WO1991013890A2 - Composes diastereoisomeres derivant de l'acide tetrahydrofolique, procede de preparation et utilisation dans la synthese de diastereoisomeres 6s et 6r de folates reduits - Google Patents

Composes diastereoisomeres derivant de l'acide tetrahydrofolique, procede de preparation et utilisation dans la synthese de diastereoisomeres 6s et 6r de folates reduits Download PDF

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WO1991013890A2
WO1991013890A2 PCT/FR1991/000185 FR9100185W WO9113890A2 WO 1991013890 A2 WO1991013890 A2 WO 1991013890A2 FR 9100185 W FR9100185 W FR 9100185W WO 9113890 A2 WO9113890 A2 WO 9113890A2
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tetrahydrofolic
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Fabrizio Marazza
Attilio Melera
René Viterbo
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Sapec S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/14—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the preparation of diastereoisomeric compounds derived from tetrahydrofolic acid.
  • These compounds include as industrial products (i) the mixture of diastereoisomers 6P and 6Q as defined below (and probably corresponding to formulas III and respectively IV given below), in the molar ratio 6P / 6Q of approximately 7 / 3, (ii) the pure 6P diastereomer and (iii) the pure 6Q diastereomer.
  • the invention also relates to the use of said diastereoisomers 6P and 6Q in the synthesis of diastereoisomers 6S and 6R of reduced folates such as in particular 5-CHO- (6S) -THF acids,
  • ( ⁇ RS) -folinic acid 5-CHO- (6RS) -THF is generally and commonly used, with its calcium salt, as a therapeutic means of "relief” in patients subjected to anti-cancer chemotherapy based on methotrexate and as a means increasing the inhibition of thymidylate synthetase by anti-cancer agents such as 5-fluorouracil and 5-fluoro-2'-deoxyuridine.
  • Method II comprises the following steps: first (according to Example 5.1 of EP-A-0 348 641), (a) solubilizing said aforementioned complex salt, of formula • vs. -
  • a new technical solution which allows the synthesis of diastereoisomers 6R and 6S of reduced folates to meet the aforementioned needs.
  • This new technical solution differs from method II of EP-A-0 348 641 mentioned above in particular by the fact that the treatment with the anion exchange resin and then the AcOH / MeOH mixture is replaced by the reaction of 5- CHO- (6RS) -THF or [5,10- CH + - (6RS) -THF] X " with HCOOH acid at a pH in the range of 2.0 to 2.6.
  • This new technical solution leads to the production of diastereoisomerically pure compounds, defined below, of configuration 6P and 6Q and very probably corresponding to formulas III and IV respectively given below.
  • This technical solution constitutes a new source of access to reduced folates, since it allows in particular the preparation of dias- tereoisomerically pure such as (6S) - and ( ⁇ R) -folinic acids, (6S) - and (6R) -N 5 , N 10 -methylene-5,6,7,8- tetrahydrofolic, (6S) - and ( 6R) -N 5 -methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolics and their salts, starting from the so-called stereoisomers of formulas III and IV.
  • a process for the preparation of a compound derived from tetrahydrofolic acid and its diastereoisomers is recommended, said process being characterized in that it comprises:
  • R represents the p-benzoyl- (L) -glutamic residue of formula:
  • A is H; and its salts, and (ii) N 5 , N 10 -methenyl-5,6,7,8-tetrahydrofoli ⁇ acid of the formula
  • X " is an anion and R is defined as above; with HCOOH at a pH in the range of 2.0 to 2.6; and
  • diastereoisomer 6Q separation, from said precipitate, of a first pure diastereoisomer belonging to the series of non-natural configuration, hereinafter called diastereoisomer 6Q, and most likely corresponding to formula IV, by fractional recrystallization;
  • the dotted bond connecting the nitrogen atoms N and N ⁇ has the purpose of signaling 1st that the positive charge is delocalized on the atoms N 5 , C 11 and N 10 .
  • diastereoisomers 6Q, 6P and their mixtures in particular the aforementioned molar mixture 7/3.
  • the 6P diastereoisomer belongs to the so-called natural series in that it leads to diastereoisomers of reduced folates such as 5-CHO- (6S) -THF, 5,10-CH- (6R) -THF,, 10-CH 2 - (6R) -THF and 5-Me- (6S) -THF, and their salts.
  • the 6Q diastereoisomer belongs to the so-called unnatural series in the sense that it leads to diastereoisomers of reduced folates such as 5-CHO- (6R) -THF, ' 5,10-CH- (6S) -THF, 5 , 10-CH 2 - (6S) -THF and -Me- (6R) -THF, and their salts.
  • the use of said 6P and 6Q diastereoisomers is recommended for obtaining diastereoisomerically pure reduced folates from the natural and non-natural series.
  • the diastereoisomers according to the invention have been designated 6P and 6Q for convenience, since it has not been possible to directly determine their configuration. There are, however, serious reasons to assume that compound 6P is of configuration 6R and that compound 6Q is of configuration 6S; there are also serious reasons to think that these diastereoisomers are compounds of the orthoamide type and correspond to formulas III and IV, (even if in the current state of knowledge there would be hypotheses which do not link the Applicant). As indicated above, the 6P diastereoisomer belonging to the natural series very likely corresponds to the formula: H
  • the R or S rating changes within each series with regard to the nomenclature rules; in the series of natural configuration we pass from the diastereoisomer 6S [for example 5- CH0- (6S) -THF or 5-Me- (6S) -THF] to the diastereoisomer 6R [for example, 10-CH- (6R) -THF or 5,10-CH 2 - (6R) -THF] when the bicyclic skeleton of the pteridinyl rest becomes tricyclic.
  • the pH of the reaction medium is adjusted between 2.0 and 2.6. The adjustment of the pH within this range will advantageously be carried out by addition of NH 2 or NH 4 OH.
  • the pH of the reaction medium will be between 2.2 and 2.4 and more advantageously on the order of 2.30-2.35.
  • stage 1 ° the reaction of stage 1 ° will be carried out for at least 0.25 h, at a temperature of 40 to 65 ° C, and better still at a temperature of 45-60 ° C.
  • stage 1) according to the invention will be implemented in two different ways:
  • route (b) I> III + IV.
  • ammonia is directly incorporated into the II + H 2 O / HCOOH mixture to regulate the pH, the reaction being carried out at a temperature of 55-65 ° C, for at least 0.25 h.
  • route (b) compound I is reacted with an H 2 O / HC00H mixture at 60-65 ° C for at least 1 hour, the resulting reaction medium is cooled to 40-45 ° C, then the ammonia, the reaction then continuing at 40-45 ° C for at least 0.25 h.
  • reaction mixture gives, on cooling to RT, a crystalline precipitate of a bright yellow color which is practically insoluble in the usual solvents.
  • the crystallizations fractioned from stages 3 °) and 4 °) can be replaced by column chromatography for chiral separation.
  • the anion X ⁇ of the compound of formula II will be an appropriate anion, and may in particular be chosen from the group consisting of the ions F “ , Cl “ , Br ⁇ , I “ , NO " , I / 2SO 2" , I / 3PO4 3 “” , oxalate, p-toluenesulfonate, maleate, benzenesulfonate, methanesulfonate, trifluoroacetate, and trichloroacetate.
  • the orthoamides of formulas III and respectively IV can also be used for the preparation of the diastereoisomerically pure acids 5,10-CH2- (6R) -THF of formula VIII and respectively 5,10-CH 2 - (6S) -THF of formula X , and their salts, by conversion of III and IV into VII and respectively IX, then treatment with NaBH ⁇ in an aprotic solvent containing pyridine, then purification according to the teaching of Swiss patent application No. 02 736/89 of the Applicant:
  • the orthoamides of formulas III and respectively IV can be used for the preparation of diastereomerically pure acids 5-Me- (6S) - THF of formula XI and respectively 5-Me- (6R) -THF of formula XII, and of their salts, by conversion to VII and respectively IX, followed by reduction with NaB ⁇ CN in an aprotic solvent:
  • the salts of the diastereoisomers of natural configuration of formulas V, VIII and XI, on the one hand, and of non-natural configuration of formulas VI, X and XII, on the other hand, comprise according to the invention (i) the metal salts , especially those of alkali metals and alka- lino-earthy, such as Na, K, Ca and Mg, and (ii) the addition salts obtained with organic bases, such as in particular ethylamine, 2- (N, N-dimethylamino) ethanol, 2 - (N, N-diethylamino) ethanol, morpholine, piperidine and the like.
  • the metal salts especially those of alkali metals and alka- lino-earthy, such as Na, K, Ca and Mg
  • organic bases such as in particular ethylamine, 2- (N, N-dimethylamino) ethanol, 2 - (N, N-diethylamino
  • Recrystallization of this mixture is carried out as follows: to a mixture of 252 ml of water and 57 ml of HCOOH with stirring, at RT and under an inert atmosphere, a sufficient quantity of NH 2 OH is added to adjust the pH to 2.3; bringing the resulting mixture to the temperature of 60 ° C and then adding said mixture III / IV 96/4; shake until complete dissolution; the resulting reaction medium is then filtered hot on Btlchner, and the filtrate is left to stand at RT for 8 h and then at 4 ° C for 60 h; the brilliant yellow solid which has precipitated is isolated by filtration, washed with water and then with acetonitrile and dried under reduced pressure for 1 h at 50 ° C.
  • the resulting medium is brought to reflux for 4.5 h; 3.3 g of carbon black are added to the hot solution and the stirring is continued for 1 h while the said medium is cooled to RT.
  • 87 ml of a 2M aqueous CaCl solution are added to the fitrat and the resulting solution is slowly diluted with 3.6 liters of EtOH (94%). Said solution thus diluted is kept overnight at 0 ° C., the precipitate formed is collected by filtration, washed with EtOH (94%) then MeCOMe.
  • EtOH EtOH
  • This product has a purity of 96% by HPLC; by repeated recrystallization using H 2 0 and drying under reduced pressure at 50 ° C, 43.5 g (rende ⁇ ment: 48.5%) of pure ( ⁇ S) -folinate are obtained. Analyzes
  • This crude product is added per portion to 80 ml of water containing traces of NaOH with stirring at 0 ° C. under an inert atmosphere: during this operation the pH is maintained at approximately 9.0 by addition of NaOH IN when the time comes. 6.0 ml of a 2M aqueous MgCl solution are added to the resulting solution, which brings the pH to 8.4. The small amount of insoluble material is removed by filtration on celite. The resulting filtrate is stirred at 0 ° C while being diluted dropwise with 105 ml of acetone; after stirring for another 45 minutes at 0 ° C., the precipitate is collected by filtration, washed (twice) with acetone and dried under reduced pressure at 50 ° C for 1 h. 3.9 g of the expected magnesium salt of formula X are obtained.
  • This crude product is suspended in a mixture of 37 ml of water and 0.25 ml of 2-mercaptoethanol.
  • the resulting mixture is stirred at RT under an inert atmosphere and a sufficient amount of IN NaOH is added to obtain complete dissolution.
  • the filtrate is filtered and acidified by adding IN HCl drop by drop to reach a pH of 3.5. After stirring the resulting suspension for 1 h at 0 ° C, centrifuging, resuspending the solid first in water, then in ethanol and finally in acetone. After drying under reduced pressure at 50 ° C for 1 h, 636 mg of the expected acid of formula XI is obtained.
  • N 5 , N 10 -methylene- (6S) -5,6,7,8-tetrahydro-folic acid of formula X and its salts are diastereoisomerically pure products, belonging to the series of reduced folates of non-natural configuration, and useful in therapy. It has been found that they inhibit thymidylate synthetase and are advantageously intended for cytostatic use in therapy, in particular against cancer.
  • a diastereoisomerically pure substance chosen from the group consisting of 5,10-CH 2 - (6S) -THF acid, its non-toxic salts and their mixtures, for obtaining d 'a drug inhibiting thymidylate synthetase intended for cytostatic use in therapy, in particular against cancer.
  • said diastereoisomerically pure substance chosen from the group consisting of 5,10-CH2- (6S) -THF acid, its non-toxic salts and their mixtures is associated with (2) an antineoplasmic agent chosen in particular from 5-fluorouracil, 5-fluoro-2'- deoxyuridine, methotrexate, cisplatin and mixtures thereof.
  • said substance (1) and said agent (2) are advantageously presented in the form of a composition in association with a physiologically acceptable excipient.
  • the combination (1) + (2) offers the advantage of having synergistic effects.
  • a diastereoisomerically pure substance chosen from the group consisting of (6R) - 5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid of formula 5- CHO- (6R) - THF, its non-toxic salts and their mixtures, for obtaining a cytostatic medicament intended for use in therapy with regard to neoplastic diseases, in particular cancer.
  • each active ingredient will come at a therapeutically effective dose.
  • a composition containing, in association with a physiologically acceptable excipient, a cytostatically effective amount of an active ingredient chosen.
  • a composition containing, in association with a physiologically acceptable excipient, a cytostatically effective amount of an active ingredient chosen.

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Abstract

La présente invention à trait à un nouveau procédé de préparation de diastéréoisomères dérivant de l'acide tétrahydrofolique. Par réaction de (i) l'acide (6RS)-folinique ou de l'un de ses sels, ou (ii) de l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, avec HCOOH à pH 2,0-2,6 on obtient un précipité constitué par un mélange de deux diastéréoisomères de structure orthoamide et de formules: (III) et (IV) où R représente le reste p-benzoyl-(L)-glutamique, dans un rapport molaire (IV/III) d'environ 7/3, le composé (III) étant de configuration dite naturelle et le composé (IV) de configuration dite non-naturelle. On isole le composé (IV) pur dudit précipité, et le composé (III) pur du filtrat correspondant. A partir du composé (III) et respectivement (IV) on prépare les diastéréoisomères des folates réduits et de leurs sels de configuration naturelle, et respectivement non-naturelle.

Description

COMPOSES DIASTEREOISOMERES DERIVANT DE L'ACIDE TETRAHYDROFOLIQUE, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION DANS LA SYNTHESE DE DIASTEREOISOMERES 6S ET 6R DE FOLATES
REDUITS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procé¬ dé de préparation de composés diastéréoisomères dérivant de l'acide tétrahydrofolique. Ces composés comprennent en tant que produits industriels (i) le mélange de diastéréoisomères 6P et 6Q tels que définis ci-après (et répondant vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données plus loin), dans le rapport molaire 6P/6Q d'environ 7/3, (ii) le diastéréoisomère 6P pur et (iii) le diastéréoisomère 6Q pur.
L'invention concerne également l'utilisation desdits diastéréoisomères 6P et 6Q dans la synthèse de diastéréoisomères 6S et 6R de folates réduits tels que notamment les acides 5-CHO-(6S)-THF,
5-CHO-(6R)-THF, 5-Me-(6S)-THF, 5-Me-(6R)-THF, 5,10-CH+-(6R)-THF, 5,10-CH+-(6S)-THF, et leurs sels. ABREVIATIONS
Dans la présente description on a utilisé par commodité les abréviations suivantes : a) pour les folates réduits 5 THF = acide 5,6,7,8-tétrahydrofolique
5-CHϋ-(6RS)-THF = acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique (ou acide folinique) 5-CHO-(6S)-THF = acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-té- -- trahydrofolique (ou facteur de croissance du Leuconostoc citro- vorum) , appartenant à la série de configuration dite "naturel¬ le",le sel de calcium de cet !5 acide étant connu sous le nom de
"leucovorine" 5-CHO-(6R)-THF = diastéréoisomère 6R de l'acide folinique, appartenant à la série de configuration dite 20 "non-naturelle"
5-Me-(6RS)-THF = acide (6RS)-5-méthyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique 5-Me-(6S)-THF = acide (6S)-5-méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofolique,appartenant à la 25 série de configuration dite
"naturelle" 5-Me-(6R)-THF = acide (6R)-5-méthyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique appartenant à la série de configuration dite 30 "non-naturelle"
[5,10-CH+-(6RS)-THF]X"
= sel de l'acide (6RS)-N5,N10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydro- folique (ou "anhydro-leucovori- 35 ne") avec l'anion X~ [ 5 , 10-CH+- ( 6R ) -THF ] X
= sel de l'acide (6R)-N5,N10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X~, apparte- z- nant à la série de configuration dite "naturelle" [5,10-CH+-(6S)-THF]X~
= sel de l'acide (6S)-N5,N10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- Q que avec l'anion X~, appartenant à la série de configuration dite "non-naturelle" [5,10-CH+-(6RS)-THF]X",HX
= sel de l'acide (6RS)-N5,N10- 5 méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X" et l'acide HX [5,10-CH+-(6S)-THF]X",HX
= sel de l'acide (6S)-N5,N10- 0 méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X~ et l'acide HX 5,10-CH2-(6RS)-THF = acide (6RS)-N5,N10-méthylène-
5,6,7,8-tétrahydrofolique 5 5,10-CH2-(6R)-THF = acide (6R)-N5,N10-méthylène-
5,6,7,8-tétrahydrofolique appar¬ tenant à la série de configura¬ tion dite "naturelle" 5,10-CH2-(6S)-THF ≈ acide (6S)-N5,N10-méthylène- 0 5,6,7,8-tétrahydrofolique appar¬ tenant à la série de configura¬ tion dite "non-naturelle" b) pour les autres abréviations DMSO = diméthylsulfoxyde FAB = bombardement atomique rapide (de l'anglais: "fast atomic bombard- ment")
HPLC = chromatographie liquide haute performance
H-TSA = acide p-toluènesulfonique MS = spectrométrie de masse
MS(FAB) = spectrométrie de masse avec dis¬ positif de bombardement atomique rapide Py = pyridine
RT ' = température ambiante (15-20°C) TSA~ = ion p-toluènesulfonate
ART ANTERIEUR
On sait que l'acide folinique commercial [ou 5- CH0-(6RS)-THF] , qui répond aux nomenclatures d'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique et d'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydroptéroyl-L-glutamique et qui est notamment préparé avec son sel de calcium à partir de l'acide folique ou de l'acide N^,N^^-méthényl- ,6,7,8-tétrahydrofolique [voir par exemple les brevets CH-A-496 012 et GB-A-1 560 372], est un mélange molaire 1/1 de deux diastéréoisomères qui diffèrent l'un de l'autre par leur configuration en C° (atome de carbone en position 6 du cycle ptéridinyle).
On sait que le brevet britannique GB-A-1 560 372 envisage dans sa description (voir page 2, lignes 4-6) l'utilisation d'un complexe, sel interne ou zwitterion, de l'anhydro-leucovorine (composé de formule [5,10-CH+ -(6RS)-THF]X~) dans lequel l'un des ions carboxylate C00" du reste R-p-benzoyl-(L)-glutamique a réagi avec la char¬ ge positive délocalisée sur les atomes N-, C - et N10 comme matière première dans la synthèse de l'acide (6RS)- folinique et de son sel de calcium. On sait de l'article de J.C. FONTECILLA-CAMPS et. al., J. Am. Chem. Soc, 101, 614 (1979) que le diastéréo¬ isomère biologiquement actif de l'acide folinique est de configuration 6S. Il est rappelé que ce diastéréoisomère a été dénommé dans le passé "isomère naturel" par commodité en raison de son activité biologique, d'une part, et "acide (1,L)-folinique" où le terme "1" se réfère à la configuration en C° et le terme "L" à la configuration de la chaîne latérale acide glutamique, d'autre part.
L'acide (ôRS)-folinique 5-CHO-(6RS)-THF est généralement et communément utilisé, avec son sel de cal¬ cium, en tant que moyen thérapeutique de "secours" chez les patients soumis à une chimiothérapie anti-cancer à base de méthotréxate et en tant que moyen augmentant l'inhibition de la thymidylate synthétase par les agents anti-cancéreux tels que les 5-fluorouracil et 5-fluoro- 2'-désoxyuridine.
On a longtemps pensé que le diastéréoisomère 6R de l'acide folinique, dénommé par commodité "isomère non- naturel" (par opposition au 6S biologiquement actif) était inactif; cependant il a été signalé [voir. F.M. SIROTNAK et al., Biochem. Pharm. , _28, 2993 (1979); et J.K. SATO et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., ,25, 312 (1984)] que ledit diastéréoisomère 6R est susceptible d'interférer avec le transport ou la polyglumatation du diastéréoisomère 6S actif.
Il existe en conséquence un besoin de mettre au point, en ce qui concerne l'acide folinique, une techni- que d'obtention du diastéréoisomère 6S pur par séparation du mélange (6RS) ou par synthèse stéréospécifique.
Il se trouve que les techniques décrites par D.B. COSULICH et al., J. Am. Chem. Soc, l , 4215 (1952) [pro¬ posant la séparation des stéréoisomères de l'acide folinique par cristallisation fractionnée de leurs sels de calcium dans l'eau], d'une part, et par C. TEMPLE et - D'¬
aï., Cancer Treatment Reports, 6_5_, 1117 (1981) [proposant la séparation de l'acide (6S)-folinique à partir du mélange (6RS) par solubilisation différentielle des sels de calcium dans l'eau], d'autre part, sont inefficaces dès lors qu'elles conduisent à un mélange de 6S et 6R dans le rapport molaire 1/1.
Pour isoler le (6S)-folinate de calcium à partir du mélange (6RS) une autre méthode a été préconisée dans la demande internationale PCT publiée WO-A-8808844 (EPROVA) qui est fondée sur la cristallisation préféren¬ tielle du (6S)-folinate de calcium à partir d'un milieu alcalin aqueux contenant Ca2+ en excès.
On sait par ailleurs que d'autres folates réduits ont été obtenus sous une forme diastéréoisomériquement pure, soit à partir d'acides (6S)- et (6R)-tétrahydrofo- liques préparés par voie enzymatique [voir notamment F.M. SIROTNAK et al., Biochem. Pharm. , 2J3, 2993 (1979) pré¬ cité; H.C.S. 00D et al., Chem. and Biol. of Pteridines, 533 (1983); P.L. CHELLO et al., Biochem. Pharm., _31, 1527 (1982)], soit encore par d'autres méthodes chimiques et chromatographiques longues et fastidieuses [voir notamment B.T. KAUFMAN et al., J. Biol. Chem., 238, 1498 (1963); S.B. HORWITZ et al., J. Med. Chem., _12, 49 (1969); B.V. RAMASASTRY et al., J. Biochem. Biophys. Res. Com . , .12, 478 (1963); J.C. HITE et al., Chem. and Biol. of Pteridines, 625 (1979); et J. FEENEY et al., Biochemistry, 2 , 1837 (1981)]; or il se trouve que toutes ces méthodes, qui conduisent à l'obtention de très petites quantités (de l'ordre du milligramme) de pro- duits qui n'ont pas été isolés sous forme de solides cristallisés ou qui ont été obtenus sous forme de poudre lyophilisée de pureté toujours inférieure ou égale à 80 %, ne sont pas satisfaisantes.
De plus, il se trouve que les tentatives de réduire asymétriquement l'acide dihydrofolique par voie chimique n'ont jamais été couronnées de succès [voir L. REES et al., Tetrahedron, .42, 117 (1986)].
Le fait de disposer de quantités importantes de folates réduits diastéréoisomériquement purs permettrait de comparer et apprécier de façon claire les activités enzymatiques, biologiques et/ou thérapeutiques de chaque diastéréoisomère. En effet, jusqu'à présent la plupart des expérimentations qui ont été entreprises ont été réalisées soit avec le mélange molaire 1/1 des diastéréoisomères soit avec le diastéréoisomère dit "naturel", les activités du diastéréoisomère dit "non- naturel" étant extrapolées à partir des valeurs obtenues à partir dudit mélange molaire 1/1 et dudit diastéréoisomère naturel [voir notamment J.A. STRA et al., Cancer Research, 41_, 3936 (1981)]. A la connaissance de la Demanderesse, les seuls isomères foliniques "non- naturels" avec lesquels des expérimentations ont été effectuées sont ceux de l'acide folinique et de l'acide N5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui ont été obtenus in situ par déplétion (i.e. élimination ou inhibition) enzymatique de l'isomère "naturel" correspondant [.voir notamment J.K. SATO précité].
On connait enfin de EP-A-0 348 641 (date de pu¬ blication : 3 janvier 1990), deux méthodes (I et II) d'accès aux folates réduits ayant la configuration de la série dite "naturelle". Selon la méthode I, on traite le sel complexe dénommé "(acide (6RS)-5,10-méthényl-5,6,7,8- tétrahydofolique) chlorure, chlorhydrate, dihydrate" de formule abrégée : [5,10-CH+-(6RS)-THF]C1",HC1,2H20 au moyen d'un mélange HC00H/HC1 2N pour obtenir par cristal¬ lisation le diastéréoisomère naturel répondant à la formule [5,10-CH+-(6R)-THF]C1",HC1.
La méthode II, comprend les étapes suivantes : en premier lieu (selon l'exemple 5.1 de EP-A-0 348 641), (a) on solubilise ledit sel complexe précité, de formule • c. -
[5,10-CH+-(6RS)-THF]C1",HC1,2H20, dans l'acide HCOOH, (b) on traite la solution résultante avec une résine échan- geuse d'anions [AMBERLITER IRA-68], (c) on évapore sous pression réduite l'éluat qui a été recueilli, puis (d) on traite le résidu d'évaporation, ainsi obtenu, avec AcOH et MeOH, pour précipiter un produit dénommé sel interne de l'acide 5,10-CH-(6RS)-THF, puis en second lieu (selon l'exemple 11 de EP-A-0 348 641), on fait réagir ledit sel interne avec une solution aqueuse de HCOOH à 20°C sous agitation, il se forme un précipité et, par filtration, on recueille le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6S)-THF avec une teneur en diastéréoisomère de forme 6S de 73%, (en répétant l'opération de précipitation on augmente la teneur en diastéréoisomère de forme 6S jusqu'à 90%); et, pa traitement des filtrats combinés au moyen d'acétone, on précipite le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6R)-THF à 75 % de pureté.
BUT DE L'INVENTION
Selon l'invention on propose une nouvelle solu- tion technique permettant la synthèse des diastéréoiso¬ mères 6R et 6S de folates réduits pour satisfaire les besoins précités. Cette nouvelle solution technique se différencie de la méthode II de EP-A-0 348 641 rappelée ci-dessus notamment par le fait que le traitement avec la résine échangeuse d'anions puis le mélange AcOH/MeOH est remplacé par la réaction de 5-CHO-(6RS)-THF ou de [5,10- CH+-(6RS)-THF]X" avec l'acide HCOOH à un pH se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6.
Cette nouvelle solution technique conduit à 1'ob- tention de composés diastéréoisomériquement purs, définis ci-après, de configuration 6P et 6Q et répondant très vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données ci-après. Cette solution technique constitue une nouvelle source d'accès aux folates réduits, dès lors qu'elle permet notamment la préparation de composés dias- téréoisomériquement purs tels que les acides (6S)- et (όR)-foliniques, (6S)- et (6R)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8- tétrahydrofoliques, (6S)- et (6R)-N5-méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofoliques et leurs sels, à partir des dits dia¬ stéréoisomères de formules III et IV.
OBJET DE L'INVENTION
Selon l'un des aspects de l'invention, on préco¬ nise un procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoisomères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
1°) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par
(i) l'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule
Figure imgf000011_0001
dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta- mique de formule :
Figure imgf000011_0002
où A est H; et ses sels, et (ii) l' acide N5, N10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli¬ que de formule
Figure imgf000012_0001
dans laquelle X" est un anion et R est défini comme ci- dessus; avec HCOOH à un pH se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6; et
2°) la récupération du précipité, qui s'est for¬ mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon¬ dant, d'autre part;
3°) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration non-naturelle, dénommé ci-après diastéréo¬ isomère 6Q, et répondant très vraisemblablement à la formule IV, par recristallisation fractionnée; et,
4°) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2°) et/ou des filtrats de recristallisation selon le stade 3°), d'un second dia¬ stéréoisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle, dénommé ci-après diastéréoisomère 6P, et répondant très vraisemblablement à la formule III.
Selon ce procédé, on obtient au stade 2°) un précipité de diastéréoisomères 6Q et 6P dans un rapport molaire 6Q/6P d'environ 7/3.
Dans la formule II, la liaison en pointillés reliant les atomes d'azote N et N^ a pour but de signa- ler que la charge positive est délocalisée sur les atomes N5, C11 et N10.
Suivant un autre aspect de l'invention, on propo¬ se en tant que produits industriels nouveaux lesdits diastéréoisomères 6Q, 6P et leurs mélanges, notamment le mélange molaire 7/3 précité. Le diastéréoisomère 6P appartient à la série dite naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-(6S)-THF, 5,10-CH-(6R)-THF, ,10-CH2-(6R)-THF et 5-Me-(6S)-THF, et à leurs sels. Le diastéréoisomère 6Q appartient à la série dite non-naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-(6R)-THF,' 5,10-CH-(6S)-THF, 5,10-CH2-(6S)-THF et -Me-(6R)-THF, et à leurs sels. Suivant encore un autre aspect de l'invention, on préconise l'utilisation desdits diastéréoisomères 6P et 6Q pour l'obtention des folates réduits diastéréoisoméri- quement purs des séries naturelle et non-naturelle. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les diastéréoisomères selon l'invention ont été désignés 6P et 6Q par commodité, car il n'a pas été possible de déterminer de façon directe leur configura¬ tion. On a néanmoins de sérieuses raisons de présumer que le composé 6P est de configuration 6R et que le composé 6Q est de configuration 6S; on a également de sérieuses raisons de penser que ces diastéréoisomères sont des com¬ posés du type orthoamide et répondent aux formules III et IV, (même si dans l'état actuel des connaissances il s'a¬ girait d'hypothèses ne liant pas la Demanderesse). Comme indiqué ci-dessus, le diastéréoisomère 6P appartenant à la série naturelle répond très vraisembla¬ blement à la formule : H
Figure imgf000014_0001
et le diastéréoisomère 6Q répond très vraisemblablement à la formule :
Figure imgf000014_0002
La transformation des dérivés orthoa ides 6P et 6Q en 5-CHO-THF, 5-Me-THF et 5,10-CH2-THF, n'affecte pas la stéréochimie du centre C . Ainsi les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration naturelle présentent une configuration spatiale en C° telle qu'illustrée notamment par les formules V, VII, VIII, et XI ci-après, d'une part, et les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration non-naturelle présentent une configuration spatiale en C° telle qu'illustrée notamment par les formules VI, IX, X, et XII ci-après, d'autre part. En revanche, la notation R ou S change à l'intérieur de chaque série eu égard aux règles de nommenclature; dans la série de configuration naturelle on passe du diastéréoisomère 6S [par exemple 5- CH0-(6S)-THF ou 5-Me-(6S)-THF] au diastéréoisomère 6R [par exemple ,10-CH-(6R)-THF ou 5,10-CH2-(6R)-THF] quand le squelette bicyclique du reste ptéridinyle devient tricyclique. II est important que lors de la mise en oeuvre du stade 1°) le pH du milieu réactionnel soit ajusté entre 2,0 et 2,6. Le réglage du pH à l'intérieur de cette gamme sera avantageusement effectué par addition de NHo ou NH^OH. De préférence, au stade 1°), le pH du milieu réac- tionnel sera compris entre 2,2 et 2,4 et plus avantageu¬ sement de l'ordre de 2,30-2,35.
De façon également avantageuse, la réaction du stade 1°) sera effectuée pendant au moins 0,25 h, à une température de 40 à 65°C, et mieux à une température de 45-60°C.
De façon pratique, le stade 1°) selon l'invention sera mis en oeuvre suivant deux voies différentes :
(a) II > III + IV
(b) I > III + IV. Dans la voie (a), on incorpore directement l'ammoniac dans le mélange II + H20/ HCOOH pour réguler le pH, la réaction étant effectuée à une température de 55-65°C, pendant au moins 0,25 h. Dans la voie (b), l'on fait réagir le composé I avec un mélange H20/HC00H à 60- 65°C pendant au moins lh, refroidit le milieu réactionnel résultant à 40-45°C, puis introduit l'ammoniac, la réac¬ tion se poursuivant ensuite à 40-45°C pendant au moins 0,25 h.
Dans les deux voies, le mélange réactionnel donne par refroidissement à RT un précipité cristallin de couleur jaune brillant qui est pratiquement insoluble dans les solvants usuels.
L'analyse élémentaire de ce précipité est en accord avec les structures III et IV; il s'agit d'un mélange d'orthoamides résultant (i) de 1'énolisation du groupe oxo exocyclique (en position C^ du squelette ptéridinyle) de la fonction lactame et (ii) d'une cyclisation par formation d'une liaison entre l'oxanion et l'atome de carbone en C11 de la formule II. La structure orthoamide des composés de formules
III et IV est également confirmé par les faits suivants :
- l'analyse par spectrométrie de masse SM(FAB) des com¬ posés de formules III et IV donne un spectre pratiquement identique à celle du précurseur de formule II et indique que la réaction II = III/IV traduit une conversion du type protonation/déprotonation;
- un échantillon du produit III/IV traité avec un excès d'acide p-toluènesulfonique ne se distingue pas du produit de formule II (ou du couple VII/IX) par analyse HPLC (sur colonne non-chirale) .
Selon l'invention, les cristallisations fraction¬ nées des stades 3°) et 4°) peuvent être remplacées par une chromatographie sur colonne pour séparation chirale. En pratique on préfère enrichir les teneurs respectives en diastéréoisomères de configuration naturelle et respectivement de configuration non-naturelle des compo¬ sés III et respectivement IV par cristallisation frac¬ tionnée, puis, si nécessaire, purifier chaque produit par HPLC sur colonne chirale • Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anion X~ du composé de formule II sera un anion approprié, et pourra notamment être choisi parmi l'ensemble constitué par les ions F", Cl", Br~, I", NO ", I/2SO 2", I/3PO43"", oxalate, p-toluènesulfonate, maléate, benzènesulfonate, méthanesulfonate, trifluoroacétate, et trichloroacétate.
Les orthoamides de formules III et respectivement
IV peuvent être convertis en composés V et respectivement VI par hydrolyse à 100°C à pH 7 et en leurs sels :
Figure imgf000017_0001
et
Figure imgf000017_0002
Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être également utilisés pour la préparation des acides diastéréoisomériquement purs 5,10-CH2-(6R)-THF de formule VIII et respectivement 5,10-CH2-(6S)-THF de formule X, et de leurs sels, par conversion de III et IV en VII et respectivement IX, traitement ensuite avec NaBH^ dans un solvant aprotique contenant de la pyridine, puis purification suivant l'enseignement de la demande de brevet suisse No 02 736/89 de la Demanderesse :
(VII)
Figure imgf000017_0003
ic et
Figure imgf000018_0001
d'une part,
Figure imgf000018_0002
et
Figure imgf000018_0003
d'autre part. Dans la synthèse des composés de formules VIII et X, (ou encore de formules XI et XII), on peut, si cela est nécessaire, isoler les composés intermédiaires VII et respectivement IX. Toutefois, une telle opération n'est pas essentielle, et la suite de la synthèse est générale¬ ment effectuée sans isoler ledit composé VII ou respecti¬ vement IX.
De même les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être utilisés pour la prépara- ration des acides diastéréoisomériquement purs 5-Me-(6S)- THF de formule XI et respectivement 5-Me-(6R)-THF de formule XII, et de leurs sels, par conversion en VII et respectivement IX, suivie d'une réduction avec NaB^CN dans un solvant aprotique :
Figure imgf000019_0001
et
Figure imgf000019_0002
Les sels des diastéréoisomères de configuration naturelle de formules V, VIII et XI, d'une part, et de configuration non-naturelle de formules VI, X et XII, d'autre part, comprennent selon l'invention (i) les sels métalliques, notamment ceux des métaux alcalins et alca- lino-terreux, tels que Na, K, Ca et Mg, et (ii) les sels d'addition obtenus avec les bases organiques, telles que en particulier les éthylamine, 2-(N,N-diméthylamino)étha- nol, 2-(N,N-diéthylamino)éthanol, morpholine, pipéridine et analogues.
Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention est illustré par les schémas réactionnels suivants. SCHEMA 1
(a) (b)
/H20/Λ
Figure imgf000020_0001
1 Q
où le groupe A intervenant dans le reste R de la formule I est l/2Ca2+, le groupe A intervenant dans le reste R des formules II, III et IV est H, et le groupe X" intervenant dans la formule II est Cl".
SCHEMA 2
CHO
III CH2—HH—R (V)
H
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
où le groupe A intervenant dans le reste R des formules V et VI est l^Ca^ ,1e groupe A intervenant dans le reste R des formules III et IV est H.
SCHEMA 3
I
Figure imgf000022_0001
Py/NaBH4/DMSO
Mg2+ purif./cristall,
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000022_0003
purif./cristall,
Figure imgf000022_0004
où le groupe A intervenant dans le reste R des formules VIII et X est l/2Mg2+,le groupe A intervenant dans le reste R des formules III, IV, VII et IX est H, et le groupe X" intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate (TSA~). SCHEMA 4
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
XII
où le groupe A intervenant dans le reste R des formules VII, IX, XI et XII est H, et le groupe X" intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate. D'autre avantages et caractéristiques de l'inven¬ tion seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. PREPARATION I
Obtention de 1Orthoamide de formule III (exemple 1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2)
Dans un mélange de 1200 ml d'eau et 270 ml d'acide formique, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte (azote ou argon), on ajoute une quantité suffisan¬ te d'ammoniaque pour arriver à un pH de 2,3. On chauffe la solution résultante à 60°C et ajoute 15,41 g de [5,10- CH+-(6RS)-THF]X" de formule II (où X = Cl obtenu selon le procédé décrit par C. TEMPLE et al., J. Med. Chem., 22, 731, (1979). On maintient l'agitation jusqu'à dissolution totale des matières solides. On filtre le milieu réactionnel et laisse reposer le filtrat à RT pendant 48 h. Le précipité volumineux de couleur jaune brillant qui s'est formé est recueilli par filtration sur Buchner et lavé avec de l'eau puis de l'acétonitrile (les filtrats sont recueillis pour traitement ultérieur) et séché pendant 1 h sous pression réduite à 50°C. On obtient 7,76 g (rendement : 54 %) du mélange d'orthoamides de formules III et IV.
Pour déterminer le rapport molaire des deux dia¬ stéréoisomères, un échantillon du mélange ainsi obtenu est transformé en un mélange d'acides N5-méthyl- tétrahydrofolique de formules XI et XII puis analysé par HPLC au moyen d'une colonne chirale RES0LV0SILR selon l'enseignement de K.E.CHOI et al. Anal. Bioch. ,168,pages 398-404 (1988). Dans ce but, 11 mg du mélange III/IV qui a été obtenu est mis en supension dans 1,5 ml d'une solution aqueuse d'acide p-toluènesulfonique à 18 g/1; on ajoute 6 mg de NaBHβCN en solution dans une faible quantité d'eau et agite le mélange résultant pendant 0,25 h à RT; on dilue ce mélange avec 7,5 volumes d'eau avant introduction dans le système HPLC. On déduit (du rapport des diastéréoisomères XII/XI) que, dans ledit mélange, III/IV les deux diastéréoisomères sont dans un rapport molaire IV/III de 7/3.
Par recristallisation répétée dudit mélange III/IV au moyen de H20/HC00H 6/1 v/v, on obtient 1,1 g (rendement : 15,4 %) d'orthoamide de formule IV diasté- réoisométriquement pur.
On combine les liqueurs mères de la préparation du composé IV, les traite avec 190 ml d'eau et les laisse reposer à 4°C pendant 62 h. On obtient un précipité jaune brillant que l'on isole par filtration, lave avec H20 puis avec de l'acétonitrile, sèche sous pression réduite pendant 1 h à 50°C. On obtient ainsi 2,2 g d'un produit qui est constitué (selon analyse HPLC sur colonne RES0LV0SILR) d'un mélange III/IV dans un rapport molaire 96/4. La recristallisation de ce mélange est réalisée 5 comme suit : à un mélange de 252 ml d'eau et de 57 ml de HCOOH sous agitation, à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute une quantité suffisante de NH^OH pour ajuster le pH à 2,3; on porte le mélange résultant à la température de 60°C puis ajoute ledit mélange III/IV 96/4 ; on agite ° jusqu'à dissolution complète; le milieu réactionnel résultant est ensuite filtré à chaud sur Btlchner, et on laisse le filtrat reposer à RT pendant 8 h puis à 4°C pendant 60 h; le solide jaune brillant qui a précipité est isolé par filtration, lavé avec de l'eau puis de 5 1'acétonitrile et séché sous pression réduite pendant 1 h à 50°C pour donner 1,41 g (rendement : 20 %) de l'ortho¬ amide de formule III diastéréoisométriquement pur, comme cela est confirmé par analyse sur colonne RESOLVOSILR. PREPARATION II 0 Obtention de l'orthoamide de formule III (exemple
1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2) à.partir du sel de calcium de l'acide (6RS)-folinique
Dans un mélange de 464 ml d'eau et de 136 ml de HCOOH sous agitation à 55-60°C et sous atmosphère inerte 5 dans un réacteur pourvu d'une électrode de pH, on introduit 18,9 g de folinate de calcium pentahydraté de formule I, et agite le mélange résultant à 55-60°C pendant 1 h. On refroidit ledit mélange à 4 °C, ajuste le pH (apparent) à 2,35 en ajoutant goutte à goutte la 0 quantité appropriée d'ammoniaque concentrée, et agite pendant une nuit à RT. Le précipité jaune qui s'est formé est isolé par filtration, lavage à l'eau puis à l'acétone. Par séchage sous pression réduite à 50°C pendant 1 h, on obtient 8,81 g d'un mélange IV/III dans 5 un rapport molaire de 7/3 selon l'analyse sur colonne RES0LV0SILR précitée.
Par recristallisation répétée de ce mélange au moyen de H20/HCOOH 6/1 on obtient 1,32 g (rendement : 18,4 %) dOrthoamide de formule IV diastéréoisoméri¬ quement pur (confirmation par analyse HPLC comme indiqué ci-dessus).
Analyse élémentaire pour C QH2^NyOg,4H20 théorie : C = 45,55% ; H = 5,54% ; N = 18,59% trouvé : C = 45,91% ; H = 5,27% ; N = 18,45% Spectre de masse MS(FAB)
(matrice rïhioglycérine; 8 keV) : 456(m+,100), 412(7,5), 410(9,1), 326(10), 311(7,0), 283(11,6), 282(21,2) On combine les liqueurs mères et les dilue avec 80 ml d'eau. On refroidit à 0°C et agite à cette température sous atmosphère inerte pendant 24 h. On recueille le précipité formé par filtration sur Btlchner, lave avec de l'eau puis de l'acétone et sèche sous pression réduite à 50°C. On obtient 2,67 g d'un produit constitué de III/IV dans un rapport molaire de 98/2, selon l'analyse HPLC sur colonne RES0LV0SILR précitée. Par recristallisation selon le mode opératoire donné à la préparation I ci-dessus (pour l'obtention du composé III), on recueille 1,91 g (rendement : 23,9%) du produit de formule III diastéréoisométriquement pur (confirmation par HPLC sur colonne RES0LV0SILR précitée.) Analyse élémentaire pour C^H^ yO^,HCOOH,1/2H20 théorie : C = 49,42% ; H = 4,74% ; N = 19,21% trouvé : C = 49,45% ; H = 4,70% ; N = 19,45%
Spectre de masse MS(FAB)
(matrice :thioglycérine; 8 keV) : 456(m+,100), 412(13,3), 410(10,8), 326(13,3), 311(10,4), 283(13,7), 282(24,1), 232(39,4) PREPARATION III
Obtention du sel de calcium de 5-CHO-(6S)-THF (exemple 3 ; formule V)
Dans un mélange dégazé de 2 litres d'eau et de 20 ml de 2-mercaptoéthanol maintenu sous agitation à RT sous une atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'un condenseur de reflux et d'une électrode de pH, on introduit 80 g du diastéréoisomère III pur obtenu selon la préparation II ci-dessus, puis 100 ml d'une solution aqueuse de tris(hydroxyméthylamino)méthane 2M. On chauffe le mélange résultant à 45-50°C et maintient le pH à 7,3 par addition de la quantité nécessaire de la solution de tris(hydroxyméthylamino)méthane jusqu'à dissolution com¬ plète de la matière solide. Le milieu résultant est porté au reflux pendant 4,5 h; on ajoute 3,3 g de noir de carbone à la solution chaude et poursuit l'agitation pendant 1 h tandis que l'on refroidit ledit milieu à RT. Après filtration du milieu réactionnel sur celite, on ajoute au fitrat 87 ml d'une solution aqueuse de CaCl 2M et dilue lentement la solution résultante avec 3,6 litres de EtOH (à 94 %). On conserve ladite solution ainsi diluée pendant une nuit à 0°C, on recueille par filtration le précipité formé, le lave avec EtOH (à 94%) puis MeCOMe. Par séchage sous pression réduite à 50°C pendant 2 h, on obtient 79 g de (6S)-folinate de calcium brut. Ce produit présente par HPLC une pureté de 96 %; par recristallisation répétée au moyen de H20 et séchage sous pression réduite à 50°C, on obtient 43,5 g (rende¬ ment : 48,5 %) de (όS)-folinate de calcium pur. Analyses
- teneur en H20 (selon FISCHER) : 15 %
- teneur en Ca : 8,11 % (théorie : 7,84 %)
- pureté HPLC : 100 %
- test HPLC [ contre l'étalon (6RS) de la phama- copée US] : 99,5 % - pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : 100 %
- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : λmax = 282 nm (£ = 30 060) λ in = 242 nm rapport des 2 pic d'adsorption A-^/A2 = 4,96
- [oi]D = -14,6° ( c = 1 dans H20) PREPARATION IV
Obtention du sel de calcium de 5-CHO-(6R)-THF (exemple 4 ; formule VI)
En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation III ci-dessus, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient le produit attendu.
Analyses
- teneur en H20 (selon FISCHER) : 10,2 %
- pureté HPLC : 99 %
- test HPLC [ contre l'étalon (6RS) de la phama- copée US] : 95 %
- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure à 98 %
- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : max = 282 nm ( €=28 350) min = 242 nm rapport des 2 pic d'adsorption A^/A2 = 4,25
- [oGD ≈ +39,8° ( c = 1 dans H20) PREPARATION V
Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH2~(6S)-THF (exemple 5 ; formule X)
On met en suspension 10 g du diastéréoisomère orthoamide de formule IV dans une solution de 4,18 g de
H-TSA dans 130 ml de DMSO sec et agite à RT sous atmosphère inerte jusqu'à dissolution complète. On ajoute à RT 44 ml de pyridine puis on ajoute lentement (pendant 10 minutes) une solution de 880 mg de aBH^ dans 44 ml de DMSO. Après avoir agité le mélange résultant à RT pendant une durée de 10 minutes on refroidit le milieu réactionnel au moyen d'un bain de glace et on le dilue goutte à goutte avec un litre de méthyléthylcétone. On agite pendant 20 minutes à 0° C et recueille le précipité jaune formé par filtration ; on lave ce précipité avec de l'acétone (2 fois) et le sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h pour obtenir 6,14 grammes de 5,10-CH9~ (6S)-THF brut (probablement sous forme d'un sel mixte de Na+/pyridinium). Ce produit a une pureté apparente par HPLC de 87,2 % et contient environ 11 % de 5-Me-THF.
On ajoute par portion ce produit brut à 80 ml d'eau contenant des traces de NaOH sous agitation à 0° C sous atmosphère inerte : pendant cette opération le pH est maintenu à environ 9,0 par addition le moment venu de NaOH IN. On ajoute à la solution résultante 6,0 ml d'une solution aqueuse de MgCl 2M, ce qui amène le pH à 8,4. On élimine la petite quantité d'insoluble par filtration sur celite. Le filtrat résultant est agité à 0° C tout en étant dilué goutte à goutte avec 105 ml d'acétone ; après agitation pendant 45 autres minutes à 0° C on recueille le précipité par filtration, le lave (2 fois) à l'acétone et le sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h. On obtient 3,9 g du sel de magnésium attendu de formule X.
Analyses
- teneur en H20 (selon FISCHER) : 14 %
- pureté HPLC : 92,3 %
(le produit contient 6 % de 5-Me-(6R)-THF) - pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure ou égale à 98 %
- spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : λmaχ ≈ 296 nm (ε =28 300)
*min " 244'5 n rapport des 2 pic d'adsorption A^/A = 3,68 - [*]D = -88,7° ( c = 1 dans H20) PREPARATION VI
Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH2-(6R)-THF (Exemple 6 ; formule VIII) Ce produit est obtenu selon des modalités opératoires analogues à celles décrites dans la préparation V à partir du diastéréoisomère orthoamide de formule III.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 14,0 %
- pureté HPLC : 95,7 %
(le produit contient 3,6 % de 5-Me-(6S)-THF)
- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 99 % - spectre UV (20 mg/1 dans NaOH 0,01N) : λmax = 296 n (£ =28 300) min = 245 n* rapport des 2 pic d'adsorption A^/A2 = 4,11
- [*]D " +123,9° ( c = 1 dans H20) PREPARATION VII
Obtention de l'acide 5-Me-(6S)-THF
(Exemple 7 ; formule XI)
A une solution de 910 mg de H-TSA dans 53 ml d'eau, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute 1,0 g du diastéréoisomère orthoamide de formule III. On ajoute ensuite goutte à goutte une solution de 500 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 1 ml d'eau puis agite le mélange résultant pendant 5 h à RT ; il se forme un précipité blanc que l'on isole par filtration, lave avec de l'eau froide, de l'éthanol puis de l'acétone, sèche sous pression réduite à 50° C pendant 1 h. On obtient 923 mg de l'acide brut de formule XI.
Ce produit brut est mis en suspension dans un mélange de 37 ml d'eau et 0,25 ml de 2-mercaptoéthanol. Le mélange résultant est agité à RT sous atmosphère inerte et on ajoute une quantité suffisante de NaOH IN pour obtenir une dissolution complète. On filtre et acidifie le filtrat en ajoutant goutte à goutte HCl IN pour atteindre un pH de 3,5. Après agitation de la suspension résultante pendant 1 h à 0° C , on centrifuge, remet en suspension le solide d'abord dans de l'eau, puis dans de l'éthanol et enfin dans de l'acétone. Après séchage sous pression réduite à 50° C pendant 1 h, on obtient 636 mg de l'acide de formule XI attendu.
Analyses
- teneur en H20 (selon FISCHER) : 10 %
- pureté HPLC : 96,0 %
- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 100 %
- spectre UV
(20 mg/1 dans tampon phosphate 0,1 M; pH 6,5) •: Λmaχ = 290 n (£ =32 100) min = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption A^/A2 = 3,65
- [ ]p = +38,0° ( c = 0,5 dans tampon phosphate
0,1M ; pH 6,5) PREPARATION VIII
Obtention de l'acide 5-Me-(6R)-THF (Exemple 8 ; formule XII)
En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation VII, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient l'acide attendu de configu- ration non-naturelle.
Analyses
- teneur en H20 (selon FISCHER) : 11,5 %
- pureté HPLC : 96,3%
- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 100 % - spectre UV
(20 mg/1 dans tampon phosphate 0,1 M; pH 6,5) : >. maχ = 290 nm ( =32 500)
Figure imgf000032_0001
rapport des 2 pic d'adsorption A-^/A = 3,74
- MT) = "9,2° ( c = 0,5 dans tampon phosphate
0,1M ; pH 6,5) UTILISATION THERAPEUTIQUE
L'acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydro- folique de formule X et ses sels (notamment le sel de magnésium obtenu selon le procédé de la préparation V ci- dessus) sont des produits diastéréoisomériquement purs, appartenant à la série des folates réduits de configuration non-naturelle, et utiles en thérapeutique. On a trouvé qu'ils inhibent la thymidylate synthétase et sont avantageusement destinés à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le cancer.
Selon l'invention, on préconise donc en tant que produits industriels nouveaux, l'acide 5,10-CH2-(6S)-THF diastéréoisomériquement pur et ses sels diastéréoisoméri¬ quement purs.
On préconise également l'utilisation d'une substance diastéréoisomériquement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH2-(6S)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase destinée à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le cancer.
En variante, on préconise également l'utilisa- tion dans laquelle (1) ladite substance diastéréoisoméri¬ quement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH2-(6S)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges est associée avec (2) un agent antinéoplasme notamment choisi parmi le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-2'- désoxyuridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges.
Dans cette dernière utilisation, ladite substance (1) et ledit agent (2) sont avantageusement présentés sous la forme d'une composition en association avec un excipient physiologiquement acceptable. L'association (1) + (2) offre l'avantage de présenter des effets syner- gétiques.
Par ailleurs, on vient de trouver que le diasté- réoisomère de la série dite de configuration non- naturelle 5-CHO-(6R)-THF et ses sels présentent des pro¬ priétés cytostatiques intéressantes en thérapeutique. Le fait d'avoir pu déceler ces propriétés cytostatiques est (i) surprenant en ce sens que le 5-CHO-(6S)-THF de la série dite de configuration naturelle, l'acide folinique commercial de formule 5-CHO-(6RS)-THF et leurs sels ont été utilisés jusqu'à présent pour limiter les effets des agents cytostatiques tels que le méthotréxate, et (ii) bénéfique en ce sens que le 5-CHO-(6R)-THF et ses sels, qui sont peu toxiques, peuvent avantageusement remplacer, en totalité ou en partie, les agents cytostatiques ou antinéoplasmes de référence réputés très toxiques ou néfastes vis-à-vis de la cellule, tels que le métho¬ tréxate. Dans l'état actuel des connaissances, la Demande¬ resse présume que l'effet cytostatique qu'elle a décelé pour le 5-CHO-(6R)-THF et ses sels serait dû à une action bénéfique de ces produits sur un ou plusieurs enzymes essentiels des cellules; cependant, la Demanderesse n'est nullement liée par cet aspect théorique.
Ainsi selon l'invention, on préconise une nouvel¬ le utilisation d'une substance diastéréoisomériquement pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide (6R)- 5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule 5-CHO-(6R)- THF, ses sels non toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament cytostatique destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des maladies néopla- siques, notamment le cancer.
Bien entendu, selon l'invention, dans le cadre de la nouvelle utilisation des 5,10-CH2-(6S)-THF, 5-CH0- (6R)-THF et de leurs sels non toxiques en tant que prin¬ cipes actifs cytostatiques, chaque principe actif inter¬ viendra à une dose thérapeutiquement efficace. Dans cette optique, on fera appel à une composition renfermant, en association avec un excipient physiologiquement accepta¬ ble, une quantité cytostatiquement efficace d'un ingré¬ dient actif choisi .parmi (a) le composé 5,10-CH2~(6S)- THF, ses sels non toxiques et leurs mélanges, et (b) le composé 5-CHO-(6R)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoisomères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
1°) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par
(i) l'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule
Figure imgf000035_0001
dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta- mique de formule :
Figure imgf000035_0002
où A est H; et ses sels, et (ii) le composé acide N , N10-méthényl-5,6,7,8-tétra- hydrofolique de formule
Figure imgf000036_0001
dans laquelle X" est un anion et R est défini comme ci- dessus; avec HCOOH, ladite réaction comportant la régulation du pH dans la gamme de 2,0 à 2,6; et
2°) la récupération du précipité, qui s'est for¬ mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon¬ dant, d'autre part;
3°) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration non-naturelle; et,
4°) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2°) d'un second diastéré¬ oisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le stade 1°) comporte : (a) la réaction du composé de formule I ou de l'un de ses sels avec un mélange H 0/HC00H, pendant au moins lh, à une température de 55- 65°C, (b) le refroidissement du mélange résultant à 40- 45°C, et (c) la poursuite de la réaction à 40-45°C, pen¬ dant au moins 0,25 h, à un pH régulé à 2,0- 2,6.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le stade 1°) comporte : la réaction du composé de formule II avec un mélange H20/HCOOH, pendant au moins 0,25 h, à une température de 55-65°C, à un pH régulé à 2,0-2,6.
4. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que au, stade 1°), le pH du milieu réactionnel est ajusté entre 2,0 et 2,6 par addition d'ammoniaque.
5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que au, stade 1°), le pH du milieu réactionnel est ajusté entre 2,2 et 2,4.
6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les séparations des stades 3°) et 4°) comportent des cristallisations fractionnées.
7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le produit obtenu au stade 2°) est un mélange dudit premier diastéréoisomère et dudit second diastéréo¬ isomère dans un rapport molaire d'environ 7/3.
8. Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 4°) de la revendica¬ tion 1, appartient à la série de configuration naturelle et répond à la formule orthoamide suivante : H
Figure imgf000038_0001
9. Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 3°) de la revendica¬ tion 1, appartient à la série de configuration non- naturelle et répond à la formule orthoamide suivante :
H
Figure imgf000038_0002
10. Utilisation d'un composé tétrahydrofolique dias¬ téréoisomère selon l'une quelconque des revendications 8 et 9 pour l'obtention de folates réduits 6S et 6R diastéréoisomériquement purs.
11. Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob¬ tention, à partir du diastéréoisomère de formule III, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par
(a) l'acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli¬ que,
(b) l'acide (6S)-N5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique, (c) l'acide (6R)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8-tétra- hydrofolique, et
(d) leurs sels.
12. Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob¬ tention, à partir du diastéréoisomère de formule IV, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par
(a) l'acide (6R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli¬ que,
(b) l'acide (6R)-N5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique,
(c) l'acide' (6S)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8-tétra- hydrofolique, et
(d) leurs sels.
13. Acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique et ses sels d'addition diastéréoisomériquement purs.
1 • Utilisation d'une substance diastéréoisomérique¬ ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase et destiné à un usage cytostatique en thérapeutique notamment contre le cancer.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractéri¬ sée en ce que (1) ladite substance diastéréoisomérique- ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, est associée avec (2) un agent anti-néoplasme, notamment choisi parmi l'ensemble comprenant le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-2'-désoxy- uridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges.
16. Utilisation d'une substance diastéréoisomérique¬ ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide (6R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médica¬ ment cytostatique destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des maladies néoplasiques.
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