WO1997023502A1 - Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique - Google Patents

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WO1997023502A1
WO1997023502A1 PCT/EP1996/005611 EP9605611W WO9723502A1 WO 1997023502 A1 WO1997023502 A1 WO 1997023502A1 EP 9605611 W EP9605611 W EP 9605611W WO 9723502 A1 WO9723502 A1 WO 9723502A1
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plasmid
virus
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dna
animals
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PCT/EP1996/005611
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Christine Swysen
Christophe Depierreux
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Solvay (Societe Anonyme)
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a plasmid vaccine against the pseudorabic virus, also known under the name of Aujeszky's disease virus (ADV), of swine virus of herpes 1 (PHV-1) or of virus he ⁇ ippo-1 Suid ( SHV-1)
  • Aujeszky's disease is a viral disease to which most mammals are sensitive
  • humans do not seem to be susceptible to this disease
  • the agent causing this disease is a double stranded DNA enveloped virus of the family Herpesviridae, subfamily of alpha-herpesvirinae, namely, pseudorabic virus (PRV).
  • PRV pseudorabic virus
  • the PRV virus genome is formed by a double-stranded DNA molecule of approximately 150 kb and consists of a single long region (UjJ and a single short region (U s ) which is flanked by two reverse repeat sequences, one terminal (TR) and the other internal (IR) (BEN-PORAT, T et al, 1979, Virology 95, p 285-294)
  • Aujeszky's disease virus genome contains at least 70 genes
  • Transmission of the virus usually occurs by oral, respiratory or direct contact between an infected animal and a healthy animal
  • the disease can be fatal and the duration of incubation is variable and between 15 hours and 12 days
  • PRV viruses of the strain are used for vaccination of pigs
  • This vaccination method gives the vaccine subject good protection which is due to the intracellular action of the living virus. Indeed, living viruses enter cells where viral antigens will be synthesized.
  • peptides derived from these viral antigens are present on the surface infected cells in association with the major histocompatibility class I complex (MHC I).
  • MHC I major histocompatibility class I complex
  • a cytotoxic response can thus be provoked in addition to the humoral response, which induces in the vaccinated subject better protection against the virus.
  • viruses are attenuated by mutations, there is a risk that viruses will become pathogenic again by spontaneous mutations or by recombinations with wild-type viruses.
  • Vaccinations with live viral agents can also lead, under certain conditions, to the proliferation of live viruses. This proliferation of live viruses, even attenuated, constitutes a risk for more susceptible subjects, such as newborns or pregnant women.
  • Another technique developed more recently consists in the use of a non-pathogenic living vector carrying selected genes of the PRV virus.
  • M L. VAN DER LEEK et al (The Veterinary Record (1994) 134, p. 13-18) have led to encouraging results with vaccination of pigs against the PRV virus by scarification or by intramuscular injection of a recombinant swine pox virus and PRV virus (rSPV-AD).
  • This recombinant was obtained by insertion of the PRV genes coding for the gp50 and gp63 attached to the promoter P 7.5 of the vaccinia virus in the thymidine kinase gene of the SPV virus.
  • ROBINSON et al describe in 1993, in Vaccine 1 1, 957-960, immunization of hens against the influenza virus by intravenous, intraperitoneal and subcutaneous injections of plasmid From 28% to 100% of the animals thus immunized resist to a "challenge" by a lethal dose of the virus II it should be noted that the effectiveness strongly depends on the route and the system used for the injection and on a possible pretreatment of the injection site (DANKO et al, Vaccine 12 , 1499-1502 (1994)) GRAHAM JM COX et al have described a method of vaccination of cattle and mice against the BHV-1 virus by injection of plasmid DNA, in J Virol.
  • the aim of the present invention is to provide a plasmid vaccine against the PRV virus responsible for Aujeszky's disease
  • a vaccine comprising at least one plasmid coding for the glycoprotein glll of the PRV virus or for a protein having the same antigenicity as the glycoprotein glll of the PRV virus and a pharmaceutically acceptable excipient for the latter.
  • the plasmid can be produced, according to well-controlled techniques, in bacteria such as E. coli
  • the gene introduced into the plasmid does not need to code for the whole glll protein, it is sufficient that it codes for a part or a homologue of the PRV glll protein which has the same antigenicity as the glll c protein. ie the same effect on the immunological system as the glll protein Indeed, only part of the glll protein is identified by the animal's immunological system, the other parts of the protein, although certainly playing a role in the life of the virus, is not essential in the recognition of the protein by the infected organism. Another advantage is that vaccinated animals can easily be distinguished from animals infected with the PRV virus.
  • the vaccinated animals develop only antibodies against the glll protein while the animals infected with the PRV virus also develop antibodies against other proteins of the virus.
  • the method is safe, because a proliferation of live viruses is not to be feared Since only a well-defined part of the virus genome is injected, there is no infection by viruses and therefore consequently there can be no proliferation of viruses.
  • Vaccination with the vaccine according to the present invention can be used as a diagnostic tool because it induces the formation of monospecific antibodies. These antibodies can be used for the detection of the p antigen. ex. during ELISA or other tests.
  • a surprising effect of the invention resides in the effectiveness of the immunization against the PRV virus.
  • the importance of the glycoprotein glll in immunization is well known, the injection of the purified glll protein does not seem to have any effect. pronounced effect of immunization.
  • Z H. BISEIBUTSU et al describe, in the Japanese patent application
  • JP 05/246888 a vaccine against the PRV virus, based on purified glycoprotein glll and an oil-based adjuvant This approach is not used on a commercial scale
  • a MATSUDA TSUCHIDA et al show in an article published in J Vet med Sci 54 (3) 447-452, 1992, that a mixture of glycoproteins gll, glll and purified gIV injected together with a conventional oil-based adjuvant, confers a better protection in mice against a challenge by virulent PRV viruses than the glycoproteins injected individually.
  • the plasmid is the plasmid pEVhisl4gIII.
  • the plasmid pEVhisl4gIII has the advantage of comprising a gene conferring resistance to ampicillin, so that the transformed bacteria, having incorporated the plasmid, are easily selected by adding ampicillin in their growth medium.
  • the plasmid comprises a gene coding for a protein having the same antigenicity as the glycoprotein gll1 of the PRV virus, inserted into the plasmid so that it is expressed.
  • a marker such as a gene conferring resistance to an antibiotic makes it possible to select the bacteria transformed by the plasmid.
  • the plasmid may contain, in addition to the gene coding for the glycoprotein glll of the PRV virus or for a protein having the same antigenicity as the glycoprotein glll of the PRV virus, one or more genes coding for cytokines.
  • cytokines are known to exert an adjuvant activity on vaccines. Introducing them into the plasmid so that they can be expressed in cells will increase the effectiveness of the vaccine.
  • the vaccine also comprises a pharmaceutically acceptable excipient in which the plasmid is incorporated.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers either to liquid media or to solid media capable of being used as excipient (vehicle) for introducing the plasmid into the animal to be vaccinated. liquids, water, saline, phosphate-saline buffer, solutions containing adjuvants, detergents, stabilizers and transfection promoting substances, liposome, virosome suspensions and emulsions.
  • DNA vaccination can possibly be preceded by pretreatment of the vaccination site (eg use of a local anesthetic) in order to improve its effectiveness.
  • the present invention also provides a plasmid vaccine against the PRV virus comprising a nucleic acid sequence coding for the glll protein of the PRV virus or for a protein having the same antigenicity as the glycoprotein glll of the PRV virus or a DNA construct comprising a expression cassette including a) a DNA sequence coding for a polypeptide containing at least one antigenic determinant of the glycoprotein glll or an immunogenic fragment thereof, and b) control sequences operatively linked to said coding sequences where said sequence coding can be transcribed and translated in a cell and where said control sequences are homologous or heterologous to said coding sequence.
  • the plasmid vaccine contains one or more genes coding for cytokines.
  • Example 1 Obtaining a vaccine
  • the vaccine was obtained in three stages, comprising the construction of a plasmid (pEVhisHglII) containing the gene for the glycoprotein gll1 of the PRV virus, the production of this plasmid in transformed bacteria and the formulation of the vaccine comprising the plasmid and an excipient pharmaceutically acceptable
  • Step A Construction of a plasmid (pEVhisHglII) containing the PRV virus glycoprotein glll gene
  • the plasmid DNA pEVhisHglII was obtained from the Institute for Animal Science and Health, (ID DLO, Lelystad, NL) . It includes the PRV virus glycoprotein glll gene, under the control of the HCMV promoter, and the ampicillin resistance marker gene.
  • Step B Production of the plasmid in transformed bacteria Preparation of E. cells. coli treated with RbCl.
  • plasmid pEVhisHglII 250 ng of plasmid pEVhisHglII were incubated for 10 minutes on ice (at 0 ° C) and then for 5 minutes at 37 ° C The mixture was then transferred into 2 ml of RB medium (1% bactopeptone (w / v ), yeast extract 0 5% (w / v), NaCl 1% (w / v)) and incubated between 30 minutes and 2 hours at 37 ° C with shaking
  • the abbreviation% (w / v) represents a percentage expressed by weight per volume
  • the pellets were dried under vacuum and taken up in 100 to 200 ⁇ l of water (filtered on Milli Q device, Millipore, USA) without RNAse treatment
  • the plasmid DNA was produced in greater quantity according to one of the following two procedures.
  • a suspension of E. coli transformed by the plasmid pEVhisl4gIII is incubated for one hour in 2 ml of RB medium and then distributed in 1 to 4 bottles of 400 ml of RB medium containing ampicillin at a rate of 100 ⁇ g / ml
  • the cultures were incubated overnight at 37 ° C. with shaking at approximately 150- 200 revolutions per minute
  • the cultures were centrifuged in 500 ml Nalgene tubes for 7 minutes at 8,670 g All the centrifugations were carried out in a Beckman model J2-21 centrifuge
  • MOPS represents sulfonic acid 3- (N-morpholino) propane
  • the solution was recovered in 40 ml Nalgene tubes 14 ml of isopropanol were added at room temperature After stirring, the mixture
  • the column was placed on another collection tube and the dissolved sample (1.8 ml) was deposited on top of the resin.
  • the column was centrifuged for 12 minutes at 980 g in a "swinging bucket" rotor.
  • the plasmid solution collected was divided into two Eppendorf tubes to which 600 ⁇ l of isopropanol were added. After centrifugation for 15 minutes at 18,320 g (SIGMA 2K15 centrifuge), the pellet was washed with 300 ⁇ l of 70% ethanol ( v / v) and dried under vacuum
  • the pellet comprising the plasmid DNA is redissolved in 500 ⁇ l of Milli-Q water (Millipore, USA) and kept cold until vaccination
  • Step C Formulation of the vaccine comprising the plasmid and a pharmaceutically acceptable excipient
  • the pellet of plasmid DNA being redissolved in water, the DNA concentration was determined by deposition on agarose gel and development with ethidium bromide (see "Molecular cloning, a laboratory manual", J
  • Example 2 Use of the Plasmid Vaccine in Mice to Stimulate the Induction of an Antibody Response and a Cytotoxic T Cell Response
  • the experiment carried out in mice to prove the efficacy of the plasmid vaccine requires the construction of a control plasmid derived from the plasmid pEVhisl4gIII, prior to the immunization of animals and the analysis of the immune response
  • Step 1 Construction of a plasmid derived from the plasmid pEVhisHglII by deletion of the coding sequence of the glll gene
  • a plasmid derived from the plasmid pEVhisHglII by deletion of the coding sequence of the glycoprotein glll gene was used as a negative control (pEVhisl4gIH ", DNA ")
  • This deleted plasmid was obtained in the following way, the plasmid pEVhisHglII was digested with the restriction enzymes Asp 718 and EcoRV.
  • the DNA was then processed using T4 DNA polymerase to obtain blunt-ended fragments.
  • the DNA thus obtained was ligated using T4 DNA ligase (see "Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, EF Fritsch and T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ⁇ 1.53 1.73 )
  • mice of the inbred Balb / c strain aged 16 to 18 weeks at the first injection, were used
  • mice must be inbred to measure cytotoxic T cell responses (CTL) because the compatibility of the major histocompatibility complex (MHC) between cytotoxic T cells and target cells, - 3T3-swiss albino cells (fibroblasts) (haplotype H-2D) -, must be guaranteed
  • the target cells were cultured in a DME medium containing 10% (v / v) fetal calf serum
  • the plasmid DNA of the plasmid pEVhisHglII containing the gene for the glycoprotein glll of the PRV virus , was used as positive DNA, (DNA + ) while the equivalent plasmid, without the glll gene, (DNA "), was used as a negative control
  • Group I comprising 10 mice marked with a colored code, was vaccinated four times, at week 0 (DNA] + ) at week 3 (DNA2 + ), at week 5 (DNA3 + ) and at week 10 ( DNA4 + ) with DNA + Serum, SADN3 4 " , was collected 2 days before the last injection, serum sADN4 + was collected 6 days after the first collection i.e. 5 days after the last injection DNA 4 "
  • Week 1 spleen cells were removed and restimulated in vitro CTL tests were performed 4 days later Group 2 also comprising 10 mice marked with a color code, was vaccinated three times, at week 0 (DNA] + ), at week 3 (DNA2 + ) and at week 5 (DNA3 + ) with DNA + Serum, sADN2 + , was taken 2 days before the last injection and serum sADN3 + a was removed at week 9, i.e. 4 weeks after the last DNA3 + injection. At week 9, the spleen cells were restimulated in vitro.
  • Group 3 comprising 8 mice marked with a color code, was vaccinated only twice, at week 0 (DNA j + ) and at week 3 (DNA2 4 " ) Serum, sADN2 + , was collected 2 weeks after the last injection and at week 9
  • Group 4 or control group, comprising 10 mice marked with a color code, was vaccinated three times with DNA ", at week 0 with 200 ⁇ g of DNA” (DNA] "), at week 2 with 100 ⁇ g (DNA2 ”) and at week 7 with 100 ⁇ g of DNA” (DNA3 ") Serum, SADN2", was taken 2 days before the last injection and SADN3 "serum was taken at week 8 ie 1 week after the last DNA3 injection "
  • Group 5 (positive control group), comprising 6 mice, was vaccinated three times with live virus, strain N1A3 M207 (obtained from the Institute for Animal Science and Health, ID-DLO, NL) at a dose of 10 7 PFU (Plate Forming Unit) per mouse and by injection into the necks , at week 0, at week 16 and at week 17 Serum was collected 2 days after the second injection. A mixture of serum from 5 animals was used for the analyzes.
  • Step 3 Analysis of the humoral and cellular immune response (CTL test). Depending on the case, the animals were euthanized and the spleen was removed under aseptic conditions between 7 days and up to six weeks after the last DNA injection. Part A - Culture and in vitro restimulation of the effectors
  • mice The vaccinated and control mice were euthanized by cervical dislocation and rinsed with alcohol (70% v / v).
  • the rats of these animals were placed in a petri dish containing PB S (Gibco) and were crushed in these dishes using nylon gauze and a curved plastic tube.
  • DME medium Dulbecco's modified Eagle, Gibco
  • penicillin-streptomycin antibiotic solution penicillin at 10,000 U / ml and streptomycin at 10,000 ⁇ g / ml (Gibco)
  • the cells were resuspended at 5 x 10 6 cells per ml in this sterile medium.
  • the spleen cells are distributed for their cultivation in vitro in 25 cm 3 culture flasks (Falcon) at the rate of 25 x 10 "cells / flask.
  • Part of these cells received an in vitro restimulation by adding one of the viral strains mentioned above with a multiplicity of infection (MOI) equal to 2 and the others served as non-restimulated controls.
  • MOI multiplicity of infection
  • the cells of the histocompatible line (fibroblasts) 3T3-swiss albino (haplotype H-2D) are used as targets
  • the CTL test comprises several steps a) The target cells were infected or not infected with a strain of the Aujeszky virus (NIA3 M207) at an MOI equal to 10, the infected cells being designated CV + and the uninfected cells CV "Ninety minutes later, the labeling of the target cells in suspension began (see below - Eu labeling of the cells targets (3T3) in suspension b) As for the effectors cultured in vitro 4 to 7 days (as described above) before, they were taken up in culture flasks, washed 2 x with effector medium and counted to be returned suspended at a rate of 5 x
  • Part C - Eu marking of suspended target cells This type of labeling is applicable both for cells growing in suspension and for adherent cells.
  • Culture flasks at maximum confluence were used for the different labeling of the 3T3 target cells.
  • the culture flask containing the adherent 3T3 target cells was freed from its growth medium and washed 1 x with PB S (Gibco).
  • 5 ml of trypsin-EDTA (Gibco) at 37 ° C. were deposited in the flask on the cell mat. After one minute, the cells were removed by short tapping on the flask. The complete detachment achieved, 7 ml of sterile effector medium [described above] were added.
  • the counting of living cells was carried out with Blue Trypan (0.4% solution (w / v), Sigma). One ml of this suspension was completed with:
  • the upper part of the solution in the tube up to the interface included was recovered.
  • the cells were rid of all traces of Ficoll-Paque by a washing with the effector medium. After counting, the cells were resuspended at a concentration of 105 cells / ml.
  • 5,000 target cells were placed in a 96-well round-bottom plate in the presence of 100 ⁇ l of effector medium to determine the amount of background noise from the Eu.
  • DNA 4 + group 1 animals injected 4 times with DNA 4 " DNA 3 " group 4, animals injected 3 times with DNA "number of repetitions Lysis of uninfected target cells was between 0 and 9% and was not affected by the transition to the Ficoll-Paque gradient.
  • the positive control (group 5) both before and after treatment Ficoll presented a significantly positive cell lysis rate. infected targets were increased by passage over Ficoll-Paque for animals immunized with DNA.
  • the CTL test Group 2 injected 3 times with DNA 4 "(DNA3 4") did not show any lytic activity.
  • the serum was collected twice during the experiment, the last collection being made just before the sacrifice of the animals to obtain the spleen cells for a CTL test, and the antibody responses were measured by :
  • the PRV virus seroneutralization test was carried out according to the procedure which is reproduced below.
  • PD5 cells SOLVAY-DUPHAPv, NL
  • strain viruses Bartha K61 SOLVAY-DUPHAR, NL
  • the medium in which the SN test was carried out had the following composition: 340 ml Eagle minimum essential medium (Flow), 100 ml lactalbumin hydrolyzate 2.5% (w / v); 5-10 ml of 5.6% NaHCO3 (w / v) and 50 ml of fetal calf serum (Gibco).
  • test serum was diluted in series of 2 in 2 in the medium, the dilutions ranging from 1 2 to 1.4096 (50 ⁇ l of serum + 50 ⁇ l of medium each time), in the 96-well plate with flat bottom (Greiner ) Each sample was tested in duplicate
  • the virus was diluted to 100 TCID50 (tissue culture infectious dose at 50%) in 0.05 ml of medium and 50 ⁇ l of this diluted virus solution were added to each well
  • the serum mixture / virus was incubated for 24 hours at 37 ° C 50 ⁇ l of the suspension of PD5 cells having a concentration of 4 ⁇ 10 ⁇ cells / ml were added to each serum / virus sample The plates were then incubated at 37 ° C for 5 days
  • the virus was checked by incubating a virus sample diluted for 24 hours at 4 ° C and another virus sample for 24 hours at 37 ° C.
  • the two virus suspensions were diluted (v / v) with the test medium SN (see above) 1 10, 1 100 and 1 1000 Then 0.05 ml of each dilution of the virus suspensions were added per well using 8 wells for each dilution Then 0.05 ml of medium and 0.05 ml of cell suspension was added.
  • the results were interpreted under the microscope after an incubation of 5 days at 37 ° C
  • Serum + is a mixture of serum from 10 OF 1 mice having received at 3 weeks 10 ⁇ TCID (tissue culture infectious dosis) of recombinant adenovirus expressing the gD gene intramuscularly and collected 3 weeks later
  • Table 3 and Table 4 reproduced below, show the optical density (OD) as a function of the dilutions of the serum
  • the positive samples thus identified were tested a second time at variable dilutions (Table 4)
  • SADN2 serum from animals injected twice with DNA
  • SADN3 serum from animals injected 3 times with DNA
  • SADN3 4 serum from animals injected 3 times with DNA
  • SADN4 4 serum from animals injected 4 times with DNA 4
  • Table 4 ELISA test - optical density (OD) as a function of dilutions of test serum 2
  • mice Five groups of ten mice (Charles River, Germany) females of 16 weeks of age of the inbred strain Balb c were used
  • Group G 1 (the positive control) was vaccinated using an attenuated virus (strain N1A3 M207) intraperitoneally l ⁇ 7 PFU (plaque-forming units) were used for each mouse This is a very high dose by comparison with the doses used for the vaccination of pigs with the attenuated vaccine strains traditionally used at the dose of 10 ⁇ 5 PFU
  • Plasmid DNA vaccination was carried out by intramuscular injection of 100 ⁇ g in 2 times 100 ⁇ l of water / mouse in the hindquarters left and right for several consecutive days
  • Group C was vaccinated twice, Friday and Monday respectively
  • Group B received four consecutive injections from Wednesday to Monday
  • Group A received 6 doses distributed from Monday to the following Monday
  • the animals were housed in cages, separated by group and the individuals were individually marked with blue felt
  • the serum taken from each animal was coded so as to be able to follow each animal individually with regard to the antibody assay and the protection conferred by the vaccinations. Part B - Analysis of the immune responses
  • Example 2 The development of humoral responses was controlled according to the ELISA protocol presented in Example 2 The test for neutralization of serum virus was carried out according to the method described in Example 2
  • Serum samples were taken at the start of the immunization period, i.e. 3 days after the last vaccine injection, at the end of the immunization period, i.e. one month after the last injection injection of vaccine and just before the test inoculation with the virulent virus which took place 9 days later Finally, one month after the challenge, serum was taken again Part C - Test inoculation
  • mice were exposed to infection with a live virulent virus of the NIA3 strain at the rate of 7,000 PFU in 200 ml per animal injected intraperitoneally.
  • Example 4 Induction of protection in mice against challenge inoculation with virulent viruses. For these experiments, the immunization protocol of Example 3 was followed, with the only difference that injections of plasmid DNA were performed every three weeks and that the mice were 19 weeks old.
  • the Gl group (positive control) was vaccinated using the attenuated virus (strain NI A3 M207) in the necks with a dose of 10? PFU per mouse
  • Four injections of plasmid DNA were carried out intramuscularly in the two hindquarters of groups of mice each comprising 10 animals, marked with a colored code
  • mice were exposed to the virulent virus NIA3 at the rate of 7000 PFU / animal, injected intraperitoneally Deaths are recorded during the 15 days following the test and are listed in Table 6 The results show the survival rates expressed as a percentage as a function of the days following the test Table 6 Monitoring of the survival rate of mice after an inoculation of test with virulent viruses
  • a group of 3 animals (# 1, 2 and 3) which have not been vaccinated is used as a negative control
  • Three animals (# 4, 5 and 6) received a dose of 75 ⁇ g of plasmid, while 3 other pigs (# 7, 8 and 9) received 560 ⁇ g of plasmid on each injection
  • the dose of DNA was diluted in 4 ml of PBS buffer (Gibco, USA) and administered in 4 portions of 1 ml at 4 places of inoculation on both sides of the neck and in the center of the left and right hindquarters
  • the injection was performed on the using a syringe fitted with a Terumo needle 40 mm long with an opening of 0 9 mm
  • Serum was collected during each injection and 2 weeks after the last injection. Analysis of the humoral responses (antibodies against the glll protein) before and during the immunization was carried out by a seroneutralization test (test sensitive to mediation by the complement, see Bitsch and Eskilsen, curr Top Vet Med Anim Sci.
  • IPMA test Immuno Peroxidase Monolayer Assay
  • test serum diluted 2 in 2 in series in PBS was distributed in the wells and the plate was incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the serum was removed and the plates were washed twice with PBS, followed of an hour's incubation in the presence of anti-porcine antibodies labeled with peroxidase (Nordic, Holland) and diluted 100 times in PBS After 1 hour, the plates were incubated in the presence of substrate 3 amino 9 ethylcarbazole (2 mg AEC in 10 ml of sodium acetate buffer (0 05 M at pH 5) and 75 ⁇ l of H 2 O 2 at 30%) The appearance of a red coloration is observed under an optical microscope The reaction was stopped after 15 minutes by 3 city water washes IPMA titers are calculated by taking the inverse of the highest dilution which causes a red coloration of the viral antigen foci on the infected cells
  • IPMA antibody titer determined by the IPMA method
  • results show that none of the unvaccinated animals developed antibodies against the PRV virus.
  • the results indicate that even at the lowest vaccination dose, ie 3 x 75 ⁇ g, a humoral response was induced in 2 out of 3 pigs. Only one animal out of 3 reacted to a dosage of 560 ⁇ g
  • Example 6 Induction of protection against a test with a virulent virus in pigs The protocol of example 5 is reproduced exactly. Three groups of 3 pigs aged 5 weeks were used. The animals come from a farm free from GRP. and of the same scope They are individually marked by a ring at the ear
  • the virulent virus test was carried out according to the method described in Vaccine 1994, 12 (7), p 661 665 and is described below.
  • the relative weight gain (RDWG) was calculated according to the formula below, in order to compare the performances of the three RDWG groups from the day of the test until day x day weight x weight on day of the test
  • RDWG weight on the day of the test
  • the nasal secretions of all the animals were taken with a swab every other day for 14 days after the test The weight of the nasal secretions taken was noted
  • the nasal secretions taken were suspended in phosphate buffer. Decimal dilutions of these suspensions were inoculated into monolayer cell cultures, these cells coming from a continuous pig testicle (ST) cell line. Then, the presence of a cytological effect for these cell cultures was checked for five days.
  • the lethal dose 50 was calculated according to the method of Reed and Muench (Amer. J. Hyg., 1938, 27, 493 497).
  • the virus titers were expressed in TCID50 per gram of nasal secretion.
  • the seroneutralizing antibody titers were observed between 64 and 128 for the animals belonging to the negative control group, between 128 and> 384 for the animals having received a dose of 75 ⁇ g of plasmid, and between 128 and 192 for animals having received a dose of 560 ⁇ g of plasmid
  • the first viruses were isolated from the nasal secretions, two days after the test, for two of the three animals in each group.
  • the titles virus reached a peak between the fourth and sixth day after the test, virus titers ranging between 10 ⁇ , 10 ⁇ 5 e t ' ⁇ TCID 50.
  • the secretion of virus was stopped between the sixth and the eighth day after the test for the vaccinated animals, while it continued until the twelfth day after the test for the animals of the negative control group.
  • the accessibility of the micro-organism can only be achieved by providing a sample to an expert designated by the applicant.

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Abstract

Vaccin comprenant au moins un plasmide codant pour la glycoprotéine gIII du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine gIII du virus PRV et un excipient pharmaceutiquement acceptable pour celui-ci. L'invention concerne également le plasmide pEVhis14gIII utilisée dans la fabrication d'un vaccin.

Description

Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique
La présente invention concerne un vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique, encore connu sous le nom de virus de la maladie d'Aujeszky (ADV), de virus porcin de l'herpès 1 (PHV-1) ou de virus heφès- 1 Suid (SHV-1) La maladie d'Aujeszky est une maladie d'origine virale à laquelle la plupart des mammifères sont sensibles Cependant, l'homme ne semble pas être sensible à cette maladie
L'agent provoquant cette maladie est un virus enveloppé à ADN bicatenaire de la famille des Herpesviridae, sous-famille des alpha- herpesvirinae, à savoir, le virus pseudorabique (PRV)
Le génome du virus PRV est formé par une molécule d'ADN bicatenaire d'environ 150 kb et consiste en une région unique longue (UjJ et en une région unique courte (Us) qui est flanquée par deux séquences répétées inverses, l'une terminale (TR) et l'autre interne (IR) (BEN-PORAT, T et al, 1979, Virology 95, p 285-294)
Le génome du virus de la maladie d'Aujeszky contient au moins 70 gènes
Les principales caractéristiques et propriétés biologiques des gènes du PRV les mieux caractérisées sont reprises dans le Tableau 1 ci-dessous
Tableau 1 Propriétés de certains gènes du PRV, leurs caractéristiques et propriétés biologiques (extrait de Mettenleiter T , Acta Veterinaria Hungarica, 42 (2-3), p 153-177 (1994)) κ5 m U) o
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1 n5
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Figure imgf000004_0001
La transmission du virus se réalise habituellement par voie orale, respiratoire ou par contact direct entre un animal infecté et un animal sain
La maladie est devenue préoccupante pour les élevages porcins où elle se manifeste sous plusieurs formes 1 Les adultes développent peu de signes cliniques, mais deviennent des sources d'infection permanentes Toutefois, le virus PRV peut provoquer l'avortement des truies en gestation 2 Les porcelets subissent une atteinte grave du système nerveux central Les porcelets présentent une sensibilité élevée à la naissance qui diminuera progressivement Jusqu'à l'âge de 10 jours, les porcelets atteints, ne bénéficiant pas d'immunité passive provenant de la mère, succombent en quelques heures Plus âgés, ils sont sujets à des tremblements musculaires, des contractions, mais l'évolution est plutôt bénigne
Dans d'autres espèces la maladie peut être mortelle et la durée d'incubation est variable et comprise entre 15 heures et 12 jours
Il existe actuellement plusieurs méthodes de vaccination contre la maladie d'Ausjeszky
Une des méthodes classiques consiste en l'injection de virus vivants, qui doivent être atténués pour éviter que la maladie ne se déclare Ainsi, on utilise pour la vaccination des porcs, des virus PRV de la souche
Bartha qui comprennent des mutations dans le génome codant pour les glycoprotéines gl, gp63 et glll ainsi que pour une protéine de la capside virale dont le gène se situe sur le fragment BamHI 4 (Mettenleiter T , Acta Veterinaria Hungarica, 42 (2 - 3), p 153-177 ( 1994)) On utilise aussi les vaccins vendus sous les noms OMNIVAC®-PRV
(FERMENTA ANIMAL HEALTH Co , Kansas City, MO, USA) et OMMMARK®-PRV (FERMENTA ANIMAL HEALTH Co , Kansas City, MO, USA) qui comprennent des virus PRV de la souche Bucharest, manipulés génétiquement Ces souches comportent des délétions dans les gènes codant respectivement pour la thymidine kinase ou pour la thymidine kinase et glll Bien entendu, il existe encore d'autres vaccins contre la maladie d'Aujeszky qui fonctionnent selon le même principe
Cette méthode de vaccination confère au sujet vaccine une bonne protection qui est due à l'action intracellulaire du virus vivant En effet, les virus vivants pénètrent dans les cellules où les antigènes viraux seront synthétises
Ensuite, les peptides dérivés de ces antigènes viraux sont présentes à la surface des cellules infectées en association avec le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC I). Une réponse cytotoxique peut ainsi être provoquée en plus de la réponse humorale ce qui induit chez le sujet vacciné une meilleure protection contre le virus. Bien que les virus soient atténués par des mutations, un risque existe que les virus redeviennent pathogènes par des mutations spontanées ou par des recombinaisons avec des virus de type sauvage.
Les vaccinations par des agents viraux vivants peuvent aussi entrainer, sous certaines conditions, une prolifération de virus vivants. Cette prolifération de virus vivants, même atténués, constitue un risque pour des sujets plus susceptibles, tels que des nouveau-nés ou des sujets en gestation.
Une autre technique mise au point plus récemment, consiste en l'utilisation d'un vecteur vivant non-pathogène portant des gènes sélectionnés du virus PRV
M. ELOIT et al (J.T. van Oirschot (éd.), Vaccination and control of Aujeszky's Disease, p. 61-66, ECSC, EEC, EAEC, Brussels and Luxembourg,
1989) ont mis au point un vaccin basé sur l'adénovirus type 5 (AD5) recombinant qui donne lieu à l'expression du gène gp50 du virus PRV
W.L. MENGELING et al (Arch. of Virology, V 134, n* 3-4, p. 259-269, 1994) ont publié des résultats d'essais avec un virus vaccinia (NYVAC) contenant les gènes du PRV codant pour les glycoprotéines gp50, gll et glll. Cependant, l'efficacité de ce type de vaccin est limitée.
Par contre M L. VAN DER LEEK et al (The Veterinary Record (1994) 134, p. 13-18) ont abouti à des résultats encourageants avec une vaccination de porcs contre le virus PRV par scarification ou par injection intramusculaire d'un recombinant du virus de la variole porcine et du virus PRV (rSPV-AD). Ce recombinant a été obtenu par insertion des gènes PRV codant pour les gp50 et gp63 attachés au promoteur P 7.5 du virus vaccinia dans le gène de la thymidine kinase du virus SPV.
Bien entendu, il existe encore d'autres vaccins contre la maladie d'Aujeszky qui fonctionnent selon le même principe
Une nouvelle approche pour induire une réponse immunologique a été décrite récemment par ULMER et al, 1993, Sci. 259 1745). Des souris ont été immunisées par injection intramusculaire d'un plasmide comprenant le gène de la nucléoprotéine du virus de l'influenza sous le contrôle d'un promoteur mammahen Cette immunisation par injection du plasmide a apparemment conduit à une transfection de cellules musculaires, suivie d'une expression in situ de la protéine, aboutissant à une réponse immunologique spécifique contre le virus de l'influenza, de type cellulaire et humoral, et par conséquent à une protection contre une attaque par ce virus.
Il semble, d'après les expériences publiées, que des parties de protéines virales produites à l'intérieur des cellules transfectées soient reprises par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et présentées à la surface de la cellule
ROBINSON et al, décrivent en 1993, dans Vaccine 1 1, 957-960 une immunisation de poules contre le virus de l'influenza par des injections intraveineuses, intrapéritonéales et sous-cutanées de plasmide De 28 % à 100 % des animaux ainsi immunisés résistent à un "challenge" par une dose létale du virus II est a noter que l'efficacité dépend fortement de la voie et du système utilise pour l'injection et d'un éventuel prétraitement du site d'injection (DANKO ét al, Vaccine 12, 1499-1502 (1994)) GRAHAM J M COX et al ont décrit une méthode de vaccination de bovins et de souris contre le virus BHV- 1 par injection d'ADN plasmidique, dans J Virol. 1994 p 5685-5689 On a pu montrer que l'injection intramusculaire de bovins et de souris (dans le quadriceps) d'ADN plasmidique contenant le gène des glycoprotéines de gl, glll ou gIV de BHV- 1 suscitait une réponse immunitaire dans l'animal vacciné La réponse immunitaire dépend fortement de la quantité d'ADN injecté, et de la glycoprotéine. Ainsi, le gène de la protéine gIV provoquait une réponse supérieure à celle des protéines gl et glll
Aucun des vaccins plasmidiques décrits à ce jour n'est efficace contre des maladies virales infectant les porcs et autres espèces tels que la maladie d'Aujeszky causée par le virus PRV.
Le but de la présente invention est de proposer un vaccin plasmidique contre le virus PRV responsable de la maladie d'Aujeszky
Ce but est atteint par un vaccin comprenant au moins un plasmide codant pour la glycoprotéine glll du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV et un excipient pharmaceutiquement acceptable pour celui-ci
Un des avantages de cette méthode réside dans le fait que cette méthode est peu onéreuse
En effet, le plasmide peut être produit, selon des techniques bien maîtrisées, dans des bactéries telles que E. coli
L'extraction de plasmides est bien connue et un rendement élevé peut être obtenu.
Il n'est pas nécessaire que le gène introduit dans le plasmide code pour la protéine glll entière, il suffit qu'il code pour une partie ou un homologue de la protéine glll du PRV qui a la même antigénicité que la protéine glll c.-à-d le même effet sur le système immunologique que la protéine glll En effet, une partie seulement de la protéine glll est identifiée par le système immunologique de l'animal, les autres parties de la protéine, bien que jouant certainement un rôle dans la vie du virus, ne sont pas essentielles dans la reconnaissance de la protéine par l'organisme infecté. Un autre avantage est qu'on peut facilement distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés par le virus PRV. En effet, les animaux vaccinés ne développent que des anticorps contre la protéine glll tandis que les animaux infectés par le virus PRV développent aussi des anticorps contre d'autres protéines du virus. De plus, la méthode est sûre, car une prolifération de virus vivants n'est pas à craindre Comme on n'injecte qu'une partie bien déterminée du génome du virus, il n'y a pas d'infection par des virus et donc par voie de conséquence il ne peut y avoir de prolifération de virus.
Du fait que les cellules musculaires ont une grande longévité et ne circulent pas dans le corps de l'animal, l'expression locale et continue de l'antigène à de faibles concentrations peut stimuler la réponse immunologique à long terme. La vaccination par le vaccin selon la présente invention peut être utilisée comme outil diagnostique car elle induit la formation d'anticorps monospécifiques Ces anticorps peuvent être utilisés pour la détection de l'antigène p. ex. lors des tests ELISA ou autres.
Un effet surprenant de l'invention réside dans l'efficacité de l'immunisation contre le virus PRV Bien que l'importance de la glycoprotéine glll dans l'immunisation soit bien connue, l'injection de la protéine glll purifiée ne semble pas avoir d'effet prononcé d'immunisation. Z H. BISEIBUTSU et al décrivent, dans la demande de brevet japonaise
JP 05/246888, un vaccin contre le virus PRV, à base de la glycoprotéine glll purifiée et d'un adjuvant à base d'huile Cette approche n'est pas utilisée à l'échelle commerciale
A MATSUDA TSUCHIDA et al montrent dans un article publié au J Vet med Sci 54(3) 447-452, 1992, qu'un mélange de glycoprotéines gll, glll et gIV purifié injecté ensemble avec un adjuvant classique à base d'huile, confère une meilleure protection à des souris contre un challenge par des virus PRV virulents que les glycoprotéines injectées individuellement.
II reste à noter que des vaccins employant des protéines purifiées sont, en général, très onéreux car les étapes de purification sont longues et compliquées Selon un premier mode de réalisation avantageux, le plasmide est le plasmide pEVhisl4gIII.
Le plasmide pEVhisl4gIII a l'avantage de comporter un gène conférant une résistance à l'ampicilline, de sorte que les bactéries transformées, ayant incorporé le plasmide, sont aisément sélectionnâmes en ajoutant de l'ampicilline dans leur milieu de croissance.
Bien entendu, on peut envisager d'utiliser d'autres plasmides II suffit que le plasmide comprenne un gène codant pour une protéine ayant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV, inséré dans le plasmide de façon à ce qu'il soit exprimé dans l'organisme vacciné Un marqueur tel qu'un gène conférant une résistance à un antibiotique permet de sélectionner les bactéries transformées par le plasmide.
Pour augmenter l'efficacité du vaccin, le plasmide peut contenir outre le gène codant pour la glycoprotéine glll du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV, un ou plusieurs gènes codant pour des cytokines.
Certaines cytokines sont connues pour exercer une activité adjuvante sur les vaccins Le fait de les introduire dans le plasmide de façon à ce qu'elles puissent être exprimées dans les cellules augmentera l'efficacité du vaccin
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le vaccin comprend aussi un excipient pharmaceutiquement acceptable dans lequel le plasmide est incorporé. Le terme "excipient pharmaceutiquement acceptable", mentionné dans ce document, se réfère soit à des milieux liquides soit à des milieux solides susceptibles d'être utilisés comme excipient (véhicule) pour introduire le plasmide dans l'animal à vacciner Citons comme exemple des milieux liquides, l'eau, le sérum physiologique, le tampon phosphate-salin, les solutions contenant des adjuvants, des détergents, des stabilisants et substances favorisant la transfection, les suspensions de liposomes, de virosomes et les émulsions.
Citons comme exemple des milieux solides, les microbilles d'or recouvertes de plasmide, destinées à être projetées par bombardement ("gène gun") dans les tissus de l'animal et les microparticules contenant de l'ADN, utilisables par voie parentérale et orale
La vaccination par ADN peut être éventuellement précédée d'un prétraitement du site de vaccination (par ex. utilisation d'un anesthésiant local) de façon à améliorer son efficacité. La présente invention propose également un vaccin plasmidique contre le virus PRV comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine glll du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV ou une construction d'ADN comprenant une cassette d'expression incluant a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide contenant au moins un déterminant antigénique de la glycoprotéine glll ou un fragment immunogénique de celle-ci, et b) des séquences de contrôle reliées opérativement auxdites séquences codantes où ladite séquence codante peut être transcrite et traduite dans une cellule et où lesdites séquences de contrôle sont homologues ou hétérologues à ladite séquence codante.
Avantageusement, le vaccin plasmidique contient un ou plusieurs gènes codant pour des cytokines.
Selon encore un autre aspect de la présente invention, on propose d'utiliser le plasmide pEVhisHglII dans la fabrication d'un vaccin
On propose également d'utiliser le plasmide pEVhisHglII dans la fabrication d'un vaccin contre le virus PRV
L'invention est décrite plus en détail, à titre d'illustration, dans les exemples qui suivent Exemple 1 : Obtention d'un vaccin
Le vaccin a été obtenu en trois étapes, comprenant la construction d'un plasmide (pEVhisHglII) contenant le gène de la glycoprotéine glll du virus PRV, la production de ce plasmide dans des bactéries transformées et la formulation du vaccin comprenant le plasmide et un excipient pharmaceutiquement acceptable Etape A : Construction d'un plasmide (pEVhisHglII) contenant le gène de la glycoprotéine glll du virus PRV L'ADN du plasmide pEVhisHglII a été obtenu de l'Institute for Animal Science and Health, (ID DLO, Lelystad, NL). Il comprend le gène de la glycoprotéine glll du virus PRV, sous contrôle du promoteur HCMV et le gène marqueur de la résistance à l'ampicilline. il est utilisé en tant que vaccin à ADN (ADN+) La carte du plasmide est donnée à la Figure 1 Le plasmide a été déposé conformément au Traité de Budapest le 16 novembre 1995 à la collection nommée "Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - Laboratorium voor Moléculaire Biologie - Plasmiden collectie" (LMBP), Universiteit Gent, K L Ledeganckstraat 35 Gent, Belgique B - 9000 sous le numéro d'accession LMBP3377
Etape B Production du plasmide dans des bactéries transformées Préparation de cellules d'E. coli traitées au RbCl.
Avant d'être transformées, les cellules d' E coli, souche DH 5* (Gibco) ont été soumises à un traitement au RbCl pour augmenter l'efficacité de la transformation La procédure qui a été suivie, à l'exception près que nous avons utilisé une souche E coli DH 5α, est décrite dans le bulletin d'information "The NEB transcript", vol 6(1 )p7, may 1994, édité par NEW ENGLAND BIOLABS, Ine , Beverly, MA01915 Transformation de cellules d'E. coli traitées au RbCl. 100 μl de cellules traitées au RbCl et 1 μl de solution d'ADN contenant
250 ng de plasmide pEVhisHglII ont été incubés pendant 10 minutes sur de la glace (à 0 °C) et ensuite pendant 5 minutes à 37 °C Le mélange a ensuite été transféré dans 2 ml de milieu RB (bactopeptone 1 % (p/v), extrait de levure 0 5 % (p/v), NaCl 1 % (p/v)) et incubé entre 30 minutes et 2 heures à 37 °C sous agitation L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume
100 et 500 μl de la culture de cellules ont été étalés sur une boîte de Pétri contenant un milieu RB + ampicilline 100 μg/ml + agar 2 % (p/v) Mini préparation d'ADN plasmidique pEVhisHglII. Les colonies obtenues ci dessus ont d'abord été utilisées pour effectuer des mini préparations afin de vérifier la production et la structure du plasmide pEVhisHglII Des colonies individuelles ont été mises en culture pendant une nuit dans 2 ml de milieu RB + ampicilline 100 μg/ml
Les cultures ont été traitées ensuite comme décrit dans "Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, E.F Fritsch et T Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) sous le chapitre "Small scale préparations of plasmid DNA", § 1 21 1 28 à l'exception près que pour les étapes 1 4, les centrifugations ont été faites à température ambiante et que la composition de la solution III a été modifiée de façon à contenir de l'acétate de sodium 3 M, a pH 4,8
Les culots ont ete séchés sous vide et repris dans 100 a 200 μl d'eau (filtrée sur appareil Milli Q, Millipore, USA) sans traitement par la RNAse
L'analyse par digestion au moyen de diverses enzymes de restriction, suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose a permis de vérifier la conformité du plasmide (voir aussi "Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, E F Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), §6) Maxi-préparation d'ADN plasmidique pEVhisHglII.
Afin d'obtenir de l'ADN plasmidique en quantité suffisante pour les vaccinations, l'ADN plasmidique a été produit en plus grande quantité selon un des deux modes opératoires suivants Une suspension de E. coli transformé par le plasmide pEVhisl4gIII est incubée pendant une heure dans 2 ml de milieu RB et ensuite répartie dans 1 à 4 flacons de 400 ml de milieu RB contenant de l'ampicilline à raison de 100 μg/ml Les cultures ont été incubées pendant une nuit à 37 °C sous agitation à environ 150-200 tours par minute Les cultures ont été centrifugées dans des tubes Nalgene de 500 ml pendant 7 minutes à 8 670 g Toutes les centrifugations ont été effectuées dans une centrifugeuse Beckman modèle J2-21
Le surnageant a été éliminé et le culot a été remis en suspension dans 10 ml de solution 1 (glucose 1 % (p/v); tris-HCl 25 mM; pH = 8,0, EDTA 10 mM, lysozyme 1 % (p/v)) et transvasé dans un tube Nalgene de 40 ml Le tube a été laissé pendant 5 minutes à température ambiante Ensuite 10 ml de la solution 2 (NaOH 0,2 M, SDS (sodium dodécyl sulfate) 1 % (p/v)) ont été ajoutés, les tubes ont été agités et laissés pendant 5 minutes à température ambiante 10 ml de solution 3 (acétate de sodium 3 M; pH = 4,8) ont été ajoutés et les flacons ont été agités puis centrifugés pendant 30 minutes à 48 400 g à 0 °C 25 ml du surnageant ont été transvasés dans un tube Falcon de 50 ml recouvert de six couches de gaze Si nécessaire, le volume peut être ajusté avec du TE (tris-HCl 10 mM, pH = 8,0, EDTA 1 mM) Ensuite, on a ajouté 15 ml d'isopropanol à température ambiante, agité et transféré le mélange dans un tube Nalgene de 40 ml Après centrifugation pendant 15 minutes à 48 400 g à 0 °C, le surnageant a été éliminé Après avoir bien drainé le liquide et dissout le culot dans 5 ml de TE, les suspensions ont été incubées pendant 30 minutes à 37 °C sous agitation en présence de RNase A à une concentration finale de 0, 1 mg/ml Ensuite on a ajouté 10 μl de protéinase K en solution ( 10 mg/ml) et incubé pendant 30 minutes à 37 °C minimum sous agitation
Les colonnes TIP 500 QIAGEN (QIAGEN, INC , CA, USA) ont été équilibrées par 10 ml de tampon QBT (NaCl 750 mM, MOPS 50 mM, ethanol 15 % (v/v), Triton X- 100 0, 15 % (v/v), pH = 7,0) par un écoulement sous simple gravité L'abréviation MOPS représente l'acide sulfonique 3-(N- morpholino)propane Les échantillons ont été déposés sur les colonnes, et les colonnes ont été lavées 6 fois par 10 ml de tampon QC (NaCl 1 000 mM, MOPS 50 mM, ethanol 15 % (v/v), pH = 7,0) Après elution par 20 ml de tampon QF1 (NaCl 1 250 mM, MOPS 50 mM, ethanol 15 % (v/v), pH = 8,2), la solution a été récupérée dans des tubes Nalgene de 40 ml 14 ml d'isopropanol ont été ajoutés a température ambiante Après agitation, le mélange a été centrifugé pendant 15 minutes à 48 400 g à 0 °C Le surnageant a été éliminé et le culot a été séché sous vide et repris dans 500 μl d'eau Milli-Q Après trois extractions du surnageant par 500 μl de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v/v) et une extraction par un volume d'éther, l'ADN a été précipite avec 50 μl d'acétate de sodium 3 M et 0,7 ml d'isopropanol Après centrifugation pendant 10 minutes à 0 °C à 18 320 g, le culot a été lavé avec 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) Le surnageant a été éliminé après une centrifugation de 10 minutes à 18 320 g à 0 °C et le culot comprenant l'ADN plasmidique a été séché sous vide et mis en solution dans 500 μl d'eau Milli-Q L'abréviation % (v/v) représente le pourcentage de volume par volume Une autre méthode pour produire de l'ADN plasmidique en grande quantité en utilisant des colonnes PZ523 (5 Prime — > 3 Prime, INC , Boulder, CO , USA), est reprise ci-dessous.
Les cultures de 400 ml ont été centrifugées pendant 10 minutes à 8 670 g dans un godet Nalgene de 500 ml (Beckman J2-21) On a ajouté 10 ml de solution 1 (glucose 1 % (p/v), tris-HCl 25 mM pH = 8, EDTA 10 mM; lysozyme 1 % (p/v) (SIGMA)) et on a transvasé 10 ml de ce mélange dans un autre tube Nalgene de 40 ml Après incubation pendant 5 minutes à température ambiante, on a ajouté 10 ml d'une solution 2 (NaOH 0,2 M, SDS 1 % (p/v) fraîchement préparée Après légère agitation, le mélange a été incubé pendant cinq minutes sur de la glace Après ajout de 10 ml de solution 3 (acétate de sodium 3 M, pH = 4,8) froide et centrifugation du tube pendant 20 minutes à 0 °C à 48 400 g, le surnageant, environ 25 ml, a été transvasé dans un tube Falcon de 50 ml recouvert de six couches de gaze Après avoir ajouté 15 ml d'isopropanol, les 40 ml d'échantillon ainsi obtenus ont été transvasés dans un autre tube Nalgene de 40 ml et centrifugés pendant 20 minutes à 0 °C à 48 400 g Le surnageant d'isopropanol a été éliminé, le culot obtenu a été lavé avec 1 ml d'éthanol a 70 % (v/v) et le liquide a été bien drainé Le culot a été resuspendu dans 5 ml de TE auquel on a ajouté 50 μl de RNase A (solution à 10 mg/ml) et incubé pendant 30 minutes à 37 °C sous agitation 10 μl de protéinase K (solution à 10 mg/ml) ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant au moins 30 minutes à 37 °C sous agitation Pour les deux extractions consécutives au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1, v/v/v), 5 ml de cette solution de phénol ont été ajoutés dans un tube Greiner à visser, puis l'échantillon Après légère agitation pendant 20 à 30 secondes pour mélanger, la solution a été centrifugée pendant 5 minutes à 3 920 g dans un rotor de type "swinging bucket" Après avoir passé la solution dans un tube Nalgene, 1 ml d'acétate d'ammonium 7,5 M et 10 ml d'éthanol absolu ont été ajoutés Après centrifugation pendant 20 minutes à 0 °C à 48 400 g (Beckman J2-21), le culot a été lavé avec 1 ml d'éthanol à 70 %, puis séché sous vide et remis en suspension dans 1,8 ml de solution 4 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1 M) Après avoir ôté le bouchon supérieur puis le bouchon inférieur de la colonne, celle-ci a été posée sur un tube de collecte et ensuite centrifugée pendant 1 minute à 980 g Le tube de collecte ayant recueilli le tampon d'équilibrage a été éliminé. La colonne a été placée sur un autre tube de collecte et l'échantillon dissous (1,8 ml) a été déposé au sommet de la résine La colonne a été centrifugée pendant 12 minutes à 980 g dans un rotor de type "swinging bucket" La solution plasmidique recueillie a été divisée en deux tubes Eppendorf auxquels on a ajouté 600 μl d'isopropanol Après centrifugation pendant 15 minutes à 18 320 g (centrifugeuse SIGMA 2K15), le culot a été lavé avec 300 μl d'éthanol à 70 % (v/v) et séché sous vide Le culot comprenant l'ADN plasmidique est remis en solution dans 500 μl d'eau Milli-Q (Millipore, USA) et conservé au froid jusqu'à la vaccination
En ce qui concerne la préparation du plasmide ADN+, environ 1 1 mg ont été préparés selon la méthode utilisant les colonnes PZ523 et environ 16 mg en utilisant les colonnes Qiagen Ces deux préparations ont été mélangées et mises en oeuvre pour les exemples décrits
Etape C Formulation du vaccin comprenant le plasmide et un excipient pharmaceutiquement acceptable Le culot d'ADN plasmidique étant remis en solution dans de l'eau, la concentration en ADN a été déterminée par dépôt sur gel d'agarose et révélation au bromure d'éthidium (voir "Molecular cloning, a laboratory manual", J
Shambrook, E F Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), § 6 et appendix E et Winnacker E.L. "From gènes to clones", VCH (1987), § 2 1.2.2 ) La concentration en ADN a été ajustée de façon à se situer entre 0 3 et 1 μg d'ADN par μl d'eau
Exemple 2 Utilisation du vaccin plasmidique chez la souris pour stimuler l'induction d'une réponse en anticorps et d'une réponse de cellules T cytotoxiques L'expérience menée chez la souris pour prouver l'efficacité du vaccin plasmidique requiert la construction d'un plasmide témoin dérivé du plasmide pEVhisl4gIII, en préalable à l'immunisation des animaux et à l'analyse de la réponse immunitaire
Etape 1 Construction d'un plasmide dérivé du plasmide pEVhisHglII par délétion de la séquence codante du gène glll Un plasmide dérivé du plasmide pEVhisHglII par délétion de ia séquence codante du gène de la glycoprotéine glll a été utilisé en tant que contrôle négatif (pEVhisl4gIH" , ADN") Ce plasmide délété a été obtenu de la manière suivante le plasmide pEVhisHglII a été digéré par les enzymes de restriction Asp 718 et EcoRV. L'ADN a été ensuite traité à l'aide d'ADN polymerase T4 pour obtenir des fragments à bouts francs. L'ADN ainsi obtenu a été ligaturé à l'aide de l' ADN ligase T4 (voir "Molecular cloning, a laboratory manual", J Shambrook, E F Fritsch et T Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), § 1.53 1.73)
En ce qui concerne la préparation du vaccin contenant le plasmide délété, les mêmes étapes ont été suivies que celles décrites pour le plasmide ADN+, à l'exception près que lors de la production du plasmide pEVhisl4gIII par maxi préparation, les colonnes PZ523 ont été utilisées uniquement Etape 2 . Immunisations des souris
5 groupes de 6 à 10 souris femelles de la souche consanguine Balb/c âgées de 16 à 18 semaines à la première injection, ont été utilisées
Les souris doivent êtres consanguines pour mesurer les réponses de cellules T cytotoxiques (CTL) car la compatibilité du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) entre les cellules T cytotoxiques et les cellules cibles, - des cellules (fibroblastes) 3T3-swiss albino (haplotype H-2D) -, doit être garantie Les cellules cibles ont été cultivées dans un milieu DME à 10 % (v/v) de sérum de veau foetal L'ADN plasmidique du plasmide pEVhisHglII, contenant le gène de la glycoprotéine glll du virus PRV, a été utilisé en tant que ADN positif, (ADN+) tandis que le plasmide équivalent, sans le gène glll, (ADN"), a été utilisé en tant que contrôle négatif
100 μg d'ADN ont été injectés dans chaque souris de manière intramusculaire, dans l'arrière train supérieur gauche et droit, en deux portions contenant de 50-150 μl de solution aqueuse, selon le protocole d'immunisation suivant
Le groupe I comprenant 10 souris marquées par un code coloré, a été vacciné quatre fois, à la semaine 0 (ADN]+) à la semaine 3 (ADN2+), à la semaine 5 (ADN3+) et à la semaine 10 (ADN4+) avec de l'ADN+ Du sérum, SADN34", a été prélevé 2 jours avant la dernière injection, du sérum sADN4+ a été prélevé 6 jours après le premier prélèvement c -à-d 5 jours après la dernière injection ADN44"
La semaine 1 1 , les cellules de la rate ont été prélevées et restimulées in vitro Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard Le groupe 2 comprenant également 10 souris marquées par un code coloré, a été vacciné trois fois, à la semaine 0 (ADN ] +), à la semaine 3 ( ADN2+) et à la semaine 5 (ADN3+) avec de l'ADN+ Du sérum, sADN2+, a été prélevé 2 jours avant la dernière injection et du sérum sADN3+ a été prélevé à la semaine 9 c -à-d 4 semaines après la dernière injection ADN3+ La semaine 9, les cellules de la rate ont été restimulées in vitro Les tests
CTL ont été effectués 6 jours plus tard
Le groupe 3 comprenant 8 souris marquées par un code coloré, a été vacciné seulement deux fois, à la semaine 0 (ADN j+) et à la semaine 3 (ADN24") Du sérum, sADN2+, a été prélevé 2 semaines après la dernière injection et à la semaine 9
La semaine 9, les cellules de la rate ont été restimulées in vitro. Les tests CTL ont été effectués 6 jours plus tard
Le groupe 4, ou groupe de contrôle, comprenant 10 souris marquées par un code coloré, a été vacciné trois fois avec de l'ADN", à la semaine 0 avec 200 μg d'ADN" (ADN]"), à la semaine 2 avec 100 μg (ADN2") et à la semaine 7 avec 100 μg d'ADN" (ADN3") Du sérum, SADN2", a été prélevé 2 jours avant la dernière injection et du sérum SADN3" a été prélevé à la semaine 8 c -à-d 1 semaine après la dernière injection ADN3"
La semaine 8, les cellules de la rate ont été prélevées et restimulees in vitro Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard
Le groupe 5 (groupe témoin positif), comprenant 6 souris, a ete vaccine trois fois avec du virus vivant, souche N1A3 M207 (obtenue de l'Institute for Animal Science and Health, ID-DLO, NL) à la dose de 107 PFU (Plaque Forming Unit) par souris et par injection dans les cous de pied, à la semaine 0, à la semaine 16 et à la semaine 17 Du sérum a été prélevé 2 jours après la deuxième injection. Un mélange de sérum provenant de 5 animaux a été utilisé pour les analyses.
La semaine 18, les cellules de la rate ont été prélevées et restimulées in vitro Les tests CTL ont été effectués 4 jours plus tard. Etape 3 : Analyse de la réponse immunitaire humorale et cellulaire (test CTL). Selon le cas, les animaux ont été euthanasiés et la rate a été prélevée dans des conditions aseptiques entre 7 jours et jusqu'à six semaines après la dernière injection d'ADN. Partie A - Mise en culture et restimulation in vitro des effecteurs
Les souris vaccinées et les souris témoins ont été euthanasiées par dislocation cervicale et rincées à l'alcool (70 % v/v). Les rates de ces animaux ont été déposées dans une boîte de Pétri contenant du PB S (Gibco) et ont été écrasées dans ces boîtes à l'aide d'une gaze en Nylon et d'un tube en plastique recourbé. L'élimination des agrégats et du tissu conjonctif entourant la rate s'est faite par filtration (au travers de la gaze en Nylon) du broyât obtenu. Après une centrifugation à 220 g pendant 4 minutes, le culot a été récupéré et les érythrocytes ont été lysés par ajout de 4 ml/rate de solution stérile ACK (0, 15 M NH4C1, 1 mM KHCO3, 0, 1 mM NaEDTA pH = 7,2-7,4).
Ensuite, deux lavages ont été réalisés avec du milieu effecteur stérile [composé de milieu DME (Dulbecco's modified Eagle, Gibco), complété par 10 % (v/v) de sérum de veau foetal (Gibco), 1 % (v/v) de L-glutamine 200 mM (Gibco), 1 % (v/v) de la solution d'antibiotique pénicilline-streptomycine (pénicilline à 10 000 U/ml et streptomycine à 10 000 μg/ml (Gibco), 10 mM de tampon HEPES (pH = 7,4) (Sigma), 2 x 10"5 M de 2-mercaptoéthanol (Gibco), 2 mM de pyruvate de sodium (Merck)]. Les cellules ont été remises en suspension à raison de 5 x IO6 cellules par ml dans ce milieu stérile. Les cellules de rate sont réparties pour leur mise en culture in vitro dans des flacons de culture de 25 cm^ (Falcon) au taux de 25 x 10" cellules/flacon. Une partie de ces cellules a reçu une restimulation in vitro par ajout d'une des souches virales citées plus haut avec une multiplicité d'infection (MOI) égale à 2 et les autres ont servi de témoins non restimulés. Ces flacons ont été disposés verticalement dans un incubateur pendant 4 à 7 jours (à 37 °C. 3 % (v/v) de CO2 et une humidité supérieure à 90 % de la saturation) comme décrit plus haut Partie B - Le test CTL
Les cellules de la lignée histocompatible (fibroblastes) 3T3-swiss albino (haplotype H-2D) sont utilisées comme cibles Le test CTL comporte plusieurs étapes a) Les cellules cibles ont été infectées ou non par une souche du virus Aujeszky (NIA3 M207) à une MOI égale à 10, les cellules infectées étant désignées CV+ et les cellules non infectées CV" Quatre-vingt-dix minutes plus tard, le marquage des cellules cibles en suspension a débuté (voir plus loin - Marquage à l'Eu des cellules cibles (3T3) en suspension b) Quant aux effecteurs mis en culture in vitro 4 à 7 jours (comme décrit plus haut) auparavant, ils ont été repris dans des flacons de culture, lavés 2 x avec du milieu effecteur et comptés pour être remis en suspension à raison de 5 x
10^ cellules/ml Six heures après le début de l'infection des cellules cibles, celles-ci ont été mises au contact des effecteurs (parmi lesquels des lymphocytes Tc) Dans une plaque de 96 puits à fond rond, 5 000 cellules cibles dans 50 μl de milieu effecteur (marquées à l'Eu et infectées ou non) ont été déposées sur respectivement 500 000, 250 000, 125 000, 62 500, 31 250, 15 625 effecteurs dans 100 μl (c.-à-d des rapports effecteurs/cibles allant de 100/1 à 3/1) Des répétitions (3 ou 4 fois) sont effectuées pour chaque condition La plaque a été centrifugée a ± 50 g pendant 4 minutes et mise à 37 *C durant 4 heures L'évaluation de la quantité de cellules cibles lysées par les lymphocytes Te a été effectuée par un prélèvement de surnageant après une nouvelle centrifugation de 4 minutes à ± 50 g Celui-ci a été déposé dans une plaque de 96 puits à fond plat dans 200 μl d'une solution amplificatrice de la fluorescence (DELFIA® Enhancement solution, Pharmacia, Sweden) dans le cas du marquage à l'Eu Le comptage au fluorimètre (delayed-time fluorimeter, 1234 DELFIA Recherche, Wallac) a été effectué ± 12 heures plus tard en ayant pris soin de mettre les plaques contenant le mélange à l'obscurité et à température ambiante
La quantification de la lyse spécifique (en %) a été estimée à l'aide de la formule suivante Libération expérimentale - bruit de fond x 100 = Lyse spécifique (%) Liberation maximale - bruit de fond
Partie C - Marquage à l'Eu des cellules cibles en suspension Ce type de marquage est d'application tant pour des cellules se développant en suspension que pour des cellules adhérentes.
Des flacons de culture à confluence maximale ont été utilisés pour les différents marquages des cellules cibles 3T3. Le flacon de culture contenant les cellules cibles 3T3 adhérentes a été débarrassé de son milieu de croissance et lavé 1 x avec du PB S (Gibco). 5 ml de trypsine-EDTA (Gibco) à 37 °C ont été déposés dans le flacon sur le tapis cellulaire Au bout d'une minute, les cellules ont été décrochées par petits coups secs sur le flacon Le décrochage complet réalisé, 7 ml de milieu effecteur stérile [décrit au-dessus] ont été ajoutés. Les cellules ont été lavées 1 x avec une solution composée de tampon HEPES [50 mM HEPES (acide (hydroxy-2-éthyl)- 4-pipérazinyl-l,2-éthanesulfonique) (pH = 7,4), (Sigma); 93 mM NaCl (Merck); 5 mM KC1 (Merck), 2 mM MgCl2-6H2θ (Merck)] et remises en suspension à raison de 6 x 10^ cellules/ml dans ladite solution. Le comptage de cellules vivantes a été effectué avec du Bleu Trypan (solution à 0,4 % (p/v), Sigma). Un ml de cette suspension a été complété par :
- 750 μl de la solution du tampon HEPES (pH 7,4),
- 200 μl de la solution d'Eu-DTPA (1,52 ml de la solution standard d'Eu (1 000 μg/ml dans 1 % (v/v) d'acide nitrique) (Aldrich); 8 ml de la solution du tampon HEPES (pH 7,4); 0,5 ml de DTPA acide diéthylène triaminepentaacétique (Merck) à 3,93 g dans 100 ml de la solution du tampon HEPES) et après 2 minutes, par 100 μl de sulfate de dextran (50 mg sulfate de dextran, M W. = 500 KDa, Pharmacia dans 10 ml de la solution du tampon HEPES).
Trente minutes ont été nécessaires au marquage à température ambiante Pendant ce marquage, les tubes ont été agités faiblement toutes les 10 minutes
Après quoi, 7 ml de tampon de réparation [0,588 g de CaCl2 2H2O (Merck); 1,8 g de glucose (Merck) dans 1 litre de la solution tampon HEPES pH 7,4]; 3 ml de milieu effecteur (voir plus haut) et 12 μl d'ADNase à 17 000 unités/ml (Boehringer Mannheim) ont été ajoutés. Une pause de 8 minutes a été observée. Ensuite, un lavage avec le milieu effecteur a été suivi d'un coussin de Ficoll-Paque (Ficoll et diatrizoate de sodium, Pharmacia LKB) Pour ce faire, les cellules ont été resuspendues dans 5 ml de milieu effecteur dans un tube de 50 ml (Falcon), et 5 ml de Ficoll-Paque ont été déposés dans le fond.
Après quinze minutes de centrifugation à 800 g et 20 °C, la partie supérieure de la solution dans le tube jusqu'à l'interface comprise a été récupérée Les cellules ont été débarrassées de toutes traces de Ficoll-Paque par un lavage avec le milieu effecteur. Après comptage, les cellules ont été remises en suspension à une concentration de 105 cellules/ml.
Pour l'évaluation du marquage, 5 000 cellules cibles ont été déposées dans une plaque de 96 puits à fond rond en présence de 100 μl de milieu effecteur pour déterminer la quantité de bruit de fond de l'Eu.
La même quantité de cellules a été déposée dans 100 μl de Triton X-100 (1 % v/v, Merck) pour la libération maximale d'Eu. Après une centrifugation de 4 minutes à 50 g, 20 μl de surnageant ont été prélevés et déposés dans 200 μl d'une solution amplificatrice (voir plus haut) de la fluorescence et la plaque de 96 puits à fond plat a été passée au fluorimètre (1234 DELFIA Recherche, Wallac) après une incubation de 1 heure dans l'obscurité de façon à atteindre une lecture stable. Partie D - Résultats du test CTL.
Tableau 2 Comparaison de la lyse spécifique des splénocytes avant et après assa e sur un gradient Ficoll-Paque
Figure imgf000021_0001
Notes explicatives concernant les traitements de restimulation in vitro et la préparation des cibles V" cellules de rate mises en culture in vitro en l'absence de virus MOI 2 cellules de rate mises en culture in vitro et restimulées par ajout de virus vivant (NIA3 M207) avec une multiplicité d'infection (MOI) égale à 2. CV" cellules cibles non-infectées, marquées à l'Europium
CV+ cellules cibles infectées par le virus NIA3 M207 à une MOI égale à
10, et marquées à l'Europium
SB++ groupe 5, témoin positif vacciné par du virus vivant
ADN4 + groupe 1, animaux injectés 4 fois avec l'ADN4" ADN3" groupe 4, animaux injectés 3 fois avec l'ADN" nombre de répétitions La lyse des cellules cibles non infectées s'est située entre 0 et 9 % et n'était pas affectée par le passage sur le gradient de Ficoll-Paque. Par contre, le témoin positif (groupe 5), aussi bien avant que après traitement Ficoll a présenté un taux de lyse cellulaire significativement positif. Les pourcentages de lyse des cibles infectées étaient augmentés par le passage sur Ficoll-Paque pour les animaux immunisés avec l'ADN.
Le test CTL du groupe 1, injecté 4 fois avec l'ADN4" (ADN4+) a montré une activité lytique.
Le test CTL du groupe 2, injecté 3 fois avec l'ADN4" (ADN34") n'a pas montré d'activité lytique.
Le test CTL du groupe 3, injecté 2 fois avec l'ADN4" (ADN24") n'a pas montré d'activité lytique.
Le test CTL du groupe 4, injecté 3 fois avec l'ADN" (ADN3") n'a pas montré d'activité lytique. Bien entendu d'autres fréquences et d'autres intervalles sont envisageables, ainsi que d'autres dosages et voies d'immunisation. Partie E - Analyse de la réponse immunologique humorale.
Le sérum a été collecté deux fois au cours de l'expérience, la dernière collecte se faisant juste avant le sacrifice des animaux pour l'obtention des cellules de la rate en vue d'un test CTL, et les réponses anticorps ont été mesurées par :
- un test de séroneutralisation du virus PRV (SN)
- un test immunoenzymatique (ELISA) pour la mesure dans le sérum de souris des anticorps dirigés contre un extrait de toutes les glycoprotéines PRV.
Le test de séroneutralisation du virus PRV a été effectué selon le mode opératoire qui est repris ci-dessous.
Des cellules PD5 (SOLVAY-DUPHAPv, NL) et des virus de la souche Bartha K61 (SOLVAY-DUPHAR, NL) ont été utilisés L'expérience a été réalisée dans des plaques à 96 micropuits à fond plat de Greiner (France)
Le milieu dans lequel le test SN a été effectué avait la composition suivante 340 ml Milieu essentiel Eagle minimum (Flow), 100 ml hydrolysat de lactalbumine 2,5 % (p/v); 5-10 ml de NaHCθ3 à 5,6 % (p/v) et 50 ml de sérum de veau foetal (Gibco).
Le sérum à tester a été dilué en série de 2 en 2 dans le milieu, les dilutions allant de 1 2 à 1.4096 (50 μl de sérum + 50 μl de milieu chaque fois), dans la plaque à 96 puits a fond plat (Greiner) Chaque échantillon a été testé en double Le virus a été dilué à 100 TCID50 (tissue culture infectious dose at 50 %) dans 0,05 ml de milieu et 50 μl de cette solution diluée de virus ont été ajoutés à chaque puit Le mélange sérum/virus a été incubé pendant 24 heures à 37 °C 50 μl de la suspension de cellules PD5 ayant une concentration de 4 x 10^ cellules/ml ont été ajoutés à chaque échantillon de sérum/virus Les plaques ont ensuite été incubées à 37 °C pendant 5 jours
Les résultats ont été observés au microscope et les titres ont été calculés en prenant l'inverse de la dilution qui correspond à 50 % de la dilution limite
Le virus a été contrôlé en incubant un échantillon de virus dilué pendant 24 heures à 4 °C et un autre échantillon de virus pendant 24 heures à 37 °C Les deux suspensions de virus ont été diluées (v/v) avec le milieu du test SN (voir plus haut) 1 10, 1 100 et 1 1000 Puis, 0,05 ml de chaque dilution des suspensions de virus ont été ajoutées par puit en utilisant 8 puits pour chaque dilution Puis 0,05 ml de milieu et 0,05 ml de suspension de cellules ont été ajoutés. L'interprétation des résultats sous le microscope a eu lieu après une incubation de 5 jours à 37 °C
Les réponses humorales mesurées par le test SN, après deux, trois et quatre injections d'ADN, ont montrés des valeurs nulles ou faiblement positives
Il est à noter qu'après immunisation avec du virus vivant à fortes doses, des titres mesurables mais relativement bas ont été observés dans l'essai de séroneutralisation. Ces observations sont confirmées par la littérature
Le mode opératoire du test ELISA est décrit par M. ELOIT et al dans ARCH virol (1992), 123, 135-143
En plus du sérum provenant des groupes d'animaux traités comme décrit sous "immunisation des souris", 2 sérums supplémentaires ont été inclus dans l'analyse, un sérum positif (sérum +) et un sérum négatif (sérum -) Le sérum - provient de souris non-injectées (souris OF1, âgées de 3 semaines) Un mélange de sérum de 10 souris a été effectué Le sérum + est un mélange de sérum provenant de 10 souris OF 1 ayant reçu à 3 semaines 10^ TCID (tissue culture infectious dosis) d'adénovirus recombinant exprimant le gène gD par voie intramusculaire et prélevé 3 semaines plus tard Le Tableau 3 et le Tableau 4, repris ci-dessous, montrent la densité optique (OD) en fonction des dilutions du sérum Les échantillons ont d'abord été testés à une dilution de 1/10 (Tableau 3 - test 1) afin d'identifier les échantillons positifs c à-d. les échantillons pour lesquels l'OD était supérieure à la densité optique du sérum du contrôle négatif (OD x 100 = 509) Les échantillons positifs ainsi identifiés ont été testés une deuxième fois à des dilutions variables (Tableau 4)
Dans le sérum des animaux auxquels on avait injecté de l'ADN plasmidique sans le gène glll (ADN" - pEVhis 14gIII"), on n'a découvert aucun anticorps dirigé contre la glycoprotéine glll II a été montré qu'après 4 injections de plasmides ADN4", espacées de 2 semaines ou plus, les souris ont montré une bonne réponse humorale contre le virus. Sept animaux sur 9 testés ont montré des anticorps anti-glll après quatre injections
Même après trois injections d'ADN4", le sérum de 9 animaux sur 10 montrait des titres d'anticorps anti-glll mesurables. De même, après 2 injections d'ADN4", le sérum de 7 animaux sur 8 montrait des réponses positives en ELISA
Tableau 3 Test ELISA Densité optique (OD) en fonction des dilutions du
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
notes explicatives
SADN2" sérum provenant d'animaux injectés 2 fois avec ADN" SADN3" sérum provenant d'aminaux injectés 3 fois avec ADN" SADN34" sérum provenant d'animaux injectés 3 fois avec ADN4" SADN44" sérum provenant d'animaux injectés 4 fois avec ADN4" témoin positif (NIA3 M207) sérum provenant d'animaux injectes avec du virus vivant NIA3 M207 sérum - sérum provenant d'animaux non-injectés sérum + sérum provenant d'animaux injectés avec de l'adénovirus exprimant le gène gD Tableau 4 : Test ELISA - densité optique (OD) en fonction des dilutions du sérum test 2
Figure imgf000028_0001
10 2000 2000 549 249
1 non testé
sérum - mélange 155 96 83 92
sérum + mélange 827 305 146 106
notes explicatives .
SADN2" sérum provenant d'animaux injectés 2 fois avec ADN"
SADN3" sérum provenant d'aminaux injectés 3 fois avec ADN"
SADN34" sérum provenant d'animaux injectés 3 fois avec ADN4"
SADN44" sérum provenant d'animaux injectés 4 fois avec ADN4" témoin positif (NI A3 M207) sérum provenant d'animaux injectés avec du virus vivant NIA3 M207 sérum - sérum provenant d'animaux non-injectés sérum + sérum provenant d'animaux injectés avec de l'adénovirus exprimant le gène gD Exemple 3 Induction d'une protection chez la souris contre une inoculation d'épreuve avec des virus virulents Partie A - Protocole d'immunisation
Cinq groupes de dix souris (Charles River, Germany) femelles de 16 semaines d'âge de la souche consanguine Balb c ont été utilisés
Pour le groupe G0, le contrôle négatif, on a utilisé uniquement un tampon PBS (Gibco)
Le groupe G 1 (le contrôle positif) a été vacciné à l'aide d'un virus atténué (souche N1A3 M207) par voie intrapéritonéale lθ7 PFU (unités formant des plaques) ont été utilisées pour chaque souris Ceci est une dose très élevée par comparaison aux doses utilisées pour la vaccination des porcs avec les souches vaccinales atténuées utilisées traditionnellement à la dose de 10^5 PFU
Les trois autres groupes ont reçu de l'ADN plasmidique obtenu selon la méthode décrite à l'exemple 1
La vaccination par l'ADN plasmidique a été réalisée par injection intramusculaire de 100 μg dans 2 fois 100 μl d'eau/ souris dans l'arrière-train gauche et droit pendant plusieurs jours consécutifs
Le groupe C a été vacciné deux fois, le vendredi et le lundi respectivement
Le groupe B a reçu quatre injections consécutives réparties du mercredi au lundi
Le groupe A a reçu 6 doses réparties du lundi au lundi suivant
Les animaux ont été logés dans des cages, séparés par groupe et les individus ont été marqués individuellement au feutre bleu
Le sérum prélevé sur chaque animal a été codé de façon à pouvoir suivre chaque animal individuellement en ce qui concerne le dosage d'anticorps et la protection conférée par les vaccinations Partie B - Analyse des réponses immunitaires
Le développement des réponses humorales a été contrôlé selon le protocole ELISA présenté à l'exemple 2 Le test de neutralisation de virus du sérum a été effectué selon la méthode décrite à l'exemple 2
Des échantillons de sérum ont été prélevés au début de la période d'immunisation, c -à-d 3 jours après la dernière injection de vaccin, à la fin de la période d'immunisation, c -à-d un mois après la dernière injection de vaccin et juste avant l'inoculation d'épreuve par le virus virulent qui a eu lieu 9 jours plus tard Enfin, un mois après le challenge, du sérum a été prélevé a nouveau Partie C - Inoculation d'épreuve
Environ 37 jours après la dernière vaccination, toutes les souris ont été exposées à l'infection par un virus virulent vivant de la souche NIA3 à raison de 7 000 PFU dans 200 ml par animal injecté intrapéritonéalement Le dosage est très élevé car la dose létale pour 50 % des animaux est environ 100 fois moins élevée (LD50 = 70 PFU)
Les animaux sont observés et les décès sont enregistrés pendant les 15 jours suivant le challenge comme indiqué au Tableau 5 Les résultats montrent l'évolution du taux de survie exprimé en pourcentage en fonction des jours suivant le challenge
Tous les animaux du groupe de contrôle négatif sont morts après le challenge Tableau 5 : Suivi du taux de survie des souris après une inoculation d'épreuve avec virus virulents.
Figure imgf000031_0001
Les résultats montrent qu'une protection a eu lieu même à la dose de vaccination la plus faible c.-à-d. 2 x 100 μg. En effet, la mort de ces animaux a été retardée par rapport au groupe de contrôle négatif (GO).
A un dosage de 4 x 100 μg, 30 % des animaux ont survécu, tandis qu'à 6 x 100 μg, 60 % des animaux ont survécu. Les résultats montrent que la protection induite par cette nouvelle méthode de vaccination plasmidique est efficace, surtout si on la compare au taux de survie de 80 % observé dans le groupe Gl (le contrôle positif) c.-à-d. le groupe d'animaux vaccinés par le virus atténué à dose très élevée (lθ7 PFU).
Il reste à noter que la méthode de vaccination utilisée dans cet exemple peut encore être optimisée. D'après les résultats de l'essai de cytotoxicité contre le virus PRV, la vaccination par injection plasmidique pendant plusieurs jours consécutifs n'a pas induit de réponse CTL tandis que l'injection de la même quantité d'ADN à des intervalles de 3 semaines ou plus, telle qu'utilisée dans l'exemple 2 a induit une réponse CTL prononcée. De plus, la réponse humorale induite, mesurée par la réponse des anticorps anti-glll dans le test ELISA, était plus faible suite aux injections plasmidiques pendant plusieurs jours consécutifs que la réponse humorale induite par des injections de la même quantité d'ADN à des intervalles de 3 semaines, décrite dans l'exemple 2. Exemple 4 : Induction d'une protection chez la souris contre une inoculation d'épreuve avec des virus virulents. Pour ces expériences, le protocole d'immunisation de l'exemple 3 a été suivi, à la seule différence que des injections d'ADN plasmidiques ont été effectuées toutes les trois semaines et que les souris étaient âgées de 19 semaines.
Pour le groupe GO (contrôle négatif), on a utilisé uniquement du tampon PBS (Gibco)
Le groupe Gl (contrôle positif) a été vacciné à l'aide du virus atténué (souche NI A3 M207) dans les cous de pied avec une dose de 10? PFU par souris Quatre injections d'ADN plasmidique ont été réalisées par voie intramusculaire dans les deux arrière trains de groupes de souris comprenant chacun 10 animaux, marqués par un code coloré
Du sérum a été prélevé soit le jour même, soit dans les trois jours précédant la nouvelle immunisation
Trois semaines après la dernière injection de plasmide et six semaines après les immmunisations des groupes de contrôle, toutes les souris ont été exposées au virus virulent NIA3 à raison de 7 000 PFU/animal, injecté intrapéritonéalement Les décès sont enregistrés pendant les 15 jours suivant l'épreuve et sont repris dans le tableau 6 Les résultats montrent les taux de survie exprimés en pourcentage en fonction des jours suivant l'épreuve Tableau 6 Suivi du taux de survie des souris après une inoculation d'épreuve avec virus virulents
Figure imgf000032_0001
Tous les animaux du groupe G0 (contrôle négatif) sont morts après l'épreuve Un taux de 80 % de survie est observé dans le groupe Gl, c à d les animaux vaccinés par le virus atténué à dose très élevée
A un dosage de 4 fois 100 mg d'ADN plasmidique, 40 % des animaux ont survécu La méthode d'immunisation par laquelle les animaux sont vaccinés avec de l'ADN plasmidique (4 injections) toutes les trois semaines s'est montrée plus efficace en comparaison aux injections journalières (meilleur taux de survie de 40 % au lieu de 30 % et retardement relatif de la mort des animaux) Exemple 5 Induction d'une réponse humorale chez le porc
Trois groupes de porcs de 3 animaux, âgés de 5 semaines ont été utilises Les animaux proviennent d'un élevage exempt de PRV et de la même portée Us sont marqués individuellement par une bague à l'oreille
Un groupe de 3 animaux (# 1, 2 et 3) qui n'ont pas été vaccines est utilisé comme contrôle négatif
Pour les 2 autres groupes, trois injections intramusculaires du plasmide pEVhisl4gIII ont été effectuées à l'âge de 5, 7 et 9 semaines
Trois animaux (# 4, 5 et 6) ont reçu une dose de 75 μg de plasmide, alors que 3 autres porcs (# 7, 8 et 9) recevaient 560 μg de plasmide à chaque injection La dose d'ADN a été diluée dans 4 ml de tampon PBS (Gibco, USA) et administrée en 4 portions de 1 ml à 4 endroits d'inoculation des 2 côtés de la nuque et au centre de l'arrière train gauche et droit L'injection s'est pratiquée à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille Terumo de 40 mm de long avec une ouverture de 0 9 mm
Du sérum a été prélevé lors de chaque injection et 2 semaines après la dernière injection L'analyse des réponses humorales (anticorps contre la protéine glll) avant et pendant l'immunisation a été effectuée par un test de séroneutralisation (test sensible à la médiation par le complément, voir Bitsch et Eskilsen, curr Top Vet Med Anim Sci.12, 41 49, 1982) et par un test EPMA (Immuno Peroxydase Monolayer Assay) Le test IPMA a été effectué selon le mode opératoire qui est repris ci dessous A chaque puit des plaques à 96 puits (Corning, USA) recouvert d'un tapis de cellules SK 6 confluentes (ATCC, USA) ont été ajoutés 500 TCID50 de virus PRV de la souche 89V87 ((Nauwynck H , Pensaert M , Am J Vet Research, 53 (4) 489 ( 1992)) dans du milieu MEM (Gibco, USA) Dès l'apparition d'un effet cythopathique les plaques sont thermofixées après un lavage au tampon PBS, les plaques sont séchèes à 37 °C jusqu'à evaporation du liquide Ensuite elles sont incubées à 80 °C pendant 1 heure
Le sérum à tester, dilué de 2 en 2 en série dans du PBS a été distribué dans les puits et la plaque a été incubée pendant 1 heure à 37 °C Le sérum a été retiré et les plaques ont subi 2 lavages au PBS, suivis d'une incubation d'une heure en présence d'anticorps anti porcins marqués à la peroxydase (Nordic, Hollande) et dilués 100 fois dans du PBS Après 1 heure, les plaques ont été incubées en présence de substrat 3 amino 9 éthylcarbazole (2 mg AEC dans 10 ml de tampon acétate de sodium (0 05 M à pH 5) et 75 μl de H202 à 30 %) L'apparition d'une coloration rouge est observée au microscope optique La réaction a ete interrompue après 15 minutes par 3 lavages à l'eau de ville Les titres IPMA sont calculés en prenant l'inverse de la dilution la plus forte qui engendre une coloration rouge des foyers d'antigène viral sur les cellules infectées
Les résultats du test de séroneutralisation et du test IPMA sont repris dans le tableau 7.
Tableau 7 Titres en anticorps contre le virus PRV déterminés par le test de séroneutralisation et ar le test IPMA
Figure imgf000034_0001
Notes explicatives
SN : titre en anticorps séroneutralisants
10 IPMA : titre en anticorps déterminés par la méthode IPMA
Les résultats montrent qu'aucun des animaux non vaccinés n'a développé des anticorps contre le virus PRV. Les résultats indiquent que même à la dose de vaccination la plus faible c'est à dire 3 x 75 μg, une réponse humorale a été induite dans 2 porcs sur 3 Un seul animal sur 3 a réagi à un dosage de 560 μg
15 Les réponses sont faibles et les différences entre les 2 groupes immunisés ne sont pas significatives Exemple 6 : Induction d'une protection contre une épreuve avec un virus virulent chez le porc On reproduit exactement le protocole de l'exemple 5 On a utilisé trois groupes de 3 porcs âgés de 5 semaines Les animaux proviennent d'un élevage exempt de PRV et de la même portée Ils sont marqués individuellement par une bague à l'oreille
Un groupe de 3 animaux qui n'ont pas été vaccinés, a été utilisé comme contrôle négatif
Pour les 2 autres groupes, trois injections intramusculaires du plasmide pEVhisHglII ont été effectuées à l'âge de 5, 7 et 9 semaines conformément à la technique décrite à l'exemple 5 Trois animaux (N° de porc 4, 5 et 6) ont reçu une dose de 75 μg de plasmide, alors que les trois autres animaux (N° de porc 7, 8 et 9) ont reçu une dose de 560 μg de plasmide
L'épreuve par virus virulent a été effectuée selon la méthode décrite dans Vaccine 1994, 12 (7), p 661 665 et est décrite ci après
27 semaines après, c'est à dire 18 semaines après la dernière injection de plasmide, tous les animaux sont transférés dans une unité isolée en vue d'une exposition au virus virulent PRV souche 75 VI 9 (Andries K, Pensaert MB, Vandeputte J, Am J Vet Res., 1978, 39, p. 1282 1285). La température de l'unité isolée est maintenue à 18 °C et la ventilation à
0,2 m/s
105*0 TCID50 de virus PRV (souche 75V 19) mis en suspension dans 5 ml de tampon phosphate sont administrés à tous les animaux 2 mi de cette suspension est donné oralement et 1,5 ml de cette suspension est instillé dans chaque narine
Tous les animaux ont été observés quotidiennement durant les deux semaines qui suivent l'épreuve La température du corps des animaux a été notée, ainsi que leur poids Le gain de poids relatif (RDWG) a été calculé selon la formule ci après, en vue de comparer les performances des trois groupes RDWG à partir du jour de l'épreuve jusqu'au jour x poids au jour x poids au jour de l'épreuve
RDWG = poids au jour de l'épreuve Les sécrétions nasales de tous les animaux ont été prélevées avec un ecouvillon tous les deux jours durant 14 jours après l'épreuve Le poids des sécrétions nasales prélevées a été noté Les sécrétions nasales prélevées ont été mises en suspension dans un tampon phosphate. Des dilutions décimales de ces suspensions ont été inoculées à des cultures de cellules en monocouche, ces cellules venant d'une lignée cellulaire continue de testicule de porc (ST). Ensuite, la présence d'un effet cytologique pour ces cultures de cellules a été contrôlée durant cinq jours. La dose léthale 50 a été calculée selon la méthode de Reed et Muench (Amer. J. Hyg., 1938, 27, 493 497). Les titres en virus ont été exprimés en TCID50 par gramme de sécrétion nasale.
Les résultats des examens sérologiques sont rassemblés dans le tableau 8
Figure imgf000037_0001
L'analyse des réponses humorales a été effectuée par un test de séroneutralisation sensible (test sensible à la médiation par le complément selon la technique décrite par Bitsch et Eskilsen, Curr Top Vet Anim Sci , 1982, 12, p 41 49) et par un test de séroneutralisation conventionnel (selon la technique décrite par Andries K, Pensaert MB, Vandeputte J, Am J Vet Res , 1978, 39, p 1282 1285)
Ces résultats montrent qu'une réponse sérologique a été trouvée pour seulement un des six animaux vaccinés au moment de la dernière vaccination Deux et dix huit semaines après, des titres en anticorps séroneutralisant entre 3 et 24 ont été observés respectivement pour trois des animaux (N° du porc 4, 6 et 9) et pour quatre des animaux (N° du porc 4, 6, 8 et 9)
14 jours après l'épreuve, les titres en anticorps séroneutralisant ont été observes entre 64 et 128 pour les animaux faisant partie du groupe contrôle négatif, entre 128 et > 384 pour les animaux ayant reçu une dose de 75 μg de plasmide, et entre 128 et 192 pour les animaux ayant reçu une dose de 560 μg de plasmide
Tous les animaux ont été hébétés et anorexiques Ils ont éternué du troisième jour après l'épreuve jusqu'au huitième ou neuvième jour après l'épreuve Des vomissements et des troubles nerveux ont été observés pour deux animaux (N° de porc 3 et 5)
Tous les animaux, sauf un (N° de porc 8), ont eu de la fièvre (> 40 °C) du troisième jour jusqu'à septième jour après l'épreuve. La température moyenne maximale a été de 41,3 °C pour le groupe contrôle négatif et de 41 °C pour les deux autres groupes Les résultats concernant les changements de poids par animal sont rassemblés au tableau 9
Tableau 9 . Changement de poids des animaux
Figure imgf000039_0001
Δ G7 = poids 7 jours après l'épreuve - poids le jour de l'épreuve
Δ G14 = poids 14 jours après l'épreuve - poids le jour de l'épreuve RDWG7 = RDWG 7 jours après l'épreuve RDWG 14 = RDWG 14 jours après l'épreuve
Tous les animaux, sauf un (N° de porc 8) ont perdu du poids durant la première semaine après l'épreuve.
Quatorze jours après l'épreuve, seulement deux animaux (N° de porc 3 et 5), n'avaient pas repris le poids qu'ils avaient avant l'épreuve. Ils ont, de plus, continué à perdre du poids. Les trois animaux ayant reçu une dose de 560 μg de plasmide et un animal (N° de porc 4) ayant reçu une dose de 75 μg de plasmide, ont montré un gain de poids compensatoire entre le septième et le quatorzième jour après l'épreuve, de telle sorte qu'ils avaient repris leur courbe de croissance initiale entre le onzième et le quatorzième jour après l'épreuve Les deux groupes d'animaux vaccinés montrent une valeur moyenne de gain de poids significativement positive, alors que le groupe de contrôle, animaux non vaccinés, montre une valeur moyenne de gain de poids négatives (= perte de poids)
Les résultats des titrations en virus dans les sécrétions nasales sont rassemblés dans le tableau 10 Tableau 10 : Sécrétion de virus a rès l'é reuve
Figure imgf000040_0001
Les premiers virus ont été isolés des sécrétions nasales, deux jours après l'épreuve, pour deux des trois animaux dans chaque groupe. Les titres en virus ont atteint un niveau maximum entre le quatrième et le sixième jour après l'épreuve, les titres en virus étant compris entre 10^,5 et 10^' υ TCID50. La sécrétion de virus a été stoppée entre le sixième et le huitième jour après l'épreuve pour les animaux vaccinés, alors qu'elle a continué jusqu'au douzième jour après l'épreuve pour les animaux du groupe contrôle négatif.
INDICΛTÏONS RELATIVES A UN MICRO-ORGANISME DEPOSE
(règle
A. Les indications ont trait au micro-organisme visé dans la description page _9_ , lignes 2~5
B. IDENTIFICATION DU DEPOT D'autres dépôts font l'objet d'une feuille supplémentaire [ |
Nom de l'institution de dépôt
BELGIAN C∞RDINATED COLLECTIONS OF tŒCROORGANISMS (BCCM)
Adresse de l'institution de dépôt ( v compris le code postal et le pays)
Laboratorium voor Moléculaire Biologie - Plasmidencollectie (LMBP)
Universiteit Gent
K.L. Ledeganckstraat, 35
B-9000 GENT (Belgique)
Date du dépôl n" d'ordre
16 NOVEMBRE 1995 LMBP3377
Une feuille supplémentaire estjomte ι — ι
C. INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES (le cas échéant ) pour la suite de ces renseignements I — I
pEV hisl4gHI
L'accessibilité du micro-organisme ne peut être réalisée que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant.
D. ETATS DESIGNES POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNEES
(si Ici indications ne sont pas donnée* pow tous les Etals désignes)
E. INDICATIONS FOURNIES SEPAREMENT (le cas échéant)
Les indications enumérées ci-apres seront fournies ultérieurement au Bureau international fψeaftei la nantie gcneiale des indications p e\ . "if d'oidie du dépôt")
Réservé au Bureau international que la I Cette feuille est parvenue au Bureau international le
Fonctionnaire autorisé
Figure imgf000041_0001
Formulaire PCI'/RO/IM (juillet 1992

Claims

R E V E N D 1 C A T I O N S
1 - Vaccin comprenant un plasmide contenant un gène codant pour la glycoprotéine glll du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV et un excipient pharmaceutiquement acceptable pour celui-ci
2 - Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide contient aussi un "promoteur du Cytomégalovirus humain"
3 - Vaccin selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le plasmide utilisé est le plasmide pEVhisHglII
4 - Vaccin selon les revendications 1 à 3 caractérisées en ce que le plasmide contient aussi au moins un gène ou une portion de celui-ci codant pour au moins une cytokine ou un fragment d'une cytokine
5 - Vaccin selon une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'excipient pharmaceutiquement acceptable comprend des billes minuscules en or revêtues du vaccin qui sont introduites dans le tissu de l'animal à vacciner
6 - Utilisation d'un plasmide pour un vaccin contre le virus PRV, ledit plasmide comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine glll du virus PRV ou pour une protéine présentant la même antigénicité que la glycoprotéine glll du virus PRV ou une construction d'ADN comprenant une cassette d'expression incluant a) une séquence d'ADN codant pour un polypeptide contenant au moins un déterminant antigénique de la glycoprotéine glll ou un fragment immunogénique de celle-ci, et b) des séquences du contrôle reliées opérativement auxdites séquences codantes où ladite séquence codante peut être transcrite et traduite dans une cellule et où lesdites séquences de contrôle sont homologues ou héterologues à ladite séquence codante
7 - Un vaccin plasmidique contre le virus PRV selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il contient aussi au moins un gène ou une portion de celui- ci codant pour au moins une cytokine ou un fragment d'une cytokine 8 - Plasmide pEVhisHglII utilisé dans la fabrication d'un vaccin.
9 - Plasmide pEVhisHglII utilisé dans la fabrication d'un vaccin contre le virus PRV.
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