WO1994019097A1 - Process and device for mixing liquids in microtitration plates - Google Patents

Abstract

Process and device for mixing liquids. According to the invention, with a suitable type of gas, frequency, strength, direction and cross-section, a periodically pulsating stream of gas acting on a quantity of liquid in a microtitration plate compartment causes rapid mixing of said liquid therein without the formation of bubbles in the liquid which could interfere with the subsequent optical concentration measurement process.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten in MikrotiterplattenMethod and device for mixing liquids in microtiter plates

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum berührungsfreien Durchmischen von Lösungen in den Kavitäten von Mikrotiterplatten.The invention relates to a method for the contact-free mixing of solutions in the cavities of microtiter plates.

Homogene Lösungen in Mikrotiterplatten sind nötig, wenn chemische Reaktionen mit Messungen der optischen Dichte in den einzelnen Kavitäten einer Mikrotiterplatte definiert ablaufen müssen.Homogeneous solutions in microtiter plates are necessary if chemical reactions with measurements of the optical density in the individual cavities of a microtiter plate have to take place in a defined manner.

Diese Messungen werden in großem Umfang für diagnostische Verfahren benutzt. In solchen Fällen kann ein verbessertes Mischverfahren von Bedeutung sein.These measurements are widely used for diagnostic procedures. In such cases, an improved mixing process can be important.

Verfahren zum berührungsfreien Mischen von Flüssigkeiten sind in umfangreichem Maße bekannt. Die angewendeten Verfahren stützen sich zum einen auf die Übertragung von Schwingungen auf die Flüssigkeit enthaltenden Gefäße oder nutzen strömende Flüssigkeiten oder Gase, um durch Verwirbelung ein Vermischen zu erreichen. Verfahren zur Herstellung homogener Lösungen in Mikrotiterplatten gründen sich auf die mechanische Übertragung von beschleunigten Bewegungen auf die Mikrotiterplatte.Processes for the contact-free mixing of liquids are known to a large extent. The methods used are based on the one hand on the transmission of vibrations to the liquid-containing vessels or use flowing liquids or gases in order to achieve mixing by swirling. Processes for producing homogeneous solutions in microtiter plates are based on the mechanical transmission of accelerated movements to the microtiter plate.

Dabei werden zwei Grundprinzipien genutzt:Two basic principles are used:

A. Lineare beschleunigte Bewegungen:A. Linear accelerated movements:

Die Mikrotiterplatte wird durch einen Schwingungsgeber in rüttelnde Bewegungen versetzt. Durch Ausnutzen der Trägheit der Flüssigkeit wird bei geeigneter Schüttelfrequenz eine solche Bewegung in der Flüssigkeit erreicht, die ein Durchmischen zur Folge hat. Schwingungsgeber ist üblicherweise eineThe microtiter plate is made to vibrate by a vibrator. By utilizing the inertia of the liquid, at a suitable shaking frequency, such a movement in the liquid is achieved that results in mixing. Vibration generator is usually one

Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird, oder auch eine extra als "Mikroplattenschüttler" vertriebene Vorrichtung. Schwingungsgeber kann aber auch ein über eine Steuerung beeinflußbarer, zielgerichtet linear bewegter Wagen sein, auf den die Mikrotiterplatte gestellt wird, wie dies beispielsweise im Mikrotiterplatten-Auswertesystem (MR 7000) der Firma Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA) realisiert wird.Shaker, as used in chemical laboratories for the mixing of large quantities of liquid, or also an extra one sold as a "microplate shaker" Contraption. However, the vibration generator can also be a carriage which can be influenced in a targeted manner and moved linearly and on which the microtiter plate is placed, as is the case, for example, in the microtiter plate evaluation system (MR 7000) from Dynatech (14340, Syllyfield Circle, Chantilly, VA 22021, USA). is realized.

B. Kreisförmig beschleunigte BewegungB. Circular accelerated motion

Die Mikrotiterplatte wird kreisförmig so beschleunigt, daß die Flüssigkeit in den einzelnen Kavitäten auf Grund ihrer Trägheit in kreisende Bewegung versetzt wird. Durch diese kreisende Bewegung soll ein Durchmischen erreicht werden. Bewegungsgeber ist üblicherweise eine Schüttelmaschine, wie sie in chemischen Laboratorien auch für das Durchmischen größerer Flüssigkeitsmengen benutzt wird.The microtiter plate is accelerated in a circular manner so that the liquid in the individual cavities is set into a circular motion due to its inertia. Mixing is to be achieved by this circular movement. The motion sensor is usually a shaker, as is also used in chemical laboratories for mixing larger quantities of liquid.

Beide unter A und B angeführten Verfahren nutzen die Trägheit der Flüssigkeit bei einer auf sie wirkenden beschleunigten Bewegung aus. 'Both of the methods listed under A and B exploit the inertia of the liquid in an accelerated movement acting on it. '

Diese Verfahren sind für größere Flüssigkeitsmengen sehr gut geeignet. Infolge der kleinen Volumina der Kavitäten in Mikrotiterplatten und deren Geometrie treten aber hier die Nachteile dieser Verfahren zutage. Da die Trägheit direkt proportional zur Masse ist, muß bei kleinen Flüssigkeitsmengen eine besonders hohe Beschleunigung angewendet werden, um eine solche Flüssigkeitsbewegung zu erreichen, die ein Durchmischen zur Folge hat. Von weiterem Nachteil sind die Adhäsion der Flüssigkeit an der Mikrotiterplatte. In zylindrischen Gefäßen verhalten sich die mit der Flüssigkeit wechselwirkenden Oberflächen umgekehrt proportional zur Flüssigkeitsmenge. Kleinere Flüssigkeitsmengen sind, bezogen auf das Volumen, größeren Adhäsionskräften ausgesetzt als größere Flüssigkeitsvolumina. Ebenso verhält es sich mit der Oberflächenspannung.These processes are very suitable for larger quantities of liquid. As a result of the small volumes of the cavities in microtiter plates and their geometry, the disadvantages of these methods come to light here. Since the inertia is directly proportional to the mass, a particularly high acceleration has to be used with small amounts of liquid in order to achieve such a liquid movement that results in mixing. Another disadvantage is the adhesion of the liquid to the microtiter plate. In cylindrical vessels, the surfaces interacting with the liquid are inversely proportional to the amount of liquid. Smaller amounts of liquid, in terms of volume, are exposed to greater adhesive forces than larger volumes of liquid. The same applies to the surface tension.

Um dennoch mit dem angewendeten Wirkungsprinzip eine exakte reproduzierbare Durchmischung der Lösungen in allen 96 Kavitäten einer Mikrotiterplatte zu erreichen, müßte eine unpraktikabel hohe Beschleunigung angewendet werden. Diese notwendigen hohen Beschleunigungen können ihrerseits zu Resonanzerscheinungen der Titerplatte führen, in deren Ergebnis es zu Zonen auf der Titerplatte kommen kann, in denen die Durchmischung sehr langsam erfolgt, und zu Bereichen, in denen Flüssigkeit aus den Kavitäten herausspritzt.In order nevertheless with the applied principle of action an exact To achieve reproducible mixing of the solutions in all 96 cavities of a microtiter plate, an impractically high acceleration would have to be applied. These necessary high accelerations can in turn lead to resonance phenomena of the titer plate, as a result of which there can be zones on the titer plate in which the mixing takes place very slowly, and areas in which liquid splashes out of the cavities.

Die oben angeführte Möglichkeit, durch strömendes Gas eineThe above-mentioned possibility of a flowing gas

Durchmischung zu erreichen, wird beim Mischen von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten bisher nicht angewendet, da sie in der bisher beschriebenen Art das nachfolgende lichtoptische Meßverfahren durch Einbringen von Gasblasen stören würde. So wurde beispielsweise in der DE-OS 28 37 002 eine Technik beschrieben, in der ein Propeller Luft auf eine Flüssigkeitsoberfläche in der Art bläst, daß die Flüssigkeit gemischt wird und Gasblasen in die Flüssigkeit eingetragen werden. Dieses Einbringen von Gasblasen wurde auch in den DE-OS'en 30 07 842 und 33 13 382 beschrieben, die ebenfalls Gas zum Vermischen nutzen. Gemäß der DE-OS 32 46 791 wird zum Umrühren von Flüssigkeiten unter Vakuum, insbesondere von viskosen Zuckerrohprodukten, Luft kontinuierlich oder impulsartig in den die Flüssigkeit enthaltenden Behälter eingeblasen, der in seiner Behälterwand oder seinem Innenraum eine oder mehrere Injektordüsen aufweist. Aber auch in dieser Anwendungsart werden Gasblasen in die Flüssigkeit eingebracht, die die Anwendung in Mikrotiterplatten verbieten.Achieving thorough mixing has not previously been used when mixing liquids in microtiter plates, since in the manner described so far it would interfere with the subsequent light-optical measuring method by introducing gas bubbles. For example, a technique was described in DE-OS 28 37 002 in which a propeller blows air onto a liquid surface in such a way that the liquid is mixed and gas bubbles are introduced into the liquid. This introduction of gas bubbles was also described in DE-OS'en 30 07 842 and 33 13 382, which also use gas for mixing. According to DE-OS 32 46 791, for stirring liquids under vacuum, in particular viscous raw sugar products, air is blown continuously or in pulses into the container containing the liquid, which has one or more injector nozzles in its container wall or its interior. But even in this type of application, gas bubbles are introduced into the liquid that prohibit the use in microtiter plates.

Aus den angeführten Gründen ist es mit den genannten Methoden nur schwer möglich, innerhalb weniger Sekunden eine Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu erreichen, die das in Mikrotiterplatten angewandte spezielle lichtoptische Meßverfahren nicht nachteilig beeinflussen.For the reasons given, it is difficult with the methods mentioned to mix liquids in microtiter plates within a few seconds, which do not adversely affect the special light-optical measuring method used in microtiter plates.

Übliche Mischungen mit Hilfe eines Magnetrührers können nicht durchgeführt werden, da der Lichtstrahl durch den Rührer gestört werden kann. Ziel der Erfindung ist die schnelle Durchmischung von Flüssigkeitsmengen in Mikrotiterplatten mit einer berührungsfreien Methode, welche sich insbesondere für die nachfolgende, auch zeitabhängige lichtoptische Konzentrationsbestimmung in den Flüssigkeiten eignet.Usual mixtures with the help of a magnetic stirrer cannot be carried out because the light beam can be disturbed by the stirrer. The aim of the invention is the rapid mixing of liquid quantities in microtiter plates using a non-contact method, which is particularly suitable for the subsequent, also time-dependent, optical determination of the concentration in the liquids.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren sowie eine Vorrichtung zur schnellen berührungsfreien Durchmischung von Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten zu schaffen.The object of the invention is to provide a novel method and a device for the rapid, contact-free mixing of liquids in microtiter plates.

Überraschend wurde gefunden, daß ein periodisch intermittierend auf eine Flüssigkeitsmenge in einer Mikrotiterplattenkavität geblasener Gasstrom bei geeigneter Gasart, Frequenz, Stärke, Richtung und geeignetem Querschnitt ein schnelles Durchmischen der Flüssigkeit in der Mikrotiterplattenkavität verursacht, ohne daß es zur Blasenbildung in der Flüssigkeit kommt, die das nachfolgende lichtoptische Konzentrationsmeßverfahren stören könnte.Surprisingly, it was found that a gas stream periodically blown intermittently onto a quantity of liquid in a microtiter plate cavity with a suitable gas type, frequency, strength, direction and suitable cross section causes the liquid in the microtiter plate cavity to mix rapidly without causing bubbles to form in the liquid, which is the result subsequent light optical concentration measurement could interfere.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gasstrom so auf die Flüssigkeitsoberfläche gelenkt, daß nur ein Teil der Flüssigkeitsoberfläche von dem Gasstrom getroffen wird. Dadurch wird die Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt wird verdrängt. Läßt der Gasdruck nach, kann die Flüssigkeit wieder zurückströmen. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorganges wird die Flüssigkeit in der Mikrotiterplatte in der gewünschten Art und Weise durchmischt.In the method according to the invention, a gas stream is directed onto the liquid surface in such a way that only a part of the liquid surface is hit by the gas stream. This displaces the liquid that is exposed to the gas flow. If the gas pressure drops, the liquid can flow back again. By repeating this process several times, the liquid in the microtiter plate is mixed in the desired manner.

Als Gasart sind alle Gase oder Gasgemische geeignet, die keine unerwünschten Wechselwirkungen mit der in der Mikrotiterplatte vorhandenen Flüssigkeit zeigen. Als besonders geeignet für wäεsrige Lösungen erwies sich Luft, aber auch Stickstoff und Argon.All gases or gas mixtures which do not show any undesired interactions with the liquid present in the microtiter plate are suitable as the gas type. Air, but also nitrogen and argon, have been found to be particularly suitable for aqueous solutions.

Die Frequenz des intermittierenden oder pulsierenden Gasstroms muß so klein sein, daß zumindest ein Teil der verdrängten Flüssigkeit zurückfließen kann. Dies ist abhängig von der Viskosität der Flüssigkeit. Die Frequenz muß andererseits so groß sein, daß das Mischen der Flüssigkeiten in den Mikrotiterplatten in einer für den Anwender ausreichend schnellen Zeit erfolgt und wird vorzugsweise zu etwa 6 Stößen je Sekunde gewählt. Allgemein kann man aber sagen, daß eine Frequenz von 1 bis 10 geeignet ist.The frequency of the intermittent or pulsating gas flow must be so low that at least part of the displaced liquid can flow back. This depends on the viscosity of the liquid. On the other hand, the frequency must be like this be large that the mixing of the liquids in the microtiter plates takes place in a time which is sufficiently fast for the user and is preferably chosen to be about 6 bursts per second. In general, however, one can say that a frequency of 1 to 10 is suitable.

Die Stärke des pulsierenden Gasstroms muß so gewählt werden, daß er stark genug ist, um einen Teil der Flüssigkeit, die dem Gasstrom ausgesetzt ist, zu verdrängen. Er darf aber nicht so stark sein, daß Flüssigkeit aus der einzelnenThe intensity of the pulsating gas flow must be chosen so that it is strong enough to displace part of the liquid which is exposed to the gas flow. But it must not be so strong that liquid from the individual

Mikrotiterplattenkavität herausgedrückt wird. Die Stärke muß weiterhin so gewählt werden, daß es auf Grund sich ausbildender Turbulenzen an der dem Gasstrahl ausgesetzten Flüssigkeitsoberfläche nicht zur Bildung von Gasblasen kommt.Microtiter plate cavity is pressed out. The strength must also be chosen so that gas bubbles do not form due to the turbulence that forms on the liquid surface exposed to the gas jet.

Die Richtung des Gasstrahls ist vorzugsweise senkrecht auf die Flüssigkeitsoberfläche gerichtet. Diese Verfahrensweise führt zu einem pulsierenden Mischungsverhalten der Flüssigkeit. Es kann aber auch von Vorteil sein, den Gasstrahl schräg auf die Flüssigkeitsoberfläche zu richten. Bei geeigneter schräger Anordnung des pulsierenden Gasstrahls auf die Randzone der Flüssigkeitsoberfläche kann es zu kreisenden Bewegungen der Flüssigkeit kommen und eine Durchmischung erreicht werden. Der Winkel mit dem der Gasstrahl bei einer nicht senkrechten Anordnung auf die Flüssigkeitsoberfäche trifft, muß so gewählt werden, daß keine Flüssigkeit aus der einzelnen Mikrotiterplattenkavität durch den Gasstrom herausgerissen wird.The direction of the gas jet is preferably perpendicular to the liquid surface. This procedure leads to a pulsating mixing behavior of the liquid. However, it can also be advantageous to point the gas jet obliquely at the liquid surface. With a suitable inclined arrangement of the pulsating gas jet on the edge zone of the liquid surface, circular movements of the liquid can occur and mixing can be achieved. The angle at which the gas jet strikes the liquid surface in a non-vertical arrangement must be chosen such that no liquid is torn out of the individual microtiter plate cavity by the gas flow.

Der Gasstrom sollte so beschaffen sein, daß etwa 30-60 % derThe gas flow should be such that about 30-60% of the

Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom ausgesetzt werden. Es kann aber auch von Vorteil sein, mehr als 60 % oder aber weniger als 30 % der Flüssigkeitsoberfläche dem Gasstrom auszusetzen. Wird der Querschnitt zu klein gewählt, kann es neben einer Verminderung der Mischgeschwindigkeit zu unerwünschterLiquid surface are exposed to the gas flow. However, it can also be advantageous to expose more than 60% or less than 30% of the liquid surface to the gas stream. If the cross-section is chosen too small, in addition to a reduction in the mixing speed, it may be undesirable

Blasenbildung kommen. Der Querschnitt des Gasstrahls soll vorzugsweise kreisförmig sein. Starke Abweichungen von dieser Kreisförmigkeit können ebenfalls zum Einschluß von Gasblasen in das Flüssigkeitsmedium führen.Blistering come. The cross section of the gas jet should preferably be circular. Large deviations from this circularity can also lead to the inclusion of gas bubbles in guide the liquid medium.

Legenden zu den Figuren:Legends for the figures:

Fig. 1: Schema der Mischvorrichtung für MikrotiterplattenFig. 1: Scheme of the mixing device for microtiter plates

Fig. 2: Einfluß des Mischvorgangs auf die Extinktion einer Lösung von 10 μl Haemoglobinlösung, die mit 200 μl Puffer versetzt wurde, gemäß Beispiel 1. Ordinate jeder einzelnen Kavität: 1.2-2.2 E bei2: Influence of the mixing process on the extinction of a solution of 10 μl hemoglobin solution to which 200 μl buffer was added, according to Example 1. Ordinate of each individual cavity: 1.2-2.2 E at

405 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 10-753 Sekunden (Zeit, nach Zugabe der Pufferlösung) Die Kavitäten von Spalte AI bis Hl ohne Verwendung der Mischeinrichtung. Die Kavitäten von Spalte A2 bis H2 unter Verwendung der Mischeinrichtung. Mischzeit: 2 Sekunden nach Zugabe der Pufferlösung.405 nm abscissa of each individual cavity: 10-753 seconds (time after adding the buffer solution) The cavities from column AI to Hl without using the mixing device. The cavities from column A2 to H2 using the mixing device. Mixing time: 2 seconds after adding the buffer solution.

Fig. 3: Einfluß des Mischvorgangs auf die Geschwindigkeit der durch die Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase katalysierten Reaktion gemäß Beispiel 2. Ordinate jeder einzelnen Kavität: 0.73-0.9 E bei 390 nm Abszisse jeder einzelnen Kavität: 81 - 637 Sekunden Die Kavitäten der Zeilen AI bis A12, Bl bis B12 und Cl bis C12 unter Verwendung der3: Influence of the mixing process on the speed of the reaction catalyzed by the peptidyl prolyl cis / trans isomerase according to Example 2. Ordinate of each individual cavity: 0.73-0.9 E at 390 nm abscissa of each individual cavity: 81-637 seconds The cavities of the rows AI to A12, Bl to B12 and Cl to C12 using the

Mischeinrichtung.Mixing device.

Die Kavitäten der Zeile Dl bis D12 waren leer. Die Kavitäten der Zeilen El bis E12, FI bis F12, Gl bis G12 und Hl bis Hl2 wurden nicht gemischt. Gemischt wurde unmittelbar nach Zugabe der letztenThe cavities in rows D1 to D12 were empty. The cavities of lines E1 to E12, FI to F12, Gl to G12 and Hl to Hl2 were not mixed. Mixing was carried out immediately after the last one had been added

Lösung durch den eingebauten automatischen Dosierer des Dynatechgerätes. Die Mischzeit betrug 7 Sekunden.Solution through the built-in automatic dosing device of the Dynatech device. The mixing time was 7 seconds.

Beispiel 1:Example 1:

Um das Gas erfindungsgemäß auf die Flüssigkeitsoberfläche richten zu können, wurde die in Fig. 1 dargestellte Anordnung gewählt. Aus einer handelsüblichen Druckflasche mit Stickstoff wurde ein Gasström mit einem Druck von 5 bar über eine 1 m lange Schlauchleitung (d - 100 mm) zu einer Wälzschlauchpumpe geleitet. Der Pumpenschlauch 5 besitzt einen Innendurchmesser von 80 mm. Der Pumpenschlauch wurde dann direkt zu demIn order to be able to direct the gas onto the liquid surface according to the invention, the arrangement shown in FIG. 1 was used selected. A gas flow at a pressure of 5 bar was passed from a commercially available pressure bottle with nitrogen via a 1 m long hose line (d - 100 mm) to a roller hose pump. The pump hose 5 has an inner diameter of 80 mm. The pump hose then went straight to that

Gasverteiler 1 der in Fig. 1 dargestellten Mischeinrichtung geführt. Der Preßdruck des Pumpenschlauchs an die Pumpenrollbügel und die Fördergeschwindigkeit wurden so eingestellt, daß der Gasstrom stoßweise mit einer Frequenz von etwa 6 Gasstößen je Sekunde aus den 8 Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche auftreffen konnte.Gas distributor 1 of the mixing device shown in Fig. 1 performed. The pressure of the pump hose against the pump roll bracket and the conveying speed were set so that the gas flow could impinge on the liquid surface from the 8 nozzles 2 at a frequency of about 6 gas bursts per second.

Mit dieser Anordnung wurden mit den im weiteren beschriebenen Verfahrensweisen und Lösungen die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse erhalten. Folgende Lösungen wurden verwendet:The results shown in FIG. 2 were obtained with this arrangement using the procedures and solutions described below. The following solutions were used:

Pufferlösung: 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6 Stammlösung A: Die Stammlösung A ist eine Lösung von menschlichem HaemoglobinBuffer solution: 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6 stock solution A: Stock solution A is a solution of human hemoglobin

In 8 Kavitäten 4 einer Mikrotiterplatte 3 wurden 10 μl der Stammlösung A pipettiert. Unmittelbar vor dem Mischen wurden mit einer 8 Kanalpipette 200 μl der Pufferlösung in einem Schritt zu den vorgelegten 10 μl pipettiert. Anschließend wurden die Extinktionen dieser 8 Kavitäten über einen Zeitraum von 600 Sekunden in Intervallen von etwa 10 Sekunden, bei 390 nm mit einem handelsüblichen Mikrotiterplattenreader bei 6 °C gemessen.10 μl of stock solution A were pipetted into 8 cavities 4 of a microtiter plate 3. Immediately before mixing, an 8-channel pipette was used to pipette 200 μl of the buffer solution in one step to the 10 μl provided. The extinctions of these 8 cavities were then measured over a period of 600 seconds at intervals of approximately 10 seconds at 390 nm using a commercially available microtiter plate reader at 6 ° C.

In einem anderen Meßansatz wurde zu Vergleichszwecken die oben angeführte Prozedur mit Ausnahme des Mischens wiederholt. Die in der Fig. 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen zwei Spalten einer Mikrotiterplatte mit den Kavitäten AI bis Hl (Spalte 1) und A2 bis H2 (Spalte 2). Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 2 wurden unter Einbeziehen eines zwei Sekunden dauernden Mischschrittes erhalten. Die Extinktions-Zeitverläufe in Spalte 1 wurden ohne Mischen erhalten. Als Zeit t=0 wurde der Zeitpunkt der Zugabe der Haemoglobin-Stammlösung benutzt. Die Endextinktionen der ungemischten Proben erreichen auch nach mehr als 10 Minuten nicht den exakten Endwert. Visuell lassen sich auch nach 20 Minuten noch Inhomogenitäten in den einzelnen Kavitäten beobachten. Alle gemischten Proben weisen nach der Mischzeit gleiche Endextinktionen auf.In another measurement approach, the above procedure was repeated with the exception of mixing for comparison purposes. The results summarized in FIG. 2 show two columns of a microtiter plate with the cavities AI to Hl (column 1) and A2 to H2 (column 2). The absorbance timings in column 2 were obtained using a two-second mixing step. The absorbance timings in column 1 were obtained without mixing. The time of addition of the hemoglobin stock solution was used as time t = 0. The final absorbances of the unmixed samples do not reach the exact final value even after more than 10 minutes. Visually, inhomogeneities in the individual cavities can still be observed even after 20 minutes. All mixed samples have the same end absorbances after the mixing time.

Beispiel 2:Example 2:

Als Mischgas wurde Druckluft verwendet, die mittels eines handelsüblichen Laborradiallüfters hergestellt wurde. Die Fördermenge betrug 9 m³/h bei einer Druckhöhe von 450 mm Wassersäule. Entsprechend Fig. 1 wird die Druckluft über eine Schlauchzuführung 5 von 100 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 90 mm zu einem Gasverteiler 1 geführt.Compressed air was used as the mixed gas, which was produced using a commercially available laboratory radial fan. The delivery rate was 9 m ³ / h at a pressure head of 450 mm water column. According to FIG. 1, the compressed air is fed to a gas distributor 1 via a hose feed 5 of 100 cm in length with an inner diameter of 90 mm.

Die Taktfrequenz des im Gasverteiler befindlichen motorgetriebenen 12-Kanalventils ist über die Motorgeschwindigkeit steuerbar. Die vom Ventil ausgehende Druckluft wird über Düsen 2 auf die Flüssigkeitsoberfläche der einzelnen Kavitäten 4 gelenkt. Die Düsen 2 waren 30 mm lang und wiesen einen kreisförmigen Querschnitt auf. Die Düsen 2 wiesen Durchmesser von 2 mm am verjüngten Ende und 5 mm an der Lufteintrittsöffnung auf.The cycle frequency of the motor-driven 12-channel valve located in the gas distributor can be controlled via the engine speed. The compressed air coming from the valve is directed via nozzles 2 onto the liquid surface of the individual cavities 4. The nozzles 2 were 30 mm long and had a circular cross section. The nozzles 2 had a diameter of 2 mm at the tapered end and 5 mm at the air inlet opening.

Die Frequenz des Luftstroms je Einzeldüse wurde zu 3The frequency of the air flow per single nozzle became 3

Luftimpulsen je Sekunde eingestellt. Der Abstand der Düsen 2 der in Fig. 1 abgebildeten Kammer zur Mikrotiterplatte 3 betrug 5 mm.Air pulses set per second. The distance between the nozzles 2 of the chamber shown in FIG. 1 and the microtiter plate 3 was 5 mm.

Die nachfolgend beschriebene Messung wurde mit folgenden Lösungen vorgenommen:The measurement described below was carried out with the following solutions:

Reaktionslösung A:Reaction solution A:

25 mg Chymotrypsin gelöst in 25 ml 0,035 m HEPES Puffer Ph 7,6 Probelösung: gleiche Konzentrationen von biologischen Rohhomogenaten, die Peptidyl Prolyl cis/trans Iεomeraseaktivität gegenüber dem Substrat Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilid aufwiesen Reaktionslösung B:25 mg chymotrypsin dissolved in 25 ml 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6 sample solution: equal concentrations of raw biological homogenates that had peptidyl prolyl cis / trans isomerase activity compared to the substrate suc-ala-phe-pro-phe-p-nitroanilide Reaction solution B:

1 mg/ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-Nitroanilid gelöst in einer Lösung von 1 ml 0.035 m HEPES Puffer Ph 7,6 plus 10 μl Dirnethylsulfoxid1 mg / ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide dissolved in a solution of 1 ml 0.035 m HEPES buffer Ph 7.6 plus 10 μl dirnethyl sulfoxide

Durchführung der Messung:Carrying out the measurement:

Mit Hilfe einer automatischen Pipettierstation der Firma GILSON/USA wurden jeweils 10 μl der einzelnen Probe in jede einzelne Kavität pipettiert. Die Kavitäten Dl, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU und Dl2 wurden nicht mit Probenlösung versehen. Alle weiteren Meß- und Pipettiervorgänge wurden mit Hilfe eines programmierbaren kommerziellen Mikrotiter- plattenreaders "MR 7000" der Firma Dynatech/USA mit den oben aufgeführten Lösungen, mit folgenden Einzelschritten vorgenommen:With the help of an automatic pipetting station from GILSON / USA, 10 μl of the individual sample was pipetted into each individual cavity. The cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU and Dl2 were not provided with sample solution. All further measuring and pipetting processes were carried out with the aid of a programmable commercial microtiter plate reader "MR 7000" from Dynatech / USA with the solutions listed above, with the following individual steps:

1. Mit der 8-fach-Pipettierung werden automatisch je 120 μl Reaktionslösung A in jede Kavität pipettiert. In die Kavitäten Dl, D2, D3, p4, DS, D6, D7, D8, D9, D10, DU und D12 wurde keine Reaktionslösung pipettiert.1. With the 8-fold pipetting, 120 μl of reaction solution A are automatically pipetted into each cavity. No reaction solution was pipetted into the cavities D1, D2, D3, p4, DS, D6, D7, D8, D9, D10, DU and D12.

2. Innerhalb von 7 Sekunden werden mit der 8-fach-Pipettierung automatisch je 20 μl Substratlösung je Kavität pipettiert. In die Kavitäten Dl, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU und Dl2 wurde keine Substratlösung pipettiert.2. The 8-fold pipetting automatically pipettes 20 μl substrate solution per cavity within 7 seconds. No substrate solution was pipetted into the cavities D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, DU and Dl2.

3. Für 7 Sekunden wird die Mikrotiterplatte in "Warteposition" gefahren.3. The microtiter plate is moved into the "waiting position" for 7 seconds.

4. Während dieser 7 Sekunden wird die Mikrotiterplatte in der oben angegebenen Weise gemischt.4. During these 7 seconds, the microtiter plate is mixed in the manner described above.

5. Danach wird die Extinktion aller Kavitäten der5. Then the extinction of all the cavities

Mikrotiterplatte im Zeittakt von etwa 9 Sekunden 70 mal gemessen. Die erhaltenen Extinktionsänderungen, deren Kurve einer Reaktion erster Ordnung entspricht, lassen sich graphisch darstellen. In Fig. 3 ist das Ergebnis einer solchen Messung abgebildet. Um die Wirkung der Mischeinrichtung einschätzen zu können, wurden nur die ersten drei Reihen in der angegebenen Weise gemischt. Das "Nicht mischen" wurde durch die Unterbrechung der entsprechenden Düsen erreicht.Microtiter plate measured 70 times in approximately 9 seconds. The extinction changes obtained, the curve of which corresponds to a first-order reaction, can be represented graphically. 3 shows the result of such a measurement. In order to be able to assess the effect of the mixing device, only the first three rows were mixed in the manner indicated. The "do not mix" was achieved by interrupting the corresponding nozzles.

Die Meßkurven lassen sich wie unter EP 0 360 029 AI beschrieben, auswerten. Die entsprechendenThe measurement curves can be evaluated as described in EP 0 360 029 AI. The corresponding

Geschwindigkeitskonstanten, die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Geschwindigkeitskonstanten gleicher Enzymkonzentrationen, mit und ohne Mischung, sind in Tab. 1 zusammengefaßt.Rate constants, the mean values and the standard deviations of the rate constants of the same enzyme concentrations, with and without a mixture, are summarized in Table 1.

Tab. 1:Tab. 1:

Einfluß des Mischvorganges auf die Geschwindigkeitskonstante (k) der Peptidyl Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität(') . Statistische Auswertung der in Fig. 3 abgebildeten MeßkurvenInfluence of the mixing process on the rate constant (k) of the peptidyl prolyl cis / trans isomerase activity ('). Statistical evaluation of the measurement curves shown in FIG. 3

Reihe k (s-¹) Δk(s^_1)Row k (s- ¹ ) Δk (s ^_1 )

[Mittelwert] [Standardabweichung] Mischart[Mean value] [standard deviation] mixed type

AI - A12 0,0162 .0008 patentgemäßAI - A12 0.0162 .0008 patented

Bl - H12 0,0161 .0010 patentgemäßBl - H12 0.0161 .0010 patented

Cl - C12 0,0162 .0009 patentgemäßCl - C12 0.0162 .0009 patented

El - E12 0,0137 .0050 Dynatech )El - E12 0.0137 .0050 Dynatech)

FI - F12 0,0158 .0019 Dynatech ^b)FI - F12 0.0158 .0019 Dynatech ^b )

Gl - G12 0,0214 .0097 Dynatech ^b)Gl - G12 0.0214 .0097 Dynatech ^b )

Hl - H12 0,0147 .0064 Dynatech ^b)Hl - H12 0.0147 .0064 Dynatech ^b )

^a) Berechnung nach EP 0 360 029 AI ^b) Mischung mit dem internen Mischer des ^a ) Calculation according to EP 0 360 029 AI ^b ) Mixing with the internal mixer of the

MikrotiterplattenreaderεMicrotiter plate reader

"MR7000" der Firma Dynatech für 7 Sekunden "MR7000" from Dynatech for 7 seconds

Claims

Patentansprüche Claims

1. Verfahren zum berührungsfreien Durchmischen von Flüssigkeiten in Kavitäten einer Mikrotiterplatte, bei welchem ein Gasstrom mit einem Querschnitt, der kleiner ist als der lichte Querschnitt der jeweiligen Kavität, mit niedriger Frequenz intermittierend in die Kavität geblasen wird, derart, daß eine Teilflüssigkeit in der Kavität unter dem Druck des auftreffenden Gasstroms blasenfrei verdrängt und durch Absenken des Druckes für das Zurückfließen wieder freigegeben wird.1. A method for the contact-free mixing of liquids in cavities of a microtiter plate, in which a gas stream with a cross section that is smaller than the clear cross section of the respective cavity is blown intermittently into the cavity at a low frequency such that a partial liquid in the cavity displaced bubble-free under the pressure of the impinging gas stream and released again for lower flow by lowering the pressure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Frequenz im Bereich von 1 bis 10 Hz, vorzugsweise von 6 Hz angewendet wird.2. The method of claim 1, wherein a frequency in the range of 1 to 10 Hz, preferably of 6 Hz is applied.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der3. The method of claim 1 or 2, wherein the

Querschnitt des Gasstroms 30 bis 60 % des lichten Querschnittes der Kavität beträgt.Cross section of the gas flow is 30 to 60% of the clear cross section of the cavity.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der Gasstrom senkrecht zu der Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet ist.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the gas stream is oriented perpendicular to the liquid surface.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der Gasstrom schräg zur Flüssigkeitsoberfläche ausgerichtet und auf eine Stelle im Abstand von der Achse der Kavität gerichtet wird.5. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the gas flow is oriented obliquely to the liquid surface and directed to a location at a distance from the axis of the cavity.

6. Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten in Kavitäten einer Mikrotiterplatte, mit einem Gasverteiler (1), der eine der Anzahl der Kavitäten (4) der Mikrotiterplatte (3) entsprechende Mehrzahl von Gasdüsen (2) aufweist, die jeweils auf eine der Kavitäten (4) ausgerichtet sind und deren Düsenmündung einen kleineren Durchmesser als der Durchmesser der Kavitäten (4) aufweisen, einer an den Gasverteiler (1) angeschlossenen Druckluftquelle und einer den Gasdüsen (2) zugeordneten Steuerung, mit welcher eine mit niedriger Taktfrequenz von 1 bis 10 Hz intermittierende Gaszufuhr zu den Gasdüsen (2) einsteuerbar ist. 6. Device for mixing liquids in cavities of a microtiter plate, with a gas distributor (1) which has a plurality of gas nozzles (2) corresponding to the number of cavities (4) of the microtiter plate (3), each of which is directed onto one of the cavities (4 ) are aligned and the nozzle mouth have a smaller diameter than the diameter of the cavities (4), a compressed air source connected to the gas distributor (1) and a control assigned to the gas nozzles (2), with which a with a low clock frequency of 1 to 10 Hz intermittent Gas supply to the gas nozzles (2) can be controlled.