2. Beschreibung
Verfahren zum direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben
Virus-Diagnostik
2.1 Stand der Technik Der routinemäßige Nachweis von Retroviren in biologischen Proben erfolgt gegenwärtig nur indirekt und Struktur-spezifisch (d.h. nichtfunktionell) uzw. über den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und/oder von Einzelkomponenten (Antigene, RNA, provirale DNA), z.B. anti-HIV- Antikörper Tests, HIV-p24-Antigen-Tests, HIV-PCR Detektions Test (Holodniy M, et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. AIDS Res. H u m . Retrovir. 8, 47-52, 1992). Diese Analytik stützt sich lediglich auf eine nicht funktionelle bzw. Struktur spezifische molekulare Interaktion zwischen Antikörper und Antigen oder PCR primer und proviraler DNA und erlaubt deshalb nicht den Rückschluß auf ein ganzes und funktionelles intaktes Virus. Außerdem erfaßt diese Analytik nicht alle Stadien einer viralen Infektion, z.B. die Phase, in der die Infektion stattgefunden hat, jedoch noch keine Antikörper gebildet sind. Diese Faktoren bewirken somit gelegentlich falsch positive oder negative
Ergebnisse. Deshalb ist der direkte und auch funktionelle Nachweis für Retroviren in biologischen Proben dringlichst notwendig. Diese Notwendigkeit ist auch gegeben durch die medizinische und sozial-politische Aktualität von Retroviren, vor allem durch die gegenwärtig größte medizinische Herausforderung AIDS und durch eine zu beobachtende ansteigende Tendenz und zunehmende Rolle von Retroviren bei tierischen und menschlichen
Erkrankungen (Leukämie, Autoimmunerkrankunge, Krebs etc.). Außerdem birgt die Übertrag¬ barkeit von Retroviren durch Infektion ernste Probleme für die Transfusions- und Trans¬ plantationsmedizin bzw. erfordert Qualitätsuntersuchungen auf Virus-Kontamination bei Lymph-, Speichel-, Sperma- oder Blutproben von Spendern und bei zu verpflanzenden Organen, Haut, Knochenmark etc. Die gleiche Problematik der Virus-Kontaminantion bzw. Infektion gilt auch für die Verwendung von Arzneimitteln und anderen pharmazeutisch-biotechnologischen oder gen¬ technologischen Präparaten biologischen Ursprungs zu Krankheits-Therapien bei Mensch und Tier sowie in der medizinischen Grundlagen-Forschung. Voraussetzung für die Lösung der oben erwähnten Problemstellungen ist der direkte und funktionelle Nachweis von Retroviren mittels möglichst einfacher, verläßlicher und empfindlicher Methoden.
Der direkte und biologisch funktionelle Nachweis von Retroviren ist bislang nur in Einzelfällen und mit sehr hohem Arbeits- und Zeitaufwand über Infektion von Zellen und nur in in gereinigten Virus-Präparaten oder in Zellkultur-Überständen möglich. Quantitative, einfache und verläßliche Routine-Methoden gibt es bislang dafür nicht. Ein Grund dafür ist die komplexe Zusammensetzung biologischer Proben (Blut, Organextrakte etc.), die Proteine, Enzyme.
Vitamine, Lipide, Zucker und verschiedene Inhibitoren enthalten. Diese erschweren oder machen den direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren immöglich.
Das vorliegende und zur Patentierung angemeldete Verfahren beschreibt den routine¬ mäßigen direkten und biochemisch funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben.
2.2 Lösung des Problems
Der direkte und biochemisch funktionelle Nachweis von Retroviren in biologischen Proben wird durch das vorliegende Verfahren ermöglicht, das aus drei Etappen besteht: a) einem Extraktionsschritt, b) einem Reaktionsschritt und c) einem Detektionsschritt.
A) Der Extraktionsschritt beruht auf einer selektiven Bindung der in einer Probe vorhandenen Retrovirus-Partikel anhand deren Öberflächenmoleküle mittels spezifischer Liganden, die ihrerseits an ein solides Träger-Material gebundenen sind. Dadurch werden sowohl Virus-Partikel als auch lösliche virale Oberflächen-Moleküle in einem Träger-Ligand-Virus Komplex immobilisiert und können aus dem komplexen Probengemisch selektiv extrahiert werden. Für den Nachweis von Retroviren in Gewebe-Extrakten bietet sich alternativ eine selektive Extraktion von retroviralen membran-freien Virus-core-Partikeln bzw. intra- cisternalen A-Partikeln mittels core-spezifischen Liganden an. Die Selektivität der Extraktion besteht darin, daß Oberflächen-spezifische Liganden für die jeweiligen Retrovirus- Spezies verwendet werden. Virus-Spezifische Liganden können sein: a) Antikörper
(monoklonale oder polyklonale) die gegen antigene Oberflächen-Epitope eines Retrovirus gerichtet sind, b) Rezeptoren, Rezeptor-Supramolekularkomplexe oder Rezeptor-Epitope (als natürliches, synthetisches oder rekombinantes Protein bzw. Peptid, lösliche oder membran-gebunden in Liposomen, Membran -Präparaten/Fraktionen oder Zellen), die vom Virus benutzt werden um eine Zelle zu infizieren bzw. einzudringen, c) anti-Rezeptor-idiotypische Antikörper (mono¬ klonale oder polyklonale), die Bindungs-Strukturen der Virus-spezifischen Rezeptoren nachahmen oder d) Complement-Proteine/Peptide, die in der Probe existierende lösliche Virus- Antikörper-Immunkomplexe über Ig-Fc Regionen bindet. Als Alternative kann auch eine Kombination mehrerer oben genannter Liganden zur selektiven Bindung von Retrovirus- Partikeln verwendet werden.
Da der Extraktionsschritt auf rein struktureller Interaktion beruht unterscheidet er nicht zwischen ganzen Virus-Partikeln und viralen Oberflächen-Komponenten z.B. Glykoproteinen. Deshalb wird der Träger-Ligand-Virus Komplex in einem nachträglichen funktionellen enzy matischen Reaktionsschritt getestet, der für Retroviren spezifisch ist und nur von einem intakten Virus-Partikel, jedoch nicht von einzelnen Virus-Komponenten durchgeführt werden kann.
B) Der Reaktionsschritt beruht auf einer Retrovirus-spezifischen enzymatischen Reaktion, die die in vivo Reaktionen in einer Retrovirus infizierten Zelle nachahmt und von mehreren spezifischen viralen Enzymen durchgefürt werden kann: Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease u.a.. Die endogene Reverse Transkription ist ein komplexer Vorgang an dem mehrere virale Komponenten beteiligt sind uzw. die Reverse Transkription der viralen RNA (vRNA ) zu komplementärer DNA (cDNA) in Abhängigkeit der als "primer" funktionierenden viralen transfer RNA (tRNA), Reversen Transkriptase (RT) und exogen zugegebener deoxy-Nukleotid-triphosphate (dNTP s). Alternativ zur oben
genannten endogenen Reaktion können exogene primer (Träger-gebunden oder ungebunden) z.B. oligo-deoxy-Guanosin-triphosphat (oligo-dG) oder oligo-deoxy Thymidin-triphophat (oligo- dT) und exogene templates z.B. poly-Cytosin-triphosphat (poly-rC) oder poly-Adenosin- triphosphat (30μg/ml) zur Reverse Transkriptions Reaktion zugegeben werden um die biochemische Funktionalität des Reverse Transkriptase Enzyms zu identifizieren. Die Reverse Transkriptions Reaktion des Träger-Ligand-Virus Komplexes muß nicht gestoppt werden, wenn die Detektion auf der Immobilisierung der neu synthetisierten cDNA basiert (z.B. Markierung mit Biotin, Br-Digoxigenin, FITC). Für genaue kinetische Untersuchungen, wo ein Reaktionsstop notwendig ist, kann die Reaktion auf Grund der Immobilisation des Ligand-Virus Komplexes durch Ersetzen des Lysis-Reaktions-Mix mit Stopper-Mix gestoppt werden, der keine dNTP's enthält. Dieser Stop-Schritt hat auch den Vorteil das die markierten Edukte (dNTP's) von den Produkten einfach getrennt werden können und die Test-Empfindlichkeit somit deutlich steigern. Durch eine anschließende komplette Lyse des Virus wird die neu synthetisierte cDNA zur Detektion freigesetzt. Der Einbau von dNTP s bzw. die Synthese von cDNA ist ein direkter Beweis für die biochemische Funktionalität des Retrovirus und zeigt die simultane Präsenz funktioneller viraler Komponenten (vRNA, tRNA und RT) in der Probe.
Zusätzlich kann die Reverse Transkriptions-Reaktion fortgesetzt werden uzw. über die Synthese des zweiten cDNA Strangs bzw. doppelsträngiger cDNA (mittels DNA Polymerase Aktivität) und deren nachträglichen Integration in ein Plasmid (mittels Retrovirus-spezifischer Integrase Aktivität). Die integrierte dsDNA wird wie auch die vorher synthetisierte cDNA in einem folgenden Detektionsschritt nachgewiesen.
C) Im Detektionsschritt werden die enzymatisch synthetisierten Reaktionsprodukte anhand radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierung mittels optischer, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Verfahren quantitativ gemessen.
Die von der Reversen Transkriptase synthetisierte cDNA wird während der enzymatischen Synthese durch den Einbau von Br-, Biotin- Fluoreszenz- oder Digoxigenin- markiertem dUTP (deoxy-Uridin-Triphosphat) markiert. Die markierte cDNA wird mittels Absorbtion mit spezifischen an einen soliden Träger gebundenen Liganden (Streptavidin, Antikörper, Oligo- nukleotide) immobilisiert bzw. von den Edukten getrennt und mittels weiteren Markierungs¬ spezifischen Antikörpern die mit einem Indikator-Enzym (Peroxidase, alkalische Phosphatase) gekoppelt sind und entsprechenden Enzym-Substraten quantitativ gemessen. Die Messung kann photometrisch oder mittels Lumineszenz bzw. Fluoreszenz erfolgen und quantitativ ausgewertet werden.
Bei radioaktiver oder Fluoreszenz-Markierung der Edukte können die markierten Edukte nach dem oben beschriebenen Reaktions-Stop von dem immobilisierten Ligand-Virus-Komplex getrennt und direkt mittels Szintillation oder Fluoreszenz-Emission quantitativ gemessen werden. Alternativ kann die markierte cDNA gefällt werden, mittels Adsorbtion auf Filtern von den Edukten getrennt und anschließend gemessen werden.
2.3 Vorteile des Verfahrens
Das beschriebene Verfahren ermöglicht erstmalig den routinemäßigen direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren in biologischen Proben. Es hat gegenüber den bisher existierenden Nachweismethoden folgende Vorteile: a) Retroviren werden bei vergleichbarer Sensitivität als Partikel spezifisch und direkt in biologischem Material anhand meherer Komponenten (Antigene, Enzyme und Nukleinsäuren) nachgewiesen, b) der Nachweis erfolgt nicht nur strukturell (im Extraktionsschritt) anhand spezifischer
Liganden sondern auch biochemisch funktionell anhand Retrovirus-spezifischer Enzyme (Reverse Transkriptase, RNAse H, Integrase, Protease), die die Reaktion in vivo nachahmen und somit ein verbesserte Spezifität des Verfahrens gewährleisten, c) der Nachweis erfolgt quantitativ, d) das Verfahren ist vom Zeit- und technischen Aufwand einfach durchfürbar, routinemäßig anwendbar, -da es an Mikrotiterformat adaptiert ist- und somit auch billiger, e) das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend spezifischer Liganden universell auf alle Spezies von Retroviren anwendbar.
2.4. Anwendungsgebiete
Die potentiellen Anwendungen des zu entwickelnden Verfahrens lassen sich in vier große Bereiche einteilen. a) Der erste Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die medizinische Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Therapie von Retrovirus bedingten Krankheiten z.B. AIDS, Leukemie beim Menschen. Die gleiche Anwendung gilt auch für Retrovirus bedingte Krankheiten bei Tieren. Dementsprechend sind die potentiellen Abnehmer: Kliniken u. Krankenhäuser sowie klinische Labors und Laborgemeinschaften. b) Ein zweiter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf virologische Forschung & Entwicklungs-Labors an Universitäten, Großforschungseinrichtungen und Industrie wo an Experimentier-Modellen gearbeitet wird um antivirale Therpiemöglichkeiten, Impfstoffe etc. zu entwickeln. Bei sämtlichen Arbeiten ist der direkte Nachweis von Retroviren (in vitro Modelle, Tiermodelle etc.) absolut notwendig. c) Ein dritter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die gesamte Transplantations- und Transfusions-Medizin bzw. auf die Spender-Banken von Blut, Organen, Knochenmark, Samen etc. Der Nachweis von Kontamination mit Retroviren in den oben genannten Spender- Materialien ist äußerst wichtig um einer Weiterverbreitung und Infektion durch Transplantation oder Spende vorzubeugen. d ) Ein vierter Anwendungs-Bereich bezieht sich auf die Qualitätskontrolle biologischer Pharmazeutika (z.B. Blutderivate, Gerinnungs-Präparate), biotechnologischer Produkte (z.B. Immunglobuline, therapheutische Enzyme, Insulin, fötale Seren etc.), biologischer Kosmetika und bestimmter (gentechnologisch hergestellter) Lebensmittel, die auf Kontamination mit Retroviren untersucht werden müssen um gegebenenfalls deren Übertragung zu verhindern.
3 Beispiel
Zur Optimierung des Verfahrens wurden als Modell Virus retrovirale T47D Partikel verwendet, die Retrovirus-typische Eigenschaften: Lipid-Membranhülle, Glykoproteins, Reverse
Transkriptase, genomische RNA, endogene cDNA Synthese und eine endogene Verteilung im menschlichen Genom aufweisen (Faff, O., Murray, A.B., Schmidt, J., Leib-Mösch, C,
Erfle,V., Hehlmann, R., J. Gen. Virol. : 73, 1087-1097, 1992).
a) Extraktion: Polyklonale Antikörper (10 μg/ml) die gegen die T47D Partikel gerichtet sind, wurden über Nacht in Coating-Puffer (50 mM Carbonat-Puffer pH9.6) an eine Mikrotiter- Platte gebunden. Anschließend wurden die frei gebliebenen Bindungsstellen der Platte 60 min bei Raumtemperatur mit 1 % BSA in Coating Puffer geblockt und dann der Überschuß an ungebundenem Material mit Waschpuffer (300 mosmol Phosphat-Puffer-Saline oder Tris-HCl pH 7.4, NaCl) gewaschen. Als Negativ Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet, daß keine T47D Partikel spezifischen Antikörper enthielt, jedoch mit T47D Partikeln inkubiert wurde. Als Positivkontrolle wurde T47D Partikel-haltige Probe verwendet, die nicht mit spezifischen Antikörpern voradsorbiert bzw. immobilisiert war.
b) Reaktion: Die mit Antikörpern beschichtete Mikrotiterplatte wurde dann über Nacht bei 4 °C mit 100 μl/well Probe inkubiert, bestehend aus: RPMI-Medium, 10% fötales Kälberserum und 10 μg gereinigte T47D Partikel. Anschließend wurde der Träger-Ligand-Virus Komplex von dem ungebundenen Material in Waschpuffer gewaschen und in einem Lysis-Reaktions-Mix Puffer lysiert und in Gegenwart eines dNTP-Gemischs 60 min bei 42 °C inkubiert. Der Lysis- Reaktions-Mix Puffer hatte folgende Zusammensetzung: 0.3 % NP40, 50 mM Tris-HCl pH7.8, 40 mM KC1, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 2mM EDTA und je 30μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP+dUTP-Biotin+dUTP-Digoxigenin. Der Einbau der dNTP^s bzw. die Synthese von cDNA wurde anschließend gemessen.
c) Detektion: Der Lysis-Reaktions-Mix wurde auf Streptavidin beschichtete Mikrotiter- Platten übertragen und zur Immobilisierung der Biotin- und Digoxigenin-markierten cDNA 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach Waschen des ungebundenen Materials wurde die immobilisierte cDNA mit Peroxidase gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörpern inkubiert (1 Stunde bei 37 °C), gewaschen und anschließend mit dem Peroxidase-Substrat ABTS (Fa. Böhringer Mannheim) inkubiert. Die Farbentwicklung wurde nach 5 min photometrisch bei 405nm (und 490 nm als Referenz) gemessen (Eberle, Land Seibl, B., J. Virol. Meth.: 40, 347-356, 1992). Die Ergebnisse in Abb. 1 zeigen, daß es möglich ist, T47D Partikel aus Zellkulturmedium immunologisch, mit spezifischen Antikörpern zu extrahieren und anschließend über endogene Reverse Transkription biochemisch funktioneil nachzuweisen.