WO1994008034A1 - Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient - Google Patents

Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient Download PDF

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WO1994008034A1
WO1994008034A1 PCT/JP1993/001384 JP9301384W WO9408034A1 WO 1994008034 A1 WO1994008034 A1 WO 1994008034A1 JP 9301384 W JP9301384 W JP 9301384W WO 9408034 A1 WO9408034 A1 WO 9408034A1
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WO
WIPO (PCT)
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hirudin
mutant
amino acid
asp
glu
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Application number
PCT/JP1993/001384
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English (en)
French (fr)
Inventor
Akiko Sukesada
Satoru Misawa
Hitoshi Matsuda
Original Assignee
Japan Energy Corporation
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Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel hirudin mutant having an amino acid sequence different from a naturally occurring hirudin mutant.
  • the present invention relates to a DNA having a DNA sequence encoding the polypeptide having the novel amino acid sequence.
  • the present invention provides a novel hirudin mutant expression vector for expressing the novel hirudin mutant, a transgenic Escherichia coli transformed with the expression vector, and a transgenic Escherichia coli.
  • the present invention relates to a method for producing a hirudin mutant by producing and secreting a hirudin mutant using enterobacteria.
  • the present invention relates to an anticoagulant having at least one novel hirudin mutant having the novel amino acid sequence as an active ingredient.
  • Hirudin is an antithrombin-active polypeptide isolated from the secretion from the salivary gland of medicinal leech (Hirudo medicinalis).
  • Three naturally occurring hirudin mutants are known: HV1, HV2 and HV3.
  • the amino acid sequences of the polypeptides that make up these naturally occurring hirudin mutants have been elucidated.
  • the gene encoding the amino acid sequence was also obtained as a c-DNA by Kuguchi-Jung, and its DNA sequence was also elucidated.
  • the expression vector 3 ⁇ 4-Escherichia coli (Escherichia coli) is also introduced into a host microorganism such as yeast (Saccharoyces cerevisiae) to express the polypeptide constituting the hirudin mutant.
  • hirudin mutant in which the amino acid sequence was artificially mutated was produced.
  • HV2 Lys 47
  • HV1 exhibits high activity comparable to the antithrombin activity of natural HV1.
  • a mutant obtained by replacing the amino acid sequence of the natural N-terminal region of HV1 with another amino acid, or obtained by adding an amino acid to the N-terminal HV1-like hirudin mutants such as mutants have also been produced.
  • the amino acid sequence of the N-terminal region of hirudin is the active site of the cleavage enzyme of the polypeptide chain of tobin.
  • the present inventors can obtain the amino acid sequence of the polypeptide constituting the above natural hirudin mutant by artificially performing a point mutation (point mutation). Based on an idea different from that of the hirudin mutant, hybrid type mutant HV1C3 in which the partial polypeptide of the C-terminal region of HV1 was replaced with the partial polypeptide of the C-terminal region of HV3, etc. Especially, the above-mentioned hybrid type hilge The mutant HV1C3 was found to exhibit higher antithrombin activity than HV1 (JP-A-4-173798).
  • these complexed hirudin mutants exhibiting high anti-thrombin activity have pharmacological properties as anticoagulants that inhibit the clotting process caused by cleavage of the polypeptide chains by thrombin. Clarified that it is effective. That is, it has been clarified that since it has antithrombin activity (the ability of thrombin to inhibit the enzyme activity of cleaving polypeptide polypeptide), it is possible to inhibit and inhibit the formation of blood clots.
  • an anticoagulant containing the above-mentioned complex type hirudin mutant HV1C3 or the like proposed in the earlier application as an active ingredient is one of pure hirudin mutants having a predetermined pharmacological equivalent. It was found that its pharmacological activity apparently changed when prepared as such and stored at room temperature for a long time.
  • the present invention is intended to solve the above-mentioned problems caused by the formation of a succinimido compound or a ⁇ transfer compound. That is, an object of the present invention is to replace a aminoic acid sequence which is liable to form a succinimide form or // transformation form with another aminoic acid sequence to obtain a hirudin derivative. An object of the present invention is to provide a novel hirudin mutant which can suppress conversion into analogs and has high antithrombin activity.
  • the present invention provides an anti-toxin that is so high that it can compensate for the decrease in the concentration of the hirudin mutant associated with the conversion to the hirudin analog due to the formation of a succinimide compound or a transition compound.
  • An object of the present invention is to provide a novel hirudin mutant having oral bin activity.
  • An object of the present invention is to suppress the decrease in the concentration of the hirudin mutant associated with the conversion to a hirudin analog due to the formation of a succinimide or ⁇ transferant, thereby providing a pharmacological effect.
  • the decrease in activity is within an acceptable range, the increase in the total concentration of hirudin in the anticoagulant is suppressed, or when the concentration of the hirudin mutant is reduced due to conversion to a hirudin analog.
  • a novel hirudin mutant having high antithrombin activity and capable of suppressing an increase in the total concentration of hirudin in the anticoagulant necessary for obtaining the desired pharmacological activity It is to provide The present invention provides a novel amino acid sequence represented by the following general formula I: It concerns a regular hirudin mutant.
  • A3 represents Lys or Glu.
  • A4 represents Asp, Asn or Gin
  • A5 represents Ala or Gly
  • A6 represents Glu or Glu.
  • Lys represents Lys or Asp
  • A8 represents Asp or Glu
  • A9 represents Ala, Tyr or a bond
  • A10 represents Tyr or Leu, respectively, and either A9 or A10 is Tyr.
  • the hirudin mutant represented by the above general formula I of the present invention can be roughly classified into two groups due to a difference from the amino acid sequence of the hirudin mutant HV1C3 characterizing the amino acid sequence. It is possible. That is, the first group, Asp 33 -Gly Ru contained in A Mi acid sequence of hirudin variants HV1C3 34 - parts and Asp 62 - Ala 63 - parts, Complex No A Mi the two Asp A group consisting of hirudin mutants obtained by artificially performing a point mutation on either or both of the amino acid partial sequences.
  • the novel hirudin mutant of the present invention can be obtained by modifying the amino acid sequence of the hirudin mutant HV1C3 with respect to the amino acid sequence. It is something that can be done.
  • the helgin mutant of the present invention has the following features.
  • mutants can you roughly classified into the first group, ⁇ Ma are in other words Hiruji emission variants A Mi acid sequence of HV1C3 - Gly 34 - And / or the Asp- 6Z Ala fc 3- and / or the amino acid partial sequence containing these two Asp's by artificially performing a point mutation.
  • the resulting hirudin mutant is one in which the conversion to the hildin analog by the formation of a succinimide or / transform is suppressed.
  • novel hirdin mutant of the present invention provides a pharmacological action as an anticoagulant due to the antithrombin activity of the hirdin mutant HV1C3, and thus the antithrombin activity.
  • the amino acid sequence is largely conserved, and it is naturally expected that the process of loss from the blood by metabolism will not differ from that of the virgin mutant HV1C3.
  • the characteristics of the novel hirudin mutant of the present invention in which the conversion to a hirudin analog by the formation of a succinimide or /?-Transformant is suppressed, Robin activity, especially
  • the characteristic of increasing the reaction rate of forming a complex with thrombin is that the amino acids are brought about by the modification of the amino acid partial sequence of each valence, and also occur without mutual interference. is there.
  • the present invention provides a DNA encoding the amino acid sequence of such a hirudin mutant, for example, a compound represented by the general formula:
  • GAA (6) is GCG TAC or binding
  • (7) is TAC
  • the present invention provides a promoter, a DNA sequence encoding a signal peptide, a DNA sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence represented by the general formula I, and a transcription termination signal.
  • the present invention relates to a novel hirudin mutant expression vector comprising a DNA sequence and a DNA sequence containing a replication initiation signal.
  • the present invention relates to a novel transgenic Escherichia coli transformed by the hirudin mutant expression vector.
  • the present invention provides a method for culturing the above-mentioned recombinant Escherichia coli in a medium, and ingesting a hirudin mutant having an amino acid sequence represented by the general formula I from the cultured cells and the medium. And a method for producing a novel hirudin mutant.
  • the hirudin mutant represented by the above general formula I of the present invention may be produced by chemical synthesis or may be produced by a genetic engineering technique.
  • the hirudin mutant secretion plasmid PMTSHV1C3 (see Japanese Patent Laid-Open Publication No. 4-798) was digested with a restriction enzyme to remove the DNA sequence encoding the amino acid sequence at positions 31 to 44.
  • a DNA sequence encoding the sequence of positions 31 to 44 of the amino acid sequence represented by the general formula I is chemically synthesized. From this plasmid PMTSHV1C3, the DNA excluding the D sequence encoding the amino acid sequence at positions 31 to 44 of the hirudin mutant HV1C3, and the chemically synthesized sequence at positions 31 to 44 of the general formula I were used.
  • each of these plasmids is cleaved with a restriction enzyme to remove the DNA sequence encoding the amino acid sequence at positions 45 to 66.
  • a DNA sequence encoding the sequence from position 45 to position 66 of the amino acid sequence represented by the general formula I is chemically synthesized.
  • a plasmid pCX397DAl comprising a DNA encoding the amino acid sequence of the hirudin mutant of the present invention, which is reacted with chemically synthesized DNA encoding the sequence from position 66 to position 66 using DNA ligase or the like.
  • plasmids contain a promoter derived from plasmid PMTSHV1C3, a DNA sequence encoding a signal peptide, a transcription termination signal, and a DNA sequence encoding the hirudin mutant of the present invention. It is inserted between the DNA sequence encoding the peptide and the transcription termination signal.
  • Escherichia coli is transformed with these plasmids.
  • the hirudin mutant of the present invention is produced in the cells and the medium.
  • the hirudin mutant of the present invention is not limited to the above-described host and vector system, and may be produced using a host and vector system generally known as a genetic engineering technique.
  • suitable microbial host strains include the above-mentioned Escherichia coli strain, Bacillus subtilis (Bac i 11 us subti 1 ⁇ ) and yeast (Saccharomyces cerevisiae) strains, and expression according to each host cell is included.
  • the hirudin mutant can be produced by using the vector.
  • the hirudin mutant of the present invention can be isolated by a generally known method and then subjected to chromatography, reverse phase HPLC. Purify by other purification methods.
  • hirudin mutant In the obtained hirudin mutant, the formation of succinimide or ⁇ transferant was suppressed more than in hirudin HV1 and hirudin mutant HV1C3 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-173798). Therefore, the stability is high. In addition, it maintains high antithrombin activity.
  • a well-known anticoagulant can be obtained by preparing a preparation by a method generally known as a method for producing a preparation. That is, the hirudin mutant of the present invention is prepared by any conventional method using any conventional pharmaceutical carrier or excipient.
  • Administration can be, for example, intravenous, intradermal, subcutaneous or intramuscular, and topical parenteral. The dosage is determined as appropriate according to the individual case, taking into account the symptoms, age of the subject, gender, etc., and is usually 0.1 to 100 mg per adult per day, 1 to several times a day. Administer separately.
  • the novel hirudin mutant of the present invention is obtained by modifying the amino acid sequence of the hirudin mutant HV1C3 to the amino acid sequence, and belongs to the first group.
  • the total amount of hirudin to be contained in the coagulant is at least less than the anticoagulant with the conventional hirudin mutant HV1C3.
  • the conventional anticoagulant using the hirudin mutant HV1C3 has the disadvantage that the total amount of hirudin to be owned must be increased in advance to compensate for the decrease in pharmacological activity during storage. It is useful as an effectively improved anticoagulant.
  • the novel hirudin mutant is produced by a genetic engineering technique in the same manner as the conventional hirudin mutant HV1C3, so that it can be produced in large quantities and with high reproducibility. It can be produced, and accordingly, can be produced at low cost.
  • FIG. 1 shows a conceptual diagram of a method for constructing a hirudin mutant CX397DA secretion plasmid PCX397DA.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of a synthetic DNA encoding a part of the hirudin mutant used in the present invention.
  • FIG. 3 shows a conceptual diagram of a method for constructing a hirudin mutant CX397NA secretion plasmid PCX397NA.
  • Fig. 4 shows a conceptual diagram of the construction method of plasmid PCX397N.
  • Figure 5 shows a conceptual diagram of a plus Mi de PCX397DA1, P CX397DA2, P CX397DA3, PCX397NA1, PCX397NA2, pCX397NA3, PCX397N1, how to build a P CX397N2 and PCX397N3.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a synthetic DNA encoding a part of the hirudin mutant used in the present invention.
  • FIG. 7 shows a conceptual diagram of a method for preparing a hirudin mutant gene, introducing the gene into a secretion expression plasmid pMTS HV19 or pMTS HV10, and transforming the JM109 or RR1 strain with the gene.
  • FIG. 8 shows a conceptual diagram of a method for constructing a hirudin mutant gene having two or more mutations. (Indicates the hirudin gene)
  • FIG. 9 shows a conceptual diagram of a method for constructing the hirudin mutant HV115 gene.
  • FIG. 10 shows a conceptual diagram of a method for constructing a hirudin mutant HV116 gene.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Microorganisms and Technology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry (hereinafter referred to as the Microtechnology Research Institute), and the accession number of the Microtechnology Research Institute was No. 3984 (FERM BP). -3984).
  • Plasmid pCX397NA was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to obtain a DNA fragment corresponding to positions 31 to 44 of the helgin mutant CX397NA, two types of oligonucleotides shown in Fig. 2 (B) were used to produce DNA fragments. (Model 380B) using the phosphoric acid amidite method. After deprotection, Each oligonucleotide was purified by crystallization gel electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organisms, and the accession number was obtained from the micro-organisms, No. 3980 (FERM BP-3980).
  • Plasmid PCX397N was constructed according to the method shown in FIG. First, the plasmid PUCHV3 (described in Reference Example of JP-A-4-173798) was digested with restriction enzymes Aval and Kpnl to obtain a DNA fragment corresponding to positions 31 to 44 of the hirudin mutant CX397N. And fragments lOpmol this, cut plus Mi de pMTSH VI C3 and (same publication) 5 Opmol the T 4 DNA ligase in Complex free solution 100] with restriction enzyme Aval and Kpnl, at 16 ° C The reaction was performed for 30 minutes.
  • the reaction liquid 10; Escherichia coli JM109 strain was transformed with the / 1, to obtain a Hiruji emissions mutant CX397N secretory expression plus Mi de P CX397N.
  • the nucleotide sequence was confirmed by a method such as Sanger.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organisms, and the accession number was obtained from the micro-organisms No. 3976 (FERM BP-3976).
  • Plasmid PCX397DA1 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of the hirudin mutant CX397DA1, the four types of oligonucleotides (1-1, 1-2, 1-3, 1-4) were synthesized. Deprotected Then, each of the oligonucleotides was purified by polyacrylamide electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organisms, and the accession number was obtained from the micro-organisms No. 3985 (FEBM BP-3985). .
  • Plasmid pCX397DA2 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of the hirudin mutant CX397DA2, four types of oligonucleotides shown in FIG. 6 (2) were synthesized. After deprotection, each of the oligonucleotides was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Micro-Institute, and the accession number No. 3986 of Micro-Institute was obtained (FERM BP-3986).
  • Plasmid PCX397DA3 was constructed according to the method shown in Fig. 5.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Micro Investigator to obtain an accession number, Micro Invest. No. 3987 (FERM BP-3987).
  • Plasmid PCX397NA1 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of hirudin mutant CX397NA1, four types of oligonucleotides shown in FIG. 6 (1) were synthesized. After deprotection, each of the oligonucleotides was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Plasmid PCX397NA2 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of hirudin mutant CX397NA2, four types of oligonucleotides shown in Fig. 6 (2) were synthesized. After deprotection, each oligonucleotide was purified by polyacrylamide gel electrophoresis. .
  • each of the four types of oligonucleotides was mixed with 2 pmo1, and then annealed. A fragment was obtained. This fragment and the restriction enzymes Kpnl and Hindlll
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organisms, and the accession number was obtained from the micro-organisms No. 3982 (FERM BP-3982).
  • Plasmid pCX397N1 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of the hirudin mutant CX397N1, four types of oligonucleotides shown in Fig. 6 (1) were synthesized. After deprotection, each oligonucleotide was purified by polyacrylamide electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organisms, and the accession number was obtained from the micro-organisms No. 3977 (FERM BP-3977).
  • the plasmid pCX397N2 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of hirudin mutant CX397N2, four types of oligonucleotides shown in Fig. 6 (2) were synthesized. After deprotection, each of the oligonucleotides was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Micro Invest., And the accession number No. 3978 of Micro Invest. (FERM BP-3978) was obtained.
  • the plasmid pCX397N3 was constructed according to the method shown in FIG. First, in order to construct a DNA fragment corresponding to the C-terminal amino acid of the hirudin mutant CX397N3, four kinds of oligonucleotides shown in Fig. 6 (3) were synthesized. After deprotection, each oligonucleotide was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the micro-organism, and the accession number was obtained from micro-organisms, No. 3979 (FERM BP-3979).
  • the E. coli JM109 strain (Examples 11) to 12) transformed with the hirudin mutant secretion expression plasmid was separately treated with 100 g / ml ampicillin.
  • the cells were cultured in 100 ml of a 2xTY medium containing 16 g / l of bactotripton, 10 g of lactose extract and 1 g of NaCl. After shaking culture at 37 ° C for 24 hours, the cells were collected. Each sample of the precipitated cells were suspended in 25% Shiyuku loin 50mM Tris ⁇ HC1 (P H7.5) 1 mM EDTA in 100 ml, at room temperature Treated for 10 minutes.
  • the cells After collecting cells by centrifugation at 10,000 Xg for 10 minutes, the cells were suspended in 100 ml of cold water and subjected to osmotic shock to release substances in the periplasmic space of the cells. After removing cells by centrifugation at 10,000 Xg for 10 minutes, the periplasmic fraction was filtered using a 0.22 ⁇ m filter.
  • the crudely purified hirudin mutant sample and the hirudin mutant HV1C3 (control) obtained in Example 2 were stored at 25'C for 4 weeks, and then fractionated using a reversed-phase high-speed liquid chromatogram. The results were compared with the results before storage.
  • the content of the succinimide or /? Transition was calculated as follows. Hirujin Peaks detected within 4 minutes before and after the elution time of the mutant peak are regarded as succinimides or transitions, and out of the sum of the peak areas of these and the hirudin mutant, The percentage occupied by the peak area of the succinimide or metamorphic form was defined as its content. That is,
  • the helgin mutant of the present invention was 25. Even when stored in C, the production of the succinimide compound or the pentatransformant can be significantly reduced in comparison with the previously known virgin mutant HV1C3, and its efficacy is high. It turned out to be stable.
  • the hirudin mutant was purified using the following method.
  • the Escherichia coli JM109 strain transformed with the virgin mutant secretion expression plasmid was transformed into a 2xTY medium (bactriptone 16g / ml) containing 50 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the cells were cultured with shaking at 500 ° C for 1 hour at 37 ° C with 500 ml of loctinoist extract extract (lOg / K NaCl 5g / l).
  • the periplasmic fraction obtained as described above was separated and eluted under the following conditions using a reversed-phase high-performance liquid chromatogram, and the peak of the hildin mutant was collected.
  • Antithrombin activity measurement of specific activity by the chromogenic technique
  • the specific activity is determined by a colorimetric assay for the inhibition of hydrolytic activity of thrombin, a synthetic substrate chromozym TH (Toshinoreguri sinoleprolinolenoreginin 4--2-toroanilide acetate, manufactured by Behringer Mannheim).
  • a colorimetric assay for the inhibition of hydrolytic activity of thrombin, a synthetic substrate chromozym TH Toshinoreguri sinoleprolinolenoreginin 4--2-toroanilide acetate, manufactured by Behringer Mannheim).
  • Antithrombin activity measurement of inhibition constant using a fluorescent synthetic substrate
  • Each of the solutions to be added was adjusted so that the concentrations of C so and human thrombin C E0 became the respective predetermined concentrations.
  • Time t at which the above-mentioned human bottle solution was added and stirred.
  • the light intensity at a wavelength of 450 nm of the fluorescence emitted from the reaction solution was measured.
  • the difference between the light intensity measured in the reaction solution and the light intensity measured in the reaction solution having zero concentration of tobin and hirudin is represented by time t.
  • a curve called “progress curve j” was obtained.
  • This “progress curve” was obtained by comparing the synthetic substrate with thrombin.
  • the change in the concentration of the complex of the synthetic substrate and thrombin represented by the “progress curve” was measured by SR Stone et al. [See Biochemistry (1986), 25, p.2622-2628. Or Biochemistry (1979), 18, p.2567-2573] and a complex of hirudin and thrombin was obtained.
  • Ki apparent dissociation constant
  • Ki is calculated using the relationship between the apparent dissociation constant' and the dissociation constant ⁇ shown in the following equation (1). I asked. The measurement was performed three times for each sample.
  • Table 2 shows the dissociation constants Ki (PM) of each hirudin mutant and thrombin complex. This smaller dissociation constant Ki indicates higher anti-thrombin activity.
  • the hirudin mutant of the present invention is a hirudin mutant that exhibited the high antithrombin activity previously proposed by the present applicant. Is
  • antithrombin has almost the same or higher anti-thrombin activity than HV1C3.
  • Mutagenic primers 1 and 2 having the above DNA sequences were synthesized by a phosphoric acid amidite method using an Applied ⁇ Biosystems (model 380B) synthesizer.
  • Hirudin HV1 secretion expression vector pMTSHVl Japanese Patent Application No. 2-3030966
  • About ⁇ g was digested with 36 units of restriction enzyme EcoRI and 60 units of restriction enzyme HindEI.
  • Approximately 250 bp DNA fragment encoding phoA signal, peptide and hirudin HV1 was separated and purified by agarose gel electrophoresis.
  • the mutagenic primers 1 and 2 were phosphorylated at the 5 'end using a method similar to the method described in Japanese Patent Application No. 3-63909.
  • a mutant DNA (named M13SHV19) was prepared using the aforementioned M13SHV1 and the above 5′-phosphorylated mutant primer 1.
  • M13SHV1 and A mutant DNA (designated M13SHV10) was prepared using 5'-phosphorylated primer 2.
  • a kit manufactured by Amersham was used.
  • the hirudin mutant HV17 secretion expression vector PMTSHV17 Japanese Patent Application No. 3-63909 was digested with the restriction enzyme EcoR I-Hind HI and subjected to agarose gel electrophoresis to obtain a 2.2 Kb vector. One DNA fragment was separated and purified.
  • Double-stranded M13SHV19 DNA is digested with the restriction enzyme EcoR I -Hind HI, and an approximately 250 bp DNA fragment encoding phoA signal peptide and hirudin mutant HV-1-9 is separated by agarose gel electrophoresis-purification did. Similarly, a purified DNA fragment of about 250 bp encoding phoA signal peptide and hirudin mutant HV-1-10 was obtained from IU3SHV10 DNA.
  • pHTSHVIO a mutant expression plasmid pHTSHVIO was obtained in the same manner.
  • the nucleotide sequence was confirmed by a method such as Sanger. (See Fig. 7)
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and obtained accession number FERM-4413.
  • periplasmic fraction obtained as in (b) above was concentrated to about 100 by ultrafiltration. This was loaded onto a reverse-phase HPLC column under the following conditions, eluted, fractionated and freeze-dried to obtain hirudin mutant HV-1-15.
  • Solvent A. 0.05% trifluoroacetic acid / water
  • the plasmid PMTSHV1C3 was also cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII in the same manner, and an approximately 150 bp fragment containing the DNA sequence encoding the C-terminal part of hirudin HV-3 was separated and purified. did.
  • the transformed Escherichia coli was deposited with the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of Trade and Industry to obtain an accession number FERM BP-4412.
  • the hirudin mutant HV-1-16 was purified using the same method as described in JP-A-4-282474.
  • the antithrombin activity of hirudin mutants HV-1-15 and HV-1-16 was measured using the same method as described in JP-A-4-282474. Table 3 shows the results.
  • Table 4 shows the composition of these amino acids.
  • the hirudin mutant HV-1-9 (the Val'-Val 2-of the hirudin mutant HV-1 lie 2- ) was transformed using a recombinant microorganism obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with the mutant expression plasmid PMTSHV19.
  • the hirudin mutant HV-1-10 (in which lysine 27 of hirudin mutant HV-1 was replaced with Glu Z7 ) is a gene obtained by transforming Escherichia coli JM109 with the mutant expression plasmid PMTSHVIO.
  • hirudin mutant HV-1-14 Hirgin mutant HV-1 in which Va-Val 2 -is replaced with lie 1 -lie 2 -and Lys 27 is replaced with Glu 27
  • E. coli JM109 strain was transformed with the mutant expression plasmid PMTSHV114, and each of the recombinant microorganisms was cultured using the recombinant microorganism. Separated and purified.
  • HV-1-1-5 and HV-1-1-16 are the same as those previously proposed by the present applicant for high antithrombin activity. It can be seen that it shows higher antithrombin activity than HV1C3, which is the body.
  • the purified hirudin mutant obtained in Example 4 was desalted with Sephadex G25 (manufactured by Pharmacia), and then aseptically filtered through a 0.22 m filter. . This solution was freeze-dried, and the obtained powder was dissolved in physiological saline to obtain a preparation that could be used as an injection.
  • the present invention relates to a hirudin variant respectively representing two groups characterized by modification of the amino acid sequence and a method for producing the same.
  • the virgin mutants belonging to both of the two groups can be prepared according to the amino acid sequence according to the above-mentioned production method.
  • a person skilled in the art can prepare a DNA sequence encoding a peptide and further construct an expression vector containing the DNA sequence by those skilled in the art using only the contents described in the above specific examples. It is.
  • virgin mutants that belong to either of the two groups have their succinimide or metastasis characteristics, which are characteristic of each of the two groups, suppressed from being converted to hildin analogs. It is evident, without giving specific examples, that the combination of the characteristics of the present invention and the characteristics of the anti-Mouth bin bin activity, particularly the reaction rate of forming a complex with the Mouth bin bin. is there.
  • the novel hirudin mutant of the present invention is characterized in that the physiologic mechanism that produces its antithrombin activity is a hirudin mutant that has a high similarity in the amino acid sequence. It is clear that it is the same as HV1C3, and it is also clear that its pharmacological action as an anticoagulant (only with a difference in its activity) and its metabolic activity are very similar .
  • the present invention provides a novel hirudin mutant.
  • the hirudin mutant of the present invention has a higher anti-thrombin activity than the conventional hirudin mutant HV1C3, and exhibits a pharmacological activity due to the formation of a succinimide or a metastasis during storage. Prevents lowering and is useful as an anticoagulant.
  • A3 Lys or Glu
  • A4 Asp, Asn or Gin
  • A6 Glu or Lys
  • A9 Ala, Tyr or bond
  • A10 Tyr or Leu

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Description

明 細 書 新規なヒルジ ン変異体、 その製造方法及びこれを有効成分とす る抗凝血剤 技 術 分 野
本発明は、 天然に存在する ヒルジ ン変異体と異なるア ミ ノ酸 配列を有する新規なヒルジ ン変異体に関する。
また、 本発明は、 当該新規なア ミ ノ酸配列を有するポリ ぺプ チ ドをコー ドする DNA 配列を有する DNA に関する。
さ らに、 本発明は、 当該新規なヒルジ ン変異体を発現させる ための新規なヒルジ ン変異体発現ベク ター、 その発現ベク ター で形質転換された遺伝子組換え大腸菌、 及び該遺伝子組換え大 腸菌を用いてヒルジ ン変異体を産出 . 分泌させてヒルジ ン変異 体を製造する方法に関する。
さ らにまた、 本発明は、 上記の新規なア ミ ノ酸配列を有する 新規なヒルジ ン変異体の少な く とも 1 種を有効成分と して舍有 する抗凝血剤に関する。
背 景 技 術
ヒルジ ンは、 薬用ヒル（Hirudo medicinalis)の唾液腺より の 分泌液中より単離された抗 ト ロ ンビン作用を有するポリ べプチ ドである。 天然に存在する ヒルジ ン変異体には、 HV1 、 HV2 及 び HV3 の 3種が知られている。 これらの天然に存在する ヒルジ ン変異体を構成するポリ ぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列は解明された。 また、 その解明されたァ ミ ノ酸配列をコ一ドする遺伝子もク 口 —ユングにより c- DNA と して得られ、 その DNA 配列も解明され た。
また、 天然に存在する遺伝子より ク ローニングされた上記の c-DNA を用い、 発現ベクターが作製された。 その発現ベクター ¾-大腸菌（Escherichia co 1 i ) は酵母 (Saccharoyces cerev i siae) などの宿主微生物に導入して、 ヒルジ ン変異体を構成す るポリ ペプチ ドを発現する こ とも行なわれている。
また、 上記の天然に存在する ヒルジ ン変異体を構成するポリ ぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列に関する知見を基に、 人為的にァ ミ ノ 酸配列に変異を加えたヒルジン変異体も作製された。 例えば、 天然の HV2 のア ミ ノ酸配列に 1 個所変更した HV2(Lys47)を作製 し、 その抗 ト ロ ンビ ン作用を測定すると、 天然の HV2 と比較し 抗 ト ロ ンビ ン活性が上昇しており、 天然の HV1 の有する抗 ト ロ ンビン活性と比較し得る高い活性を示すこ とが報告されている。 或は、 天然の HV1 の N末端領域のア ミ ノ酸配列を他のア ミ ノ酸 により置き換えるこ とで得られる変異体、 又は該 N末端にア ミ ノ酸を付加する こ とで得られる変異体等の HV1 類似のヒルジ ン 変異体も作製されている。 天然の HV1 における N末端領域のァ ミ ノ酸配列、 Valに Va -、 を lieに lie2-に置き換える こ とで得 られる変異体は、 天然の HV1 より高い抗 ト ロ ンビン活性を示す こ とが 告されている。 なお、 ヒルジ ンの N末端領域のァ ミ ノ 酸配列は、 ト 口 ンビンのポリ ぺプチ ド鎖の切断酵素活性中心
(或はそれに近接する領域） と分子間の結合を形成すると予測 される部分である。 また、 ヒルジンと ト ロ ンビン との複合体が 解離する過程におけ ¾速度を支配する と予測される部分である。
本発明者らは、 上記の天然のヒルジン変異体を構成するポリ ペプチ ドのア ミ ノ酸配列に対して、 人為的に点変異（po i n t mut a t i on)を行う こ とによ り得られる ヒルジ ン変異体と異なる発想 に基づき、 HV1 の C末端領域部分の部分ポリ ペプチ ドを HV3 の C末端領域部分の部分ポリ ぺプチ ドにより置換した複合型のヒ ルジ ン変異体 HV1C3 等を作製し、 特に、 前記の複合型のヒルジ ン変異体 HV1C3 は HV1 より高い抗 ト ロ ンビン活性を示すこ とを 明らかにした （特開平 4-173798号公報） 。 更に、 これら高い抗 ト ロ ンビ ン活性を示す複合型のヒルジ ン変異体は、 ト ロ ンビン によるポリ.ぺプチ ド鎖の切断に起因する凝血過程を抑制する抗 凝血剤と しての薬理的効果があるこ とを明らかにした。 即ち、 抗 ト ロ ンビン活性 （ ト ロ ンビンによるポ リ べプチ ド鎮の切断酵 素活性の阻害能） を有する故に、 凝血形成を阻害抑制でき る こ とを明らかにした。
本発明者らは、 先の出願で提案した上記の複合型のヒルジ ン 変異体 HV1C3 等を有効成分とする抗凝血剤は、 純粋なヒルジ ン 変異体の 1 種を所定の薬理的当量舍むものと して調製して、 長 期に室温で保管する と、 その薬理的活性が見かけ上変化する こ とを見出した。 その原因を解明すべ く 本発明者らは研究を行つ た結果、 例えばヒルジ ン変異体 HV1C3 においては、 そのア ミ ノ 酸配列中に含まれる Asp33- Gly34-の部分において、 Asp33 の側 鎖のカルボキシル基とその C末端に隣接する Gly 34 との化学反 応により、 スク シンィ ミ ド体或は ^転移体が形成されている こ とを見出した （特願平 4- 135582号） 。 これらのス ク シ ンイ ミ ド 体或は /?転移体は、 その原ヒルジ ン変異体と同様に抗 ト ロ ンビ ン活性を有する ものの、 抗 ト ロ ンビン活性は低下しており、 抗 凝血剤の薬理的活性に見かけ上の変化をもたらすこ とが判明し た。 更に、 Asp は、 その C末端に隣接するア ミ ノ酸との化学反 応によ り 、 スク シ ンイ ミ ド体或は /?転移体を形成する例が報告 されている こ とに鑑み、 より詳細な研究を進め、 本発明者らは、 Asp62- Ala63-の部分においても、 スク シンィ ミ ド体或は 転移 体が形成されている可能性を見出した。
これらのスク シ ンィ ミ ド体或は /9転移体 （以下 「 ヒルジ ン類 縁体」 と称する） は、 薬剤と して調製した後、 保存中に生成し 得るため、 当該抗凝血剤の薬理的活性を所望の活性以上に保つ 上で、 障害となる ものである。 例えば、 上記の反応を抑制する ために、 低温にて保管したり、 或は室温保管中の薬理的活性の 低下を考慮し、 当初のヒルジ ン変異体の含有量を増す等の手段 をとるこ とが必要とされる。 特に、 当該抗凝血剤の当初のヒル ジ ン変異体含有量を増すと、 投与後血液中に残余する ヒルジ ン の濃度が低下するに要する時間が不必要に長く なる問題を生ず る こ とになる。
発 明 の 開 示
本発明は、 スク シ ンイ ミ ド体或は ^転移体の形成に起因する 上記問題を解決しょう とする ものである。 すなわち、 本発明の 目的は、 スク シ ンィ ミ ド体或は /?転移体の形成を起こ し易いァ ミ ノ酸配列を、 他のア ミ ノ酸配列に置換するこ とにより、 ヒル ジ ン類緣体への変換を抑制でき、 且つ抗 ト ロ ンビン活性の高い 新規なヒルジ ン変異体を提供する ことにある。
また、 本発明は、 スク シ ンィ ミ ド体或は 転移体の形成によ る ヒルジ ン類緣体への変換に伴う、 該ヒルジ ン変異体の濃度減 少を-補い得るほどに高い抗 ト 口 ンビン活性を有する新規なヒル ジ ン変異体を提供する こ とにある。
本発明の目的は、 スク シ ンイ ミ ド体或は ^転移体の形成によ る ヒルジ ン類縁体への変換に伴う、 該ヒルジ ン変異体の濃度減 少を抑制する こ とで、 薬理的活性の低下を許容される範囲に留 め、 当該抗凝血剤中のヒルジ ン総濃度の増加を抑える、 又は、 ヒルジ ン類緣体への変換に伴う該ヒルジ ン変異体の濃度減少に 際しても、 高い抗 ト ロ ンビン活性を有する故に所望の薬理的活 性を得るに必要な当該抗凝血剤中のヒルジン総濃度の増加を抑 える こ とが可能な新規なヒルジ ン変異体を提供する こ とにある。 本発明は、 次の一般式 I で表されるァ ミ ノ酸配列を有する新 規なヒルジ ン変異体に関する。
H Al A2 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly
Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn
Val Cys Gly Gin Gly Asn A3 Cys lie Leu
Gly Ser A4 A5 A6 A7 Asn Gin Cys Val
Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser
His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro lie Pro
Glu A8 A9 A10 Asp Glu OH 〔 I 〕
(式中、 Alは Val または lie を、 A2は Val または lie を、 A3 は Lys または Glu をそれぞれ示す。 また、 A4は Asp 、 Asn また は Gin を、 A5は Ala または Gly を、 A6は Glu または Lys を、 A7 は Lys または Asp を、 A8は Asp または Glu を、 A9は Ala 、 Tyr または結合を、 A10 は Tyr または Leu をそれぞれ表し、 かつ A9 または A10 のいずれかは Tyr である。 ）
本発明の上記一般式 I で示される ヒルジ ン変異体は、 そのァ ミ ノ酸配列を特徴付ける ヒルジ ン変異体 HV1C3 のア ミ ノ酸配列 との差異により、 2 つの群に大別する こ とが可能である。 即ち、 第 1 の群は、 ヒルジン変異体 HV1C3 のア ミ ノ酸配列中に含まれ る Asp33-Gly34-の部分と Asp62- Ala63-の部分、 この 2 つの Asp を舍むア ミ ノ酸部分配列の何れか或はその両方を人為的に点変 異 （point mutation) を行う こ とにより得られる ヒルジ ン変異 体からなる群である。 また第 2 の群は、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 のア ミ ノ酸配列中に含まれる N末端領域のア ミノ酸配列、 Val1 - Val2-、 を lieに lie2- に置き換える こ とで得られる こ とを主 な特徴とする ヒルジン変異体からなる群である。 さ らに、 前記 2つの群の何れにも属する ヒルジン変異体をも舍むものである。 本発明の新規なヒルジ ン変異体は、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 の ァ ミ ノ酸配列に対して、 そのア ミノ酸配列を改変するこ とで得 られる ものである。 本発明の ヒ ルジ ン変異体は、 次のよ う な特 徴を有する ものとなる。
上記する新規なヒルジ ン変異体の内、 その第 1 の群に大別す る ことができる変異体、 即ちヒルジ ン変異体 HV1C3 のア ミ ノ酸 配列中に舍まれる Asp33- Gly34 -の部分と Asp- 6ZAlafc 3-の部分、 この 2 つの Asp を含むァ ミ ノ酸部分配列の何れか或はその両方 を人為的に点変異（point mutation)を行う こ とによ り得られる ヒルジン変異体は、 スク シンィ ミ ド体或は /?転移体の形成によ る ヒ ルジ ン類緣体への変換が抑制された もの となる。
また、 第 2 の群に大別するこ とができるもの、 即ちヒルジ ン 変異体 HV1C3 のァ ミ ノ酸配列中に含まれる N末端領域のァ .ミ ノ 酸配列、 Val Valz-を lie1 -lie2-に置き換えるこ とで得られる ものは、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 と比べて、 抗 ト ロ ンビン活性が 格段に高いものとなる。 特に、 ト ロ ンビンとの複合体を形成す る反応速度、 即ち速度定数 konがヒ ルジン変異体 HV1C3 より大 きな値を有する。 即ち、 ト ロ ンビンに対して、 ヒルジ ンが複合 体を形成する際に、 最初に分子間の結合を形成する とされてい る C末端領域は、 同じア ミ ノ酸配列を有するにも係らず、 複合 体を形成する反応速度が大き く 上昇したものとなる。
更には、 本発明の新規なヒ ルジ ン変異体は、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 の抗 ト ロ ンビン活性、 ひいては抗 ト ロ ンビン活性に起因 する抗凝血剤と しての薬理的作用をもたらすア ミ ノ酸配列を相 当部分保存しており、 代謝によ り血液中より失われる過程はヒ ルジ ン変異体 HV1C3 と差異がないものとなるこ とが当然に予想 される。
なお、 前記する本発明の新規なヒルジ ン変異体において達成 される、 ス ク シ ンィ ミ ド体或は /?転移体の形成による ヒルジ ン 類縁体への変換が抑制される特徴と、 抗 ト ロ ンビン活性、 特に ト ロ ンビンとの複合体を形成する反応速度が上异する特徴とは、 それぞれ価別のァ ミ ノ酸部分配列の改変により もたらされるも のであり、 且つ互いに干涉するこ とな く起こる ものである。
また、 本発明は、 このよ う な ヒルジ ン変異体のァ ミ ノ配列を コー ドしている DNA 、 例えば、 一般式 Π
GTT GTA TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC CAA CAT ATG TGA CTA ACA TGA CTT AGA CCG
CAG AAC CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC GTC TTG CAC ACA GAC ACA CTT CCT AGG TTG
GTT TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGT ATC CTC CAA ACA CCA GTC CCA TTG TTT ACA TAG GAG
GGG TCT (1) (2) (3) (4) AAC CAG TGT GTT
CCC AGA TTG GTC ACA CAA
ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT TGA CCA CTT CCA TGG GGC TTT GGC GTC AGA
CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG ATC CCG GTA TTG GTC CCA CTA AAG CTT GGC TAG GGC
GAA (5) (6) (7) GAT GAA
CTT CTA CTT 〔 Π j
(式中、 （1) は GAT AAC または CAG を、 （2) は GCT また CTA, TTG GTC CGA は GGT を、
CCA
(3) は GAA または AAA を、 （4) は AAG または GAT を、
CTT TTT TTC CTA
(5) は GAC
CTG
または GAA を (6) は GCG TAC または結合を、 （7) は TAC
CTT CGC, ATG ATG または CTG
GAC
をそれぞれ表す。 ）
で示される新規な DNA に関する。
さ らに、 本発明はプロモータ一、 シグナルペプチ ドをコー ド する DNA 配列、 一般式 I で表されるア ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ドをコー ドする DNA 配列、 転写停止シグナルを舍む DNA 配列及び複製開始シグナルを舍む DNA 配列を舍んでなる新規な ヒルジ ン変異体発現べクタ一に関する。
さ らに、 本発明は前記ヒルジ ン変異体発現ベクターにより形 質転換された新規な遺伝子組換え大腸菌に関する。
さ らに、 本発明は、 前記遺伝子組換え大腸菌を培地中で培養 し、 その培養菌体及び培地から一般式 I で表されるア ミ ノ酸配 列を有する ヒルジ ン変異体を摂取する ことより なる新規なヒル ジ ン変異体の製造方法に関する。
本発明の上記一般式 I で示される ヒルジ ン変異体は、 化学合 成において製造してもよいし、 また遺伝子工学的手法によって 製造してもよい。
遺伝子工学的手法で製造するには、 例えば後述する実施例で 示すよう に、 まずヒルジン変異体分泌プラス ミ ド PMTSHV1C3(特 開平 4-Π3798号参照） を制限酵素で切断して 31位から 44位のァ ミ ノ酸配列をコー ドする DNA 配列を除く 。 一方、 一般式 I で示 されるァ ミ ノ酸配列のう ち 31位から 44位の配列をコ一ドする DNA 配列を化学合成する。 このプラス ミ ド PMTSHV1C3 からヒルジン 変異体 HV1C3 の 31位から 44位のァ ミ ノ酸配列をコ一ドする D 配列を除いた DNA と、 化学合成した一般式 I の 31位から 44位の 配列をコー ドする DNA とを DNA リ ガ一ゼ等を用いて反応させ、 本発明のヒルジン変異体のア ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を舍 むプラス ミ ド PCX397DA, PCX397NA, あるいは PCX397N を構築す る。 さ らに、 これらのプラス ミ ドをそれぞれ制限酵素で切断し て 45位から 66位のァ ミ ノ酸配列をコー ドする DNA 配列を除く 。 その一方、 一般式 I で示されるア ミ ノ酸配列のう ち 45位から 66 位の配列をコー ドする DNA 配列を化学合成する。 このプラス ミ ド PCX397DA, pCX397NA, pCX397 からそれぞれヒルジ ン変異体 CX397DA, CX 397NA, CX397Nの 45位から 66位のア ミ ノ酸配列を コー ドする DNA 配列を除いた DNA と、 一般式 I の 45位から 66位 の配列をコー ドする化学合成した DNA とを DNA リガーゼ等を用 いて反応させ、 本発明のヒルジン変異体のァ ミ ノ酸配列をコー ドする DNAを舍むプラス ミ ド pCX397DAl, PCX397DA2, PCX397DA3, PCX397NA1, pCX397NA2, pCX397NA3、 PCX397N1, PCX397N2, PCX397N3を構築する。
これらのプラス ミ ドは、 プラス ミ ド PMTSHV1C3 由来のプロモ —ター、 シグナルペプチ ドをコー ドする DNA 配列、 転写停止シ グナルを舍み、 本発明のヒルジン変異体をコー ドする DNA 配列 が、 シグナルぺプチ ドをコ一ドする DNA 配列と転写停止シグナ ルとの間に組込まれている。
これらのプラス ミ ドによって大腸菌を形質転換し、 この形質 転換微生物を培養する と菌体および培地中に本発明のヒルジ ン 変異体が産生される。
本発明のヒルジ ン変異体は、 上述のような宿主、 ベクター系 に限らず、 遺伝子工学的手法と して一般によ く 知られた宿主、 ベクター系を用いて産生させてもよい。 例えば、 適当な微生物 宿主株と して、 上述の大腸菌 (Escherichia coli) 株、 枯草菌 (Bac i 11 us sub t i 1 ^ 及び酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 株が含まれ、 それぞれの宿主細胞に応じた発現ベクターを用い る こ とによって、 ヒルジ ン変異体を産生させる こ とができ る。 本発明のヒルジ ン変異体は、 通常一般的に知られている方法 で単離し、 ク ロマ トグラフ、 逆相 HPLCその他の精製法によって 精製する。
得られたヒルジ ン変異体は、 ヒルジ ン HV1 やヒルジ ン変異体 HV1C3(特開平 4- 173798号公報） より も、 ス ク シ ンイ ミ ド体また は ^転移体の形成が抑制されており、 従って安定性が高い。 さ らに、 高い抗 ト ロ ンビン活性も維持している。
本発明の抗凝血剤を得るには、 通常製剤の製法と して一般的 に知られている方法で製剤とする こ とによって、 す ぐれた抗凝 血剤とする こ とができる。 すなわち本発明のヒルジ ン変異体は 任意慣用の製薬用担体や賦形剤を用いて任意慣用の方法で調製 される。 投与は、 例えば静脈内、 皮内、 皮下も し く は筋肉内に、 また局所に非経口的に行う こ とができる。 投与量は症状や投与 対象者の年令、 性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定 される力く、 通常成人 1 日当り 0.1〜100mg であり、 これを 1 日 1 〜数回に分けて投与する。
本発明の新規なヒルジ ン変異体は、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 の ァ ミ ノ酸配列に対して、 そのア ミ ノ酸配列を改変する こ とで得 られる ものであり、 その第 1 の群に大別する こ とができる、 即 ちヒルジ ン変異体 HV1C3のァ ミ ノ酸配列中に含まれる Asp33-Gly の部分と Aspfc Z- Ala63-の部分、 この 2 つの Asp を舍むア ミ ノ酸 部分配列の何れか或はその両方を人為的に点変異 （Point muta tion) を行う こ とにより得られる ヒルジ ン変異体は、 ヒルジ ン 変異体 HV1C3 と比較し得る抗 ト ロ ンビン活性を有する とともに、 スク シンィ ミ ド体或は ^転移体の形成による ヒルジン類緣体へ の変換が抑制されたものであるため、 それを有効成分とする抗 凝血剤においては、 薬理的活性の低下が抑えられ利点があり、 又第 2の群に大別する こ とができる、 即ちヒルジン変異体 HV1C3 のァ ミ ノ酸配列中に含まれる N末端領域のァ ミ ノ酸配列、 Val 1 -Val 2-、 を lieに lie2-に置き換える こ とで得られる ヒルジ ン変 異体は、 ヒルジ ン変異体 HV1C3 と比較して、 極めて高い抗 ト ロ ンビン活性を有するために、 スク シンィ ミ ド体或は 転移体の 形成によるヒルジ ン類縁体への変換が起こ つても所望の薬理的 活性を満足するに要する抗凝血剤中に舍有させるべき ヒルジ ン の総量を、 少な く と も従来のヒルジ ン変異体 HV1C3 による抗凝 血剤より少な く できる利点がある。 これにより、 従来のヒルジ ン変異体 HV1C3 による抗凝血剤では、 保管中の薬理的活性の低 下を補うべ く 、 舍有させるべき ヒルジ ンの総量を予め高 く する 必要がある という欠点を、 実効的に改善した抗凝血剤と して有 用である。
また、 上記の新規なヒルジ ン変異体は本発明の製造方法にお いて、 従来のヒルジ ン変異体 HV1C3 と同様に遺伝子工学的手法 により生産される ものであるので、 大量に且つ高い再現性で生 産する こ とができ、 それに伴い安価に製造する こ とができる。
図面の簡単な説明
第 1 図は、 ヒルジ ン変異体 CX397DA 分泌プラス ミ ド PCX397DA の構築方法の概念図を示す。 第 2図は、 本発明において使用する、 ヒルジ ン変異体の一部 をコー ドする合成 DNA の塩基配列を示す。
第 3図は、 ヒルジ ン変異体 CX397NA 分泌プラ ス ミ ド PCX397NA の構築方法の概念図を示す。
第 4図は、 プラス ミ ド PCX397N の構築方法の概念図を示す。 第 5図は、 プラ ス ミ ド PCX397DA1, PCX397DA2, PCX397DA3, PCX397NA1, PCX397NA2, pCX397NA3, PCX397N1, PCX397N2及び PCX397N3の構築方法の概念図を示す。
第 6図は、 本発明において使用する ヒルジ ン変異体の一部を コー ドする合成 DNA の塩基配列を示す。
第 7図は、 ヒルジ ン変異体遺伝子を作成し、 分泌発現プラ ス ミ ド pMTS HV19 または pMTS HV10 に導入し、 これで JM109 株あ るいは RR1 株を形質転換する方法の概念図を示す。
第 8図は、 2個またはそれ以上の変異をもつヒルジ ン変異体 遺伝子の構築方法の概念図を示す。 （ はヒルジ ン遺伝子を示 す）
第 9図は、 ヒルジン変異体 HV115 遺伝子の構築方法の概念図 を示す。
第 10図は、 ヒルジ ン変異体 HV116 遺伝子の構築方法の概念図 示す。
発明を実施するため最良の形態 前項で述べた本発.明の新規なヒルジ ン変異体のァ ミ ノ酸配列 の特徴と、 それに伴う スク シ ンイ ミ ド体或は /?転移体の形成に よる ヒルジ ン類緣体への変換が抑制される特徴と、 抗 ト ロ ンビ ン活性、 特に ト ロ ンビンとの複合体を形成する反応速度が上昇 する特徴とを 1 体 1 に対比して示す目的を持ち、 具体例により 本発明を以下に説明する。 なお、 実施例においては、 上記した ア ミノ酸配列の改変により特徴付けられた 2 つの群をそれぞれ 代表する ヒルジ ン変異体について、 開示する こ とで上記の作用 を明確にする。
実施例 1
ヒルジ ン変異体及びそれを発現する プラス ミ ドの作製
1 ) ヒ ルジ ン変異体 CX397DA 分铋プラ ス ミ ド PCX397DAの作製 プラス ミ ド PCX397D/Uま第 1 図に示した方法に従って構築した。 まずヒルジ ン変異体 CX397DA の 31〜44位に対応する DNA 断片を 得るために第 2図（A) に示す 2種のオ リ ゴヌク レオチ ドをアブ ライ ド ' バイ ォシステムズ DNA 合成機 （モデル 380B) を用いて、 リ ン酸ァ ミダイ ト法により合成した。 脱保護したのち、 ポリ ア ク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動により各オ リ ゴヌク レオチ ドを精製 した。
2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （DA-1, DA-2) 各 2 pmolを混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Av alと Kpnlとで切断したプラス ミ ド PMTSHV1C3 50pmolとを T4DNA リ ガーゼを舍む溶液 100// 1 中で、 16ΐにて 30分間反応させた。 この反応液 10^ 1 を用いて大腸菌 JM09 株を形質転換し、 ヒル ジ ン変異体 CX397DA 分泌発現プラ ス ミ ド PCX397DAを得た。 塩基 配列はサ ンガー等の方法で確認した。
この形質転換した大腸菌を通商産業省工業技術院微生物工業 技術研究所 （以下、 微ェ研という。 現生命工学工業技術研究所） に寄託し、 受託番号微ェ研条寄第 3984号（FERM BP-3984)を得た。
2 ) ヒルジ ン変異体 CX397NA 分泌プラ ス ミ ド PCX397NAの作製 プラス ミ ド pCX397NAは第 3図に示した方法に従つて構築した。 まずヒ ルジ ン変異体 CX397NA の 31〜44位に対応する DNA 断片を 得るために第 2図（B) に示す 2種のオ リ ゴヌク レオチ ドをァフ' ラィ ド · バイ オ システムズ DNA 合成機 （モデル 380B) を用いて、 リ ン酸ア ミダイ ト法により合成した。 脱保護したのち、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動により各オ リ ゴヌク レオチ ドを精製 した。
2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （NA-1， NA-2) 各 2 pmolを混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Aval と Kpnlとで切断したプラス ミ ド PMTSHV1C3 50pmolとを T4DNA リ ガーゼを舍む溶液 100〃 1 中で、 16°Cにて 30分間反応させた。 この反応液 10 ^ 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 ヒル ジ ン変異体 CX397NA 分泌発現プラ ス ミ ド PCX397NAを得た。 塩基 配列はサンガ一等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3980号（FERM BP-3980)を得た。
3 ) ヒルジ ン変異体 CX397N分泌プラ ス ミ ド PCX397N の作製
プラス ミ ド PCX397N は第 4図に示した方法に従って構築した。 まずプラ ス ミ ド PUCHV3 (特開平 4- 173798号公報参考例に記載） を制限酵素 Avalと Kpnlとで切断し、 ヒルジン変異体 CX397Nの 31 〜44位に対応する DNA 断片を得た。 こ の断片 lOpmolと、 制限酵 素 Avalと Kpnlとで切断したプラス ミ ド pMTSH VI C3 (同公開公報） 5 Opmol とを T4DNA リ ガーゼを舍む溶液 100 ] 中で、 16°Cにて 30分間反応させた。 この反応液 10；/ 1を用いて大腸菌 JM109株を 形質転換し、 ヒルジ ン変異体 CX397N分泌発現プラ ス ミ ド PCX397N を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3976号（FERM BP-3976)を得た。
4 ) ヒルジ ン変異体 CX397DM分泌プラ ス ミ ド pCX397DAl の作製 プラス ミ ド PCX397DA1 は第 5図に示した方法に従って構築し た。 まずヒルジン変異体 CX397DA1の C末端ァ ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（1) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （1-1, 1-2, 1-3, 1-4) を合成した。 脱保護したの ち、 ポリ アク リ ルア ミ ド電気泳動により、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （1-2, 1-3) 各 50pmolをリ ン酸化 後、 4種各 2 pmolを混合し、 ァニールし、 ニ本鑌 DNA 断片を得 た。 この断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド pCX397DA 50pmolとを T4DNA リ ガ一ゼを含む溶液 100〃 1 中で、 16て にて 30分間反応させた。 こ の反応液 10 1 を用いて 大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラス ミ ド PCX397DA1 を得た。 塩基配列はサンガ一等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3985号（FEBM BP- 3985)を得た。 .
5 ) ヒルジ ン変異体 CX397DA2分泌プラス ミ ド PCX397DA2 の作製 プラス ミ ド pCX397DA2 は第 5図に示した方法に従って構築し た。 まずヒルジ ン変異体 CX397DA2の C末端ァ ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（2) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ド 電気泳動により、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （2-2, 2-3) 各 50pmolを リ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397DA 50pmolとを T4DNA リガ一ゼ を舍む溶液 100 1 中で、 16てにて 30分間反応させた。 この反 応液 10 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PCX397DA2 を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3986号（FERM BP- 3986)を得た。
6 ) ヒルジ ン変異体 CX397DA3分泌プラ ス ミ ド PCX397DA3 の作製 プラス ミ ド PCX397DA3 は第 5図に示した方法に従って構築し た。 まずヒ ルジン変異体 CX397DA3の C末端ァ ミ ノ 酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（3) に示す 4種のオリ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポリ アク リ ルア ミ ド 電気泳動により、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のォ リ ゴヌ ク レオチ ド （3-2, 3-3) 各 50pmolをリ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmolを混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpi lと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397DA 50pmolとを T4DNA リ ガーゼ を舍む溶液 100 1 中で、 16てにて 30分間反応させた。 こ の反 応液 10/ 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラス ミ ド PCX397DA3 を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3987号（FERM BP-3987)を得た。
7 ) ヒルジ ン変異体 CX397NA1分泌プラ ス ミ ド PCX397NA1 の作製 プラス ミ ド PCX397NA1 は第 5図に示した方法に従つて構築し た。 まずヒルジン変異体 CX397NA1の C末端ア ミノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（1) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポリ ア ク リ ルア ミ ド 電気泳動により、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌク レオチ ド （レ 2, 1-3) 各 50pmolを リ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmolを混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397NA 50pmolとを T4DNA リ ガーゼ を舍む溶液 100 1 中で、 16°Cにて 30分間反応させた。 この反 応液 10 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PCX397NA1 を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3981号（FERM BP-3981)を得た。 8 ) ヒルジ ン変異体 CX397NA2分泌プラ ス ミ ド PCX397NA2 の作製 プラス ミ ド PCX397NA2 は第 5図に示した方法に従って構築し た。 まずヒルジン変異体 CX397NA2の C末端ア ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（2) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポリ ア ク リ ルア ミ ド 電気泳動により、 各ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。 .
2種のオ リ ゴヌク レオチ ド （2-2, 2-3) 各 50pmolをリ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll
1
とで切断したプラス ミ ド PCX3 797NA 50pmolとを T4DNA リ ガーゼ を舍む溶液 100/ 中で、 16°Cにて 30分間反応させた。 こ の反 応液 10 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PCX397NA2 を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。
この形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3982号（FERM BP- 3982)を得た。
9 ) ヒルジ ン変異体 CX397NA3分泌プラ ス ミ ド. PCX397N/13 の作製 プラス ミ ド PCX397NA3 は第 5図に示した方法に従って構築し た。 まずヒ ルジン変異体 CX397NA3の C末端ア ミ ノ酸に対応する D A 断片を構築するために、 第 6図（3) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ド 電気泳動により、 各オリ ゴヌク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド （3-2, 3-3) 各 50pmolをリ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397NA 50pmolとを T4DNA リ ガーゼ を舍む溶液 100 1 中で、 16てにて 30分間反応させた。 こ の反 応液 10 〗 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PCX397NA3 を得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法で確認した。 こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3983号（FERM BP-39^3)を得た。
10) ヒルジ ン変異体 CX397N1 分泌プラ ス ミ ド PCX397N1の作製 プラス ミ ド pCX397Nlは第 5図に示した方法に従って構築した。 まずヒルジン変異体 CX397N1 の C未端ア ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（1) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レ ォチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポ リ アク リ ルア ミ ド電気 泳動により、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌク レオチ ド （ 2, 1-3) 各 50pmolを リ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 ニ本鎮 DN'A 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397N 50pmolとを T4DNA リ ガ一ゼを 舍む溶液 100 1 中で、 16'Cにて 30分間反応させた。 この反応 液 10 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラス ミ ド pC X397N1を得た。 塩基配列はサンガ一等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3977号（FERM BP-3977)を得た。
11) ヒルジ ン変異体 CX397N2 分铋プラ ス ミ ド PCX397N2の作製
プラス ミ ド pCX397N2は第 5図に示した方法に従って構築した。 まずヒルジ ン変異体 CX397N2 の C末端ァ ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（2) に示す 4種のオ リ ゴヌク レ ォチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポリ ア ク リ ルア ミ ド電気 泳動によ り 、 各オ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌク レオチ ド （2-2, 2-3) 各 50Pmolをリ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397N 50pmolとを T4DNA リ ガーゼを 舍む溶液 100 1中で、 16°Cにて 30分間反応させた。 こ の反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PCX97N2 を得た。 塩基配列はサンガー等の方法で確認した。
こ の形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3978号（FERM BP- 3978)を得た。
12) ヒルジ ン変異体 CX397N3 分泌プラ ス ミ ド PCX397N3の作製
プラス ミ ド pCX397N3は第 5図に示した方法に従って構築した。 まずヒルジン変異体 CX397N3 の C末端ァ ミ ノ酸に対応する DNA 断片を構築するために、 第 6図（3) に示す 4種のオ リ ゴヌ ク レ ォチ ドを合成した。 脱保護したのち、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ド電気 泳動により、 各オ リ ゴヌク レオチ ドを精製した。
2種のオ リ ゴヌク レオチ ド （3-2, 3-3) 各 50pmolを リ ン酸化 後、 4種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド各 2 pmo 1を混合し、 ァニールし、 二本鎖 DNA 断片を得た。 こ の断片と、 制限酵素 Kpnlと Hindlll とで切断したプラス ミ ド PCX397N 50pmolとを T4DNA リ ガ一ゼを 含む溶液 100 1 中で、 16'Cにて 30分間反応させた。 こ の反応 液 10^ 1 を用いて大腸菌 JM109 株を形質転換し、 プラ ス ミ ド PC X397N3を得た。 塩基配列はサンガ一等の方法で確認した。
この形質転換した大腸菌を微ェ研に寄託し、 受託番号微ェ研 条寄第 3979号（FERM BP- 3979)を得た。
実施例 2
ヒルジ ン変異体の製造
ヒルジ ン変異体分泌発現プラ ス ミ ドによ って形質転換された 大腸菌 JM109 株 〔実施例 1 1) 〜12) の大腸菌株〕 を、 それぞ れ別個に 100 g/mlのア ンピシ リ ンを舍む 2xTY培地 （バク ト ト リ プ ト ン 16g/l, ノ 'ク ト イ ース ト エキ ス ト ラ ク ト lOg/1, NaCl 5g/l) 100ml で培養した。 37°Cで 24時間振とう培養した後、 集 菌した。 沈澱した細胞の各サ ンプルを 100ml の 25%シユーク ロース 50mM Tris · HC1 (PH7.5) 1 mM EDTA に懸濁し、 室温にて 10分間処理した。 10000 X g にて 10分間遠心分離して集菌した のち、 細胞を 100ml の冷水に懸濁し、 浸透圧ショ ッ クをかけて、 細胞のペリ ブラズム空間中の物質を放出させた。 10000 X g に て 10分間の遠心により細胞を除ました後、 ペリ ブラズム画分を 0.22 ^ m フ ィ ルターを用いて濾過した。
上記のよう にして得たペリ プリ ズム画分 20mlに 12.9 g の（NH4) 2 S04 を溶解し、 4 ΐで一晩処理した。 20000 Χ g にて 30分間遠 心したのち、 沈澱物を 2 mlの水に溶解し、 これを 0.22i/ m フ ィ ルターを用いて濾過し、 ヒルジ ン変異体の粗精製サ ンプルを得 た。
これを逆相高速液体ク ロマ ト グラムを用いて以下の条件で分 折した。
カ フ ム YMC-Pack PROTEIN-BP 250 X 4.6mm
溶媒 A 0.065%TFA/H20
B 0.065%TFA/ァセ ト ト リ ル
勾 配 17% B/10min
1Ί→32% B /30min
1 m 1 /m l n
検 出 215nm
実施例 3
ヒルジ ン変異体中のスク シ ンィ ミ ド体または /?転移体の測定 及び放置試験による低減
実施例 2 で得られたヒルジ ン変異体粗精製サ ンプル及びヒル ジ ン変異体 HV1C3 (対照） を 25'Cで 4 週間保存した後、 逆相高 速液体ク ロマ トグラムを用いて分折し、 保存前の分析結果との 比較を行った。
逆相高速液体ク ロマ トグラ ムの結果より、 ス ク シ ンイ ミ ド体 または /?転移体の含有率を次のよ う に して算出した。 ヒルジ ン 変異体のピーク の溶出時間を中心にその前後 4分以内に検出さ れるピークをスク シ ンイ ミ ド体または 転移体とみなし、 これ らとヒルジ ン変異体とのピーク面積の総和のう ち、 スク シ ンィ ミ ド体または ?転移体のピーク面積が占める割合をその含有率 と した。 すなわち、
(スク シ ンィ ミ ド体または ^転移体含有率 （％) ) = (主ピー クの前後 4 分以内に検出される ピークの面積） / [ (主ピーク の面積） + (主ピーク前後 4分以内に検出される ピーク の面積）] X 100 ' という式を用いて算出した。
結果を表 1 に示す。
表 i
ヒルジ ン変異体 25°C保存時における、 ス ク シ ンイ ミ ド体または 転移休含有率 （％) ア ミ ノ 酸 配 列 ス ク シ ンイ ミ ド体又は 大 腸 菌 ヒ クレジ ン 転移体含有率 ）
(実施例 1 )
A B C D E F G 保存前 保存後 増加分
HV1C3 Asp Gly Glu し ys Asp Ala Tyr 3.3 17.2 13.9
3 ) N Gin Gly し ys Asp Asp Ala Tyr 0 6.6 6.6
10) N1 Gin Gly し ys Asp Glu Ala Tyr 0 2.5 2.5
11) N2 Gin Gly し ys Asp Asp 結合 Tyr 0 1.1 1.1 t
12) N3 Gin Gly し ys Asp Asp Tyr Leu 2.5 4.3 1.8
1 ) DA Asp Ala Glu Lys Asp Ala Tyr 1.0 10.2 9.2
4) DA1 Asp Ala Glu し ys Glu Ala Tyr 0.2 2.4 2.2
5 ) DA2 Asp Ala Glu Lys Asp Wa Tyr 1.8 1.4 - 0.4
6 ) DA3 Asp Ala Glu し ys Asp Tyr Leu 1.3 4.9 3.6
2 ) NA Asn Ala Glu し ys Asp Ala Tyr 0.9 8.5 7.6
7 ) NA1 Asn Ala Glu Lys Glu Ala Tyr 0 3.1 3.1
8 ) NA2 Asn Ala Glu Lys Asp 結合 Tyr 0 1.4 1.4
9 ) NA3 Asn Ala Glu Lys Asp Tyr Leu 0.9 5.2 4.3
この結果、 本発明のヒ ルジ ン変異体は、 25。Cで保存しても従 来知られている ヒ ルジン変異体 HV1C3 に く らベてス ク シ ンィ ミ ド体又は 5転移体の生成を著し く 低減する こ とができ、 その効 力が安定であるこ とが判明した。
実施例 4
ヒルジ ン変異体の精製
ヒルジ ン変異体は次のよう な方法を用いて精製した。
まず、 ヒ ルジ ン変異体分泌発現プラ ス ミ ドによ って形質転換 された大腸菌 JM109 株を 50 ^ g/mlのァ ンピシリ ンを舍む 2xTY培 地 （バク ト ト リ プ ト ン 16g/lヽ ノ ク ト イ一ス ト エキス ト ラ ク ト lOg/K NaCl 5g/l) 500ml で、 37 °Cにおいて 24時間振とう培養 をおこなった。
遠心分離により沈澱した細胞の各サ ンプルを 50mlの 25%シュ 一ク ロース、 50mM Tris-HCl (PH7.5) . ImM EDTAに懸濁し、 室温 にて 10分間処理した。 10000 Xg にて 10分間遠心して集菌した のち、 細胞を 50mlの冷水に懸濁して浸透圧ショ ツ クをかけ（4°C 30min) 、 細胞のペリ ブラズム空間.中の物質を放出させた。 15000 X g 、 15分間の遠心分離により細胞を除去した後、 ペリ プラズム画分を 0.22 t in フ ィ ルターを用いて濾過した。
上記のよう にして得たペリ ブラズム画分を逆相高速液体ク ロ マ トグラムを用いて以下の条件で分離溶出させ、 ヒ ルジ ン変異 体のピークを分取した。
装 置 ： ウ ォーターズ社
カ ラム ： YMC社 PROTEIN-RP 3.0x25cm
溶媒 A ： 0.06%TFA/H20
B ： 0.06%TFA/ァセ ト ニ ト リ ル
勾 配 ： 17% B /5min
17→32% B /45min 流 速 - 15ml /mi π
検 出 ： 215nm
実施例 5
1) 抗 ト ロ ンビン活性： ク ロ モ ジエニ ッ ク ' ア ツ セ ィ 法によ る 比活性の測定
比活性は ト ロ ンビンに対する合成基質ク ロモザィ ム TH ( ト シ ノレグリ シノレプロ リ ノレアノレギニ ン 4 -二 ト ロ アニ リ ドアセテ一 ト 、 ベーリ ンガーマ ンハイ ム社製） 水解活性の阻害度を比色定量試 験により測定した。
1 mlの反応容量において lOOmM Tris-HCl (pH8.5) . 150mM Na CI、 0.1 %ポ リ エ チ レ ングリ コール 6000からなる緩衝液に 0.5 ュニ ッ ト の ヒ ト . ト ロ ンビンを加え、 さ らにヒルジ ン変異体サ ンプルを加えて 37てで 3分間プレイ ンキュベー ト した。 終濃 度 200〃M となるよ う にク ロモザィ ム THを加え、 ト ロ ンビンに よるク ロモザィ ム THの分解生成物である P-二 ト ロアユリ ドの遊 離を波長 405nmで測定し、 1 分間あたり の吸収の増加を求めた。
ヒ ルジ ン変異体を加える量を変化させ、 様々なヒ ルジ ン変異 体濃度における吸収の増加率を測定してダラフ （横軸 ： ヒ ルジ ン変異体濃度、 縦紬 ： 1 分間あたり の吸収の増加） を作成し、 グラフの外捜により、 ト ロ ンビンの水解活性を完全に阻害する のに必要な最小のヒ ルジ ン変異体濃度を求め、 これを 0.5ATIH ア ンチ ト ロ ンビンユニ ッ ト ） と した。
本発明のヒ ルジ ン変異体の比活性 （ATU/mg) を表 2 に示す。
2) 抗 ト ロ ンビン活性 ： 発蛍光性の合成基質を用いた阻害定数 の測定
ト ロ ンビンに対する発蛍光性の合成基質である Boc-Asp(0Bzl ) -Pro-Arg-MCA (ペプチ ド研究所製） を用い、 ト ロ ンビンと して ヒ ト . ト ロ ンビンを用いて、 該合成基質と ト ロ ンビン との複合 体形成における阻害度を指標と して、 下記の方法で種々のヒル ジ ン変異体の抗 ト ロ ンビン活性を求めた。
0.05M Tris-塩酸緩衝液（pH7.8) 、 0.1 %ポ リ エチ レ ンダリ コール （ M6000) 、 0.1M NaCK 及び 250 U g/mlヒ ト血清アル ブ ミ ン （HSA)を舍有してなり、 且つ予め 3 7 。C に加熱されてい る緩衝液 1970 1 に、 試験すべき ヒルジ ン変異体の上記緩衝液 溶液 1 0 / 1 (終濃度 ΙΟΟρΜ)及び該合成基質の DMS0溶液 1 0 1 (終濃度 5 O PM) を添加して撹拌した後、 3 7 てで、 3分間プ レイ ンキュ ベー ト した。 更に、 その ヒルジ ン及び該合成基質を
2
溶解した液に、 ヒ ト · ト π ン 5ビン溶液 1 0 1 (終濃度 4 0 pM) を添加して激し く 撹拌し、 反応溶液と した。 この合成基質と ト ロ ンビ ンとの複合体形成の反応は、 ヒ ト . ト ロ ンビン溶液を添 加撹拌した時刻 t 。 より開始した。 なお、 その時刻 t 。 のと き、 反応溶液中における ヒルジ ンの濃度 C I 0、 該合成基質の濃度
C so, 及びヒ ト · ト ロ ンビンの濃度 C E0がそれぞれ所定の濃度 となるよう に前記の添加する各溶液を調整した。 前記ヒ ト ♦ ト 口 ンビン溶液を添加撹拌した時刻 t 。 以降の時刻 t において、 前記の反応溶液に波長 365nm 0励起光を照射しつつ、 該反応溶 液より発せられる蛍光の波長 450nm の光強度を測定した。 前記 反応溶液において測定される光強度と ト 口 ンビン及びヒルジ ン の濃度が零の反応溶液において測定される光強度との差を、 時 刻 t。 より の経過時間 Δ t ( = t — t 。 ) に対しプロ ッ トする こ とにより、 「プログレスカーブ j と呼ばれる曲線を得た。 この 「プロ グレスカーブ」 は、 該合成基質と ト ロ ンビンとの複合体 形成及びヒルジ ンと ト ロ ンビ ンとの複合体形成が競合して起こ る ときに、 該合成基質と ト ロ ンビ ンとの複合体の濃度変化に対 応する ものである。 「プロ グレスカーブ」 で表される該合成基 質と ト ロ ンビン との複合体の濃度変化を、 S. R. Stone らの用 いた方法 [Biochemistry (1986) , 25 , P.2622-2628. 或は Biochemistry(1979) , 18, P.2567-2573 を参照] に準じて解折 し、 ヒルジ ンと ト ロ ンビン との複合体の見かけの解離定数 K を求め、 得られた見かけの解離定数 Ki 'より、 下記の式 (1)に示 す見かけの解離定数 ' と解離定数 Κ との関係を用いて、 解 難定数 Ki を求めた。 尚、 測定は各試料につき 3回づっ行なつ た。
Figure imgf000028_0001
(但し、 式中、 Ks は該合成基質と ト ロ ンビン との複合体の 解離定数であり、 本例においては、 該合成基質と ト ロ ンビ ン と の酵素反応の ミ カ エ リ ス定数 Km と等し く 、 Ks =11.6 M で あった。 ）
各々 の ヒルジ ン変異体と ト ロ ンビン複合体の解離定数 K i ( P M ) を表 2 に示した。 なお、 こ の解離定数 Ki は、 数字の 小さい方が、 高い抗 ト ロ ンビン活性である こ とを示す。
表- 2
ヒルジ ン変異体の抗 ト ロ ンビン活性 ヒルジ ン変異体 比活性 （ATU/mg) 解離定数 K i(pM)
H V 1 C 3 10943 0.0433 ± 0.0008 N 13138 0.0374 ± 0.0026
N 1 11853 0.0459 ±0.0019 N 2 11133 0.107±0.004 N 3 15164 0.101±0.008 D A 11493 0.0355土 G.0026 D A 1 11572 0.0510± 0.0046 D A 2 11472 0.109±0.006 D A 3 11565 0.106±0.011 N A 11225 0.0360 ± 0.0009 N A 1 10553 0.0457 ± 0.0027 N A 2 12146 0.118±0.004 N A 3 13713 0.113±0.005 こ の表から本発明のヒルジ ン変異体は、 本出願人が先に提案 した高抗 ト ロ ンビン活性を示したヒルジ ン変異体である
HV1C3 に比べてほとんど遜色ないか、 むしろ高い抗 ト ロ ンビン 活性を示すこ とが分かる。
実施例 6
単鎖 M13SHV1 を用いてのヒルジ ン HV1 残基 Vall-Val2 の Ilel -Ile2 への変異および Lys27 の Glu27 への変異
1) 変異原プラ イ マ ー 1: (lie Ile2 変異用）
5 ' ACC AAA GCT ATC ATC TAC ACT GAT 3' 変異原プラ イ マー 2: (Glu27 変異用）
5' CAG GGT AAC GAA TGT ATC CTC 3 '
上記の DNA配列を有する変異原プライ マ一 1 および 2 を、 ァ プラ イ ド ♦ バイオシステムズ （モデル 380 B)合成機を用いて、 リ ン酸ア ミダイ ト法により合成した。
2) M13SHV1 の調製
(a) 制限酵素 EcoR I - Hind IEによ る M13mpl9 DNA の切断 特願平 3- 63909 号 に記載されている方法と同様の方法を用 いて、 M13mpl9 の EcoR I - Hind DI断片精製物（7.2Kb) を得た。
(b) 制限酵素 EcoR I - Hind HI によ るプラス ミ ド pMTSHVl DNA の切断
ヒルジ ン HV1 分泌発現べク タ一 pMTSHVl (特願平 2-303096号） 約 ΙΟτ gを、 36単位の制限酵素 EcoR I 、 60単位の制限酵素 Hind EIを用いて切断した。 ァガロースゲル電気泳動にて pho Aシグナ ル、 ペプチ ドおよびヒルジ ン HV1 をコー ドする約 250bp の DNA 断片を分離 · 精製した。
(c) ニ本鎮 M13SHV1 の作成および、 単鎮 M13SHV1 の調製
2 u 1 (0.04PM) の EcoR I - Hind HI切断 M13mP19 、 2 μ 1 (0.2ρΜ) の上記 (b)断片精製物を T4DNAリ ガーゼにより連結したのち、 こ れで大腸菌 TG 1株を形質導入した。 得られたプラークより J. Messing (Methods in Enzymology, 101, 21-78(1983) 〕 の方 法に従って単鎖 M13SHV1 DNA を調製した（lingノ TE 緩衝液 PH 8.0)。 塩基配列は、 サンガー等の方法で確認した。
3) 部位特異的変異誘発
前記変異原プライ マー 1 および 2 を特願平 3-63909 号に記載 されている方法と同様の方法を用いて 5' 末端をリ ン酸化した。 前述の M13SHV1 と上記 5' - リ ン酸化変異プライ マー 1 を用 いて変異 DNA(M13SHV19と命名） を作成した。 また、 M13SHV1 と 5' - リ ン酸化プライ マー 2 を用いて変異 DNA(M13SHV10と命名） を作成した。 なお、 作成の方法は、 特願平 3- 63909 号に記載さ れている とおり、 アマシャム社製のキ ッ トを使用した。
(第 7図参照）
4) ヒルジ ン変異体分泌発現プラス ミ ドの作製
(a) 制限酵素 EcoB I - Hind ΠΙによるプラ ス ミ ド pMTSHVl? DNA の切断
第 7図②に示すようにヒルジン変異体 HV17分泌発現べクタ一 PMTSHV17 (特願平 3- 63909 号） を制限酵素 EcoR I - Hind HIで分 解し、 ァガロースゲル電気泳動により約 2.2Kb のべクタ一 DNA 断片を分離 ， 精製した。
(b) 制限酵素 EcoB I - Hind fflによる二本鎖 M13SHV19および M13SHV10の切断
二本鎖 M13SHV19 DNA を制限酵素 EcoR I -Hind HIで分解し、 phoAシグナルぺプチ ドおよびヒルジン変異体 HV- 1-9をコ一 ドす る約 250bpの DNA 断片をァガロースゲル電気泳動により分離 - 精製した。 また、 IU3SHV10 DNAより同様にして phoAシグナルぺ プチ ドおよびヒルジ ン変異体 HV-1- 10 をコー ドする約 250bpの DNA 断片精製物を得た。
(c) 分泌発現プラ ス ミ ドへの連結
前記 (a)分解精製物 3.5 1 と上記 (b)の M13SHV19分解精製物と を リ ガ一ゼにより連結したのち、 これで大腸菌 JM109 株を形 質転換し、 変異体発現プラ ス ミ ド PMTSHV19を得た。
また、 同様の方法にて変異体発現プラス ミ ド pHTSHVIOを得た。 塩基配列はサ ンガー等の方法により確認した。 （第 7図参照）
(d) 制限酵素 EcoR I - BamH I による変異体発現プラ ス ミ ドの 切断
上記プラス ミ ド PMTSHV19 約 30 g を制限酵素 EcoR I 70 単 位、 BamH I 70単位を用いて切断した。 phoAシグナルペプチ ドお よびヒルジン変異体 HV-1- 9の N末端部分をコ一ドする約 120bp の D 'A 断片をァガロースゲル電気泳動によ り分離 · 精製した。 同様にして、 ブラ ス ミ ド PMTSHVIO約 30 ^ g を用いてヒルジ ン変 異体 HV- 1-10 の C末端部分を舍む約 2.71(1)の£0；01? 1 - BamH I 断 片精製物を得た。 （第 8図参照）
(e) ヒルジ ン変異体発現プラ ス ミ ド PMTSHV115 の作製 上記 (d)において得られた DNA 断片を T4リ ガ一ゼにより連結し たのち、 これで大腸菌 JM109 株を形質転換し、 ヒルジ ン変異体 発現プラス ミ ド PMTSHV114 を得た。 塩基配列は、 サンガー等の 方法によ り確認した。
このプラ ス ミ ド PMTSHV114 約 17 / g を制限酵素 H i nd IE 96単位、 Kpn I 96単位を用いて切断した。 phoAシグナルべプチ ドおよび ヒルジ ン HV- 1-14 N末端部分をコー ドする DNA 配列を舍む断片 をァガロースゲル電気泳動にて分離 · 精製した。
一方、 プラ ス ミ ド PVCHV3 (特願平 2- 303096号） 約 13 ^ 8を Hind IE84単位、 Kpn I 84単位を用いて切断し、 ヒルジ ン HV-3 C 末端部分をコー ドする DNA 配列およびプロモータ一、 転写停止 シグナルを舍む DN A 断片をァガロースゲル電気泳動にて分離 - 精製した。
上記のよう にして得られた DN A 断片を T4リ ガ一ゼにより連結 したのち、 これで大暍菌 RR1 株を形質転換し、 ヒルジ ン変異体 発現プラス ミ ド PMTSHV115 を得た。 塩基配列は、 サ ンガー等の 方法により確認した。 （第 9図参照）
こ の形質転換した大腸菌を通商産業省工業技術院生命工学研 究所に寄託し、 受託番号 FERM-4413 を得た。
4) ヒルジ ン変異体 HV-1- 15 の単離精製
(a) 形質転換株大腸菌 RRl/pMTSHV115 の培養 上記のよう にして得られた形質転換株 RIH/pMTSHV115を、 100 μ g/wiのア ン ピシ リ ンを舍む 2xTY培地 500fflC/2 £ フ ラ ス コ X
2本で 37て、 24時間の振とう培養を行なった。
(b) 浸透圧ショ ッ ク法によるペリ ブラズム画分の単離 培養終了後、 遠心分離によ り集菌し、 菌体を 25%シユーク ロ ース、 30mM ト リ ス- 塩酸 （pH7.4)、 Im EDTA 1 £ に懸濁し、 室 温で 10分間処理した。 これを遠心分離して得られた菌体を 1 £ の冷水に懸濁し、 4 tで 30分間処理してぺリ ブラズム空間中の 物質を放出させた。 さ らに遠心分離により細胞を除去して得ら れた上清を 0.22 m のフ ィ ルタ一で濾過した。
(c) ヒルジ ン変異体 HV-1- 15 の精製
上記 (b)のよう にして得られた約 1 のペリ ブラズム画分を限 外濾過にて約 100 まで濃縮した。 これを下記の条件にて逆相 HPLCカ ラ ムに負荷、 溶出させ、 分取して凍結乾燥してヒルジ ン 変異体 HV- 1-15 を得た。
装 置 ： ウ ォーターズ社 デルタ プレ ツ プ 3000
カ ラム ： Vydac C4 (4.7 X 30cm)
溶 媒 ： A. 0.05 % ト リ フルォ口酢酸/水
Β. ァセ ト ニ ト リ ル
勾 配 ： Β. 10〜60%、 ノ50分
流 速 ： B. 80ml/min
実施例 Ί
1) ヒルジ ン変異体 HV- 1-16 発現プラ ス ミ ドの構築
上記実施例 5 3) の (c)において得られたプラ ス ミ ド pMTSHV19 と、 プラス ミ ド PMTSHV1C3 (特願平 2- 303096号） とを用いて、 ヒ ルジ ン変異体 HV- 1-16 発現プラス ミ ド PMTSHV116 を構築した。
(a) 制限酵素 BamH I - H i nd ID による変異体発現プラ ス ミ ドの 切断 プラ ス ミ ド PMTSHV19約 6 ^g を制限酵素 BamHI 24ュニ ッ ト、 制限酵素 Hind IE 24ュニ ッ トを用いて切断した。 得られたプロモ 一ター、 phoAシグナルべプチ ドおよびヒルジン変異体 HV- 1 - 9の N未端部分をコー ドする DNA 配列を舍む約 1.75Kbの断片をァガ ロースゲル電気泳動により分離 · 精製した。
一方、 プラ ス ミ ド PMTSHV1C3 も同様に制限酵素 BamHI 及び H i nd ΠΙにて切断した後、 ヒルジ ン HV- 3 C末端部分をコ一 ドする DNA 配列を舍む約 150bp の断片を分離 · 精製した。
(b) ヒルジ ン変異体発現プラ ス ミ ド PMTSHV116 の構築 上記 (a)において得られた DNA 断片を T4リ ガーゼにより連結し たのち、 これで大腸菌 JM109 株を形質転換し、 ヒルジ ン変異体 発現プラス ミ ド PMTSHV116 を得た。 塩基配列は、 サンガー等の 方法により確認した。 （第 10図参照）
この形質転換した大腸菌を通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に寄託し、 受託番号 FERM BP- 4412を得た。
2) ヒルジ ン変異体 HV-1- 16 の単離精製
ヒルジ ン変異体 HV- 1-16 は、 特開平 4-282474号公報に記載さ れているのと同様の方法を用いて精製した。
実施例 8
ヒルジ ン変異体の抗 ト ロ ンビ ン活性の測定
ヒルジ ン変異体 HV- 1-15 及び HV- 1-16 の抗 ト ロ ンビン活性は、 特開平 4- 282474号公報に記載されているのと同様の方法を用い て測定した。 結果を表 3 に示す。
また、 これらのア ミ ノ酸組成を表 4 に示す。 なお、 前記ヒル ジ ン変異体 HV- 1-15 及び HV- 1-16 に加えて、 ヒルジ ン変異体 HV - 1-9 (ヒルジ ン変異体 HV- 1の Val '-Val2-を lieに lie2-に置き換 えたもの） は、 変異体発現プラス ミ ド PMTSHV19により大腸菌 JM 109 株を形質転換して得られた遺伝子組換え微生物を用いて、 ヒルジ ン変異体 HV-1-10(ヒルジ ン変異体 HV- 1の Lys27 を GluZ7 に置き換えたもの） は、 変異体発現プラス ミ ド PMTSHVIOにより 大腸菌 JM109 株を形質転換して得られた遺伝子組換え微生物を 用いて、 ヒルジ ン変異体 HV-1- 14(ヒルジ ン変異体 HV-1の Va - Val2- を lie1 -lie2-に、 Lys27 を Glu27 にそれぞれ置き換えた もの） は、 変異体発現プラス ミ ド PMTSHV114により大腸菌 JM109 株を形質転換して得られた遺伝子組換え微生物を用いて、 それ ぞれの遺伝子組換え微生物を培養し、 その培養菌体及び培地よ り単離精製した。
表 3 ヒルジン変異体の抗トロンビン活性
Hirudins 1-2- ■27- -53 to C- terminus Ki(pM) Kon lO- M-'S-1) Koff XIO S"1) rHV-1 V- V- K- rHV-1 type 0.148±0.009 2.56±0.37 3.78±0.51 rllVlC3 v-v- -K- rHV-3 type 0.0433±0.0008 3.33±0.09 1.44±0.05 rIlV-1-9 I-I- -K - rHV-1 type 0.0743±0.0044 2.58±0.26 1.91±0.12 rHV-1-10 V- V- -E - rHV-1 type 0.237±0.016 2.35±0.16 5.57±0.16 rHV-1-14 I- 1- -E- rHV-1 type 0.0796±0.0038 2.56±0.08 2.04±0.16 *rHV-l-15 I-I- -E- rHV-3 type 0.0226±0.0007 4.00±0.44 0.907±0.130 *rHV - 1- 16 I-I- -K- rHV-3 type 0.0213±0.0006 4.58±0.26 0.976±0.047
表 4
ァ ノ κ HV- 1 HV-1- Π9 HV-1-1U HV小 14 A
πν-1-lo HV-l-l cb
Asx 9 ο ηπ Ω、 o o any o、
o. y · yd uu y * ou uu
Q OA ( A
inr 4 0 Q 、 i ( Α\ Q OO (A \
o.00 4, ο 0· Q y1 4 0.04 4ノ
r ,
oer Q CO ( A\
4 o. Ob 1 0.06 4 o . DD 4
10 >( C 1
b Q、
lX 10 14. DU U4 14. bl 4 10. ίθ 丄 d
bly y Q y . Π UΠU 0、 y， UU y . uu y y♦ uu ノ y Q · π υπυ fQ、
Cys b i 、
0· yu D. Q y1丄 、 ς o 0 · DU vu^ D · uy val QC f<)ヽ
4 、 1
丄 · yb κί) no ( \
丄 * yo KL) lie L し 91 1. yb、乙、 y丄 \ ) 0 70 ( A\
Leu A
4 4.14(4) 4· 1 Λ7 ,0、 ΠΛ 0 ί (4； 4， lo (A) Δ. yu ο)
Tyr L* A uQy (、乙ヽ) Π7 9、 1
L . U4 L) Q 《 ヽ
Phe 1 1.00(1) 1.01(1) 1.01(1) 0.99(1) 1.00(1)
His 1 1.05(1) 1.08(1) 1.03(1) 1.02(1) 0.96(1)
Lys 3 3.07(3) 2.05(2) 2.04(2) 2.01(2) 2.97(3)
Pro 3 3.12(3) 3.21(3) 3.12(3) 4.06(4) 4.53(4)
Ala 1.09(1) 1.00(1)
( ) 内の値は組成値を表す。
110 でで 24時間加水分解を行な た,
※ 使用機器
7 ミ ノ酸分析 ： ァ ミ ノ酸分折計 システム 7300 (ベッ クマン）
Ν末端配列 ： 477 Α プロティ ンシークェ ンサ一
(アプライ ドバイオシステムズ社） こ の表 3 から、 本発明のヒ ルジ ン変異体、 特に H V - 1 - 1 5 , H V - 1 - 1 6は、 本出願人が先に提案した高抗 ト ロ ンビン活性のヒ ルジ ン変異体である H V 1 C 3 に比べてより高い抗 ト ロ ンビン活性を示 すこ とがわかる。
実施例 9
ヒルジン変異体を舍有する製剤
実施例 4 で得られたヒルジ ン変異体精製物をセ フ ア デ ッ ク ス G25 (フ ア ルマ シア製） によ り脱塩した後、 0. 22 m のフ ィ ルタ 一により無菌濾過した。 こ の溶液を凍結乾燥し、 得られた粉末 を生理食塩水で溶解する こ とにより、 注射剤と して使用する こ とができる製剤を得た。 なお、 上記の具体例においては、 本発明の新規なヒ ルジン変 異体のう ち、 ア ミ ノ酸配列の改変により特徴付けられた 2つの 群をそれぞれ代表するヒルジ ン変異体及びその製造方法に関し て述べたが、 その 2 つの群の何れにも属する ヒ ルジ ン変異体は、 上記の製造方法に準じて、 そのア ミ ノ酸配列に即して、 当該ァ ミ ノ酸配列を有するポリ ぺプチ ドをコ一 ドする DN A 配列の調製 し、 更にその DNA 配列を舍む発現ベクターを構築する こ とは、 当業者においては、 上記の具体例に記す内容のみで充分に行え る こ とである。 加えて、 その 2つの群の何れにも属する ヒ ルジ ン変異体は、 2 つの群それぞれの特徴であるスク シ ンィ ミ ド体 或は 転移体の形成による ヒ ルジン類縁体への変換が抑制され る特徴と、 抗 ト 口 ンビン活性、 特に ト 口 ンビンとの複合体を形 成する反応速度が上昇する特徴とを兼ね備える ものである こ と は、 具体的な例示を行うまでもな く 明白である。 更には、 本発 明の新規なヒ ルジ ン変異体は、 その抗 ト ロ ンビン活性を生む生 理的機構はァ ミ ノ酸配列の高い類似性を有する ヒ ルジ ン変異体 HV1C3 と同じである こ とは明白であり、 且つ抗凝血剤と しての 薬理的作用 （その活性の大小に差異があるのみで、 ） 並びに代 謝活性も極めて類似する こ とも明白である。
産業上の利用可能性
本発明は、 新規なヒルジ ン変異体を提供する ものである。 本発明のヒルジ ン変異体は、 従来のヒルジ ン変異体 HV1C3 に く らべて抗 ト ロ ンビ ン活性が高く 、 また保管中スク シ ンイ ミ ド 体又は /?転移体の形成による薬理活性の低下を防ぎ、 抗凝血剤 と して有用なものである。
寄託された微生物への言及
1. E.coli JM109/PCX397 N
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所）
住 所 ： 日本国茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 7 6
2. E.coli JM109/PCX397 Nl
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所）
住 所 ： 日本国茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄託 B ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 7 7
. E.coli JM109/pCX397 N2
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P — 3 9 7 8
E.coli JM109/PCX397 N3
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所）
住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 7 9
E.col i JM109/pCX397 NA
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 8 0
E.col i JM109/pCX397 NA1
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P — 3 9 8 1
E.coli JM109/PCX397 NA2
寄 託 機 閬
名 称 ·· 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 8 2
E.col i JM109/PCX397 NA3
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） .
住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P — 3 9 8 3
E.col i JM109/pCX397 DA
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F' E R M B P— 3 9 8 4
E.coli JM109/PCX397 DAI
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P 3 9 8 5
E.coli JM109/PCX397 DA2
寄 託 機 閔
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 8 6
E.coli J 109/pCX397 DA3
Figure imgf000042_0001
名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(現 生命工学工業技術研究所） 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄託日 ： 平成 4年 （ 1992年） 8月 2 6 日
受託番号 ： F E R M B P - 3 9 8 7
E.coli JM109/PMTSHV116
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 5年 （ 1993年) 9月 1 7 日
受託番号 ： F E R M B P — 4 4 1 2
E.coli RRl/pMTSHV115
寄 託 機 関
名 称 ： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住 所 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3号 寄託日 ： 平成 5年 （ 1993年） 9月 1 7 日
受託番号 ： F E R M B P — 4 4 1 3
配列表
配列番号 1
配列の長さ 65または 66
配列の型 ア ミ ノ酸
鎖の数 一本鎮
トポ口ジ一 直鎖状
配列の種類 ぺプチ ド
Al A2 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly
5 10 Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn
15 20 Val Cys Gly Gin Gly Asn A3 Cys lie Leu
25 30 Gly Ser A4 A5 A6 A7 Asn Gin Cys Val
35 40 Thr Gly Glu Gly Thr Pro し ys Pro Gin Ser
45 50 His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro lie Pro
55 60
Glu A8 A9 A10 Asp Glu
65
Al ： Val または lie
A2 ： Val または lie
A3 ： Lys または Glu
A4 ： Asp, Asn または Gin
A5 ： Ala または G】y
A6 ： Glu または Lys
A7 ： Lys または Asp A8 ： Asp または Glu
A9 ： Ala, Tyrまたは結合
A10:Tyr または Leu
A9または A10 のいずれかは Tyr
配列番号
配列の長さ 390 乃至 396
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
トポ口ジ一 直鎖状
配列の種類 ヒ ノレジン DNA
GTT GTA TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC CAA CAT ATG TGA CTA ACA TGA CTT AGA CCG
CAG AAC CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC
GTC TTG CAC ACA GAC ACA CTT CCT AGG TTG
GTT TGT GGT CAG GGT AAC ΛΑΑ TGT ATC CTC
CAA ACA CCA GTC CCA TTG TTT ACA TAG GAG
GGG TCT (1) (2) (3) (4) AAC CAG TGT GTT
CCC AGA TTG GTC ACA CAA
ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT
TGA CCA CTT CCA TGG GGC TTT GGC GTC AGA
CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG ATC CCG GTA TTG GTC CCA CTA AAG CTT GGC TAG GGC GAA (5) (6) (7) GAT GAA
CTT CTA CTT
(式中、 （1)は GAT AAC または CAG を、 （2)は GCT または GGT を、
CTA, TTG GTC CGA CCA
(3)は GAA または AAAを、 （4)は AAGまたは GAT を、 （5)は GAC
CTT TTT TTC CTA CTG または GAA を、 （6)は GCG TAC または結合を、 （7)は TACまたは CTG
CTT CGC, ATG ATG 'GAC をそれぞれ表す。 ）
配列番号 3
配列の長さ 396
配列の型 核酸
鎖の数 二本鎖
トポ口ジ一 直鎖状
配列の種類 ヒ ノレジン DNA
ATC ATC TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC TAG TAG ATG TGA CTA ACA TGA CTT AGA CCG
CAG AAC CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC GTC TTG GAC ACA GAC ACA CTT CCT AGG TTG
GTT TGT GGT CAG GGT AAC (1) TGT ATC CTC CAA ACA CCA GTC CCA TTG ACA TAG GAG
GGG TCT GAT GGT GAA AAG AAC CAG TGT GTT CCC AGA CTA CCA CTT TTC TTG GTC ACA CAA
ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT TGA CCA CTT CCA TGG GGC TTT GGC GTC AGA
CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG ATC CCG GTA TTG GTC CCA CTA AAG CTT GGC TAG GGC
GAA GAC GCG TAC GAT GAA CTT CTG CGC ATG CTA CTT
(式中、 （1)は、 AAA または GAA を表す）
TTT CTT

Claims

請 求 の 範 囲
1. 次の一般式 I により表されるア ミ ノ酸配列を有する ヒルジ ン変異体。
H Al A2 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly
Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn
Val Cys Gly Gin Gly Asn A3 Cys lie Leu
Gly Ser A4 A5 A6 A7 Asn Gin Cys Val
Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser
His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro He Pro
Glu A8 A9 A10 Asp Glu OH 〔 I 〕
(式中、 Alは Val または lie を、 A2は Val または lie を、 A3 は Lys または Glu を、 A4は Asp 、 Asn または Gin を、 A5は Ala または Gly を、 A6は Glu または Lys を、 A7は Lys または Asp を、 A8は Asp または Glu を、 A9は/ Ha, Tyr または結合を、 A10は Tyr または Leu をそれぞれ表し、 かつ A9または A10のいずれかは Tyr である。 ）
2. 一般式 I により表されるァ ミ ノ酸配列を有するポリ ぺプチ ドをコー ドする DM A 配列を有する DNA 。
3. プロモータ一、 シグナルペプチ ドをコー ドする DNA 配列、 一般式 I により表されるア ミ ノ酸配列を有するポリ ペプチ ドを コー ドする DNA 配列、 転写停止シグナルを含む DNA 配列及び複 製開始シグナルを舍む DNA 配列を含んでなる ヒルジ ン変異体発 現べクタ一。
4. 請求の範囲 3 に記載の新規なヒルジ ン変異体発現ベク ター によ り形質転換されている遺伝子組換え微生物。
5. 請求の範囲 4 に記載の遺伝子組換え大腸菌を培養し、 その 培養菌体及び培地から一般式 I により表されるァ ミ ノ酸配列を 有する新規なヒルジ ン変異体を採取する こ とを特徴とする ヒル ジ ン変異体の製造方法。 .
6. 一般式 I により表されるア ミ ノ酸配列を有する新規なヒル ジン変異体の少な く とも 1 種を有効成分と して舍有する抗凝血 剤。
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