WO1994028115A1 - Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen nachweis von retroviren in biologischen proben - Google Patents

Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen nachweis von retroviren in biologischen proben Download PDF

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Definitions

  • This analysis is based only on a non-functional or structure-specific molecular interaction between antibody and antigen or PCR primer and proviral DNA and therefore does not allow conclusions to be drawn about a whole and functional intact virus.
  • this analysis does not cover all stages of a viral infection, e.g. the phase in which the infection took place but no antibodies have yet been formed. These factors sometimes cause false positives or negatives
  • retroviruses leukemia, autoimmune diseases, cancer, etc.
  • the transmissibility of retroviruses through infection harbors serious problems for transfusion and transplantation medicine or requires quality tests for virus contamination in lymph, saliva, sperm or blood samples from donors and with organs, skin, bone marrow to be transplanted etc.
  • the same problem of virus contamination or infection also applies to the use of pharmaceuticals and other pharmaceutical-biotechnological or genetic-technological preparations of biological origin for disease therapies in humans and animals and in basic medical research.
  • a prerequisite for solving the problems mentioned above is the direct and functional detection of retroviruses using the simplest, most reliable and sensitive methods.
  • the direct and biochemically functional detection of retroviruses in biological samples is made possible by the present method, which consists of three stages: a) an extraction step, b) a reaction step and c) a detection step.
  • the extraction step is based on a selective binding of the retrovirus particles present in a sample on the basis of their surface molecules by means of specific ligands, which in turn are bound to a solid carrier material.
  • both virus particles and soluble viral surface molecules are immobilized in a carrier-ligand-virus complex and can be extracted selectively from the complex sample mixture.
  • a selective extraction of retroviral membrane-free virus core particles or intracisternal A particles using core-specific ligands is an alternative.
  • the selectivity of the extraction is that surface-specific ligands are used for the respective retrovirus species.
  • Virus-specific ligands can be: a) Antibodies
  • a retrovirus which are directed against antigenic surface epitopes of a retrovirus
  • c) anti-receptor idiotypic antibodies (monoclonal or polyclonal) that mimic the binding structures of the virus-specific receptors or d) complement -Proteins / peptides, which binds soluble virus-antibody-immune complexes existing in the sample via Ig-Fc regions.
  • a combination of several of the above-mentioned ligands can also be used for the selective binding of retrovirus particles.
  • the extraction step is based on purely structural interaction, it does not differentiate between whole virus particles and viral surface components e.g. Glycoproteins. Therefore, the carrier-ligand-virus complex is tested in a subsequent functional enzymatic reaction step, which is specific for retroviruses and can only be carried out by an intact virus particle, but not by individual virus components.
  • the reaction step is based on a retrovirus-specific enzymatic reaction which mimics the in vivo reactions in a retrovirus-infected cell and can be carried out by several specific viral enzymes: reverse transcriptase, RNAse H, integrase, protease and others. Endogenous reverse transcription is a complex process in which several viral components are involved, etc. the reverse transcription of the viral RNA (vRNA) to complementary DNA (cDNA) depending on the viral transfer RNA (tRNA), reverse transcriptase (RT) and exogenously added deoxy nucleotide triphosphate (dNTP s) functioning as a "primer".
  • vRNA viral RNA
  • cDNA complementary DNA
  • tRNA viral transfer RNA
  • RT reverse transcriptase
  • dNTP s exogenously added deoxy nucleotide triphosphate
  • endogenous reaction can be exogenous primers (carrier-bound or unbound), for example oligo-deoxy-guanosine triphosphate (oligo-dG) or oligo-deoxy-thymidine triphophate (oligo-dT) and exogenous templates, for example poly-cytosine triphosphate (poly- rC) or poly-adenosine triphosphate (30 ⁇ g / ml) can be added to the reverse transcription reaction to identify the biochemical functionality of the reverse transcriptase enzyme.
  • exogenous primers carrier-bound or unbound
  • oligo-dG oligo-deoxy-guanosine triphosphate
  • oligo-dT oligo-deoxy-thymidine triphophate
  • exogenous templates for example poly-cytosine triphosphate (poly- rC) or poly-adenosine triphosphate (30 ⁇ g / ml) can be added to the reverse transcription reaction to identify the biochemical functionality of the reverse transcripta
  • the reverse transcription reaction of the carrier-ligand-virus complex does not have to be stopped if the detection is based on the immobilization of the newly synthesized cDNA (eg labeling with biotin, Br-digoxigenin, FITC).
  • the reaction can be stopped due to the immobilization of the ligand-virus complex by replacing the lysis reaction mix with a stopper mix which does not contain any dNTPs.
  • This stop step also has the advantage that the labeled educts (dNTP's) can be easily separated from the products and thus significantly increase the test sensitivity.
  • a subsequent complete lysis of the virus releases the newly synthesized cDNA for detection.
  • the incorporation of dNTP s or the synthesis of cDNA is direct evidence of the biochemical functionality of the retrovirus and shows the simultaneous presence of functional viral components (vRNA, tRNA and RT) in the sample.
  • the reverse transcription reaction can be continued. on the synthesis of the second cDNA strand or double-stranded cDNA (using DNA polymerase activity) and its subsequent integration into a plasmid (using retrovirus-specific integrase activity).
  • the integrated dsDNA like the previously synthesized cDNA, is detected in a subsequent detection step.
  • the enzymatically synthesized reaction products are quantitatively measured using radioactive or non-radioactive labeling using optical, fluorescence or luminescence methods.
  • the cDNA synthesized by the reverse transcriptase is labeled during the enzymatic synthesis by the incorporation of Br, biotin fluorescent or digoxigenin-labeled dUTP (deoxy-uridine triphosphate).
  • the labeled cDNA is immobilized by means of absorption with specific ligands (streptavidin, antibodies, oligonucleotides) bound to a solid support or separated from the starting materials and coupled with an indicator enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase) by means of further labeling-specific antibodies are and corresponding enzyme substrates measured quantitatively.
  • the measurement can take place photometrically or by means of luminescence or fluorescence and can be evaluated quantitatively.
  • the labeled starting materials can be separated from the immobilized ligand-virus complex after the reaction stop described above and quantitatively measured directly by means of scintillation or fluorescence emission.
  • the labeled cDNA can be precipitated, separated from the starting materials by means of adsorption on filters and then measured.
  • the described method enables the routine direct and functional detection of retroviruses in biological samples for the first time. It has the following advantages over the existing detection methods: a) Retroviruses are detected with comparable sensitivity as particles specifically and directly in biological material using several components (antigens, enzymes and nucleic acids), b) the detection is not only carried out structurally (in the extraction step) more specific
  • Ligands but also biochemically functional using retrovirus-specific enzymes (reverse transcriptase, RNAse H, integrase, protease), which mimic the reaction in vivo and thus ensure an improved specificity of the method, c) the detection is quantitative, d) the method is dated Time and technical effort are easy to implement, routinely applicable, since it is adapted to microtiter format, and therefore also cheaper, e) the method can be applied universally to all species of retroviruses using correspondingly specific ligands.
  • retrovirus-specific enzymes reverse transcriptase, RNAse H, integrase, protease
  • the potential applications of the process to be developed can be divided into four broad areas.
  • the first area of application relates to medical diagnostics and monitoring of the course of therapy for retrovirus-related diseases, for example AIDS, leukemia in humans.
  • the same application also applies to retrovirus-related diseases in animals. Accordingly, the potential customers are: clinics and. Hospitals as well as clinical laboratories and laboratory communities.
  • a second area of application relates to virological research & development laboratories at universities, large research institutions and industry where experimental models are being worked on to develop antiviral therapy options, vaccines etc.
  • the direct detection of retroviruses in vitro models, animal models etc.
  • a third area of application relates to the entire transplantation and transfusion medicine or to the donor banks of blood, organs, bone marrow, semen etc. The detection of contamination with retroviruses in the above-mentioned donor materials is extreme important to prevent spreading and infection through transplantation or donation.
  • a fourth area of application relates to the quality control of biological pharmaceuticals (e.g. blood derivatives, coagulation preparations), biotechnological products (e.g. immunoglobulins, therapeutic enzymes, insulin, fetal serums etc.), biological cosmetics and certain (genetically engineered) foods, which must be checked for contamination with retroviruses to prevent their transmission if necessary. 3 example
  • retroviral T47D particles were used as the model virus, the properties typical of retrovirus: lipid membrane envelope, glycoproteins, reverse
  • the lysis reaction mix buffer had the following composition: 0.3% NP40, 50 mM Tris-HCl pH7.8, 40 mM KC1, 5mM MgCl 2 , 2mM DTT, 2mM EDTA and 30 ⁇ M dATP, dCTP, dGTP and dTTP + dUTP- Biotin + dUTP digoxigenin.
  • the incorporation of the dNTP ⁇ s or the synthesis of cDNA was then measured.
  • Detection The lysis-reaction mix was transferred to streptavidin-coated microtiter plates and incubated at 37 ° C. for 1 hour to immobilize the biotin and digoxigenin-labeled cDNA. After washing the unbound material, the immobilized cDNA was incubated with peroxidase-coupled anti-digoxigenin antibodies (1 hour at 37 ° C.), washed and then incubated with the peroxidase substrate ABTS (from Bschreibinger Mannheim). The color development was measured photometrically after 5 min at 405 nm (and 490 nm as reference) (Eberle, Land Seibl, B., J. Virol. Meth .: 40, 347-356, 1992). The results in Fig. 1 show that it is possible to immunologically extract T47D particles from cell culture medium with specific antibodies and then to demonstrate them biochemically by endogenous reverse transcription.

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Abstract

Das beschriebene Verfahren ermöglicht den routinemäßigen direkten und biochemisch funktionnellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben. Dies wird realisiert durch die Kombination einer Struktur-spezifischen Extraktion mit immobilisierten gegen die Virus-Oberfläche gerichteten Liganden mit einer anschließenden Funktions-spezifischen Enzym-Reaktion für Retroviren mittels Reverser Transkriptase, RNAse H, Integrase oder Protease. Für die Retrovirus spezifische Enzym-Reaktion eignet sich besonders die Reverse Transkription, an der die Reverse Transkriptase, retrovirale RNA und tRNA beteiligt sind. In einem nachträglichen Detektionsschritt werden die neu synthetisierten cDNA-Produkte anhand radioaktiver, photometrischer, Lumineszenz- oder Fluoreszenz-Verfahren identifiziert. Dieses Verfahren ist eine biochemische Nachahmung des natürlichen Vorgangs einer Retrovirus Infektion und dessen Prozessierung in der Zelle (Reverse Transkription, Integration, Maturierung) und ermöglicht den simultanen Nachweis mehrerer retroviraler Komponenten usw. Oberflächen-Glykoproteine, Enzyme, Struktur-Proteine, RNA und tRNA. Dadurch wird auch eine qualitativ bessere Spezifität des Verfahrens gegenüber den bisherigen Methoden gewährleistet. Das Verfahren dauert ca. 1-2 Tage, ist einfach und routinemäßig im Mikrotiterformat durchführbar und ermöglicht somit das gleichzeitige Verarbeiten vieler Proben in kurzer Zeit. Weiterhin ist das Verfahren unter Anwendung entsprechend spezifischer Liganden universell auf alle Spezies von Retroviren anwendbar. Das Verfahren eignet sich zum Nachweis von Retroviren bei Diagnostik, Verlauf und Therapie von Virus bedingten Krankheiten, in der Transfusion- und Transplantationsmedizin, in der virologischen Forschung und Entwicklung sowie bei der biologischen Qualitätskontrolle pharmazeutischer und biotechnologischer Produkte.

Description

2. Beschreibung
Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben
Virus-Diagnostik
2.1 Stand der Technik Der routinemäßige Nachweis von Retroviren in biologischen Proben erfolgt gegenwärtig nur indirekt und Struktur-spezifisch (d.h. nichtfunktionell) uzw. über den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und/oder von Einzelkomponenten (Antigene, RNA, provirale DNA), z.B. anti-HIV- Antikörper Tests, HIV-p24-Antigen-Tests, HIV-PCR Detektions Test (Holodniy M, et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. AIDS Res. H u m . Retrovir. 8, 47-52, 1992). Diese Analytik stützt sich lediglich auf eine nicht funktionelle bzw. Struktur spezifische molekulare Interaktion zwischen Antikörper und Antigen oder PCR primer und proviraler DNA und erlaubt deshalb nicht den Rückschluß auf ein ganzes und funktionelles intaktes Virus. Außerdem erfaßt diese Analytik nicht alle Stadien einer viralen Infektion, z.B. die Phase, in der die Infektion stattgefunden hat, jedoch noch keine Antikörper gebildet sind. Diese Faktoren bewirken somit gelegentlich falsch positive oder negative
Ergebnisse. Deshalb ist der direkte und auch funktionelle Nachweis für Retroviren in biologischen Proben dringlichst notwendig. Diese Notwendigkeit ist auch gegeben durch die medizinische und sozial-politische Aktualität von Retroviren, vor allem durch die gegenwärtig größte medizinische Herausforderung AIDS und durch eine zu beobachtende ansteigende Tendenz und zunehmende Rolle von Retroviren bei tierischen und menschlichen
Erkrankungen (Leukämie, Autoimmunerkrankunge, Krebs etc.). Außerdem birgt die Übertrag¬ barkeit von Retroviren durch Infektion ernste Probleme für die Transfusions- und Trans¬ plantationsmedizin bzw. erfordert Qualitätsuntersuchungen auf Virus-Kontamination bei Lymph-, Speichel-, Sperma- oder Blutproben von Spendern und bei zu verpflanzenden Organen, Haut, Knochenmark etc. Die gleiche Problematik der Virus-Kontaminantion bzw. Infektion gilt auch für die Verwendung von Arzneimitteln und anderen pharmazeutisch-biotechnologischen oder gen¬ technologischen Präparaten biologischen Ursprungs zu Krankheits-Therapien bei Mensch und Tier sowie in der medizinischen Grundlagen-Forschung. Voraussetzung für die Lösung der oben erwähnten Problemstellungen ist der direkte und funktionelle Nachweis von Retroviren mittels möglichst einfacher, verläßlicher und empfindlicher Methoden.
Der direkte und biologisch funktionelle Nachweis von Retroviren ist bislang nur in Einzelfällen und mit sehr hohem Arbeits- und Zeitaufwand über Infektion von Zellen und nur in in gereinigten Virus-Präparaten oder in Zellkultur-Überständen möglich. Quantitative, einfache und verläßliche Routine-Methoden gibt es bislang dafür nicht. Ein Grund dafür ist die komplexe Zusammensetzung biologischer Proben (Blut, Organextrakte etc.), die Proteine, Enzyme.
Vitamine, Lipide, Zucker und verschiedene Inhibitoren enthalten. Diese erschweren oder machen den direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren immöglich. Das vorliegende und zur Patentierung angemeldete Verfahren beschreibt den routine¬ mäßigen direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben.
2.2 Lösung des Problems
Der direkte und biochemisch funktionelle Nachweis von Retroviren in biologischen Proben wird durch das vorliegende Verfahren ermöglicht, das aus drei Etappen besteht: a) einem Extraktionsschritt, b) einem Reaktionsschritt und c) einem Detektionsschritt.
A) Der Extraktionsschritt beruht auf einer selektiven Bindung der in einer Probe vorhandenen Retrovirus-Partikel anhand deren Öberflächenmoleküle mittels spezifischer Liganden, die ihrerseits an ein solides Träger-Material gebundenen sind. Dadurch werden sowohl Virus-Partikel als auch lösliche virale Oberflächen-Moleküle in einem Träger-Ligand-Virus Komplex immobilisiert und können aus dem komplexen Probengemisch selektiv extrahiert werden. Für den Nachweis von Retroviren in Gewebe-Extrakten bietet sich alternativ eine selektive Extraktion von retroviralen membran-freien Virus-core-Partikeln bzw. intra- cisternalen A-Partikeln mittels core-spezifischen Liganden an. Die Selektivität der Extraktion besteht darin, daß Oberflächen-spezifische Liganden für die jeweiligen Retrovirus- Spezies verwendet werden. Virus-Spezifische Liganden können sein: a) Antikörper
(monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Oberflächen-Epitope eines Retrovirus gerichtet sind, b) Rezeptoren, Rezeptor-Supramolekularkomplexe oder Rezeptor-Epitope (als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein bzw. Peptid, lösliche oder membran-gebunden in Liposomen, Membran -Präparaten/Fraktionen oder Zellen), die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. einzudringen, c) anti-Rezeptor-idiotypische Antikörper (mono¬ klonale oder polyklonale), die Bindungs-Strukturen der Virus-spezifischen Rezeptoren nachahmen oder d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus- Antikörper-Immunkomplexe über Ig-Fc Regionen bindet. Als Alternative kann auch eine Kombination mehrerer oben genannter Liganden zur selektiven Bindung von Retrovirus- Partikeln verwendet werden.
Da der Extraktionsschritt auf rein struktureller Interaktion beruht unterscheidet er nicht zwischen ganzen Virus-Partikeln und viralen Oberflächen-Komponenten z.B. Glykoproteinen. Deshalb wird der Träger-Ligand-Virus Komplex in einem nachträglichen funktionellen enzy matischen Reaktionsschritt getestet, der für Retroviren spezifisch ist und nur von einem intakten Virus-Partikel, jedoch nicht von einzelnen Virus-Komponenten durchgeführt werden kann.
B) Der Reaktionsschritt beruht auf einer Retrovirus-spezifischen enzymatischen Reaktion, die die in vivo Reaktionen in einer Retrovirus infizierten Zelle nachahmt und von mehreren spezifischen viralen Enzymen durchgefürt werden kann: Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease u.a.. Die endogene Reverse Transkription ist ein komplexer Vorgang an dem mehrere virale Komponenten beteiligt sind uzw. die Reverse Transkription der viralen RNA (vRNA ) zu komplementärer DNA (cDNA) in Abhängigkeit der als "primer" funktionierenden viralen transfer RNA (tRNA), Reversen Transkriptase (RT) und exogen zugegebener deoxy-Nukleotid-triphosphate (dNTP s). Alternativ zur oben genannten endogenen Reaktion können exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden) z.B. oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphophat (oligo- dT) und exogene templates z.B. poly-Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin- triphosphat (30μg/ml) zur Reverse Transkriptions Reaktion zugegeben werden um die biochemische Funktionalität des Reverse Transkriptase Enzyms zu identifizieren. Die Reverse Transkriptions Reaktion des Träger-Ligand-Virus Komplexes muß nicht gestoppt werden, wenn die Detektion auf der Immobilisierung der neu synthetisierten cDNA basiert (z.B. Markierung mit Biotin, Br-Digoxigenin, FITC). Für genaue kinetische Untersuchungen, wo ein Reaktionsstop notwendig ist, kann die Reaktion auf Grund der Immobilisation des Ligand-Virus Komplexes durch Ersetzen des Lysis-Reaktions-Mix mit Stopper-Mix gestoppt werden, der keine dNTP's enthält. Dieser Stop-Schritt hat auch den Vorteil das die markierten Edukte (dNTP's) von den Produkten einfach getrennt werden können und die Test-Empfindlichkeit somit deutlich steigern. Durch eine anschließende komplette Lyse des Virus wird die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigesetzt. Der Einbau von dNTP s bzw. die Synthese von cDNA ist ein direkter Beweis für die biochemische Funktionalität des Retrovirus und zeigt die simultane Präsenz funktioneller viraler Komponenten (vRNA, tRNA und RT) in der Probe.
Zusätzlich kann die Reverse Transkriptions-Reaktion fortgesetzt werden uzw. über die Synthese des zweiten cDNA Strangs bzw. doppelsträngiger cDNA (mittels DNA Polymerase Aktivität) und deren nachträglichen Integration in ein Plasmid (mittels Retrovirus-spezifischer Integrase Aktivität). Die integrierte dsDNA wird wie auch die vorher synthetisierte cDNA in einem folgenden Detektionsschritt nachgewiesen.
C) Im Detektionsschritt werden die enzymatisch synthetisierten Reaktionsprodukte anhand radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierung mittels optischer, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Verfahren quantitativ gemessen.
Die von der Reversen Transkriptase synthetisierte cDNA wird während der enzymatischen Synthese durch den Einbau von Br-, Biotin- Fluoreszenz- oder Digoxigenin- markiertem dUTP (deoxy-Uridin-Triphosphat) markiert. Die markierte cDNA wird mittels Absorbtion mit spezifischen an einen soliden Träger gebundenen Liganden (Streptavidin, Antikörper, Oligo- nukleotide) immobilisiert bzw. von den Edukten getrennt und mittels weiteren Markierungs¬ spezifischen Antikörpern die mit einem Indikator-Enzym (Peroxidase, alkalische Phosphatase) gekoppelt sind und entsprechenden Enzym-Substraten quantitativ gemessen. Die Messung kann photometrisch oder mittels Lumineszenz bzw. Fluoreszenz erfolgen und quantitativ ausgewertet werden.
Bei radioaktiver oder Fluoreszenz-Markierung der Edukte können die markierten Edukte nach dem oben beschriebenen Reaktions-Stop von dem immobilisierten Ligand-Virus-Komplex getrennt und direkt mittels Szintillation oder Fluoreszenz-Emission quantitativ gemessen werden. Alternativ kann die markierte cDNA gefällt werden, mittels Adsorbtion auf Filtern von den Edukten getrennt und anschließend gemessen werden. 2.3 Vorteile des Verfahrens
Das beschriebene Verfahren ermöglicht erstmalig den routinemäßigen direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben. Es hat gegenüber den bisher existierenden Nachweismethoden folgende Vorteile: a) Retroviren werden bei vergleichbarer Sensitivität als Partikel spezifisch und direkt in biologischem Material anhand meherer Komponenten (Antigene, Enzyme und Nukleinsäuren) nachgewiesen, b) der Nachweis erfolgt nicht nur strukturell (im Extraktionsschritt) anhand spezifischer
Liganden sondern auch biochemisch funktionell anhand Retrovirus-spezifischer Enzyme (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease), die die Reaktion in vivo nachahmen und somit ein verbesserte Spezifität des Verfahrens gewährleisten, c) der Nachweis erfolgt quantitativ, d) das Verfahren ist vom Zeit- und technischen Aufwand einfach durchfürbar, routinemäßig anwendbar, -da es an Mikrotiterformat adaptiert ist- und somit auch billiger, e) das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend spezifischer Liganden universell auf alle Spezies von Retroviren anwendbar.
2.4. Anwendungsgebiete
Die potentiellen Anwendungen des zu entwickelnden Verfahrens lassen sich in vier große Bereiche einteilen. a) Der erste Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die medizinische Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Therapie von Retrovirus bedingten Krankheiten z.B. AIDS, Leukemie beim Menschen. Die gleiche Anwendung gilt auch für Retrovirus bedingte Krankheiten bei Tieren. Dementsprechend sind die potentiellen Abnehmer: Kliniken u. Krankenhäuser sowie klinische Labors und Laborgemeinschaften. b) Ein zweiter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf virologische Forschung & Entwicklungs-Labors an Universitäten, Großforschungseinrichtungen und Industrie wo an Experimentier-Modellen gearbeitet wird um antivirale Therpiemöglichkeiten, Impfstoffe etc. zu entwickeln. Bei sämtlichen Arbeiten ist der direkte Nachweis von Retroviren (in vitro Modelle, Tiermodelle etc.) absolut notwendig. c) Ein dritter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die gesamte Transplantations- und Transfusions-Medizin bzw. auf die Spender-Banken von Blut, Organen, Knochenmark, Samen etc. Der Nachweis von Kontamination mit Retroviren in den oben genannten Spender- Materialien ist äußerst wichtig um einer Weiterverbreitung und Infektion durch Transplantation oder Spende vorzubeugen. d ) Ein vierter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die Qualitätskontrolle biologischer Pharmazeutika (z.B. Blutderivate, Gerinnungs-Präparate), biotechnologischer Produkte (z.B. Immunglobuline, therapheutische Enzyme, Insulin, fötale Seren etc.), biologischer Kosmetika und bestimmter (gentechnologisch hergestellter) Lebensmittel, die auf Kontamination mit Retroviren untersucht werden müssen um gegebenenfalls deren Übertragung zu verhindern. 3 Beispiel
Zur Optimierung des Verfahrens wurden als Modell Virus retrovirale T47D Partikel verwendet, die Retrovirus-typische Eigenschaften: Lipid-Membranhülle, Glykoproteins, Reverse
Transkriptase, genomische RNA, endogene cDNA Synthese und eine endogene Verteilung im menschlichen Genom aufweisen (Faff, O., Murray, A.B., Schmidt, J., Leib-Mösch, C,
Erfle,V., Hehlmann, R., J. Gen. Virol. : 73, 1087-1097, 1992).
a) Extraktion: Polyklonale Antikörper (10 μg/ml) die gegen die T47D Partikel gerichtet sind, wurden über Nacht in Coating-Puffer (50 mM Carbonat-Puffer pH9.6) an eine Mikrotiter- Platte gebunden. Anschließend wurden die frei gebliebenen Bindungsstellen der Platte 60 min bei Raumtemperatur mit 1 % BSA in Coating Puffer geblockt und dann der Überschuß an ungebundenem Material mit Waschpuffer (300 mosmol Phosphat-Puffer-Saline oder Tris-HCl pH 7.4, NaCl) gewaschen. Als Negativ Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet, daß keine T47D Partikel spezifischen Antikörper enthielt, jedoch mit T47D Partikeln inkubiert wurde. Als Positivkontrolle wurde T47D Partikel-haltige Probe verwendet, die nicht mit spezifischen Antikörpern voradsorbiert bzw. immobilisiert war.
b) Reaktion: Die mit Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 4 °C mit 100 μl/well Probe inkubiert, bestehend aus: RPMI-Medium, 10% fötales Kälberserum und 10 μg gereinigte T47D Partikel. Anschließend wurde der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in Waschpuffer gewaschen und in einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer lysiert und in Gegenwart eines dNTP-Gemischs 60 min bei 42 °C inkubiert. Der Lysis- Reaktions-Mix Puffer hatte folgende Zusammensetzung: 0.3 % NP40, 50 mM Tris-HCl pH7.8, 40 mM KC1, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 2mM EDTA und je 30μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP+dUTP-Biotin+dUTP-Digoxigenin. Der Einbau der dNTP^s bzw. die Synthese von cDNA wurde anschließend gemessen.
c) Detektion: Der Lysis-Reaktions-Mix wurde auf Streptavidin beschichtete Mikrotiter- Platten übertragen und zur Immobilisierung der Biotin- und Digoxigenin-markierten cDNA 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach Waschen des ungebundenen Materials wurde die immobilisierte cDNA mit Peroxidase gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörpern inkubiert (1 Stunde bei 37 °C), gewaschen und anschließend mit dem Peroxidase-Substrat ABTS (Fa. Böhringer Mannheim) inkubiert. Die Farbentwicklung wurde nach 5 min photometrisch bei 405nm (und 490 nm als Referenz) gemessen (Eberle, Land Seibl, B., J. Virol. Meth.: 40, 347-356, 1992). Die Ergebnisse in Abb. 1 zeigen, daß es möglich ist, T47D Partikel aus Zellkulturmedium immunologisch, mit spezifischen Antikörpern zu extrahieren und anschließend über endogene Reverse Transkription biochemisch funktioneil nachzuweisen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben dadurch gekennzeichnet, daß eine Struktur-spezifische Extraktion der Retrovirus Partikel mit einer Funktions-spezifischen Enzym-Reaktion von Retroviren kombiniert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß bei der Extraktion Retrovirus- spezifische Liganden und bei der Enzym-Reaktion Retrovirus-spezifische Enzyme eingesetzt bzw. nachgewiesen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Retrovirus-Partikel mittels spezifischer Liganden (Antikörper, Rezeptoren, Lektine, Proteine, Peptide), die an die Virus-Oberfläche oder Virus-cores binden selektiv aus dem Proben-Material extrahiert werden (Extraktionsschritt), b) anschließend durch ein Retrovirus spezifisches Enzym (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease) auf biochemische Funktionalität bzw. Reaktion getestet werden (Reaktionsschritt) und c) nachträglich anhand der markierten neu synthetisierten Reaktions-Produkte (cDNA, DNA- Proben, Oligonukleotide, Peptide, Proteine) mittels radioaktiver, photometrischer Methoden oder durch Lumineszenz- bzw. Fluoreszenz-Verfahren identifiziert werden (Detektionsschritt).
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen Liganden kovalent oder nicht kovalent, direkt oder mittels eines sogenannten "Spacers" an einen soliden Träger uzw. Mikrotiterplatten, Träger-Sonden oder magnetische oder nicht magnetische Träger-
Kügelchen gebunden sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß folgende spezifische Liganden einzeln oder in Kombination miteinander eingesetzt werden können: a) virus spezifische Antikörper (monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Ober- flächen-Epitope oder core-Epitope des entsprechenden Retrovirus gerichtet sind, b) virus spezifische Rezeptoren, Rezeptor-Komplexe oder Rezeptor-Komponenten, die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. in diese einzudringen c) anti-Rezeptor-Idiotypische Antikörper (monoklonale oder polyklonale), die Virus- Bindungs-Epitope der viralen Rezeptoren nachahmen oder d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus- Antikörper- Immunkomplexe über die Fc-Region der Antikörper binden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein oder Peptid, in löslicher Form oder membran-gebunden in Liposomen, Membran-Präparationen/Fraktionen oder ganzen Zellen verwendet werden können.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger immobilisierte Ligand für die Virus-Extraktion mit der Virus-haltigen Probe über Nacht bei 4 °C inkubiert wird und anschließend der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in 300 mosmol Phosphat-Puffer oder Tris-HCl pH 7.4 gewaschen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger-Ligand- Virus Komplex lysiert wird und in einem weiteren Reaktionsschritt auf enzymatische Aktivität eines oder mehrerer Retrovirus-spezifischer Enzyme bzw. Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase und/oder Protease getestet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis-Puffer folgende Zusammensetzung hat: 10-50 mM Tris-HCl pH7.8, 2mM PMSF, 2 mM DTT, 0.1-1 %
(v/v) NP40, 2 mM EDTA.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger- Ligand-Virus Komplex mit einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer inkubiert wird und mit einem Gemisch von deoxy-Nukleotid-Triphosphaten (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und einem Zusatz von markiertem dUTP (Br-, Fluoreszenz-, Biotin- oder Digoxigenin-), inkubiert wird um den Nukleotid-Einbau in die neu synthetisierte cDNA mittels endogener Reversen Transkription d.h. mittels Reverser Transkriptase, endogener viraler transfer RNA (primer) und RNA (template) quantitativ zu messen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden), [oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphosphat (oligo-dT)] und exogene templates [poly- Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin-triphosphat] zur Reversen Transkriptions- Reaktion zugegeben werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Lysis- Reaktions-Mix Puffer folgende Zusammensetzung hat: 50 mM Tris-HCl pH7.8, 40-80mM KC1, 5-10 mM MgCl2, 2mM PMSF, 2 mM DTT, 0.1-1 % (v/v) NP40, 2 mM EDTA und je 30-500 μM dATP, dCTP, dGTP bzw. dTTP sowie dem Zusatz von (Br-, Biotin- , Digoxigenin- oder
Fluoreszenz-) markiertem dUTP, oder radioaktiv markiertem deoxy-Nukleotid-Triphosphat.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reverse Transkriptions Reaktion durch den Austausch des Lysis-Reaktions-Mix mit einem Stopper-Mix gestoppt wird, der folgende Zusammsensetzung hat: 50-100mM Tris-HCl pH 7.8. 40-80mM
KC1, 0.1% (v/v) NP40, 5 mM EDTA.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus mittels eines Lysis-Puffers (1% NP40, 10 mM Tris-HCl pH7.8, 5 mM EDTA) 15 min bei Raum- temperatur lysiert und die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigelegt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- Produkte der Retrovirus spezifischen Enzym-Reaktion bzw. der Reversen Transkription (cDNA) in einem Detektionsschritt mittels Fluoreszenz, Photometrie, Lumineszenz oder Szintillation nachgewiesen werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger immobilisierten markierten Reaktions-Produkte von den lösüchen markierten Edukten durch deren einfaches Wegwaschen getrennt werden und anschließend direkt mittels Fluoreszenz-Emission, bzw. Szintillation oder mittels Markierungs-spezifischer Liganden, daran gebundener Indikator- Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die ungebun- denen (Br-, Biotin-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz-) markierten Reaktions-Produkte mittels spezifischer Träger-gebundener Liganden (Antikörper, Streptavidin, Oligonukleotide) immobilisiert, von den Edukten getrennt und mittels Ligand-gebundener Indikator-Enzyme (Alkalische Phosphatase, Peroxidase) und der entsprechenden Substrate quantitativ photometrisch oder luminometrisch gemessen werden.
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