WO1997047172A1

WO1997047172A1 - Vitamin d receptor isoform protein

Info

Publication number: WO1997047172A1
Application number: PCT/IB1997/000947
Authority: WO
Inventors: Shigeaki Kato; Kenju Ueno
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 1997-12-18
Also published as: AU3555097A; JPH09327295A

Abstract

A nucleotide sequence coding for the amino acid sequence represented by SEQ ID NO 1; a nucleotide sequence coding for a protein having vitamin D receptor isoform protein activities and comprising an amino acid sequence resulting from the substitution, deletion or addition of part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO 1; a gene coding for the vitamin D receptor isoform protein that is a DNA containing a nucleotide sequence hybridizing with the above-specified nucleotide sequences; a recombinant vector containing said gene; prokaryotic or eukaryotic host cells transformed by said vector; a vitamin D receptor isoform protein obtained by culturing said host cells; an antibody recognizing said protein; a method of diagnosing bone densities by using said protein; and a method of screening vitamin D-like substances by using said protein.

Description

明細書 Specification

ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質 Vitamin D receptor isoform protein

技術分野 Technical field

本発明は新規なビタミン Dレセプタ一アイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養することによって得られるビタミン Dレセプタ一ァイソフォームタンパク質、該タンパク質を認識する抗体、該タンパク質を用いた骨密度の診断方法、ならびに該タンパク質を用いたビタミン D様物質のスクリ一ニング法に関する..、 The present invention provides a gene encoding a novel vitamin D receptor isoform protein, a recombinant vector containing the gene, a host cell transformed with the recombinant vector, and culturing the host cell. The obtained vitamin D receptor isoform protein, an antibody recognizing the protein, a method for diagnosing bone density using the protein, and a method for screening a vitamin D-like substance using the protein.

贿贿

1， 2 5—ジヒドロキシビタミン D₃ [ 1， 2 5 (OH) ₂D₃] は、カルシウム恒常性や細胞分化を制御するなどの生物活性を有するが、その生物活性のほとんどは核内ビタミン Dレセプタ一（VDR) によって媒介される遺伝子の発現によつて作用する (Darwisn ana Deし uca, Cri t. Rev. Eukaryoti c Gene express. , 3 :89-116, 1993) 一 V DRは、リガンド誘導可能な転写因子として機能する核内レセプタ一ス一ハーフアミリ一のメンバ一であることが知られている（Green and Chambon, Trends Genet. , 4:309-314, 1988; Parker, Curに Op in. Cell Biol. , 5:499-504， 1993) このファミリ一にはステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびレチノイン酸に対する核内レセプタ一、ならびにォ一ファン ' レセブタ一と呼ばれるリガンド未知のレセプタ一が含まれる，構造や機能の類似性に基づくと、 V D Rは、レチノイン酸レセプタ一（RA R) 、 9—シスレチノイン酸レセプタ一（RX R) や甲状腺ホルモンレセプタ一（T R) と共に核内レセプタ一ス一バーファミリ一内でサブファミリ一を形成する。 1,25-Dihydroxyvitamin D ₃ [1,25 (OH) ₂ D ₃ ] has biological activities such as controlling calcium homeostasis and cell differentiation, but most of its biological activities are nuclear. Acts by the expression of a gene mediated by the internal vitamin D receptor (VDR) (Darwisnana der De uca, Crit. Rev. Eukaryotic Gene express., 3: 89-116, 1993). It is known to be a member of nuclear receptors and half-amilies that function as ligand-inducible transcription factors (Green and Chambon, Trends Genet., 4: 309-314, 1988; Parker, Cur, Op in. Cell Biol., 5: 499-504, 1993) This family includes nuclear receptors for steroid hormones, thyroid hormone and retinoic acid, as well as a ligand called Ophan's Resebuta. Based on similarities in structure and function, including unknown receptors VDR forms subfamilies within the nuclear receptor bar family with retinoic acid receptor (RAR), 9-cis retinoic acid receptor (RXR) and thyroid hormone receptor (TR) .

R A Rや T Rと同様に、 V D Kは R X Rとへテロダイマ一を形成することが知られている，これらのへテ口ダイマ一は異なってはいるが類似の標的ェンハンサ —エレメントと結合するこの標的ェンハンサ一エレメントは 2つの反復するコ Like RAR and TR, VDK is known to form a heterodimer with RXR. These heterodimers are different but similar target enhancers — which bind to the element. One element consists of two repetitive commands.

差替え用紙（規則 26) ァ AGGTCAモチーフ（または関連の 6塩基からなるモチーフ）からなつている.： 2つのコアモチーフの間に存在するスぺ一サ一は R X R/V D Rへテ口ダイマ一の場合には 3 b p (D R 3) であり、 1¾ 1¾ノ丁1¾では4 （DR4) であり、 {¾乂 1 ノ1^ 1¾では2 （DR 2) および 5 b p (DR 5) である。このスベーサ一の違いにより、標的ェンハンサ一エレメントを認職するための核内レセプターを区別する（Umesono et al. , Cell 65:1255-1266, 1991; Rastineja d et al. , ature 375:203 - 211， 1995) 。 Replacement form (Rule 26) The AGGTCA motif (or a related 6-base motif) consists of: The space between the two core motifs is 3 bp (RXR / VDR) It is 4 (DR4) for 1¾1¾1¾1 丁 and 2 (DR2) and 5 bp (DR5) for {¾A1 11111¾. Based on this difference, the nuclear receptor for recognizing the target enhancer element is distinguished (Umesono et al., Cell 65: 1255-1266, 1991; Rastinejad et al., Ature 375: 203- 211, 1995).

上述した RX Rと VDRとのへテロダイマ一形成に加えて、 VDRはいくつ力のビタミン Dレスポンスエレメント（VDRE) においてホモダイマーを形成し、これはビタミン Dに 2つのシグナル伝達経路の存在することを示唆する（Carber g et al . , ature 361： οο7-66ϋ, 1993； Towers et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6310-6311, 1993) 。 In addition to the formation of the heterodimer between RXR and VDR described above, VDR forms a homodimer in several potent vitamin D response elements (VDREs), indicating that vitamin D has two signaling pathways. Suggest (Carber et al., Ature 361: ο7-66ϋ, 1993; Towers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6310-6311, 1993).

これらのレセプターの機能上および構造上の類似性にもかかわらず、現在までに V D Rタンバク質ではただ 1つのタイプが見いだされているのみである。一方、 RAR、 RXRや TRでは複数のサブタイプならびにこれによりコードされるタンパク質が変化した形のアイソフォームが見いだされている（Kastner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2700-2704, 1990; Leroy et al. , E B0 J. 10: 59-69, 1991 ; Zelent et al. , EMB0 J. 10:71 - 81， 1991) - RARおよび T Rのアイソフォームは選択的スプライシングおよび Zまたは異なるプロモーターの制御により生じると考えられている. また、一過性発現アツセィを用いる機能的分析によると、レセプタ一アイソフォーム間では転写促進活性が異なることが示されている（Nagpal, et al. , Cell 70:1007-1019, 1992) , さらに、 RARおよび RX Rのレセプタ一アイソフ； j -一ムゃサブタイブを欠失するマウス系を用いる遗伝実験から、レチノイン酸シグナル経路に及ぼす各サブタイプやアイソフォームの組織特異的ならびに発生段階特異的な役割が明らかとなった（Kastner et al. , Cell 78:987-1003, 1994) , したがって、核內レセブターのサブタイプおよびァイソフォームはリガンドの生物学的作用を区別して調節しているように思われる， V D Rのインビトロでの機能的分析 (Nakajima et al. , Μυΐ. Endocrinol. 8: Despite the functional and structural similarities of these receptors, only one type of VDR protein has been found to date. On the other hand, in RAR, RXR and TR, multiple subtypes and isoforms with altered proteins encoded by them have been found (Kastner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2700-2704, 1990; Leroy et al., EB0 J. 10: 59-69, 1991; Zelent et al., EMB0 J. 10: 71-81, 1991)-Alternative splicing of RAR and TR isoforms And the control of Z or different promoters. In addition, functional analysis using transient expression assays has shown that the transcription promoting activity differs between the receptor and the isoform ( Nagpal, et al., Cell 70: 1007-1019, 1992), and furthermore, retinoic acid signaling pathway from a transmission experiment using a mouse system lacking the receptor for RAR and RXR; Effect of each subtype and isoform Specific and stage-specific roles have been elucidated (Kastner et al., Cell 78: 987-1003, 1994); therefore, nuclear receptor subtypes and isoforms may In vitro functional analysis of VDR that appears to be differentially regulated (Nakajima et al., Μυΐ. Endocrinol. 8:

差替え用紙（規則 26) 1 9-172, 1994) ならびに遺伝性 1， 25 (OH) ₂D₃耐性佝僂病（HVDRR) 患者に見られる遺伝的突然変異（Kristjansson et al. , J. Clin. Invest. 92 : 1 2-16, 1993) を用いることにより、ビタミン Dシグナル伝達経路にとっての VD Rの重要性が示されている ₃ また最近になって、ヒト VDR遺伝子（h VDR) の第 8イントロンにマッピングされる対立遺伝子の変異体が、ォステオカルシン (骨形成やその維持に関与するタンパク質）の循環と骨密度に密接に関連することが報告されている（Morrison et al. , ature 367:284-287, 1994) ₃ これらの知見 (こ基づき、彼らは h VDR遗伝子の対立遣伝子変異体を用いて骨密度を予測し、これを成人の骨折危険度予測に用いることを提案している。ヒト VDR遣伝子の対立遺伝子の相違が原因となるスプライシングの変化による mRN Aの 3，非翻訳領域（じ TR) の配列の変化によって、転写の半減期が異なる可能性を彼らは示唆しているが、対立遺伝子の変異がビタミン Dのシグナル経路にどのように影饗するかについての分子生物学的な研究はなされていない。 Replacement form (Rule 26) 1 9-172, 1994) and hereditary _{1, 25 (OH) 2 D} 3 resistance rickets (HVDRR) genetic mutations seen in patients (Kristjansson et al, J. Clin Invest 92:... 1 2-16 , 1993) is used, becomes VD significance also ₃ have recently been shown in R for the vitamin D signaling pathway, alleles that map to the eighth intron of human VDR gene (h VDR) Have been reported to be closely related to osteocalcin (a protein involved in bone formation and maintenance) and bone density (Morrison et al., Ature 367: 284-287, 1994) ₃ Based on these findings (based on this, they propose to use the allelic variant of the hVDR 遗 gene to predict bone density and use this to predict fracture risk in adults. 3, untranslated region of mRNA due to splicing changes caused by differences in gene alleles Although they suggest that alterations in the sequence of (TR) may alter the half-life of transcription, the molecular organism describes how allelic mutations affect the vitamin D signaling pathway. No scientific studies have been done.

したがって、ビタミン Dの広範な効果や 1， 2 5 (OH) ₂D ₃の種々の代謝誘導体を考えると、ビタミン Dの作用に影饗する VDRタンパク質のサブタイプやアイソフォームが存在する可能性がある。 Therefore, extensive effect and 1 of vitamin D, 2 5 (OH) Given the various metabolic derivative conductors ₂ D _3, may exist subtypes or isoforms of VDR protein that Kagekyo the action of vitamin D There is.

多くの核內レセプタ一において終止コドンを含むェキソンは他のェキソンに比ベて長さが長いことが知られている。この最終ェキソンおよびその前後のィン卜口ンの塩基配列には種々の遺伝的多型が知られているこの遣伝的多型は非コード領域に生じる力、あるいはコードされるアミノ酸は変化しない場合が多いが、多型による塩基の変異により mRN Aの安定性および発現量が変化することが知られている。塩基の変化による疾患と関連した異常なスプライシングに関しては、 1 ) ェキソン . スキッビング、 2) 隠れたスプライス都ィ iの活性化、 3) イントロン内における偽ェキソンの生成、 4) イントロンのェキソン化、の 4つが知られており、多くの疾患と関連している,. 特に長いェキソンの前後において異常なスプライシングが起きやすい It is known that exons containing a termination codon in many nuclear receptors are longer than other exons. Various genetic polymorphisms are known in the nucleotide sequence of the final exon and the introductory front and rear of the exon. In many cases, it is known that mutations in bases due to polymorphisms alter mRNA stability and expression level. For aberrant splicing associated with disease due to base changes, 1) exon skimming, 2) activation of hidden splice city i, 3) generation of pseudo-exons within introns, 4) intronic exons. Is known to be associated with many diseases. Abnormal splicing is particularly likely to occur around long exons.

上述したように、核内レセブターにおける mRNAの多型については、 T R、 RA R、 R X Rなどでは遺伝子が異なる種々のサブタイプが存在し、さらに個々 As described above, with regard to mRNA polymorphism in nuclear receptors, there are various subtypes having different genes in TR, RAR, RXR, etc.

差替え用紙（規則 26) の遺伝子から選択的スプライシングによる m R N Aの多型が生理的条件で生じることが知られている，また、これによりコードされるタンパク質が変化してアイソフォームが生成したり、 mRN Aの安定性が変化し、より精緻な遺伝子発現調節に寄与していると考えられる。 Replacement form (Rule 26) It is known that mRNA splicing can occur under physiological conditions due to alternative splicing from other genes. In addition, the encoded protein changes to produce isoforms and mRNA stability. Is thought to contribute to more precise regulation of gene expression.

しかしながら、ビタミン Dレセプタ一（VDR) ではこのような現象はまだ知られていないしたがって、本発明の目的は、 VD Rの選択的スプライシングにより生じるァイソフォームの有無を検討し、併せてその機能を研究することにある発明の開示 However, such a phenomenon is not yet known in the vitamin D receptor (VDR). Therefore, an object of the present invention is to examine the presence or absence of an isoform caused by alternative splicing of VDR, and to examine its function. DISCLOSURE OF THE INVENTION

上記目的を達成するために、本発明者らは正規の（canonical) ラット VDR (以下において r VDR 0という）の種々の領域をコ一ドする DNA断片および DN A結合ドメイン中の Pボックスのオリゴヌクレオチド（Parker, Curr. Opin. Cell Biol. 5:499-504, 1993) を用いて、各種ネズミおよび鳥類組織由来の c D N Aライブラリーをスクリーニングすることにより、新規な VDRァイソフォームをコ一ドする遺伝子を単離し、その構造を決定することができた。 In order to achieve the above object, the present inventors have designed a DNA fragment encoding various regions of canonical rat VDR (hereinafter referred to as rVDR0) and a P-box in the DNA binding domain. By screening cDNA libraries derived from various murine and avian tissues using oligonucleotides (Parker, Curr. Opin. Cell Biol. 5: 499-504, 1993), new VDR isoforms can be encoded. The isolated gene was isolated and its structure could be determined.

また、この遺伝子を適当なベクターに揷入した後、この発現べクタ一により形質転換された形質転換体を培養し、産生された目的タンパク質を分離、精製することにより新規な VD Rアイソフォームタンパク質を得ることができたビタミン Dレセプターでこのようなアイソフォームが同定されたのはこれが最初の例である _υ After introducing this gene into an appropriate vector, the transformant transformed by the expression vector is cultured, and the produced target protein is separated and purified to obtain a novel VDR isoform. this such isoforms in vitamin D receptors can be obtained proteins were identified this is the first example _υ

併せて、上記新規な VD Rァイソフォームタンパク質の機能を検討し、これがビタミン Dのシグナル伝達経路をネガティブに調節することを確認した In addition, the function of the novel VDR isoform protein was examined, and it was confirmed that this function negatively regulates the vitamin D signaling pathway.

したがって、本発明は、 VDRァイソフォームタンパク質をコードする遣伝子を提供する- 本発明の好ましい遺伝子は、配列番号 1に示すアミノ酸配列をコ一ドするヌクレオチド配列、または配列番号 1に示すァミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したァミノ酸配列であってビタミン Γ)レセプタ一アイソフォ一ムタンパク質活性を有すろタンパク質をコ一ドするヌクレオチド配列、あるいは Accordingly, the present invention provides a gene encoding a VDR isoform protein-a preferred gene of the present invention is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence in which a part of the acid sequence has been substituted, deleted or added, and a nucleotide sequence encoding a protein having vitamin i) receptor isoform protein activity, or

差替え用紙（規則 26) これらにハイプリダイズするヌクレオチド配列を含む DN Aであり、二の遣伝子はラッ卜に由来する。このようなラッ卜由来の好ましい遗伝子は配列番号 2に示すものである本発明の好ましい遺伝子はまた、配列番号 3に示すヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダィズするヌクレオチド配列を含む DN Aであり、この遺伝子はヒ卜に由来する。 Replacement form (Rule 26) These are DNAs containing nucleotide sequences that hybridize to them, and the second gene is derived from rat. A preferred gene derived from such a rat is that shown in SEQ ID NO: 2. A preferred gene of the present invention is also a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a nucleotide obtained by partially substituting, deleting or adding the nucleotide sequence. A DNA comprising a sequence or a nucleotide sequence that hybridizes thereto, the gene being derived from a human.

本発明はまた、 VDRァイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を含む組換えべクタ—を提供する本発明はさらに、 VDRァイソフォームタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する：本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を含む組換えべクタ一によって形質転換して得られた形質転換体を培養することによつて得られる VD Rアイソフォームタンパク質を提供する。 The present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding a VDR isoform protein. The present invention further provides a recombinant vector comprising a gene encoding a VDR isoform protein. Prokaryotic or eukaryotic host cells are provided: The invention further provides for culturing transformants obtained by transformation with a recombinant vector containing a gene encoding a VDR isoform protein. A VDR isoform protein obtained by the above method.

本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を認識する抗体を提供する本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を用いた骨密度の診断方法を提供する。 The present invention further provides an antibody recognizing a VDR isoform protein. The present invention further provides a method for diagnosing bone density using a VDR isoform protein.

本発明はさらに、 VDRアイソフォームタンパク質を用いたビタミン D様物質のスクリーニング法を提供する- The present invention further provides a method for screening a vitamin D-like substance using a VDR isoform protein.

図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

図 1は、 r VDR 0およびラット腎臓 c DNAライブラリ一から単離された r VD R 1の c DNAのヌクレオチドおよびァミノ酸配列を示す。 FIG. 1 shows the nucleotide and amino acid sequences of rVDR0 and rVDR1 cDNA isolated from a rat kidney cDNA library.

図 2は、ェキソン 7〜9近傍のラット VD Rゲノム領域および選択的スブライシングによって生じた 2つの r VDRァイソフォーム（ r VD R Oおよび r VD R 1 ) のタンハク質の構造を示す。 r V【）Rの Λ〜Ε領域およびそのアミノ酸残基を模式的に示すラット VDRゲノム領域の制限酵素部位の Sは S ma I を、【Iは H i n d HIを、 Kは K p n I を、 Pは P s t 1 を表す,， FIG. 2 shows the rat VDR genomic region near exons 7-9 and the protein structure of the two rVDR isoforms (rVDRO and rVDR1) generated by alternative slicing. r V [) R schematically shows the R to Ε regions of R and their amino acid residues. S: SmaI, I: HindHI, K: KpnI , P represents P st 1 ,,

図 3は、 r V D R 0および r V D R 1転写物の発現を、ラット腸および腎臓か Figure 3 shows the expression of rVDR0 and rVDR1 transcripts in rat intestine and kidney.

差替え用紙（規則 26) らのポリ A ( + ) mRN Aを用いてノーザンプロットで分析した図（電気泳動の写真）である。 Replacement form (Rule 26) FIG. 3 is a diagram (photograph of electrophoresis) analyzed by Northern Plot using these poly A (+) mRNAs.

図 4は、 CATアツセィを用いた、 r VDROの r VDR 1に対するドミナントネガティブ活性試験の結果を示す。 FIG. 4 shows the results of a dominant negative activity test of rVDRO against rVDR1 using CAT technology.

図 5は、 CATアツセィを用いた、 r VDR 1の用量依存的活性試験の結果を示す。 FIG. 5 shows the results of a dose-dependent activity test of rVDR1 using CAT assay.

図 6は、 CATアツセィを用いた、 r VDR 1の甲状腺ホルモンおよびレチノィン酸シグナリング経路に及ぼす試験の結果を示す。 FIG. 6 shows the results of a test using CAT Atsee on rVDR1 on thyroid hormone and retinoic acid signaling pathways.

図 7は、 r VD R 1のドミナントネガティブ活性が配列特異的であることを示すグラフである， Figure 7 is a graph showing that the dominant negative activity of rVDR1 is sequence-specific,

図 8は、大腸菌中で r V D R 0および r V D R 1を G S T融合タンパク質として発現させた試料（G ST_ r VDR Oおよび G ST— r VDR l ) 、ならびに卜ロンビンで消化し、精製して得た r VDROおよび r VDR 1試料を用いて、ポリアクリルアミド—SDSゲルで測定した分子量を示す（電気泳動の写真）。図 9は、 DR 3丁をプローブとして用い、種々の量の精製マウス RX Rひ (R X R) 、精製 r VDR 0および r VD R 1で行ったゲルシフトアツセィの結果を示す（電気泳動の写真）。 Figure 8 shows samples obtained by expressing rVDR0 and rVDR1 as GST fusion proteins in Escherichia coli (GST_rVDRO and GST-rVDRl), and digested with trombin and purified. The molecular weight measured on a polyacrylamide-SDS gel using rVDRO and rVDR1 samples was shown (photograph of electrophoresis). Figure 9 shows the results of gel shift assay performed on various amounts of purified mouse RXR (RXR) and purified rVDR0 and rVDR1 using three DRs as probes. ).

図 1 0は、 DR 4および D R 5をブローブとして用い、種々の量の精製 r V D R 1、ニヮトリ T Ra (T R) およびマウス R A Rひ（RAR) で行ったゲルシフトアツセィの結果を示す（電気泳動の写真）。 FIG. 10 shows the results of gel shift assay performed on various amounts of purified rVDR1, nitrile T Ra (TR) and mouse RAR (RAR) using DR4 and DR5 as probes. Photo of electrophoresis).

図 1 1は、大腸菌にて合成した組換え r VD Rタンパク質（ r VDR Oまたは r V D R 1 ) と、 [³H] でラベルした 1 , 2 5 ( O H ) , Dn 1 n Mと、ラベルしていない 1， 2 5 (OH) をいろいろな濃度で加え、 4'⁵C、 1 6時間インキュべ一卜し、結合しなかったビタミン Dを遠心分離にて除き、組換え r VD Rタ質に結合したリガンドの放射活性を測定した結果を示す発明を実施すろための最良の形態 Figure 1 1 is a synthetic recombinant r VD R protein in E. coli (r VDR O or r VDR 1), 1, 2 5 (OH), and Dn 1 n M labeled with ^[3 H], and label in addition no 1, 2 5 (OH) at various concentrations, 4 ^'5 C, 1 6 hour ink Interview base and one Bok, except vitamin D not bound by centrifugation, the recombinant r VD R data Showing the results of measuring the radioactivity of a ligand bound to a substance Best mode for carrying out the invention

本発明では V D Rァインフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子を以下の手順 In the present invention, a gene encoding a VDR form protein is prepared by the following procedure.

差替え用紙（規則 26) によって得ることができた。しカゝし、本発明の遺伝子を得るには、これに限定されず、後述するように本発明の遺伝子を発現する組織、細胞などから当業者に公知の方法を用いて c D N Aを調製することができる。 Replacement form (Rule 26) Was able to get by. However, the method for obtaining the gene of the present invention is not limited to the method described above. can do.

このようにして、クローン化された V D Rアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子は適当なベクター D N Aに組み込むことにより、他の原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換させることができる。 In this way, the gene encoding the cloned VDR isoform protein can be transformed into other prokaryotic or eukaryotic host cells by incorporating it into the appropriate vector DNA.

さらに、これらのベクターに適当なプロモータ一および形質発現に係わる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することができる：また、目的とする遺伝子の他にポリペプチドをコードする遣伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げ、精製工程中で適当な処理を施すことにより、目的のタンパク質を切り出すことも可能である。後述する実施例では G S T融合タンパク質として発現させ、精製した後、 G S Tを除去して V D Rアイソフォームタンパク質を単離した。 Furthermore, by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors, the gene can be expressed in each host cell: In addition, the polypeptide encodes a polypeptide in addition to the target gene. By linking the gene and expressing it as a fusion protein, it is also possible to cut out the target protein by facilitating purification, increasing the expression level, and performing appropriate treatment in the purification process. In the examples described below, after expressing and purifying as a GST fusion protein, GST was removed and the VDR isoform protein was isolated.

一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遗伝子等で知られているように、多型現象を示すと考えられ（例えば、 N i shi等、 J. Biochem. 97 15 198 5)、この多形現象によって 1個またはそれ以上のァミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあってもァミノ酸は全く変わらない場合もある。 In general, eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism as is known in human interferon genes (eg, Nishi et al., J. Biochem. 97 15 198 85). One or more amino acids may be replaced by a polymorphism, or the nucleotide sequence may change but the amino acid may not change at all.

また、配列番号 1のァミノ酸配列の中の 1個またはそれ以上のァミノ酸を欠くかまたは付加したボリぺブチドあるレ、はァミノ酸が 1個もしくはそれ以上のァミノ酸で置換されたポリベプチドでも V D Rアイソフォームタンパク質の活性を有することがある。例えば、ヒトインタ一ロイキン 2 ( I L— 2 ) 遺伝子のシスティンに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当する配列に変換して得られたポリペプチドが〖し一 2活性を保持することも既に公知となっていろ（Wang等、 Sc ience, 224 1431 1984) ■ In addition, one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that lack or add one or more amino acids have amino acids replaced by one or more amino acids. Polypeptides may also have VDR isoform protein activity. For example, it has already been known that a polypeptide obtained by converting a nucleotide sequence corresponding to the cysteine of the human interleukin 2 (IL-2) gene to a sequence corresponding to serine retains more than 12 activities. (Wang et al., Science, 224 1431 1984) ■

また、真核細胞で発現させた場合その多くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を 1ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるがこの場合、 V D Rアイソフォームタンパク質の活性を有することがあろ,， In addition, when expressed in eukaryotic cells, sugar chains are often added, but the addition of sugar chains can be regulated by converting one or more amino acids. In this case, VDR isoform protein May have activity,

さらに、得られたポリベプチドカ； V D Rアイソフォームタンパク質活性を有し、 Further, the obtained polypeptide has VDR isoform protein activity,

差替え用紙（規則 26) 配列番号 1に示されたアミノ酸配列を含むボリべプチドをコ一ドする遺伝子または配列番号 2または 3に示すヌクレオチド配列とハイブリダイズする遗伝子も本発明に含まれる：なお、ハイブリダィゼ一シヨン条件は、通常行われているプロ —ブハイプリダイゼ一ションの条件を適用することもできる（例えば Molecular Cloning ： A し aboratory Manual, SaniDrook ら、し old spring Habor し aboratorv Press, 1989) 。 Replacement form (Rule 26) The present invention also includes a gene that encodes a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a gene that hybridizes with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3. The conditions may be the same as those used in ordinary probe hybridization (eg, Molecular Cloning: A and aboratory Manual, SaniDrook et al., And old spring Habor and aboratorv Press, 1989).

本発明の発現ベクターは、複製起源、選択マ一カー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモータ一、 RN Aスブライス部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいる。 The expression vector of the present invention contains an origin of replication, a selection marker, a promoter located in front of the gene to be expressed, an RNA slice site, a polyadenylation signal, and the like.

本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌 (Escherichia col i) 、ノヽシノレス · ズ'ノ、'チリス (Baci 1 us subtil i s) 、ノくシルス 'サ一モフィルス (Bacillus thermophi lus) 等が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばサッカロミセス ·セレビシエー (Saccharomvces cerevisiae) 等が挙げられ、哺乳動物由来の宿主細胞としては、例えば CO S細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、 C 1 2 7細胞、 3 T 3細胞、 H e 1 a細胞、 B HK細胞、ナバルバ細胞などが挙げられるなお、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行えばよいつ Prokaryotic host cells among the hosts used in the expression system of the present invention include, for example, Escherichia coli, Nosinoles zuno, thyris (Baci 1 us subtil is), Mofilus (Bacillus thermophi lus) and the like. Among eukaryotes, examples of host cells for eukaryotic microorganisms include Saccharomyces cerevisiae, and examples of mammalian host cells include COS cells and Chinese hamster ovary ( CHO) cells, C127 cells, 3T3 cells, Hela cells, BHK cells, Nabarba cells, etc.The transformant of the present invention is cultured under culture conditions suitable for host cells. Can be selected as appropriate

以上のようにして目的とする VD Rアイソフォームタンパク質をコードする遗伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生した VDRァイソフォームタンパク質は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで精製することができる。 As described above, the transformant transformed with the gene encoding the desired VDR isoform protein is cultured, and the produced VDR isoform protein is isolated from the inside or outside of the cell and homogenized. Can be purified.

なお、本発明の目的タンパク質である VDRアイソフォームタンパク質の分離 •精製は、通常の蛋白質で用いられる分離 ·精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない例えば各種クロマトグラフィー、限外據過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれて用いることができる.， The separation and purification of the VDR isoform protein, which is the target protein of the present invention, may be carried out by using the separation and purification methods used for ordinary proteins, and is not limited at all. For example, various types of chromatography, Reliance, salting, dialysis, etc. can be appropriately selected and combined.

VD Rアイソフォームタンパク質の活性を測定するには、例えば以下に記載する、 C AT (クロラムフエニコ一ルァセチル卜ランスフェラ一ゼ）遺伝子をレポ —ター遺伝子として用いろ遺伝子転写活性測定法であろ一過性発現ァッセィ（C To measure the activity of the VDR isoform protein, use the CAT (chloramphenico-l-acetyltransferase) gene as a reporter gene, for example, as described below, and use the gene transcription activity measurement method. Sexual expression assay (C

差替え用紙（規貝リ26) ATアツセィ）を用いて評価することができる。 Replacement paper (26) AT Atsushi).

H e L a細胞をダルベッコの改変イーグル培地（フエノールレッド不含、 5 % デキストランコ一ティングチヤコール処理をしたゥシ胎児血清補充）中に維持する。リン酸カルシウム法により全量 2 0 μ gの DNAを用いて 9 c mのぺトリ皿で 4 0— 5 0%コンフルェントの細胞に形質転換する。用いる DN Aは CATレポ一タ一プラスミド 2 μ gとレセプタ一発現ベクター 5 00 n gを、さらに形質転換の効率によるバラツキを正規化するための内部対照として用いる —ガラクトシダーゼ発現べクタ一である p CH 1 0 0 (Pharmacia) 3 / gも加え、 DNA の全量を合わせるためのキヤリアとして B l u e s c r i b e M 1 3 - (Stra tagene) を使用する。 Maintain the HeLa cells in Dulbecco's modified Eagle's medium (without phenol red, supplemented with 5% dextran coating charcoal-treated fetal serum). Transform 40-50% confluent cells in a 9 cm Petri dish using a total of 20 μg DNA by the calcium phosphate method. The DNA used is 2 μg of CAT reporter plasmid and 500 ng of the receptor expression vector, as well as an internal control to normalize for variation due to transformation efficiency—the galactosidase expression vector. Add a certain p CH 100 (Pharmacia) 3 / g and use Bluescribe M 13-(Stra tagene) as a carrier to match the total amount of DNA.

形質転換の 1時間後および各培地交換時に、培地中にリガンド（オール卜ランスレチノィン酸 1 μ Μあるいは甲状腺ホルモン 0. 1 μ Μあるいはビタミン D 0. 1 Μ ) を加える。リン酸カルシウム沈殿化 DN Αとともに 2 0時間インキュべ —卜した後、細胞を新しい培地で洗浄し、さらに 2 0〜 2 4時間インキュべ一卜する。凍結乾燥により細胞抽出物を調製し、文献（Sasaki et al. , Biochemistr y 34:370-377, 1995) 記載の方法で一ガラクトシダ一ゼ活性を正規化した後、 C A Tをァッセィする。 One hour after transformation and at the time of each medium change, add ligand (1 μl of alltrans retinoic acid or 0.1 μm of thyroid hormone or 0.1% of vitamin D) to the medium. After incubating with calcium phosphate-precipitated DNA for 20 hours, wash the cells with fresh medium and incubate for another 20 to 24 hours. A cell extract is prepared by lyophilization, and the galactosidase activity is normalized by the method described in the literature (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995), and the CAT is assayed.

本発明の VD Rアイソフォ一ムタンパク質を認識する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい，ホリクローナル抗体の作製にあたっては、常法（例えば、新生化学実験講座 1、タンパク質 I 、 p 3 8 9〜 3 9 7、 1 9 9 2参照）に従い、抗原（V D Rァイソフォームタンパク質）をゥサギ、ラット、ャギ、ヒッジ、マウスなどの動物に免役し、生体内に産生される抗体を採取することにより得ることができる。得られた抗体の力価は当業界で公知の方法により測定できる。モノクローナル抗体の作製も常法（例えば、 Kohler et al. , ature 256:496, 1 75; Kohlcr et al. , Eur. J. Immunol. 6:511, 19 76) に従って行うことができろ.，すなわち、上述したように動物を免疫して抗体分泌体細胞を得て、これを骨髄腫細胞系と融合し、抗体を産生するハイプリド一マを選択する二とにより行う。 The antibody recognizing the VDR isoform protein of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In the production of a polyclonal antibody, a conventional method (for example, Neogene Chemistry Laboratory Course 1, Protein According to I, p389-3997, 1992), the antigen (VDR isoform protein) is immunized to animals such as egrets, rats, goats, sheep, mice, etc. It can be obtained by collecting the produced antibody. The titer of the obtained antibody can be measured by a method known in the art. Monoclonal antibodies can also be prepared according to a conventional method (eg, Kohler et al., Feature 256: 496, 175; Kohlcr et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976). The animals are immunized as described above to obtain antibody secreting somatic cells, which are fused with a myeloma cell line, and a hybridoma producing the antibody is selected.

差替え用紙（規則 26) また、このようなモノク口一ナル抗体およびボリク口一ナル抗体の結合性断片、例えば、 F a b、 F ( a b ' ) F ν断片も本発明の抗体として使用できる，抗体断片は完全な抗体をパパインまたはペプシンなどで消化して常法により得ることができる。 Replacement form (Rule 26) In addition, binding fragments of such a monoclonal antibody and a monoclonal antibody, for example, Fab, F (ab ') Fv fragment can also be used as the antibody of the present invention. The antibody can be obtained by a conventional method by digesting the antibody with papain or pepsin.

本発明を以下において具体的に説明する。 The present invention will be specifically described below.

VD Rアイソフォームタンパク誓をコ一ドする i音伝子の単離 Code for VDR isoform protein oath Isolation of the i sound gene

正規の（canonical) ラット V D R ( r VD R O) のリガンド結合ドメイン（S asaki et al. , Biochemistry 34:370-377, 1995) を用いて、 r VD R O c D N Aと密接に関連する 1 0個の陽性クローンを単離した。次いで r VD R Oタンパク質 (Burmester et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988) をコ一ドするェキソンに対応するプライマー対を用いるポリメラーゼチヱインリアクシヨン（P C R) によってこれらのクローンを分析し、同じアイソフォーム (以下において r V D R 1 という）をコ一ドする 2つのクローンを見いだした。 r VD R Oと r VD R l の配列決定を行い、 r V D R 1に特異的な 2 8 5ヌクレオチドを同定した（図 1 ) 。 r VD R 1では r V D R 0のリガンド結合ドメィンに 1 1 3 4 b pが揷入されていたが、 r V D R 1のその他の配列は r VD R 0 のオープンリーディングフレームと同一であった（図 1 ) Using the ligand-binding domain of the canonical rat VDR (rVDRO) (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995), 10 10 Positive clones were isolated. Then, a polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair corresponding to an exon encoding rVDRO protein (Burmester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988). ) Analyzed these clones and found two clones encoding the same isoform (hereinafter referred to as rVDR1). The sequence of rVDRO and rVDRI was identified to identify 285 nucleotides specific for rVDR1 (Figure 1). In rVDR1, 1134 bp was inserted in the ligand binding domain of rVDR0, but the other sequences of rVDR1 were identical to the open reading frame of rVDR0 (Fig. 1)

r VD R遣伝子のゲノム構造と配列とを分析することにより、この挿入された配列がェキソン 8と 9の間にあるイントロンに由来すること（図 2 ) 、ならびにこのェキソンーィントロンの間の配列が C h a m b o nの一般則（イントロンの両側の 5 ' 側が GT、 3 ' 側が AGとなる）に合致し、したがつてこのアイソフオームが選択的スプライシングによる一次転写物により生じたことを示唆する遺伝子座の f V D R lのェキソンとしてイントロン 8を保持することは、遣伝子座の最も下流領域に位置する比較的大きなェキソンを生じろことになるラット V D Rのこの遺伝子構造は、大きな最終ェキソンをもつこのレセブタ一スーパ一ファミリーの他のメンバ一の構造とよく似ている (Gronemeyer, Annu. Rev. Gen el. 25:89-123, 1991) ., Analysis of the genomic structure and sequence of the rVD R gene revealed that the inserted sequence was derived from the intron between exons 8 and 9 (Figure 2), and that the exon-intron Match the Chambon's general rule (GT on the 5 'side on both sides of the intron and AG on the 3' side), thus confirming that this isoform was generated by the primary transcript by alternative splicing. Suggestion Retaining intron 8 as an exon of fVDRl at the locus would result in a relatively large exon located at the most downstream region of the locus. It is very similar to the structure of the other members of this receptor family with the final exon (Gronemeyer, Annu. Rev. Gen. 25: 89-123, 1991).

したがって、本発明の V D Rァイソフォームタンパク質（ r V D R l ) をコー Therefore, the VDR isoform protein (rVDR1) of the present invention is coded.

差替え用紙（規則 26) ドする遺伝子は配列番号 2に示すヌクレオチド配列、ならびに配列番号 1 に示すアミノ酸配列をもつ。 r VD R 1の推定アミノ酸配列は r VD R 0と比べて、 C 末端の 8 6アミノ酸を欠失し、 1 9アミノ酸を余分にもつ：これは、ェキソン 8 とェキソン 9の間に存在するイントロンの 1 1 34 b pに位置するストップコドンによって翻訳が停止したためであると考えられる（図 1および図 2参照）。次いで、 r VD R 1のこのェキソンをノーザンブロッ卜の特異的プローブとして用いて r VDR l転写物（Sasaki et al.， Biochemistry 34:370-377, 1995) の存在を検出した。その結果、この転写物は r VD R 0が発現している賢臓と腸で検出された（図 3 ) ： —方、ェキソン 6と 7の間にあるィントロン 6の 1 04 2 b pを含む非特異的プローブを用いると特異的転写物は検出できなかった。特異的バンドをデンシトメータ一で分析したところ、 r VDR 1転写物の量は r V DR 0の量の 1 1 5〜 1 Z20であった。また、各種組織由来のボリ（A) ⁺m RN Aを逆転写酵素を用いて c DN Aとした後、 PCRで增幅し、細胞質ゾルの mRNA分画中の r VDR 1転写物を検出し、 r VDR 1転写物の存在を確認した _ύ したがって、 r VDR 1転写物は転写のための成熟 mRN Αとして細胞質ゾル中に局在していることが示唆された。 Replacement form (Rule 26) The gene to be loaded has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The deduced amino acid sequence of rVDR1 lacks 86 amino acids at the C-terminus and has an additional 19 amino acids compared to rVDR0: this is the intron present between exon 8 and exon 9. This is probably because translation was stopped by the stop codon located at 1134 bp in (Fig. 1 and Fig. 2). This exon of rVDR1 was then used as a Northern blot specific probe to detect the presence of the rVDR1 transcript (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995). As a result, this transcript was detected in the stomach and intestine where rVDR0 was expressed (Fig. 3): On the other hand, the nontranscript containing 1042 bp of intron 6 between exons 6 and 7 was detected. No specific transcripts could be detected using specific probes. Analysis of the specific band with a densitometer revealed that the amount of rVDR1 transcript was between 115 and 1Z20 of the amount of rVDR0. In addition, bor (A) ⁺ mRNA from various tissues was converted to cDNA using reverse transcriptase, and then amplified by PCR to detect rVDR1 transcript in the cytosolic mRNA fraction. The presence of the _rVDR1 transcript was confirmed. Therefore, it was suggested that the rVDR1 transcript was localized in the cytosol as the mature mRN for transcription.

r VDR ΐ の機能的役割 r Functional role of VDR ΐ

ヒト VDRの C末端にあるリガンド結合ドメインの正確な位置は 40 3〜4 2 7ァミノ酸残基（ r V D R 0では 39 9〜 4 2 3アミノ酸）にマッピングされるという最近の報告（!Nakajima et al.， Mol. Endocrinol. , 8:159 - 172， 1994) と合致して、インビトロ合成した r VD R 1タンパク質はリガンド結合を示さなかつた（図 1 1 ) A recent report that the exact location of the ligand-binding domain at the C-terminus of human VDR maps to 403-427 amino acid residues (399-423 amino acids in rVDR0) (! Nakajima Consistent with et al., Mol. Endocrinol., 8: 159-172, 1994), the rVDR1 protein synthesized in vitro did not show ligand binding (Fig. 11).

R X Rとのへテ口ダイマ一形成に必要とされる 2つのドメインのうちの 1つ (h e p t a d 9 : r VD R ()では 3 99〜 40 7アミノ酸）は r VD R lにはなかったが、特異的 DNA結合に関与するもう一方の領域（h e p t a d 4 ： r VD R Oでは 32 1〜32 8アミノ酸）は r VD R 1に存在していたつ One of the two domains required for the formation of the hepatic dimer with RXR (heptad 9: 399 to 407 amino acids in rVDR ()) was absent in rVDRI, The other region involved in specific DNA binding (heptad 4: 321 to 328 amino acids in rVDRO) was present in rVDR1

そこで、一過'性発現アツセィ（CATアツセィ）（Sasaki et al. , Biochemis try 31:370-377, 1995) を用いて、 r V D R 1の転写促進活性を評価した r V Therefore, the transcriptional promotion activity of rVDR1 was evaluated using transient 'expression (CAT atsey) (Sasaki et al., Biochemis try 31: 370-377, 1995).

差替え用紙（規則 26) DR O、 r V D R 1およびラット RX R αを発現するべクタ一、ならびにコンセンサスなビタミン Dレスポンスエレメント（VDRE) を含む CATレポ一ターブラスミドを調製したこのコンセンサスなビタミン Dレスポンスエレメントは上述した 3 b pのスぺ一サ一（DR3 T) を介して 2つの AGTTCAモチーフが直接連結したものである。このモチーフは AGGTC Aよりも強い VDRの結合モチーフであると言われている（Freedman et al.， Mo]. Endcrinol. , 8:265- 273, 1994) 。その結果、 r VDR 1 自体は転写促進活性を有していなかった。しかし、 r VDR O (0. 5 μ g) と r VDR l ( 2 μ g ) とをコトランスフエクシヨンした場合には、試験したすべての細胞（以下の実施例では代表例として H e L a細胞について示す）において、 r VDR 0によるリガンド誘導の転写促進活性を阻害した（図 4参照）。また、 r VDR Oの存在下（発現べクタ一 0. 5 μ g) に r VD R 1発現べクタ一の添加量を増加すろと、 r VDR lの阻害活性はより顕著になった（図 5参照）。 r VDR 0発現べクタ一を 5 μ g添加したときにもリガンド誘導の転写促進活性は抑制されなかったので（図 5) 、この阻害作用は限られた核内ファクターに対する 2つのアイゾフォーム間の単なる拮抗Replacement form (Rule 26) This consensus vitamin D response element was prepared from a vector expressing DRO, rVDR1 and rat RXRα, and a CAT reporter brasmid containing a consensus vitamin D response element (VDRE). In this example, two AGTTCA motifs are directly linked via the 3 bp spacer (DR3T) described above. This motif is said to be a stronger VDR binding motif than AGGTC A (Freedman et al., Mo]. Endcrinol., 8: 265-273, 1994). As a result, rVDR1 itself did not have transcription promoting activity. However, when rVDR0 (0.5 μg) and rVDR1 (2 μg) were cotransfected, all cells tested (representative in the examples below) In the case of HeLa cells, the activity of rVDR0 to inhibit ligand-induced transcription was inhibited (see FIG. 4). In addition, when the amount of the rVDR1 expression vector was increased in the presence of rVDR0 (0.5 μg of the expression vector), the inhibitory activity of rVDRl became more remarkable (see Fig. 5). r The addition of 5 μg of the VDR0 expression vector did not inhibit ligand-induced transcriptional activity (Figure 5), indicating that this inhibitory effect was due to the two Izoforms against a limited number of nuclear factors. Mere antagonism between

(Tasset et al. , Cell 62:1177-1187， 1990) によるものではない。さらに、本明細書ではデータを記載していないが、 R X Rの 3つのサブタイプ（ α、 β、 γ ) 間では明瞭な差は観察されなかった： (Tasset et al., Cell 62: 1177-1187, 1990). Furthermore, although no data is presented here, no clear differences were observed between the three subtypes of R X R (α, β, γ):

r V D R 1のドミナントネガティブ活性は配列特異的であろ The dominant negative activity of rVDR1 may be sequence-specific.

r VDR 0に対する r VDR】の阻害程度は配列特異的であり、これはヒト · ォステオカルシン VDREよりもマウス . ォステオポンチンについての方が顕著であった：これは VDRホモダイマーがマウス · ォステオホンチンの標的 V D R Eとの結合をより好むためであるとされている（Cheskis et al. , Mole Cell. Biol. 11:3329-3338, 1 94) , A G T T C Aモチーフの方が A G G T C Aモチ一フよりも VDRの結合コアとして優れているという考えは、 D R 3 Tが DR 3 G よりも VDR ['：としてより活性であるという事実からも支持される（図 7参照） The degree of inhibition of rVDR against rVDR0 was sequence-specific, which was more pronounced for mouse osteopontin than for human osteocalcin VDRE: the VDR homodimer was found to bind to the target VDRE of mouse osteohontin. (Cheskis et al., Mole Cell. Biol. 11: 3329-3338, 194), suggesting that the AGTTCA motif is a VDR binding core rather than the AGGTCA motif. Is better supported by the fact that DR3T is more active as VDR [': than DR3G (see Figure 7).

—方、 r V D R 1は同種のレセブターが存在するときには、レチノイン酸のコンセンサスレスポンスエレメント（D R 5) や甲状腺ホルモンのコンセンサスレ On the other hand, rVDR1 is a consensus response element of retinoic acid (DR5) and thyroid hormone consensus when the same receptor is present.

差替え用紙（規則 26) スポンスエレメント（DR4) のリガンド誘導の転写促進活性を抑制しなかった (図 6参照）。同種のレスポンスエレメントが存在するときに、 r VD R lはその他のレチノイン酸レスポンスエレメント（DR l T DR 2) やエス卜ロゲンレスポンスエレメント（コンセンサス E RE) に明瞭な効果を及ぼざなかった。したがって、これらの結果は r VD R 1ァイソフォームが r V D R 0に対するドミナン卜ネガティブレセプターとして作用することを示唆する。 Replacement form (Rule 26) It did not suppress the ligand-induced transcription promoting activity of the spawn element (DR4) (see Figure 6). In the presence of the same type of response element, rVDR1 has no clear effect on other retinoic acid response elements (DRlTDR2) or estrogen response elements (consensus ERE). Did not. Thus, these results suggest that the rVDR1 isoform acts as a dominant negative receptor for rVDR0.

r VP R 1はホモダイマーとして VDREと結合する力；、 RXRとはへテロダイマー榨合体形成しない r VP R 1 binds to VDRE as a homodimer; does not form a heterodimer with RXR

r VDR 1のドミナン卜ネガティブ活性についての分子メ力二ズムを検討するため、コンセンサス VDRE (DR 3丁）との結合活性を試験し、 r VDR Oの結合活性と比較した。 To study the molecular mechanism of dominant negative activity of rVDR1, the binding activity to consensus VDRE (3 DRs) was tested and compared to the binding activity of rVDRO.

このため、遺伝子組換え法により r V D R 0タンパク質と r V D R 1タンパク質とを生産した： r VDR Oおよび r VDR lの c DN Aのオープンリ一ディンダフレームからは、それぞれ 48 KD aおよび 40 KD aのタンパク質であることが予測された：精製した r VD R 0および r V D R 1タンパク質は S D S— P AGEゲル上で予測された分子量の位置に移動した（図 8) 。 For this reason, the rVDR0 and rVDR1 proteins were produced by the genetic recombination method: 48 kDa and 40 kDa, respectively, from the open reading frame of the cDNA of rVDRO and rVDRl. It was predicted to be a KDa protein: The purified rVDR0 and rVDR1 proteins migrated to the expected molecular weight position on the SDS-PAGE gel (Figure 8).

DR 3 Tとの結合試験の結果、精製組換え r VDROタンパク質は、文献（Fr eedman et al. , Viol. Endocrinol. 8:265-273, 1994) に記載するように、 RX R がなくてもホモダイマ一として D R 3丁と結合した（図 9) r VDR lホモダイマ一もこれと同程度に D R 3 Tと結合した。次いで、マウス RX R aを r VD R0に加えると、ヘテロダイマー形成によって DN Λ結合が顕著に增加し、 RX R αに対する特異的モノク口一ナル抗体がこの D Ν Α—へテ口ダイマ一を認識し結合することにより、電気泳動のバンドがシフトした，これによつて複合体中に R X Rが存在することが確認された.，しかしながら、 r VD R lは r RXR ctとヘテロダイマ一を形成する二とができず、二れはヒト VD R ( h VD ) の C末端をもたない突然変異体 (Nakajima ct al. , Moし Endocrinol. 8: 159-172, 199 ■1) と同様に、ヘテロダイマ一形成に必要な C末端ドメインをもたないためであろと思われる。差替え用紙（規則 26) r VDR lは、コンセンサス甲状腺レスポンスエレメント（DR 4) およびレチノイン酸レスポンスエレメント（DR 5) とは特異的結合をせず（図 1 0) 、これは標的ェンハンサーエレメントに対する r VDR 1の特異性が r VDR 0と同じであることを示唆する。 As a result of the binding test with DR 3 T, the purified recombinant rVDRO protein was found to be free of RXR, as described in the literature (Freedman et al., Viol. Endocrinol. Homodimer bound to DR3 (Fig. 9) r VDRl homodimer bound to DR3T to the same extent. Then, when mouse RXRa was added to rVDR0, DNΛ binding was significantly increased by heterodimer formation, and a specific monoclonal antibody against RXRα induced this D ダイ HΝ dimer. Recognition and binding shifted the electrophoretic band, confirming the presence of RXR in the complex. However, rVDR1 formed a heterodimer with rRXRct. It is a mutant that does not have the C-terminal end of human VDR (hVD) (Nakajima ct al., Mo. Endocrinol. 8: 159-172, 199 1). Similarly, it may be because they do not have the C-terminal domain required for heterodimer formation. Replacement form (Rule 26) rVDR1 does not specifically bind to the consensus thyroid response element (DR4) or retinoic acid response element (DR5) (Figure 10), indicating that rVDR1 binds to the target enhancer element. It suggests that the specificity is the same as rVDR0.

VDRでは、 RAR、 1^ 1¾ゃ丁と同様に、 D N Λ結合ドメイン間に形成されるダイマー境界面がその同種のレスポンスエレメントとのレセプターダイマーの結合認識を特定するという従来の観察（例えば、 Rastinejad et al. , Nature 375:203-211, 1995) と今回の結果はよく一致する。 In VDR, similar to RAR, 1 ^ 1¾ ゃ, the conventional observation that the dimer interface formed between the DNΛ binding domains specifies the recognition of receptor dimer binding to its cognate response element (eg, Rastinejad et al., Nature 375: 203-211, 1995) and this result agree well.

転写促進活性アツセィの結果をまとめると、 r VDR lが、ホモダイマ一として標的 VDRE (ビタミン Dレスポンスエレメント）と競合的に結合することによって、ビタミン Dシグナル伝達経路においてドミナン卜ネガティブレセプターとして作用することを示している。 Summarizing the results of the transcriptional activation activity, rVDR1 competitively binds to the target VDRE (vitamin D response element) as a homodimer, and as a dominant negative receptor in the vitamin D signaling pathway. It shows that it works.

本発明で得られた新規ラッ卜 VDRァイソフォーム（ r VDR l ) は選択的スプライシングによって生じた一次 r VDR耘写物であるが、 r VDR 1は r VD R 0ではイントロン 8に存在する余分のェキソンをもつ。この新しいェキソン The novel rat VDR isoform (rVDRl) obtained in the present invention is a primary rVDR tiller produced by alternative splicing, but rVDR1 is present at intron 8 in rVDR0. Has extra exons. This new exon

( r VD R 0中のィントロン 8) のストップコドンは C末端にあるリガンド結合ドメイン（86アミノ酸）の一部を失わせるが、 1 9アミノ酸を付加する。 The stop codon of (intron 8 in rVDRO) loses part of the ligand-binding domain (86 amino acids) at the C-terminus, but adds 19 amino acids.

ヒト V D Rアイソフォームの単離 Isolation of human VDR isoforms

既知のヒ卜 VD Kイントロン 8の酉己歹 lj (W094— 036 3 3号）よりイン卜ロン 8を特異的に增幅するプライマ一をデザインし、ヒトゲノム DNAよりイントロン 8を增幅した。このイントロン 8をランダムプライマ一により ³² P— d C T Pを取り込ませたプロ一ブとして用い、ヒト白血球 c DN Λライブラリ一（C1 oruech社）をスクリ一二ングし、ヒト VD Rイン卜ロン 7、ェキソン 8、イン卜ロン 8を含む c DNA断片を得た. ヒトの場合には、アミノ酸への翻訳の際にィントロン 7全長のフレームが合ってェキソン 8と連結するためにラッ卜の場合と異なり、イントロン 7も保持したアイソフォーム c ΟΝΛの断片をクローニングすろことができた..， From the known human VDK intron 8, a primer was designed to specifically enhance intron 8 based on the structure of the intron 8 (W094-03633), and intron 8 was amplified from human genomic DNA. Using this intron 8 as a probe incorporating ³² P-d CTP by a random primer, screening of human leukocyte cDNII library (C1 oruech) was performed, and human VDR A cDNA fragment was obtained that contained the long intron 7, the exon 8, and the intron 8. In the case of a human, the cDNA was ligated to the exon 8 so that the intron 7 full-length frame was aligned during amino acid translation. Unlike the case of mouse, the fragment of isoform cΟΝΛ which also retained intron 7 could be cloned ..,

得られたし' DN Λ断片のヌクレオチド配列を決定し、配列番号： iに示すヌクレ The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was determined, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: i was determined.

差替え用紙（規則 26) ォチド配列を有することを確認した。 Replacement form (Rule 26) It was confirmed to have the peptide sequence.

ヒ卜の場合、イントロン 7も保持したクローンが得られたことから、他のアイソフォーム（例えば、イントロン 7のみをもつアイソフォーム、イントロン 7と 8をもつアイソフォーム、イントロン 8のみをもつアイソフォームなど）の存在が示唆される-, なお、ヒト VDRァイソフォームにおけるイントロン 7のヌクレォチド配列を配列表の配列番号 4に、またイントロン 8のヌクレオチド配列を配列番号 5に示す。 In the case of a human, since a clone retaining intron 7 was obtained, another isoform (for example, an isoform having only intron 7; an isoform having introns 7 and 8; and having only intron 8) was obtained. The nucleotide sequence of intron 7 in human VDR isoform is shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of intron 8 is shown in SEQ ID NO: 5 in human VDR isoform. .

VD Rアイソフォームの機能とその利用 Functions of VDR isoforms and their use

構造と機能の類似性から、 VDI^tRAR、 RX Rおよび TRとともに核内レセプターフ―パ—ファミリ—の中でサブファミリ—を形成する。しかしながら、 Due to similarity in structure and function, it forms a subfamily in the nuclear receptor family with VDI ^ tRAR, RXR and TR. However,

RAR、尺ゃ丁！^のァィソフォームタンパク質は選択的スプライシングおよびまたは異なるプロモータ一の使用によって組合わされる種々のェキソンからなっているので、 VDRはこのサブファミリ一中では特異なものであるといえるこいくつかの遺伝子では、イントロンをェキソンとして保持すると機能的に異なるァイソフォームタンパク質を生じることが既に知られている（Nakamura et al., Science 257:1138-1142, 1992) 力；、核內レセプタ一遺伝子ス一パ一ファミリ一のレセプタ一ァイソフォームとしてはこれが最初の例である,」このために、 RA R、 RX Rや T Rとは異なり、 V D Rァイソフォームはその c DN Aクロ一ニングがなされたにも拘わらず、その後も長く発見されなかったともの思われる _ 本発明の VD Rアイソフォームタンパク質はビタミン Dシグナル伝達経路においてドミナントネガティブレセプターとして作用する最近の報告（Morrison e t al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6665-6669, 1994) によると、ヒ卜 V DR遺伝子における対立遺伝子の変化が血中ォステオカルシンの濃度と骨密度に密接に関連する。骨密度は骨粗鬆症による骨折の危険性を予測する基準となりうるものであるこの報告によると、骨密度を予測するヒト VDR遺伝子の対立遗伝子変化はイントロン 8に位置するという.. したがって、本発明において得られた r V D R 1がラット V D R遣伝子のィントロン 8を保持することによって生じたものであることは極めて興味深い。本発明の VD Rアイソフォームタンパク質 RAR, Shaku ゃ cho! The VDR is unique in this subfamily because the isoform of ^ consists of various exons that are combined by alternative splicing and / or use of different promoters. In some of these genes, it is already known that retaining introns as exons results in functionally distinct isoform proteins (Nakamura et al., Science 257: 1138-1142, 1992). This is the first example of a receptor isoform of a gene superfamily, '' unlike the RAR, RXR and TR, the VDR isoform has its cDNA clone. Despite the ning, it may not have been discovered for a long time _ The VDR isoform protein of the present invention According to a recent report that acts as a dominant negative receptor in the pathway (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6665-6669, 1994), allelic changes in the human VDR gene are It is closely related to blood osteocalcin levels and bone density. Bone density can be a criterion for predicting the risk of osteoporotic fracture.The report states that allelic changes in the human VDR gene that predict bone density are located in intron 8. It is very interesting that the rVDR1 obtained in the present invention was generated by retaining the rat VDR gene intron 8. VDR isoform protein of the present invention

差替え用紙（規則 26) を用いることによりビタミン Dシグナル伝達経路の調節メカニズムを解明し、また骨密度の改善などに使用することが期待できる。さらに、本発明の VDRアイソフォームタンパク質を用いて骨密度の診断を行うことも可能である： Replacement form (Rule 26) It can be expected to elucidate the regulation mechanism of the vitamin D signaling pathway and to use it to improve bone density. In addition, it is possible to diagnose bone density using the VDR isoform proteins of the invention:

また、本発明の VDRアイソフォームの発現量が種々の疾患と関係していると考えられる，疾患としては、骨粗鬆症、骨折、二次性甲状腺機能亢進症、免疫疾患、皮瘠疾患など VDRが関係していると考えられるすべての疾患におレ、て本発明のアイソフォームの発現の大小が発病と関連のある可能性がある。したがって、本発明の VDRァイソフォームの単離、性状決定はこれらの疾患の解明、治療に大きな意味を有する。 It is considered that the expression level of the VDR isoform of the present invention is related to various diseases. Examples of the diseases include VDR such as osteoporosis, fracture, secondary hyperthyroidism, immune disease, and skin sickness disease. In all diseases considered to be related, the magnitude of expression of the isoform of the present invention may be related to the onset. Therefore, the isolation and characterization of the VDR isoform of the present invention has great significance in elucidating and treating these diseases.

さらには、本発明の VD Rァイソフォームタンパク質を用いて、ビタミン D様物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、本発明の VDRタンパク質をコードする遺伝子を適当な細胞にトランスフニク卜し、該細胞を用いてビタミン D様の作用（例えばカルシウム ·骨代謝作用、分化誘導作用、免疫抑制作用、抗腫瘍作用、脂肪 ·脂質代謝抑制作用）の少なくとも 1つをもつ物質（例えばステロイド、レチノイン酸）をスクリーニングすることができるつ Furthermore, a vitamin D-like substance can be screened using the VDR isoform protein of the present invention. For example, a gene encoding the VDR protein of the present invention is transfected into an appropriate cell, and a vitamin D-like action (eg, calcium / bone metabolism action, differentiation induction action, immunosuppressive action, antitumor (Eg, steroids, retinoic acid) that have at least one of the following actions:

本スクリ一ニング系に本発明の VD Rアイソフォームタンパク質の遺伝子を用いれば，より生理的条件下に近い系を構築できる（実際に緊臓などではアイソフオームは既存の VDRの 1 0分の 1量ほど発現している）ため、既存の VDR遗伝子を用いたスクリ一ユング系よりも精度が上がると考えられる By using the gene for the VDR isoform protein of the present invention in this screening system, a system closer to physiological conditions can be constructed. It is thought that the accuracy will be higher than that of the screening system using the existing VDR gene.

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。実施例 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited thereto. Example

実施例 1 ： c DN Aおよびゲノム DN Aのクローニング Example 1: Cloning of cDNA and Genomic DNA

c DNAのクロ一ニング c Cloning of DNA

r VDR Oのリガンド結合ドメインを含む X h o I — P s t 【制限酵素断片を放射性標識し、ラット胬臓 c D N Λライブラリ一（Clontech) をスクリーニングするプローブとして用いた. ハイブリダィゼーシヨン混合物には、 50%ホルム r Xho I — Pst containing the ligand binding domain of VDR O [Restriction enzyme fragment was radiolabeled and used as a probe to screen a rat cDNA DN library (Clontech). 50% Holm for Zession mixture

差替え用紙（規則 26) アミド、 1 x D e n h a r d s溶液、 5 x S S P E、 1 00 μ g / m 1変性サケ*** DNAおよび】 0⁶c p mの³² P—標識プローブ D N Aを含んでいた.. 二トロセルロース膜を 4 2 °C、 1 6時間ハイブリダィズさせ、 2 x S S C、 0. 1 %S DS中、 5 5°C、 30分、 2回洗浄した。膜を增感スクリーンを用いて一 8 0°Cで 1 6時間露光した _ς Replacement form (Rule 26) Ami de, 1 x D enhards solution, 5 x SSPE, 1 00 μ g / m 1 denatured salmon sperm DNA and] contained ³² P- labeled probe DNA of 0 ⁶ cpm .. nitrocellulose membrane 4 2 ° C, hybridized for 16 hours, and washed twice in 2 × SSC, 0.1% SDS at 55 ° C. for 30 minutes. _Σ membrane was 1 6 hour exposure in one 8 0 ° C using增感screen

r VDR0タンノク質 (Burmester et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988) をコードするェキソンに対応するプライマ一を用いるポリメラ —ゼチェインリアクション（PCR) によってこれらのクロ一ンを分析し、 1 0 ⁶個のプラークから、】 0個の陽性クロ一ンを選択したこの中から同じアイソフオームである r VDR 1をコードする 2個のクローンをさらに選択した。すなわち、ヌクレオチド配列の決定を行ったところ、 1 0個の陽性クロ一ンのうち、 8 個が r VDROであり、 2個が r V D R 1であることが判明した。 r Polymer using a primer corresponding to the exon encoding the VDR0 protein (Burmester et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988). analyze Ichin, 1 0 ⁶ plaques,] 0 positive black Ichin were further selected from the selected two clones encoding the r VDR 1 is the same Aisofu ohms. That is, when the nucleotide sequence was determined, it was found that out of the 10 positive clones, 8 were rVDRO and 2 were rVDR1.

ゲノム DNAのクローニング Genomic DNA cloning

r VD R 1 c DN Aの S ma 1 — K p n I断片をプローブとして用いて、ラットゲノムライブラリ一（C]ontech) 由来の B a mH I部位をもつ約 2 0 k bのゲノム断片をクローニングした。イントロン 8を含む P s t I部位をもつ 3. 5 k bの DNA断片をサブクローニングし、配列決定した。 r Using the Sma1—KpnI fragment of VDR1c DNA as a probe, clone a genomic fragment of about 20 kb with a BamHI site derived from rat genomic library (C) ontech. did. A 3.5 kb DNA fragment with a PstI site containing intron 8 was subcloned and sequenced.

得られた r VD R 1のヌクレオチド配列を配列番号 2に、推定ァミノ酸配列を配列番号 1に示す：また、 r VDR 0と比較した配列を図 ] に、 VDRゲノムの関連領域と選択的スプライシングによって生じる r VDR 1のマッピングを r V D R 0と比較して図 2に示す。実施例 2 ：ノーザンブロット分析 The nucleotide sequence of the obtained rVDR1 is shown in SEQ ID NO: 2, and the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1. Also, the sequence compared with rVDR0 is shown in Figure]. The mapping of rVDR1 resulting from splicing is shown in FIG. 2 in comparison to rVDR0. Example 2: Northern blot analysis

r VDR 0および r VDR 1転写物の発現を、ラット腸および ¾臓由来のポリ A ） mRNA 3 gを用いて、ノーザンブロッ卜分析により試験したプロ一ブとして r VDR 1のェキソン 8を用いた得られた結果を図 3に示す: r VD R 1転写物は r V D K ()が発現している腸と臓で発現していた. r V D「転写物の相対量は、特異的バンドをデンシトメ一ターでスキャニングして計算した Expression of rVDR0 and rVDR1 transcripts using exon 8 of rVDR1 as a probe tested by Northern blot analysis using 3 g of rat intestinal and rat poly (A) mRNA The results obtained are shown in Figure 3: rVDR1 transcript was expressed in the gut and gland where rVDK () was expressed.The relative amount of rVD `` transcript was Calculated by scanning with densitometer

差替え用紙（規則 26) 3つ以上の試料の平均を求めたところ、 r V D R 1転写物の量は r VD R ()の量の 1ノ 1 5〜： 1 2 0であった実施例 3 ：プラスミドの構築 Replacement form (Rule 26) When the average of three or more samples was calculated, the amount of the rVDR1 transcript was 1 to 15 of the amount of rVDR (): 120. Example 3: Construction of Plasmid

H i n d I I 1および X b a I制限部位をもつ合成ォリゴヌクレオチドをプラスミド p G CAT (Kato et al.， Cell 68:731-742, 1992) の対応する制限部位に揷入して CATレポ一タ一遺伝子を構築した。 CATレポ一タ一遺伝子およびゲルシフトアツセィでプローブとして用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである： Synthetic oligonucleotides with Hind II 1 and Xba I restriction sites were inserted into the corresponding restriction sites of the plasmid pGCAT (Kato et al., Cell 68: 731-742, 1992) to generate a CAT report. Each gene was constructed. The oligonucleotide sequences used as probes in the CAT reporter gene and gel shift assay are as follows:

DR3G： 5' -AGCTTCAGGTCAGGAAGGTCAGT-3' ； DR3G: 5'-AGCTTCAGGTCAGGAAGGTCAGT-3 ';

DR3T： 5' -AGCTTCAGTTCGGAAGTTCAGT-3' ； DR3T: 5'-AGCTTCAGTTCGGAAGTTCAGT-3 ';

DR4： 5' -AGCTTCAGGTCACGGAAGGTCAGT-3' ； DR4: 5'-AGCTTCAGGTCACGGAAGGTCAGT-3 ';

DR5： 5' -AGCTTCAGGTCACCGGAAGGTCAGT-3' ； DR5: 5'-AGCTTCAGGTCACCGGAAGGTCAGT-3 ';

ヒ卜ォステオカルシン VD R E (OC) ： Human osteocalcin VD R E (OC):

5' -AGCTTGCTCGGGTAGGGGTGACTCACCGGGTGAACGGGGGCATCTCGACTCGT-3' マウスォステオボンチン VDR E (O PN) ： 5'-AGCTTGCTCGGGTAGGGGTGACTCACCGGGTGAACGGGGGCATCTCGACTCGT-3 'mouse osteobontin VDR E (OPN):

5' -AGCTTGCTCGGGTAGGGTTCACGAGGTTCACTCGACTCGT-3' 5 '-AGCTTGCTCGGGTAGGGTTCACGAGGTTCACTCGACTCGT-3'

また、 r V D R 0の S a c I — B a mil I断片を、 P C Rで増幅した r VD R 1断片（図 1中の 9 1 1〜 1 0 7 1 b p ) で置換することにより r V D R 1発現べクターを構築した。実施例 4 ：組換え VD Rタンパク質の発現と精製 In addition, rVDR1 expression was achieved by substituting the SacI-BamylI fragment of rVDR0 with the rVDR1 fragment (91 1 to 1071 bp in FIG. 1) amplified by PCR. A vector was built. Example 4: Expression and purification of recombinant VDR protein

r V D R ()および r V D R 1をコードする c D N Λを、 B a m H Iおよび E c o R 1制限部位を用レ、る P C Rにより增幅し、プラスミド p G E X— 2 T (Phar macia) の対応する部位に挿入した，これらのベクターを用いて大腸菌（ D H 5 α ) を形質転換し、 1 PT G ( 0. 1 mM) で誘導した The cDNA encoding rVDR () and rVDR1 is amplified by PCR using the BamHI and EcoR1 restriction sites to generate the corresponding plasmid pGEX-2T (Phar macia). Escherichia coli (DH5α) was transformed with these vectors inserted into the site, and induced with 1 PTG (0.1 mM).

得られろ G S T融合タンパク質をグルタチオン 'セファロース 4 Bで精製した，各 G S T融合タンパク質 5 0 0 /i _gをトロンビン（ 5じ）で消化した後、グルタ Resulting Rarero GST fusion protein was purified by glutathione 'Sepharose 4 B, after each GST fusion protein 5 0 0 / i _g was digested with thrombin (5 Ji) glutarate

差替え用紙（規則 26) I 9 Replacement form (Rule 26) I 9

チオン 'セファロースに通してトロンビンと G S Tを除去した，フロースル一分画をさらに、 1 M N a C l、 .1 mM DTT、 1 0 %グリセロールを含む 5 () mM T r i s — H C Iバッファ一（pH 8. 0) で平衡化したセフアデックス G 2 00カラムにかけた- これらのタンパク質の純度は SD S— PAGEで 9 5 %以上であった。実施例 5 ： CATアツセィによる r VDR lの作用 The thrombin and GST were removed by Thion 'Sepharose to remove thrombin and GST. The flow-through fraction was further added to 5 () mM Tris—HCI buffer (pH 8) containing 1 M NaCl, .1 mM DTT, and 10% glycerol. The protein was> 95% pure by SDS-PAGE. Example 5: Effect of r VDR l by CAT technology

r VDR 0に対する r VDR 1のドミナントネガティブ活性を試験した _c 3 b p (DR 3 T) のスへ一サ一を介して 2つの 5 ' — AGTTCAモチーフを含む CATレポ一タ一プラスミド、ならびにマウス RX R a (0. 5 μ g) 、 r VDR 0 (0. 5 u g ) および r VDR l ( 2 μ g) を発現するベクターで H e L a細胞を形質転換した：形質転換した細胞を 1 , 2 5— (OH) ₂D ( 1 0 nM) の存在下（丄）または不在下（一）に 44時間維持し、 p CH l 1 0内部対照べクタ一によって発現する β—力'ラクトシダ一ゼ活性によって CAT活性を正規化し、少なくとも 3つの独立した試験から得られる平均値 ±標準偏差で示したつ得られた結果を図 4に示す _c r VDR _c 3 bp tested dominant negative activity of r VDR 1 for 0 (DR 3 T) 5 scan the two via a colonel one into '- AGTTCA CAT reporter one data one plasmid containing the motif, and mouse HeLa cells were transformed with vectors expressing RXRa (0.5 μg), rVDR0 (0.5 ug) and rVDR1 (2 μg): , 25— (OH) ₂ D (10 nM) in the presence (丄) or absence (1) for 44 hours, β-force expressed by the pCHl10 internal control vector Toshida CAT activity was normalized by Ichize activity, the results obtained stand expressed as mean ± standard deviation from the the three least independent testing Figure 4 _c

図から明らかなように、 r VD R 1 自体は転写促進活性を有していなかった。し力し、 r VDR 0と r VDR 1 とをコトランスフエクシヨンした場合には、 H eし a細胞において、 r VDR0によるリガンド誘導の転写促進活性を阻害した, 実施例 6 ： r V D R 1の用量依存的活性 As is clear from the figure, rVDR1 itself did not have a transcription promoting activity. When co-transfection of rVDR0 and rVDR1 inhibited the transcription-stimulating activity of ligand induced by rVDR0 in He cells, Example 6: Dose-dependent activity

細胞を r VD R 0発現べクタ一 0. 5 jii g、ならびに 1， 2 5— (OH) 2D. ( 1 0 nM) の存在下に、図 5に示す量の V D R発現ベクター（ r VDR 0または r VDR l ) で形質転換した. CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した図 5から明らかなように、 r VDR0の存在下に r VD R 1発現べクタ一の添加量を増加すると、 r V D K 1 の阻害活性はより顕著になった。 r VD R O発現べクタ一を 5 μ g添加したときにもリガンド誘導の転写促進活性は抑制されなかつた,，差替え用紙（規則 26) 実施例 7 ：甲状腺ホルモンおよびレチノィン酸シグナル伝達経路に及ぼす r V D R 1の効果 The cells were cultured in the presence of 0.5 jii g of the rVDR0 expression vector and 1,25- (OH) 2D. (10 nM) in the amount of the VDR expression vector (rVDR0 CAT activity was calculated in the same manner as in Example 5. As is clear from FIG. 5, the amount of the rVDR1 expression vector added in the presence of rVDR0 was determined. With increasing, the inhibitory activity of rVDK1 became more pronounced. r Addition of 5 μg of VDRO expression vector did not suppress ligand-induced transcriptional promotion activity. Example 7: Effect of rVDR1 on thyroid hormone and retinoic acid signaling pathway

4 b p (DR4 ：コンセンサス甲状腺ホルモンレスポンスエレメント）または 5 b p (D R 5 ：コンセンサスレチノィン酸レスポンスエレメント）のスぺ一サ一を介して 2つの 5，一 AGTTC Aモチーフを含む C ATレポータープラスミド、ならびにマウス RXR αおよびニヮトリ T R a (DR4用）あるいは RXR αおよびマウス RARa (DR 5用）を発現するベクターで、同種のリガンド [ 1 0 n M甲状腺ホルモン（丁³) 、 1 μ Μオールトランスレチノィン酸] の存在下または不在下に、細胞を形質転換した。 r VDR l発現ベクター（2 / g) でコトランスフエクションすることにより r VD R 1 の効果を試験した, CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した。 Cat reporter plasmid containing two 5,1 AGTTC A motifs through a 4 bp (DR4: consensus thyroid hormone response element) or 5 bp (DR 5: consensus retinoic acid response element) spacer , and a vector expressing mouse RXR alpha and two Wa tri TR a (for DR4) or RXR alpha and mouse RARa (for DR 5), the same type of ligand [1 0 n M thyroid hormone (Ding ^3), 1 mu Micromax Cells were transformed in the presence or absence of [all trans retinoic acid]. The effect of rVDR1 was tested by co-transfection with rVDR1 expression vector (2 / g). CAT activity was calculated in the same manner as in Example 5.

得られた結果を図 6に示す。 r VDR 1は同種のレセプターが存在するときには、レチノイン酸のコンセンサスレスポンスエレメント（DR 5) や甲状腺ホルモンのコンセンサスレスポンスエレメント（DR4) のリガンド誘導の転写促進活性を抑制しないことが判明した。実施例 8 ： r V D R 0に対する r V D R 1 の阻害活性の配列特異性 The results obtained are shown in FIG. r VDR1 was found not to suppress ligand-induced transcriptional promotion of retinoic acid consensus response element (DR5) or thyroid hormone consensus response element (DR4) in the presence of the same type of receptor. Example 8: Sequence specificity of the inhibitory activity of rVDR1 on rVDR0

DR 3 G、 DR 3丁、ヒトォステオカルシン V D R E (OC) およびマウスォステオボンチン VDRE (OPN) を含む CATレボータ一プラスミド、ならびに RXRおよび VDR ( r VDROまたは r VDR 1 ) の発現ベクターを用いて、 DR 3G, DR 3 CAT, CAT Revota-Plasmid, including hyosteocalcin VDRE (OC) and mouse steobontin VDRE (OPN), as well as RXR and VDR (rVDRO or rVDR1) expression vectors ,

1， 2 5 - (OH) ₂D₃ ( Ι Ο ηΜ) の存在下または不在下に、ト1 e L a細胞を形質転換した。 CAT活性は実施例 5と同様の方法で計算した _υ 1, 2 5 - (OH) in the presence or absence of _{_{2 D 3 (Ι Ο ηΜ)}} , the door 1 e L a cells were transformed. CAT activity was calculated in the same manner as in Example 5 _upsilon

得られた結果を図 7に示す r VD R 0に対する r V D R 1 の阻害程度は配列特異的であり、これはヒト · ォステオカルシン VD REよりもマウス · ォステオボンチンについての方が顕著であったまた、 D R 3丁は D R 3 Gよりも V D R The results obtained are shown in FIG. 7.The degree of inhibition of rVDR1 against rVDR0 was sequence-specific, which was more pronounced for mouse osteobontin than for human osteocalcin VDRE. , DR 3 is more VDR than DR 3 G

Eとしてより活性であることが観察された。 It was observed that E was more active.

差替え用紙（規則 26) 実施例 9 ： r VDR 1のホモダイマーおよびへテロダイマ一形成ならびにその D N A結合性 Replacement form (Rule 26) Example 9: r VDR 1 homodimer and heterodimer formation and its DNA binding

(A) r V D R 1の分子量 (A) r V D R 1 molecular weight

実施例 4の方法により大腸菌中で r VD R 0および r VD R 1を G S T融合タンパク質として発現させ、ダルタチオン ' セファロ一ス 4 Bで精製した後トロンビンで消化した。消化した試料をセフアデックス G— 1 00カラムにかけてさらに r VDR Oと r VDR lタンパク質を精製したつ G S T融合タンパク質（図 8 中、 GST— r VDR Oまたは G ST— r VDR 1として示す）および精製 r V DRタンパク質（図 8中、 r VDR Oまたは r VDR 1 として示す）を 5%ポリアクリルアミド一 SDSゲルで電気泳動を行い、分子量マ一カーから分子量を測定した： r VD R 0および r VD R 1のオープンリ一ディングフレームから予期されたそれぞれの分子量（ r VD R 0では 48 KD a ； 1~ 01¾ 1では401 0 a) の位置にバンドが観察された。 According to the method of Example 4, rVDR0 and rVDR1 were expressed as GST fusion proteins in Escherichia coli, purified with daltathione 'Sepharose 4B, and then digested with thrombin. The digested sample was applied to a Sephadex G-100 column to further purify the rVDRO and rVDRl proteins. GST fusion protein (shown as GST-rVDRO or GST-rVDR1 in Figure 8) and The purified rVDR protein (shown as rVDRO or rVDR1 in Figure 8) was electrophoresed on a 5% polyacrylamide-SDS gel and the molecular weight was determined from the molecular weight marker: rVDR A band was observed at the position of each of the molecular weights expected from the open reading frames of 0 and rVDR1 (48 KDa for rVDR0; 4010a for 1 to 01¾1).

(B) ゲルシフトアツセィ (B) Gersif Totssey

文献 (Sasaki et al. , Biochemistry 34:370-377, 1995) 記載の方法を用いて、電気泳動移動シフトアツセィ（EMSA) および抗体スーパーシフトを行った：このアツセィには以下の精製レセプターも使用した： Electrophoretic migration shift assay (EMSA) and antibody supershift were performed using the method described in the literature (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995): The following purified receptors were also used for this assay. did :

R A ：大腸菌中で生成した AB領域を欠く部分精製マウス RAR ct R A: partially purified mouse RAR ct lacking AB region generated in E. coli

(mR A R αΔΛΒ) ； (mR A R αΔΛΒ);

RX R ：大腸菌中で生成した ΛΒ領域を欠く部分精製マウス RXR _α RX R: partially purified mouse lacking ΛΒ region produced in E. coli RXR _alpha

(mRX RaAAB) ； (mRX RaAAB);

T ：大腸菌中で生成した部分精製ニヮトリ T R α _ T: Partially purified chicken T R α _ produced in E. coli

杭体スーパ一シフトにはモノクローナル抗体 4 R X (RX R用）を用いた。レセブタ一および [³² Ρ] — 5—末端標識合成オリゴヌクレオチド（DR 3丁、 DR 3G、 01 4ぉょび131^ 5) を含む結合反応混合物、ならびにボリ（d i d C) (Pharmacia, 2 M g ) を、結合バッファ一 [ 1 0 mM T r i s - H C I ( p H 7. 5) 、 i mMジチオスレィ卜一ル、 1 mM EDT八、 l O O mM KC I 、 1 0%グリセ口一ル] 中、 2 5"Cで 1 5分インキュベートしたインキ Monoclonal antibody 4 RX (for RX R) was used for the pile super shift. Resebuta first and ^[32 Ρ] - 5- end-labeled synthetic Origonuku Reochido (DR 3 chome, DR 3G, 01 4 Oyobi 131 ^ 5) coupled reaction mixture containing, and Helsingborg (did C) (Pharmacia, 2 M g ) In a binding buffer [10 mM Tris-HCI (pH 7.5), imM dithiothreitol, 1 mM EDT, 10 mM KCI, 10% glycerol] Ink incubated at 25 "C for 15 minutes

差替え用紙（規則 26) ュべ一シヨン開始時に抗体を添加した、文献（Sasaki et al. , Biochemistry 34 :370-377, 1995) 記載の方法により、得られた生成物を 5%ポリアクリルアミドゲルに溶解した。 Replacement form (Rule 26) The resulting product was dissolved in a 5% polyacrylamide gel by the method described in the literature (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995) to which the antibody was added at the start of the probe.

をプローブとして用い、図 9に示す種々の量の精製マウス RX Ret (RXR) 、精製 r VDR 0および r VDR 1でゲルシフトアツセィを行った。得られた結果を図 9に示す。モノクローナル抗体（マウス RX Rct用の 4 RX) を用いるスーパ一シフト試験によって DR 3 T— RXR— VDR複合体の存在が確認された。図 9中、レーン 6のバンドは抗 RX R抗体でスーパ一シフトした複合体の位置を示す：これより r VDR 1ホモダイマーがコンセンサス VDRE (DR 3 T) と結合することが示された。 Using gel as a probe, gel shift assays were performed with various amounts of purified mouse RX Ret (RXR) and purified rVDR0 and rVDR1 shown in FIG. Fig. 9 shows the obtained results. A supershift test using a monoclonal antibody (4 RX for mouse RX Rct) confirmed the presence of the DR3T-RXR-VDR complex. In FIG. 9, the band in lane 6 shows the position of the complex super-shifted with the anti-RXR antibody: This shows that the rVDR1 homodimer binds to the consensus VDRE (DR3T).

次に、 D R 4および D R 5をブローブとして用い、図 1 0に示す種々の量の精製 r VDR l、ニヮトリ TRct (TR) およびマウス RAR ct (RAR) でゲルシフトアツセィを行った。得られた結果を図 1 0に示す _c r VDR 1ホモダイマ —はコンセンサス甲状腺ホルモンレスポンスエレメントまたはレチノィン酸レスポンスエレメント（DR4および DR 5) と結合しなかったつ実施例 1 0 ：ヒト VDRアイソフォームの単離 Next, using gels DR4 and DR5 as probes, gel shift assays were performed with various amounts of purified rVDR1, chicken TRct (TR) and mouse RARct (RAR) as shown in Figure 10. Was. The obtained results _c r VDR 1 1 0 homodimer - less consensus thyroid hormone response elements or Rechinoin acid Pons elementary bets (DR4 and DR 5) One did not bind to Example 1 0: human VDR eye Seo Form isolation

ヒトゲノム DNAより VDRイントロン 8を特異的に P C R法により增幅し、ランダムプライム法にて放射性標識し、ヒト白血球 c DNAライブラリ一（Ciori tech社）をスクリーニングするプローブとした。ハイプリダイゼ一ション混合液には 50%ホルムアミド、 5 x D e n h a r d t ' s溶液、 5 x S S C、 0. 1 %S D S、 200 μ g/m I変性サケ*** DNAおよび I 0 ^β c p mの³² P—標識ァローブ D N Λを含んでいた.」ニトロセルロース膜を 42。し'、 1 6時間ハイブリダイズさせ、 4 X S S C、 0. 1 % S D S中で 1回、 2 X S S C、 0. 1 % S D S中で 1回、 l x S S C、 0. 1 %S DS中で 1回それぞれ室温 1 0分間洗浄した，膜を增感スクリーンを用いて一 y o cで 1 e時間露光した- 4 x 1 ()。クロ一ンより約 1 . 4 k bのィンサ一トをもつ I個の陽性ク口一ンを得た， VDR intron 8 was specifically amplified from human genomic DNA by PCR, radiolabeled by random prime method, and used as a probe to screen human leukocyte cDNA library-1 (Ciori tech). Haipuridaize one Deployment The mixture of 50% formamide, 5 x D enhardt 's solution, 5 x SSC, ³² P- labeled 0. 1% SDS, 200 μ g / m I denatured salmon sperm DNA and I 0 ^beta cpm Nitrocellulose membrane. " And hybridized for 16 hours, once in 4 XSSC, 0.1% SDS, once in 2 XSSC, 0.1% SDS, once in lx SSC, 0.1% SDS After washing at room temperature for 10 minutes, the film was exposed for 1 e hour at 1 yoc using a 增 -sensitive screen-4 x 1 (). I positive clones with an insert of about 1.4 kb were obtained from the clone.

得られたクローンのヌクレオチド配列を決定し、配列番号： 5のヌクレオチド酉己 The nucleotide sequence of the obtained clone was determined, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 was determined.

差替え用紙（規則 26) 列を得た，このヌクレオチド配列には、ヒト V D Rイントロン 7、ェキソン 8、イン卜ロン 8を含むヒ卜 V D Rアイソフォームにおけるィントロン 7のヌクレォチド配列を配列表の配列番号 4に、またイントロン 8のヌクレオチド配列を配列番号 5に示す。 Replacement form (Rule 26) In this nucleotide sequence, the nucleotide sequence of intron 7 in the human VDR isoform including human VDR intron 7, exon 8, and intron 8 is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and The nucleotide sequence of intron 8 is shown in SEQ ID NO: 5.

差替え用紙 (規則 26)

Μ Replacement forms (Rule 26)

Μ

OZ 3VD3V30303 V iX 'J丄 0：)丄 V )i)V丄 VOLV ^VD'JVDVVDV V'JVVOIDIVI OOVVDDD'JOV 09S OIOIOVOVO!) VV011 309V VVOOVOVVV V'JV'JVV'J丄 VV IVOIVOVO'JO V0VV10D0V3 OOS VIOOVOOVOI VOVDVOIDDI VDII'JVO'JVV OIV'JIVDOOD IVOVOOiOlD 1303VVV31D Ol^ 1)33 0丄：) VCOOL VDV'J OO'JOOVVDVO i)VVCX)V:)丄 V3 3：)：)'：)丄丄 V VS 3丄 VV3丄丄: )0：) 081 lOlODVDlI'J 丄 iJVV i) ：) 'JVV 丄 DD 'JVDllD 11100VVV00 IDDOVVDl'Jl 0 - 1 33V01VI301 VV311DV331 1300V3V3D0 V033V0V001 'JIOIOV'J IO 1D1V003330 09 0103VV0030 V01113V010 OI30DV033D 013D01DDVD OVDDOOD'JVD VVDOOVOOIV OZ 3VD3V30303 V iX 'J 丄 0 :) 丄 V) i) V 丄 VOLV ^ VD'JVDVVDV V'JVVOIDIVI OOVVDDD'JOV 09S OIOIOVOVO!) VOVDVOIDDI VDII'JVO'JVV OIV'JIVDOOD IVOVOOiOld 1303VVV31D Ol ^ 1) 33 0 丄 :) VCOOL VDV'J OO'JOOVVDVO i) VVCX) V :) 丄 V3 3)) :) ':) 丄丄 V VS 3 丄VV3 丄丄:) 0 :) 081 lOlODVDlI'J 丄 iJVV i) :) 'JVV 丄 DD' JVDllD 11100VVV00 IDDOVVDl'Jl 0-1 33V01VI301 VV311DV331 1300V3V3D0 V033V0V01 0J1OV103V01 09J01V103V01

本二：璨^餺 mm - fS >½3i ΐ z o I ： Honji: 璨 ^ 餺 mm-fS> ½3i ΐ z o I:

99S 3Da0AH91GM133H0dH10dSAI0IVWnAH333HlN1 >n0A0d)ind3n31IH οοε ov SAaiAGA AaesooaMswaaiMdso SinwiAaivss^nAioaasnaadOdi v joiA OrsASAiaviHcnKsidsioiiASdaasa30Nian Sdosd3wwaisiiA'iasss 08i sssNosdsiidadSAS9isoawaAddiidaMdavAidaAi)iHHvaniviiH0533siida osi Hsanv333 a wiK3M>iy A33aiiid3)iwwoiaAoa>naovooHaa a>iiia3aoNidd 09 Didiv)ia)iwsaajjo)iDoa3XKV dHdOivyao3A03iadA dadaDdacnsisvviV3w 99S 3Da0AH91GM133H0dH10dSAI0IVWnAH333HlN1> n0A0d) ind3n31IH οοε ov SAaiAGA AaesooaMswaaiMdso SinwiAaivss ^ nAioaasnaadOdi v joiA OrsASAiaviHcnKsidsioiiASdaasa30Nian Sdosd3wwaisiiA'iasss 08i sssNosdsiidadSAS9isoawaAddiidaMdavAidaAi) iHHvaniviiH0533siida osi Hsanv333 a wiK3M> iy A33aiiid3) iwwoiaAoa> naovooHaa a> iiia3aoNidd 09 Didiv) ia) iwsaajjo) iDoa3XKV dHdOivyao3A03iadA dadaDdacnsisvviV3w

^wm■· 一^^ wm ■

/ ： o)

/: O)

9 s ε： 9 s ε:

l ：告暴 l: extortion

【挲 ¾】 [挲 ¾]

Z Z

Lt600IL6SUXDd ZL\L lL6 OAV AAGACCTATG ACCCCACCTA CGCTGACTTC AGGGACTTCC GGCCTCCACT TCGTATGGAC 480Lt600IL6SUXDd ZL \ L lL6 OAV AAGACCTATG ACCCCACCTA CGCTGACTTC AGGGACTTCC GGCCTCCACT TCGTATGGAC 480

GGAAGTACAG GGAGCTATTC TCCAAGGCCC ACACTCAGCT TCTCCGGGAA CTCCTCCTCC 540GGAAGTACAG GGAGCTATTC TCCAAGGCCC ACACTCAGCT TCTCCGGGAA CTCCTCCTCC 540

TCCAGCTCTG ACCTGTACAC CACCTCACTA GACATGATGG AACCATCCGG CTTTTCCAAC 600TCCAGCTCTG ACCTGTACAC CACCTCACTA GACATGATGG AACCATCCGG CTTTTCCAAC 600

CTGGATCTGA ACGGAGAGGA TTCTGATGAC CCGTCTGTGA CTCTGGACCT GTCTCCTCTC 660CTGGATCTGA ACGGAGAGGA TTCTGATGAC CCGTCTGTGA CTCTGGACCT GTCTCCTCTC 660

TCCATGCTGC CCCACCTGGC TGACCTTGTC AGTTACAGCA TCCAAAAGGT CATCGGCTTT 720TCCATGCTGC CCCACCTGGC TGACCTTGTC AGTTACAGCA TCCAAAAGGT CATCGGCTTT 720

GCCAAGATGA TCCCAGGATT CAGGGATCTC ACCTCCGATG ACCAGATTGT CCTGCTTAAG 780GCCAAGATGA TCCCAGGATT CAGGGATCTC ACCTCCGATG ACCAGATTGT CCTGCTTAAG 780

TCAAGCGCCA TTGAGGTGAT CATGTTACGC TCCAACCAGT CTTTCACCAT GGATGATATG 840TCAAGCGCCA TTGAGGTGAT CATGTTACGC TCCAACCAGT CTTTCACCAT GGATGATATG 840

TCCTGGGACT GTGGCAGCCA GGACTACAAG TACGACGTCA CCGATGTCTC CAAAGCTGGG 900TCCTGGGACT GTGGCAGCCA GGACTACAAG TACGACGTCA CCGATGTCTC CAAAGCTGGG 900

CACACCCTGG AGCTGATCGA GCCCCTCATA AAGTTCCAGG TGGGGCTGAA GAAGCTGAAC 960CACACCCTGG AGCTGATCGA GCCCCTCATA AAGTTCCAGG TGGGGCTGAA GAAGCTGAAC 960

TTACATGAGG AAGAGCATGT CCTTCTCATG GCCATCTGCA TTGTCTCCCC GGGTACGGAG 1020TTACATGAGG AAGAGCATGT CCTTCTCATG GCCATCTGCA TTGTCTCCCC GGGTACGGAG 1020

CCTGGCAGGG AGGAGCTGAG GGACCTGGGA CACGTTGGGG ACTGTGAATG A 1071 配列番号： 3 CCTGGCAGGG AGGAGCTGAG GGACCTGGGA CACGTTGGGG ACTGTGAATG A 1071 SEQ ID NO: 3

配列の長さ： 1 4 0 4 Array length: 1 4 0 4

配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid

鎖の数：二本 Number of chains: two

トポロジー：直鎖状 Topology: linear

配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A

配列 Array

ATGGAGGCAA TGGCGGCCAG CACTTCCCTG CCTGACCCTG GAGACTTTGA CCGGAACGTG 60 ATGGAGGCAA TGGCGGCCAG CACTTCCCTG CCTGACCCTG GAGACTTTGA CCGGAACGTG 60

CCCCGGATCT GTGGGGTGTG TGGAGACCGA GCCACTGGCT TTCACTTCAA TGCTATGACC 120CCCCGGATCT GTGGGGTGTG TGGAGACCGA GCCACTGGCT TTCACTTCAA TGCTATGACC 120

TGTGAAGGCT GCAAAGGCTT CTTCAGGCGA AGCATGAAGC GGAAGGCACT ATTCACCTGC 180TGTGAAGGCT GCAAAGGCTT CTTCAGGCGA AGCATGAAGC GGAAGGCACT ATTCACCTGC 180

CCCTTCAACG GGGACTGCCG CATCACCAAG GACAACCGAC GCCACTGCCA GGCCTGCCGG 240CCCTTCAACG GGGACTGCCG CATCACCAAG GACAACCGAC GCCACTGCCA GGCCTGCCGG 240

CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TTCTGACAGA TGAGGAAGTG 300CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TTCTGACAGA TGAGGAAGTG 300

CAGAGGAAGC GGGAGATGAT CCTGAAGCGG AAGGAGGAGG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360CAGAGGAAGC GGGAGATGAT CCTGAAGCGG AAGGAGGAGG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360

CGGCCCAAGC TGTCTGAGGA GCAGCAGCGC ATCATTGCCA TACTGCTGGA CGCCCACCAT 420CGGCCCAAGC TGTCTGAGGA GCAGCAGCGC ATCATTGCCA TACTGCTGGA CGCCCACCAT 420

AAGACCTACG ACCCCACCTA CTCCGACTTC TGCCACTTCC GGCCTCCAGT TCCTGTGAAT 480AAGACCTACG ACCCCACCTA CTCCGACTTC TGCCACTTCC GGCCTCCAGT TCCTGTGAAT 480

GATGGTGGAG GGAGCCATCC TTCCAGGCCC AACTCCAGAC ACACTCCCAG CTTCTCTGGG 540 GATGGTGGAG GGAGCCATCC TTCCAGGCCC AACTCCAGAC ACACTCCCAG CTTCTCTGGG 540

差替え用紙 (規則 26) GACTCCTCCT CCTCCTGCTC AGATCACTGT ATCACCTCTT CAGACATGAT GGACTCGTCC 600Replacement forms (Rule 26) GACTCCTCCT CCTCCTGCTC AGATCACTGT ATCACCTCTT CAGACATGAT GGACTCGTCC 600

AGCTTCTCCA ATCTGGATCT GAGTGAAGAA GATTCAGATG ACCCTTCTGT GACCCTAGAG 660AGCTTCTCCA ATCTGGATCT GAGTGAAGAA GATTCAGATG ACCCTTCTGT GACCCTAGAG 660

CTGTCCCAGC TCTCCATGCT GCCCCACCTG GCTGACCTGG TCAGTTACAG CATCCAAAAC 720CTGTCCCAGC TCTCCATGCT GCCCCACCTG GCTGACCTGG TCAGTTACAG CATCCAAAAC 720

GTCATTGGCT TTGCTAAGAT GATACCAGGA TTCAGAGACC TCACCTCTGA GGACCAGATC 780GTCATTGGCT TTGCTAAGAT GATACCAGGA TTCAGAGACC TCACCTCTGA GGACCAGATC 780

GTACTGCTGA AGTCAAGTGC CATTGAGGTC ATCATGTTGC GCTCCAATGA GTCCTTCACC 840GTACTGCTGA AGTCAAGTGC CATTGAGGTC ATCATGTTGC GCTCCAATGA GTCCTTCACC 840

ATGGACGACA TGTCCTGGAC CTGTGGCAAC CAAGACTACA AGTACCGCGT CAGTGACGTG 900ATGGACGACA TGTCCTGGAC CTGTGGCAAC CAAGACTACA AGTACCGCGT CAGTGACGTG 900

ACCAAAGGTA TGCCTAGNNN NCACCTCCTG GGGAGTCTTT TTCAGCTCCC AGATTCTGGC 960ACCAAAGGTA TGCCTAGNNN NCACCTCCTG GGGAGTCTTT TTCAGCTCCC AGATTCTGGC 960

TCCACCCGTC CTGGGGTTTG GCTCCAATCA GATACATGGG AGGGAGTTAG GCACCAACAG 1020TCCACCCGTC CTGGGGTTTG GCTCCAATCA GATACATGGG AGGGAGTTAG GCACCAACAG 1020

GCAGAGAAGG GCGAGGGTCA GACCCATGGG GTTGGAGGTG GGTGGGCGGC TCCTCAGCTC 1080GCAGAGAAGG GCGAGGGTCA GACCCATGGG GTTGGAGGTG GGTGGGCGGC TCCTCAGCTC 1080

TTGCCCGCAG TACCTCCCCA TTGTCTCTCA CAGGCCGGAC ACAGCCTGGA GCTGATTGAG 1 140TTGCCCGCAG TACCTCCCCA TTGTCTCTCA CAGGCCGGAC ACAGCCTGGA GCTGATTGAG 1 140

CCCCTCATCA AGTTCCAGGT GGGACTGAAG AAGCTGAACT TGCATGAGGA GGAGCATGTC 1200CCCCTCATCA AGTTCCAGGT GGGACTGAAG AAGCTGAACT TGCATGAGGA GGAGCATGTC 1200

CTGCTCATGG CCATCTGCAT CGTCTCCCCA GGTATGGGGC CAGGCAGGGA GGAGCTCAGG 1260CTGCTCATGG CCATCTGCAT CGTCTCCCCA GGTATGGGGC CAGGCAGGGA GGAGCTCAGG 1260

GACCTGGGGA GCGGGGAGTA TGAAGGACAA AGACCTGCTG AGGGCCAGCT GGGCAACCTG 1320GACCTGGGGA GCGGGGAGTA TGAAGGACAA AGACCTGCTG AGGGCCAGCT GGGCAACCTG 1320

AAGGGAGACG TAGCAAAAGG AGACACAGAT AAGGAAATAC CTACTTTGCT GGTTTGCAGA 1380AAGGGAGACG TAGCAAAAGG AGACACAGAT AAGGAAATAC CTACTTTGCT GGTTTGCAGA 1380

GCCCCTGTGG TGTGTGGACG CTGA 1404 配列番号： 4 GCCCCTGTGG TGTGTGGACG CTGA 1404 SEQ ID NO: 4

配列の長さ： 2 1 0 Array length: 2 1 0

配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid

鎖の数：二本 Number of chains: two

トボロン一：直鎖状 Tobolon-1: Linear

配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A

配列 Array

GGTATGCCTA GNNNNCACCT CCTGGGGAGT CTTTTTCAGC TCCCAGATTC TGGCTCCACC 60 GGTATGCCTA GNNNNCACCT CCTGGGGAGT CTTTTTCAGC TCCCAGATTC TGGCTCCACC 60

CGTCCTGGGG TTTGGCTCCA ATCAGATACA TGGGAGGGAG TTAGGCACCA ACAGGCAGAG 120CGTCCTGGGG TTTGGCTCCA ATCAGATACA TGGGAGGGAG TTAGGCACCA ACAGGCAGAG 120

AAGGGCGAGG GTCAGACCCA TGGGGTTGGA GGTGGGTGGG CGGCTCCTCA GCTCTTGCCC 180AAGGGCGAGG GTCAGACCCA TGGGGTTGGA GGTGGGTGGG CGGCTCCTCA GCTCTTGCCC 180

GCAGTACCTC CCCATTGTCT CTCACAGGCC 210 GCAGTACCTC CCCATTGTCT CTCACAGGCC 210

差替え用紙（規貝 IJ26) 配列番号： 5 Replacement paper (Kaikai IJ26) SEQ ID NO: 5

配列の長さ： 1 7 3 Array length: 1 7 3

配列の型：核酸 Sequence type: nucleic acid

鎖の数二本 Number of chains Two

トポロジー：直鎖状 Topology: linear

配列の種類： c D N A Sequence type: c D N A

配列 Array

GTATGGGGCC AGGCAGGGAG GAGCTCAGGG ACCTGGGGAG CGGGGAGTAT GAAGGACAAA 60 GACCTGCTGA GGGCCAGCTG GGCAACCTGA AGGGAGACGT AGCAAAAGGA GACACAGATA 120 AGGAAATACC TACTTTGCTG GTTTGCAGAG CCCCTGTGGT GTGTGGACGC TGA 173 GTATGGGGCC AGGCAGGGAG GAGCTCAGGG ACCTGGGGAG CGGGGAGTAT GAAGGACAAA 60 GACCTGCTGA GGGCCAGCTG GGCAACCTGA AGGGAGACGT AGCAAAAGGA GACACAGATA 120 AGGAAATACC TACTTTGCTG GTTTGCAGAG CCCCTGTGGT GTGTGGACGC TGA 173

差替え用紙（規則 26) Replacement form (Rule 26)

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

1 . ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質をコ一ドする遺伝子。 2 . ビタミン Dレセプタ一アイソフ； rームタンハク質をコードする遺伝子がラット由来である請求項 1記載の遺伝子。 1. A gene encoding a vitamin D receptor isoform protein. 2. The gene according to claim 1, wherein the gene encoding the vitamin D receptor is derived from rat.

3 . 配列番号 1に示すァミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号 1に示すァミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列であってビタミン Dレセブターアイソフォームタンパク質活性を有するタンパク質をコ一ドするヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダイズするヌクレォチド配列を含む D N Aである請求項 1または 2記載の遺伝子。 3. A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and comprising a vitamin D receptor isoform protein 3. The gene according to claim 1, which is a nucleotide sequence encoding a protein having an activity, or a DNA containing a nucleotide sequence hybridizing thereto.

4 . 配列番号 2に示すヌクレオチド配列を有する請求項 3記載の遺伝子。 δ . ビタミン Dレセプターアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子がヒト由来である請求項 1記載の遺伝子。 4. The gene according to claim 3, which has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. 2. The gene according to claim 1, wherein the gene encoding the vitamin D receptor isoform protein is derived from human.

6 . 配列番号 4および/または配列番号 5に示すヌクレオチド配列を含む請求項 5記載の遺伝子。 6. The gene according to claim 5, comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 5.

7 . 配列番号 3に示すヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失もしくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む D Ν Αである請求項 5または 6記載の遺伝子。 7. The nucleotide sequence according to claim 5 or 6, which comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence obtained by partially substituting, deleting or adding the nucleotide sequence, or a nucleotide sequence hybridizing thereto. gene.

8 . 請求項 1記載の遺伝子を含む組換えべクタ一 _ 8. A recombinant vector containing the gene according to claim 1 _

9 . 請求項 8記載の組換えベクターにより形質転換された原核もしくは真核宿主細胞， 9. A prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with the recombinant vector of claim 8,

1 0 . 請求項 9記載の宿主細胞を培赛することによって得られるビタミン Dレセプタ一アイソフォームタンパク質， 10. A vitamin D receptor isoform protein obtained by culturing the host cell according to claim 9,

1 . 請求項 1 0記載のビタミン Γ)レセブタ一アイソフォームンパク質を認識する抗体 1. Vitamin according to claim 10) i) An antibody that recognizes receptor pig isoform protein

1 2 . 請求項 1 0記載のビタミン Dレセブタ一アイソフォームタンパク質を用いた骨密度の診断方法 12. A method for diagnosing bone density using the vitamin D receptor pig isoform protein according to claim 10.

1 3 . 請求項 1 ()記載のビタミン Dレセブターアイソフォームタンパク質を用い 13. Using the vitamin D receptor isoform protein according to claim 1 ().

差替え用紙（規則 26) たビタミン D様物質のスクリ一二ング法.: Replacement form (Rule 26) Screening method for vitamin D-like substances:

差替え用紙（規則 26) Replacement form (Rule 26)