WO1991014777A1 - Isoform of platelet-derived growth factor a chain - Google Patents

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WO1991014777A1
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pdgf
growth factor
platelet
amino acid
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PCT/JP1991/000381
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Japanese (ja)
Inventor
Ryozo Nagai
Kenichi Nakahara
Makoto Kuroo
Original Assignee
Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to platelet-derived growth factor A protein (Platelet).
  • PDGF-AJ -Derived growth factor A Chain
  • Platelet-derived growth factor is a protein purified from platelet suspension as a growth factor for smooth muscle and fibroblasts released from platelets, and contains two proteins called A-chain and B-chain. It has a structure in which the peptide chains are linked by S—S bonds.
  • PDGF-A a component of PDGF, has potent growth factor activity on mesenchymal cells and is thought to play an important role in the development of atherosclerosis.
  • the cDNA of PDGF-A has been cloned from human glioma cells, human endothelial cells and ovule cells, and the nucleotide sequence of the cDNA encoding PDGF-A and The amino acid sequence of PDGF-A has been elucidated (Nature, 32, 695-6999 (19986), Nature, 32, 619-62) (1989), Science, 241, 1223 to 1225 (19888), etc.).
  • PDGF-A As a result of comparing the amino acid sequences of the revealed PDGF-A, PDGF-A cloned from human glial cells and PDGF-A cloned from human endothelial cells were compared.
  • the amino acid sequence from the amino terminus to the 107th amino acid is the same, and the amino acid sequence near the C-terminal part from the 108th position is different.
  • PDGF-A from endothelial cells with short carboxy terminus is abbreviated as PDGF-A1
  • PDGF-A from glioma cells with long carboxy terminus is abbreviated as PDGF-A2.o
  • PDGF-A showed high homology in its amino acid sequence to PDGF-A2 derived from human glioma, and was included in the group of PDGF-A2.
  • the growth factor activity of PDGF-A on mesenchymal cells depends on the structure of the carboxyl terminus. This part (the part after the 108th position) is short, and PDGF-A1 is long. It is known to have a remarkably low activity as compared to (Nature, 328, 621-1624 (19987)).
  • An object of the present invention is to provide a novel isoform of PDGF-A having a structure different from that of PDGF-A and having strong growth factor activity.
  • Another object of the present invention is to provide a DNA encoding a novel isoform of PDGF-A.
  • the present invention relates to a novel PDGF-A isoform (PDGF-A3) and a precursor protein of the PDGF-A isoform (pro and prebu oral bodies) It is.
  • the present invention also relates to a DNA containing a DNA sequence encoding the PDGF-A isoform of the present invention and a precursor protein (pro-form and prebu-form) of the PDGF-A isoform. It is.
  • FIG. 1 shows an outline of P1 (PDGF-A1) cDNA and P3 (PDGF-A3) cDNA cloned from the fetal avian aorta.
  • the 222 bp cDNA shows the same DNA sequence in P1 and P3 that encode PDGF-A, and the 8 'bp of P1 and the 110 bp of P3 on the 3' end side.
  • DNA shows the DNA sequence of the non-common part.
  • the 60 bp and 204 bp of the 5 'end of P1 are a DNA sequence encoding a signal peptide and a DNA sequence encoding a propeptide, respectively ⁇ Show.
  • Figure 2 is coded by PIc DNA
  • the white triangle indicates the connection site between the signal peptide and the propeptide
  • the black triangle indicates the connection site between the propeptide and PDGF-A1.
  • the single underline indicates a portion that differs from the amino acid sequence of the previously reported propeptide.
  • the double underline indicates the carboxy terminus different from PDGF-A3.
  • Fig. 3 is coded by P3cDNA.
  • This figure shows the amino acid sequence and base sequence of the PDGF-A isoform (PDGF-A3) precursor protein.
  • the white triangle indicates the connection site between the signal peptide and the propeptide
  • the black triangle indicates the connection site between the propeptide and PDGF-A3.
  • the single underline indicates a portion that differs from the amino acid sequence of the previously reported propeptide.
  • the double underlined part is a carboxy terminal different from PDGF-A1.
  • Fig. 4 shows the same PDGF-A gene in vivo.
  • FIG. 3 schematically shows a process in which PDGF-A1 and PDGF-A3 are prepared by selective plating, respectively.
  • FIG. 5 shows the C-terminus of PDGF-A3 of the present invention, human glioma PDGF-A and PDGF-A This is a comparison of amino acid sequences near the part.
  • amino acid is represented by a three-letter code
  • DNA base is represented by a one-letter code
  • the PDGF-A isoform of the present invention has an amino acid sequence of the following formula [I] at the carboxyl terminal or a sequence identical to a part of the amino acid sequence. And a peptide having a function substantially the same as that of the amino acid sequence of the following formula [I] at the carboxyl terminal.
  • ProG1yG1yVa1HisPr0G1nG1yCysLeuArgA1aHisAsG1yCysG1nSerSerArgA sn H is M et G 1 n A 1 a L eu G 1 y T r PL ys Lys Lys M et CI
  • the polypeptide represented by the amino acid sequence of the above formula [I] binds to the amino acid at the 108th position or later counted from the terminal. What is being done is preferred.
  • the amino acid sequence other than the carboxy terminus may be a known amino acid sequence of PDGF-A derived from human endothelial cells, human glioma cells or ovule cells [Nature, 320, 6 9 5-6 9 9 (1 9 8 6), Nature, 3 2 8, 6 1 9-6 2 1 (1 9 8 7);
  • aminoic acid derived from the fetal aorta of the egret embryo cloned according to the present invention may be an array.
  • L eu G 1 u G 1 u H is L e ⁇ G 1 u C ys A 1 a C ys A 1 a A 1 a Serser A 1 a G 1 y P r 0 G 1 ⁇ H is
  • the cysteine residue may exist in a reduced state, or may be in a oxidized state, that is, a molecule between two cystine residues by disulfide bond. Of these, an S-S bond may be formed.
  • one or more independent or continuous amino acids may be deleted, inserted or substituted. Good.
  • the peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention is not particularly limited, and this probeptide and the PDGF-A isoform of the present invention are referred to.
  • the PDGF-A isoform of the present invention is converted from the precursor protein of the PDGF-A isoform by the action of the protease. Anything that can guide the team will do.
  • such a peptide is represented by the following formula:
  • Examples include polypeptides consisting of 68 amino acids represented by [III], but are not particularly limited to these polypeptides, as long as they have the same function.
  • one or more independent or continuous amino acids near the amino terminal site may be deleted, inserted or substituted.
  • the signal peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention has a function of promoting secretion of the PDGF-A isoform into and out of a host cell.
  • a host cell There is no particular limitation.
  • a polypeptide consisting of 20 amino acids represented by the following formula [IV] is exemplified. Also has a similar function As long as it has, one or more independent or continuous amino acids may be deleted, inserted or substituted.
  • propeptides and signal peptides bind to the amino acid terminus of PDGF-A isoform to form a precursor protein of PDGF-A isoform.
  • the PDGF-A isoform and the propeptide combine to form a pro-PDGF-A isoform
  • the pro-PDGF-A isoform and the signal The peptides combine to form a pre-pro PDGF-A isoform.
  • the PDGF-A isoform of the present invention and a DNA containing a DNA sequence encoding a precursor protein thereof The PDGF-A isoform of the present invention is coded.
  • DNA containing a DNA sequence having a PDGF-A isoform having the amino acid sequence of the above formula [I] at the carboxy terminus is a DNA containing a DNA sequence encoding a PDGF-A isoform.
  • DNA sequence encoding the PDGF-A isoform at the carboxy terminus Contains DNA. This DNA encodes the PDGF-A isoform of the present invention and can express the PDGF-A isoform of the present invention when introduced into a suitable host cell. Any DNA may be used.
  • CTGCCATCTGCAAGACCAGGA CGGTCATTTACGAGATACCTC GGAGTCAGGTGGACCCCACGT CGGCC AA CTTCCTGATCTGGCCGCCGTG CGTGGAGGTCAAGCGCTGCAC CGGCTGTTGCAACACCAGCAG CGTC AA GTGCCAGCCCTCGCGGGTGCA CCACCGCAGCGTCAAGGTGGC CAAGGTGGAGT AT GTCAGAAAGAAGCCCAAGTTG AAAGAAGTGCAGGTGCGGCTG GAGGAGCACCTGGAGTGCGCG TGCGCGGCCTCGAGCGCGGGC CCGGAGCACCGCGAGGAGGAG GCAGGGACCCTCCTGCCCGCG CCTGGTGGCGTCCATCCTCAG GGTTGCCTCAG AGCCCACGATGGCTGCCAGAG C
  • a DNA sequence encoding an acid sequence can be used when the PDGF-A isoform of the present invention is produced by a genetic engineering method.
  • Such a DNA sequence encodes the amino acid sequence of the above formula [I] or an amino acid sequence identical to a part of the amino acid sequence, and comprises the PDGF-A isoform of the present invention. Any DNA sequence may be used as long as it can express the form.
  • PDGF PDGF of the present invention.
  • DNA sequence of the portion coding for the propeptide in such DNA examples include those represented by the following formula [VI].
  • the polypeptide of the formula [IV] consisting of the 20 amino acids described above as a specific example of the signal peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention.
  • the DNA containing the DNA sequence encoding the polypeptide may be any that encodes the polypeptide and can express the PDGF-A isoform precursor protein of the present invention. Any type of DNA may be used.
  • the DNA sequence of the portion encoding such a signal peptide in DNA is represented by the following formula [H]. Is exemplified.
  • DNA containing a DNA sequence encoding the PDGF-A isoform as described above can be prepared from cDNA, the triester method, the phosphophyte method, or the like. It can be prepared using a usual method such as a method of chemically synthesizing using the method.
  • the method for preparing a DNA containing the DNA sequence encoding the PDGF-A isoform of the present invention will be described with reference to the method for preparing from cDNA as an example.
  • Preparation, 2 PDGF — can be carried out by appropriately combining conventional methods such as selection of a cDNA clone containing a DNA sequence that encodes the A-isoform. You.
  • Preparation of the DNA library can be performed according to a conventional method. For example, total RNA is extracted from the fetal blood vessel of an animal according to a conventional method, and the extracted RNA is passed through an oligo (dT) cellulose column to purify poly (A) RNA. Obtained m Let the RNA be type II, and let the double-stranded DNA be, for example,
  • Selection of cDNA clones containing the DNA sequence encoding the PDGF-A IT form from the DNA library can be performed by plaque hybridization using a phage vector. Method (Maniates et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
  • the probe used for screening is a known PDGF-A Synthetic oligonucleotides of 40- to 60-mer prepared with reference to the nucleotide sequence of the isoform can be used.
  • a clone to be hybridized is selected using the probe, the recombinant phage DNA (or recombinant plasmid DNA) is prepared according to a conventional method, and the inserted cD
  • the nucleotide sequence of the NA fragment was determined by the dideoxythiene terminator method (Sager, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (19777)) or the Determined by the Girno coat method (Methods in Enzymology, _6_5_, 497 (1980)).
  • the thus obtained cDNA sequence DNA encoding PDGF-A isoform or open reading frame of PDGF-A isoform precursor protein After the DNA is introduced into an appropriate expression vector, host cells (such as Escherichia coli, yeast, and Bacillus subtilis) are transformed using the obtained recombinant plasmid. The transformant is cultured to express the PDGF-A isoform of the present invention or its precursor protein.
  • the obtained PDGF-A isoform or its precursor protein of the present invention can be isolated and purified by a conventional method for isolating and purifying a physiologically active substance. It can be.
  • RNA was extracted from the aorta extirpated from a 4 week gestational heron embryo kept at 70 ° C according to the thermal phenol method.
  • the extracted RNA was prepared according to the method of Maniatis et al.
  • the recovered DNA was used as a 50 a1 reaction solution (67 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 6.7 mM magnesium chloride, 1 mM 2_mercaptoethanol, 3 3 / Md NTP, 2 units of Klenow fragment (manufactured by Boehringer Mannheim)]] at 37 ° C for 1 hour to blunt the cDNA fragment. Terminated. 50 blunt-ended cDNA fragments
  • the cDNA fragment was Ec0RI terminated.
  • Ec0RI-terminated cDNA fragment was treated with EcoRI and alkaline phosphatase; IZap DNA was mixed, and the reaction mixture was mixed at 50 / zl [66 mM tris-HCl Buffer (H7.6), 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, 0.1 mM ATP, 100 units of T4 DNA ligase] at 16 ° C for 12 hours I let it.
  • This reaction solution was subjected to ADNA Invitrono II according to the method of Williams et al. (Genetic Engineering, 2, PI enum Press (1989)). Invitrono, using a packaging kit (in vitro Packaging kit (manufactured by Aramasham)). Escherichia coli Y1088 (ATCC No. 37195) was transduced to prepare a cDNA library of 5 ⁇ 105 or more.
  • a plaque hybridizer probed with a 50-mer oligonucleotide synthesized from PDGF-A Screening was carried out using the molecular method (Molecular Cloning, described above). As a result, 2 plaques were pro portion and hives re Dizu in 2 X 1 0 5 plaques. Recombinant phage DNA was prepared from the probe and hybridized clones according to the plate lysate method (Molecular cloning, described above).
  • the inserted Ec0RI fragment was obtained from Plasmidec Yuichi pBluescript SK (-) (Nucleic Acide Res., 12, 70-35 to 7056 (1994)): Stratagene was subcloned and structural analysis was performed by digestion with various restriction enzymes. As a result of the analysis, the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment of two clones, P1 and P3, having different restriction enzyme cleavage maps was determined by the dideoxythiamine terminus method (Sanger, F., et al. , Pro Nat 1. Acad.
  • P1 has a total length of 1 In Kb, a signal peptide consisting of a 5 'untranslated region and 20 amino acids, followed by a propane peptide consisting of 68 amino acids and a PDGF-A isoform It encodes a PDGF-A isoform precursor protein consisting of (see Figure 1).
  • This precursor protein of PDGF-A is cleaved by peptide enzyme between arginine, the 68th amino acid, and the next threonine, resulting in 110 amino acids. It was thought to be secreted as PDGF-A, which is composed of amino acids (see Fig. 2).
  • This PDGF-A isoform is derived from human endothelial cell-derived PDGF-A isoform (Tong B. D et al, Nature, 328, 619-621, (19) 87))) and 90% homology, and the carboxyl termini of both were identical. Therefore, this PDGF-A isoform is considered to belong to the group of PDGF-A1.
  • P 3 has a total length of 2 Kb
  • P3 As shown in (PDGF-A3), the coding at the 5 'end was initiated from the middle of the PDGF-A precursor protein.
  • P3 also encodes the 60 bp and 204 bp DNA sequences encoding the same signal peptide and propeptide as P1 at 5 ′. It has been clarified that it has the terminal side.
  • P3 is between the 5 'end and the 386th base, that is, from the N-terminal of the final mature PDGF-A to the 107th amino acid Is the nucleotide sequence and amino acid sequence Both were completely consistent with those of P 1.
  • the amino acid sequence between the 387th base and the 497th base of P3 is a specific sequence not present in P1, and the 498th base is not present in P1.
  • the amino acid sequences of P1 and P3 were identical.
  • the PDGF-A encoded by P1 becomes a carboxyl-terminus with the sequence of aspartic acid mono-arginine after the 108th amino acid, whereas P3 After diverging from the common part with P1, PDGF-A becomes a carboxyl terminus with 38 amino acid sequences (see Fig. 3).
  • P1 and P3 are generated by selective splicing from the same PDGF-A gene, and the nucleotide sequence specific to P3 is PDGF-A It may be coded by an independent exon in the gene (see Fig. 4).
  • the PDGF-A3 force coded by this P3 is the PDGF-A isoform of the present invention.
  • P D G F A has been used to date as a human immunoglobulin (Nature, 320, 695-699 (19986)), endothelial cells
  • PDGF-A 3 is the previously reported PDGF — It was completely different from the Aisoform (A1 or A2) in the structure of the carboxyl terminus. PDGF-A2 is also expressed in egg cells and shows high homology with the human glioma PDGF-A2 (see Fig. 5). This is probably because the peculiar structure of the carboxyl terminus of PDGF-A3 derived from the egret blood vessel is not due to the species difference but to the origin of the blood vessel.
  • PDGF-A has potent growth factor activity on mesenchymal cells and is thought to play an important role in the development of atherosclerosis.
  • the growth factor activity of PDGF-A depends on the structure of the carboxyl terminus, and the shorter PDGF-A1 is much less active than the longer PDGF-A2 This is known (Nature, 328,
  • PDGF-A3 also exhibits unique growth factor activity and expression patterns, and is useful as a reagent for studying the development of atherosclerosis.
  • PDGF-A isoform precursor protein has a different amino acid sequence from previously reported human PDGF-A precursor protein. Two amino acids, alanine-proline, have been inserted. For this reason, the precursor protein of the PDGF-A isoform derived from blood vessels of the present invention is useful for preparing a specific antibody against the precursor protein, and the precursor protein is used as the precursor protein.
  • the DNA to be coded is the genetic engineering technique of the present invention.

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Abstract

A cDNA which codes for PDGF-A3, a novel isoform of the platelet-drived growth factor A chain, has now been cloned from the rabbit fetus aorta. The PDGF-A3 has an amino acid sequence different from that of the known platelet-derived growth factor A chain at the C-terminus thereof and is thought to have a specific growth factor activity against mesenchyme cells.

Description

明 細 書 血小板由来増殖因子 A鎮ァイ ソ フ ォ ーム 技術分野  Description Platelet-derived growth factor A isoform Technical field
本発明は、 血小板由来増殖因子 A鎮 （Platelet  The present invention relates to platelet-derived growth factor A protein (Platelet).
-derived growth factor A Chain, 以下、 「 P D G F - A J と略称する こ と もある） の新規なァイ ソ フ ォ ーム ( Isoform ) 及びそれをコー ドする D N Aに関する も の である。 -Derived growth factor A Chain (hereinafter sometimes abbreviated as "PDGF-AJ") and a new isoform and the DNA encoding it.
背景技術 Background art
血小板由来増殖因子 （ P D G F ) は血小板から放出さ れる平滑筋や線維芽細胞に対する増殖因子と して血小板 浮遊液から精製されたタ ンパク質であ り、 A鎖、 B鎖と 呼ばれる 2本のポ リ ペプチ ド鎖が S — S結合で結合した 構造を有している。  Platelet-derived growth factor (PDGF) is a protein purified from platelet suspension as a growth factor for smooth muscle and fibroblasts released from platelets, and contains two proteins called A-chain and B-chain. It has a structure in which the peptide chains are linked by S—S bonds.
P D G Fの構成成分である P D G F— Aは間葉系細胞 に対して強力な増殖因子活性を有し、 動脈硬化の発症に 重要な役割を演じている と考えられている。  PDGF-A, a component of PDGF, has potent growth factor activity on mesenchymal cells and is thought to play an important role in the development of atherosclerosis.
従来、 ヒ ト グリ オ一マ細胞 （human glioma cell ) 、 ヒ ト内皮細胞および力エル卵細胞から P D G F — Aの c D N Aがク ローニングされ、 P D G F— Aをコー ドす る c D NAの塩基配列および P D G F— Aのァ ミ ノ酸配 列が明らかにされている （Nature, 3 2 0 , 6 9 5〜 6 9 9 ( 1 9 8 6 ) 、 Nature, 3 2 8 , 6 1 9〜 6 2 1 ( 1 9 8 7 ) 、 Science ， 2 4 1 , 1 2 2 3〜 1 2 2 5 ( 1 9 8 8 ) な ど参照） 。 Conventionally, the cDNA of PDGF-A has been cloned from human glioma cells, human endothelial cells and ovule cells, and the nucleotide sequence of the cDNA encoding PDGF-A and The amino acid sequence of PDGF-A has been elucidated (Nature, 32, 695-6999 (19986), Nature, 32, 619-62) (1989), Science, 241, 1223 to 1225 (19888), etc.).
これら明らかにされた P D G F — Aのア ミ ノ酸配列を 比較した結果、 ヒ ト グリ オ一マ細胞から ク ローニングさ れた P D G F — A と ヒ ト内皮細胞から ク ローニ ングされ た P D G F — Aはァ ミ ノ 末端から数えて 1 0 7番目のァ ミ ノ酸までのア ミ ノ 酸配列は同一であ り、 1 0 8 番目以 降の C末端部付近のァ ミ ノ酸配列が異なる こ とが明らか にされた。 このため、 P D G F — Aには 2 つのアイ ソ フ オームが存在する と考えられている。 短いカルボキシ末 端を持つ内皮細胞由来の P D G F — Aは P D G F — A 1 と、 長いカルボキシ末端を持つグリ オ一マ細胞由来の P D G F — Aは P D G F — A 2 とそれぞれ略称されてい る o  As a result of comparing the amino acid sequences of the revealed PDGF-A, PDGF-A cloned from human glial cells and PDGF-A cloned from human endothelial cells were compared. The amino acid sequence from the amino terminus to the 107th amino acid is the same, and the amino acid sequence near the C-terminal part from the 108th position is different. Was revealed. For this reason, it is thought that there are two isoforms in PDGF-A. PDGF-A from endothelial cells with short carboxy terminus is abbreviated as PDGF-A1, and PDGF-A from glioma cells with long carboxy terminus is abbreviated as PDGF-A2.o
また、 力エルの卵細胞からク ローニングされた  It was also cloned from the egg cell
P D G F — Aはそのア ミ ノ酸配列において ヒ ト グリ オ一 マ由来の P D G F — A 2 と高い相同性を示し、 P D G F 一 A 2 のグループに含まれる ものであった。  PDGF-A showed high homology in its amino acid sequence to PDGF-A2 derived from human glioma, and was included in the group of PDGF-A2.
P D G F — Aの持つ間葉系細胞に対する増殖因子活性 はカルボキシル末端部の構造に依存し、 この部分 （ 1 0 8 番目以降の部分） が短い P D G F — A 1 はこ の部分が 長い P D G F — A 2 に比して著し く 低活性である こ と力 知られている （Nature, 3 2 8 , 6 2 1 〜 6 2 4 ( 1 9 8 7 ) ) 。  The growth factor activity of PDGF-A on mesenchymal cells depends on the structure of the carboxyl terminus. This part (the part after the 108th position) is short, and PDGF-A1 is long. It is known to have a remarkably low activity as compared to (Nature, 328, 621-1624 (19987)).
発明の開示 したがって、 本発明の目的は従来報告されているDisclosure of the invention Therefore, the object of the present invention has been reported previously.
P D G F— Aとは異なる構造を有し、 強力な増殖因子活 性を有する P D G F— Aの新規なァイ ソ フ ォ ームを提供 する こ とを目的とする ものである。 An object of the present invention is to provide a novel isoform of PDGF-A having a structure different from that of PDGF-A and having strong growth factor activity.
本発明の他の目的は、 P D G F— Aの新規なアイ ソ フ オ ームをコー ドする D N Aを提供する こ とを目的とする ものである。  Another object of the present invention is to provide a DNA encoding a novel isoform of PDGF-A.
すなわち、 本発明は、 新規な P D G F— Aアイ ソ フ ォ ーム （ P D G F — A 3 ) および該 P D G F— Aアイ ソ フ オ ームの前駆体蛋白質 （プロ体およびプレブ口体） に関 する ものである。 また、 本発明は上記の本発明の P D G F — Aアイ ソ フ オームおよび該 P D G F— Aアイ ソ フ ォームの前駆体蛋白質 （プロ体およびプレブ口体） をコー ドする D N A配列を含有する D N Aに関する もの である。  That is, the present invention relates to a novel PDGF-A isoform (PDGF-A3) and a precursor protein of the PDGF-A isoform (pro and prebu oral bodies) It is. The present invention also relates to a DNA containing a DNA sequence encoding the PDGF-A isoform of the present invention and a precursor protein (pro-form and prebu-form) of the PDGF-A isoform. It is.
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
第 1 図はゥサギ胎児大動脈よ り ク ロ一ニングされた P 1 ( P D G F— A l ) c D N A , P 3 ( P D G F - A 3 ) c D N Aの概要を示したものである。  FIG. 1 shows an outline of P1 (PDGF-A1) cDNA and P3 (PDGF-A3) cDNA cloned from the fetal avian aorta.
3 2 2 bpの c D N Aは P D G F — Aをコー ドする P 1 と P 3 における同一の D NA配列部分を示し、 3 ' 末端 側の P 1 の 8 bp及び P 3 の 1 1 0 bpの c D N Aは非共通 部分の D NA配列を示す。 P 1 の 5 ' 末端側の 6 0 bp及 び 2 0 4 b pは、 それぞれシグナルペプチ ドをコー ドする D N A配列及びプロペプチ ドをコー ドする D N A配列 ^ 示す。 The 222 bp cDNA shows the same DNA sequence in P1 and P3 that encode PDGF-A, and the 8 'bp of P1 and the 110 bp of P3 on the 3' end side. DNA shows the DNA sequence of the non-common part. The 60 bp and 204 bp of the 5 'end of P1 are a DNA sequence encoding a signal peptide and a DNA sequence encoding a propeptide, respectively ^ Show.
第 2図は P I c D NAによ り コー ドされている  Figure 2 is coded by PIc DNA
P D G F— Aアイ ソ フ ォ ーム （ P D G F— A 1 ) 前駆体 蛋白質のァ ミ ノ 酸配列と塩基配列を示したものである。 It shows the amino acid sequence and base sequence of the PDGF-A isoform (PDGF-A1) precursor protein.
白い三角はシグナルぺプチ ドとプロべプチ ドとの連結 部位を示し、 黒い三角はプロペプチ ドと P D G F— A 1 との連結部位を示す。 一重の下線部分は従来報告されて いるプロべプチ ドのァ ミ ノ酸配列と相違する部分を示す。 二重の下線部分は P D G F— A 3 と相違するカルボキシ 末端を示す。  The white triangle indicates the connection site between the signal peptide and the propeptide, and the black triangle indicates the connection site between the propeptide and PDGF-A1. The single underline indicates a portion that differs from the amino acid sequence of the previously reported propeptide. The double underline indicates the carboxy terminus different from PDGF-A3.
第 3図は P 3 c D N Aによ り コー ドされてレ、る  Fig. 3 is coded by P3cDNA.
P D G F— Aァイ ソ フ ォ ーム （ P D G F— A 3 ) 前駆体 蛋白質のァ ミ ノ酸配列と塩基配列を示した ものである。 This figure shows the amino acid sequence and base sequence of the PDGF-A isoform (PDGF-A3) precursor protein.
白い三角はシグナルぺプチ ドとプロべプチ ドとの連結 部位を示し、 黒い三角はプロペプチ ドと P D G F— A 3 との連結部位を示す。 一重の下線部分は従来報告されて いるプロべプチ ドのァ ミ ノ酸配列と相違する部分を示す。 二重の下線部分は P D G F — A 1 と相違するカルボキシ 末 ¾：不す o  The white triangle indicates the connection site between the signal peptide and the propeptide, and the black triangle indicates the connection site between the propeptide and PDGF-A3. The single underline indicates a portion that differs from the amino acid sequence of the previously reported propeptide. The double underlined part is a carboxy terminal different from PDGF-A1.
第 4 図は生体内で同一の P D G F— A遺伝子から  Fig. 4 shows the same PDGF-A gene in vivo.
P D G F— A 1 と P D G F— A 3がそれぞれ選択的スプ ライ シ ン グによ り調製される過程を模式的に示 した もの である。  FIG. 3 schematically shows a process in which PDGF-A1 and PDGF-A3 are prepared by selective plating, respectively.
第 5 図は本発明の P D G F— A 3、 ヒ ト グリ オ一マ P D G F — Aおよび力エル卵細胞 P D G F— Aの C末端 部付近のァ ミ ノ酸配列を比較したものである。 FIG. 5 shows the C-terminus of PDGF-A3 of the present invention, human glioma PDGF-A and PDGF-A This is a comparison of amino acid sequences near the part.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明を詳細に説明する。  Hereinafter, the present invention will be described in detail.
なお、 本明細書においては、 ア ミ ノ酸は 3文字記号に よ り、 また D NAの塩基は 1文字記号 （Nucleic Acid In this specification, amino acid is represented by a three-letter code, and DNA base is represented by a one-letter code (Nucleic Acid
Research, 1 3， 3 0 2 1 - 3 0 3 0 ( 1 9 8 5 ) ； 及 び The Biochemical Journal, 2 1 9， No 2 , 3 4 5 - 3 7 3 ( 1 9 8 4 ) 〕 によ り表示する。 Research, 13, 30 21-30-30 (1985); and The Biochemical Journal, 2 19, No 2, 345-373 (1984)]. Display.
I . 本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームおよびその前 駆体蛋白質  I. PDGF-A Isoforms and Precursor Proteins of the Invention
本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームはそのカ ルボキ シル末端に下記式 〔 I〕 のア ミ ノ酸配列を有する もの、 または該ア ミ ノ酸配列の一部と同 じ配列を有し、 かつ下 記式 〔 I 〕 のア ミ ノ酸配列の保有する機能と実質的に同 一の機能を有するぺプチ ドをカルボシキル末端に有する ものである。  The PDGF-A isoform of the present invention has an amino acid sequence of the following formula [I] at the carboxyl terminal or a sequence identical to a part of the amino acid sequence. And a peptide having a function substantially the same as that of the amino acid sequence of the following formula [I] at the carboxyl terminal.
G 1 y T h r L e u L e u P r 0 A 1 aG 1 y T h r L e u L e u P r 0 A 1 a
P r o G 1 y G 1 y V a 1 H i s P r 0 G 1 n G 1 y C y s L e u A r g A 1 a H i s A s G 1 y C y s G 1 n S e r S e r A r g A s n H i s M e t G 1 n A 1 a L e u G 1 y T r P L y s L y s L y s M e t C I ProG1yG1yVa1HisPr0G1nG1yCysLeuArgA1aHisAsG1yCysG1nSerSerArgA sn H is M et G 1 n A 1 a L eu G 1 y T r PL ys Lys Lys M et CI
特に 上記式 〔 I 〕 のア ミ ノ 酸配列で表わされるポ リ ぺプチ ドがァ ミ ノ 末端から数えて 1 0 8番目以降に結合 されている ものが好ま しい。 尚、 カルボキシ末端以外の ア ミ ノ 酸配列は、 公知の ヒ ト内皮細胞、 ヒ ト グ リ オ一マ 細胞あるいは力エル卵細胞由来の P D G F — Aのァ ミ ノ 配列 [Nature, 3 2 0 , 6 9 5 - 6 9 9 ( 1 9 8 6 ) , Nature, 3 2 8 , 6 1 9 - 6 2 1 ( 1 9 8 7 ) ； In particular, the polypeptide represented by the amino acid sequence of the above formula [I] binds to the amino acid at the 108th position or later counted from the terminal. What is being done is preferred. The amino acid sequence other than the carboxy terminus may be a known amino acid sequence of PDGF-A derived from human endothelial cells, human glioma cells or ovule cells [Nature, 320, 6 9 5-6 9 9 (1 9 8 6), Nature, 3 2 8, 6 1 9-6 2 1 (1 9 8 7);
Science ， 2 4 1 , 1 2 2 3 - 1 2 2 5 ( 1 9 8 8 ) 〕 と同 じものでも よ く 、 また本発明によ ってク ローニング されたゥサギ胎児大動脈由来のァ ミ ノ酸配列でも よい。  Science, 241, 1223-122 (1988)], and aminoic acid derived from the fetal aorta of the egret embryo cloned according to the present invention. It may be an array.
そのよ うなァイ ソ フ ォームを具体的に例示すれば、 下 記式 〔 II〕 で表わされる ものを例示する こ とができる。  If such an isoform is concretely illustrated, one represented by the following formula [II] can be exemplified.
1  1
T h r I 1 e G 1 u G 1 u A 1 a I 1 e T h r I 1 e G 1 u G 1 u A 1 a I 1 e
P r 0 A 1 a I 1 e C y s L y s T h rP r 0 A 1 a I 1 e C y s L y s T h r
A r g T h r V a 1 I 1 e T y r G 1 uA r g T h r V a 1 I 1 e T y r G 1 u
I 1 e P r 0 A r g S e r G 1 n V a 1I 1 e P r 0 A r g S e r G 1 n V a 1
A s P P r 0 T h r S e r A 1 a A s nA s P P r 0 T h r S er A 1 a A s n
P h e L e u I 1 e T r P P r 0 P r 0P h e L e u I 1 e T r P P r 0 P r 0
C y s V a 1 G 1 u V a 1 L y s A r gC y s V a 1 G 1 u V a 1 L y s A r g
C y s T h r G 1 y c y s C y s A s nC y s T h r G 1 y c y s C y s A s n
T h r S e r S e r V a 1 L y s C y sT h r S e r S e r V a 1 L y s C y s
G 1 n P r 0 S e r A r g V a 1 H i sG 1 n P r 0 S e r A r g V a 1 H i s
H i s A r g S e r V a 1 L y s V a 1H i s A r g S e r V a 1 L y s V a 1
A 1 a L y s V a 1 G 1 u T y r V a 1A 1 a L y s V a 1 G 1 u T y r V a 1
A r g L y s L y s P r 0 L y s L e uA r g L y s L y s P r 0 L y s L e u
L y s G 1 u V a 1 G 1 n V a 1 A r gL y s G 1 u V a 1 G 1 n V a 1 A r g
L e u G 1 u G 1 u H i s L e υ G 1 u C y s A 1 a C y s A 1 a A 1 a S e r s e r A 1 a G 1 y P r 0 G 1 υ H i sL eu G 1 u G 1 u H is L e υ G 1 u C ys A 1 a C ys A 1 a A 1 a Serser A 1 a G 1 y P r 0 G 1 υ H is
A r g G 1 u G 1 u G 1 u A 1 a G 1 yA r g G 1 u G 1 u G 1 u A 1 a G 1 y
T h r L e u L e u P r 0 A 1 a P r 0T h r L e u L e u P r 0 A 1 a P r 0
G 1 y G 1 y V a 1 H i s P r o G 1 nG1yG1yVa1HisProG1n
G 1 y c y s L e υ A r g A 1 a H i sG 1 y c y s L e υ A r g A 1 a H i s
A s P G 1 y C y s G 1 n S e r S e rA s P G 1 y C y s G 1 n S e r S E r
A r g A s n H i s e t G 1 n A 1 aA r g A s n H i s e t G 1 n A 1 a
L e u G 1 y T r P L y s L y s L y sL e u G 1 y T r P L y s L y s L y s
M e t 〔 I〕 M e t [I]
上記式 〔II〕 中 システィ ン残基は、 還元された状態で 存在して も よ く また、 酸化された状態、 すなわち ジス ルフ ィ ド結合によ り 2個のシスティ ン残基の間で分子内 S — S結合を形成されていて も よい。 また、 式 〔 I〕 の ァイ ソ フ ォ ーム と同様の機能を有する ものであれば 1 個 または複数個の独立または連続したア ミ ノ酸が欠失、 揷 入または置換されていて も よい。 In the above formula [II], the cysteine residue may exist in a reduced state, or may be in a oxidized state, that is, a molecule between two cystine residues by disulfide bond. Of these, an S-S bond may be formed. In addition, as long as it has the same function as the isoform of the formula [I], one or more independent or continuous amino acids may be deleted, inserted or substituted. Good.
本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質 中のプロべプチ ドは特に制限されず、 こ のプロべプチ ド と本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォ ーム との連結部位が ぺプチターゼ等のプロテア一ゼの作用部位とな り、 プロ テアーゼの作用によ り P D G F— Aアイ ソ フ ォ ームの前 駆体蛋白質から本発明の P D G F— Aアイ フ フ オ ームを 導ける も のであればよい。  The peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention is not particularly limited, and this probeptide and the PDGF-A isoform of the present invention are referred to. Of the PDGF-A isoform of the present invention is converted from the precursor protein of the PDGF-A isoform by the action of the protease. Anything that can guide the team will do.
具体的に、 こ の よ う なプロペプチ ドと しては下記式 〔 III〕 で表わされる 6 8 個のア ミ ノ酸からなるポ リ ぺプ チ ドが例示されるが、 特にこのポ リ べプチ ドに限定され ず、 同様の機能を有する ものであれば、 特にア ミ ノ 末端 部位付近の 1 個または複数個の独立または連続したァ ミ ノ酸が欠失、 挿入または置換されている ものであって も よい。 Specifically, such a peptide is represented by the following formula: Examples include polypeptides consisting of 68 amino acids represented by [III], but are not particularly limited to these polypeptides, as long as they have the same function. In particular, one or more independent or continuous amino acids near the amino terminal site may be deleted, inserted or substituted.
G 1 u G 1 u P r 0 G 1 y I 1 e P r 0 G 1 u G 1 u P r 0 G 1 y I 1 e P r 0
A r g G 1 u V a 1 L e u A s P A r gA r g G 1 u V a 1 L e u A s P A r g
L e u A l a A r g S e r G 1 n I 1 e H i s S e r I 1 e A r g A s P L e uL e u A l a A r g S e r G 1 n I 1 e H i s S e r I 1 e A r g A s P L e u
G i n A r g L e u L e u G 1 u I 1 eG in A r g L e u L e u G 1 u I 1 e
A s S e r V a 1 G 1 y A 1 a G 1 uA s S e r V a 1 G 1 y A 1 a G 1 u
A s A l a P r 0 G 1 u P r 0 S e rA s A l a P r 0 G 1 u P r 0 S e r
L e u A r g A 1 a P r o G 1 y V a 1 H i s T h r A 1 a A r g H i s V a 1LeuArgA1aProG1yVa1HisThrA1aArgHisVa1
A l a G 1 u L y s P r 0 P r 0 A 1 aA l a G 1 u L y s P r 0 P r 0 A 1 a
P r o V a 1 P r 0 V a 1 A r S A r gP r o V a 1 P r 0 V a 1 A r S A r g
L y s A r g c m ) L y s A r g c m)
また、 本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォ ームの前駆体 蛋白質中のシグナルペプチ ドは P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームの宿主細胞内外への分泌を促す機能を有する もので あれば特に制限されない。  In addition, the signal peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention has a function of promoting secretion of the PDGF-A isoform into and out of a host cell. There is no particular limitation.
具体的に、 このよ う なシグナルぺプチ ドと しては下記 式 〔 IV〕 で表わされる 2 0 個のア ミ ノ酸からなるポ リ べ プチ ドが例示されるが、 該ポ リ ベプチ ドも同様の機能を 有する ものであれば、 1個または複数個の独立または連 続したァ ミ ノ酸が欠失、 挿入または置換されている も の であっても よい。 Specifically, as such a signal peptide, a polypeptide consisting of 20 amino acids represented by the following formula [IV] is exemplified. Also has a similar function As long as it has, one or more independent or continuous amino acids may be deleted, inserted or substituted.
M e t A r g T h r L e u A l a C y s A r g L e u L e u L e u G 1 y C y s G 1 y T y r L e u A l a H i s V a 1 L e u A l a 〔IV〕  M e t A r g T h r L e u A l a C y s A r g L e u L e u L e u G 1 y C y s G 1 y T y r L e u A l a H i s V a 1 L e u A l a (IV)
これらのプロべプチ ドおよびシグナルぺプチ ドは P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームのア ミ ノ酸末端に結合する こ と によ り P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質 を構成する。 すなわち、 P D G F— Aァイ ソ フ ォ ーム と プロべプチ ドが結合してプロ P D G F— Aアイ ソ フ ォ 一 ムを構成し、 プロ P D G F— Aァイ ソ フ ォ ーム と シグナ ルぺプチ ドが結合してプレプロ P D G F— Aアイ ソ フ ォ ームを構成する。  These propeptides and signal peptides bind to the amino acid terminus of PDGF-A isoform to form a precursor protein of PDGF-A isoform. Is configured. That is, the PDGF-A isoform and the propeptide combine to form a pro-PDGF-A isoform, and the pro-PDGF-A isoform and the signal The peptides combine to form a pre-pro PDGF-A isoform.
II. 本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームおよびその前 駆体蛋白質をコー ドする D NA配列を含有する D NA 上記本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォームをコ 一 ドす る D NA配列を含有する D NAは、 カルボキシ末端に上 記式 〔 I 〕 のア ミ ノ酸配列を有する P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームをコー ドする D NA配列を含有する D NA、 ま たは該ア ミ ノ酸配列の一部と同 じ配列を有し、 かつ上記 式 〔 I 〕 のア ミ ノ 酸配列の保有する機能と実質的に同一 の機能を有するぺプチ ドをカルボキシ末端に有する P D G F— Aアイ ソ フ ォ ームをコー ドする D N A配列を 含有する D NAである。 こ の D NAは本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォームをコー ドし、 適当な宿主細胞中に導 入した時に本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームを発現 し得る ものであればいずれの D N Aでも よい。 II. The PDGF-A isoform of the present invention and a DNA containing a DNA sequence encoding a precursor protein thereof The PDGF-A isoform of the present invention is coded. DNA containing a DNA sequence having a PDGF-A isoform having the amino acid sequence of the above formula [I] at the carboxy terminus is a DNA containing a DNA sequence encoding a PDGF-A isoform. Or a peptide having the same sequence as a part of the amino acid sequence, and having substantially the same function as the amino acid sequence of the above formula [I]. DNA sequence encoding the PDGF-A isoform at the carboxy terminus Contains DNA. This DNA encodes the PDGF-A isoform of the present invention and can express the PDGF-A isoform of the present invention when introduced into a suitable host cell. Any DNA may be used.
このよ う な D NA中の本発明の P D G F — Aアイ ソ フ オームをコー ドする部分の D N A配列の具体的一例と し ては下記式 〔 V〕 で表わされる ものを挙げる こ とができ る o  As a specific example of the DNA sequence of the portion encoding the PDGF-A isoform of the present invention in such a DNA, one represented by the following formula [V] can be mentioned. o
5 ' ― A C G A T C G A G G A A G C C A T T C  5 '― A C G A T C G A G G A A G C C A T T C
C T G C C A T C T G C A A G A C C A G G A C G G T C A T T T A C G A G A T A C C T C G G A G T C A G G T G G A C C C C A C G T C G G C C AA C T T C C T G A T C T G G C C G C C G T G C G T G G A G G T C A A G C G C T G C A C C G G C T G T T G C A A C A C C A G C A G C G T C AA G T G C C A G C C C T C G C G G G T G C A C C A C C G C A G C G T C A A G G T G G C C A A G G T G G A G T AT G T C A G A A A G A A G C C C A A G T T G A A A G A A G T G C A G G T G C G G C T G G A G G A G C A C C T G G A G T G C G C G T G C G C G G C C T C G A G C G C G G G C C C G G A G C A C C G C G A G G A G G A G G C A G G G A C C C T C C T G C C C G C G C C T G G T G G C G T C C A T C C T C A G G G T T G C C T C A G A G C C C A C G A T G G C T G C C A G A G C CTGCCATCTGCAAGACCAGGA CGGTCATTTACGAGATACCTC GGAGTCAGGTGGACCCCACGT CGGCC AA CTTCCTGATCTGGCCGCCGTG CGTGGAGGTCAAGCGCTGCAC CGGCTGTTGCAACACCAGCAG CGTC AA GTGCCAGCCCTCGCGGGTGCA CCACCGCAGCGTCAAGGTGGC CAAGGTGGAGT AT GTCAGAAAGAAGCCCAAGTTG AAAGAAGTGCAGGTGCGGCTG GAGGAGCACCTGGAGTGCGCG TGCGCGGCCTCGAGCGCGGGC CCGGAGCACCGCGAGGAGGAG GCAGGGACCCTCCTGCCCGCG CCTGGTGGCGTCCATCCTCAG GGTTGCCTCAG AGCCCACGATGGCTGCCAGAG C
T C C A G A A A T C A C A T G C A A G C C C T G G G C T G G A A G A A G A A G A T G - 3 ' T C C A G A A A T C A C A T G C A A G C C C T G G G C T G G A A G A A G A A G A T G-3 '
〔 V〕 また、 本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォームのカルボ キシ末端に相当する上記式 〔 I 〕 のア ミ ノ 酸配列または 該ァ ミ ノ 酸配列の一部と同一のァ ミ ノ 酸配列をコ一 ドす る D N A配列は、 本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォ ーム を遺伝子工学的方法によ り製造する場合に利用する こ と ができ る。 このよ う な D N A配列は上記式 〔 I 〕 のア ミ ノ 酸配列または該ァ ミ ノ酸配列の一部と同一のァ ミ ノ 酸 配列をコー ドし、 本発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォ ーム を発現し得る ものであればいずれの D N A配列であって も よい。  [V] In addition, the amino acid sequence of the above formula [I] corresponding to the carboxy terminal of the PDGF-A isoform of the present invention or an amino acid identical to a part of the amino acid sequence A DNA sequence encoding an acid sequence can be used when the PDGF-A isoform of the present invention is produced by a genetic engineering method. Such a DNA sequence encodes the amino acid sequence of the above formula [I] or an amino acid sequence identical to a part of the amino acid sequence, and comprises the PDGF-A isoform of the present invention. Any DNA sequence may be used as long as it can express the form.
このよ う な D N A配列の具体的一例と しては下記式 ί Ι で表される ものを挙げる こ とができ る。  As a specific example of such a DNA sequence, one represented by the following formula (II) can be mentioned.
_5 '_ - G G G A C C C T C C T G C C C G C G C C T G G T G G C G T C C A T C C T C A G G G T T G C C T C A G A G C C C A C G A T G G G C T G C C A C A G C T C C A G A A A T C A C A T G C A A G C C C T G G G C T G G A A G A A G A A G A T G 一 3 ' { I ) 本発明の P D G F — Aアイ フ フ オ ームの前駆体蛋白質 のプロべプチ ドの具体例と して挙げた前述の 6 8 個のァ ミ ノ 酸からなる式 〔 IE〕 のポ リ ペプチ ドをコー ドする D N A配列を含有する D N A と しては、 該ポ リ ペプチ ド をコー ド し、 本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォームの前 駆体蛋白質を発現し得る ものであればいずれの D NAで め つ こ お よレヽ ο _5'_-GGGACCCTCCTGCCCGCGCCT GGTGGCGTCCATCCTCAGGGT TGCCTCAGAGCCCACGATGGG CTGCCACAGCTCCAGAAATCA CATGCAAGCCCTGGGCTGGAA GAAGAAGATG 13 '(I) PDGF of the present invention. The DNA containing the DNA sequence encoding the polypeptide of the formula [IE] consisting of an amino acid of the formula: And any DNA that can express the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention may be used.
このよ う な D NA中のプロべプチ ドをコ一 ドする部分 の D N A配列と しては下記式 〔VI〕 で表わされる ものが 例示される。  Examples of the DNA sequence of the portion coding for the propeptide in such DNA include those represented by the following formula [VI].
5 / - G A G G AA C C C G G G A T C C C C C 5 / -GAGG AA CCCGGGATCCCCC
G C G A G G T G C T G G A C A G G C T C G C C C G C A G C C A G A T C C A C A G C A T C C G G G A C C T G C A G C G G C T C C T G G A G A T T G A C T C C G T A G G G G C T G A G G A C G C T C C G G A G C C G A G C C T G A G A G C C C C C G G C G T C C A C A C G G C C A G G C A T G T G G C C G A G AA G C C G C C A G C G C C G G T G C C C G T G C G G A G G A A G C G T - _3_ _ 〕 G C G A G G T G C T G G A C A G G C T C G C C C G C A G C C A G A T C C A C A G C A T C C G G G A C C T G C A G C G G C T C C T G G A G A T T G A C T C C G T A G G G G C T G A G G A C G C T C C G G A G C C G A G C C T G A G A G C C C C C G G C G T C C A C A C G G C C A G G C A T G T G G C C G A G AA G C C G C C A G C G C C G G T G C C C G T G C G G A G G A A G C G T - _3_ _]
本発明の P D G F— Aァイ ソ フ ォームの前駆体蛋白質 中のシグナルペプチ ドの具体例と して挙げた前述の 2 0 個のァ ミ ノ酸からなる式 〔IV〕 のポ リ べプチ ドをコ一 ド する D N A配列を含有する D NAと しては、 該ポ リ ぺプ チ ドをコ一 ドし本発明の P D G F— Aアイ ソ フ ォームの 前駆体蛋白質を発現し得る も のであればいずれの D NA であっても よい。  The polypeptide of the formula [IV] consisting of the 20 amino acids described above as a specific example of the signal peptide in the precursor protein of the PDGF-A isoform of the present invention. The DNA containing the DNA sequence encoding the polypeptide may be any that encodes the polypeptide and can express the PDGF-A isoform precursor protein of the present invention. Any type of DNA may be used.
このよ う な D N A中のシグナルぺプチ ドをコ一 ドする 部分の D N A配列と しては下記式 〔H〕 で表わされる も のが例示される。 The DNA sequence of the portion encoding such a signal peptide in DNA is represented by the following formula [H]. Is exemplified.
5 ' - A T G A G G A C C T T G G C T T G C C  5 '-A T G A G G A C C T T G G C T T G C C
G G C T G C T C C T C G G C T G C G G A T A C C T C G C C C A T G T T C T G G C C - CM) G G C T G C T C C T C G G C T G C G G A T A C C T C G C C C A T G T T C T G G C C-CM)
I II. 本発明の P D G F — Aアイ ソ フ オ ームおよ びその 前駆体蛋白質、 並びにそれらをコー ドする D N A配列 を含有する D N Aの調製  I II. Preparation of PDGF-A Isoforms and Precursor Proteins of the Present Invention, and DNAs Containing DNA Sequences Encoding them
上記したよ う な P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームをコー ド する D N A配列を含有する D N Aは、 c D N Aから調製 する方法、 ト リ エステル法、. フ ォス フ ァ イ ト法な どの方 法を用いて化学的に合成する方法な どの通常の方法を用 いて調製する こ とができ る。  DNA containing a DNA sequence encoding the PDGF-A isoform as described above can be prepared from cDNA, the triester method, the phosphophyte method, or the like. It can be prepared using a usual method such as a method of chemically synthesizing using the method.
たとえば、 c D N Aから調製する方法を例に挙げて本 発明の P D G F — Aァイ ソ フ ォームをコー ドする D N A 配列を含有する D N Aの調製を説明すれば、 ① c D N A ラ イ ブラ リ 一の調製、 ②目的とする P D G F — Aァイ ソ フ オ ームをコ一 ドする D N A配列を含有する c D N A ク ロー ンの選出等の常法を適宜組み合わせる こ と よ り実施 する こ とができ る。  For example, the method for preparing a DNA containing the DNA sequence encoding the PDGF-A isoform of the present invention will be described with reference to the method for preparing from cDNA as an example. Preparation, ② PDGF — can be carried out by appropriately combining conventional methods such as selection of a cDNA clone containing a DNA sequence that encodes the A-isoform. You.
① c D N Aラ イ ブラ リ ーの調製  ① Preparation of c DN A library
c D N A ラ ィブラ リ 一の調製は常法に従って行う こ と ができ る。 たとえば、 動物胎児の血管よ り常法に従い全 R N Aを抽出 し、 これをオ リ ゴ （ d T ) セルロースカ ラ ムに通液し、 ポ リ （ A ) R N Aを精製する。 得られた m R NAを鐯型と して、 2本鎮 c D NAを、 たとえば Preparation of the DNA library can be performed according to a conventional method. For example, total RNA is extracted from the fetal blood vessel of an animal according to a conventional method, and the extracted RNA is passed through an oligo (dT) cellulose column to purify poly (A) RNA. Obtained m Let the RNA be type II, and let the double-stranded DNA be, for example,
Gubler -Hoffman 法 ( Gubler, U. and Hoffman, J.， Gubler-Hoffman method (Gubler, U. and Hoffman, J.,
Gene, —2 5， 2 6 3 ( 1 9 8 3 ) ) 、 Okayama - Berg法 ( Okayaraa, H. and Breg, P.， Mol. Cell Biol., 1 6 1 ( 1 9 8 2 ) ) な どの通常の方法を用いて合成する。 合成した c D NAから c D NAライブラ リ ーの調製は、 i Z a pな どのフ ァ ージベク タ一を用レ、るイ ン ビ ト ロノ、。 ッ ケ—ジン グ （in vitro packaging) 法 ( Short, J. M et al, Nucleic acids Res. , 1 6_, 7 5 8 3〜 7 6 0 0 ( 1 9 8 8 ) ) 、 プラス ミ ドベク タ一を用レ、る Gene, —25, 26 3 (198 3)), Okayama-Berg method (Okayaraa, H. and Breg, P., Mol. Cell Biol., 16 1 (198 2)) Synthesize using normal methods. Preparation of the cDNA library from the synthesized cDNA is performed using an invitrono, such as an iZap or other facsimile vector. Packaging (in vitro packaging) method (Short, J. M et al, Nucleic acids Res., 16_, 7583-760 (1998)), Plasmid vector Use
Okayama- Berg法 （前記） な どの通常の方法を用いて行う こ とができ る。  It can be performed using a normal method such as the Okayama-Berg method (described above).
② c D N Aライブラ リ ーからの ク ロー ンの選出および 塩基配列の決定  ② Selection of clone from cDNA library and determination of nucleotide sequence
c D NAライブラ リ 一から P D G F— Aアイ ツ フ ォ ー ムをコ一 ドする D N A配列を含有する c D NAク ロ一 ン の選出は、 フ ァ ージベク ターを用いるプラー クハイプ リ ダイゼ一シ ヨ ン法 ( Maniates et al. , Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,  Selection of cDNA clones containing the DNA sequence encoding the PDGF-A IT form from the DNA library can be performed by plaque hybridization using a phage vector. Method (Maniates et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York ( 1 9 8 2 ) ) 、 ま たはプラス ミ ドベク タ一を用いるコ ロニーハイプリ ダイ ゼ―シ ヨ ン法 ( Perbal, B. , A Practical Guide to Molecular cloning, John Wiley &Sons， New York ( 1 9 8 4 ) ) を用いて行う こ とができ る。 ス ク リ ーニング の際に使用するプローブと しては、 既知の P D G F— A ァイ ソ フ ォ ームの塩基配列を参考に して作製した 4 0〜 6 0 mer の合成オ リ ゴヌ ク レオチ ドな どを使用する こ と ができ る。 該プローブを用いてハイブ リ ダィズする ク ロ ー ンを選出 し、 その組換え体フ ァ ージ D N A (または、 組換え体プラス ミ ド D N A) を常法に従って調製し、 揷 入された c D NA断片の塩基配列をジデォキシチエイ ン ター ミ ネータ一法 （Sager, F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 7 4， 5 4 6 3 ( 1 9 7 7 ) また はマ クサム一ギルノくー ト法 （ Methods in Enzymology, _6_5_， 4 9 7 ( 1 9 8 0 ) ) によ り決定する。 Cold Spring Harbor, New York (1992)), or the colony-hyperidase method using plasmid vectors (Perbal, B., A Practical Guide to Molecular cloning, John Wiley & Sons). , New York (1994)). The probe used for screening is a known PDGF-A Synthetic oligonucleotides of 40- to 60-mer prepared with reference to the nucleotide sequence of the isoform can be used. A clone to be hybridized is selected using the probe, the recombinant phage DNA (or recombinant plasmid DNA) is prepared according to a conventional method, and the inserted cD The nucleotide sequence of the NA fragment was determined by the dideoxythiene terminator method (Sager, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (19777)) or the Determined by the Girno coat method (Methods in Enzymology, _6_5_, 497 (1980)).
決定された D N A塩基配列に対応した c D NAのコ一 ドする蛋白質のァ ミ ノ酸配列 と従来報告されている  Previously reported as the amino acid sequence of the protein encoding cDNA corresponding to the determined DNA base sequence
P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームのア ミ ノ酸配列とを比較し て、 c D N Aのコー ドする蛋白質が P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームまたはその前駆体蛋白質である こ とを確認する。 By comparing the amino acid sequence of PDGF-A isoform, it was confirmed that the protein encoded by the cDNA was PDGF-A isoform or its precursor protein. Confirm.
このよ う に して得られた c D N Aカヽら P D G F — Aァ イ ソ フ ォ ームまたは P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームの前駆 体蛋白質のオープン リ ーディ ン グフ レームをコー ドする D N Aを調製し、 この D NAを適当な発現べク タ一に導 入後、 得られた組換えプラス ミ ドを用いて宿主細胞 （大 腸菌、 酵母、 枯草菌な ど） を形質転換する。 こ の形質転 換体を培養し、 本発明の P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームま たはその前駆体蛋白質を発現させる。 得られた本発明の P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームまたはその前駆体蛋白質は、 通常の生理活性物質の単離精製法によ り単離精製する こ とができ る。 The thus obtained cDNA sequence DNA encoding PDGF-A isoform or open reading frame of PDGF-A isoform precursor protein After the DNA is introduced into an appropriate expression vector, host cells (such as Escherichia coli, yeast, and Bacillus subtilis) are transformed using the obtained recombinant plasmid. The transformant is cultured to express the PDGF-A isoform of the present invention or its precursor protein. The obtained PDGF-A isoform or its precursor protein of the present invention can be isolated and purified by a conventional method for isolating and purifying a physiologically active substance. It can be.
実施例 Example
以下、 実施例を示し、 本発明をよ り具体的に説明する。 (1) 血管由来 P D G F— Aァイ ソ フ ォ ームをコ一 ドす る D NA配列を含有する c D NAク ロー ンの単離 (1- a) c D NAライブラ リ 一の調製  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. (1) Isolation of cDNA clone containing DNA sequence encoding blood vessel-derived PDGF-A isoform (1-a) Preparation of cDNA library
一 7 0 °Cに保冷しておいた妊娠 4週間目のゥサギ胎児 よ り摘出 した大動脈から熱フ エ ノ ール法に従って R N A を抽出 した。 抽出 した RNAは、 Maniatisらの方法  RNA was extracted from the aorta extirpated from a 4 week gestational heron embryo kept at 70 ° C according to the thermal phenol method. The extracted RNA was prepared according to the method of Maniatis et al.
( Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ( 1 9 8 2 ) ) に従って、 オ リ ゴ （ d T ) セルロースク ロマ ト グラ フ ィ ーを行い、 ポ リ （ A ) R N Aを精製した。 精製したポリ （ A )  Purify poly (A) RNA by performing oligo (dT) cellulose chromatography according to (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1992)). did. Purified poly (A)
R NAを用いて、 Gubler— Hoffman法 ( Gene, 2 5， 2 6Using the RNA, Gubler-Hoffman method (Gene, 25, 26)
3 ( 1 9 8 3 ) ) に従って、 2本鎖 c D NAを調製した 第 1 鎖は、 プライマー と してオ リ ゴ （ d T ) 1 2 — 1 83 (19983)), the first strand of which double-stranded cDNA was prepared was used as a primer for oligo (dT) 12 — 18
(フ ア ル-マシア社經） を用レ、、 Avian myeloblastosis virus の逆転写酵素 （ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム社製） を 使用 して作製した。 第 2鎖は、 RNase H (ベ一 リ ンガー マ ンハイ ム社製） および D N Aポ リ メ ラーゼ I (ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム社製） を使用 して合成した。 作製した 2本鎖 c D NA 2 〃 gを 5 0 〃 1 の反応液 〔 1 0 O mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ pH 7. 5 ) 、 2 mMジチオス レイ ト —ル （ D T T) 、 1 0 mM E D T A、 8 0 M S—ァ デノ シル メ チォニ ン、 1 0 (]11 の £ c 0 R I メ チラ 一ゼ (ベー リ ンガーマ ンハイ ム社製） 〕 中 3 7 °C、 1 時間処 理し、 エタ ノ ール沈澱によ り D N Aを回収した。 回収し た D N Aは 5 0 a 1 の反応液 〔 6 7 mMリ ン酸カ リ ウム緩 衝液 （ pH 7 . 4 ) 、 6 . 7 mM塩化マグネ シウム、 1 mM 2 _ メ ルカプ トエタ ノ ール、 3 3 / M d N T P、 2 unitの ク レ ノ ー フ ラ グメ ン ト （ベー リ ンガ一マ ンノヽィ 厶 社製） 〕 中、 3 7 °Cで 1 時間反応させ、 c D N A断片を 平滑末端化した。 平滑末端化した c D N A断片を 5 0 (Pharmacia), using Avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Belinger Mannheim). The second strand was synthesized using RNase H (manufactured by Behringer Mannheim) and DNA polymerase I (manufactured by Behringer Mannheim). 2 g of the prepared double-stranded cDNA was added to a reaction solution of 50-1 [100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 mM dithiothreitol (DTT), 0 mM EDTA, 80 MS—adenosylmethionine, 10 (] 11 £ c 0 RI methylase (Manufactured by Boehringer Mannheim)] at 37 ° C for 1 hour, and DNA was recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA was used as a 50 a1 reaction solution (67 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 6.7 mM magnesium chloride, 1 mM 2_mercaptoethanol, 3 3 / Md NTP, 2 units of Klenow fragment (manufactured by Boehringer Mannheim)]] at 37 ° C for 1 hour to blunt the cDNA fragment. Terminated. 50 blunt-ended cDNA fragments
1 の反応液 〔 6 6 mMト リ ス —塩酸緩衝液 （ pH 7 . 6 ) 、 Reaction solution (1) [66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6)
6 . 6 mM塩化マグネ シウム、 1 0 mM D T T、 0 . 1 mM A T P、 1 0 O unitの T 4 D N A リ ガーゼ （ベー リ ンガ —マ ンハイ ム社製） 、 1 0 ngZ〃 1 の p E c o R I リ ン 力 一 （ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム社製） 〕 中 1 2 °C、 1 2 時間処理し、 エタ ノ ールで沈殿させて D N Aを回収後、 5 0 1 の反応液 〔 1 0 O mMト リ ス—塩酸緩衝液 （pH 7 . 5 ) 、 7 mM塩化マグネシウム、 5 0 mM 塩化ナ ト リ ゥ ム、 7 mM 2 — メ ノレカ プ トエタ ノ ール、 0 . 0 1 %ゥ シ 血清アルブ ミ ン、 2 0 リ!1 の £ (： 0 1^ 1 (ベー リ ンガー マ ンハイ ム社製） 〕 中、 3 7 °Cで 2 時間処理し、 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, 0.1 mM ATP, 10 O units of T4 DNA ligase (Boehringer-Mannheim), 10 ngZ〃1 pEco RI Lin (manufactured by Behringer Mannheim)] at 12 ° C for 12 hours, precipitate with ethanol and collect DNA, and then use the reaction mixture (501) O mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride, 7 mM 2 — Menolecaptoethanol, 0.01% Serum albumin, treated at 37 ° C for 2 hours in 20 l! 1 of £ (: 0 1 ^ 1 (manufactured by Boehringer Mannheim))
c D N A断片を E c 0 R I 末端化した。  The cDNA fragment was Ec0RI terminated.
反応液中の過剰の E c 0 R I リ ンカ一は、 セフ ア デッ ク ス （ Sephadex) G - 1 0 0 を充塡したカ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ 一によ り 除去した。  Excess Ec0RI linker in the reaction solution was removed by column chromatography with Sephadex G-100.
λ Z a p ( Short, J. M. et at, Nucleic acids Res.， 1 6 ， 7 5 8 3 〜 7 6 0 0 ( 1 9 8 8 ) ) D N A l / g を反応液 2 0 〃 1 C l O O mMト リ スー塩酸緩衝液 （pH 7. 5 ) 、 7 mM塩化マグネ シウム、 5 0 mM 塩化ナ ト リ ゥ ム、 7 mM 2 — メ ルカ プ トエタ ノ ーノレ、 0. 0 1 %ゥ シ 血清アルブ ミ ン、 2 0 unitの E c 0 R I 〕 中、 3 7で、 2時間処理し、 エタ ノ ールで沈澱させて D NAを回収後、 反応液 2 0 1 〔 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) 、 1 unitの大腸菌アルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ （ベー リ ンガ —マ ンハイ ム社製） 〕 中、 3 7で、 2時間処理し、 フ エ ノ ール一 ク ロ 口ホルム抽出およびエタノ ール沈澱を行つ て、 D NAを回収した。 λ Z ap (Short, JM et at, Nucleic acids Res., 16, 758 3 〜 7600 (1988)) DNA l / g The reaction solution is 20 01 Cl OO mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride, 7 mM 2-Methylcaptoethanol , 0.01% ゥ serum albumin, 20 units of Ec0RI], treated with 37 for 2 hours, precipitated with ethanol to recover DNA, 0 1 [1 M Tris-HCl buffer (PH8.0), 1 unit of E. coli alkaline phosphatase (Boehringer-Mannheim)], 37, 2 hours After treatment, DNA was collected by phenol-closed-hole extraction and ethanol precipitation.
E c 0 R I 末端化した c D NA断片と E c o R I およ びアルカ リ フ ォスフ ァ ターゼ処理した ； I Z a p D NA を混合 し、 反応液 5 0 /z l 〔 6 6 mMト リ ス ー塩酸緩衝液 ( H 7. 6 ) 、 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mM D T T， 0 . 1 mM A T P、 1 0 0 uni tの T 4 D N A リ ガーゼ〕 中、 1 6 °Cで 1 2時間反応させた。 こ の反応液 を、 Williamsらの方法 （Genetic Engineering , 2 , PI enum Press ( 1 9 8 0 ) ) に準じて、 A D N Aイ ン ビ ト ロ ノヽ。ッ ケ一ジングキ ッ ト （in vitro Packaging kit (ァ マ シ ャ ム社製） ） を使用 して、 イ ン ビ ト ロ ノ、。 ッ ケ一 ジ ン グを行い、 大腸菌 Y 1 0 8 8 ( A T C C No. 3 7 1 9 5 ) を形質導入し、 5 X 1 0 5 以上の c D NAライブラ リ ーを作製した。 Ec0RI-terminated cDNA fragment was treated with EcoRI and alkaline phosphatase; IZap DNA was mixed, and the reaction mixture was mixed at 50 / zl [66 mM tris-HCl Buffer (H7.6), 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, 0.1 mM ATP, 100 units of T4 DNA ligase] at 16 ° C for 12 hours I let it. This reaction solution was subjected to ADNA Invitrono II according to the method of Williams et al. (Genetic Engineering, 2, PI enum Press (1989)). Invitrono, using a packaging kit (in vitro Packaging kit (manufactured by Aramasham)). Escherichia coli Y1088 (ATCC No. 37195) was transduced to prepare a cDNA library of 5 × 105 or more.
(1-b) c D N Aライブラ リ 一からのク ロー ンの選出お よび塩基配列の決定 こ の c D NAライブラ リ 一の中から、 P D G F— Aァ ィ ソ フ オ ームをコー ドする D NA配列を含有する (1-b) Selection of clones from cDNA library and determination of nucleotide sequence Contains a DNA sequence encoding the PDGF-A isoform from one of the cDNA libraries
c D N Aを選出するため、 ヒ ト グ リ オ一マ由来の c In order to select DNA,
P D G F - A (Nature, 3 2 0 , 6 9 5 - 6 9 9 ( 1 9 8 6 ) ) をも とに合成した 5 0 mer のオ リ ゴヌ ク レオチ ドをプローブと したプラー クハイブリ ダイゼ一シ ョ ン法 (Molecular Cloning , 前述） を用いてス ク リ ーニン グ した。 その結果、 2 X 1 0 5 プラー クの中で 2 プラー ク がプロ一ブとハイブ リ ダィズした。 プロ一ブとハイ ブ リ ダイズした ク ロー ンよ り plate lysate法 ( Molecular cloning, 前述） に従って組換え体フ ァ ージ D N Aを調 製した。 挿入された E c 0 R I 断片は、 プラス ミ ドべク 夕一 pBluescript S K ( - ) (Nuclei c Acide Res. , 1 2， 7 0 3 5〜 7 0 5 6 ( 1 9 8 4 ) ： Stratagene社 . 製） にサブク ローニングを行い、 各種制限酵素切断によ り構造解析を行った。 解析の結果、 制限酵素切断地図の 異なる 2つの ク ロー ン、 P 1 および P 3 の揷入された c D NA断片の塩基配列をジデォキシチヱイ ンター ミ ネ 一夕一法 ( Sanger, F. , et al. , Pro Nat 1. Acad. A plaque hybridizer probed with a 50-mer oligonucleotide synthesized from PDGF-A (Nature, 320, 695-69 (1996)) Screening was carried out using the molecular method (Molecular Cloning, described above). As a result, 2 plaques were pro portion and hives re Dizu in 2 X 1 0 5 plaques. Recombinant phage DNA was prepared from the probe and hybridized clones according to the plate lysate method (Molecular cloning, described above). The inserted Ec0RI fragment was obtained from Plasmidec Yuichi pBluescript SK (-) (Nucleic Acide Res., 12, 70-35 to 7056 (1994)): Stratagene Was subcloned and structural analysis was performed by digestion with various restriction enzymes. As a result of the analysis, the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment of two clones, P1 and P3, having different restriction enzyme cleavage maps was determined by the dideoxythiamine terminus method (Sanger, F., et al. , Pro Nat 1. Acad.
Sci. U S A. , 7 4 > 5 4 6 3 ( 1 9 7 7 ) ) に従つ て決定した。 得られた D N A塩基配列よ り タ ンパク質の 一次構造を推定し、 ヒ ト グ リ オ一マ由来の P D G F— A と比較し、 P 1 と P 3がいずれも P D G F— Aをコー ド する D N A配列を含有する c D N Aである こ とを確認し ' た。 2種類の c D NAク ロー ンのう ち、 P 1 は全長力 1 Kbで、 5 ' 非翻訳部と 2 0 個のア ミ ノ酸からなる シグナ ルぺプチ ドおよびそれにひきつづき 6 8 個のア ミ ノ酸か らなるプロペプチ ドと P D G F — Aアイ ソ フ ォ ーム とか らなる P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質をコ ー ドしていた （第 1 図参照） 。 Sci. US A., 74> 5464 (19777)). The primary structure of the protein is deduced from the obtained DNA base sequence, compared with PDGF-A derived from human histology, and P1 and P3 both encode PDGF-A. It was confirmed to be a cDNA containing the sequence. Of the two types of cDNA clones, P1 has a total length of 1 In Kb, a signal peptide consisting of a 5 'untranslated region and 20 amino acids, followed by a propane peptide consisting of 68 amino acids and a PDGF-A isoform It encodes a PDGF-A isoform precursor protein consisting of (see Figure 1).
こ の P D G F — Aの前駆体蛋白質は 6 8 番目のァ ミ ノ 酸であるアルギニン と次のス レオニンの間でぺプチ夕一 ゼによ り切断され、 最終的には 1 1 0 個のア ミ ノ酸よ り なる P D G F — A と して分泌される と考え られた （第 2 図参照） 。 この P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームは ヒ ト内皮 細胞由来の P D G F — Aァイ ソ フ ォーム （ Tong B. D et al, Nature, 3 2 8 , 6 1 9 — 6 2 1 、 ( 1 9 8 7 ) ) と 9 0 %の相同性を示し、 両者のカルボキシル末端は一 致していた。 こ のため、 こ の P D G F — Aアイ ソ フ ォ ー ムは P D G F — A 1 のグループに属する と考え られる。  This precursor protein of PDGF-A is cleaved by peptide enzyme between arginine, the 68th amino acid, and the next threonine, resulting in 110 amino acids. It was thought to be secreted as PDGF-A, which is composed of amino acids (see Fig. 2). This PDGF-A isoform is derived from human endothelial cell-derived PDGF-A isoform (Tong B. D et al, Nature, 328, 619-621, (19) 87))) and 90% homology, and the carboxyl termini of both were identical. Therefore, this PDGF-A isoform is considered to belong to the group of PDGF-A1.
一方、 P 3 は、 全長が 2 Kbで、 第 1 図の P 3  On the other hand, P 3 has a total length of 2 Kb,
( P D G F — A 3 ) に示されている よ う に、 5 ' 端は P D G F — A前駆体蛋白質の途中からコー ドが開始され ていた。 尚、 その後の本発明者らのク ローニングによ り、 P 3 も P 1 と同一のシグナルぺプチ ド及びプロべプチ ド をコー ドする 6 0 bp及び 2 0 4 bpの D N A配列を 5 ' 末 端側に有する こ とが明 らかにされている。 P 3 はその 5 ' 端よ り第 3 8 6 番目の塩基までの間、 すなわち、 最 終的な成熟型 P D G F - Aの N末端から数えて 1 0 7番 目のァ ミ ノ酸までの間は塩基配列およびァ ミ ノ 酸配列の 両者で P 1 のそれら と完全に一致した。 しかしながら、 P 3 の第 3 8 7 番目の塩基から第 4 9 7 番目の塩基の間 のァ ミ ノ 酸配列は P 1 には存在しない特異的な配列であ り、 第 4 9 8 番目の塩基以後 P 1 と P 3 の両者のア ミ ノ 酸配列は一致した。 この結果、 P 1 のコー ドする P D G F — Aは第 1 0 8 番目のア ミ ノ酸以後、 ァスパラギン酸 一ノく リ ン ーアルギニ ン の配列をも ってカルボキシル末端 となるのに対し、 P 3 のコー ドする P D G F — Aは P 1 との共通部分から分岐後、 3 8 個のア ミ ノ 酸配列を も つ てカルボキシル末端となる （第 3 図参照） 。 こ のこ とは、 P 1 と P 3 は同一の P D G F — A遺伝子から選択的スプ ライ シ ン グによ って生ずる こ とを意味し、 P 3 に特異的 な塩基配列は、 P D G F — A遺伝子の中で独立したェク ソ ン によ ってコー ドされている考え られる （第 4 図参 照） 。 こ の P 3 によ ってコー ドされる P D G F — A 3 力 本発明の P D G F — Aアイ ソ フ ォームである。 As shown in (PDGF-A3), the coding at the 5 'end was initiated from the middle of the PDGF-A precursor protein. In addition, according to the subsequent cloning of the present inventors, P3 also encodes the 60 bp and 204 bp DNA sequences encoding the same signal peptide and propeptide as P1 at 5 ′. It has been clarified that it has the terminal side. P3 is between the 5 'end and the 386th base, that is, from the N-terminal of the final mature PDGF-A to the 107th amino acid Is the nucleotide sequence and amino acid sequence Both were completely consistent with those of P 1. However, the amino acid sequence between the 387th base and the 497th base of P3 is a specific sequence not present in P1, and the 498th base is not present in P1. Thereafter, the amino acid sequences of P1 and P3 were identical. As a result, the PDGF-A encoded by P1 becomes a carboxyl-terminus with the sequence of aspartic acid mono-arginine after the 108th amino acid, whereas P3 After diverging from the common part with P1, PDGF-A becomes a carboxyl terminus with 38 amino acid sequences (see Fig. 3). This means that P1 and P3 are generated by selective splicing from the same PDGF-A gene, and the nucleotide sequence specific to P3 is PDGF-A It may be coded by an independent exon in the gene (see Fig. 4). The PDGF-A3 force coded by this P3 is the PDGF-A isoform of the present invention.
P D G F — Aは現在までに ヒ ト グ リ オ一マ （Nature, 3 2 0 , 6 9 5 — 6 9 9 ( 1 9 8 6 ) ) 、 内皮細胞  P D G F — A has been used to date as a human immunoglobulin (Nature, 320, 695-699 (19986)), endothelial cells
( Nature, 3 2 8 , 6 1 9 - 6 2 1 ( 1 9 8 7 ) ) およ び力エル卵細胞 （ Science ， 2 4 1 , 1 2 2 3 - 1 2 2 5 ( 1 9 8 8 ) ) よ り c D N Aがク ローニ ン グされてレヽ る。 P 1 のコー ドする P D G F — Aの塩基配列は、 ヒ ト 内皮細胞由来 P D G F — Aの塩基配列とほぼ一致した。 しかし、 P 3 によ ってコー ドされる P D G F — A  (Nature, 328, 619-62 (1 987)) and Powered Egg Cells (Science, 24.1, 1223-1225 (1988)) The more cDNA is cloned, the lower the level. The nucleotide sequence of PDGF-A encoded by P1 was almost identical to the nucleotide sequence of PDGF-A derived from human endothelial cells. However, P D G F — A coded by P 3
( P D G F - A 3 ) は、 従来報告されている P D G F — Aァイ ソ フ ォーム （ A 1 または A 2 ) とはカルボキシル 末端の構造において全 く 異なっていた。 P D G F — A 2 は力エル卵細胞でも発現し、 ヒ ト グリ オ一マ P D G F — A 2 と高い相同性を示す （第 5 図参照） 。 こ のこ とは今 回のゥサギ血管由来 P D G F — A 3 のカルボキシル末端 の特異な構造は、 種差による相違ではな く 、 その由来が 血管である こ とによる と考えられる。 (PDGF-A 3) is the previously reported PDGF — It was completely different from the Aisoform (A1 or A2) in the structure of the carboxyl terminus. PDGF-A2 is also expressed in egg cells and shows high homology with the human glioma PDGF-A2 (see Fig. 5). This is probably because the peculiar structure of the carboxyl terminus of PDGF-A3 derived from the egret blood vessel is not due to the species difference but to the origin of the blood vessel.
産業上の利用可能性 Industrial applicability
P D G F — Aは間葉系細胞に対する強力な増殖因子活 性を有し、 動脈硬化の発症に重要な役割を演じている と 考えられている。 P D G F — Aの増殖因子活性は、 カル ボキシル末端の構造に依存し、 こ の部分が短い P D G F — A 1 は、 こ の部分が長い P D G F — A 2 に比し、 〖まる かに低活性である こ とが知られている （Nature, 3 2 8 , PDGF-A has potent growth factor activity on mesenchymal cells and is thought to play an important role in the development of atherosclerosis. The growth factor activity of PDGF-A depends on the structure of the carboxyl terminus, and the shorter PDGF-A1 is much less active than the longer PDGF-A2 This is known (Nature, 328,
6 2 1 - 6 2 4 ( 1 9 8 7 ) ) 。 従って、 本発明の 6 2 1-6 2 4 (1 9 8 7)). Therefore, the present invention
P D G F — A 3 も特異な増殖因子活性と発現様式を示し、 動脈硬化の発症を研究するための試薬と して有用である。 PDGF-A3 also exhibits unique growth factor activity and expression patterns, and is useful as a reagent for studying the development of atherosclerosis.
また、 第 2 図および第 3 図に示される本発明の  In addition, the present invention shown in FIG. 2 and FIG.
P D G F — Aァイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質中のプロべ プチ ドは従来報告されている ヒ ト P D G F — Aの前駆体 蛋白質のプロべプチ ドとはア ミ ノ酸配列が異な り、 ァラ ニン一 プロ リ ン という 2 ケのア ミ ノ酸が挿入されている。 このため、 本発明の血管由来の P D G F — Aアイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質は、 該前駆体蛋白質に対する特異抗 体を調製するのに有用であ り、 かつ、 該前駆体蛋白質を コ 一 ドする D NAは遺伝子工学的手法で本発明の PDGF-A isoform precursor protein has a different amino acid sequence from previously reported human PDGF-A precursor protein. Two amino acids, alanine-proline, have been inserted. For this reason, the precursor protein of the PDGF-A isoform derived from blood vessels of the present invention is useful for preparing a specific antibody against the precursor protein, and the precursor protein is used as the precursor protein. The DNA to be coded is the genetic engineering technique of the present invention.
P D G F— Aアイ ソ フ オ ームおよび前駆体蛋白質を調製 するのに欠 く こ とのできなレ、ものである。 It is an indispensable element for preparing PDGF-A isoforms and precursor proteins.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. 下記式 〔 I 〕 で表わされるア ミ ノ酸配列または 該ァ ミ ノ酸配列の一部と同一のァ ミ ノ酸配列をカルボキ シル末端に有する血小板由来増殖因子 A鎖アイ フ フ ォ ー ム。  1. A platelet-derived growth factor A chain having at the carboxyl terminal an amino acid sequence represented by the following formula [I] or an amino acid sequence identical to a part of the amino acid sequence: M
G 1 T h r L e u L e u P r o A 1 a P r o G 1 y G 1 y V a 1 H i s P r o G 1 n G 1 y C y s L e u A r g A 1 a H i s A s G 1 y C y s G 1 n S e r S e r A r g A s n H i s M e t G 1 n A 1 a L e u G 1 y T r p L y s L y s L y s M e t C I  G 1 T hr L eu L eu Pro A 1 a Pro G 1 y G 1 y V a 1 H is Pro G 1 n G 1 y Cys L eu A rg A 1 a H is As G 1 y CysG1nSerSerArgAsnHisMetG1nA1aLeuG1yTrpLysLysLysMetCI
2. ァ ミ ノ末端から数えて 1 0 8番目以降に、 請求 項 1 記載のァ ミ ノ酸配列または該ァ ミ ノ酸配列の一部と 同一のァ ミ ノ酸配列を有する請求項 1 記載の血小板由来 増殖因子 A鎖ァイ ソ フ ォ ーム。  2. The amino acid sequence according to claim 1, which has the same amino acid sequence as the amino acid sequence according to claim 1 or a part of the amino acid sequence at the 108th position or later counted from the amino terminal. Platelet-derived growth factor A chain isoform.
3. 下記式 〔II〕 で表わされるア ミ ノ 酸配列を有す る請求項 1 記載の血小板由来増殖因子 A鎖アイ ソ フ ォ ー ム。  3. The platelet-derived growth factor A chain isoform according to claim 1, which has an amino acid sequence represented by the following formula [II].
T h r l i e G 1 u G 1 υ A l a l i e T h r l i e G 1 u G 1 υ A l a l i e
P r 0 A 1 a I 1 e C y s L y s T h rP r 0 A 1 a I 1 e C y s L y s T h r
A r g T h r V a 1 I 1 e T y r G 1 uA r g T h r V a 1 I 1 e T y r G 1 u
I 1 e P r 0 A r g S e r G 1 n V a 1I 1 e P r 0 A r g S e r G 1 n V a 1
A s P P r 0 T h r S e r A 1 a A s n P h e L e u I 1 e T r P P r 0 P r 0 C y s V a 1 G 1 u V a 1 L y s A r gA s PP r 0 T hr Ser A 1 a A sn P he L eu I 1 e T r PP r 0 P r 0 C ys V a 1 G 1 u V a 1 L ys A rg
C y s T h r G 1 y C y s C y s A s nC y s T h r G 1 y C y s C y s A s n
T h r S e r S e r V a 1 L y s C y sT h r S e r S e r V a 1 L y s C y s
G 1 n P r 0 S e r A r g V a 1 H i sG 1 n P r 0 S e r A r g V a 1 H i s
H i s A r g S e r V a 1 L y s V a 1H i s A r g S e r V a 1 L y s V a 1
A 1 a L y s V a 1 G 1 u T y r V a 1A 1 a L y s V a 1 G 1 u T y r V a 1
A r g L y s L y s P r 0 L y s L e uA r g L y s L y s P r 0 L y s L e u
L y s G 1 u V a 1 G 1 n V a 1 A r gL y s G 1 u V a 1 G 1 n V a 1 A r g
L e u G 1 u G 1 υ H i s L e υ G 1 uL e u G 1 u G 1 υ H is L e υ G 1 u
C y s A 1 a C y s A 1 a A 1 a S e rC y s A 1 a C y s A 1 a A 1 a S Er
S e r A 1 a G 1 y P r 0 G 1 u H i sS e r A 1 a G 1 y P r 0 G 1 u H i s
A r g G 1 u G 1 υ G 1 u A 1 a G 1 yA r g G 1 u G 1 υ G 1 u A 1 a G 1 y
T h r L e υ L e u P r 0 A 1 a P r 0T h r L e υ L e u P r 0 A 1 a P r 0
G 1 y G 1 y V a 1 H i s P r 0 G 1 nG1yG1yVa1HisPr0G1n
G 1 y C y s L e υ A r g A 1 a H i sG 1 y C y s L e υ A r g A 1 a H i s
A s P G 1 y C y s G 1 n S e r S e rA s P G 1 y C y s G 1 n S e r S E r
A r g A s n H i s M e t G 1 n A 1 a A r g A s n H i s M e t G 1 n A 1 a
L e υ G 1 y T r P L y s L y s L y s L e υ G 1 y T r P L y s L y s L y s
M e t 〔 I〕 M e t [I]
4. 請求項 1 記載の血小板由来増殖因子 A鎖アイ ソ フ ォ 厶のァ ノ 末端にさ らにポ リ ベプチ ドが結合 さ れ ている血小板由来増殖因子 A鎖アイ ソ フ ォ ームの前駆体 o  4. A precursor of the platelet-derived growth factor A-chain isoform, wherein the polypeptide is further bound to the ano-terminus of the platelet-derived growth factor A-chain isoform according to claim 1. Body o
5. ァ ミ ノ 末端にプロべプチ ドが結合されている請 求項 4 記載の血小板由来増殖因子 A鎖アイ ソ フ ォ ームの 前駆体蛋白質。 5. The platelet-derived growth factor A-chain isoform according to claim 4, wherein a propeptide is bound to the amino terminal. Precursor protein.
6. プロペプチ ドが下記式 〔 IE〕 で表わされポ リ べ プチ ドである請求項 5 記載の血小板由来増殖因子 A鎮ァ ィ ソ フ オ ームの前駆体蛋白質。  6. The precursor protein of platelet-derived growth factor A-analysoform according to claim 5, wherein the propeptide is a polypeptide represented by the following formula [IE].
G 1 11 G 1 11 p o G 1 y I 1 e p r o G 1 11 G 1 11 p o G 1 y I 1 e p r o
A r & G 1 v a 1 L υ A s p A r τ 11 A 1 A r Cr A r & G 1 v a 1 L υ A s p A r τ 11 A 1 A r Cr
& s r G 1 n I 1 e & s r G 1 n I 1 e
H 1* c S e r I 1 A A s P L e uH 1 * c S e r I 1 A A s P L e u
G 1 n A r g L e U L e u G 1 u I 1 e0 A s P S e r V a 1 G 1 y A 1 a G 1 u G 1 n A r g L e U L e u G 1 u I 1 e0 A s P S e r V a 1 G 1 y A 1 a G 1 u
A s P A 1 a P r 0 G 1 u P r 0 S e r A s P A 1 a P r 0 G 1 u P r 0 S Er
L e u A r g A 1 a P r 0 G 1 y V a 1L e u A r g A 1 a P r 0 G 1 y V a 1
H i s T h r A 1 a A r g H i s V a 1H i s T h r A 1 a A r g H i s V a 1
A 1 a G 1 u L y s P r 0 P r 0 A 1 a5 P r 0 V a 1 P r 0 V a 1 A r g A r g A 1 a G 1 u L y s P r0 P r 0 A 1 a5 P r 0 V a 1 P r 0 V a 1 A r g A r g
L y s A r g 〔  L y s A r g 〔
3  Three
7. m求項 5 記載の血小板由来増殖因子 A鎖ァ フ オ ームの前駆体蛋白質のァ ミ ノ末端にさ らにシグナル ぺプチ ドが結合されている請求項 4 記載の血小板由来増0 殖因子 A鎖ァイ ソ フ ォ ームの前駆体蛋白質。  7. The platelet-derived growth factor according to claim 4, wherein a signal peptide is further bound to the amino terminal of the precursor protein of the platelet-derived growth factor A-chain form according to claim 5. Growth factor A-chain isoform precursor protein.
8. シグナルペプチ ドが下記式 〔 IV〕 で表わされる ぺプチ ドである請求項 7記載の血小板由来増殖因子 A鎖 アイ ソ フ オ ームの前駆体蛋白質。 5 M e t A r g T h r L e u A l a C y s A r g L e u L e u L e u G 1 y C y s G 1 y T y r L e u A l a H i s V a 1 L e u A l a 〔 IV〕 8. The precursor protein of platelet-derived growth factor A chain isoform according to claim 7, wherein the signal peptide is a peptide represented by the following formula [IV]. Five Met A rg T hr L eu A la Cys A rg L eu L eu L eu G 1 y Cys G 1 y T yr L eu A la H is V a 1 L eu A la (IV)
9. 請求項 1 記載の血小板由来増殖因子 A鎮ァイ ソ フ オ ームをコー ドする D N A配列を含有する D N A。  9. A DNA comprising a DNA sequence encoding the platelet-derived growth factor A antibody isoform according to claim 1.
10. 請求項 3記載の血小板由来増殖因子 A鎖アイ ソ フ ォ ームをコー ドする D NA配列を含有する請求項 9記 載の D N A。  10. The DNA according to claim 9, which comprises a DNA sequence encoding the platelet-derived growth factor A chain isoform according to claim 3.
11. 請求項 3記載の血小板由来増殖因子 A鎖ァイ ソ フ ォ ームをコー ドする D N A配列が下記式 〔V〕 で表わ される D NA配列である請求項 1 0記載の D N A。  11. The DNA according to claim 10, wherein the DNA sequence encoding the platelet-derived growth factor A chain isoform according to claim 3 is a DNA sequence represented by the following formula [V].
5 ' ― A C G A T C G A G G A A G C C A T T C  5 '― A C G A T C G A G G A A G C C A T T C
C T G C C A T C T G C A A G A C C A G G A C G G T C A T T T A C G A G A T A C C T C G G A G T C A G G T G G A C C C C A C G T C G G C C A A C T T C C T G A T C T G G C C G C CC T G C C A T C T G C A A G A C C A G G A C G G T C A T T T A C G A G A T A C C T C G G A G T C A G G T G G A C C C C C C G T C G G C C A A C T T C C T G A T C T G G C C G C C
G T G C G T G G A G G T C A A G C G C T G C A C C G G C T G T T G C A A C A C C A G C A G C G T C A A G T G C C A G C C C T C G C G G G T G C A C C A C C G C A G C G T C A A G G T G G C C A A G G T G G A G T A T G T C A G A A A G A A G C C C A A G T T G AA A G A A G T G C A G G T G C G G C T G G A G G A G C A C C T G G A G T G C G C G T G C G C G G C C T C G A G C G C G G G C C C G G A G C A C C G C G A G G A G G A G G C A G G G A C C C T C C T G C C C G C G C C T G G T G G C G T C C A T C C T C A G G G T T G C C T C A G A G C C C A C G A T G G C T G C C A G A G C T C C A G A A A T C A C A T G C A A G C C C T G G G C T G G A A G A A G A A G A T G - 3 ' GTGCGTGGAGGTCAAGCGCTG CACCGGCTGTTGCAACACCAG CAGCGTCAAGTGCCAGCCCTC GCGGGTGCACCACCGCAGCGT CAAGGTGGCCAAGGTGGAGTA TGTCAGAAAGAAGCCCAAGTT G AA AGAAGTGCAGGTGCGGCTGGA GGAGCACCTGGAGTGCGCGTG CGCGG CCTCGAGCGCGGGCCCGGAGC ACCGCGAGGAGGAGGCAGGGA CCCTCCTGCCCGCGCCTGGTG GCGTCCATCCTCAGGGTTGCC TCAGAGCCCACGATGGCTGCC AGAGCTCCAGAAATCACATGC AAGCCCTGGGCTGGAAGAAGA AGATG-3 '
〔V〕  [V]
12. 請求項 1 0記載の血小板由来増殖因子 A鎖ァイ ソ フ ォームをコー ドする D NA配列の 5 ' 末端にさ らに請 求項 6記載のプロべプチ ドをコ一 ドする D N A配列が結 合されている D NA配列を含有する請求項 9記載の D N A。  12. A DNA encoding the propeptide of claim 6, which is further added to the 5 'end of the DNA sequence encoding the platelet-derived growth factor A-chain isoform according to claim 10. 10. The DNA according to claim 9, comprising a DNA sequence to which the sequence is ligated.
13. プロべプチ ドをコ一 ドする D N A配列が下記式 〔 〕 で表わされる D N A配列である請求項 1 2記載の D N A。  13. The DNA according to claim 12, wherein the DNA sequence encoding a propeptide is a DNA sequence represented by the following formula [].
5 ' ― G A G G A A C C C G G G A T C C C C C  5 '― G A G G A A C C C G G G A T C C C C C
G C G A G G T G C T G G A C A G G C T C G C C C G C A G C C A G A T C C A C A G C A T C C G G G A C C T G C A G C G G C T C C T G G A G A T T G A C T C C G T A G G G G C T G A G G A C G C T C C G G A G C C G A G C C T G A G A G C C C C C G G C G T C C A C A C G G C C A G G C A T G T G G C C G A G AA G C C G C C A G C G C C G G T G C C C G T G C G G A G G A A G C G T - 3 ' CM) GCGAGGTGCTGGACAGGCTCG CCCGCAGCCAGATCCACAGCA TCCGGGACCTGCAGCGGCTCC TGGAGATTGACTCCGTAGGGG CTGAGGACGCTCCGGAGCCGA GCCTGAGAGCCCCCGGCGTCC ACACGGCCAGGCATGTGGCCG AG AA GCCGCCAGCGCCGGTGCCCGT GCGG AGGAAGCGT-3 'CM)
14. 請求項 1 2記載のプロペプチ ドをコー ドする 14. Code the propeptides according to claim 12
D N A配列の 5 ' 末端にさ らに請求項 8記載のシグナル ぺプチ ドをコ一 ドする D N A配列が結合されている D N A配列を含有する請求項 9記載の D N A。 10. The DNA according to claim 9, further comprising a DNA sequence to which a DNA sequence encoding the signal peptide according to claim 8 is bound at the 5 'end of the DNA sequence.
15. シグナルぺプチ ドをコ一 ドする D N A配列が下 記式 〔 M〕 で表わされる D N A配列である請求項 1 4記 載の D N A。  15. The DNA according to claim 14, wherein the DNA sequence encoding a signal peptide is a DNA sequence represented by the following formula [M].
5 ' ― A T G A G G A C C T T G G C T T G C C  5 '― A T G A G G A C C T T G G C T T G C C
G G C T G C T C C T C G G C T G C G G A T A C C T C G C C C A T G T T C T G G C C - _3_^_ G G C T G C T C C T C G G C T G C G G A T A C C T C G C C C A T G T T C T G G C C-_3 _ ^ _
C W )  C W)
16. 下記式 〔 I 〕 で表されるア ミ ノ酸配列または該 ァ ミ ノ酸配列の一部と同一のァ ミ ノ酸配列をコー ドする D N A配列。  16. A DNA sequence encoding an amino acid sequence represented by the following formula [I] or an amino acid sequence identical to a part of the amino acid sequence.
G 1 y T h r L e u L e u P r 0 A 1 a G 1 y T h r L e u L e u P r 0 A 1 a
P r 0 G 1 y G 1 y V a 1 H i s P r 0Pr0G1yG1yVa1HisPr0
G 1 n G 1 y G y s L e u A r g A 1 aG 1 n G 1 y G y s L e u A r g A 1 a
H i s A s P G 1 y C y s G 1 n S e r S e r A r g A s n H i s M e t G 1 nH i s A s P G 1 y C y s G 1 n S e r S e r A r g A s n H i s M e t G 1 n
A 1 a L e u G 1 y T r P L y s L y sA 1 a L e u G 1 y T r P L y s L y s
L y s M e t C I 〕 L ys M e t C I)
17. 下記式 〔^〕 で表される D N A配列である請求 項 1 6記載の D N A配列。 ΟΗϋΟ<Ηϋ Ι 17. The DNA sequence according to claim 16, which is a DNA sequence represented by the following formula [^]. ΟΗϋΟ <Ηϋ Ι
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0001
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN CIRC. J., Vol. 54, 1990, NAKAHARA K. et al., "Characterization of Two Types of Vascular PDGF-A Chain Isoform Complementary DNA Clones", p. 713-714. *
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