜 5 X 1 04個/ c m2の密度になるよう直径 1 0 c mの細胞培養用シャーレに 植え継いで上記と同様の方法により 1 0〜 3 0時間培養後、 オールトランス体レ チノイン酸 〔Sigma社製〕 を 2〜 2 0 M添加し、 さらに 5〜 1 0日間培養する ことにより神経細胞に分化させる方法を例示することができる。 ― 該分化させた細胞に、 アポト一シス誘因剤を用いて、 アポト一シスを誘導させ る。 As a method for differentiating the nerve cells, specifically, SH-SY5Y cultured above is used. . 1 to 5 X 1 0 4 pieces / footsteps planted cm 2 diameter 1 0 cm Petri dish for cell culture to a density 1 0-3 0 hours of culture in the same manner as described above, all-trans form retinoic acid [Sigma] can be added in an amount of 2 to 20 M, and further cultured for 5 to 10 days to differentiate the cells into nerve cells. -Inducing the differentiated cells to induce apoptosis using an apoptosis inducer.
アポト一シス誘因剤として、 アミロイ ド/?ペプチド 〔Pro Natl. Acad. Sci USA, 90, 7951 (1992)〕 、 エトポシ ド 〔Brain Res.， 641, 350 (1994)〕 、 コル ヒチン 〔Biochem. Biophys.Res. Commun. , J_99, 807 (1994)〕 等をあげることが できる。  As apoptotic inducers, amyloid /? Peptide [Pro Natl. Acad. Sci USA, 90, 7951 (1992)], etoposide [Brain Res., 641, 350 (1994)], colchicine [Biochem. Biophys] .Res. Commun., J_99, 807 (1994)].
アポトーシスを誘導させる具体的な方法として、 上記分化させた細胞に、 0. 1〜 1 0 Mのコルヒチン （和光純薬製） を添加し、 上記と同様の方法で 5〜 9 0時間培養することによ りアポト一シスを誘導させる方法を例示することができ る。  As a specific method for inducing apoptosis, 0.1 to 10 M of colchicine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to the differentiated cells, and the cells are cultured for 5 to 90 hours in the same manner as described above. Thus, a method for inducing apoptosis can be exemplified.
該細胞にアポト一シスが誘導されていることは、 常法によ り該細胞から D N A を抽出、 精製し、 該 DN Aをァガロースゲル電気泳動にかけ、 該 DN Aの断片化 が生じていることを観察することによ り確認できる。  The fact that apoptosis is induced in the cells means that DNA is extracted and purified from the cells by a conventional method, and the DNA is subjected to agarose gel electrophoresis, whereby fragmentation of the DNA occurs. It can be confirmed by observation.
コルヒチン添加後経時的に細胞を回収し、 これら各々の細胞よ り RN Aを抽出 する。  Cells are collected over time after the addition of colchicine, and RNA is extracted from each of these cells.
神経細胞から全 RN Aを調製する方法と しては、 チォシアン酸グァニジン一ト リフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymol. , 154, 3 (1987)〕 、 AG P C 法 〔実験医学， 1937 (1991)3 などがあげられる。  Methods for preparing total RNA from neural cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], the AGPC method [Experimental Medicine, 1937 (1991) 3]. And so on.
また全 RN Aからポリ（A) + RN Aとして m R N Aを調製する方法としては、 オリゴ （ d T ) 固定化セルロースカラム法 〔モレキュラー · クローニング 第 2 版〕 等があげられる。  In addition, as a method for preparing mRNA as poly (A) + RNA from total RNA, an oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, 2nd Edition] and the like can be mentioned.
更に、 ファース ト - トラッ ク - mRNA ' アイソレーショ ン - キッ ト 〔Fast T rack mRNA Isolation Kit； イ ンビトロジェン （Invitrogen) 社製〕 、 クイック ' プレップ * m R N A · ピユリフィケーシヨン · キッ ト （Quick Prep mRNA Purif i cation Kit； フアルマシア社製） などのキッ トを用いて神経細胞から直接 m R N Aを調製することもできる。 - 経時的に採取した神経細胞よ り抽出した上記各々の R N Aから、 アンカ一ブラ イマ一を用いて常法により c DNAを合成し、 続いて、 これら各々の c DNAに 対して 5 '末端を蛍光標識したアンカープライマーと任意のブライマ一を用いて P C Rを行い、 c DNAを増幅する。 In addition, Fast-Track-mRNA 'isolation-kit [Fast T rack mRNA Isolation Kit; manufactured by Invitrogen), and Quick'Prep * mRNA / Purification Kit (Quick Prep mRNA Purification Kit; manufactured by Pharmacia). MRNA can also be prepared directly from cells. -CDNA is synthesized from each of the RNAs extracted from the nerve cells collected over time using an anchor primer in a conventional manner, and then the 5 'end of each cDNA is Perform PCR using the fluorescently labeled anchor primer and any primer to amplify cDNA.
アンカープライマ一とは、 3 '末端にチミジンを除く、 アデニン、 グァニンあ るいはシトシンのオリゴヌクレオチドを、 m R N Aの 3 '末端ポリ A配列に会合 するオリゴ d T配列に付加したプライマーであり、 例えば、 gT15MA (配列番 号 1 0〜 1 2の混合物） 、 gT15MT (配列番号 1 3〜 1 5の混合物） 、 gT15 MG (配列番号 1 6〜 1 8の混合物） 、 gT 15MC (配列番号 1 9〜 2 1の混合 物） 等をあげることができる。 蛍光標識はフルォレシン · イソチオシァネート （ 以下、 F I TCと略す） を用いて常法によ り行うことができる。 An anchor primer is a primer obtained by adding an adenine, guanine, or cytosine oligonucleotide, excluding thymidine, at the 3 ′ end to an oligo dT sequence associated with the 3 ′ end poly A sequence of mRNA. , (mixture of SEQ ID NO 1 0~ 1 2) gT 15 MA , ( mixture of SEQ ID NO: 1 3~ 1 5) gT 15 MT , ( mixture of SEQ ID NO: 1 6~ 1 8) gT 15 MG , gT 15 MC (Mixtures of SEQ ID NOS: 19 to 21). Fluorescent labeling can be performed by a conventional method using fluorescin / isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC).
任意プライマーとは、 多種類の c DN Aの配列に対して増幅し、 かつ一度の反 応で多数の c DN A増幅断片を得ることができるオリゴヌクレオチドのことであ り、 オペロン ' テクノロジーズ （Operon Technologies)社製の 0 P A— 1〜 2 0、 O P B— 1〜 2 0、 OP C— 1〜 2 0、 OP D— 1〜 2 0等をあげることができ る。 任意ブライマ一は 1 0塩基程度の長さのものが好ましい。  Optional primers are oligonucleotides that can amplify many types of cDNA sequences and obtain a large number of amplified cDNA fragments in a single reaction. Operon 'Technologies Technologies) 0 PA-1 to 20; OPB-1 to 20; OPC-1 to 20; OPD-1 to 20 and the like. The optional primer preferably has a length of about 10 bases.
P C Rにより増幅された上記各々の c DN Aを、 ポリアクリルアミ ドゲルで電 気泳動し、 それぞれについて、 得られたバン ドの蛍光量をフルォロイメージャ一 を用いて測定する。  Each of the above-mentioned cDNAs amplified by the PCR is electrophoresed on a polyacrylamide gel, and the amount of fluorescence of the resulting band is measured using a fluoroimager for each.
各々のバン ドの蛍光量を比較し、 経時的に、 蛍光量の変動しているバン ドの位 置に相当するところのゲルより、 常法によ り c DNA断片を回収する。  Compare the amount of fluorescence of each band, and recover the cDNA fragment from the gel corresponding to the position of the band where the amount of fluorescence fluctuates over time by a conventional method.
該 c DNAを P C R等により増幅する。 該増幅 D N A断片をそのままあるいは適当な制限酵素などで切断後常法により ベクタ一に組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー（Sange r)らのジデォキシ法 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 あるい は 3 73 A . DNAシークェンサ一 〔Perkin Elmer社製〕 等の塩基配列分析装置 を用いて分析することにより、 該 DN Aの塩基配列を決定する。 The cDNA is amplified by PCR or the like. The amplified DNA fragment is used as it is or after digestion with an appropriate restriction enzyme or the like and integrated into a vector by a conventional method. A commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Pro Natl. Acad. Sci. USA , 74, 5463 (1977)] or 373 A. The nucleotide sequence of the DNA is determined by analysis using a nucleotide sequence analyzer such as DNA Sequencer (manufactured by Perkin Elmer).
該増幅 DN A断片を組み込むベクタ一としては、 pBluescript KS (+) (Stratag ene社製) 、 pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)〕 、 pCR-Scri pt Amp SK (+) 〔Stratagene社製、 Strategies, 5, 6264 (1992)] 、 pT7Blue [No vagen社製〕 、 pCR II 〔イ ンビトロジヱン社製、 Biotechnology, 9, 657 (1991) Examples of the vector incorporating the amplified DNA fragment include pBluescript KS (+) (manufactured by Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene Strategies, 5, 6264 (1992)], pT7Blue [manufactured by Novagen], pCR II [manufactured by Invitrodin, Biotechnology, 9, 657 (1991)]
〕 、 pCR-T AP [Genehunter社製〕 および pNoTAT7 〔5プライム— 3プライム社制], PCR-T AP (Genehunter) and pNoTA T7 (5 prime-3 prime)
) などをあげることができる。 ) And so on.
このようにして決定された塩基配列の新規性は、 b i a s t等の相同性検索プ ログラムを用いて、 G e n B a n k、 E M B Lおよび D D B Jなどの塩基配列デ —タベースを検索することにより、 デ一夕べ一ス中の塩基配列と一致すると考え られるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことによ り確認できる。  The novelty of the nucleotide sequence determined in this way can be determined overnight by searching base sequence databases such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as biast. This can be confirmed by the fact that there is no nucleotide sequence showing obvious homology, which is considered to be identical to the nucleotide sequence in one copy.
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有する DN Aと して、 例えば、 配列番号 3または 4で表される配列を有する D N A等をあげることができる。 配列番号 1で表される配列を有する DNAを有するブラスミ ド p 3 8— 1— 1 を含有する大腸菌 Escherichia coli D H 5 a /p 3 8— 1— 1、 配列番号 2で 表される配列を有する DN Aを有するプラスミ ド p G 2 7 T Iを含有する大腸菌 Escherichia coli D H 5 a/p G 2 7 T 配列番号 3で表される配列を有す る DNAを有するプラスミ ド p C 4 6 - 5を含有する大腸菌 Escherichia coli DH 5 «/p C 4 6 - 5または配列番号 4で表される配列を有する D N Aを有す るプラスミ ド C 5 5— 3— 1を含有する大腸菌 Escherichia coli D H 5 a /C 5 5— 3— 1はそれぞれ、 F E RM B P— 584 3、 FE RM B P— 5 84 4、 F ERM B P- 584 5 , F ERM B P— 584 6として、 平成 9年 2 月 2 8日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、 日本国茨城県つくば市東 1 丁目 3番 （郵便番号 3 0 5004 6 ) に寄託されている。 Examples of the DNA having the novel base sequence obtained as described above include DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and the like. Escherichia coli DH5a / p38-1-1-1 containing a plasmid p38-1-1-1 having a DNA having a sequence represented by SEQ ID NO: 1, having a sequence represented by SEQ ID NO: 2 Escherichia coli DH5a / pG27T containing plasmid pG27TI having DNA Plasmid pC46-5 having DNA having a sequence represented by SEQ ID NO: 3 Escherichia coli DH5 «/ pC46-5 or Escherichia coli DH5a / containing plasmid C55-3-1 containing DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 4 C 5 5—3—1 are FE RM BP—584 3, FE RM BP—5844, F ERM B P-584 5 and F ERM BP—584 6, respectively. It has been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, on March 28, 1-3-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code: 30050046).
上述の方法で得られた DN Aが、 アポトーシスによ り発現の変動する mRN A に対応する c DNAの部分 DNA断片であった場合には、 下記 （ 1 ) 、 （2) ま たは （3) の方法により c DN A全長を得ることができる。  If the DNA obtained by the above method is a partial DNA fragment of cDNA corresponding to mRNA whose expression varies due to apoptosis, the following (1), (2) or (3) ) Can be used to obtain the full-length cDNA.
( 1 ) c DN Aライブラリーの利用  (1) Use of the cDNA library
上記 DN A断片をプローブとして、 各種 c DNAライブラリ一を用いたハイブ リダィゼ一シヨンによるスクリーニングを行うことによ り、 c DN A全長を得る ことができる。  By performing screening by hybridization using various cDNA libraries using the above-mentioned DNA fragment as a probe, the full-length cDNA can be obtained.
以下に c DN Aライブラリ一の作製法について述べる。  The following describes a method for preparing a cDNA library.
c D N Aライブラリ一作製法と しては、 モレキュラー · クロ一ニング 第 2版 や Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレン ト · プロ ト コールズ ' イ ン ' モレキュラー ' ノ ィォロジ一と略記 する）等に記載された方法、あるいは市販のキッ ト、例えばスーパースクリプト - プラスミ ド ' システム · フォー · c D N A · シンセシス · アン ド ' プラスミ ド クローニング [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning； Gibco BRL社製〕 やザップ一 c D N A · シンセシス · キッ ト 〔ZAP- cDN A Synthesis Kit, ス トラタジーン社製〕 を用いる方法などがあげられる。 さら に、 c DN Aライブラリ一そのものの市販品、 例えばクローンテック （Clontech ) 社のヒ ト脳 c D N Aライブラリ一などもあり、 利用することができる。  c Methods for preparing DNA libraries include Molecular Cloning, 2nd Edition and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereafter referred to as Current Protocols' In 'Molecular'). Or a commercially available kit, such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and And Plasmid Cloning [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning; Gibco BRL) or Zap-1 cDNA, synthesis kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, Stratagene). In addition, there is a commercially available cDNA library itself, such as a human brain cDNA library from Clontech, which can be used.
c DNAライブラリ一を作成するための、 クロ一ニングベクターとしては、 大 腸菌 K 1 2株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクタ一、 プラスミ ツ ドベクター等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [Stratagene社 製、 Strategies, 5, 58 (1992)〕 、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Rese arch, 17, 9494 (1989)〕 、 A zap II (Stratagene社製） 、 ス gtlO、ス tll (DN A Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕 、 Lambda BlueMid (クロ一 ンテック社製） 、 ス ExCell (フアルマシア社製） 、 pT7T3 18U (フアルマシア社 製） 、 pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983)〕 および pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)3等をあげることができる。 Any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as a closing vector for preparing a DNA library as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain. Specifically, ZAP Express [Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Rese arch, 17, 9494 (1989)], A zap II (Stratagene) GtlO, stll (DN A Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)), Lambda BlueMid (clo ExCell (Pharmacia), pT7T3 18U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) 3) Can be given.
宿主微生物と しては、 大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることが できる。 具体的には、 Escherichia cojj XLl-Blue MRF' 〔Stratagene社製、 Str ategies, 5， 81 (1992)] 、 Escherichia coli C600 (Genetics, 39, 440 (1954) 〕 、 Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y1090 (Science, 222, 778 (1983)〕 , Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕 、 Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol. , 16, 118 (1966)〕 および Escherichia col i JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 等が用いられる。  As the host microorganism, any microorganism belonging to Escherichia coli can be used. Specifically, Escherichia cojj XLl-Blue MRF '[Stratagene, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 (Science, 222, 778 (1983)), Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] and Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
c DNAライブラリ一からの c DNAクローンの選択と しては、 アイソ トープ あるいは蛍光標識したプロ一ブを用いたコロニー 'ハイブリダイゼーション法ぁ るレ、はプラーク ' ハイブリ ダィゼーシヨ ン法 （モレキュラー ' クロ一ニング 第 2版） により選択することができる。  The selection of cDNA clones from a single cDNA library includes colony hybridization using isotopic or fluorescently labeled probes, plaque hybridization hybridization (molecular), and cloning. 2nd edition).
選択されたクローンより常法により目的とする DN Aを取得することができる。 The desired DNA can be obtained from the selected clone by a conventional method.
(2) 上述の方法により mRNAより c DNAを合成し、 該 c DN Aの両端にァ グプタ一を付加し、 このアダプターの塩基配列と増幅断片の塩基配列に基づいた ブライマ一で P C Rを行う 5 '— R A C E (rapid amplification of cDNA ends) および 3 '— RAC E (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)〕 によ り目 的とする DN Aを取得することができる。 (2) cDNA is synthesized from mRNA by the above-described method, and the cDNA is added to both ends of the cDNA, and PCR is performed with a primer based on the nucleotide sequence of the adapter and the nucleotide sequence of the amplified fragment. '—RACE (rapid amplification of cDNA ends) and 3'—RACE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)) can obtain the desired DNA.
(3) 塩基配列に基づいたプライマーを調製し、 mRNAから合成した c DN A あるレ、は c DN Aライブラリーを铸型として、 P C R法 （PCR Protocols, Acade mic Press (1990)〕 により目的とする D N Aを取得することができる。  (3) A primer based on the nucleotide sequence was prepared, and the cDNA synthesized from mRNA was used for PCR. (PCR Protocols, Academic Press (1990)) DNA can be obtained.
これらの方法により取得された DNAの塩基配列は、 上述の塩基配列の決定法 により決定することができる。 該配列の新規性に関しても上述の方法により確認 することができる。 該方法により確認された新規な塩基配列を有する DNAとして、 例えば、 配列 番号 7または 8で表される配列を有する DN A等をあげることができる。 The nucleotide sequence of DNA obtained by these methods can be determined by the above-described nucleotide sequence determination method. The novelty of the sequence can also be confirmed by the method described above. Examples of the DNA having a novel nucleotide sequence confirmed by the method include DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8.
決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 DN A合成機で化学合成することに よ り目的とする DN Aを調製することもできる。 DNA合成機としては、 チォホ スフアイ ト法を利用した島津製作所社製の DN A合成機、 フォスフォアミダイ ト 法を利用したパーキン ·エルマ一社製の DNA合成機 m 0 d e 1 3 92等をあげ ることができる。  Based on the determined DNA sequence, the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer. Examples of the DNA synthesizer include a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the Thoho phosphite method, and a DNA synthesizer m0de1 392 manufactured by Perkin Elmer Inc. using the phosphoramidite method. I can give it.
該 DN Aおよび DN A断片を用いて、 常法あるいは DN A合成機により、 アポ トーシスに関与する DN Aの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドおよびアン チセンス · オリゴヌクレオチドを調製することができる。  Using the DNA and the DNA fragment, an oligonucleotide having a partial sequence of DNA involved in apoptosis and an antisense oligonucleotide can be prepared by a conventional method or a DNA synthesizer.
該ォリゴヌクレオチドまたはアンチセンス · ォリゴヌクレオチドとして、 例え ば、 検出したい mR N Aの一部の塩基配列において、 5 '末端側の塩基配列に相 当するセンスプライマ一、 3'末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライ マ一等をあげることができる。 ただし、 mR N Aにおいてゥラシルに相当する塩 基は、 オリゴヌクレオチドプライマ一においてはチミジンとなる。  As the oligonucleotide or the antisense oligonucleotide, for example, in a part of the nucleotide sequence of mRNA to be detected, a sense primer corresponding to a 5 ′ terminal nucleotide sequence and a nucleotide sequence at a 3 ′ terminal corresponding to a nucleotide sequence at a 5 ′ terminal side And the like. However, the base corresponding to peracyl in mRNA is thymidine in the oligonucleotide primer.
センスプライマ一およびアンチセンスプライマーとしては、 両者の融解温度 （ Tm) および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドで、 1 0〜4 0塩基数のものが好ましい。  The sense primer and the antisense primer are oligonucleotides whose melting temperature (Tm) and the number of bases thereof do not extremely change, and preferably have a base number of 10 to 40 bases.
アポト一シスに関与する DNAの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドまた はアンチセンス · オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 配列番号 2 2〜 52で表 される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するヌクレオチドをあげることができ る。  An oligonucleotide having a partial sequence of DNA involved in apoptosis or an antisense oligonucleotide, for example, a nucleotide having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 22 to 52 Can be done.
また、 本発明においては、 該ヌクレオチドの誘導体も用いることができ、 例え ば、 該ヌクレオチドのメチル体ゃフォスフ才ロチォエー ト体をあげることができ る o 2 . アポトーシス関連ポリペプチドの調製 In the present invention, derivatives of the nucleotide can also be used, and examples thereof include a methyl derivative of the nucleotide and a phosphotiotate derivative o. 2. Preparation of apoptosis-related polypeptide
上記 1 . に記載の方法によ り取得したアポトーシス関連 D N Aを宿主細胞中で 発現させるために、 モレキュラー · クロ一ニング 第 2版や力レン ト ' プロ トコ —ルズ ' イン ' モレキュラー · バイォロジ一等に記載された方法等を用いること ができる。  In order to express the apoptosis-related DNA obtained by the method described in 1. above in host cells, Molecular Cloning 2nd edition, Kirilent 'Protocols' in' Molecular Biologics, etc. Can be used.
即ち、 アポト一シス関連 D N Aを適当な発現べクターのプロモータ一下流に揷 入した組換え体ベクターを造成し、 それを宿主細胞に導入することによ り、 本発 明のポリペプチドを発現する形質転換体を得ることができる。  That is, a recombinant vector having an apoptosis-related DNA inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector is constructed, and the recombinant vector is introduced into a host cell to express the polypeptide of the present invention. A transformant can be obtained.
宿主細胞と しては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 目的とする遺伝子を 発現できるものであればいずれも用いることができる。  As the host cell, any one that can express the gene of interest, such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells, can be used.
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組込が可能で、 アポトーシス関連 D N Aを転写できる位置にプロモータ一を 含有しているものが用いられる。  As the expression vector, those which can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position capable of transcribing apoptosis-related DNA are used.
細菌等の原核生物を宿主細胞と して用いる場合は、 アポトーシス関連遺伝子発 現べクタ一は原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソ —ム結合配列、 アポト一シス関連遺伝子、 転写終結配列、 よ り構成されているこ とが好ましい。 プロモータ一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。  When prokaryotes such as bacteria are used as host cells, apoptosis-related gene expression vectors can replicate autonomously in prokaryotes, as well as promoters, ribosome binding sequences, apoptosis-related genes, It is preferably composed of a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter may be included.
発現べクタ一としては、 例えば、 pBT卬 2、 pBTacl , pBTac2 (いずれもべ一リ ン ガ一マンハイム社製） 、 pKK233 - 2 (フアルマシア社製） 、 pGEX (フアルマシア社 製） 、 pSE280 (イ ンビトロジヱン社製） 、 pGEMEX- 1 (Promega社製） 、 pQE - 8 (Q IAGEN社製） 、 pET- 3 (ノバジヱン社製） 、 pKYPIO (特開昭 58- 110600) 、 pKYP20 0 [Agr ic. Bio l . Chem.， 48, 669 (1984)〕 、 pLSAl [Agr ic. Bio l . Chem. , 53, 277 (1989)〕 、 pGELl [Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA.， 82, 4306 (1985)〕 、 pBl uescriptll SK+ (STRATAGENE社製） 、 pBluescript II SK (-) (STRATAGENE社製 ) 、 pTrS30 [Escher ichia col i JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407)よ り調製〕 、 pTrS3 2 [Escherichia col i JM109/pTrS32 (FERM BP - 5408)よ り調製〕 、 GKA2 (Escher i chia coH IGKA2 (FER B-6798)よ り調製〕 、 pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 ( FERM BP - 400)よ り調製〕 、 UC19 [Gene, 33, 103 (1985)〕 、 pSTV28 (宝酒造社 製） 、 pUC118 (宝酒造社製) 、 pPAl (特開昭 63-233798) 、 PTerm2 (特開平 3-22 979、 US4686191, US4939094, US5160735) 、 pGEX (Pharmacia社) 、 pETシステ- ム （Novagen社） 、 pSupex等を例示することができる。 Examples of expression vectors include pBT 卬 2, pBTacl, and pBTac2 (all manufactured by Berliner Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pGEX (manufactured by Pharmacia), and pSE280 (invitrogen). PGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by QIAGEN), pET-3 (manufactured by Novazidin), pKYPIO (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600), pKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Aglic. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sc i. USA., 82, 4306. 1985)), pBluescriptll SK + (manufactured by STRATAGENE), pBluescript II SK (-) (manufactured by STRATAGENE), pTrS30 (prepared from Escherichia col i JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)), pTrS32 (Escherichia col i JM109 / pTrS32 (FERM BP-5408)), GKA2 (Escher i chia coH IGKA2 (FER B-6798)], pGHA2 [prepared from Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400)], UC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pPAl (JP-A-63-233798), P Term2 (JP-A-3-22979, US4686191, US4939094, US5160735), pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pSupex, etc. Can be exemplified.
プロモーターとしては、 大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいか なるものでもよレ、。 例えば、 t卬プロモーター （Ptrp) 、 iacプロモータ一、 P L プロモーター、 P Rプロモータ一、 P SEプロモータ一、 T7プロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、 SP01プロモーター、 SP02プロモ 一ター、 penPプロモータ一等をあげることができる。 また P t卬を 2つ直列させ たプロモータ一 （ P t卬 X 2 ) 、 tacプロモーター、 iacT7プロモータ一、 let I プロモータ—のように人為的に設計改変されたプロモータ一等も用いることがで きる。  Any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage, such as t 卬 promoter (Ptrp), iac promoter, PL promoter, PR promoter, PSE promoter, T7 promoter, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter Etc. can be given. It is also possible to use a promoter designed and modified artificially, such as a promoter in which two Pt 卬 s are connected in series (Pt 卬 X2), a tac promoter, an iacT7 promoter, and a let I promoter. .
リボソ一ム結合配列としては、 シャイン一ダルガノ （Shine-Dalgarno) 配列と と開始コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 5〜 1 8塩基） に調節したプラスミ ッ ドを用いることが好ましい。  As the ribosomal binding sequence, it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 5 to 18 bases).
本発明の組換え体 D N Aにおいては、 本発明の D N Aの発現には転写終結配列 は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが 好ましい。  In the recombinant DNA of the present invention, a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
宿主細胞と しては、 ェシエリヒア属、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属、 バチルス属、 ミ クロバクテリウム属、 セラチア属、 シユードモナス属等 に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2- Blue、 Escherichia col i DH1、 Escherichia col丄 MC1000、 Escherichia col i KY 3276、 Escherichia col i W1485、 Escher icnia col i JM109> Escherichia col H B101、 Escherichia col i No.49、 Escherichia coli. W3110、 Escherichia coli N Y49、 Bacillus subtilis、 Bacillus amylol iquef acines, Brevibacter ium iramar iophi lum ATCC14068、 Brevibacter ium saccharolyt icum ATCC14066、 Brevibacte rium f 1 avum ATCC14067、 Brevibacter ium lactofermentum ATCC13869、 Coryneba cterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium acetoac idophi lum ATCC13870、 Microbacterium ammon i a h i 1 ura ATCC15354等をあげること力'できる。 Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Corynebacterium, Brevipacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, etc., such as Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2. -Blue, Escherichia col i DH1, Escherichia col 丄 MC1000, Escherichia col i KY 3276, Escherichia col i W1485, Escher icnia col i JM109> Escherichia col H B101, Escherichia col i No. 49, Escherichia coli.W3110, Escherichia coli Y49, Bacillus subtilis, Bacillus amylol iquef acines, Brevibacterium iramar iophi lum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyt icum ATCC 14066, Brevibacterium f 1 avum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoac idophi lum ATCC 13870, etc.
組換え体 DN Aの導入方法としては、 上記宿主細胞へ DN Aを導入する方法で あればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 〔Pr 0 Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] 、 プロ トプラス ト法 （特開昭 63 -2483942) 、 エレク ト口ポレーシヨ ン法 [Nucleic Acids Research, 16, 6127 ( 1988)]〕 等をあげることができる。  Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the above host cells. For example, a method using calcium ions [Pr0 Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-2483942), and the electroporation method [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)].
酵母菌株を宿主細胞と して用いる場合には、 発現べクターと して、 例えば、 YE P13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 pHS19、 pHS15等 を用いることができる。  When a yeast strain is used as a host cell, for example, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like can be used as expression vectors.
プロモータ一としては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモータ 一、 ADHプロモーター、 gal 1プロモータ一、 gal 10プロモ一ター、 ヒ一トショ ックポリぺプチドプロモータ一、 MF a 1 プロモ一ター、 CUP 1プロモ一タ一等の プロモーターをあげることができる。 百王糸 EQ胞としては、 saccharomyces erev^_ ae、 Schizosaccharomvces Dombe、 Kluyveromyces lactis Tr lchosporon puilulansゝ Schwann iomyces ailuvius等 をあげることができる。  Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. For example, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter And promoters such as heat shock polypeptide promoter, MFa1 promoter, CUP1 promoter and the like. Examples of the Hyodorou EQ vesicle include saccharomyces erev ^ _ae, Schizosaccharomvces Dombe, Kluyveromyces lactis Tr lchosporon puilulans ゝ Schwann iomyces ailuvius and the like.
組換え体 DN Aの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロポレーシヨン法 [Methods. Enzym ol.， 194, 182 (1990)〕 、 スフエロプラス ト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)] 、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)〕 等を あげることができる。  As a method for introducing the recombinant DNA, any method can be used as long as it introduces DNA into yeast. For example, the electroporation method [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)], Suferoplus Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)] and the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pAGElO 7 (特開平 3-22979) 、 pAS3-3 (特開平 2-227075) 、 PCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)〕 、 pcDNAI/Amp (イ ンビトロジェン社製） 、 pREP4 (インビトロジェン社 製） 、 pAGE103 [J. Biochem, 101， 1307 (1987)〕 、 pAGE210等が用いられる。 プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の I E (immediate earl y) 遺伝子のプロモーター、 S V 4 0の初期プロモータ一あるいはメタ口チォネ イ ンのプロモータ一、 レ トロウイルスのプロモーター、 ヒー トショ ックプロモ— ター、 S R "プロモーター等をあげることができる。 また、 ヒ ト CMVの I E遺 伝子のェンハンサーをプロモータ一と共に用いてもよい。 When an animal cell is used as a host, an expression vector such as pAGElO 7 (JP-A 3-22979), pAS3-3 (JP-A-2-227075), P CDM8 [Nature, 329, 840, (1987) ], (manufactured by Lee Nbitorojen Co.) pcDNAI / Amp, pREP4 (manufactured by Invitrogen) , PAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells. For example, the promoter of the immediate-early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), the early promoter of SV40 or the meta- Examples thereof include a promoter of a mouth protein, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, and an SR "promoter. An enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter. .
宿主細胞と しては、 ヒ トの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である CO S細胞、 チャイニーズ ' ハムスターの細胞である C H 0細胞、 HBT563 7 (特開昭 63-299) 等をあげることができる。  Examples of the host cells include human cells such as Namalwa cells, monkey cells such as COS cells, Chinese hamster cells such as CH0 cells, and HBT5637 (JP-A-63-299). Can be given.
組換え体 DN Aの導入方法と しては、 動物細胞に DN Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨ ン法 〔Cytotechno logy, 3， 133 (1990)〕 、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2 - 227075) 、 リボフェク シヨ ン法 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげること力； できる。  Any method for introducing the recombinant DNA can be used so long as it is a method for introducing the DNA into animal cells. For example, an electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] ], The calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the ribofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and the like.
昆虫細胞を宿主と して用いる場合には、 例えば Baculovirus Expression Vect ors， A Laboratory Manual、 カレン ト ' プロ トコールズ . イ ン . モレキュラー - バイオロジー、 Bio/Technology, 6， 47 (1988)等に記載された方法によって、 本 発明のポリぺプチドを発現することができる。  When an insect cell is used as a host, it is described in, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current 'Protocols in Molecular Biology, Bio / Technology, 6, 47 (1988). The polypeptide of the present invention can be expressed by the above method.
即ち、 組換え遺伝子導入べクターおよびバキュ口ゥィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えゥィルスを昆 虫細胞に感染させ、 本発明のポリべプチドを発現させることができる。  That is, the recombinant gene transfer vector and Baculovirus were co-transfected into insect cells to obtain recombinant viruses in the culture supernatant of insect cells, and the recombinant viruses were further infected with insect cells to obtain the present invention. The polypeptide can be expressed.
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 p VL1393、 pBlueBacIII (ともにインビトロジェン社製） 等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである ァゥ トグラファ · カリ フォルニ力 · ヌク レア一 · ポリへ ドロシス · ウィルス（Aut ographa cal l fornica nuclear polyhedros i s vi rus) などを用レ、ること力 でさる c 昆虫細胞としては、 Spodoptera f rugiperdaの卵巣細胞である S f 9、 S f 2- 1 (Baculovi rus Express ion Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman a nd Company, New York ( 1992)〕 、 Trichoplus i a eJ_の卵巣細胞である H i g h 5 (インビトロジヱン社製） 等を用いることができる。 Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like. Examples of the baculovirus include viruses that infect night insects such as Atographa, Californi, Nuclea, Polyhedrosis, and virus (Autographa cal l fornica nuclear polyhedros is virus). as the monkey c insect cells Rukoto force, S f 9 is an ovarian cell of Spodoptera f rugiperda, S f 2- 1 (Baculovi rus Express ion Vectors, a Laboratory Manual, WH Freeman a nd Company, New York (1992 )], And High 5 (manufactured by Invitrogen), which is an ovarian cell of Trichoplus ia eJ_, can be used.
組換えウイルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記バキュロウィルスの共導入方法と しては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075) 、 リボフヱクシヨン法 〔Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 84, 7413 ( 1987)〕 等をあげることができる。  Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene introduction vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 84, 7413 (1987)].
遺伝子の発現方法と しては、 直接発現以外に、 モレキュラー . クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合タンパク質発現等をお こなうことができる。  As a method for expressing a gene, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular. Cloning, 2nd edition.
酵母、 動物細胞または昆虫細胞によ り発現させた場合には、 糖あるいは糖鎖が 付加されたポリぺプチドを得ることができる。  When expressed by yeast, animal cells or insect cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明のポ リペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本発明のポリべ プチドを製造するごとができる。 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。  By culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the polypeptide of the present invention in the culture, and collecting from the culture, the polypeptide of the present invention is produced. it can. The method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地と しては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を 含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地の いずれを用いてもよレ、。  A culture medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium can efficiently culture the transformants.
炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよ く、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等が用を用いることができる。 Any carbon source may be used as long as the organism can assimilate it, such as glucose, fructose, sucrose, molasses, starch or starch hydrolyzate containing these. Carbohydrates such as pulverized products, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 並びに、 ペプト ン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ —プリカ一、 カゼイ ン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌 体、 およびその消化物等を用いることができる。  Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells, and digests thereof can be used.
無機物としては、 リ ン酸第一カリ ウム、 リ ン酸第二カリ ウム、 リ ン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシゥム、 塩化ナ ト リ ウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。  Inorganic substances include potassium (II) phosphate, potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. Can be used.
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 1 5〜 4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6〜 9 6時間である。 培養中 p Hは 3. 0〜 9. 0に保持する。 p Hの調整は、 無機または有機の酸、 アル力 リ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。  The culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The cultivation temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the cultivation time is usually 16 to 96 hours. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリ ンゃテトラサイクリ ン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。  If necessary, an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現べクタ一で形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加しても よい。 例えば、 1 a cプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物 を培養するときにはイソプロピル一 ,3— D—チォガラク トビラノシド等を、 プロモータ一を用いた発現べクターで形質転換した微生物を培養するときには ィン ド一ルァクリル酸等を培地に添加してもよい。  When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium, if necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the 1ac promoter, isopropyl-1,3-D-thiogalactobyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the promoter. Monoacrylic acid or the like may be added to the medium.
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている RPMI1640培地 (The Journal of the American Medical Associati on, 199， 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 (Science, 122, 501 (1952)] 、 DME M培地 [Virology, 8， 396 (1959)〕 、 199培地 [Proceeding of the Society fo r the Biological Medic ine, 73, 1 (1950) ] またはこれら培地に牛胎児血清等 を添加した培地等を用いることができる。 As culture media for transformants obtained using animal cells as hosts, commonly used RPMI1640 media (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle's MEM media (Science , 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society fo r the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium.
培養は、 通常 p H 6〜8、 30〜40°C、 5% C 0 2存在下等の条件下で 1〜7日間行 また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に 添加してもよレ、o Culture is usually p H 6-8, 1 to 7 days row also under such 30~40 ° C, 5% C 0 2 presence, during the culturing, if necessary kanamycin, the antibiotic penicillin such O Can be added to the medium
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている TNM - FH培地 〔Pharaingen社製〕 、 Sf- 900 II SFM培地 （ギブコ B R L社製） 、 ExCe l l400、 ExCe l l405 〔いずれも JRH B iosc iences社製〕 、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195， 788 ( 1962) ] 等をもちいることができる。  Examples of a medium for culturing the transformant obtained by using insect cells as a host include commonly used TNM-FH medium (Pharaingen), Sf-900II SFM medium (Gibco BRL), ExCell 400 ExCel 140 (both manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) and the like can be used.
培養は、 通常 p H 6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。  Cultivation is usually carried out at pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。  If necessary, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
上記形質転換体の培養液から、 上記方法によ り発現させたポリペプチドを単離 精製するためには、 通常の酵素の単離、 精製法を用いればよい。  In order to isolate and purify the polypeptide expressed by the above-mentioned method from the culture of the above-mentioned transformant, an ordinary enzyme isolation and purification method may be used.
例えば、 本発明のポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培 養終了後、 細胞を遠心分離によ り回収し水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マン ト ンガウリ ンホモゲナィザ一、 ダイ ノ ミル等によ り細胞を 破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによ り得られ た上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （D E A E ) —セファロ —ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマト グラフィ一法、 S - Sepharose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用いた陽ィォ ン交換クロマ トグラフィー法、 ブチルセファロ一ス、 フエ二ルセファロ一ス等の レジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフ ィニティ一クロマ トグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動 等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ること ができる。 For example, when the polypeptide of the present invention is expressed in a dissolved state in a cell, after completion of the culture, the cell is recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press. Then, the cells are disrupted using a mantongaulin homogenizer, a dynomill, or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary enzyme isolation and purification method is used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent. Method, getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), etc. Anion exchange chromatography using resin, S-Sepharose FF (Pharmacia), etc. Cation exchange chromatography used, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography , Chromatofocusing, isoelectric focusing A purified sample can be obtained by using techniques such as electrophoresis alone or in combination.
また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細 胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことによ り得られた沈殿画分よ り、 通常の方 法により該ポリべプチドを回収後、 該ポリべプチドの不溶体をポリべプチド変性 剤で可溶化する。 該可溶化液を、 ポリぺプチド変性剤を含まないあるいはポリぺ プチド変性剤の濃度がポリべプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 ある いは透析し、 該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単 離精製法によ り精製標品を得ることができる。  When the polypeptide is expressed as an insoluble form in cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged. After recovering the polypeptide by a method, the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide modifier. The lysate is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturing agent or diluted so that the concentration of the polypeptide denaturing agent does not denature the polypeptide. After the structure is formed, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
本発明のポリぺプチドあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された 場合には、 培養上清に該ポリべプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収 することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理 することによ り可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製 法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。  When a derivative of the polypeptide of the present invention or its modified sugar is secreted extracellularly, the derivative of the polypeptide or its sugar chain adduct can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
また、 上記方法によ り発現させたポリペプチドを、 F m o c法 （フルォレニル メチルォキシカルボニル法） 、 t B 0 c法 （ t 一ブチルォキシカルボニル法） 等 の化学合成法によっても製造することができる。 また、 桑和貿易 （米国 Advance d ChemTech社製） ， パーキンエルマ一 ジャパン （米国 Perkin- Elmer社製） ， フ アルマシア バイオテク （スウェーデン Pharmac iaBiotech社製） ， ァロカ （米国 Protein Technologylnstrument ttM) ， クラボウ (米国 Synthecei l - Vega社裂) ， 日本パーセプティブ . リ ミテッ ド （米国 PerSept ive社製） ， 島津製作所等のぺ プチド合成機を利用し合成することもできる。  Also, the polypeptide expressed by the above method may be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tB0c method (t-butyloxycarbonyl method). Can be. Also, Kuwawa Trading (Advance d ChemTech, USA), Perkin-Elmer Japan (Perkin-Elmer, USA), Pharmacia Biotech (PharmaciaBiotech, Sweden), Aroka (Protein Technologylnstrument ttM, USA), Kurabo (US Synthecei, USA) It can also be synthesized using peptide synthesizers such as l-Vega, Japan Perceptive Limited (made by PerSeptive, USA) and Shimadzu Corporation.
3 . アルツハイマー関連抗体の調製  3. Preparation of Alzheimer's antibody
上記 2 . に記載の方法により取得したポリべプチドの全長または部分断片精製 標品 （抗原） を 5 0〜 1 0 0 g Z匹程、 ゥサギ、 ャギまたは 3〜 2 0週令のラ ッ ト、 マウスもしくはハムスターの皮下、 静脈内または腹腔内に、 適当なアジュ バン ト 〔例えば、 フロイ ン ドの完全アジュバン ト （Complete Freund' s Adjuvant) または、 水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕 とともに投与する。 該抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回行う。 各投与 後、 3〜 7日目に眼底静脈叢よ り採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応する- ことを酵素免疫測定法 〔酵素免疫測定法 （ELISA法） ： 医学書院刊 1976年、 An tibodies - A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕 など で確認する。 Purification of a full-length or partial fragment of the polypeptide obtained by the method described in 2. above was performed for 50 to 100 g of Z animals, such as rabbits, goats, or 30 to 20 weeks old rats. Subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally in mice, mice or hamsters. Administer with a band (eg, Complete Freund's Adjuvant or aluminum hydroxide gel and B. pertussis vaccine). The administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and it is determined that the serum reacts with the antigen used for immunization by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin 1976 Year, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].
免疫に用いた抗原に対し、 該血清が充分な抗体価を示したゥサギ、 ャギ、 マウ ス、 ラッ トまたはハムスターより血清を取得し、 該血清よ り、 4 0〜 5 0%飽和 硫酸アンモニゥムによる塩析法、 力プリ ル酸沈殿法、 DEAE—セファロースカ ラム、 プロテイン A—カラムあるレ、はゲルろ過カラム等を用いたクロマト法等の 常法を用いて精製抗体を取得することができる。  Serum was obtained from a heron, goat, mouse, rat or hamster whose serum showed a sufficient antibody titer to the antigen used for immunization, and 40-50% saturated ammonium sulfate was obtained from the serum. Purified antibodies can be obtained by standard methods such as salting out method using PEG, sedimentation method using DEP-Sepharose column, protein A-column, and chromatographic method using gel filtration column. .
また、 上記方法によ り免疫した動物の脾細胞とマウスのミエ口一マ細胞とを融 合させてハイプリ ドーマを作製し、 このハイプリ ドーマを培養する力、、 動物に投 与して該動物を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を採取することにより本発明 のポリぺプチドに対するモノクロ一ナル抗体を製造することができる。  In addition, the spleen cells of the animal immunized by the above method and the myeoma cells of the mouse are fused to produce a hybridoma, and the ability to culture the hybridoma is applied to the animal. Is transformed into ascites tumor, and the culture solution or ascites is collected to produce a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention.
4. アポト一シス関連の、 DNA、 ポリペプチドまたは抗体の利用 4. Use of DNA, polypeptide or antibody related to apoptosis
( 1 ) 1. 記載の DNAを用い、 ノーザン · ハイプリダイゼ一ション法 （モレ キユラ— . クローニング 第 2版） 、 P C R法 〔PCR Protocols Academic Pres s (1990)〕 、 R T (reverse-transcribed) — P CR法等によ り、 本発明のアポ トーシス関連遺伝子の mRN Aを検出することができる。  (1) 1. Using the described DNA, Northern hybridization method (Molecular cloning. Cloning 2nd edition), PCR method (PCR Protocols Academic Pres s (1990)), RT (reverse-transcribed) — PCR By the method or the like, mRNA of the apoptosis-related gene of the present invention can be detected.
(2) 上述 （ 1 ) に記載した方法によ り、 正常細胞および被験細胞におけるァ ポト一シス関連遺伝子の m R N Aを検出し、 その発現量を正常細胞と被験細胞と で比較し、 量的な変動を調べることによ り、 被験細胞でのアポト一シスを検出す ることができる。 このとき用いる細胞と しては、 いずれの細胞も用いることがで きる力 ?、 好ましくは神経細胞をあげることができる。 mRNAの発現量は、 ノーザン ' ハイブリ ダィゼ一シヨ ン法の場合は、 ハイブ リダイズしたプローブの量をプローブの標識に応じて、 例えば32 P標識の場合は 放射能量を、 蛍光標識の場合は蛍光量を測定することによ り測定できる。 RT— P CR法の場合は、 例えば増幅断片をェチジゥムブロミ ドゃサイバーグリーン Γ などの DN A特異的な蛍光染色剤で染色し、 その蛍光量を測定することによ り測 定できる。 (2) Detect mRNA of apoptosis-related gene in normal cells and test cells by the method described in (1) above, and compare the expression levels between normal cells and test cells. By examining such changes, apoptosis in the test cells can be detected. Is a cell used in this case, the force as possible out is possible to use any of the cell?, Preferably it is possible to increase the nerve cell. In the case of the Northern 'hybridization method, the mRNA expression level depends on the amount of the hybridized probe according to the label of the probe.For example, the amount of radioactivity in the case of 32 P labeling, the amount of fluorescence in the case of fluorescent labeling It can be measured by measuring. In the case of the RT-PCR method, for example, the amplified fragment can be measured by staining the amplified fragment with a DNA-specific fluorescent stain such as ethidium bromide {cyber green} and measuring the amount of fluorescence.
( 3 ) 1. 記載のアンチセンス ' オリゴヌクレオチド （R N A/DN A) を用 いて 〔化学、 ， 681 (1991)、 Biotechnology, 9, 358 (1992)] 、 DNAの転写 も しくは mRNAの翻訳を抑制することによ り、 アポトーシスの抑制やアポト一 シスの関与している疾患に利用することができる。 アポトーシスの関与している 疾患として、 例えば、 神経細胞の進行性の減少に関与している疾患、 例えばアル ッハイマ一病やパーキンソン病等をあげることができる。  (3) 1. Using the described antisense 'oligonucleotide (RNA / DNA) [Chemistry,, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992)] to perform DNA transcription or mRNA translation. By suppressing it, it can be used for suppression of apoptosis and for diseases involving apoptosis. Examples of the disease in which apoptosis is involved include, for example, diseases involved in the progressive decrease of nerve cells, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
また、 b c 1 — 2のアンチセンス · オリ ゴ DNAを用いたヒ トの結腸ガンの成 長を抑止と同様の方法により、 アポトーシス関連のガンの治療に利用することが できる。  In addition, it can be used for the treatment of apoptosis-related cancers by the same method as that used to inhibit human colon cancer growth using the antisense oligo DNA of bc1-2.
(4 ) 1. 記載の DN Aを用い、 2. 記載の方法によ り本発明のポリペプチド を取得することができる。  (4) The polypeptide of the present invention can be obtained using the DNA described in 1. and the method described in 2.
(5) 2. 記載のポリペプチドを抗原として用い、 3. 記載の方法により抗体 を製造することができる。  (5) Using the polypeptide described in 2. as an antigen, an antibody can be produced by the method described in 3.
(6) 3. 記載の抗体を用いて、 アポトーシスに関連したポリペプチドを検出 することができる。  (6) A polypeptide associated with apoptosis can be detected using the antibody described in 3.
具体的にはマイクロタイタープレー トを用いる E L I S A法 '蛍光抗体法、 ゥ エスタ ンブロッ ト法等を用いた検出法をあげることができる。  Specific examples include the ELISA method using a microtiter plate, a fluorescent antibody method, and a detection method using an estanblot method.
(7) 3. 記載の抗体を用いて、 被験神経細胞に対する免疫組織染色に利用で きる。  (7) The antibody described in 3. can be used for immunohistological staining of test nerve cells.
( 8 ) 被験神経細胞または正常な神経細胞由来のアポトーシスに関連した蛋白 質を、 3. 記載の抗体を用いて検出し、 両細胞における該蛋白質の量を測定して 比較し、 その量的な変動を調べることによ り、 被験神経細胞でのアポトーシスの 検出を行うことができる。 (8) Apoptosis-related proteins derived from test nerve cells or normal nerve cells Quality is detected using the antibody described in 3., the amount of the protein in both cells is measured and compared, and a quantitative change is examined to detect apoptosis in the test nerve cells. be able to.
(9) 3. 記載の抗体をアポトーシスの抑制やアポト一シスの関与している疾 患に利用することができる。 アポトーシスの関与している疾患として、 例えば、 神経細胞の進行性の減少に関与している疾患、 例えばァルツハイマ—病やパーキ ンソン病等をあげることができる。  (9) 3. The antibody described above can be used for diseases involving suppression of apoptosis and apoptosis. Examples of the disease in which apoptosis is involved include, for example, diseases involved in the progressive decrease of nerve cells, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
また、 該抗体を用いて、 アポトーシス関連のガンの診断や治療に利用すること ができる。  In addition, the antibody can be used for diagnosis and treatment of apoptosis-related cancer.
以下、 本発明の実施例を示すが、 本発明はこれら実施例に限定されるものでは ない。 実施例 1 アポトーシスを誘導した神経細胞のディ フヱレンシャル ' ディスプレ  Hereinafter, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 Differential display of neurons that induced apoptosis
( 1 ) 細胞の培養とアポトーシスの誘導 (1) Cell culture and induction of apoptosis
ヒ ト神経芽細胞腫系セルライ ン S H— S Y 5 Yを、 1 0% 子牛胎児血清、 1 0 0単位/ m l ペニシリ ン、 1 00 / g/m l ス ト レプトマイシンを添加した ダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM : 日水製薬製） を用い、 3 7°C、 5 %C 02の条件で、 該細胞が 8 0〜 1 0 0 %コンフルェン トな状態になるまで培養し た。 増殖した細胞を、 2 X 1 04個 Z c m2の密度になるよう直径 1 0 c mの細胞 培養用シャ一レに植え継いで 24時間培養後、 1 0 オールトランス体レチノ ィン酸 〔Sigma社製〕 を添加しさらに 7日間培養することによ り、 神経細胞に分 化させた。 Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, supplemented with 10% fetal calf serum, 100 units / ml penicillin, and 100 / g / ml streptomycin. (DMEM: manufactured by Nissui Seiyaku) was used, at 3 7 ° C, 5% C 0 2 conditions, and cultured until the cells became 8 0-1 0 0% Konfuruen preparative conditions. Cells grown, 2 X 1 0 4 or Z cm diameter 1 to a density of 2 0 is subcultured in cm Shah for cell culture Ichire 24 hours of culture, 1 0 all trans body retinoic fin acid [Sigma Was added to the cells, and the cells were further cultured for 7 days to differentiate into nerve cells.
この分化した細胞に、 1 M コルヒチン （和光純薬製） を添加して培養し、 アポトーシスを誘導した。 コルヒチン含有培地は 2日おきに新しいものと交換し た。 細胞にアポトーシスが誘導されていることは、 以下に述べる DN Aの断片化 を観察することにより確認した。 To the differentiated cells, 1 M colchicine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and cultured to induce apoptosis. The medium containing colchicine was replaced with a fresh one every two days. Induction of apoptosis in cells is due to DNA fragmentation described below. Was confirmed by observation.
即ち、 コルヒチン添加後 0、 6、 1 2、 2 4、 4 8、 72時間後の細胞を遠心 分離 （ 1 , 00 0 X g、 5分間） によ り回収し、 低張性溶解液 〔5 OmM ト リス （ヒ ドロキシメチル） ァミ ノメ タン塩酸塩 （T r i s— HC し p H 8. 0 ) 、 1 OmM エチレンジアミ ン四酢酸ニナ ト リ ウム （EDTA) 、 0. 3 % ト ライ ト ン （T r i t o n) X— 1 0 0〕 を添加し、 水中で 3 0分間おいて細胞を 溶解させた。  That is, cells 0, 6, 12, 24, 48, and 72 hours after the addition of colchicine were collected by centrifugation (1,000 X g, 5 minutes), and the hypotonic lysate [5 OmM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris—HC and pH 8.0), 1 OmM sodium diethylenetetraminetetraacetate (EDTA), 0.3% triton (T riton) X—100] was added and left in water for 30 minutes to lyse the cells.
該細胞溶解液を 2 7， 000 X gで 2 0分間遠心することによ りクロマチン 画分 （沈殿） と低分子 DNA画分 （上清） に分けた。  The cell lysate was centrifuged at 27,000 × g for 20 minutes to separate into a chromatin fraction (precipitate) and a low molecular weight DNA fraction (supernatant).
該上清にプロティナ一ゼ Kを 0. 5 m g/m 1添加して 50でで 1時間反応さ せて上清中の蛋白質を分解した。  0.5 mg / ml of proteinase K was added to the supernatant and reacted at 50 for 1 hour to decompose the protein in the supernatant.
該反応液を用い、 フヱノールークロロホルム抽出を 2回行い、 得られた水層を 用いて、 エタノール沈殿することにより DN Aを精製した。  Using the reaction solution, phenol-chloroform extraction was performed twice, and the obtained aqueous layer was subjected to ethanol precipitation to purify DNA.
該 DNAを TE緩衝液 〔 1 OmM T r i s— HC 1 ( p H 8. 0) 、 1 mM EDTA] に溶解後、 1. 2 %ァガロースゲル電気泳動を行なった。  The DNA was dissolved in TE buffer [1 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mM EDTA], and subjected to 1.2% agarose gel electrophoresis.
DN Aの断片化は、 コルヒチン添加後 1 2時間以降に見られた。  Fragmentation of DNA was seen 12 hours after addition of colchicine.
(2) 細胞からの全 RN Aの取得  (2) Acquisition of total RNA from cells
コルヒチン添加後、 0、 2、 6、 1 2、 2 4、 36、 4 8、 6 0、 72時間後 の細胞をそれぞれ回収し、 トリゾル試薬 〔Gibco BRL社製〕 を用いて、 それぞれ の細胞から全 RN Aを取得した。 取得の具体的方法は試薬のプロ トコ一ルに従つ た。  After the addition of colchicine, the cells at 0, 2, 6, 12, 24, 36, 48, 60, and 72 hours later were collected, and the cells were collected from each cell using a Trizol reagent (Gibco BRL). All RNAs were obtained. The specific method of acquisition was in accordance with the reagent protocol.
該全 RN Aをリボヌ ク レアーゼ不含デォキシリボヌク レア一ゼ 〔Promega社製 〕 で処理し、 混入している DNAを分解、 除去した。  The total RNA was treated with ribonuclease-free deoxyribonuclease (Promega) to decompose and remove contaminating DNA.
該 RN Aをフヱノ一ルークロロホルムによ り抽出後、 エタノール沈殿 （水層に 1 / 1 0量の 2M N a C し 2倍量のエタノールを添加して R N Aを沈殿させ 回収する） によ り精製し、 0. 1 %ジェチルピロカーボネート （DE P C) で処 理した蒸留水に溶解させた。 該溶液は、 必要に応じて一 8 0 °Cで保存することが できる。 . After extracting the RNA with phenol-chloroform, ethanol precipitation (precipitating and collecting RNA by adding 1/10 volume of 2M NaC to the aqueous layer and adding 2 volumes of ethanol). Purify and treat with 0.1% getyl pyrocarbonate (DE PC) Dissolved in distilled water. The solution can be stored at 180 ° C if necessary. .
( 3 ) 神経細胞 R N Aを用いた蛍光デフヱレンシアル . ディ スプレイ  (3) Fluorescent differential display using neuronal RNA
経時的に採取した神経細胞よ り抽出した、 上記 （ 2 ) 記載の各々の全 RNAに ついて下記操作を行い c DN A調製液を取得した。  The following operations were performed on each of the total RNAs described in (2) above, which were extracted from the nerve cells collected over time, to obtain a cDNA preparation.
全 RNA 2. 5 gに、 5 '末端をフルォレセイ ンイ ソチオシァネー ト （以下 F I T Cと略す） で蛍光標識したアンカープライマー g T 15MA (配列番号 1 0〜 1 2の混合物） 、 g T 15MT (配列番号 1 3〜 1 5の混合物） 、 g T 15MGAll RNA 2. 5 g, 5 'end of Furuoresei N'i Sochioshiane preparative (hereinafter abbreviated as FITC) (a mixture of SEQ ID NO: 1 0-1 2) anchor primer g T 15 MA fluorescently labeled with, g T 15 MT (SEQ Mixture of numbers 13 to 15 ), gT15MG
(配列番号 1 6〜 1 8の混合物） あるいは g T 15MC (配列番号 1 9〜 2 1の混 合物） を 5 0 p m 0 1添加した後、 DE P C処理蒸留水で 1 0 1 に調製した。 該調製液を、 7 0 ° (：、 1 0分間加熱後、 氷水中につけ急冷した。 (Mixture of SEQ ID NOs: 16 to 18 ) or gT15MC (mixture of SEQ ID NOs: 19 to 21) was added at 50 pm 01, and then adjusted to 101 with distilled water treated with DEPC. did. After heating the prepared solution at 70 ° (:, 10 minutes), it was immersed in ice water and rapidly cooled.
該冷却液に等量の 2 X逆転写酵素反応用緩衝液 〔4 0 mM T r i s — H C 1 Equivalent volume of 2X reverse transcriptase buffer [40 mM Tris — H C 1
( p H 8. 4 ) 、 1 0 0 mM K C U 5 mM M g C l 2、 2 0 mMジチオスレ ィ トール （D TT、 0. 2 m g/m 1 ゥシ血清アルブミ ン （B S A) 、 1 mM d NT P ( d AT P、 d G T P、 d TT Pおよび d C T P) ] を加えた後、 逆転 写酵素スーパースクリプト Π (Superscript II Reverse Transcriptase) (ギブ コ B R L社製） 2 0 0単位を添加して混合した。 2 5 °Cで 1 0分間、 4 2 °Cで 5 0分間反応させた後、 9 0 °Cで 5分間加熱して反応を停止させた。 (P H 8. 4), 1 0 0 mM KCU 5 mM M g C l 2, 2 0 mM Jichiosure I torr (D TT, 0. 2 mg / m 1 © shea serum albumin (BSA), 1 mM d NTP (dATP, dGTP, dTTP and dCTP)], and add 200 units of reverse transcriptase Superscript II (Superscript II Reverse Transcriptase) (manufactured by Gibco BRL). After mixing at 25 ° C for 10 minutes and at 42 ° C for 50 minutes, the reaction was stopped by heating at 90 ° C for 5 minutes.
該反応停止液に T E緩衝液 8 0 μ 1 を添加し、 c DNA調製液を取得した。 該 調製液は、 必要に応じて一 2 0 °Cで保存することができる。  80 μl of TE buffer was added to the reaction stop solution to obtain a cDNA preparation solution. The preparation can be stored at 120 ° C. if necessary.
9 6穴プレート 〔Teche社製〕 の各ゥヱルに、 上記で取得した各々の c D N A 調製液を別々に 2 μ 1 (もとの R NA 5 0 n gに相当する） づっ分注後、 該ゥヱ ルに、 最終的に 2 0 1 となるように、 5 0 M d NT P、 蛍光標識アンカ一 プライマー （ c DN A合成時に用いたのと同じ種類を用いる） 5 0 p m 0 1、 任 意プライマー 1 0 p m 0 1 、 D N Aポリ メ ラ一ゼ Gene Taq (二ッポンジーン社製 ) 1単位を含む P C R用緩衝液 〔 1 0 mM T r i s — HC 1 ( p H 8. 8 ) 、 5 0 mM KC 1. 5 mM Mg C 1 2、 0. 1 %トライ トン X— 1 0 0〕 を 添加した。 9 After dispensing 2 μl (corresponding to 50 ng of the original RNA) of each of the cDNA preparations obtained above, separately into each well of a 6-well plate (manufactured by Teche),ヱ M NT M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M PCR buffer containing 10 units of primer 10 pm 01 and 1 unit of DNA polymerase Gene Taq (manufactured by Nippon Gene) [10 mM Tris — HC 1 (pH 8.8), 50 mM KC 1.5 mM MgC12, 0.1% Triton X—100] was added.
該 9 6穴プレー トを P C R用装置 P H C— 3 (テクネ社製） にセッ ト し、 94 °Cで 3分間加熱後、 9 5 °Cで 1 5秒間、 4 0 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 1分間からな る反応工程を 1サイクルとして 2 5サイクル行い、 最後に 7 2 °Cで 5分間反応さ せる P C Rを行った。 蛍光標識アンカープライマーとしては前述した 4種類のう ちから 1種類、 任意プライマーとしては、 オペロン ' テクノロジ一ズ （Operon T echnologies)社製の O PA— 1〜 2 0、 O P B— 1〜 2 0、 OP C— 1〜 2 0お よび O P D— 1〜 2 0の 8 0種類のうちから 1種類を選んで反応に用い、 それぞ れを組み合わせることにより計 3 2 0種類の反応を、 1種類の c DN Aに対して 行った。  Set the 96-well plate in a PCR device PHC-3 (manufactured by Techne), heat at 94 ° C for 3 minutes, and then heat at 95 ° C for 15 seconds, 40 ° C for 2 minutes, Twenty-five cycles were performed with a reaction step consisting of 1 minute at 2 ° C as one cycle, and finally PCR was performed at 72 ° C for 5 minutes. One of the above four types of fluorescent-labeled anchor primers is used. One of the optional primers is OPA-1-20, OPB-1-20, OPB manufactured by Operon's Technologies. One of the 80 types of C—1 to 20 and OPD—1 to 20 is selected for use in the reaction, and by combining each of them, a total of 320 types of reactions are combined into one type of c. Performed for DNA.
各々の P C R反応液に等量の色素溶液 （ 9 8 %ホルムアミ ド、 0. 0 1 %メチ ルバイオレッ ト、 1 0mM EDTA) を添加し、 9 0 °Cで 2分間加熱処理した。 該処理液 2 μ 1 を 7 Μ 尿素を含む 6 % ポリアク リルアミ ドゲル （ 2 0 0 X 1 7 0 X 0. 3 mm) にのせ、 T B E緩衝液 （ 8 9 mM T r i s、 8 9 mMホゥ 酸、 2 mM E DTA) 中で D N Aシークェンサ一 S Q— 3 0 0 0 (日立製） を 用いて 8 0 0 Vで 0. 5〜 3時間電気泳動した。 An equal amount of a dye solution (98% formamide, 0.01% methyl violet, 10 mM EDTA) was added to each PCR reaction solution, and the mixture was heated at 90 ° C. for 2 minutes. 2 μl of the treatment solution was placed on a 6% polyacrylamide gel (200 × 170 × 0.3 mm) containing 7 μ urea, and TBE buffer solution (89 mM Tris, 89 mM phosphate, Electrophoresis was performed at 800 V for 0.5 to 3 hours using a DNA sequencer SQ-3000 (manufactured by Hitachi) in 2 mM EDTA.
泳動後の該ゲルに得られたバン ドの蛍光を測定し、 画像と して出力した。 得ら れたバン ドの測定結果よ り、 コルヒチン処理によ り経時的に蛍光量の変動したバ ン ド （即ち、 コルヒチン処理によ り経時的に発現量の変動した mRN Aに対応す る） を拾い出した。  The band fluorescence obtained on the gel after the electrophoresis was measured and output as an image. Based on the band measurement results obtained, the band whose fluorescence intensity fluctuated over time due to colchicine treatment (that is, the band corresponding to mRNA whose expression level fluctuated over time due to colchicine treatment) ) Was picked up.
結果を第 1表に示した。 第 1 表 The results are shown in Table 1. Table 1
Figure imgf000029_0001
検出された総バン ド数は約 2 00 00であり、 全体の約 1. 3 %にあたる 2 6 3個に何らかの変動がみられた。
Figure imgf000029_0001
The total number of detected bands was about 200000, and some variation was observed in about 26.3, which is about 1.3% of the total.
(4) 発現変動遺伝子のクローニング  (4) Cloning of expression-variable genes
実施例 1- (3) において、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に用いたサンプ ル 5 6 1 を同様に 7 Μ尿素を含むポリァクリルァミ ドゲル （ 2 00 X 3 3 0 X 0. 3 5 mm) にのせ、 T B E緩衝液中、 1 , 500 Vで 1 2時間電気泳動 後、 ビス トラ · フルォロイメージャ一 S I [Vistra Fluorlmager SI； Molecular Dynamics社製〕 で、 蛍光を測定することによ り増幅したバン ドを検出し、 画像 を実物大で出力した。  In Example 1- (3), the sample 561 used for polyacrylamide gel electrophoresis was similarly placed on a polyacrylamide gel (200 × 330 × 0.35 mm) containing 7 μ urea, After electrophoresis at 1,500 V for 12 hours in TBE buffer, the band was amplified by measuring the fluorescence with Vistra Fluorlmager SI (manufactured by Molecular Dynamics). Was detected, and the image was output in full size.
該出力画像をゲルとあわせ、 変動しているバンドに相当するところのゲルを切 り出した。  The output image was combined with the gel, and a gel corresponding to the fluctuating band was cut out.
該ゲルより常法によ り DNAを抽出し、 該 DNAを錶型として、 実施例 1 - （ 3) と同様の方法で P C Rを行い DN Aを増幅した。 ただし、 該反応のスケール は 50 1で行い、 アンカ一プライマーと任意プライマ一は各バン ドの増幅に用 いた組み合わせを用いた。  DNA was extracted from the gel by a conventional method, and the DNA was subjected to PCR in the same manner as in Example 1- (3) to amplify DNA. However, the scale of the reaction was 501, and the combination of anchor primer and optional primer used for amplification of each band was used.
該增幅 DNAを P C R断片クロ一ニング用ベクター p T 7 B 1 u e T—べク ター （ノバジェン社製、 E c 0 R Vサイ トに P C R断片を直接クロ一ユングする ように、 E c 0 RVで切断し両鎖の 3 '端に Tを付加してあるように加工してあ るベクター） に DN A · ライゲーシヨン . キッ ト （宝酒造社製） を用いて組み込 んだ。 - 得られた組換えプラスミ ドを用い、 常法によ り大腸菌 DH 5 a (ギブコ B R L 社製） を形質転換し、 該形質転換体を 50 gZm 1のアンピシリンを含む L B 寒天培地に塗布後、 3 7°Cで 1晚培養した。 The amplified DNA was used for PCR fragment cloning vector pT7B1ueT—vector. The PCR fragment was cut with Ec0RV and processed so that T was added to the 3 'end of both strands so that the PCR fragment could be directly cloned into the Ec0RV site (Novagen). Using a DNA / ligation kit (Takara Shuzo). -Using the obtained recombinant plasmid, transform Escherichia coli DH5a (manufactured by Gibco BRL) by an ordinary method, apply the transformant to LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, The cells were cultured at 37 ° C for 1 晚.
生育してきた形質転換体のコロニーよ り、 アルカリ S D S法 （モレキュラー ' クローニング 第 2版） によ りプラスミ ド DN Aを単離した。  Plasmid DNA was isolated from the grown transformant colonies by the alkaline SDS method (Molecular 'Cloning, 2nd edition).
該プラスミ ド DN Aに組み込まれている上記増幅 DN Aの塩基配列を、 S Q— 5 500 DNAシークェンサ一 （日立製作所社製） あるいは 3 73 A . DNA シークェンサ一 （パーキンエルマ一社製） を用いて決定した。  The nucleotide sequence of the amplified DNA incorporated into the plasmid DNA was determined using SQ-5500 DNA Sequencer (manufactured by Hitachi, Ltd.) or 373 A. DNA Sequencer (manufactured by PerkinElmer). Were determined.
塩基配列決定のための具体的試薬および方法は、 S Q— 5500 DNAシ— クェンサ一においては、 サーモシーケナ一ゼ . プレミ ックス ド . サイクル · シー クェンシング ' キッ ト 〔Thermo Sequenase pre- mixed cycle sequencing kit ;A mersham社製〕 を用い、 3 73 A · D N Aシークェンサ一においては、 プリズム · ダイ · プライマ一 ' サイクル ' シークェンンシング ' キッ ト （PRISM Dye primer cycle sequencing kit； ノ、。一キンエルマ一社製） を用レ、、 各々キッ トに添付さ れた説明書に従って行った。 実施例 2 アポト—シス誘導によ り発現の変動した mRNAの RT— P C Rによ る検出  The specific reagents and methods for nucleotide sequence determination are as follows: SQ-5500 DNA sequencer, Thermosequenase.Premixed.Cycle-sequencing kit; Thermo Sequenase pre-mixed cycle sequencing kit; mersham, Inc.) and used a PRISM Dye primer cycle sequencing kit (PRISM Dye primer sequencing kit; No. 1 Kinelma) in the DNA sequencer. The test was performed according to the instructions attached to the kit. Example 2 Detection of mRNA whose expression fluctuates due to apoptosis induction by RT-PCR
実施例 1のディ ファ レンシャル ' ディスプレイにおいて、 アポト一シス誘導に よ り発現量の変動すると思われた 1 1種類の mRNAについて、 該変動を、 実施 例 1で取得された DN Aの一部を含むオリゴヌク レオチドおよびアンチセンス · オリゴヌクレオチドを遺伝子特異的 5 '側センスプライマ一および 3 '側アンチセ ンスプライマーとして用い、 丁ー？〇 1?にょり検出した。 In the Differential 'display of Example 1, for one type of mRNA whose expression level was thought to fluctuate due to apoptosis induction, the fluctuation was compared with a part of the DNA obtained in Example 1. Oligonucleotides and antisense oligonucleotides containing gene-specific 5 'sense primers and 3' Used as a primer, 〇 1?
実施例 1で得られた全 RNAを一本鎖 c DNA合成キッ トス一パースクリプト · プレアンプリ フィケ—ショ ン - システム (Superscript preampl if ication syste !11 ; ギブコ81^ 社製） を用いて、 キッ トに付属のオリゴ d Tプライマーによ 一本鎖 c DN Αを合成した。 具体的試薬および方法は、 キッ トに付属の説明書に 従つた。  The total RNA obtained in Example 1 was converted into a kit using a single-stranded cDNA synthesis kit, a superscript preamplification system-11 (manufactured by Gibco 81 ^). Was synthesized using the oligo dT primer attached to the kit. Specific reagents and methods followed the instructions attached to the kit.
該一本鎖 c DN A 2 1 に、 最終的に 2 0 1 となるように、 50 M d N T P、 遺伝子特異的 5 '側センスプライマー、 3 '側アンチセンスプライマ一各 1 0 p m 0 し DNAポリメラーゼ G e n e T a qを 1単位含む P C R用緩衝液を 添加し、 94 °Cで 3分間加熱後、 9 5 °Cで 3 0秒間、 5 5 °Cで 1分間、 72 °Cで 1分間からなる反応工程を 1サイクルと して 1 7〜 2 5サイクル行い、 最後に 7 2 で 5分間反応させる P C Rを行った。  The single-stranded cDNA 21A is then ligated with 50 Md NTP, a gene-specific 5 'sense primer, and a 3' antisense primer to 10 Add PCR buffer containing 1 unit of polymerase Gene Taq, heat at 94 ° C for 3 minutes, and then start at 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. This reaction step was performed 17 to 25 cycles as one cycle, and finally PCR was performed in which the reaction was performed at 72 for 5 minutes.
用いた遺伝子特異的 5 '側センスプライマ一および 3 '側アンチセンスプライマ 一の塩基配列を、 第 2表の RT— P CRと記載したカラムに、 配列表の配列番号 を用いて記載した。 該プライマーは、 実施例 1で取得したアポト一シスに関与す るものとして取得された DN Aをもとに常法によ り化学合成して取得した。  The nucleotide sequences of the gene-specific 5'-side sense primer and 3'-side antisense primer used were described in the column labeled RT-PCR in Table 2 using the SEQ ID NO in the sequence listing. The primer was chemically synthesized by a conventional method based on the DNA obtained in Example 1 and involved in apoptosis.
上記 P C Rにより増幅された DN Aを 2 %ァガロースゲル電気泳動後、 0. 0 1 %サイバーグリーン I 〔SYBR Green I； Molecular Probes社製〕 で染色し、 増幅した断片の量をフルォロイメージャーあるいは UVトランスイルミネーター で検出し、 mR N Aの相対発現量と した。  The DNA amplified by the above PCR is subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and then stained with 0.01% Cyber Green I (SYBR Green I; manufactured by Molecular Probes), and the amount of the amplified fragment is measured using a fluoroimager or UV. Detection was performed using a transilluminator, and the relative expression level of mRNA was determined.
結果を第 2表に示した。 ディファ レンシャル · ディスプレイで得られた結果と よく一致しており、 アポトーシスに関与する DN Aの一部を含むオリゴヌクレオ チドおよびアンチセンス · オリゴヌクレオチドを用いて、 1^丁ー？〇1^法にょ り、 アポトーシスの誘導によ り変動する mRN Aを検出可能であることがわかった。 第 2 表 The results are shown in Table 2. It is in good agreement with the results obtained with differential display, using oligonucleotides and antisense oligonucleotides containing a portion of the DNA involved in apoptosis. According to the m1 ^ method, it was found that mRNA that fluctuates due to induction of apoptosis can be detected. Table 2
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：実施例 1で行ったテ"ィファレンシャル -テ 'イスフ°レイにおいて用いた、 ア ンカープライマ一と任意プ ライマ一を' ' D Dプライマー''のカラムに、該実施例で得られた D N Aの塩基数を" b p " のカ ラムに、 該 D N Aの塩基配列を配列番号で"配列番号"のカ ラムに記載した。  : An anchor primer and an arbitrary primer used in the “T-Differential-T” assay performed in Example 1 were placed on a “DD primer” column, and the DNA obtained in the example was used. The number of bases is described in the column of "bp", and the nucleotide sequence of the DNA is shown in the column of "SEQ ID NO."
：相同性は、 塩基配列デー タベース G e n B a n k中で一致した塩基配列の遺伝子名ま たは E S Tのみの場合はアクセス番号を示した。 第 2表に記載した、 アポトーシスに関与する D N Aの塩基配列を塩基配列デー 夕べ一ス G e n B a n kを利用し、 相同性検索を行い、 既知の遺伝子の塩基配列 と一致するか調べた。 結果を第 2表に示した。 : For homology, the gene name of the nucleotide sequence matched in the GenBank database or the access number in the case of EST only is shown. Based on the nucleotide sequence of the DNA involved in apoptosis listed in Table 2, a homology search was performed using the GenBank database, and the nucleotide sequence of a known gene was determined. I checked whether it matches. The results are shown in Table 2.
C 3 8 - 1 - 1の増幅断片は、 配列番号 7の塩基配列の 1 4 4 6番目から 1 8 4 7番目にあたる塩基配列を有していた。 この塩基配列は、 塩基配列データーべ —ス G e n B a n kの中のアクセス番号 A A 0 1 9 4 3 4をはじめとする同一遺 伝子の c DN Aと考えられる一群の E S T (expressed sequnence tag； c DN Aライブラリ一中の多数の c DNAクローンの 3 '端および 5 '端の塩基配列情報 を重複を含めて集めたもの） と一致した。 G e n B a n k中の c DN A全長の塩 基配列データ中には一致するものはなかった。  The amplified fragment of C38-1-1 had a base sequence corresponding to positions 14464 to 1847 of the base sequence of SEQ ID NO: 7. This base sequence is composed of a group of ESTs (expressed sequence tag; EST) which are considered to be the same gene as the cDNA including access number AA 0 1 9 4 3 4 in the base sequence database Gen Bank. The 3'-end and 5'-end nucleotide sequence information of many cDNA clones in the cDNA library was collected including duplications). No match was found in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
G 2 7 T Iの増幅断片は、 配列番号 8の塩基配列の 2 3 5 7番目から 2 6 0 6 番目にあたる塩基配列を有していた。 この塩基配列は、 塩基配列データ一ベース G e n B a n kの中のアクセス番号 N 4 8 5 9 3および N 4 0 6 8 5の （両者は 同一遺伝子の c DN Aと考えられる） E S Tと一致した。 G e n B a n k中の c DN A全長の塩基配列データ中には一致するものはなかった。  The amplified G27TI fragment had a nucleotide sequence corresponding to the nucleotide positions from 235 to 266 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. This nucleotide sequence was consistent with the ESTs of access numbers N485593 and N40685 in the base sequence database GenBank (both are considered to be the same gene's cDNA). . There was no match in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
C 4 6 - 5の増幅断片の塩基配列を配列番号 3に、 C 5 5— 3— 1の増幅断片 の塩基配列を配列番号 4に示した。 両者とも塩基配列データベース G e n B a n kの中に一致する配列は見い出せなかった。  The nucleotide sequence of the amplified fragment of C46-5 is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the amplified fragment of C55-3-1 is shown in SEQ ID NO: 4. In both cases, no matching sequence was found in the base sequence database G EnBan k.
C 2 5— 1 一 2の増幅断片の塩基配列を配列番号 5に示した。 この塩基配列は、 塩基配列データーベース G e n B a n kの中のアクセス番号 W 7 6 3 4 3をはじ めとする同一遺伝子の c DNAと考えられる一群の E S Tと一致した。 G e n B a n k中の c DN A全長の塩基配列データ中には一致するものはなかった。  SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of the C25-1-2 amplified fragment. This nucleotide sequence was consistent with a group of ESTs considered to be cDNAs of the same gene including access number W76643 in the nucleotide sequence database GEnBank. There was no match in the nucleotide sequence data of the full-length cDNA in GenBank.
G 6の増幅断片の塩基配列を配列番号 6に示した。 この塩基配列は、 塩基配列 データベース G e n B a n kの中のアクセス番号 N 5 1 2 3 0をはじめとする同 一遺伝子の c DN Aと考えられる一群の E S Tと一致した。 また、 G 6あるいは E S Tの 3 '端と考えられる部分 （ 1 9 3 〜 4 2 2番目） が G e n B a n k中の ヒ ト M a b _ 2 1遺伝子 [Human Molecular Genetics, 5, 607 (1996)〕 の c D N Aの 5 '非翻訳領域 （ 7〜 2 3 5番目） と一致していた。 ただしこの一致する 部分は c DNAの3 '端側と 5 '端側であり、 両 c DN Aは同一の遺伝子由来でな い可能性もある。 The nucleotide sequence of the amplified fragment of G6 is shown in SEQ ID NO: 6. This nucleotide sequence was consistent with a group of ESTs considered to be cDNAs of the same gene, including accession number N51230 in the nucleotide sequence database GenBank. In addition, the portion considered to be the 3 'end of G6 or EST (1933 to 42nd 2nd) is composed of the human Mab_21 gene in GenBank [Human Molecular Genetics, 5, 607 (1996). 5 'untranslated region of cDNA (7th to 23rd position). But this matches The portions are at the 3 'and 5' ends of the cDNA, and both cDNAs may not be derived from the same gene.
G 4 8の増幅断片はヒ ト p 1 1遺伝子の c DNA [Gene, 102, 255 (1991)〕 の 3 '端と一致していた。 p i 1はカルシウム結合性蛋白であり、 ァネキシン I- I (a n n e x i n I I ) p 3 6と結合しヘテロテトラマ一を形成して存在し ている。 ァネキシン I I複合体は、 カルシウム依存的に蛋白リン酸化酵素 P KC により リン酸化を受け、 膜と結合している蛋白であり、 副腎のクロマフィ ン細胞 等のェクソサイ ト一シス （exostosis) による分泌に関与していると考えられて いる (Journal of Cell Biology, 114, 1135 (1191)〕 神経細胞との関係では、 セルライン P C 1 2に NG Fを投与し、 神経細胞に分化させた時に p 3 6ととも に p 1 1 も蛋白量が増加することが報告されている CBiocem. Biophys. Res. Co mmun. , 177, 1188 (1191)〕 。 また、 p 1 1を P C 1 2に強制的に発現させた場 合、 NG Fがなくても神経細胞への分化を思わせる形態変化が観察されており 〔 Journal of Neuroscience Research, 27, 264 (1990)] 、 細胞の分化自身に関与 している可能性もある。 ただし、 細胞のアポト一シスとの関係は報告されていな レ、o  The amplified fragment of G48 coincided with the 3 'end of the cDNA of the human p11 gene [Gene, 102, 255 (1991)]. p i1 is a calcium-binding protein and binds to annexin II (annexinII) p36 to form a heterotetramer. Annexin II complex is a protein that is phosphorylated by the protein kinase PKC in a calcium-dependent manner and is bound to the membrane, and is involved in secretion by exostosis of chromaffin cells in the adrenal gland. (Journal of Cell Biology, 114, 1135 (1191)) In relation to neurons, NGF was administered to cell line PC12 and differentiated into neurons. It has been reported that p11 also increases the amount of protein. CBiocem. Biophys. Res. Commun., 177, 1188 (1191)] In addition, p11 is forcibly expressed in PC12. In this case, morphological changes reminiscent of differentiation into nerve cells were observed even without NGF [Journal of Neuroscience Research, 27, 264 (1990)], which may be involved in cell differentiation itself. However, no relationship with cell apoptosis has been reported.
C 4 3の増幅断片はヒ ト MC P— 1遺伝子 〔FEBS Lett. , 244, 487 (1989)〕 の c DNAの 3 '端と一致していた。 MC P— 1は、 ケモカイ ンの一つであり、 リセプターを介して単球対し走化性をおこさせる活性をもち、 炎症時のマクロフ ァ一ジの集積に関与していると考えられている。 また、 実験的にラッ ト脳に虚血 を起こさせた時やマウスの脳に損傷を与えたときにその発現が上昇するという報 告がなされている 〔： iournal of Neuroimmunology, 56, 127 (1995)、 Stroke, 26, The amplified fragment of C43 coincided with the 3 'end of the cDNA of the human MCP-1 gene [FEBS Lett., 244, 487 (1989)]. MCP-1 is one of the chemokines, has an activity to induce chemotaxis to monocytes via receptors, and is thought to be involved in macrophage accumulation during inflammation . In addition, it has been reported that the expression increases when rat brain ischemia is caused experimentally or when mouse brain is damaged [Iournal of Neuroimmunology, 56, 127 (1995) ), Stroke, 26,
661 (1995)〕 。 ただし、 アポトーシスとの関係は報告されていない。 661 (1995)]. However, no relationship with apoptosis has been reported.
C 7 8 - 3 - 3の増幅断片はヒ トアルドラ一ゼ C遺伝子〔Nucieic Acids Res.， The amplified fragment of C78-3-3 was obtained from human aldolase C gene [Nucieic Acids Res.,
16, 4733 (1988)〕 の c D N Aの 3 '端と一致していた。 アルドラ一ゼは、 解糖 系においてクルク ト一ス 1， 6—リ ン酸を分解する酵素であり、 アルドラ一ゼ C は脳に特異的なタィプである。 アポト一シスとの関連は報告されていない。 16, 4733 (1988)]. Aldolase is an enzyme that degrades curtose 1,6-phosphate in the glycolysis system. Is a brain-specific type. No association with apoptosis has been reported.
A 58 TDと C 68 - 2 ~ 3 4 6はヒ ト αチューブリン遺伝子の c DN Αの 3 '端と一致していた。 ひチューブリンは チューブリンとともにチューブリンを 構成し重合して微小管を形成する蛋白である。 コルヒチンのようなチューブリン と結合して微小管形成を妨げるような薬剤が細胞にアポトーシスを誘導すること は報告されている 〔Cancer Letters, 23, 307 (1984) 、 Experimental Cell Rese arch, 198, 367 (1992)〕 せ、 アポトーシスに伴う αチューブリ ンの発現の変動 は報告されていない。 ただし、 細胞をコルヒチン処理することによ り、 ひチュー ブリ ンの mRN Αの発現量が減少するという報告はなされている 〔Cell, 17, 31 9 (1979) 、 EMBO Journal, 1, 835 (1982) 〕 。 実施例 3 C 3 8 _ 1— 1の c DN Aの取得と解析 A58TD and C68-2 to 346 were in agreement with the 3 'end of cDNΑ of the human α-tubulin gene. Hepatic tubulin is a protein that forms tubulin together with tubulin and polymerizes to form microtubules. It has been reported that drugs such as colchicine that bind to tubulin and prevent microtubule formation induce apoptosis in cells [Cancer Letters, 23, 307 (1984), Experimental Cell Rese arch, 198, 367. (1992)] However, changes in the expression of α- tubulin associated with apoptosis have not been reported. However, it has been reported that treatment of cells with colchicine decreases the expression level of mRNΑ in tubulin (Cell, 17, 319 (1979), EMBO Journal, 1, 835 (1982). )] Example 3 Acquisition and analysis of cDNA of C38_1-1—1
C 38— 1 _ 1の塩基配列は塩基配列デ一夕ベース G e n B a n k中のある E S T (アクセス番号 AA 0 1 94 34 ) と塩基配列が一致したが、 この E S Tは c DNAクローン （ヒ ト網膜 c DNAクローン 3 6 2 93 2) の 3 '側の塩基配 列であり、 同じクローンの 5 ' 側にあたる E S T (アクセス番号 A A 0 1 88 9 3) の塩基配列をデータベース上から得ることができた。 そこでこの AA 0 1 8 8 9 3の塩基配列に基づく配列番号 44に示す 5 ' 特異的センスプライマーと、 C 3 8— 1— 1の塩基配列に基づく配列番号 4 5に示す 3 '特異的アンチセンス ブライマ一を用いて実施例 2と同様にして S H— SY 5 Yの c DN Aに対して P C Rを行った。  The nucleotide sequence of C38-1_1 was identical to a certain EST (Access No. AA019434) in GenBank, which was a cDNA clone (human). This is the base sequence at the 3 'side of the retinal cDNA clone 3 6 2 93 2), and the base sequence of the EST (accession number AA 018893) at the 5' side of the same clone can be obtained from the database. Was. Therefore, the 5 'specific sense primer shown in SEQ ID NO: 44 based on the base sequence of AA 018893 and the 3' specific antisense primer shown in SEQ ID NO: 45 based on the base sequence of C38-1-1-1 PCR was performed on SH-SY5Y cDNA using the sense primer in the same manner as in Example 2.
該 P C Rによ り増幅された約 1. 6 k bの c DN A断片を実施例 1 と同様にし てべク夕一 p T 7 B l u e T—べクタ一 （ノバジェン社製） に組み込み、 大腸 菌 DH 5 «を形質転換し、 c DNAクローンとして形質転換株を得た。  About 1.6 kb of the cDNA fragment amplified by the PCR was incorporated into Bec-Yuichi pT7Blue T-Becta-1 (Novagen) in the same manner as in Example 1 to obtain E. coli. DH5 was transformed to obtain a transformant as a cDNA clone.
該形質転換株よ り実施例 1 と同様にしてプラスミ ド DN Aを調製し、 その c D N Aの塩基配列を決定した。 得られた塩基配列を配列番号 7の 1番目から 1 57 2番目にあたる塩基を有していた。 この塩基配列と C 3 8 - 1 - 1の塩基配列よ り， 配列番号 7に示した C 3 8— 1— 1の c DN Aの塩基配列が得られた。 Plasmid DNA was prepared from the transformant in the same manner as in Example 1, and the nucleotide sequence of the cDNA was determined. The obtained nucleotide sequence was 157 It had a second base. From this nucleotide sequence and the nucleotide sequence of C38-1-1-1, the nucleotide sequence of cDNA of C38-1-1-1 shown in SEQ ID NO: 7 was obtained.
この塩基配列中には、 2 3 8アミノ酸からなるオープンリーディ ングフレーム (ORF) が存在した。 このアミノ酸配列をアミノ酸配列データベース G e n p e p t と相同性検索を行ったところ、 最も相同性の高いものはシロイヌナズナの 丁 GF— /?リセプタ一 II結合蛋白 T R I P - 1ホモログ 〔Nature， 377, 548 (1 995)] であり、 ギヤップを許すと、 2 3 8アミノ酸中 74アミ ノ酸の相同性 （ 3 1. 1 %) の相同性があることが見い出された。 実施例 4 G 2 7 T Iの c DNAクローンの取得と解析  In this nucleotide sequence, there was an open reading frame (ORF) consisting of 238 amino acids. When this amino acid sequence was subjected to a homology search with the amino acid sequence database Genpept, the most homologous one was found to be the homologue of Arabidopsis thaliana GF- /? Receptor-1 II binding protein TRIP-1 homolog [Nature, 377, 548 (1959 )], And when allowing gaps, it was found that there was a homology of 74 amino acids (31.1%) in 238 amino acids. Example 4 Acquisition and Analysis of G27TTI cDNA Clone
G 2 7 T Iのディ ファ レンシャル ' ディスプレイ增幅断片と一致したデータベ —ス中の E S Tは、 3 '側の塩基配列しか登録されていなかったため、 c DNA についてはそれ以上の情報が得られなかった。 そこで、 02 7丁 1のょり長ぃじ DNAをクローン化し塩基配列の情報を得るため、 ヒ ト胎児脳マラソンレディ一 c DNA (Marathon-Ready cDNA； クローンテック社製） およびヒ ト成人脳マラ ソンレディ一 c DNA (クローンテック社製） を用いて付属する説明書に従って 5 '— RAC Eおよび 3 '— RAC Eを行い、 増幅した断片をプラスミ ドベクタ一 p T 7 B 1 u e T一べクタ一 （ノバジェン社製） にクローニングし、 大腸菌 D Η 5 を形質転換し、 形質転換株を得た。  Since only the 3 'nucleotide sequence of the EST in the database matching the G27TI differential' display 'wide fragment was registered, no further information could be obtained for cDNA. Therefore, in order to obtain nucleotide sequence information by cloning the length of the DNA of 2077-1, human fetal brain marathon-ready cDNA (Marathon-Ready cDNA; Clontech) and human adult brain maladies Perform 5'-RACE and 3'-RACE using Sonredi cDNA (manufactured by Clontech) according to the attached instructions and transfer the amplified fragment to plasmid vector pT7B1ueT-vector. (Manufactured by Novagen), and E. coli D 大腸菌 5 was transformed to obtain a transformed strain.
5 '— R AC Εには配列番号 4 6および 4 7に示した G 2 7 T I特異的アンチ センスプライマ一を、 3 '— R A C Eには配列番号 4 8および 4 9に示した G 2 7 T I特異的センスプライマ一を用いた。  5′—RAC を contains the G 27 TI specific antisense primer shown in SEQ ID NOs: 46 and 47, and 3′—RACE shows G 27 TI shown in SEQ ID NOs: 48 and 49 A specific sense primer was used.
それぞれクローンから公知の方法 （モレキュラー ' クローニング 第 2版） に 従ってプラスミ ド DN Aを単離し、 その塩基配列を、 7—デァザ一 d GT P使用 ラブステーション · サーモシーケナ一ゼ '標識プライマー ·サイクルシークェン ンング · ャッ ト Labstaion l'hermo Sequenase label led primer cycle sequenc ing kit with 7-deaza-dGTP； アマシャム （Amersham) 社製〕 を用いたジデォキ シ ·チェーン · 夕一ミネーション法 〔Proに Natl. Acad. Sci.，U.S.A.， 74, 546 3 (1977)] によ り決定した。 具体的方法はキッ トに付属の説明書に従った。 5' 一 RAC Eにより得られたクローンの 5'端付近の塩基配列に基づく配列番号 5 - 0に示す G 2 7 T I特異的アンチセンスプライマーを用い、 再度同様にして 5 ' 一 RAC Eを行い、 それぞれのクローンの塩基配列から、 配列番号 53に示した G 2 7 T Iの c DN Aの塩基配列を得た。 ただし、 この塩基配列中には 6 8アミ ノ酸以下の非常に短い 0 R Fしかなく、 全長 c DN Aの 3 '側の一部にあたる塩 基配列と考えられた。 また、 この塩基配列全体に対して塩基配列データベース G e n B a n kと相同性を比較した力 、 相同性を示すものはデータベース中にはな かった。 Plasmid DNA was isolated from each clone according to a known method (Molecular 'Cloning 2nd edition), and its nucleotide sequence was analyzed using 7-daza-1d GTP. Lab station, thermosequenase, labeled primer, and cycle sequence Labstaion l'hermo Sequenase label led primer cycle sequenc ing kit with 7-deaza-dGTP; manufactured by Amersham Co., Ltd.] using the dideoxy-chain and yuichi-mination method [Prol. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]. Decided more. The specific method followed the instructions attached to the kit. Using the G27TI-specific antisense primer shown in SEQ ID NO: 5-0 based on the base sequence near the 5 'end of the clone obtained by 5'-RACE, 5'-RACE was performed again in the same manner. The cDNA sequence of G27TI cDNA shown in SEQ ID NO: 53 was obtained from the nucleotide sequence of each clone. However, this nucleotide sequence contained only a very short 0RF of 68 amino acids or less, and was considered to be a nucleotide sequence corresponding to a part on the 3 'side of full-length cDNA. In addition, the power of comparing the homology with the base sequence database GenBank for this entire base sequence, and none of those showing homology were found in the database.
さらに長い c DN Aクローンを得るため、 ヒ ト脳 5， 一ス トレッチ ' プラス c DNAライブラリ一 （クロ一ンテック社；ベクタ一 x g t 1 1 ) に対してブラ一 クハイプリダイゼ一ションによるスクリーニングを行った。 プローブとしては 3 ' — R A C Eで得られたクローンの塩基配列をもとにした、 配列番号 5 1 と 52 に示した G 2 7 T I特異的ブライマ一を用いてクローンの DN Aに対して P C R を行つて増幅した断片を RadPrime DNA labeling system (ライフ · テクノロジー ズ社） を用いて32 P標識したものを用いた。 ハイプリダイゼーションの具体的方 法はクローンテツク社の指示に従った。 得られたクローンの c DN Aの塩基配列 を決定したところ、 配列番号 8に示す塩基配列が得られた力？、 やはりこの塩基配 列中には 80アミノ酸以下の非常に短い〇 R Fしかなく、 全長 c DN Aの 3 '側 の一部にあたる塩基配列と考えられた。 また、 この塩基配列全体に対して塩基配 列データベース G e n B a n kと相同性を比較した力 ?、 相同性を示すものはデー タベース中にはなかった。 産業上の利用可能性 In order to obtain a longer cDNA clone, screening was performed by using the human brain 5, 1 Stretch 'plus cDNA library (Clonetech; Vector xgt11) by black hybridization. As a probe, PCR was performed on the DNA of the clone using the G27TI-specific primer shown in SEQ ID NOS: 51 and 52 based on the nucleotide sequence of the clone obtained by 3'-RACE. The fragment amplified and then 32 P-labeled using a RadPrime DNA labeling system (Life Technologies) was used. The specific method of hybridization was in accordance with the instructions of Clonetech. When the nucleotide sequence of cDNA obtained was determined, the ability to obtain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8? Again, this base sequence had only a very short 〇RF of 80 amino acids or less, and was considered to be a base sequence corresponding to a part on the 3 ′ side of full-length cDNA. Moreover, the force of comparing the nucleotide sequence database G en B ank and homology with the entire base sequence?, Shows homology was not in the database. Industrial applicability
本発明によ り、 アポトーシスに関与する新規 DNA、 該 DNAの取得方法、 該 DNAとべクタ一からなる組み換えベクター、 該組み換えべクターを宿主に導入 して得られる形質転換体、 該形質転換体を用いた上記 DN Aのコ—ドする新規ポ リベプチドの製造法並びに該新規ポリべプチド、 該ポリべプチドを認識する抗体、 上記 DNA、 ポリペプチド、 抗体を用いたアポトーシスの検出用試薬並びに検出 法、 および、 上記 DNA、 ポリペプチド、 抗体を用いたアポト一シスの抑制薬並 びにアポトーシスシスの関与する疾患の診断、 予防、 治療法を提供することがで きる。 According to the present invention, a novel DNA involved in apoptosis, a method for obtaining the DNA, a recombinant vector comprising the DNA and a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant vector into a host, and a transformant A method for producing a novel polypeptide coding for the above-mentioned DNA, the novel polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, the above DNA, polypeptide, a reagent for detecting apoptosis using the antibody, and a method for detecting the same The present invention can also provide a method for diagnosing, preventing, and treating a disease involving apoptosis and an apoptotic inhibitor using the DNA, polypeptide, or antibody described above.
配 列 表 Arrangement table
配列番号： 1 SEQ ID NO: 1
配列の長さ ： 418 Sequence length: 418
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 Array
CCACAGCAGT AAATAATGAG GAAAATGAAT TAGCTCCAGT GCTGGAACAA CTAACTAACT 60 TGGTGTTACC TGTAAGTGAA AACTCAAGTG TCAGATGAAG GGAGGTGGAG TTATCCTCTT 120 ATAGTACAGT GGCCTGTTAT CTTTTTAATG AATATATACA AGCCAACATC CAATTTCTAT 180 TATTACAATT AGGGTTCTTG TAGCTGTTTA TGTTAATATG GAGAAGAAAA CTATATTGGC 240 TGATTTTTTC TGATCTTAAA GCAGAATGCC TTTTCTTTTT TTGCTTCAGT TGTAAAGAAG 300 AGGGAATACA TGATAAAGTA ACTGGTTTGA TTTCTCGTTC ATTGTACACT GCCTCTGAAC 360 ATCTAATTGT TTTTAGTTGT CTAAATAAAA TGCCTCTAAA ACAAAAAAAA AAAAAAAC 418 配列番号： 2  CCACAGCAGT AAATAATGAG GAAAATGAAT TAGCTCCAGT GCTGGAACAA CTAACTAACT 60 TGGTGTTACC TGTAAGTGAA AACTCAAGTG TCAGATGAAG GGAGGTGGAG TTATCCTCTT 120 ATAGTACAGT GGCCTGTTAT CTTTTTAATG AATATATACA AGCCAACATC CAATTTCTAT 180 TATTACAATT AGGGTTCTTG TAGCTGTTTA TGTTAATATG GAGAAGAAAA CTATATTGGC 240 TGATTTTTTC TGATCTTAAA GCAGAATGCC TTTTCTTTTT TTGCTTCAGT TGTAAAGAAG 300 AGGGAATACA TGATAAAGTA ACTGGTTTGA TTTCTCGTTC ATTGTACACT GCCTCTGAAC 360 ATCTAATTGT TTTTAGTTGT CTAAATAAAA TGCCTCTAAA ACAAAAAAAA AAAAAAAC 418 sequences No .: 2
配列の長さ ： 257 Sequence length: 257
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ— ：直鎖状  Topology-: Linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y Organism name: human Cell line: neuroblastoma SH—SY5Y
配列 Array
GGTGACGCAG ACGAGAGCAA CATACGTTTT TATTTTTTGA TAGGTTTTTA TTTTTTTGAT 60 ACCAGAGGGA ATTAACTATG ATCACATCGT GCTCTCTCTG TTCAGCATCA CACGCCCACA 12-0 TACTGCAGTG TGGGAGTAGA TTGGTACGTA CTGAGCACTT AGAAACATCA CGCATCAGGA 180 ACCGGGTCAG GGTGACAGCA TCCTACGGTC ATATCATGAA GGAAGCCTCC CTTACAAACC 240 TAAAAAAAAA AAAAAAC 257 配列番号： 3  GGTGACGCAG ACGAGAGCAA CATACGTTTT TATTTTTTGA TAGGTTTTTA TTTTTTTGAT 60 ACCAGAGGGA ATTAACTATG ATCACATCGT GCTCTCTCTG TTCAGCATCA CACGCCCACA 12-0 TACTGCAGTG TGGGAGTAGA TTGGTACGTA CTGAGCACTT AGAAACATCA CGCATCAGGA 180 ACCGGGTCAG GGTGACAGCA TCCTACGGTC ATATCATGAA GGAAGCCTCC CTTACAAACC 240 TAAAAAAAAA AAAAAAC 257 SEQ ID NO: 3
配列の長さ ： 144 Array length: 144
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ： 神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 Array
GAACGGACTC TTAGAAAGAT GCAGACTGCA GCAACACTCA TTCAGTCAAA CTACAGAAGA 60 TACAGACAGC AAACATACTT TAATAAGTTA AAGAAAATAA CAAAAACAGT ACAGCAAAGA 120 TACTGGGTAA AAAAAAAAAA AAAC 144 配列番号： 4  GAACGGACTC TTAGAAAGAT GCAGACTGCA GCAACACTCA TTCAGTCAAA CTACAGAAGA 60 TACAGACAGC AAACATACTT TAATAAGTTA AAGAAAATAA CAAAAACAGT ACAGCAAAGA 120 TACTGGGTAA AAAAAAAAAA AAAC 144 SEQ ID NO: 4
配列の長さ ： 124 Sequence length: 124
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類： c D N A 起源 Sequence type: cDNA origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 ― GACGGATCAG AAGATTGAGG GTTCGAGTCC CTTCGTGGTC GTGTTCTTAC TATTGTCAGG 60 AAATATCTTT ACTTTCTGCA CATCTCCTTG AGCTTTCTGC AAGCCAGCAA AAAAAAAAAA 120 AAAC 124 配列番号： 5 Sequence-GACGGATCAG AAGATTGAGG GTTCGAGTCC CTTCGTGGTC GTGTTCTTAC TATTGTCAGG 60 AAATATCTTT ACTTTCTGCA CATCTCCTTG AGCTTTCTGC AAGCCAGCAA AAAAAAAAAA 120 AAAC 124 SEQ ID NO: 5
配列の長さ ： 317 Array length: 317
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 Array
TGCGCCCTTC TCTACAGGAA TCTCTGGAAA ACTATCAGAA GACAAAGTTT GACACCTTGA 60 TACCCACTCT CTGTGAATAC CTACCCCCTT CTGGCCACGG TGCCATACCT GTTTCTTCCT 120 GTGACTGTAG AGACAGTTCT AGACCTTTGT GATAGAACTA AAATGCTCTC TGTACTCTAG 180 TCTCCTGCCT CCTCAGCTCT GCAAGTAGTT TAGTAGGAAT GAAGTGGAAG TCCAGGCTTG 240 GATTGCCTAA CTACACTGCT AAAAATATTT GTAATCCTTA ATAATTAAAC TTTGGATTTG 300 TAAAAAAAAA AAAAAAC 317 配列番号： 6  TGCGCCCTTC TCTACAGGAA TCTCTGGAAA ACTATCAGAA GACAAAGTTT GACACCTTGA 60 TACCCACTCT CTGTGAATAC CTACCCCCTT CTGGCCACGG TGCCATACCT GTTTCTTCCT 120 GTGACTGTAG AGACAGTTCT AGACCTTTGT GATAGAACTA AAATGCTCTC TGTACTCTAG 180 TCTCCTGCCT CCTCAGCTCT GCAAGTAGTT TAGTAGGAAT GAAGTGGAAG TCCAGGCTTG 240 GATTGCCTAA CTACACTGCT AAAAATATTT GTAATCCTTA ATAATTAAAC TTTGGATTTG 300 TAAAAAAAAA AAAAAAC 317 SEQ ID NO: 6
配列の長さ ： 438 Sequence length: 438
配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 Sequence type: nucleic acid Number of chains: double strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 ― 生物名 ： ヒ ト Origin-Organism name: human
セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 Array
GGTCCCTGAC AATGACTGAT TTCAAGTTTG ATTTCGGGTT GATTGATTGA TTGATAGAAA 60 GAAAGTTGCT TTTCTTTTGA GAATTAAAAA CTTTGGCTTG ATTTCTTTTT TCCCTTTGCT 120 TATATCTAGC ATTAGAATTT TGTCTTAAAA TAACAGCGGT AAGTTTCACT TTTTATTCTG 180 TATTGTGCAG TACACAATAA GGTAATTAGA TTTAGAAGTA CTCAGTCACT TTAAGTGGAT 240 AAATGTATTA GTTAAAACTT TAGGGTTTGC TTTTTTGCTG TTTAGATCAA AGTTTTTTCT 300 GATTCTTCTG TCCTCATTGT GAACATAACC GTGTAGTTGA AACAGTCAAA CTTATTTTTG 360 TAATGTATGT TATTGTGTGA TGCAGTTTTT TTGCTTCTGT CTCCAATATT AAACCATTTT 420 CCAAAAAAAA AAAAAAAC 438 配列番号： 7  GGTCCCTGAC AATGACTGAT TTCAAGTTTG ATTTCGGGTT GATTGATTGA TTGATAGAAA 60 GAAAGTTGCT TTTCTTTTGA GAATTAAAAA CTTTGGCTTG ATTTCTTTTT TCCCTTTGCT 120 TATATCTAGC ATTAGAATTT TGTCTTAAAA TAACAGCGGT AAGTTTCACT TTTTATTCTG 180 TATTGTGCAG TACACAATAA GGTAATTAGA TTTAGAAGTA CTCAGTCACT TTAAGTGGAT 240 AAATGTATTA GTTAAAACTT TAGGGTTTGC TTTTTTGCTG TTTAGATCAA AGTTTTTTCT 300 GATTCTTCTG TCCTCATTGT GAACATAACC GTGTAGTTGA AACAGTCAAA CTTATTTTTG 360 TAATGTATGT TATTGTGTGA TGCAGTTTTT TTGCTTCTGT CTCCAATATT AAACCATTTT 420 CCAAAAAAAA AAAAAAAC 438 SEQ ID NO: 7
配列の長さ ： 1847 Sequence length: 1847
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ— ：直鎖状  Topology-: Linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライン ：神経芽細胞腫 S H _ S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H _ S Y 5 Y
配列 Array
TGGACGCTGT GAATCGTGGC TGGCCCGGTT CTCCGCTTCT CCCCATCCCC TACTTTCCTC 60 CCTCCCTCCC TTTCCCTCCC TCGTCGACTG TTGCTTGCTG GTCGCAGACT CCCTGACCCC 120 TCCCTCACCC CTCCCTAACC TCGGTGCCAC CGGATTGCCC TTCTTTTCCT GTTGCCCAGC 180 CCAGCCCTAG TGTCAGGGCG GGGGCCTGGA GCAGCCCGAG GCACTGCAGC AGAAGAGAGA 240 AAAGACAACG ACGACCCTCA GCTCGCCAGT CCGGTCGCTG GCTTCGCCGC CGCCATGGCA 300 ATGAGACAGA CGCCGCTCAC CTGCTCTGGC CACACGCGAC CCGTGGTTGA TTTGGCCTTC 360 AGTGGCATCA CGCCTTATGG GTATTTCTTA ATCAGCGCTT GCAAAG ATG GTA AAC 415 TGGACGCTGT GAATCGTGGC TGGCCCGGTT CTCCGCTTCT CCCCATCCCC TACTTTCCTC 60 CCTCCCTCCC TTTCCCTCCC TCGTCGACTG TTGCTTGCTG GTCGCAGACT CCCTGACCCC 120 TCCCTCACCC CTCCCTAACC TCGGTGCCAC CGGATTGCCC TTCTTTTCCT GTTGCCCAGC 180 CCAGCCCTAG TGTCAGGGCG GGGGCCTGGA GCAGCCCGAG GCACTGCAGC AGAAGAGAGA 240 AAAGACAACG ACGACCCTCA GCTCGCCAGT CCGGTCGCTG GCTTCGCCGC CGCCATGGCA 300 ATGAGACAGA CGCCGCTCAC CTGCTCTGGC CACACGCGAC CCGTGGTTGA TTTGGCCTTC 360 AGTGGCATCA CGCCTTATGG GTATTTCTTA ATCAGCGCTT GCAAAG ATG GTA AAC 415
Met Val Asn  Met Val Asn
1  1
CTA TGC TAC GCC AGG GGA GAT ACA GGA GAC TGG ATT GGA ACA TTT TTG 463 Leu Cys Tyr Al a Arg Gly Asp Thr Gly Asp Trp l ie Gly Thr Phe Leu  CTA TGC TAC GCC AGG GGA GAT ACA GGA GAC TGG ATT GGA ACA TTT TTG 463 Leu Cys Tyr Al a Arg Gly Asp Thr Gly Asp Trp lie Gly Thr Phe Leu
5 10 15  5 10 15
GGT CAT AAA GGT GCT GTT TGG GGT GCA ACA CTG AAT AAG GAT GCC ACC 511 Gly Hi s Lys Gly Ala Val Trp Gly Ala Thr Leu Asn Lys Asp Ala Thr  GGT CAT AAA GGT GCT GTT TGG GGT GCA ACA CTG AAT AAG GAT GCC ACC 511 Gly His Lys Gly Ala Val Trp Gly Ala Thr Leu Asn Lys Asp Ala Thr
20 25 30 35  20 25 30 35
AAA GCA GCT ACA GCA GCT GCA GAT TTC ACA GCC AAA GTG TGG GAT GCT 559 Lys Ala Ala Thr Al a Ala Ala Asp Phe Thr Al a Lys Val Trp Asp Ala  AAA GCA GCT ACA GCA GCT GCA GAT TTC ACA GCC AAA GTG TGG GAT GCT 559 Lys Ala Ala Thr Al a Ala Ala Asp Phe Thr Al a Lys Val Trp Asp Ala
40 45 50  40 45 50
GTC TCA GGA GAT GAA TTG ATG ACC CTG GCT CAT AAA CAC ATT GTC AAG 607 Val Ser Gly Asp Glu Leu Met Thr Leu Ala Hi s Lys Hi s l ie Va l Lys  GTC TCA GGA GAT GAA TTG ATG ACC CTG GCT CAT AAA CAC ATT GTC AAG 607 Val Ser Gly Asp Glu Leu Met Thr Leu Ala Hi s Lys Hi s lie Va l Lys
55 60 65  55 60 65
ACT GTG GAT TTC ACG CAG GAT AGT AAT TAT TTG TTA ACC GGG GGA CAG 655 Thr V l Asp Phe Thr Gin Asp Ser Asn Tyr Leu Leu Thr Gly G ly Gin  ACT GTG GAT TTC ACG CAG GAT AGT AAT TAT TTG TTA ACC GGG GGA CAG 655 Thr Vl Asp Phe Thr Gin Asp Ser Asn Tyr Leu Leu Thr Gly Gly Gin
70 75 80  70 75 80
GAT AAA CTG TTA CGC ATA TAT GAC TTG AAC AAA CCT GAA GCA GAA CCT 703 Asp Lys Leu Leu Arg l ie Tyr Asp Leu Asn Lys Pro Glu Ala Glu Pro  GAT AAA CTG TTA CGC ATA TAT GAC TTG AAC AAA CCT GAA GCA GAA CCT 703 Asp Lys Leu Leu Arg lie Tyr Asp Leu Asn Lys Pro Glu Ala Glu Pro
85 90 95 AAG GAA ATT AGT GGT CAT ACT TCT GGT ATA AAA AAA GCT CTG TGG TGC 75185 90 95 AAG GAA ATT AGT GGT CAT ACT TCT GGT ATA AAA AAA GCT CTG TGG TGC 751
Lys Glu lie Ser Gly His Thr Ser Gly lie Lys Lys Ala Leu Trp Cys Lys Glu lie Ser Gly His Thr Ser Gly lie Lys Lys Ala Leu Trp Cys
100 105 110 115  100 105 110 115
AGT GAG GAT AAA CAG ATT CTT TCT GCT GAT GAC AAA ACT GTT CGA CTT 79-9 AGT GAG GAT AAA CAG ATT CTT TCT GCT GAT GAC AAA ACT GTT CGA CTT 79-9
Ser Glu Asp Lys Gin lie Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr Val Arg Leu Ser Glu Asp Lys Gin lie Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr Val Arg Leu
120 125 130  120 125 130
TGG GAT CAT GCT ACT ATG ACA GAA GTG AAA TCT CTA AAT TTT AAT ATG 847 Trp Asp His Ala Thr Met Thr Glu Val Lys Ser Leu Asn Phe Asn Met  TGG GAT CAT GCT ACT ATG ACA GAA GTG AAA TCT CTA AAT TTT AAT ATG 847 Trp Asp His Ala Thr Met Thr Glu Val Lys Ser Leu Asn Phe Asn Met
135 140 145  135 140 145
TCT GTT AGT AGT ATG GAA TAT ATT CCT GAG GGA GAG ATT TTG GTT ATA 895 Ser Val Ser Ser Met Glu Tyr lie Pro Glu Gly Glu He Leu Val He  TCT GTT AGT AGT ATG GAA TAT ATT CCT GAG GGA GAG ATT TTG GTT ATA 895 Ser Val Ser Ser Met Glu Tyr lie Pro Glu Gly Glu He Leu Val He
150 155 160  150 155 160
ACT TAT GGA CGA TCT ATT GCT TTT CAT AGT GCA GTA AGT TTG GAC CCA 943 Thr Tyr Gly Arg Ser lie Ala Phe His Ser Ala Val Ser Leu Asp Pro  ACT TAT GGA CGA TCT ATT GCT TTT CAT AGT GCA GTA AGT TTG GAC CCA 943 Thr Tyr Gly Arg Ser lie Ala Phe His Ser Ala Val Ser Leu Asp Pro
165 170 175  165 170 175
ATT AAA TCC TTT GAA GCT CCT GCA ACC ATC AAT TCT GCA TCT CTT CAT 991 lie Lys Ser Phe Glu Ala Pro Ala Thr lie Asn Ser Ala Ser Leu His  ATT AAA TCC TTT GAA GCT CCT GCA ACC ATC AAT TCT GCA TCT CTT CAT 991 lie Lys Ser Phe Glu Ala Pro Ala Thr lie Asn Ser Ala Ser Leu His
180 185 190 195 180 185 190 195
CCT GAG AAA GAA TTT CTT GTT GCA GGC GGT GAA GAT TTT AAA CTT TAT 1039 Pro Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Gly Gly Glu Asp Phe Lys Leu Tyr  CCT GAG AAA GAA TTT CTT GTT GCA GGC GGT GAA GAT TTT AAA CTT TAT 1039 Pro Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Gly Gly Glu Asp Phe Lys Leu Tyr
200 205 210  200 205 210
AAG TAT GAT TAT AAT AGT GGA GAA GAA TTA GAA TCC TAC AAG GGA CAC 1087 Lys Tyr Asp Tyr Asn Ser Gly Glu Glu Leu Glu Ser Tyr Lys Gly His  AAG TAT GAT TAT AAT AGT GGA GAA GAA TTA GAA TCC TAC AAG GGA CAC 1087 Lys Tyr Asp Tyr Asn Ser Gly Glu Glu Leu Glu Ser Tyr Lys Gly His
215 220 225  215 220 225
TTT GGT CCT ATT CAC TGT GTG AGA TTT AGT CCC TGATGGAGAA CTCTATGCCA 1140 Phe Gly Pro lie His Cys Val Arg Phe Ser Pro 230 235 TTT GGT CCT ATT CAC TGT GTG AGA TTT AGT CCC TGATGGAGAA CTCTATGCCA 1140 Phe Gly Pro lie His Cys Val Arg Phe Ser Pro 230 235
GTGGTTCAGA AGATGGAACA TTGAGACTAT GGCAAACTGT GGTAGGAAAA ACGTATGGCC 1200 TTTGGAAATG TGTGCTTCCT GAAGAAGATA GTGGTGAGCT GGCAAAGCCA AAGATTGGTT 1260 TTCCAGAGAC AACAGAAGAG GAGCTAGAAG AAATTGCTTC AGAGAATTCA GATTGCATCT 1320 TTCCTTCAGC TCCTGATGTT AAGGCCTGAG CGTCAATCAT ATGTTGCAGT TAGTATACAA 1380 CTGACTAAAA CAAGCAAGCA GAGAAAAGCA TCAGCCTTCC AGAGTTACTG TCTGCTTAAG 1440 GCAGAAACAG CAGTAAATAA TGAGGAAAAT GAATTAGCTC CAGTGCTGGA ACAACTAACT 1500 AACTTGGTGT TACCTGTAAG TGAAAACTCA AGTGTCAGAT GAAGGGAGGT GGAGTTATCC 1560 TCTTATAGTA CAGTGGCCTG TTATCTTTTT AATGAATATA TACAAGCCAA CATCCAATTT 1620 CTATTATTAC AATTAGGGTT CTTGTAGCTG TTTATGTTAA TATGGAGAAG AAAACTATAT 1680 TGGCTGATTT TTTCTGATCT TAAAGCAGAA TGCCTTTTCT TTTTTTGCTT CAGTTGTAAA 1740 GAAGAGGGAA TACATGATAA AGTAACTGGT TTGATTTCTC GTTCATTGTA CACTGCCTCT 1800 GAACATCTAA TTGTTTTTAG TTGTCTAAAT AAAATGCCTC TAAAACA 1847 配列番号 8 GTGGTTCAGA AGATGGAACA TTGAGACTAT GGCAAACTGT GGTAGGAAAA ACGTATGGCC 1200 TTTGGAAATG TGTGCTTCCT GAAGAAGATA GTGGTGAGCT GGCAAAGCCA AAGATTGGTT 1260 TTCCAGAGAC AACAGAAGAG GAGCTAGAAG AAATTGCTTC AGAGAATTCA GATTGCATCT 1320 TTCCTTCAGC TCCTGATGTT AAGGCCTGAG CGTCAATCAT ATGTTGCAGT TAGTATACAA 1380 CTGACTAAAA CAAGCAAGCA GAGAAAAGCA TCAGCCTTCC AGAGTTACTG TCTGCTTAAG 1440 GCAGAAACAG CAGTAAATAA TGAGGAAAAT GAATTAGCTC CAGTGCTGGA ACAACTAACT 1500 AACTTGGTGT TACCTGTAAG TGAAAACTCA AGTGTCAGAT GAAGGGAGGT GGAGTTATCC 1560 TCTTATAGTA CAGTGGCCTG TTATCTTTTT AATGAATATA TACAAGCCAA CATCCAATTT 1620 CTATTATTAC AATTAGGGTT CTTGTAGCTG TTTATGTTAA TATGGAGAAG AAAACTATAT 1680 TGGCTGATTT TTTCTGATCT TAAAGCAGAA TGCCTTTTCT TTTTTTGCTT CAGTTGTAAA 1740 GAAGAGGGAA TACATGATAA AGTAACTGGT TTGATTTCTC GTTCATTGTA CACTGCCTCT 1800 GAACATCTAA TTGTTTTTAG TTGTCTAAAT AAAATGCCTC TAAAACA 1847 SEQ ID NO: 8
配列の長さ ： 3072 Array length: 3072
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類： c D N A t o m R N A Sequence type: c D N A t o m R N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト Organism name: human
組織の種類：脳 Tissue type: brain
配列 ： Array:
GAATTTTAAG TCATTTTGGG GTAATGCCAG ACAGAGAACC TGAGCCTCAG AGTAATCCCA 60 GCGGCCCTGC CTGGTCCTGG TGGATCCTGG CCGTGCTGCC CCTGGAGCGC AAGGCTCAGC 120 TGGCCATCCT CGGCATGACC TCGCTCAAAG AGCGGCTCCT TGCCATCCGA CGGATATTAG 180 o GAATTTTAAG TCATTTTGGG GTAATGCCAG ACAGAGAACC TGAGCCTCAG AGTAATCCCA 60 GCGGCCCTGC CTGGTCCTGG TGGATCCTGG CCGTGCTGCC CCTGGAGCGC AAGGCTCAGC 120 TGGCCATCCT CGGCATGACC TCGCTCAAAG AGCGGCTCCT TGCCATCCGA CGGATATTAG o
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0001
GTAAAGAGAA AATGTGAAAG TATTTTCCAA TCCAATGTTT CAAGTGCCTC ACTTATTGTG 1800GTAAAGAGAA AATGTGAAAG TATTTTCCAA TCCAATGTTT CAAGTGCCTC ACTTATTGTG 1800
AATCTCAAAT ATCATCTTGA GATGGTTTAA TGGCAGTTTG GCCAAGTGAT TTCTAAGAGA 1860AATCTCAAAT ATCATCTTGA GATGGTTTAA TGGCAGTTTG GCCAAGTGAT TTCTAAGAGA 1860
TTTTATTAAT TTATGCATTA ACAATAGTAT TCAACTTTCT TAGGCATTAT AACCTAACCC 1920TTTTATTAAT TTATGCATTA ACAATAGTAT TCAACTTTCT TAGGCATTAT AACCTAACCC 1920
GATCATTTGA TTGGAATAAC TGAATCATTC ATTGATTGGA ATAAAATAAA GAAAACAAAA 1980GATCATTTGA TTGGAATAAC TGAATCATTC ATTGATTGGA ATAAAATAAA GAAAACAAAA 1980
TGCATCTCAC ATGCCAGAAG ACCTTTACCA GAAGTGGTTC ATGAAAATCA GTATGCATTG 2040TGCATCTCAC ATGCCAGAAG ACCTTTACCA GAAGTGGTTC ATGAAAATCA GTATGCATTG 2040
ACCATTCTCT GCCTTTCCCT TTTGGAAAAT TTTTTTGTAC CTTCATATCA CAGCTGAATA 2100ACCATTCTCT GCCTTTCCCT TTTGGAAAAT TTTTTTGTAC CTTCATATCA CAGCTGAATA 2100
GTTATCAATG CCATTTCCAT TTGGAAGTAT CTAAATAACC ACAATGTGAT CACAGCTTCT 2160GTTATCAATG CCATTTCCAT TTGGAAGTAT CTAAATAACC ACAATGTGAT CACAGCTTCT 2160
CCACGAGCCT TCCTGAAGTA AAGCTGGTAT GCTTGCTATA ATACTTGGAA CCTGTTGCTT 2220CCACGAGCCT TCCTGAAGTA AAGCTGGTAT GCTTGCTATA ATACTTGGAA CCTGTTGCTT 2220
TCTCTTCCTC ACTCTTTTAT GTCATAAGGT CACACAGTTC TTGGAATCAG AACTATTCGG 2280TCTCTTCCTC ACTCTTTTAT GTCATAAGGT CACACAGTTC TTGGAATCAG AACTATTCGG 2280
TTATTTCTTC ATGATTCTGC CTGGCTTTCT GAGTCTTCTC ATTCGGCATG TTATGTAAAA 2340TTATTTCTTC ATGATTCTGC CTGGCTTTCT GAGTCTTCTC ATTCGGCATG TTATGTAAAA 2340
GTCTGAACAA CAATGATGAC GCAGACGAGA GCAACATACG TTTTTATTTT TTGATAGGTT 2400GTCTGAACAA CAATGATGAC GCAGACGAGA GCAACATACG TTTTTATTTT TTGATAGGTT 2400
TTTATTTTTT TGATACCAGA GGGAATTAAC TATGATCACA TCGTGCTCTC TCTGTTCAGC 2460TTTATTTTTT TGATACCAGA GGGAATTAAC TATGATCACA TCGTGCTCTC TCTGTTCAGC 2460
ATCACACGCC CACATACTGC AGTGTGGGAG TAGATTGGTA CGTACTGAGC ACTTAGAAAC 2520ATCACACGCC CACATACTGC AGTGTGGGAG TAGATTGGTA CGTACTGAGC ACTTAGAAAC 2520
ATCACGCATC AGGAACCGGG TCAGGGTGAC AGCATCCTAC GGTCATATCA TGAAGGAAGC 2580ATCACGCATC AGGAACCGGG TCAGGGTGAC AGCATCCTAC GGTCATATCA TGAAGGAAGC 2580
CTCCCTTACA AACCTAAAAA AAAAAACCCC AGCTTCAGTT TGCTACCAAT TAAGCTAAAG 2640CTCCCTTACA AACCTAAAAA AAAAAACCCC AGCTTCAGTT TGCTACCAAT TAAGCTAAAG 2640
CAGAACGGTC TGCTTCCTCC TCCGCCTGCC CCCTTCTGCC TCTTTTCTGT TGGGGAGATG 2700CAGAACGGTC TGCTTCCTCC TCCGCCTGCC CCCTTCTGCC TCTTTTCTGT TGGGGAGATG 2700
CCAATTCTAA GGATTTCTCA GAAAATAATG TAATCTCTCA TTCAATGTCA GGACATTCCA 2760CCAATTCTAA GGATTTCTCA GAAAATAATG TAATCTCTCA TTCAATGTCA GGACATTCCA 2760
GCTTAATTGT ACTGAAAGTG CTCCAATAGG CATGCTCTCG TTACATTGGA ATCAAGCAGA 2820GCTTAATTGT ACTGAAAGTG CTCCAATAGG CATGCTCTCG TTACATTGGA ATCAAGCAGA 2820
AAAGAGTAAT AGCAGCGTGG GGGAATCATT TTTCTTCTTG AGGAACAATA CATGCTGTTC 2880AAAGAGTAAT AGCAGCGTGG GGGAATCATT TTTCTTCTTG AGGAACAATA CATGCTGTTC 2880
TGTATTTTTC CATTCATCGC CCAAACCTGC CTGTGTCTTT GAAATGCAAG TAAGATCCCA 2940TGTATTTTTC CATTCATCGC CCAAACCTGC CTGTGTCTTT GAAATGCAAG TAAGATCCCA 2940
AAGGCAGCTT TCTGAAAGCC CGTGGCATTT TTAGCTTATC CCATCCCCCG TGTGTGTCCT 3000AAGGCAGCTT TCTGAAAGCC CGTGGCATTT TTAGCTTATC CCATCCCCCG TGTGTGTCCT 3000
CATCTTCAGA ATTGAAAGTT AGGATACTTT TTAAAGTTTC AAAAGAAAAA AAAAAAAAAA 3060CATCTTCAGA ATTGAAAGTT AGGATACTTT TTAAAGTTTC AAAAGAAAAA AAAAAAAAAA 3060
AAAAAAAAAA AA 3072 配列番号： 9 AAAAAAAAAA AA 3072 SEQ ID NO: 9
配列の長さ ： 238 Array length: 238
配列の型： ポリべプチド トポロジー ：直鎖状 Sequence type: Polypeptide Topology: linear
配列の種類： ポリべプチド Sequence type: Polypeptide
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ：神経芽細胞腫 S H— S Y 5 Y  Cell line: neuroblastoma S H— S Y 5 Y
配列 Array
Met Val Asn Leu Cys Tyr Ala Arg Gly Asp Thr Gly Asp Trp He Gly Met Val Asn Leu Cys Tyr Ala Arg Gly Asp Thr Gly Asp Trp He Gly
1 5 10 151 5 10 15
Thr Phe Leu Gly His Lys Gly Ala Val Trp Gly Ala Thr Leu Asn Lys Thr Phe Leu Gly His Lys Gly Ala Val Trp Gly Ala Thr Leu Asn Lys
20 25 30  20 25 30
Asp Ala Thr Lys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Asp Phe Thr Ala Lys Val  Asp Ala Thr Lys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Asp Phe Thr Ala Lys Val
35 40 45  35 40 45
Trp Asp Ala Val Ser Gly Asp Glu Leu Met Thr Leu Ala His Lys His Trp Asp Ala Val Ser Gly Asp Glu Leu Met Thr Leu Ala His Lys His
50 55 60 50 55 60
lie Val Lys Thr Val Asp Phe Thr Gin Asp Ser Asn Tyr Leu Leu Thr 65 70 75 80lie Val Lys Thr Val Asp Phe Thr Gin Asp Ser Asn Tyr Leu Leu Thr 65 70 75 80
Gly Gly Gin Asp Lys Leu Leu Arg lie Tyr Asp Leu Asn Lys Pro Glu Gly Gly Gin Asp Lys Leu Leu Arg lie Tyr Asp Leu Asn Lys Pro Glu
85 90 95 85 90 95
Ala Glu Pro Lys Glu lie Ser Gly His Thr Ser Gly lie Lys Lys Ala Ala Glu Pro Lys Glu lie Ser Gly His Thr Ser Gly lie Lys Lys Ala
100 105 110  100 105 110
Leu Trp Cys Ser Glu Asp Lys Gin lie Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr  Leu Trp Cys Ser Glu Asp Lys Gin lie Leu Ser Ala Asp Asp Lys Thr
115 120 125  115 120 125
Val Arg Leu Trp Asp His Ala Thr Met Thr Glu Val Lys Ser Leu Asn Val Arg Leu Trp Asp His Ala Thr Met Thr Glu Val Lys Ser Leu Asn
130 135 140 130 135 140
Phe Asn Met Ser Val Ser Ser Met Glu Tyr lie Pro Glu Gly Glu lie 145 150 155 160 Leu Val lie Thr Tyr Gly Arg Ser He Ala Phe His Ser Ala Val Ser Phe Asn Met Ser Val Ser Ser Met Glu Tyr lie Pro Glu Gly Glu lie 145 150 155 160 Leu Val lie Thr Tyr Gly Arg Ser He Ala Phe His Ser Ala Val Ser
165 170 175  165 170 175
Leu Asp Pro He Lys Ser Phe Glu Ala Pro Ala Thr lie Asn Ser Ala  Leu Asp Pro He Lys Ser Phe Glu Ala Pro Ala Thr lie Asn Ser Ala
180 185 190  180 185 190
Ser Leu His Pro Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Gly Gly Glu Asp Phe  Ser Leu His Pro Glu Lys Glu Phe Leu Val Ala Gly Gly Glu Asp Phe
195 200 205  195 200 205
Lys Leu Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asn Ser Gly Glu Glu Leu Glu Ser Tyr  Lys Leu Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asn Ser Gly Glu Glu Le Glu Ser Tyr
210 215 220  210 215 220
Lys Gly His Phe Gly Pro He His Cys Val Arg Phe Ser Pro  Lys Gly His Phe Gly Pro He His Cys Val Arg Phe Ser Pro
225 230 235 225 230 235
配列番号： 10 SEQ ID NO: 10
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTAA 18 配列番号： 11  GTTTTTTTTT TTTTTTAA 18 SEQ ID NO: 11
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTGA 18 配列番号： 12 GTTTTTTTTT TTTTTTGA 18 SEQ ID NO: 12
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 ― トポロジー ：直鎖状 Number of chains: single-stranded-Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTCA 18 配列番号： 13  GTTTTTTTTT TTTTTTCA 18 SEQ ID NO: 13
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTAT 18 配列番号： 14  GTTTTTTTTT TTTTTTAT 18 SEQ ID NO: 14
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTGT 18 配列番号： 15  GTTTTTTTTT TTTTTTGT 18 SEQ ID NO: 15
配列の長さ ： 18 配列の型：核酸 Array length: 18 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A - 配列 Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA-sequence
GTTTTTTTTT TTTTTTCT 18 配列番号： 16  GTTTTTTTTT TTTTTTCT 18 SEQ ID NO: 16
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTAG 18 配列番号： 17  GTTTTTTTTT TTTTTTAG 18 SEQ ID NO: 17
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTGG 18 配列番号： 18  GTTTTTTTTT TTTTTTGG 18 SEQ ID NO: 18
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 トポロジ— ：直鎖状 Number of chains: single strand Topology-: Linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTCG 18 配列番号： 19  GTTTTTTTTT TTTTTTCG 18 SEQ ID NO: 19
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTAC 18 配列番号： 20  GTTTTTTTTT TTTTTTAC 18 SEQ ID NO: 20
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTTTTTTTT TTTTTTGC 18 配列番号： 21  GTTTTTTTTT TTTTTTGC 18 SEQ ID NO: 21
配列の長さ ： 18 Array length: 18
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ：直鎖状  Topology-: Linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA 配列 Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA Array
GTTTTTTTTT TTTTTTCC 18 配列番号： 22  GTTTTTTTTT TTTTTTCC 18 SEQ ID NO: 22
配列の長さ ： 20 - 配列の型：核酸 Sequence length: 20-Sequence type: Nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TGAATTAGCT CCAGTGCTGG 20 配列番号： 23  TGAATTAGCT CCAGTGCTGG 20 SEQ ID NO: 23
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GATGTTCAGA GGCAGTGTAC 20 配列番号： 24  GATGTTCAGA GGCAGTGTAC 20 SEQ ID NO: 24
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
ACTATGATCA CATCGTGCTC 20 配列番号： 25 ACTATGATCA CATCGTGCTC 20 SEQ ID NO: 25
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 - トポロジー ：直鎖状 Number of chains: single-stranded-Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GACCGTAGGA TGCTGTCACC 20 配列番号： 26  GACCGTAGGA TGCTGTCACC 20 SEQ ID NO: 26
配列の長さ ： 21 Array length: 21
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TTAGAAAGAT GCAGACTGCA G 21 配列番号： 27  TTAGAAAGAT GCAGACTGCA G 21 SEQ ID NO: 27
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
CCAGTATCTT TGCTGTACTG 20 配列番号： 28  CCAGTATCTT TGCTGTACTG 20 SEQ ID NO: 28
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸 Array length: 20 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ： 直鎖状  Topology-: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A - 配列 Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA-sequence
TAATGGATAA GGCGTCTGAC 20 配列番号： 29  TAATGGATAA GGCGTCTGAC 20 SEQ ID NO: 29
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TCACTCTGTC ACTTGTTCTC 20 配列番号： 30  TCACTCTGTC ACTTGTTCTC 20 SEQ ID NO: 30
配列の長さ ： 21 Array length: 21
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TCTGGAAAAC TATCAGAAGA C 21 配列番号： 31  TCTGGAAAAC TATCAGAAGA C 21 SEQ ID NO: 31
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 トポロジー ：直鎖状 Number of chains: single strand Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
CCTGGACTTC CACTTCATTC 20 配列番号： 32  CCTGGACTTC CACTTCATTC 20 SEQ ID NO: 32
配列の長さ ： 22 Array length: 22
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GGGTTGATTG ATTGATTGAT AG 22 配列番号： 33  GGGTTGATTG ATTGATTGAT AG 22 SEQ ID NO: 33
配列の長さ ： 21 Array length: 21
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
CTGCATCACA CAATAACATA C 21 配列番号： 34  CTGCATCACA CAATAACATA C 21 SEQ ID NO: 34
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA 配列 Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA Array
AGTGGGCTTC CAGAGCTTCT 20 配列番号： 35  AGTGGGCTTC CAGAGCTTCT 20 SEQ ID NO: 35
配列の長さ ： 20 ― 配列の型：核酸 Sequence length: 20-Sequence type: Nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
AGGGCAAGGG GATGCAAACA 20 配列番号： 36  AGGGCAAGGG GATGCAAACA 20 SEQ ID NO: 36
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTTGATGTGA ACATTATGCC 20 配列番号： 37  GTTGATGTGA ACATTATGCC 20 SEQ ID NO: 37
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GTAGAACTGT GGTTCAAGAG 20 配列番号： 38 GTAGAACTGT GGTTCAAGAG 20 SEQ ID NO: 38
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 - トポロジ— ：直鎖状 Number of chains: single-stranded-Topology—: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TTGGCTGCTG TGTACAAGG 19 配列番号： 39  TTGGCTGCTG TGTACAAGG 19 SEQ ID NO: 39
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GCATGAGTCA GGGCTTCTG 19 配列番号： 40  GCATGAGTCA GGGCTTCTG 19 SEQ ID NO: 40
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TGGCCCTGCA GCATGTCATC 20 配列番号： 41  TGGCCCTGCA GCATGTCATC 20 SEQ ID NO: 41
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸 Array length: 20 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
CAAGTACACA TGGAAAAGAC 20 配列番号： 42  CAAGTACACA TGGAAAAGAC 20 SEQ ID NO: 42
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GGCATCAACT ACCAGCCTC 19 配列番号： 43  GGCATCAACT ACCAGCCTC 19 SEQ ID NO: 43
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
AAGCAGCACC TTTGTGACG 19 配列番号： 44  AAGCAGCACC TTTGTGACG 19 SEQ ID NO: 44
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 トポロジー ：直鎖状 Number of chains: single strand Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TGGACGCTGT GAATCGTGG 19- 配列番号： 45  TGGACGCTGT GAATCGTGG 19- SEQ ID NO: 45
配列の長さ ： 22 Array length: 22
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジ— ：直鎖状  Topology-: Linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TGTACTATAA GAGGATAACT CC 22 配列番号： 46  TGTACTATAA GAGGATAACT CC 22 SEQ ID NO: 46
配列の長さ ： 24 Array length: 24
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数： 一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
TGACCGTAGG ATGCTGTCAC CCTG 24 配列番号： 47  TGACCGTAGG ATGCTGTCAC CCTG 24 SEQ ID NO: 47
配列の長さ ： 27 Array length: 27
配列の型：核酸. Sequence type: nucleic acid.
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA 配列 Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA Array
TCAGTAAGTA CCAATCTACT CCCACAC 27 配列番号： 48  TCAGTAAGTA CCAATCTACT CCCACAC 27 SEQ ID NO: 48
配列の長さ ： 29 Array length: 29
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
ACCAGAGGGA ATTAACTATG ATCACATCG 29 配列番号： 49  ACCAGAGGGA ATTAACTATG ATCACATCG 29 SEQ ID NO: 49
配列の長さ ： 28 Array length: 28
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
CAGCATCACA CGCCCACATA CTGCAGTG 28 配列番号： 50  CAGCATCACA CGCCCACATA CTGCAGTG 28 SEQ ID NO: 50
配列の長さ ： 28 Array length: 28
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 Array
GGTTAAGAAT GTCCACCTTA CAGACAGG 28 配列番号： 51 GGTTAAGAAT GTCCACCTTA CAGACAGG 28 SEQ ID NO: 51
配列の長さ ： 20 Array length: 20
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 - トポロジー ：直鎖状 Number of chains: single-stranded-Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 ： Array:
ACTATGATCA CATCGTGCTC 20 配列番号： 52  ACTATGATCA CATCGTGCTC 20 SEQ ID NO: 52
配列の長さ ： 19 Array length: 19
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：一本鎖 Number of chains: single strand
トポロジー ：直鎖状  Topology: linear
配列の種類：他の核酸、 合成 D N A Sequence type: other nucleic acids, synthetic DNA
配列 ： Array:
AAGATGAGGA CACACACGG 19 配列番号： 53  AAGATGAGGA CACACACGG 19 SEQ ID NO: 53
配列の長さ ： 2025 Array length: 2025
配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数：二本鎖 Number of chains: double strand
トポロジ一 ：直鎖状  Topology I: Linear
配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト  Organism name: human
セルライ ン ：脳  Cell line: Brain
配列
Figure imgf000063_0001
Array
Figure imgf000063_0001
LV1VJJ LV1VJJ
0∞ 11Vΐ  0∞ 11Vΐ
οοε1V0SJV1 οοε1V0SJV1
}ΐ}ν3νν } ΐ} ν3νν
VVVVV1L1  VVVVV1L1
VDVV11V111  VDVV11V111
〕1LLV1 vv )ll 1LLV1 vv) ll
)13vv  ) 13vv
VIII〕  VIII]
VS〕LV〕〕V3 V30ivv〕l VVVJ11L〕11113
Figure imgf000063_0002
VS] LV]] V3 V30ivv] l VVVJ11L] 11113
Figure imgf000063_0002
3 sw〕〕3 g〕〕 ΰνΰ〕ν〕〕1〕11V3V31Vivv vl〕3vlllwvlalvivvl3 vvol〕〕 0ν38V 3111V11S 111ννΰν 0VVVJS 11J3V31111111  3 sw]) 3 g]) ΰνΰ] ν]) 1) 11V3V31Vivv vl) 3vlllwvlalvivvl3 vvol]] 0ν38V 3111V11S 111ννΰν 0VVVJS 11J3V31111111
33V03G301v ga3393VV1V11111VJV3VVlsvcG 3VVV1l1 8o vlv39vV13138V vgvvlvl1lV3 3VVVVVVV 110V3VVVV VV13V ¾8VV V139V V1113 SV3VV1VVL9V1V3 33V03G301v ga3393VV1V11111VJV3VVlsvcG 3VVV1l1 8o vlv39vV13138V vgvvlvl1lV3 3VVVVVVV 110V3VVVV VV13V ¾8VV V139V V1113 SV3VV1VVL9V1V3
mvv§ 311U3Dovvlき：l1111311 mvv§ 311U3Dovvl comes: l1111311
3V0VV39 Jvvvl 3 VV0111 L1V1ll131VVS1V 3V0VV39 Jvvvl 3 VV0111 L1V1ll131VVS1V
Figure imgf000064_0001
oj D¾vvv vv ¾11111V311 nlvljlllll1L111V_
Figure imgf000064_0001
oj D¾vvv vv 11111111V311 nlvljlllll1L111V_
vvofsvv 31V3VVSVV srvll Dvv vvv VVVVVVVVVV vvvv vvvv ¾vvvib1  vvofsvv 31V3VVSVV srvll Dvv vvv VVVVVVVVVV vvvv vvvv ¾vvvib1

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
I . 配列番号 3、 4、 7および 8で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を 有するアポトーシス関連 DN Aまたは該 DN Aとストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする DNA。 ， 2. 配列番号 1〜 8で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した 1 0〜 4 0残基と同じ配列を有する DN Aまたは該 DN Aと相補的な配列を有する DN A。  I. An apoptosis-related DNA having a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 4, 7, and 8, or a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions. 2. a DNA having the same sequence as the continuous 10 to 40 residues in the nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8, or a DNA having a sequence complementary to the DNA .
3. DNA力 ?、 配列番号 2 2〜 52で表される塩基配列から選ばれる塩基配列 を有する DNAである、 請求項 2記載の DNA。 3. DNA force? A DNA having a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 2-52, claim 2 DNA according.
4. 請求項 1、 2または 3記載の DN Aを含有する、 アポト一シスの診断薬。 4. A diagnostic agent for apoptosis, comprising the DNA according to claim 1, 2 or 3.
5. 請求項 1、 2または 3記載の DN Aを用いる、 アポトーシス関連遺伝子の mRN Aの検出法。 5. A method for detecting mRNA of apoptosis-related gene using the DNA according to claim 1, 2 or 3.
6. 請求項 2または 3記載の DN Aを用いる、 アポトーシス関連遺伝子の転写 または m R N Aの翻訳を抑制する方法。  6. A method for suppressing transcription of an apoptosis-related gene or translation of mRNA, using the DNA according to claim 2 or 3.
7. 請求項 2または 3記載の DN Aを含有する、 アポトーシスの抑制薬。  7. An agent for suppressing apoptosis, comprising the DNA according to claim 2 or 3.
8. 請求項 2または 3記載の DNAを含有する、 アポト一シスが関与している 疾患の治療薬。  8. A therapeutic agent for a disease associated with apoptosis, which comprises the DNA according to claim 2 or 3.
9. 配列番号 5で表される塩基配列を有する DNA、 配列番号 6で表される塩 基配列を有する DNA、 p 11遺伝子、 単球走化性蛋白一 1遺伝子、 アルドラー ゼ C遺伝子および《チューブリン遺伝子から選ばれる D N Aまたは該 D N Aとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aを含有する、 アポト一シス の診断薬。  9. DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, p11 gene, monocyte chemoattractant protein-1 gene, aldase C gene and << tube An apoptotic diagnostic agent comprising DNA selected from the phosphorus gene or DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions.
1 0. 請求項 9記載の DN Aを用いる、 アポト一シス関連遺伝子の mRNAの 検出法。  10. A method for detecting apoptosis-related gene mRNA using the DNA according to claim 9.
I I . 配列番号 9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 または配列 番号 9で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、 欠失または付加 したアミノ酸配列を有するポリべプチドであり、 且つ配列番号 9で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドの有するアポトーシスに関与する活性を有するポ リぺプチド。 II. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or one or more amino acids substituted, deleted or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 A polypeptide having the following amino acid sequence, and having an activity involved in apoptosis possessed by the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
1 2 . 請求項 1 1記載のポリペプチドをコードする D N Aをベクターに組み込 んで得られる組換え体 D N A。  12. A recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding the polypeptide according to claim 11 into a vector.
1 3 . 請求項 1 2記載の組換え体 D N Aを宿主細胞に導入して得られる形質転 換体。  13. A transformant obtained by introducing the recombinant DNA according to claim 12 into a host cell.
1 4 . 請求項 1 3記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に請求項 1 1記 載のポリペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該ポリベプチドを採取すること を特徴とするポリペプチドの製造法。  14. The transformant according to claim 13 is cultured in a medium, the polypeptide according to claim 11 is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide is collected from the culture. A method for producing a polypeptide.
1 5 . 請求項 1 1記載のポリペプチドを認識する抗体。  15. An antibody that recognizes the polypeptide of claim 11.
1 6 . 請求項 1 5記載の抗体を含有する、 アポト一シス検出薬。  16. A drug for detecting apoptosis, comprising the antibody according to claim 15.
1 7 . 請求項 1 5記載の抗体を用いる、 請求項 1 1記載のポリペプチドの免疫 学的検出法。  17. An immunological detection method for the polypeptide according to claim 11, wherein the antibody according to claim 15 is used.
1 8 . 請求項 1 5記載の抗体を用いる、 免疫組織染色法。  18. An immunohistochemical staining method using the antibody according to claim 15.
1 9 . 請求項 1 5記載の抗体を含有する、 免疫組織染色剤。  19. An immunohistochemical staining agent comprising the antibody according to claim 15.
2 0 . 請求項 1 5記載の抗体を含有する、 アポトーシスの抑制薬。  20. An apoptosis inhibitor comprising the antibody according to claim 15.
2 1 . 請求項 1 5記載の抗体を含有する、 アポトーシスが関与している疾患の 治療薬。  21. A therapeutic agent for a disease involving apoptosis, comprising the antibody according to claim 15.
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