WO1995024428A1 - Process for extracting highly purified, virus-inactivated alpha1-anti-trypsin by anion exchanger chromatography - Google Patents

Process for extracting highly purified, virus-inactivated alpha1-anti-trypsin by anion exchanger chromatography Download PDF

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WO1995024428A1
WO1995024428A1 PCT/EP1995/000638 EP9500638W WO9524428A1 WO 1995024428 A1 WO1995024428 A1 WO 1995024428A1 EP 9500638 W EP9500638 W EP 9500638W WO 9524428 A1 WO9524428 A1 WO 9524428A1
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WO
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alkyl
radicals
chromatography
groups
sulfonic acid
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Application number
PCT/EP1995/000638
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Inventor
Ales Strancar
Djuro Josic
Israel Nur
Original Assignee
Octapharma Ag
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Publication date
Application filed by Octapharma Ag filed Critical Octapharma Ag
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining high-purity, virus-inactivated a -anthrypsin by means of anion exchanger chromatography from sources containing this factor.
  • ⁇ . -Antitrypsin belongs to the superfamily of serpins and is a serum protein (anti-enzyme). a -Antitrypsin has anti-elastase activity. If the inhibitor activity is lost as a result of a genetic defect, the structural protein elastin is broken down and, as a result, pulmonary emphysema.
  • EP 0 282 363 A2 relates to a process for producing an ⁇ - -antitrypsin concentrate from a fraction of human plasma.
  • the isolation is carried out with the help of chromatography and provides a fraction a.
  • - Antitrypsin with a yield of at least 80%.
  • the chromatography is carried out on DEAE-Sepharose CL.
  • WO 90/14886 describes materials for chromatography with polyalkylamine chains which are anchored to the surface of a chromatographic support. This means that the group carrying the terminal functional residue is bound to this surface via nitrogen atoms with alkylene groups in between. These polyamine groups are connected to the matrix forming the chromatography material via coupling reagents. For this purpose, substances such as cyanogen bromide, epichlorohydrin, carbonyldiimidazole or 1,4-butanediol diglycidyl ether are used.
  • This "linking group” is characterized in that it forms a chain having up to 10 carbon atoms, which can be interrupted by oxygen atoms and can contain further substituents such as hydroxyl or oxo groups.
  • EP 0 343 275 AI describes the purification of factor VIII with the aid of anion exchange chromatography, such as, for example, TSK DEAE Fractogel.
  • the technical problem underlying the invention is the provision of a method by which the isolation of biologically active ⁇ . -Antitrypsin can improve from sources containing this factor, and this ensures a more economical way of working. Surprisingly, this problem is solved by a method according to the features of claim 1.
  • the subclaims relate to preferred embodiments of the method according to the invention.
  • the separating materials to be used according to the invention consist of carrier particles as disclosed in EP-A-0 337 144. These are carrier particles with hydroxyl groups onto which a polymeric material is grafted via the alpha-C atoms of the hydroxyl groups. Suitable carrier particles are all generally known porous and non-porous chromatography supports which have primary or secondary, aliphatic hydroxyl functions on the surface. Hydrophilic polymers based on acrylate and methacrylate, polymers based on polyvinyl alcohol, diol-substituted silica gels, polysaccharides based on agarose, cellulose, cellulose derivatives or polymers based on dextran are preferred. However, other polymers or copolymers based on monomers such as vinyl compounds, acrylamide, (meth) -acrylic acid esters or (meth) -acrylonitrile in hydroxylated form can of course also be used.
  • the polymeric material which is bonded to the carrier particles via the ⁇ -C atoms of the hydroxyl groups is based on the monomers of the formulas II and / or III.
  • the product obtained is preferably subsequently converted into a separating material with hydroxyl groups.
  • This conversion into a hydroxyl phase is achieved by a mild alkaline or acidic saponification known per se.
  • methanolic K_CO solution at room temperature described for example by Y. Tezuka et al. , in macro ol. Chem. 186, 685-694 (1985).
  • R ⁇ preferably denotes H, ie the acrylic acid derivatives are preferred.
  • Y in formula II preferably means - C -X, li 0 tr g
  • Y in formula I primarily means - C -X,
  • R and R independently of one another denote H or an alkyl group with up to 5 C atoms.
  • at least one of the radicals R and R is H.
  • the following radicals are particularly preferred: acetyloxy, propionyloxy, butyryloxy, valeryloxy and hexanoyloxy radical.
  • radicals R and / or R preferably denote an alkyl
  • radicals R 2 and / or R3 are preferably alkyl, alkoxyalkyl, cyanoalkyl, aminoalkyl, mono- or dialkylaminoalkyl, trialkylammoniumalkyl, carboxyalkyl or sulfonic acid alkyl having up to 10 carbon atoms, preferably up to 6 carbon atoms
  • Atoms particularly preferably up to 4 carbon atoms in the
  • R 2 and / or R3 are preferably cyanomethyl, cyanoethyl, cyanopropyl, cyanobutyl, cyanopentyl, cyanohexyl, 2-cyanopropyl, 2-cyanobutyl, carboxylmethyl, carboxylethyl, carboxylpropyl, carboxylisopropyl, carboxy-ylbutyl, carboxylpentyl, carboxylhexyl, carboxylhexyl -methyl propyl, carboxyl-2-methylbutyl, sulfonic acid methyl, sulfonic acid ethyl, sulfonic acid propyl, sulfonic acid butyl, sulfonic acid pentyl, sulfonic acid hexyl, sulfonic acid 2-methylpropyl, sulfonic acid 2-methylbutyl, s
  • the alkyl groups are preferably simply substituted by an amino, mono- or dialkylamino or trialkylammonium group.
  • the alkyl groups can be the same or different and have up to 10, preferably up to 6 C atoms, particularly preferably up to 4 C atoms, and accordingly preferably denote methylaminoethyl, diethylaminoethyl, methylaminoethyl, methylaminopropyl, dimethylaminopropyl, ethylaminoethyl, propylaminoethyl , Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammonium-ethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethylammoniumethyl, Amino
  • R2 and / or R3 preferably also has the meaning of a
  • Phenyl group which is preferably simply substituted by cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, mono- or dialkylamino, alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, mono- or dialkylaminoalkyl, trialkylammonium or trialkylammoniumalkyl, carboxy, carboxyalkyl, sulfonic acid or sulfonic acid alkyl.
  • the preferred meanings of these substituents correspond to the preferred alkyl groups and substituted alkyl groups given above.
  • the substituent on the phenyl group is preferably in the p-position.
  • alkylphenyl or phenylalkyl group is also preferred for R 2 and / or R3, the preferred meanings given also being intended for the alkyl, substituted alkyl or substituted phenyl groups.
  • substituted phenyl groups are particularly preferred, for example: 4-cyanophenyl, 4-alkylphenyl, 4- (N, N-dimethylamino) phenyl, 4- (N, N-dialkylaminoethyl) phenyl, 4-ethoxyphenyl, 4-ethoxyethylphenyl, 4-trialkylammoniumphenyl, 4-carboxylpheny1, 4-sulfonic acid phenyl, phenylethyl, 4- (N-ethylamino) phenylpropyl or 4-cyanophenylethyl.
  • R 2 and / or R3 is a cyclic or bicyclic radical, which can be aromatic or saturated, with 5 to 10 carbon atoms, in which one or more CH - or CH_ groups are replaced by N or NH, N or NH and S, or N or NH and 0, mean.
  • R2 and R3 preferably also mean a py ⁇ dm radical, imidazolyl radical, indolyl radical, further preferably one
  • R 2 and / or R3 can, for example, also be a thiazole
  • aromatic, heterocyclic radicals are particularly preferred.
  • radicals R 2 and R3 In order to arrive at suitable exchangers, the radicals R 2 and R3 must be coordinated with one another in such a way that either both radicals contain an acidic or basic group or one of the radicals is neutral.
  • the person skilled in the art has no difficulty in assigning the groups accordingly and thus putting together suitable radicals for R 2 and R 3, depending on the function and task of the desired ion exchanger.
  • One of the two radicals R and R is preferably a neutral radical.
  • R preferably denotes alkyl, alkoxyalkyl, cyanoalkyl, carboxyalkyl or sulfonic acid alkyl having up to 10 carbon atoms, preferably having up to 6 carbon atoms, particularly preferably having up to 4 carbon atoms in the alkyl group
  • R preferably denotes methyl, ethyl, propyl, butyl, hexyl, methoxymethyl, ethoxymethyl, 2-methoxyethyl, 2-, 3- or 4-
  • alkyl groups which are characterized by a
  • R preferably denotes cyanomethyl, cyanoethyl, cyanopropyl, cyanobutyl, cyanopentyl, cyanohexyl, 2-cyanopropyl, 2-cyanobutyl, carboxymethyl, carboxylethyl, carboxylpropyl, carboxylisopropyl, carboxylbutyl, carboxylpentyl, carboxylhexyl, carboxyl-2-methylpropyl-2-methylpropyl 2-methylbutyl, sulfonic acid methyl, sulfonic acid ethyl, sulfonic acid propyl, sulfonic acid butyl, sulfonic acid pentyl, sulfonic acid hexyl, sulfonic acid 2-methylpropyl, sulfonic acid 2-methylbutyl, sulfonic acid 3-methylbutyl, sulfonic acid 2-methylpentyl, sulfonic acid 2-methyl
  • R preferably also has the meaning of a phenyl group which is preferably monosubstituted by cyano, cyanoalkyl, alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, carboxy, carboxyalkyl, sulfonic acid or sulfonic acid alkyl.
  • the preferred meanings of these substituents correspond to the preferred alkyl groups and substituted alkyl groups given above.
  • the substituent on the phenyl group is preferably in the p-position.
  • R and R in the monomers of the formula II preferably denote H, and thus R 'and R "in formula I also preferably have the meaning hydrogen.
  • separating materials in which IY -OH in formula and one of the radicals R 'and R "also means -OH.
  • a vinylene carbonate of the formula III must then be used as the monomer, and that which is formed during the polymerization The product can then be converted into a hydroxyl phase.
  • R7 and R1 in formula III are preferably H. n in
  • Formula I represents the number of repeating units and means 2-100, preferably 5-60, chain lengths of 10-30 are particularly preferred.
  • the process according to the invention for obtaining highly pure, virus-inactivated ⁇ -antitrypsin by means of anion exchange chromatography preferably assumes that the so-called Cohn IV-1 fraction is applied from an application buffer to a chromatography column which is equipped with an anion exchanger, as described above, is loaded.
  • the application buffer is an aqueous solution with a relatively low ionic strength.
  • the chromatography material is optionally treated with a solution corresponding to an ionic strength of 5 to 35 mM sodium chloride and sodium acetate at pH 4 to 5.5, preferably at pH 4.5. With the a. -Antitrypsin associated proteins are removed.
  • the a-antitrypsin still adsorbed on the chromatographic material is then eluted.
  • the aqueous solution which can be used for the elution of the ⁇ -antitrypsin is distinguished by a relatively high ionic strength, preferably corresponding to a 50 to 300 mM sodium chloride concentration in a suitable buffer such as 25 to 37 mM Tris / HCl in alkali chemical environment (pH 7.4 to 9.2). Further elution can then optionally follow the elution, such as desalination steps and other conventional concentration steps up to freeze-drying the eluate. It may be advantageous to connect a second chromatography on reverse phase materials to the first chromatography. Octyl-Sepharose has proven to be particularly suitable.
  • the chromatographic steps can be carried out by means of membrane chromatography.
  • membranes made of cellulose or synthetic fibers and compact disks e.g. made of polyglycidyl methacrylate in question.
  • the membrane systems preferably have covalently bonded anion exchanger groups of the type mentioned above for carrying out the method according to the invention. If a second chromatographic separation step by means of membrane chromatography is used, membrane systems are used which have a hydrophobic interaction with the a. -Antitrypsin can enter. These hydrophobic groups are preferably covalently bound to the material forming the membrane.
  • virus inactivation or virus removal step is recommended.
  • a generally recognized method is virus inactivation with di- or trialkyl phosphates and non-ionic detergents as described by Horowitz et al. is described in EP 0 131 740.
  • Woods, K. and Orme, Th. Describe in EP-A-0 239 859 that it is advantageous to extract the sample with oils, preferably with soybean oil, after virus removal or inactivation and before chromatographic separation. Castor oil and / or cottonseed oil.
  • the measures according to the invention make it possible for the first time to produce high-purity ⁇ in high yields. -Antitrypsin to produce, which has a previously unattained specific activity.
  • Antitrypsin is intended to serve the Cohn IV-1 fraction below. This is taken up in 35 mM Tris / HCl, at a pH of 8.2 (buffer 1). The fraction is preferably treated with buffer 1 at a slightly elevated temperature.
  • virus inactivation by stirring about 10 g / 1 Tween 80 and 3 g / 1 TNBP for 6 hours at 30 ° C with the sample in the application buffer (buffer 1).
  • This step can then optionally be followed by steps for pre-cleaning and removal of the detergents, as described in EP 0 239 859.
  • viruses that do not have lipid envelopes can also be inactivated. This is preferably done according to a method as proposed in P 43 18 435.9.
  • the corresponding fraction to be treated is treated with an effective amount of di- or trialkylphosphates and optionally wetting agents simultaneously or successively at an elevated temperature in the range from 55 ° C. to 77 ° C. for a period of 5 to 30 hours.
  • the amount of detergent can preferably be used in a range from 1 to 15% by weight.
  • the first chromatography is then carried out on an anion exchange chromatography material, which is preferably the commercially available Fractogel • EMD-DEAE (M).
  • the chromatography column with the material mentioned above is equilibrated with the application buffer (buffer 1).
  • the Cohn IV-1 fraction is then added to the column and preferably washed with a 10 mM sodium chloride solution buffered with 20 mM sodium acetate at pH 4.6. This is followed by the elution of the ⁇ .
  • Fraction containing antitrypsin for example with 150 mM sodium chloride solution, which is buffered with 30 mM Tris / HCl at pH 8.2.
  • the fraction obtained is optionally subjected to a further purification step on octyl-Sepharose. Desalination can also be carried out, for example, by diafiltration or other desalination measures known per se.
  • the fraction highly enriched with a -antitrypsin can then be dried, for example by lyophilization.
  • the chromatography column can be buffered with a 0.5 M sodium chloride solution with 30 mM Tris / HCl at pH 8.2 and regenerated.
  • the yield of active ⁇ . -Antitrypsin is 70 to 80% (measured by electrophoretic analysis).

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Abstract

A process is disclosed for extracting highly purified, virus-inactivated α1-anti-trypsin from a cryoprecipitate by means of anion exchanger chromatography with so-called 'tentacular' materials. Membrane chromatography with appropriately modified surfaces may also be used in addition to or instead of conventional column chromatography.

Description

Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusin¬ aktiviertem a. -Antitrypsin mittels Anionenaustauscher- ChromatographieProcess for obtaining high-purity, virus-activated a. -Antitrypsin using anion exchange chromatography
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem a -Anti¬ trypsin mittels Anionenaustauscher-Chro atographie aus diesen Faktor enthaltenden Quellen.The present invention relates to a method for obtaining high-purity, virus-inactivated a -anthrypsin by means of anion exchanger chromatography from sources containing this factor.
α. -Antitrypsin gehört zur Superfamilie der Serpine und ist ein Serumprotein (Antienzym) . a -Antitrypsin besitzt Anti-elastase-Aktivitä . Bei Verlust der Inhibitor-Akti¬ vität infolge eines genetischen Defekts kommt es zum Abbau des Struktur-Proteins Elastin und infolgedessen zu Lungenemphysemen.α. -Antitrypsin belongs to the superfamily of serpins and is a serum protein (anti-enzyme). a -Antitrypsin has anti-elastase activity. If the inhibitor activity is lost as a result of a genetic defect, the structural protein elastin is broken down and, as a result, pulmonary emphysema.
Die EP 0 282 363 A2 betrifft ein Verfahren zur Herstel¬ lung eines α- -Antitrypsin-Konzentrats aus einer Fraktion menschlichen Plasmas . Die Isolierung erfolgt dabei mit Hilfe der Chromatographie und liefert eine Fraktion a. - Antitrypsin mit einer Ausbeute von mindestens 80 %. Die Chromatographie erfolgt an DEAE-Sepharose CL.EP 0 282 363 A2 relates to a process for producing an α- -antitrypsin concentrate from a fraction of human plasma. The isolation is carried out with the help of chromatography and provides a fraction a. - Antitrypsin with a yield of at least 80%. The chromatography is carried out on DEAE-Sepharose CL.
M.H. Coan et al . beschreibt in Vox Sang. 48: 333 bis 342 (1985) die Reinigung von α -Proteinase Inhibitor ausge¬ hend von einer Cohn-Fraktion IV-1 durch eine Polyethylen- glykol-Präzipitation mit nachfolgender Chromatographie an DEAE-Sepharose. Die Ausbeuten an c. -Antitrypsin be¬ tragen ungefähr 60 % (bestimmt durch spezifische Akti¬ vität gegenüber 100 % reinem Protein) . Die Cohn-Fraktion wird erhalten gemäß Cohn E.J. et al . , Preparation and properties of seru and plasmaproteins IV. A System for the preparation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids, Journal of American Chemical Society 68: 457 bis 459, 1946.MH Coan et al. describes in Vox Sang. 48: 333 to 342 (1985) the purification of α-proteinase inhibitor based on a Cohn fraction IV-1 by a polyethylene glycol precipitation with subsequent chromatography on DEAE-Sepharose. The yields of c. Antitrypsin is approximately 60% (determined by specific activity towards 100% pure protein). The Cohn fraction is obtained according to Cohn EJ et al. , Preparation and properties of seru and plasma proteins IV. A System for the preparation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids, Journal of American Chemical Society 68: 457 to 459, 1946.
Die DE 42 06 694 beschreibt die Eignung eines Materials, welches aus der EP 0 337 144 bekannt ist, zur Isolierung von Faktor VIII aus entsprechenden Fraktionen.DE 42 06 694 describes the suitability of a material which is known from EP 0 337 144 for the isolation of factor VIII from corresponding fractions.
Die WO 90/14886 beschreibt Materialien zur Chromatogra¬ phie mit Polyalkylaminketten, die an der Oberfläche eines chromatographischen Trägers verankert sind. Dies bedeu¬ tet, daß unbedingt die den endständigen funktioneilen Rest tragende Gruppe über Stickstoffatome mit dazwischen¬ liegenden Alkylengruppen an diese Oberfläche gebunden ist. Diese Polyamingruppierungen sind über Kupplungs- reagenzien mit der das Chromatographiematerial bildenden Matrix verbunden. Dazu werden Substanzen wie Cyanogen- bromid, Epichlorhydrin, Carbonyldiimidazol oder 1,4-Bu- tandioldiglycidylether verwendet. Diese "linking group" wird dadurch charakterisiert, daß sie eine bis zu 10 Kohlenstoff tome aufweisende Kette bildet, die durch Sauerstoffatome unterbrochen sein kann und weitere Substituenten wie Hydroxyl oder Oxo-Gruppen enthalten kann.WO 90/14886 describes materials for chromatography with polyalkylamine chains which are anchored to the surface of a chromatographic support. This means that the group carrying the terminal functional residue is bound to this surface via nitrogen atoms with alkylene groups in between. These polyamine groups are connected to the matrix forming the chromatography material via coupling reagents. For this purpose, substances such as cyanogen bromide, epichlorohydrin, carbonyldiimidazole or 1,4-butanediol diglycidyl ether are used. This "linking group" is characterized in that it forms a chain having up to 10 carbon atoms, which can be interrupted by oxygen atoms and can contain further substituents such as hydroxyl or oxo groups.
Die EP 0 343 275 AI beschreibt die Reinigung von Faktor VIII mit Hilfe der Anionenaustauscher-Chromatographie, wie beispielsweise TSK DEAE-Fractogel .EP 0 343 275 AI describes the purification of factor VIII with the aid of anion exchange chromatography, such as, for example, TSK DEAE Fractogel.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Isolierung von biologisch aktivem α. -Antitrypsin aus diesen Faktor enthaltenden Quellen verbessern läßt, und das eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährleistet. Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unter¬ ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The technical problem underlying the invention is the provision of a method by which the isolation of biologically active α. -Antitrypsin can improve from sources containing this factor, and this ensures a more economical way of working. Surprisingly, this problem is solved by a method according to the features of claim 1. The subclaims relate to preferred embodiments of the method according to the invention.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen wie sie in der EP-A-0 337 144 offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxylgruppen, auf die über die alpha-C-Atome der Hydroxylgruppen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Trägerteilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekundäre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Dabei sind bevorzugt hy¬ drophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele, Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulosederivate oder Polymere auf Dextran-Basis. Es können aber selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylver- bindungen, Acrylamid, (Meth) -Acrylsäureestern oder (Meth) -Acrylnitril in hydroxylierter Form eingesetzt werden.The separating materials to be used according to the invention consist of carrier particles as disclosed in EP-A-0 337 144. These are carrier particles with hydroxyl groups onto which a polymeric material is grafted via the alpha-C atoms of the hydroxyl groups. Suitable carrier particles are all generally known porous and non-porous chromatography supports which have primary or secondary, aliphatic hydroxyl functions on the surface. Hydrophilic polymers based on acrylate and methacrylate, polymers based on polyvinyl alcohol, diol-substituted silica gels, polysaccharides based on agarose, cellulose, cellulose derivatives or polymers based on dextran are preferred. However, other polymers or copolymers based on monomers such as vinyl compounds, acrylamide, (meth) -acrylic acid esters or (meth) -acrylonitrile in hydroxylated form can of course also be used.
Das polymere Material, das über die α-C-Atome der Hydro¬ xylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder III.The polymeric material which is bonded to the carrier particles via the α-C atoms of the hydroxyl groups is based on the monomers of the formulas II and / or III.
CR7R8 = CR1-Y IICR 7 R 8 = CR 1 -Y II
11
R7 R~R 7 R ~
\ ./\ ./
= C III ό 0= C III ό 0
\ /\ /
C 11 0 Diese Monomeren stellen (Meth)Acrylsäure (Y = -COOH) , (Meth) -Acrylsäurederivate (Y = - -X) ,
Figure imgf000006_0001
C 11 0 These monomers represent (meth) acrylic acid (Y = -COOH), (meth) acrylic acid derivatives (Y = - -X),
Figure imgf000006_0001
Allylamine (Y = -CH2NH2# -CH NR2R3) , (Meth) -AcrylnitrileAllylamines (Y = -CH 2 NH 2 # -CH NR 2 R 3 ), (meth) -acrylonitriles
(Y = -CN) , Acroleine (Y = -CHO) , Vinylcarboxylate (Y =(Y = -CN), acroleins (Y = -CHO), vinyl carboxylates (Y =
5 6 -OCOCHR R ) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.5 6 -OCOCHR R) or vinylene carbonates of the formula III.
Alle diese Monomere stellen in wäßriger Lösung radika¬ lisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel binden¬ den Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.In aqueous solution, all these monomers are free-radically polymerizable substances with reversibly binding groups, which can be neutral, acidic or basic.
Werden als Monomere Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR7R8 = CR1-OCOCHR5R6 der Formel II eingesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt anschließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen überführt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K_CO-, -Lösung bei Raumtemperatur, be¬ schrieben z.B. von Y. Tezuka et al . , in Macro ol . Chem. 186, 685-694 (1985) , durchgeführt werden.If vinylene carbonates of the formula III or vinyl carboxylates CR 7 R 8 = CR 1 -OCOCHR 5 R 6 of the formula II are used as monomers, the product obtained is preferably subsequently converted into a separating material with hydroxyl groups. This conversion into a hydroxyl phase is achieved by a mild alkaline or acidic saponification known per se. For example, the reaction with methanolic K_CO solution at room temperature, described for example by Y. Tezuka et al. , in macro ol. Chem. 186, 685-694 (1985).
In den Formeln I, II und III bedeutet R^ vorzugsweise H, d.h. die Acrylsäurederivate sind bevorzugt.In the formulas I, II and III, R ^ preferably denotes H, ie the acrylic acid derivatives are preferred.
Y in Formel II bedeutet vorzugsweise - C -X, li 0 tr gY in formula II preferably means - C -X, li 0 tr g
-OCOCHR R oder -CH NH_, in zweiter Linie bevorzugt -CN oder -CHO. Dementsprechend bedeutet Y in Formel I in erster Linie bevorzugt - C -X,-OCOCHR R or -CH NH_, in the second place preferably -CN or -CHO. Accordingly, Y in formula I primarily means - C -X,
II 0II 0
-OH (da vorzugsweise die -OCOCHR R -Gruppe in eine Hy- droxylphase umgewandelt wird) oder -CH NH , in zweiter-OH (since the -OCOCHR R group is preferably converted into a hydroxyl phase) or -CH NH, in the second
Linie bevorzugt -CN oder -CHO. 5 6Line preferred -CN or -CHO. 5 6
R und R bedeuten unabhängig voneinander H oder eine Alkylgruppe mit bis zu 5 C-Atomen. Vorzugsweise ist min¬ destens einer der Reste R und R H. Folgende Reste sind besonders bevorzugt : Acetyloxy- , Propionyloxy- , Butyry- loxy- , Valeryloxy- und Hexanoyloxy-Rest .R and R independently of one another denote H or an alkyl group with up to 5 C atoms. Preferably at least one of the radicals R and R is H. The following radicals are particularly preferred: acetyloxy, propionyloxy, butyryloxy, valeryloxy and hexanoyloxy radical.
4 X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -0R ,4 X denotes -0R both in formula I and in formula II,
-OH oder -NR 2R3, vorzugsweise -NR2R3.-OH or -NR 2R3, preferably -NR2R3.
Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR 2R3 be- deutet und einer der Reste R 2 und R3 H ist.Compounds in which X is —NR 2R3 and one of the radicals R 2 and R3 is H are preferred.
2 32 3
Die Reste R und/oder R bedeuten bevorzugt eine Alkyl-,The radicals R and / or R preferably denote an alkyl,
Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach, insbesondere bevorzugt einfach, substituiert sein kann durch einen Alkoxy- , Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino- , Trialkylammoni- um- , Carboxyl-, Sulfonsäure- , Acetoxy- oder Acetamino- Rest .Phenyl, phenylalkyl or alkylphenyl group, where the alkyl and / or the phenyl group can be substituted one or more times, preferably once or twice, particularly preferably once, by an alkoxy, cyano, amino, mono- or dialkylamino -, Trialkylammonum-, carboxyl, sulfonic acid, acetoxy or acetamino radical.
Die Reste R 2 und/oder R3 bedeuten bevorzugt Alkyl, Al- koxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylami- noalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfon- säurealkyl mit bis zu 10 C-Atomen, bevorzugt bis zu 6 C-The radicals R 2 and / or R3 are preferably alkyl, alkoxyalkyl, cyanoalkyl, aminoalkyl, mono- or dialkylaminoalkyl, trialkylammoniumalkyl, carboxyalkyl or sulfonic acid alkyl having up to 10 carbon atoms, preferably up to 6 carbon atoms
Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C-Atomen in derAtoms, particularly preferably up to 4 carbon atoms in the
2 Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R2 alkyl group, which can be linear or branched. R
3 und/oder R bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl,3 and / or R accordingly preferably denote methyl, ethyl,
Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxyme- thyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-0xapentyl, 2-, 3-,Propyl, butyl, pentyl, hexyl, methoxymethyl, ethoxymethyl, 2-methoxyethyl, 2-, 3- or 4-0xapentyl, 2-, 3-,
4- oder 5-0xahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl,4- or 5-0xahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- or 6-oxaheptyl,
Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl,Isopropyl, 2-butyl, isobutyl, 2-methylbutyl, isopentyl,
2- Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-oxa-3-methylbutyl, 3-
Oxa- 4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxa- hexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl . Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eineOxa-4-methylbutyl, 2-methyl-3-oxapentyl, 2-methyl-3-oxa-hexyl, also heptyl, octyl, nonyl or decyl. Also preferred are alkyl groups which are characterized by a
Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor- liegen. Demnach bedeuten R 2 und/oder R3 bevorzugt Cyano- methyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl, Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carbox- ylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-me- thylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-me- thylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3- methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3- methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl .Cyano, carboxy or sulfonic acid groups are substituted. Accordingly, R 2 and / or R3 are preferably cyanomethyl, cyanoethyl, cyanopropyl, cyanobutyl, cyanopentyl, cyanohexyl, 2-cyanopropyl, 2-cyanobutyl, carboxylmethyl, carboxylethyl, carboxylpropyl, carboxylisopropyl, carboxy-ylbutyl, carboxylpentyl, carboxylhexyl, carboxylhexyl -methyl propyl, carboxyl-2-methylbutyl, sulfonic acid methyl, sulfonic acid ethyl, sulfonic acid propyl, sulfonic acid butyl, sulfonic acid pentyl, sulfonic acid hexyl, sulfonic acid 2-methylpropyl, sulfonic acid 2-methylbutyl, sulfonic acid 3-methylbutyl, sulfonic acid 2-methylpentyl, sulfonic acid -3-methylhexyl or sulfonic acid-2-ethylpentyl.
Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substi¬ tuiert durch eine Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe . Die Alkylgruppen können dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 C- Atomen, besitzen und bedeuten demnach vorzugsweise Dirne- thylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammonium- ethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethyl- ammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl oder Aminopentyl . Alle diese Alkyl- und substituierten Alkyl¬ gruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenylgruppe.Furthermore, the alkyl groups are preferably simply substituted by an amino, mono- or dialkylamino or trialkylammonium group. The alkyl groups can be the same or different and have up to 10, preferably up to 6 C atoms, particularly preferably up to 4 C atoms, and accordingly preferably denote methylaminoethyl, diethylaminoethyl, methylaminoethyl, methylaminopropyl, dimethylaminopropyl, ethylaminoethyl, propylaminoethyl , Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammonium-ethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl or Aminopentyl. All of these alkyl and substituted alkyl groups are also preferred as substituents on the phenyl group.
Bevorzugt für R 2 und/oder R3 ist auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH 2) n-S02- (CH,2 -S- (CH2„) nOH mit n = 2, 3,Also preferred for R 2 and / or R3 is a sulfone sulfide of the structure - (CH 2) n-SO 2 - (CH, 2 -S- (CH 2 ") nOH with n = 2, 3,
4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4. Vorzugsweise hat R2 und/oder R3 auch die Bedeutung einer4, 5 or 6, preferably 2, 3 or 4. R2 and / or R3 preferably also has the meaning of a
Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammo- niumalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sul- fonsäurealkyl . Die bevorzugten Bedeutungen dieser Sub- stituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevor¬ zugten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p- Stellung.Phenyl group which is preferably simply substituted by cyano, cyanoalkyl, amino, aminoalkyl, mono- or dialkylamino, alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, mono- or dialkylaminoalkyl, trialkylammonium or trialkylammoniumalkyl, carboxy, carboxyalkyl, sulfonic acid or sulfonic acid alkyl. The preferred meanings of these substituents correspond to the preferred alkyl groups and substituted alkyl groups given above. The substituent on the phenyl group is preferably in the p-position.
p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenylp-acetoxyphenyl, p-aminophenyl or p-acetaminophenyl
2 s 1ind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R und/oder
Figure imgf000009_0001
2 s are also preferred meanings for R and / or
Figure imgf000009_0001
Bevorzugt für R 2 und/oder R3 ist ferner eine Alkylphenyl oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.An alkylphenyl or phenylalkyl group is also preferred for R 2 and / or R3, the preferred meanings given also being intended for the alkyl, substituted alkyl or substituted phenyl groups.
Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen bei¬ spielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4- Alkylphenyl, 4- (N,N-Dimethylamino) -phenyl, 4-(N,N-Dial- kylaminoethyl) -phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethylphe- nyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylpheny1, 4-Sul- fonsäurephenyl, Phenylethyl, 4- (N-Ethylamino) phenylpropyl oder 4-Cyanophenylethyl .Accordingly, the following substituted phenyl groups are particularly preferred, for example: 4-cyanophenyl, 4-alkylphenyl, 4- (N, N-dimethylamino) phenyl, 4- (N, N-dialkylaminoethyl) phenyl, 4-ethoxyphenyl, 4-ethoxyethylphenyl, 4-trialkylammoniumphenyl, 4-carboxylpheny1, 4-sulfonic acid phenyl, phenylethyl, 4- (N-ethylamino) phenylpropyl or 4-cyanophenylethyl.
Des weiteren sind Einheiten der Formel I bzw. Monomere der Formel II bevorzugt, in denen R 2 und/oder R3 einen cyclischen oder bicyclischen Rest, der aromatisch oder gesättigt sein kann, mit 5 bis 10 C-Atomen, worin ein- oder mehrere CH- oder CH_-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und 0 ersetzt sind, be¬ deuten. R2 und R3 bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyπdm- rest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einenFurthermore, units of the formula I or monomers of the formula II are preferred in which R 2 and / or R3 is a cyclic or bicyclic radical, which can be aromatic or saturated, with 5 to 10 carbon atoms, in which one or more CH - or CH_ groups are replaced by N or NH, N or NH and S, or N or NH and 0, mean. Accordingly, R2 and R3 preferably also mean a pyπdm radical, imidazolyl radical, indolyl radical, further preferably one
Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochino- linrest .Pyrrole, pyrimidine, pyrazine, quinoline or isoquinoline residue.
R 2 und/oder R3 können beispielsweise auch einen Thiazol-,R 2 and / or R3 can, for example, also be a thiazole,
Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzothia- zol-, Purin- , Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxa- zol-Rest bedeuten.Thiadiazole, morpholine, triazine, piperazine, benzothiazole, purine, pyrazole, triazole, pyrrolidine or isoxazole radical mean.
Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen, hete- rocyclischen Reste.The aromatic, heterocyclic radicals are particularly preferred.
Die Reste R 2 und R3 müssen, um zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden, daß entwe¬ der beide Reste eine saure oder basische Gruppe enthalten oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann be¬ reitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit geeignete Reste für R 2 und R3 zusam¬ menzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des gewünsch¬ ten Ionenaustauschers .In order to arrive at suitable exchangers, the radicals R 2 and R3 must be coordinated with one another in such a way that either both radicals contain an acidic or basic group or one of the radicals is neutral. The person skilled in the art has no difficulty in assigning the groups accordingly and thus putting together suitable radicals for R 2 and R 3, depending on the function and task of the desired ion exchanger.
2 3 Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R und R ein neutraler Rest.2 3 One of the two radicals R and R is preferably a neutral radical.
R bedeutet bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Carboxyalkyl oder Sulfonsäurealkyl mit bis zu 10 C-Ato¬ men, vorzugsweise mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere bevorzugt mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe, dieR preferably denotes alkyl, alkoxyalkyl, cyanoalkyl, carboxyalkyl or sulfonic acid alkyl having up to 10 carbon atoms, preferably having up to 6 carbon atoms, particularly preferably having up to 4 carbon atoms in the alkyl group
4 linear oder verzweigt sein kann. R bedeutet demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Hexyl, Methox- ymethyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-4 can be linear or branched. Accordingly, R preferably denotes methyl, ethyl, propyl, butyl, hexyl, methoxymethyl, ethoxymethyl, 2-methoxyethyl, 2-, 3- or 4-
Oxapentyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl,Oxapentyl, isopropyl, 2-butyl, isobutyl, 2-methylbutyl,
Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-me- thylbutyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl oder 2-Methyl-3-oxahexyl . Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eineIsopentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-oxa-3-methylbutyl, 3-oxa-4-methylbutyl, 2-methyl-3-oxapentyl or 2-methyl-3-oxahexyl. Also preferred are alkyl groups which are characterized by a
Cyano, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vor-Cyano, carboxy or sulfonic acid group substituted
4 liegen. Demnach bedeutet R bevorzugt Cyanomethyl, Cyano¬ ethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxymethyl, Carboxyl¬ ethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäure- ethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäure- pentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl .4 lie. Accordingly, R preferably denotes cyanomethyl, cyanoethyl, cyanopropyl, cyanobutyl, cyanopentyl, cyanohexyl, 2-cyanopropyl, 2-cyanobutyl, carboxymethyl, carboxylethyl, carboxylpropyl, carboxylisopropyl, carboxylbutyl, carboxylpentyl, carboxylhexyl, carboxyl-2-methylpropyl-2-methylpropyl 2-methylbutyl, sulfonic acid methyl, sulfonic acid ethyl, sulfonic acid propyl, sulfonic acid butyl, sulfonic acid pentyl, sulfonic acid hexyl, sulfonic acid 2-methylpropyl, sulfonic acid 2-methylbutyl, sulfonic acid 3-methylbutyl, sulfonic acid 2-methylpentyl, sulfonic acid 3-methylhexyl or 2-ethylpentyl sulfonic acid.
Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind ebenfalls bevorzugt als Substituenten an der Phenylgrup¬ pe.All of these alkyl and substituted alkyl groups are also preferred as substituents on the phenyl group.
4 Vorzugsweise hat R auch die Bedeutung einer Phenylgrup¬ pe, die vorzugsweise einfach substituiert ist durch Cya¬ no, Cyanoalkyl, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Carboxy, Car- boxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl . Die bevor- zugten Bedeutungen dieser Substituenten ent¬ sprechen den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkyl¬ gruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.4 R preferably also has the meaning of a phenyl group which is preferably monosubstituted by cyano, cyanoalkyl, alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, carboxy, carboxyalkyl, sulfonic acid or sulfonic acid alkyl. The preferred meanings of these substituents correspond to the preferred alkyl groups and substituted alkyl groups given above. The substituent on the phenyl group is preferably in the p-position.
7 8 R und R in den Monomeren der Formel II bedeuten vor¬ zugsweise H, und damit haben auch R' und R" in Formel I vorzugsweise die Bedeutung Wasserstoff.7 8 R and R in the monomers of the formula II preferably denote H, and thus R 'and R "in formula I also preferably have the meaning hydrogen.
Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in For¬ mel I Y = -OH ist und einer der Reste R' und R" ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres muß dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und das bei der Polyme¬ risation entstandene Produkt anschließend in eine Hydro- xylphase überführt werden. R7 und R1 in Formel III bedeuten vorzugsweise H. n inAlso preferred are separating materials in which IY = -OH in formula and one of the radicals R 'and R "also means -OH. A vinylene carbonate of the formula III must then be used as the monomer, and that which is formed during the polymerization The product can then be converted into a hydroxyl phase. R7 and R1 in formula III are preferably H. n in
Formel I stellt die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.Formula I represents the number of repeating units and means 2-100, preferably 5-60, chain lengths of 10-30 are particularly preferred.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von hoch¬ reinem, virusinaktiviertem α -Antitrypsin mittels Anio- nenaustauscher-Chromatographie geht vorzugsweise davon aus, daß die sogenannte Cohn IV-1-Fraktion aus einem Auftragungspuffer auf eine Chromatographie-Säule gegeben wird, welche mit einem Anionenaustauscher, wie oben be¬ schrieben, beschickt ist. Der Auftragungspuffer ist eine wäßrige Lösung mit relativ geringer Ionenstärke. Nach dem Auftragen der Cohn-Fraktion aus dem wäßrigen System geringer Ionenstärke wird das Chromatographiematerial gegebenenfalls mit einer Lösung entsprechend einer Ionen¬ stärke von 5 bis 35 mM Natriumchlorid und Natriumacetat bei pH 4 bis 5,5, vorzugsweise bei pH 4,5, behandelt. Damit können mit dem a. -Antitrypsin vergesellschaftete Proteine entfernt werden.The process according to the invention for obtaining highly pure, virus-inactivated α-antitrypsin by means of anion exchange chromatography preferably assumes that the so-called Cohn IV-1 fraction is applied from an application buffer to a chromatography column which is equipped with an anion exchanger, as described above, is loaded. The application buffer is an aqueous solution with a relatively low ionic strength. After the Cohn fraction has been applied from the aqueous system of low ionic strength, the chromatography material is optionally treated with a solution corresponding to an ionic strength of 5 to 35 mM sodium chloride and sodium acetate at pH 4 to 5.5, preferably at pH 4.5. With the a. -Antitrypsin associated proteins are removed.
Nach gegebenenfalls einem oder mehreren Waschschritten folgt dann die Elution des noch an dem chromatographi¬ schen Material adsorbierten a -Antitrypsins. Die wäßrige Lösung, die zur Elution des α -Antitrypsins eingesetzt werden kann (Elutionspuffer) , zeichnet sich durch eine relativ hohe Ionenstärke aus, vorzugsweise entsprechend einer 50 bis 300 mM Natriumchloridkonzentration in einem geeigneten Puffer wie 25 bis 37 mM Tris/HCl in alkali¬ schem Milieu (pH 7,4 bis 9,2) . An die Elution kann sich dann gegebenenfalls eine weitere Prozeßierung anschließen wie Entsalzungsschritte und andere übliche Konzentrie¬ rungsschritte bis hin zur Gefriertrocknung des Eluats. Es kann vorteilhaft sein, an die erste Chromatographie eine zweite Chromatographie an Umkehrphasen-Materialien anzuschließen. Als besonders geeignet hat sich hierbei Octyl-Sepharose herausgestellt.After optionally one or more washing steps, the a-antitrypsin still adsorbed on the chromatographic material is then eluted. The aqueous solution which can be used for the elution of the α-antitrypsin (elution buffer) is distinguished by a relatively high ionic strength, preferably corresponding to a 50 to 300 mM sodium chloride concentration in a suitable buffer such as 25 to 37 mM Tris / HCl in alkali chemical environment (pH 7.4 to 9.2). Further elution can then optionally follow the elution, such as desalination steps and other conventional concentration steps up to freeze-drying the eluate. It may be advantageous to connect a second chromatography on reverse phase materials to the first chromatography. Octyl-Sepharose has proven to be particularly suitable.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemä¬ ßen Verfahrens können die chromatographischen Schritte mittels der Membran-Chromatographie durchgeführt werden. Dabei kommen sowohl Membranen aus Cellulose oder synthe¬ tischen Fasern, als auch kompakte Disks z.B. aus Polygly- cidylmethacrylat in Frage. Vorzugsweise weisen die Mem¬ bran-Systeme covalent gebundene Anionenaustauschergruppen der oben genannten Art auf zur Durchführung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens. Falls ein zweiter chromatogra¬ phischer Trennungsschritt mittels Membran-Chromatographie eingesetzt wird, werden solche Membran-Systeme einge¬ setzt, die eine hydrophobe Wechselwirkung mit dem zu trennenden a. -Antitrypsin eingehen können. Vorzugsweise sind diese hydrophoben Gruppen kovalent an das die Mem¬ bran bildende Material gebunden.In an advantageous embodiment of the method according to the invention, the chromatographic steps can be carried out by means of membrane chromatography. Both membranes made of cellulose or synthetic fibers and compact disks e.g. made of polyglycidyl methacrylate in question. The membrane systems preferably have covalently bonded anion exchanger groups of the type mentioned above for carrying out the method according to the invention. If a second chromatographic separation step by means of membrane chromatography is used, membrane systems are used which have a hydrophobic interaction with the a. -Antitrypsin can enter. These hydrophobic groups are preferably covalently bound to the material forming the membrane.
Zur Vermeidung der Übertragung infektiöser viraler Er¬ krankungen empfiehlt sich ein Virusinaktivierungs- oder Virusentfernungsschritt . Ein allgemein anerkanntes Ver¬ fahren ist hierbei die Virusinaktivierung mit Di- oder Trialkylphosphaten und nicht ionischen Detergenzien wie sie von Horowitz et al . in EP 0 131 740 beschrieben wird.To avoid the transmission of infectious viral diseases, a virus inactivation or virus removal step is recommended. A generally recognized method is virus inactivation with di- or trialkyl phosphates and non-ionic detergents as described by Horowitz et al. is described in EP 0 131 740.
Woods, K. und Orme, Th. beschreiben in der EP-A-0 239 859, daß es von Vorteil ist, nach der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen Tren¬ nung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinöl und/oder Baumwollsamenöl . Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals möglich, in hohen Ausbeuten hochreines α. -Antitrypsin herzustellen, das eine bisher nicht erreichte spezifische Aktivität aufweist.Woods, K. and Orme, Th. Describe in EP-A-0 239 859 that it is advantageous to extract the sample with oils, preferably with soybean oil, after virus removal or inactivation and before chromatographic separation. Castor oil and / or cottonseed oil. The measures according to the invention make it possible for the first time to produce high-purity α in high yields. -Antitrypsin to produce, which has a previously unattained specific activity.
Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von c. -Antitrypsin soll im folgenden die Cohn IV-1-Fraktion dienen. Diese wird aufgenommen in 35 mM Tris/HCl, bei einem pH von 8,2 (Puffer 1) . Die Fraktion wird vorzugsweise bei etwas erhöhter Temperatur mit dem Puffer 1 behandelt.As a starting material for the extraction of c. Antitrypsin is intended to serve the Cohn IV-1 fraction below. This is taken up in 35 mM Tris / HCl, at a pH of 8.2 (buffer 1). The fraction is preferably treated with buffer 1 at a slightly elevated temperature.
Daran schließt sich die Virusinaktivierung an, indem etwa 10 g/1 Tween 80 und 3 g/1 TNBP 6 Stunden bei 30°C mit der Probe im Auftragungspuffer (Puffer 1) gerührt werden .This is followed by virus inactivation by stirring about 10 g / 1 Tween 80 and 3 g / 1 TNBP for 6 hours at 30 ° C with the sample in the application buffer (buffer 1).
An diesen Schritt können sich dann gegebenenfalls Schrit¬ te zur Vorreinigung und Entfernung der Detergenzien an¬ schließen, wie in der EP 0 239 859 beschrieben.This step can then optionally be followed by steps for pre-cleaning and removal of the detergents, as described in EP 0 239 859.
Gewünschtenfalls kann auch eine Inaktivierung von Viren, die nicht mit Lipidhüllen versehen sind, erfolgen. Dies erfolgt vorzugsweise gemäß einem Verfahren wie es in der P 43 18 435.9 vorgeschlagen wird. Dabei wird die entspre¬ chende zu behandelnde Fraktion mit einer wirksamen Menge von Di- oder Trialkylphosphaten und gegebenenfalls Be¬ netzungsmitteln gleichzeitig oder aufeinanderfolgend bei einer erhöhten Temperatur im Bereich von 55°C bis 77°C für eine Zeitdauer von 5 bis 30 Stunden behandelt.If desired, viruses that do not have lipid envelopes can also be inactivated. This is preferably done according to a method as proposed in P 43 18 435.9. The corresponding fraction to be treated is treated with an effective amount of di- or trialkylphosphates and optionally wetting agents simultaneously or successively at an elevated temperature in the range from 55 ° C. to 77 ° C. for a period of 5 to 30 hours.
Die Menge an Detergenz kann vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 15 Gew.-% eingesetzt werden.The amount of detergent can preferably be used in a range from 1 to 15% by weight.
Die erste Chromatographie erfolgt dann an einem Anionen- austausch-Chromatographiematerial, welches vorzugsweise das kommerziell erhältliche Fractogel • EMD-DEAE (M) ist. Die Chromatographie-Säule mit dem oben genannten Material wird mit dem Auftragungspuffer (Puffer 1) äquilibriert . Dann wird die Cohn IV-1-Fraktion auf die Säule gegeben und vorzugsweise mit einer 10 mM Natriumchloridlösung, die mit 20 mM Natriumacetat bei pH 4,6 gepuffert ist, gewaschen. Daran schließt sich dann die Elution der α. - Antitrypsin enthaltenden Fraktion, beispielsweise mit 150 mM Natriumchloridlösung, die mit 30 mM Tris/HCl bei pH 8,2 gepuffert ist, an. Die erhaltene Fraktion wird gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt an Octyl- Sepharose unterworfen. Eine Entsalzung kann ebenfalls durchgeführt werden beispielsweise durch Diafiltration oder andere an sich bekannte Entsalzungsmaßnahmen. Danach kann die mit a -Antitrypsin hoch angereicherte Fraktion beispielsweise durch Lyophilisation getrocknet werden.The first chromatography is then carried out on an anion exchange chromatography material, which is preferably the commercially available Fractogel • EMD-DEAE (M). The chromatography column with the material mentioned above is equilibrated with the application buffer (buffer 1). The Cohn IV-1 fraction is then added to the column and preferably washed with a 10 mM sodium chloride solution buffered with 20 mM sodium acetate at pH 4.6. This is followed by the elution of the α. - Fraction containing antitrypsin, for example with 150 mM sodium chloride solution, which is buffered with 30 mM Tris / HCl at pH 8.2. The fraction obtained is optionally subjected to a further purification step on octyl-Sepharose. Desalination can also be carried out, for example, by diafiltration or other desalination measures known per se. The fraction highly enriched with a -antitrypsin can then be dried, for example by lyophilization.
Die Chromatographie-Säule kann mit einer 0,5 M Natrium¬ chloridlösung mit 30 mM Tris/HCl bei pH 8,2 gepuffert, regeneriert werden.The chromatography column can be buffered with a 0.5 M sodium chloride solution with 30 mM Tris / HCl at pH 8.2 and regenerated.
Die Ausbeute an aktivem α. -Antitrypsin beträgt 70 bis 80 % (gemessen durch elektrophoretische Analyse) . The yield of active α. -Antitrypsin is 70 to 80% (measured by electrophoretic analysis).

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h eP a t e n t a n s r u c h e
Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti- viertem α. -Antitrypsin mittels Anionenaustauscher- Chromatographie aus Blutplasma oder Kryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, daß als Anionenaustauscher- material ein Trennmaterial verwendet wird auf Basis von hydroxylgruppenhaltigen Trägern, deren Oberflä¬ chen mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, die Polymeren gleiche oder verschiedene wie¬ derkehrende Einheiten der Formel I enthalten,Process for obtaining high-purity, virus-inactivated α. -Antitrypsin by means of anion exchangers. Chromatography from blood plasma or cryoprecipitate, characterized in that a separating material is used as the anion exchanger material on the basis of hydroxyl group-containing supports, the surfaces of which are coated with covalently bound polymers, the polymers being the same or different repeating units of the polymers Contain formula I
Figure imgf000016_0001
worin
Figure imgf000016_0001
wherein
R1 H oder CH3 R 1 H or CH 3
Y - C -X , - CN , -CHO , II 0Y - C -X, - CN, -CHO, II 0
-OH, -CH2-NH2 oder -CH2NR2R3,-OH, -CH 2 -NH 2 or -CH 2 NR 2 R 3 ,
R1 und R" jeweils H oder CH , und falls Y = -OH kann einer der Reste R' und R" auch -OH sein,R 1 and R "are each H or CH, and if Y = -OH one of the radicals R 'and R" can also be -OH,
X -OH, -NR2R3 oder -0R4 ,X -OH, -NR 2 R 3 or -0R 4 ,
R 2 und R3 jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphen- ylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkylgruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach substituiert sein können durch Alkoxy- , Cyano-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium- , Carboxyl-, Sulfonsäure- Acetoxy- oder Acetamino-Reste, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5 bis 10 C-Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH - Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und 0 ersetzt sind, oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2_) n-S02_-(CH2_) nR 2 and R3 each represent an alkyl, phenyl, phenylalkyl or alkylphenyl group with up to 10 carbon atoms in the alkyl group, these groups being able to be substituted one or more times by alkoxy, cyano, amino, mono - Or dialkylamino, trialkylammonium, carboxyl, sulfonic acid, acetoxy or acetamino radicals, a cyclic or bicyclic radical having 5 to 10 carbon atoms, in which one or more CH or CH groups by N or NH, N or NH and S, or N or NH and 0 are replaced, or a sulfone sulfide of the structure - (CH2_) n-S02 _- (CH2_) n
S(CH„) OH mit n = 2-6 bedeuten und einer der Reste R 2 un2dnR3 auch H bedeuten kann, wobei R 2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind, n 2 bis 100,S (CH “) OH with n = 2-6 and one of the radicals R 2 and 2 d n R3 can also mean H, where R 2 and R3 are coordinated with one another such that either both radicals are acidic or basic or one or both the residues are neutral, n is 2 to 100,
4 und R eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Al- kylphenylgruppe mit bis zu 10 C-Atomen in der Alkyl¬ gruppe, wobei diese Gruppen ein- oder mehrfach sub¬ stituiert sein können durch Alkoxy- , Cyano-, Carbo- xyl-, Sulfonsäure- oder Acetoxy-Reste, bedeutet, aufweisen.4 and R are an alkyl, phenyl, phenylalkyl or alkylphenyl group with up to 10 carbon atoms in the alkyl group, it being possible for these groups to be substituted one or more times by alkoxy, cyano, carbo- xyl, sulfonic acid or acetoxy radicals means.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -C -XThe method of claim 1, wherein Y in formula I of claim 1 -C -X
II o mit X = OH oder -OR 4 bedeutet, wobei R4 die in An¬ spruch 1 angegebene Bedeutung hat .II o with X = OH or -OR 4, where R4 has the meaning given in claim 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -C -XThe method of claim 1, wherein Y in formula I of claim 1 -C -X
II 0 mit X = -NR2R3 ist, worin R 2 und R3 jeweilsII 0 with X = -NR 2 R 3 , wherein R 2 and R3 are each
Alkyl, Alkoxyalkyi, Cyanoalkyl, Aminoalkyl , Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Car- boxyalkyl, Sulfonsäurealkyl mit jeweils bis zu 10 C- Atomen in der Alkylgruppe, unsubstituiertes oder durch einen oder mehrere Al¬ kyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyi, Cyano-, Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino- , Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium- , Trial¬ kylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulfon¬ säure-, Sulfonsäurealkyl- , Acetoxy- oder Acetamino- Gruppe (n) substituiertes Phenyl mit bis zu 10 C-Alkyl, alkoxyalkyi, cyanoalkyl, aminoalkyl, mono- or dialkylaminoalkyl, trialkylammoniumalkyl, carboxyalkyl, sulfonic acid alkyl each having up to 10 carbon atoms in the alkyl group, unsubstituted or by one or more alkyl, alkoxy, alkoxyalkyi, cyano- , Cyanoalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- or Dialkylamino-, Mono- or Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trial¬ kylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl, Sulphonic acid-, Sulphonic acid alkyl-, Acetoxy- or Acetamino- Group (s) substituted phenyl with up to 10 C-
Atomen in der Alkylgruppe, einen cyclischen oder bicyclischen Rest mit 5 bisAtoms in the alkyl group, a cyclic or bicyclic radical with 5 to
10 C-Atomen, worin eine oder mehrere CH- oder CH„-10 carbon atoms, in which one or more CH or CH “-
Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und 0 ersetzt sind, oder ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH 2„)n-SO2n-Groups are replaced by N or NH, N or NH and S, or N or NH and 0, or a sulfone sulfide of the structure - (CH 2 “) n-SO2 n -
(CH2„)n-S- (CH2_)nOH mit n = 2-6 bedeuten und einer der(CH2 „) n-S- (CH2_) nOH with n = 2-6 and one of the
ResteLeftovers
R 2 und R3 auch H bedeuten kann, wobei R2 und R3 so aufeinander abgestimmt sind, daß entweder beide Reste sauer oder basisch oder einer oder beide der Reste neutral sind.R 2 and R3 can also denote H, R2 and R3 being coordinated with one another such that either both radicals are acidic or basic or one or both of the radicals are neutral.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -CH_NH oder
Figure imgf000018_0001
wobei R2 und R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.4. The method according to claim 1, wherein Y in the formula I of claim 1 -CH_NH or
Figure imgf000018_0001
wherein R2 and R have the meaning given in claim 1.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Y in der Formel I des Anspruchs 1 -CN, -CHO oder -OH ist.5. The method of claim 1, wherein Y in formula I of claim 1 is -CN, -CHO or -OH.
6. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinakti¬ viertem α -Antitrypsin mittels Anionenaustauscher- Chromatographie, wobei die α. -Antitrypsinhaltige Fraktion, ins¬ besondere Cohn IV-1-Fraktion, aus einer wäßri¬ gen Lösung (Auftragungspuffer) auf eine Chroma¬ tographie-Säule, die mit einem Anionenaustau- scher wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 beschrieben, beschickt ist, gegeben wird unter Bedingungen relativ geringer Ionenstärke, gefolgt von mindestens einem Waschschritt mit einer Lösung entsprechend 5 bis 35 mM Natrium¬ chlorid und Natriumacetat in der Nähe des pK - Wertes der Essigsäure, gefolgt von einer Elution mit einer Lösung hö¬ herer Ionenstärke entsprechend 50 bis 300 mM Natriumchlorid in 25 bis 37 mM Tris/HCl in al¬ kalischem Milieu (pH 7,4 bis 9,2) , gegebenen¬ falls gefolgt von Entsalzungsschritten und üb¬ licher Konzentrierung wie Lyophilisation.6. Process for obtaining highly pure, virus-inactivated α-antitrypsin by means of anion exchange chromatography, the α. Antitrypsin-containing fraction, in particular Cohn IV-1 fraction, from an aqueous solution (application buffer) onto a chromatography column which is charged with an anion exchanger as described in at least one of claims 1 to 5 is given under conditions of relatively low ionic strength, followed by at least one washing step with a solution corresponding to 5 to 35 mM sodium chloride and sodium acetate in the vicinity of the pK value of the acetic acid, followed by elution with a solution of higher ionic strength corresponding to 50 to 300 mM sodium chloride in 25 to 37 mM Tris / HCl in an alkaline environment (pH 7.4 to 9.2), optionally followed by desalination steps and the like concentration such as lyophilization.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei vor der chromato¬ graphischen Reinigung eine Virusinaktivierung und/ oder alkalische Vorbehandlung der Cohn IV-1 Fraktion erfolgt .7. The method according to claim 6, wherein virus inactivation and / or alkaline pretreatment of the Cohn IV-1 fraction takes place before the chromatographic purification.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die chroma¬ tographischen Reinigungsschritte mittels Membran- Chromatographie durchgeführt werden, wobei im ersten Chromatographieschritt mit Anionenaustauschergruppen modifizierte Membranen und im zweiten Chromatogra¬ phieschritt mit hydrophoben Gruppen modifizierte Membranen eingesetzt werden.8. The method according to claim 6 or 7, wherein the chromatographic purification steps are carried out by means of membrane chromatography, wherein membranes modified with anion exchange groups are used in the first chromatography step and membranes modified with hydrophobic groups in the second chromatography step.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Membranen als Disks ausgebildet sind.9. The method according to at least one of claims 6 to 8, wherein the membranes are designed as disks.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Membranen aus modifizierten Cellulose- und/oder synthetischen Fasern und/oder aus Kunstfasern aus Polyglycidylmethacrylat aufgebaut sind. 10. The method according to any one of claims 6 to 9, wherein the membranes are made of modified cellulose and / or synthetic fibers and / or synthetic fibers made of polyglycidyl methacrylate.
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