WO1995006663A2 - BACTERIOCINA ACTIVA CONTRA LISTERIA MONOCYTOGENES OBTENIDA A PARTIR DE UNA CEPA DE $i(ENTEROCOCCUS FAECIUM) - Google Patents

BACTERIOCINA ACTIVA CONTRA LISTERIA MONOCYTOGENES OBTENIDA A PARTIR DE UNA CEPA DE $i(ENTEROCOCCUS FAECIUM) Download PDF

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listeria
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Marta Hugas Maurici
Margarita Garriga Turon
Josep Mª MONFORT BOLIVAR
Josep Ylla Ullastre
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Institut De Recerca I Technologia Agroalimentaries (Irta)
Casa Tarradellas, S.A.
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3526—Organic compounds containing nitrogen

Definitions

  • the present invention relates to a new bacteriocin, obtained from a new strain of Enterococcus faecium, with bactericidal action against Listeria monocvtogenes and with application to inhibit the growth and spread of said pathogenic microorganism in food, especially in meat and meat. meat and milk products and dairy products.
  • Listeria monocvtogenes is a pathogenic microorganism that causes serious disorders in people and animals and can be easily transmitted through contaminated food, especially through meat and meat products and milk and milk products. Said pathogenic microorganism is resistant to refrigeration but is sensitive under acidity conditions, that is, at low pH.
  • bacteriocin is applied to substances of the peptide type, produced by microorganisms, capable of specifically inhibiting the growth of other bacteria by their absorption on specific receptors thereof.
  • Marugg et al. describe in the European patent application nQ 0 493 779 a cloned gene, which codes for a bacteriocin of Pediococcus acidilactici. useful to inhibit the growth of Listeria in food products.
  • Kawase, Kozo et al. describe in European Patent Application No. 0 503 939 an antimicrobial peptide capable of inhibiting Listeria monocvtogenes. among other microorganisms, obtained by hydrolysis of bovine lactoferrin.
  • a product with antimicrobial activity obtained from Streptococcus faecium cultures. for the treatment and prevention of gastrointestinal disorders produced, in other microorganisms, by bacteria of the genus Listeria.
  • Said product has a molecular weight of less than 1,000 and is not a bacteriocin.
  • the bacteriocins against Listeria monocvtogenes described to date have different advantages and disadvantages, but there remains a need to find alternatives with a high degree of efficacy and affordability that allow the food industry to effectively combat the risks of contamination of its products by Listeria moncvtogenes.
  • the authors of the present invention have 'discovered a novel bacteriocin produced by a novel strain of Enterococcus faecium, with surprising activity against Listeria monocytogenes specific and it is very affordable and easy to obtain.
  • the present invention aims to provide a new bacteriocin against Listeria monocvtogenes. highly effective in combating the growth and spread of Listeria monocvtogenes in food.
  • Another object of the present invention is to provide a new bacterial strain of Enterococcus faecium capable of producing said bacteriocin.
  • Still another object of the present invention is the use of the bacteriocin or bacterial strain mentioned to prevent and prevent the growth and spread of Listeria monocvtogenes in food.
  • the bacteriocin against Listeria monocvtogenes object of the present invention is characterized by being a peptide of molecular weight greater than 4,000 that is obtained by culturing the strain Enterococcus faecium bacterial CTC492.
  • CTC492 is the denomination provided to the aforementioned strain by the authors of the present invention and corresponds to the Crop Collection of the Carn Technology Center, the Institute for Agrifood Research and Technology, with domicile at the Camps i Armet s Farm / n, 17121 Monells (Girona), Spain.
  • a culture of the aforementioned strain has been deposited, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the international recognition of the deposit of microorganisms for the purposes of the procedure for the Spanish Type Culture Collection (CECT) of the University of Valencia , domiciled at Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia), Spain, which has assigned the deposit number CECT 4453.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the Enterococcus faecium CTC492 strain consists of gram-positive cocci, non-sporulated catalase negatives, whose main fermentation product is lactic acid and which are capable of producing August 22, 1994 a-hem lysis in blood agar (48 hours at 30QC ).
  • the strain ferments the melibious, it is unable to ferment the melezitose and does not reduce the triphenyltetrazolium chloride (TTZ) in a medium with 0.1% thallium acetate. It has a positive growth at 45QC and in 6.5% of sodium chloride and reacts positively with the D antigen.
  • TTZ triphenyltetrazolium chloride
  • Enterococcus faecium genus are approved by the International Federation of Dairy Products as food grade bacteria useful for use as starter cultures in dairy products.
  • the strain CTC492 can be grown with excellent results in an MRS broth (broth for lactobacilli according to De Man, Rogosa and Sharpe, marketed by DIFCO, 0X0ID, MERCK, etc.) in aerobiosis, at a temperature of the order of 30Q C .
  • the bacteriocin against Listeria monocvtogenes object of the present invention obtained from strain CTC492, has a molecular weight of 4,282 Daltons and is a peptide consisting of 35 amino acids whose sequence is as follows:
  • This amino acid sequence is new and has certain similarities with those of the bacteriocins pediocina, sakacina A, leucocina A and curvacina A.
  • the bacteriocin object of the invention can be located in an EcoR1 chromosomal fragment of between 12 and 14 Kb.
  • the bacteriocin object of the present invention is inactivated by treatment with proteolytic enzymes such as trypsin, nagarse or proteinase K, but it is resistant to a treatment at 100QC of temperature for 20 minutes.
  • Both the whole culture of strain CTC492 and the entericin bacterio ⁇ cine CTC492 are capable of inhibiting the growth of Listeria monocvtogenes.
  • Listeria innocua and Listeria welshi eri enl the tests of gout in agar, diffusion in agar and direct antagonism in conditions in which the inhibition due to acid and hydrogen peroxide is suppressed.
  • the inhibitory action is bactericidal.
  • Tests have also been carried out to inhibit the growth of the different strains of Listeria in contaminated food products, for example in contaminated crushed meat, with drastic reductions in the number of colony forming units (ufe), in times of order of 24 hours, after the addition of the enrericin CTC492 object of the invention.
  • Entericin CTC492 can be obtained by a procedure consisting of cultivating the Enterococcus faecium CTC492 strain in MRS broth, centrifuging the culture to obtain the supernatant, treating it with cold ammonium sulfate and centrifuging it to recover the sediment consisting of a very active entericin concentrate CTC492, which can be resuspended in an appropriate amount of phosphate buffer solution at pH 7.0.
  • the activity against Listeria is measured in units of activity, UA, according to the method described by Barefoot, S. et al. in Appl. Environ. Microbiol 45 (6), 1808-1815 (1983), conveniently adapted.
  • a UA is the reciprocal of the highest dilution that has completely inhibited the Listeria monocvtogenes strain in a culture thereof with approximately 100.00 cfu / ml.
  • UA is express per milliliter (UA / l) in the case of liquid preparations or per gram (UA / g) in the case of solid preparations.
  • the CTC492 entericin concentrate obtained can be further purified by a four-stage protocol consisting of its precipitation in ammonium acetate, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction 1 chromatrography and phase chromatography reverse in the FPLC system (Fast Performance Liquid Chromatography), eluting in a 30% isocratic gradient of isopropanol in a C2-C18 column.
  • the molecular weight is determined, on the purified CTC492 entericin, by SDS-PAGE electrophoresis (Sodium Dodecy Sulfate-PolyAcrilamide Gel Electrophoresis) and by mass spectrometry.
  • the entericin CTC492 object of the invention can also be obtained by known genetic engineering techniques, for example by cloning an auxiliary strain of any appropriate microorganism with a plasmid vector obtained from the chromosomal fragment responsible for the production of said entericin. CTC492.
  • the CTC492 entericin concentrate obtained in the aforementioned obtaining procedures can be used, for application to food, in the form of a liquid suspension or in solid form, by drying and mixing it with any type of appropriate excipients or subjecting it to a lyophilization process, all through the application of techniques sufficiently known in the state of the art.
  • the same culture of the Enterococcus faecium strain in liquid form can also be used in food application, frozen or not, dried or lyophilized, as well as any preparation from it, with different degrees of activity.
  • Both the entericin CTC492 and the culture of the Enterococus faecium CTC492 strain and the preparations obtainable therefrom can be used with great efficiency to, by adding them to food by any appropriate known method, prevent and prevent the growth and spread in the same as Listeria monocvto ⁇ genes. even if the acidity of the mentioned foods is low.
  • Entericin CTC492 the culture of the Enterococcus faecium CTC492 strain and the preparations obtainable therefrom can also be used in the treatment of food-containing packages, so that they constitute a protective barrier against contamination by Listeria monocvtogenes.
  • they can be incorporated into a food protective film by known techniques, such as those described in European Patent Application No. 0384319.
  • entericin CTC492 object of the present invention can be presented in the form of compositions of matter containing other types of chemical products, natural or not, or biological that are appropriate.
  • Figure 1 shows a graph with the effect of the addition of entericin CTC492 to an exponential phase culture of Listeria monocvtogenes.
  • Entericin was added at the concentrations of 800 AU / ml and 3,200 AU / ml and the results are represented in a comparative way with a control culture to which no ether has been added.
  • the abscissa axis the elapsed time is represented and in the ordinate the logarithm of the colony-forming units per milliliter.
  • Example 1 Obtaining a CTC492 entericin concentrate
  • DIFCO with 1% by volume of a culture in MRS, in stationary phase, of Enterococcus faecium CTC492 and the resulting culture is incubated at 30QC for 12-18 hours.
  • the culture is then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, the supernatant is collected and 40% by weight of ammonium sulfate is added thereto.
  • the resulting mixture is maintained at 0QC and 5 Q C for 30 minutes and then centrifuged at 10,000 rpm for 35 minutes.
  • the sediment obtained is suspended in 10 of 3mM potassium phosphate buffer at pH 7.0.
  • the suspension obtained is the CTC492 entericin concentrate that can be used as is or diluted at different concentrations.
  • Example 2 Assay for agar diffusion inhibition A culture in MRS broth of Enterococcus faecium CTC492, incubated for 20-24 hours at 30QC, is centrifuged at 10,000 rpm. The supernatant is taken, the pH is adjusted to 6.5 and sterilized by filtration with a 0.45 micrometer pore diameter filter.
  • An MRS soft agar tube, with 0.2% glucose, is inoculated with 200 microliters of a Listeria monocvtogenes overnight culture. It is poured onto an MRS agar plate, with 0.2% glucose, and allowed to solidify. The sterile pipette of 3mm in diameter is perforated and the agar is deposited in each well 30 microliters of the supernatant of the culture of Enterococcus faecium obtained above. The plate is incubated in anaerobiosis, at 25QC for 24 hours and it is observed that a halo of 10mm inhibition occurs around each well in which the supernatant was deposited.
  • Example 3 Inhibition of the growth of Listeria monovto ⁇ genes by the effect of entericin bacteriocin CTC492.
  • Example 4 Inhibition assays of Listeria innocua in meat products.
  • Two batches of meat dough were prepared for the preparation of sausages, according to a traditional recipe in the meat industry, and both were contaminated with innocuous Listeria levels of 10,000 cfu per gram of meat dough.
  • One of the lots was added 800 AU per gram of entericin meat mass CTC492 obtained in Example 1. Next, the meat dough was stuffed.
  • the deposited crop is available to the public without restrictions, under the conditions provided in the Treaty of

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Abstract

Se describe una nueva bacteriocina contra Listeria monocytogenes, obtenida a partir del cultivo de una nueva cepa de Enterococcus faecium denominada CTC492. La bacteriocina es un péptido de peso molecular 4.282 Daltons que consta de una secuencia de 35 aminoácidos y se puede aplicar con notable eficacia para prevenir y evitar el crecimiento y propagación de Listeria monocytogenes en los alimentos, especialmente en la carne y los productos cárnicos y en la leche y los productos lácteos.

Description

BACTERIOCINA ACTIVA CONTRA LISTERIA MONOCYTOGENES OBTENIDA A PARTIR DE UNA CEPA DE ENTEROCOCCUS FAECIUM
Campo de la técnica.
La presente invención se refiere a una nueva bacteriocina, obtenida a partir de una nueva cepa de Enterococcus faecium, con acción bactericida contra Listeria monocvtogenes y con aplicación para inhibir el crecimiento y propagación de dicho microorganismo patógeno en los alimentos, especialmente en la carne y los productos cárnicos y en la leche y los productos lácteos.
Estado de la técnica.
La Listeria monocvtogenes es un microorganismo patógeno que produce serios trastornos en las personas y en los animales y que se puede transmitir con facilidad a través de alimentos contaminados, especialmente a través de la carne y los productos cárnicos y de la leche y los productos lácteos. Dicho microorganismo patógeno se muestra resistente a la refrigeración pero resulta sensible en condiciones de acidez, es decir, a pH bajo.
En muchos casos no resulta posible almacenar y ofrecer al consumo los alimentos con un pH bajo. Así, en la actualidad el consumidor rechaza los productos cárnicos demasiado ácidos y sus preferencias se decantan por los productos cárnicos fermentados con poco gusto ácido, con lo que aumenta considerablemente las posibilida¬ des de que se produzca en los mismos contaminación y crecimiento de Listeria monocvtogenes.
De acuerdo con Tagg, J.R. et al.; Bacteriol. Revie , 40; 7222-756 (1976), el término bacteriocina se aplica a sustancias de tipo peptídico, producidas por microorganismos, capaces de inhibir específi¬ camente el crecimiento de otras bacterias mediante su absorción sobre receptores específicos de las mismas.
HOJA SUSTITUIDA Se han descrito varias bacteriocinas activas contra Listeria monocvtogenes. útiles para combatir la contaminación de los alimentos por parte de la misma. Así, Vendenbergh et al., en la patente europea nQ 0326062, describen un método para inhibir Listeria monocvtogenes mediante la utilización de una bacteriocina obtenida a partir de una cepa de Pediococcus acidilactici. Los mismos autores describen, en la solicitud de patente europea nQ 0453719, que la actividad bactericida está ligada a un fragmento de peso molecular 4.629, aislado a partir de la bacteriocina original de peso molecular 16.500.
Marugg et al. describen en la solicitud de patente europea nQ 0 493 779 un gen clonado, que codifica por una bacteriocina de Pediococcus acidilactici. útil para inhibir el crecimiento de Listeria en productos alimenticios. Kawase, Kozo et al. describen en la solicitud de patente europea nQ 0 503 939 un péptido antimicrobiano capaz de inhibir Listeria monocvtogenes. entre otros microorganismos, obtenido mediante la hidrólisis de la lactoferrina bovina.
Se sabe, por otra parte, que las bacterias del género Streptoccus faecium. actualmente denominado Enterococcus faecium. son capaces de producir substancias de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, no bacteriocinas, útiles en tratamientos terapéuticos de tipo preventivo y curativo. Así, Kawai, Yasuo et al. describen, en las solicitudes de patente japonesas publicadas nQs 6153293 y 61109728, el empleo en productos dentífricos de un compuesto de fórmula molecular
C11^15N5°5 atenido a partir de Streotococcus faecium. Por su parte,
Lewenstein et al. describen, en la solicitud de patente europea nQ 0
405 569, un producto con actividad antimicróbiana, obtenido a partir de cultivos de Streptococcus faecium. para el tratamiento y prevención de trastornos gastrointestinales producidos, en otros microorganismos, por bacterias del género Listeria. Dicho producto tiene un peso molecular inferior a 1.000 y no se trata de una bacteriocina. Las bacteriocinas contra Listeria monocvtogenes descritas hasta la fecha presentan diferentes ventajas e inconvenientes, pero permanece la necesidad de encontrar alternativas con un elevado grado de eficacia y asequibilidad que permitan a la industria de la alimenta- ción combatir con eficacia los riesgos de la contaminación de sus productos por Listeria moncvtogenes.
Los autores de la presente invención han' descubierto una nueva bacteriocina producida, por una nueva cepa de Enterococcus faecium, con una sorprendente actividad específica contra Listeria monocvtogenes y que resulta muy asequible y fácil de obtener.
objeto de la invención.
La presente invención tiene como objeto proporcionar una nueva bacteriocina contra Listeria monocvtogenes. altamente eficaz para combatir el crecimiento y propagación de Listeria monocvtogenes en los alimentos.
Otro objeto de la presente invención consiste en proporcio¬ nar una nueva cepa bacteriana de Enterococcus faecium capaz de producir la mencionada bacteriocina.
Todavía otro objeto de la presente invención consiste en la utilización de la bacteriocina o de la cepa bacteriana mencionadas para prevenir y evitar el crecimiento y propagación de Listeria monocvtogenes en los alimentos.
Descripción de la invención.
La bacteriocina contra Listeria monocvtogenes objeto de la presente invención se caracteriza por ser un péptido de peso molecular superior a 4.000 que se obtiene mediante el cultivo de la cepa bacteriana de Enterococcus faecium CTC492. CTC492 es la denominación proporcionada a la mencionada cepa por los autores de la presente invención y corresponde a la Colección de Cultivos del Centre de Tecnología de la Carn, del Institut de Recerca i Tecnología Agroalimen- táries, con domicilio en la Granja Camps i Armet s/n, 17121 Monells (Girona), España.
Se ha depositado un cultivo de la citada cepa, de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedi¬ miento en materia de Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) de la Universidad de Valencia, domiciliada en Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia), España, que le ha asignado el número de depósito CECT 4453.
La cepa de Enterococcus faecium CTC492 está constituida por cocos gram positivos, catalasa negativos no esporulados, cuyo principal producto de fermentación es el ácido láctico y que son capaces de producir 22 de agosto de 1994 a-hem lisis en agar sangre (48 horas a 30QC) . La cepa fermenta la melibiosa, es incapaz de fermentar la melezitosa y no reduce el cloruro de trifeniltetrazolio (TTZ) en un medio con 0,1% de acetato de talio. Presenta un crecimiento positivo a 45QC y en 6,5% de cloruro sódico y reacciona positivamente con el antígeno D. Su perfil de fermentación de algunos azúcares es el siguiente: glucosa + ribosa + melibiosa + mañosa + celobiosa + ramnosa - sacarosa + D-rafinosa - melezitosa - lactosa +" maltosa + trehalosa +
Todos estos caracteres concuerdan con los descritos en el manual "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", vol 2, Balti ore: illiam an Willains (1986) para la clasificación de Enterococcus faecium. anteriormente Streptococcus faecium.
Los miembros del género Enterococcus faecium están aprobados por la Federación Internacional de Productos Lácteos como bacterias de grado alimentario útiles par su empleo como cultivos iniciadores en productos lácteos.
La cepa CTC492 se puede cultivar con excelentes resultados en un caldo de cultivo MRS (caldo para lactobacilos según De Man, Rogosa y Sharpe, comercializado por las empresas DIFCO, 0X0ID, MERCK, etc. ) en aerobiosis, a temperatura del orden de 30Q C.
La bacteriocina contra Listeria monocvtogenes objeto de la presente invención, obtenida a partir de la cepa CTC492, tiene un peso molecular de 4.282 Daltons y es un péptido que consta de 35 aminoácidos cuya secuencia es la siguiente:
Thr-Thr-His-Ser-Gly-Lys-Tyr-Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Tyr-Cys- Thr-Lys-Asn-Lys-Cys-Thr-Val-Asp-Thr-Ala-Lys-Ala-Thr-Thr-Xaa-Ile-Ala- Gly-Met-Ser-Ile
Dicha secuencia de aminoácidos es nueva y presenta ciertas semejanzas con las de las bacteriocinas pediocina, sakacina A, leucocina A y curvacina A.
Mediante el empleo de una sonda degenerada que comprende del residuo 6 al 15, los autores de la presente invención han podido determinar, por medio de la hibridación de la mencionada sonda con el DNA plasnlídico y cromosómico de la cepa CTC492, que el gen productor de la bacteriocina objeto de la invención puede estar localizado en un fragmento cromosómico EcoRl de entre 12 y 14 Kb.
La bacteriocina objeto de la presente invención, denominada por los autores de la misma entericina CTC492, se inactiva mediante su tratamiento con enzimas proteolíticos tales como tripsina, nagarsa o proteinasa K, pero resulta resistente a un tratamiento a 100QC de temperatura durante 20 minutos.
Tanto el cultivo entero de la cepa CTC492 como la bacterio¬ cina entericina CTC492 son capaces de inhibir el crecimiento de Listeria monocvtogenes. Listeria innocua y Listeria welshi eri enl los ensayos de la gota en agar, difusión en agar y de antagonismo directo en condiciones en las que se suprime la inhibición debida al ácido y al peróxido de hidrógeno. La acción inhibidora es de tipo bactericida.
También se han efectuado ensayos de inhibición del crecimiento de las diferentes cepas de Listeria en productos alimenti- cios contaminados, por ejemplo en masa cárnicas trituradas contamina¬ das, observándose drásticas reduccciones en el número de unidades formadoras de colonia (ufe), en tiempos del orden de 24 horas, después de la adición de la enrericina CTC492 objeto de la invención.
La entericina CTC492 se puede obtener mediante un procedi¬ miento consistente en cultivar la cepa Enterococcus faecium CTC492 en caldo MRS, centrifugación del cultivo para obtener el sobrenadante, tratamiento del mismo con sulfato amónico en frío y centrifugación del mismo para recuperar el sedimento que consiste en un concentrado, muy activo, de entericina CTC492, que se puede resuspender en una cantidad apropiada de disolución tampón fosfato a pH 7,0.
La actividad contra Listeria se mide en unidades de actividad, UA, de acuerdo con el método descrito por Barefoot, S. et al. en Appl. Environ. Microbiol. 45 (6), 1808-1815 (1983), conveniente¬ mente adaptado. Así, una UA es el recíproco de la dilución más elevada que ha inhibido por completo la cepa de Listeria monocvtogenes en un cultivo de la mismo con aproximadamente 100.00 ufc/ml. Las UA se expresan por mililitro (UA/ l) en el caso de preparados líquidos o por gramo (UA/g) en el caso de preparados sólidos.
A los efectos de los estudios de identificación química y bioquímica, el concentrado de entericina CTC492 obtenido se puede purificar adicionalmente mediante un protocolo de cuatro etapas consistente en su precipitación en acetato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatrografía de interacción1 hidrofóbica y cromatografía en fase reversa en el sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography), eluyendo en un gradiente isocrático al 30% de isopropanol en una columna C2-C18.
El peso molecular se determina, sobre la entericina CTC492 purificada, mediante electroforesis en SDS-PAGE (Sodium DodecySulphate- PolyAcrilamide Gel Electrophoresis) y mediante espectrometría de masas.
La entericina CTC492 objeto de la invención se puede obtener también mediante técnicas conocidas de ingeniería genética, por ejemplo mediante clonación de una cepa auxiliar de cualquier microorga- nismo apropiado con un vector plásmido obtenido a partir del fragmento cromosómico responsable de la producción de la mencionada entericina CTC492.
El concentrado de entericina CTC492 obtenido en los procedimientos de obtención anteriormente mencionados se puede utilizar, para su aplicación a los alimentos, en forma de una suspen¬ sión liquida o en forma sólida, mediante su desecación y mezcla con cualquier tipo de excipientes apropiados o sometiéndolo a un proceso de liof'ilización, todo ello mediante la aplicación de técnicas suficientemente conocidas en el estado de la técnica.
También se puede utilizar en la aplicación a los alimentos el propio cultivo de la cepa Enterococcus faecium en forma líquida, congelada o no, desecada o liofilizada, así como cualquier preparado proveniente del mismo, con diferentes grados de actividad.
Tanto la entericina CTC492 como el cultivo de la cepa Enterococus faecium CTC492 y los preparados obtenibles a partir de la misma se pueden utilizar con gran eficacia para, mediante su adición a los alimentos por cualquier método conocido apropiado, prevenir y evitar el crecimiento y propagación en los mismos de Listeria monocvto¬ genes. incluso en el caso de que la acidez de los mencionados alimentos sea baja. Dada la inocuidad de la entericina CTC492 y de la cepa de Enterococcus faecium CTC492, no existen en principio contraindicaciones sobre el tipo de alimentos en los que se puede emplear, si bien el empleo de los mismos está especialmente indicado para evitar contamina¬ ciones en la carne y los productos cárnicos y en la leche y los productos lácteos.
La entericina CTC492, el cultivo de la cepa Enterococcus faecium CTC492 y los preparados obtenibles a partir de la misma también se pueden utilizar en el tratamiento de los envases que contienen los alimentos, de manera que constituyan una barrera protectora contra la contaminación por Listeria monocvtogenes. Por ejemplo, se pueden incorporar a una película protectora de los alimentos por medio de técnicas conocidas, tales como las descritas en la solicitud de patente europea nQ 0384319.
La entericina CTC492 objeto de la presente invención se puede presentar en forma de composiciones de materia que contengan otro tipo de productos químicos, naturales o no, o biológicos que resulten apropiados.
Descripción de los dibujos
Acompaña a la presente memoria descriptiva una hoja con dibujos en el que con carácter explicativo y no limitativo del objeto de la presente invención se representa lo siguiente:
La figura 1 muestra una gráfica con el efecto de la adición de la entericina CTC492 a un cultivo en fase exponencial de Listeria monocvtogenes. La entericina se añadió a las concentraciones de 800 UA/ml y 3.200 UA/ml y los resultados se representan de forma comparati¬ va con un cultivo control al que no se ha añadido la ehtericina. En el eje de abscisas se representa el tiempo transcurrido y en el de ordenadas el logaritmo de las unidades formadora de colonia por mililitro.
Ejemplos:
También con carácter explicativo y no limitativo de la presente invención, se exponen a continuación los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1. Obtención de un concentrado de entericina CTC492
Se inoculan 500 mi de un caldo de cultivo MRS de la empresa
DIFCO con un 1% en volumen de un cultivo en MRS, en fase estacionaria, de Enterococcus faecium CTC492 y el cultivo resultante se incuba a 30QC durante 12-18 horas. A continuación se centrifuga el cultivo a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos, se recoge el sobrenadante y se añade sobre el mismo un 40% en peso de sulfato amónico. La mezcla resultante se mantiene entre 0QC y 5QC durante 30 minutos y posteriormente se centrífuga a 10.000 r.p.m durante 35 minutos. El sedimento obtenido se suspende en lO l de tampón de fosfato potásico 3mM a pH 7,0. La suspensión obtenida es el concentrado de entericina CTC492 que se puede emplear tal cual o diluido a diferentes concentraciones.
Ejemplo 2. Ensayo de inhibición por difusión en agar Se centrífuga a 10.000 r.p.m un cultivo en caldo MRS de Enterococcus faecium CTC492, incubado durante 20-24 horas a 30QC. Se toma el sobrenadante, se ajusta el pH a 6,5 y se esteriliza mediante filtración con un filtro de 0,45 micrometro de diámetro de poro.
Se inocula un tubo de agar blando MRS, con 0,2% de glucosa, con 200 microlitros de un cultivo de noche de Listeria monocvtogenes. se vierte sobre una placa de agar MRS, con 0,2% de glucosa, y se deja solidificar. Mediante una pipeta estéril de 3mm de diámetro se perfora el agar y se depositan en cada pocilio 30 microlitros del sobrenadante del cultivo de Enterococcus faecium obtenido anteiormente. Se incuba la placa en anaerobiosis, a 25QC durante 24 horas y se observa que se produce un halo de inhibición de lOmm alrededor de cada pocilio en el que se depositó el sobrenadante.
Ejemplo 3. Inhibición del crecimiento de Listeria monocvto¬ genes por el efecto de la bacteriocina entericina CTC492.
Se preparan de idéntica manera tres cultivos en fase exponencial de Listeria monocvtogenes en medio TSBYE (caldo de soja tríptica de la empresa DIFCO) al que se ha añadidos un 0,6% de extracto de levadura. Uno de los cultivos se reserva como control y a los otros dos se les añaden, respectivamente, 800 y 3.200 UA/ml de entericina CTC492, preparada según se ha descrito en el ejemplo 1. Los cultivos se incuban a 30.. y, a diferentes intervalos de tiempo, se plaquea en medio de agar TSBYE a las diluciones adecuadas para poder efectuar los recuentos de las unidades formadadoras de colonia de Listeria monocvto¬ genes por mililitro. Los resultados obtenidos, expresados como log ufc/ml, son los siguientes: Tiempo (min) Control +800 UA +3200 UA
0,0 5,43 5,43 5,43
40,0 5,68 1,90 1,30
70,0 5,77 2,00 1,30
130,0 6,34 2,20 1,90
190,0 6,48 2,40 2,00
En la figura 1 se representan gráficamente los valores obtenidos. De su observación se deduce, sin lugar a duda, la elevada eficacia de la entericina CTC492 para inhibir el crecimiento de Listeria monocvto¬ genes.
Ejemplo 4. Ensayos de inhibición de Listeria innocua en productos cárnicos.
Por motivos de seguridad para el personal investigador estos ensayos se efectuaron con Listeria innocua, especie de género Listeria que, al contrario que Listeria monocvtogenes. no produce trastornos en caso de su ingestión por las personas.
Se prepararon dos lotes de masa cárnica para la elaboración de salchichones, según receta tradicional en la industria cárnica, y ambos se contaminaron con niveles de Listeria innocua de 10.000 ufe por gramo de masa cárnica. A uno de los lotes se le añadieron 800 UA por gramo de masa cárnica de entericina CTC492 obtenida en el ejemplo 1. A continuación se procedió a la embutición de la masa cárnica.
A las 24 horas el recuento de ufc/g se redujo hasta 100 en el caso"de los embutidos fabricados con el lote tratado con entericina CTC492 y a los 8 dias de proceso el recuento se redujo a 50 ufc/g.
La evolución del pH en el lote control y en el lote tratado con entericina CTC492 fue totalmente semejante, por lo que cabe deducir que la disminución en el recuento de ufc/g se debe a la acción de entericina CTC492 y no a variaciones en acidez de la masa cárnica.
Información sobre el depósito de microorganismos
El depósito de microorganismos se ha efectuado, conforme a las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedi¬ miento en materia de patentes, en la Autoridad Internacional de Depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), de la Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia), España.
Identificación Número CECT Fecha del del solicitante depósito
Enterococcus faecium CTC492 CECT 4453 14/07/93
El cultivo depositado está a disposición del público sin restricciones, bajo las condiciones previstas en el Tratado de
Budapest, si bien dicha disponibilidad no se puede interpretar como una licencia para practicar el objeto de la presente invención infringiendo los derechos del solicitante de la presente patente.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Bacteriocina contra las bacterias del género Listeria. caracterizada por ser un péptido de peso molecular 4.282 Daltons que posee la siguiente secuencia de aminoácidos:
Thr-Thr-His-Ser-Gly-Lys-Tyr-Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Tyr-Cys- Thr-Lys-Asn-Lys-Cys-Thr-Val-Asp-Thr-Ala-Lys-Ala-Thr-Thr-Xaa-Ile-Ala- Gly-Met-Ser-Ile.
2.-Bacteriocina, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por ue se obtiene a partir de un cultivo de la cepa bacteriana de Enterococcus faecium CTC492, obtenible de CECT 4453.
3.- Bacteriocina, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque se obtiene mediante clonación de una cepa auxiliar de cualquier microorganismo apropiado con un vector plásmido obtenido a partir de un fragmento cromosómico apropiado de la cepa bacteriana de Enterococcus faecium CTC492, obtenible de CECT 4453.
4.- Bacteriocina, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por presentarse en forma de suspensión acuosa.
5.- Bacteriocina, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por presentarse en forma desecada o liofilizada.
6.- Composiciones de materia caracterizadas por contener la bacteriocina de la reivindicación 1.
7.- La cepa bacteriana de Enterococcus faecium CTC492, obtenible de CECT 4453, capaz de producir la bateriocina de la reivindicación 1.
8.- La utilización de la bacteriocina de la reivindicación 1 para prevenir y evitar el crecimiento y propagación en los alimentos de Listeria monocvtogenes.
9.- La utilización de la bacteriocina de la reivindicación 1, de acuerdo con la reivindicación 8, para prevenir y evitar el crecimiento y propagación en la carne y los productos cárnicos de Listeria monocvtogenes.
10.- La utilización de bacteriocina de la reivindicación 1, de acuerdo con la reivindicación 8, para prevenir y evitar el creci¬ miento y propagación en la leche y los productos lácteos de Listeria monocytogenes.
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