WO1986004353A1 - Process for the intrasequential cofactor regeneration in enzymatic synthesis, particularly when producing vitamine c - Google Patents

Abstract

Process for the intrasequential cofactor regeneration in enzymatic synthesis with one or a plurality of steps. In this process, a substrate is reduced by enzymes in a same reaction system (with one or a plurality of steps), and the reduction product thus obtained is transformed by enzymes into an oxidation product, or a substrate is oxidized by enzymes and the oxidation product thus obtained is transformed by enzymes into a reduction product. The desired final product is isolated by known processes, and two enzymes presenting the same specificity as to the cofactor are used for the associated oxidation and reduction processes. The process is particularly well adapted for the production of vitamine C, intermediate products thereof or precursors thereof.

Description

Verfahren zur intrasequentiellen Cof^'aktor-Regeneration b enzymatischen Synthesen, insbesondere bei der Herstellun von Vitamin CProcess for intrasequential Cof ^' actuator regeneration b enzymatic syntheses, especially in the production of vitamin C.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen- . tiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehr¬ stufigen enzymatischen Synthesen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Vitamin C oder L-Ascorbinsäure und zur Herstellung von Zwischen¬ produkten, die für die Herstellung von Vitamin C ver¬ wendet werden können.The invention relates to a method for intrasequen. tial cofactor regeneration in two- or multi-stage enzymatic syntheses. The invention relates in particular to processes for the production of vitamin C or L-ascorbic acid and for the production of intermediate products which can be used for the production of vitamin C.

Chemische Reaktionen, die unter der Einwirkung von Enzymen als Katalysatoren ablaufen, besitzen unter anderem den großen Vorteil, daß die Reaktionen bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, meist stereospezifisch verlaufen und der Bedarf an Hilfs¬ chemikalien minimal gehalten werden kann. Die Verwendung von Enzymen bei technischen oder halbtechnischen Syn¬ thesen hat jedoch, abgesehen ^"von Hydrolysereaktionen, bis jetzt nur beschränkte Anwendung 'gefunden. Dafür gibt es eine Anzahl von Gründen. Einer der Gründe ist, daß zahlreiche Enzyme nur in Gegenwart eines Cofaktors oder Coenzyms wirksam sind. Dies gilt z.B. für die Gruppe der Dehydrogenasen. Die Regeneration der Cofaktoren, insbesondere der Coenzyme, wie beispielsweise NAD oder FAD ist vor allem bei einer technischen Durchführung mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. Es besteht daher Bedarf an enzymkatalysierten Verfahren, die auch halbtechnisch oder technisch durchgeführt werden können und bei denen Cofaktoren benötigt werden.Chemical reactions which take place under the action of enzymes as catalysts have the great advantage, among other things, that the reactions are carried out at low temperatures, are usually stereospecific and the need for auxiliary chemicals can be kept to a minimum. However, apart from ^" hydrolysis reactions, the use of enzymes in technical or semi-industrial syntheses has so far only been used to a limited extent. There are a number of reasons for this. One of the reasons is that numerous enzymes are only present in the presence of a cofactor or coenzyme The regeneration of the cofactors, in particular the coenzymes, such as NAD or FAD, is associated with considerable difficulties, especially when carried out industrially. There is therefore a need for enzyme-catalyzed processes which are also semi-industrial or can be carried out technically and where cofactors are required.

Je umgesetztes Mol Substrat wird normalerweise auch 1 Mol des Cofaktors benötigt, welcher oftmals wesent¬ lich teurer ist als das zu gewinnende Produkt. Diese theoretisch unüberwindliche ökonomische Barriere kann nur dadurch genommen werden, indem man analog zu den in der lebenden Zelle ablaufenden Prozessen versucht - wie bei Enzymen üblich -_/auch beim Cofaktor mit kata- lytischen Mengen auszukommen. Dazu benötigt man Cofaktor- Regenerationssysteme, deren Entwicklung in den letzten Jahren intensiv betrieben worden ist. Die Ergebnisse sind bisher jedoch noch bei weitem nicht optimal._ Die besten Resultate wurden bei enzymatischer Coenzym- Regeneration erhalten. Das einzige kurz vor einer größeren industriellen Anwendung stehende Verfahren be¬ trifft die Herstellung von L-Aminosäuren aus ent¬ sprechenden Ketosäuren durch reduktive enzymatische Transaminierung (M. . Kula, C.Wandrey Bioengineering 23_, S. 1341For each mole of substrate converted, 1 mole of the cofactor is normally also required, which is often considerably more expensive than the product to be obtained. This theoretically insurmountable economic barrier can only be removed by trying to do the same as the processes taking place in the living cell - as is usual with enzymes - _/ also with the cofactor with catalytic lytic amounts. This requires cofactor regeneration systems, the development of which has been intensively pursued in recent years. So far, however, the results are far from optimal._ The best results were obtained with enzymatic coenzyme regeneration. The only process that is about to be used on a larger industrial scale relates to the production of L-amino acids from corresponding keto acids by reductive enzymatic transamination (M.. Kula, C. Wandrey Bioengineering 23_, p. 1341

(1981)). Für die Eegeneration des im übrigen an ein lösliches Polymere gebundenen Coenzyms wird dort ein zweites Enzym verwendet, welches während seiner Reaktion aus Ameisensäure ledig¬ lich nicht störendes CO- produziert, ein jedoch letzt- lieh nicht nutzbares Produkt.(1981)). For the regeneration of the coenzyme, which is otherwise bound to a soluble polymer, a second enzyme is used there, which during its reaction only produces non-interfering CO- from formic acid, but a product which cannot be used in the end.

In der DE-OS 33 26 546.1-42 (1983) wird dem¬ gegenüber erstmals ein technisch interessantes Ver¬ fahren beschrieben, bei welchem aus Gemischen von Glucose und Fructose, wie sie auch bei enzymtechnischer Hydrolyse aus Saccharose großtechnisch hergestellt werden, gleichzeitig zwei ökonomisch interessante Produkte erhalten werden. Während dabei Glucose durch Glucose-Dehydrogenase zu Gluconsäure oxidiert wird, ent- steht aus der Fructose in einer von Sorbitol- oderIn contrast, DE-OS 33 26 546.1-42 (1983) describes for the first time a technically interesting process in which two mixtures of glucose and fructose, as are also produced on an industrial scale from sucrose on an industrial scale, are simultaneously economical interesting products can be obtained. While glucose is oxidized to gluconic acid by glucose dehydrogenase, fructose in one of sorbitol or

Mannitol-Dehydrogenase katalysierten Reduktionsreaktion D-Sorbitol bzw. D-Mannitol. Das in der Oxidations- reaktion reduzierte Coenzym (NAD ^ NADH _-__,.) wird parallel mit der Fructose-Reduktion reoxidiert (NADH- <_-_• NAD ) , so daß es für einen weiteren Cyclus zur Verfügung steht und dieser Prozeß kontinuierlich _r.**_iProdukte bei Gegenwart nur katalytischer Mengen von Enzym und Coenzym liefern kann: D-GluconsäureMannitol dehydrogenase catalyzed reduction reaction D-sorbitol or D-mannitol. The coenzyme reduced in the oxidation reaction (NAD ^ NADH _-__ ,.) is reoxidized in parallel with the fructose reduction (NADH- <_-_ • NAD) so that it is available for another cycle and this process continuously _r. ** _ can deliver iProducts in the presence of only catalytic amounts of enzyme and coenzyme: D-gluconic acid

D-Fructose

D-fructose

D-Sorbitol

D-FructoseD-sorbitol

D-fructose

In der Literaturstelle "Vitamin C" von U. Wintermeyer et al, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1981, werden verschiedene Synthesen von Vitamin C beschrieben. Es finden sich jedoch keine Hinweise zur großtechnischen Herstellung von Vitamin C unter Verwendung von Enzymen als Katalysatoren.Various syntheses of vitamin C are described in the reference "Vitamin C" by U. Wintermeyer et al, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1981. However, there are no indications for the industrial production of vitamin C using enzymes as catalysts.

L-Ascorbinsäure (Vitamin C) wird großtechnisch nach wie vor nach dem von T. Reichstein und A. Grüssner (Helv. Chi . Acta V7, 311 (1934)) entwickelten chemischen Syntheseverfahren, ausgehend von D-Glucose, hergestellt.L-ascorbic acid (vitamin C) is still produced on an industrial scale using the chemical synthesis method developed by T. Reichstein and A. Grüssner (Helv. Chi. Acta V7, 311 (1934)), starting from D-glucose.

In dem folgenden Reaktionsschema sind die Einzelschritte der von Reichstein und Mitarbeitern entwickelten industriellen Synthese von L-Ascorbinsäure aus D- Glucose dargestellt. The following reaction scheme shows the individual steps of the industrial synthesis of L-ascorbic acid from D-glucose developed by Reichstein and co-workers.

1 _) Dabei werden folgende Stufen durchlaufen: D-Sorbit, L-Sorbose, 2-Keto-L-gulonsäure, L-Ascorbinsäure. Nicht berücksichtigt wurden hierbei zwei Zwischenstufen, welche die Einführung von zwei Isopropyliden-Schutz- gruppen in L-Sorbose und ihre Abspaltung aus dem Oxi¬1 _) The following stages are carried out: D-sorbitol, L-sorbose, 2-keto-L-gulonic acid, L-ascorbic acid. Two intermediate stages, which introduce two isopropylidene protective groups into L-sorbose and split them off from the oxi¬, were not taken into account

2 Ü dationsprodukt dieses Derivates betreffen. Auch die chemische Umwandlung von 2-Keto-L-gulonsäure in L-Ascorbinsäure erfordert diese Derivatisierung.2 concern product of this derivative. The chemical conversion of 2-keto-L-gulonic acid into L-ascorbic acid also requires this derivatization.

Jeder dieser Schritte ist mit erheblichen Ausbeutever-Each of these steps involves considerable yield

..5 lusten infolge der Bildung von Nebenprodukten verbunden. Insbesondere wird ein kontinuierlicher Verfahrensablauf durch die bis heute aus stereochemischen Gründen er¬ forderliche mikrobiologische Oxidation von D-Sorbit zu L-≤orbose unterbrochen. Auch nach nunmehr jahrzehnte¬..5 associated due to the formation of by-products. In particular, a continuous process is interrupted by the microbiological oxidation of D-sorbitol to L-≤orbose, which is still required for stereochemical reasons. Even after decades

3 U langer Produktionserfahrung mit der entsprechenden Fermentation durch z.B. Gluconobacter suboxydans oder Acetobacter xylinus treten bis heute erhebliche Schwierig¬ keiten bei der Durchführung dieses Schrittes auf (vgl. K. Dannhäuser, Chem. Rdsch. 27, 40 (1974)). Rein ^ chemische Reaktionsschritte führen jedoch bei weitem nicht zu vergl ichbaren Ergebnissen in Bezug auf die Stereospezifität dieser Oxidation und somit auf die Reinheit des Produkts. Die Gesamtausbeute bezogen auf eingesetzte Glucose beträgt ca. 60%.3 U long production experience with the corresponding fermentation by, for example, Gluconobacter suboxydans or Acetobacter xylinus, considerable difficulties arise to this day in carrying out this step (cf. K. Dannhäuser, Chem. Rdsch. 27, 40 (1974)). Purely chemical reaction steps, however, by no means lead to comparable results with regard to the stereospecificity of this oxidation and thus to the Purity of the product. The overall yield based on glucose used is approximately 60%.

In verschiedenen Laboratorien wurde in den letzten Jahren versucht, eine kontinuierliche Produktion von L-Sorbose mit Hilfe immobilisierter Mikroorganismen zu erreichen. Bisher ist jedoch kein hinreichend be¬ friedigendes Ergebnis erzielt worden. Außerdem muß auch hier mit ausbeutevermindernden Nebenprodukten und den daraus resultierenden Aufarbeitungsproblemen ge¬ rechnet werden.In recent years, various laboratories have tried to achieve continuous production of L-sorbose using immobilized microorganisms. So far, however, no sufficiently satisfactory result has been achieved. In addition, yield-reducing by-products and the resulting processing problems must also be expected here.

Es ist eine Reihe rein chemischer Synthesen von L-Ascor- binsäuren entwickelt worden, die aber aus wirtschaft- liehen Gründen ebenfalls keine Anwendung gefunden haben (T.C. Crawford, S.A. Crawford, Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 21_, 79 (1980)).A series of purely chemical syntheses of L-ascorbic acids have been developed which, however, have likewise not been used for economic reasons (T.C. Crawford, S.A. Crawford, Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 21_, 79 (1980)).

Rein enzymatische Syntheseverfahren für Vitamin C sind bisher nicht beschrieben worden. J.P. Danehy (US-Patent 4,259,443, 1981) verwendet einen Extrakt aus keimenden Erbsensamen zur Umwandlung von Galactono-y-lacton in L-Ascorbinsäure. Dieser Schritt würde aber stöchio- metrische Mengen an Coenzym erfordern, was für ein Produktionsverfahren wirtschaftlich völlig untragbar wäre. Ganz davon abgesehen könnte dieser Prozeß in keinem Falle kontinuierlich geführt werden. Das bei der Verwen¬ dung einer Oxidase entstehende Nebenprodukt H-O-, würde zudem das Enzym sehr rasch inaktivieren.Purely enzymatic synthesis processes for vitamin C have not been described so far. J.P. Danehy (U.S. Patent 4,259,443, 1981) uses an extract from germinating pea seeds to convert galactono-y-lactone to L-ascorbic acid. However, this step would require stoichiometric amounts of coenzyme, which would be economically prohibitive for a production process. Apart from that, this process could never be carried out continuously. The by-product H-O- formed when using an oxidase would also inactivate the enzyme very quickly.

In der US-PS 2,681,858 wird die enzymatische Spaltung der Lactose durch 3-Galactosidase in D-Galactose und D-Glucose beschrieben. Die Überführung der Glucose und Galactose in die entsprechenden Uronsäure bzw. Uron- säurederivate unter Verwendung von Schutzgruppen ist ebenfalls bekannt: (US-Patent 4,259,443 1981; C.L. Mehltretter et al J. Amer. Chem. Soc. 73_, 2424 (1951)) . Jedoch sind bei diesem bekannten Verfahren die erziel¬ ten Ausbeuten an Uronsäuren zu gering für eine ökonomische In der US-PS 4,259,443 wird ein Verfahren zur Herstel¬ lung von L-Ascorbinsäure aus LactoseUS Pat. No. 2,681,858 describes the enzymatic cleavage of lactose by 3-galactosidase in D-galactose and D-glucose. The conversion of glucose and galactose into the corresponding uronic acid or uronic acid derivatives using protective groups is also known: (US Pat. No. 4,259,443 1981; CL Mehltretter et al. J. Amer. Chem. Soc. 73_, 2424 (1951)). However, the yields of uronic acids obtained in this known process are too low for an economical one US Pat. No. 4,259,443 describes a process for the production of L-ascorbic acid from lactose

1) durch Hydrolyse der Lactose in D-Galactose und 5 D-Glucose;1) by hydrolysis of the lactose in D-galactose and 5 D-glucose;

2) Oxidation der D-Galactose und D-Glucose zu D-Galactu- ronsäure und D-Glucuronsäure;2) oxidation of D-galactose and D-glucose to D-galacturonic acid and D-glucuronic acid;

3) Reduktion der D-Galacturonsäure und D-Glucuronsäure zu der L-Galactonsäure und L-Gulonsäure; 0 4) Überführung der letztgenannten Säuren in die ent¬ sprechenden y-Lactone und 5) enzymatische Oxidation der y-Lac one zu L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses bekannte Verfahren besitzt den Nachteil, daß es nicht kontinuierlich durchgeführt werden ^•- kann und daß die Ausbeuten sehr -niedrig sind.3) reduction of D-galacturonic acid and D-glucuronic acid to L-galactonic acid and L-gulonic acid; 4) Conversion of the latter acids into the corresponding y-lactones and 5) enzymatic oxidation of the y-lacone to L-ascorbic acid. This known method has the disadvantage that it can not be carried out continuously ^• - can and that the yields are very -low.

Die Welt ahresproduktion an Vitamin C betrug im .Jahre 1981 ca. 35.000 Tonnen.- Davon wurde ein Großteil in er^' Bundesrepublik Deutschland hergestellt. ü bύ bis 70% der Weltproüuktion an L-Ascorbinsäure gehen in die Lebensmittelindustrie. Es besteht daher ein steigender Bedarf an Vitamin C.The world ahresproduktion of vitamin C was in .Jahre 1,981 35,000 Tonnen.- of which a large part was made ^'Federal Republic of Germany in it. ü bύ up to 70% of the world production of L-ascorbic acid goes to the food industry. There is therefore an increasing need for vitamin C.

5 _fjer vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- fanren zur Herstellung von Vitamin C zur Verfügung zu stellen, das in cecni≤cneii. und lalbtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann, bei αer Enzyme als Katalysatoren eingesetzt weruen unu welches die Regeneration der erforderlichen *-*¹ cofaktoren ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren, b i dem Enzyme verwendet werden, soll auf wirtschaftliche Weise durchgeführt werden können, ohne daß untragbare Ver¬ luste entstehen. Es soll das gewünschte Produkt in hohen Ausbeuten ergeben. bThe object 5 _f Jer present invention is based on a comparison fanren for the production of vitamin C to provide, in the cecni≤cneii. and can be carried out on a technical scale, with αer enzymes used as catalysts and which enables the regeneration of the required * - * ¹ cofactors. The process according to the invention, in which enzymes are used, should be able to be carried out in an economical manner without incurring unacceptable losses. It should give the desired product in high yields. b

Insbesondere soll erfindungsgemäß ein einfaches Verfahren zur Hersteϊlunc von Vitamin C oder seinen Vorstufen bzw. Zwischenprodukten zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem Vitamin C bzw. seine Vorstufen oder Zwischenprodukte auf einfachere Weise und mit höheren Ausbeuten oder kosten¬ günstiger als bei den bekannten Verfahren hergestellt werden können. 5In particular, according to the invention, a simple process for the production of vitamin C or its precursors or Intermediates are made available, according to which vitamin C or its precursors or intermediates can be produced in a simpler manner and with higher yields or at lower cost than in the known processes. 5

Insbesondere soll ein rein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure bzw. Gemischen von D-Glucuronsäure und D-Galacturonsäure zur Verfügung gestellt werden. Es 10 soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem durch enzymatische/chemische Verfahren diese Uron- säuren aus Lactose oder anderen leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien, ie z.B. Glucose, Pectin, Alginsäure oder Gluconsäure, wirtschaftlich gewonnen werden können.In particular, a purely enzymatic process for the production of L-ascorbic acid from D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or mixtures of D-glucuronic acid and D-galacturonic acid is to be made available. A method is to be made available according to which these uronic acids from lactose or other easily accessible starting materials, e.g. Glucose, pectin, alginic acid or gluconic acid can be obtained economically.

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Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere das Ver¬ fahren zur Herstellung von Vitamin C oder seinen Vor¬ stufen oder Zwischenprodukten, soll_, sich durch folgende Vorteile auszeichnen:The inventive method, in particular the process for the production of vitamin C or step his Vor¬ or intermediate products, _shall be characterized by the following advantages:

2020th

1. Verwendung von preiswerten Substraten, beispielsweise für die Vitamin-C-Herstellung Lactose, Glucose;1. Use of inexpensive substrates, for example for the production of vitamin C lactose, glucose;

2. vollständige Verwertung der Substrate, beispielsweise der-Lactose;2. complete utilization of the substrates, for example the lactose;

25 - 3. keine Nebenprodukte bei den enzymatischen Schritten;25 - 3. no by-products in the enzymatic steps;

4. hoher Reinheitsgrad des gewünschten Endprodukts;4. high degree of purity of the desired end product;

5. geringere Umwel belastung als bei chemischer Synthese;5. lower environmental impact than with chemical synthesis;

6. das Verfahren soll kontinuierlich durchgeführt werden können;6. the process should be able to be carried out continuously;

30 7. es sollen kleinere Anlagen als bei einem chemischen Syntheseverfahren erforderlich sein und damit _o. σeπn ere Investitionskosten benötigt werden.30 7. Smaller plants than a chemical synthesis process should be required and thus _o . σeπn ere investment costs are required.

_.3 Während gemäß DS-OS 33 26 546.1-42 (1983) eine - wenn auch produktive - Hilfsreaktion zur Cofaktor-Regeneration benutzt wurde, wird nun erfindungsgemäß ein Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration insbesondere am Beispiel der Synthese von L-Ascorbinsäure beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für mehr¬ stufige enzymatische Synthesen, welche Oxidations- und Reduktionsschritte innerhalb der gleichen Synthese¬ kette enthalten._.3 While according to DS-OS 33 26 546.1-42 (1983) an - albeit productive - auxiliary reaction for cofactor regeneration was used, a method for intrasequential cofactor regeneration is now described according to the invention, in particular using the example of the synthesis of L-ascorbic acid. This method is particularly suitable for multistage enzymatic syntheses which contain oxidation and reduction steps within the same synthesis chain.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur intrasequen¬ tiellen Cofaktor-Regeneration bei enzymatischen Synthesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man im gleichen Reaktor oder in getrennten Stufen (D ein Substrat enzymatisch reduziert und das erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidations¬ produkt überführt oder (2) ein Sunstrat enzymatisch oxidiert und ^"das erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktions- produkt überführt und das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise isoliert, wooei für die gekoppelte Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktorspezifität besitzen. (Dieses Verfahren ist in den Figuren 1 und 3 bis 8 an einigen Beispielen erläutert. )The invention relates to a method for intrasequen¬ tial cofactor regeneration in enzymatic syntheses, which is characterized in that a substrate is enzymatically reduced in the same reactor or in separate stages (D) and the reduction product obtained is converted enzymatically into an oxidation product or (2 ) enzymatically oxidizes a Sunstrat and ^" enzymatically converts the oxidation product obtained into a reduction product and isolates the desired end product in a manner known per se, where two enzymes are used for the coupled oxidation and reduction, which have the same cofactor specificity. (This process is illustrated in Figures 1 and 3 to 8 using some examples.)

In dem folgenden Reaktionsschema ist der enzymatische Herstellungsprozeß für L-Sorbose aus D-Glucose mit intra¬ sequentieller Cofaktor- (hier NAD /NADH₂> Regeneration darσestellt.

The following reaction scheme shows the enzymatic production process for L-sorbose from D-glucose with intra-sequential cofactor (here NAD / NADH ₂ > regeneration).

In den beigefügten Figuren 6 und 8 sind die enzymati¬ schen Reaktionen detaillierter dargestellt.The attached FIGS. 6 and 8 show the enzymatic reactions in more detail.

Mit dem erfindungsgemäßen- Verfahren ist es möglich, die Überführung eines primären Reaktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung eines primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere cofaktorunabhänge Zwischenstufen ab¬ laufen zu lassen, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder getrennt durchgeführt werden können.With the process according to the invention, it is possible to convert a primary reaction product to the oxidized end product or to convert a primary oxidation product to the reduced end product via one or more cofactor-independent intermediate stages, all reactions being carried out in the same reactor or separately can.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den großen Vor¬ teil, daß es kontinuierlich und sowohl im halbtechni¬ schen als auch im technischen Maßstab durchgeführt wer¬ den kann.The process according to the invention has the great advantage that it can be carried out continuously and on a semi-technical as well as on an industrial scale.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den wesentlichen Vorteil, daß die Co aktoren auf einfache Weise regene¬ riert werden kennen, daß preiswerte Substrate eingesetzt werden können und die Substrate vollständig verwertet werden. Das erhaltene Endprodukt besitzt einen hohen Reinheitsgrad, so daß kaum oder keine Nebenprodukte ent¬ stehen, und die Umwel b lastung sehr gering ist. Die Investitions osten sind ebenfalls niedriσ. Die Oxidations-Reduktions-Reaktionen werden bei den Reaktionsbedingungen durchgeführt, wie sie normaler¬ weise für die Durchführung enzymatischer Reaktionen angewandt werden, beispielsweise liegt der pH-Wert im allgemeinen zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8.The process according to the invention has the essential advantage that the co-actuators can be regenerated in a simple manner, that inexpensive substrates can be used and that the substrates are fully utilized. The end product obtained has a high degree of purity, so that little or no by-products are formed and the environmental impact is very low. The investment east is also low. The oxidation-reduction reactions are carried out under the reaction conditions normally used for carrying out enzymatic reactions, for example the pH is generally between 5 and 9, preferably between 6 and 8.

Als Reduktionsenzym können beispielsweise L-Hexonat- Dehydrogenase, Äldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydro- genäse oder Lactat-Dehydrogenase, und als Oxidations- enzyme können L-Galactonsäure-(L-Gulonsäuire) -Lacton- Dehydrogenase und L-Galactonsäure-(L-Gulonsäure) - Lactonase und Inositol-1-phosphat-Synthase, Fructuronat- Dehydrogenase oder Malat-Dehydrogenasen verwendet werden.L-hexonate dehydrogenase, aldose reductase, mannuronate dehydrogenase or lactate dehydrogenase can be used as the reducing enzyme, and L-galactonic acid (L-gulonic acid) -lactone dehydrogenase and L-galactonic acid (L -Gulonic acid) - lactonase and inositol-1-phosphate synthase, fructuronate dehydrogenase or malate dehydrogenases can be used.

Der Cofaktor wird bei dem.erfindungsgemäßen Verfahren nur in katalytischen Mengen verwendet und er kann in^* freier Form oder an lösliche Polymere oder an Enzyme gebunden eingesetzt werden. Die Enzyme können in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.The cofactor is only used in the process according to the invention in catalytic amounts and it can be used in ^* free form or bound to soluble polymers or to enzymes. The enzymes can be used in free or in immobilized form.

Beispiele für Cofaktoren sind:Examples of cofactors are:

2+ 1 + Cu /Cu in freier oder komplexierter Form, Fe ⁺ _/Fe ⁺-Komplexe, wie K Fe(CN) _g/K₄Fe(CN)₆ oder Cyto- chrorne c,2+ 1 + Cu / Cu in free or complex form, Fe ⁺ _/ Fe ⁺ complexes, such as K Fe (CN) _g / K ₄ Fe (CN) ₆ or cytochlorne c,

Riboflavin,Riboflavin,

Benzochinon-Hydrochinon,Benzoquinone hydroquinone,

^T-Naphthochinon, ß-Naphthochinon, natürlich vorkommende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2 ,6-Dichlorphenolindophenol, o-Chlorophenolindo-2,6- dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyl- tetrazoliumchlorid, Phenzinmethosulfat,^ T-naphthoquinone, ß-naphthoquinone, naturally occurring or synthetic redox dyes, such as 2, 6-dichlorophenolindophenol, o-chlorophenolindo-2,6-dichlorophenol, methylene blue, Wurster's blue, triphenyl-tetrazolium chloride, phenzin methosulfate,

Coenzyme, wie NAD NADH₂, NADP / DPH₂, Q0, Q2, Q6, Q7,Coenzymes, such as NAD NADH ₂ , NADP / DPH ₂ , Q0, Q2, Q6, Q7,

FAD/FADH-. und FMN. Bevorzugt werden die Redoxsysteme Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid (NAD /NADH-,) oder Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat (NADP⁺/NADPH₂) , Fe ⁺/Fe -Cyto- chrom c, 2 ,6-Dichlorphenol-indophenol oder Phenazin- ethosulfat eingesetzt.FAD / FADH-. and FMN. The redox systems nicotinamide adenine dinucleotide (NAD / NADH-) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP ⁺ / NADPH ₂ ), Fe ⁺ / Fe-cyto-chromium c, 2, 6-dichlorophenol-indophenol or are preferred Phenazine ethosulfate used.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut für die enzymatische Herstellung von Vitamin C geeignet. Dabei können, wie in Figur 2 dargestellt, die folgenden Ausgangsmaterialien verwendet werden.The method according to the invention is particularly well suited for the enzymatic production of vitamin C. As shown in FIG. 2, the following starting materials can be used.

(1) D-Galacturonsäure oder D-Galacturonsäure ent¬ haltenden natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;(1) D-galacturonic acid or D-galacturonic acid-containing naturally occurring or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates;

(2) D-Glucuronsäure oder D-Glucuronsäure enthaltende natürlich -vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;(2) D-glucuronic acid or naturally occurring or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates containing D-glucuronic acid;

(3) D-Mannuronsäure oder D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlenhydrate;(3) D-mannuronic acid or naturally occurring or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates containing D-mannuronic acid;

(4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D- Fructose enthaltende Dissaccharide;(4) D-galactose and / or D-glucose and / or D-fructose containing dissaccharides;

(5) D-Galatose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;(5) D-galatose and / or D-glucose and / or D-fructose and / or D-mannose;

( 6 ) D-Glucose , L-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo-* oder ύeteropolyglycane (vgl. das in Figur 4 dargestellte(6) Homo- * or eteropolyglycans containing D-glucose, L-galactose or D-mannose (cf. the one shown in FIG. 4)

Feakt ions schemn )Function schemes)

( 7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure ) oder myo- Inosιt_ol- 1 -phospha . (8) Pectine;(7) myo-inositol or its hexaphosphate (phytic acid) or myo- Inosιt_ol- 1 -phospha. (8) pectins;

(9) Alginsäure (vgl. das in Figur 3 dargestellte Reak¬ tionsschema) ;(9) alginic acid (cf. the reaction scheme shown in FIG. 3);

(10) Stärke, Maltose, Cellulose, Cellobiose oder Saccha¬ rose.(10) Starch, maltose, cellulose, cellobiose or sucrose.

In Figur 7 ist ein weiterer Syntheseweg, •der von D-Glu- consäure ausgeht, dargestellt.FIG. 7 shows a further synthetic route, which starts from D-gluconic acid.

Die Galacturonsäure bzw. D-Galacturonsäure bzw. Mannuron- säure enthaltenden Homo- oder Heteropolyglycane werden chemisch oder enzymatisch hydrolysiert (vgl. Figur 1) . Die D-Galactose bzw. D-Glucose bzw. D-Mannose enthalten¬ den Homo- oder Heteropolymeren werden chemisch, mikro¬ biologisch oder enzymatisch zu den entsprechenden D-Ga¬ lacturonsäure bzw. D-Glucuronsäure bzw. D-Mannuronsäure enthaltenden Verbindungen oxidiert und dann hydrolysiert.The homo- or heteropolyglycans containing galacturonic acid or D-galacturonic acid or mannuronic acid are hydrolyzed chemically or enzymatically (cf. FIG. 1). The homopolymers or heteropolymers containing D-galactose or D-glucose or D-mannose are oxidized chemically, microbiologically or enzymatically to the corresponding compounds containing D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or D-mannuronic acid and then hydrolyzed.

Als vorteilhafter Rohstoff zur Gewinnung von L-Ascorbin¬ säure kommt Pectin in Frage, welches sich zu 15 bis 30% in der Mittellamelle von Pflanzenzellwänden findet. Aus diesem Pectin (zum Beispiel aus Zuckerrübenschnitzeln) wird durch Angriff von Pectinmethylesterasen, Endo- und Exo-Polygalacturonasen, bevorzugt im pH-Bereich 4 bis 6, D-Galacturonsäure erzeugt. Die verwendeten Enzympräpara- ^' te müssen zur Erzielung einer hohen Ausbeute an D-Ga¬ lacturonsäure unbedingt lyasefrei sein, da andernfalls Δ-4-5-ungesättigte D-Galacturonsäure-Derivate entstehen, die nicht zu L-Ascorbinsäure weiterumgesetzt werden kön¬ nen.As an advantageous raw material for the production of L-ascorbic acid, pectin comes into question, which is found to 15 to 30% in the middle lamella of plant cell walls. This pectin (for example from sugar beet chips) is used to produce D-galacturonic acid by attacking pectin methyl esterases, endo- and exo-polygalacturonases, preferably in the pH range 4 to 6. The Enzympräpara- used ^'te need to achieve a high yield of D-Ga¬ lacturonsäure necessarily be lyasefrei, otherwise Δ-4-5-unsaturated D-galacturonic acid-derivatives are formed which are not reacted further to L-ascorbic acid NEN kön¬.

Durch Reduktion von D-Galacturonsäure zu L-Galactonsäu- re mittels L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) bzw.By reducing D-galacturonic acid to L-galactonic acid using L-hexonate dehydrogenase (EC 1.1.1.20) or

Hexuronat-Reductase (EC 1.1.1.19) erhält man L-Galacton- säure, deren γ-Lactose bevorzugt enzymatisch-oxidativ weiter umgesetzt werden kann zu 2-Keto-L-galactonsäure (bzw. deren γ-Lacton) . In bekannter, nicht enzymatisch zu katalysierender Weise erhält man aus dieser Verbin- düng durch Umlagerung L-Ascorbinsäure (vgl. Figur 1) .Hexuronate reductase (EC 1.1.1.19) gives L-galactone acid, the γ-lactose of which can preferably be further reacted enzymatically-oxidatively to give 2-keto-L-galactonic acid (or its γ-lactone). In a known, non-enzymatically catalyzed manner, this compound gives L-ascorbic acid by rearrangement (cf. FIG. 1).

Die Disaccharide werden chemisch, mikrobiologisch oder enzymatisch oxidiert und darauf folgend enzyma^'tisch oder chemisch hydrolysiert, oder sie werden enzymatisch oder chemisch in ihre monomeren Bestandteile gespalten.The disaccharides are chemically, enzymatically or microbiologically oxidized and then enzymatically following ^'table or chemically hydrolyzed or they are enzymatically or chemically cleaved into their monomeric constituents.

Die Monosaccharide werden enzymatisch oder chemisch zu den entsprechenden Uronsäuren oxidiert. Das chemische Verfahren erfordert die Einführung und spätere Entfer- nung von Schutzgruppen.The monosaccharides are oxidized enzymatically or chemically to the corresponding uronic acids. The chemical process requires the introduction and later removal of protective groups.

Stärke, Maltose, Cellobiose oder Saccharose werden enzy¬ matisch in myo-Inositol umgewandelt und dann enzymatisch über Glucose-1-phosphat zu D-Glucuronsäure oxidiert.Starch, maltose, cellobiose or sucrose are enzymatically converted into myo-inositol and then enzymatically oxidized to D-glucuronic acid via glucose-1-phosphate.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, bei dem als Substrat D- Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet wird. Ein Gemisch dieser beiden Säuren erhält man beispielsweise durch chemische oder enzymatischeOxidation zusammen mit einer Hydrolyse aus Lactose. The invention further relates to a process for the preparation of L-ascorbic acid, in which D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or a mixture of these two acids is used as the substrate. A mixture of these two acids is obtained, for example, by chemical or enzymatic oxidation together with hydrolysis from lactose.

Die beiden genannten Säuren oder das Gemisch der Säuren werden enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert, und diese werden gegebenenfalls in ihre Lactone oder ein Gemisch der Lactone überführt. Die Säuren oder ein Gemisch der Säuren bzw. die Lactone oder ein Gemisch der Lactone werden dann enzymatisch zu den entsprechenden 2-Keto- Säuren oxidiert und zu Ascorbinsäure umgelagert, welche in an sich bekannter Weise isoliert wird.The two acids mentioned or the mixture of the acids are enzymatically reduced to L-galactonic acid or L-gulonic acid or a mixture of these acids, and these are optionally converted into their lactones or a mixture of the lactones. The acids or a mixture of the acids or the lactones or a mixture of the lactones are then oxidized enzymatically to the corresponding 2-keto acids and rearranged to ascorbic acid, which is isolated in a manner known per se.

Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß im gleichen Reaktor nicht nur die Oxidations- und Reduktions-Reaktionen, sondern auch Zwischenreaktionen, wie beispielsweise die Lactonisierung oder Überführung der Säuren in andere Derivate durchgeführt werden kann. Anhand der beigefügten Figur 5 wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus Lactose näher erläutert.It is a particular advantage of the process according to the invention that not only the oxidation and reduction reactions, but also intermediate reactions, such as, for example, the lactonization or conversion of the acids into other derivatives, can be carried out in the same reactor. The method according to the invention for producing L-ascorbic acid from lactose is explained in more detail with reference to the attached FIG.

In einer ersten Verfahrensstufe wird dazu aus Lactose durch chemische oder enzymatische Oxidation in Kombina¬ tion mit einem Hydrolyseschritt ein Gemisch von D-Galactu¬ ronsäure und D-Glucuronsäure gewonnen. In einem zweiten enzymkatalysierten Reduktionsprozeß wird aus diesen beiden D-Uronsäuren unter Konfigurationsumkehr (Inversion) ein Gemisch von L-Galactonsäure und L-Gulonsäure erzeugt. Die daraus durch enzymatische Oxidation erhältlichen 2-Keto- L-Galactonsäure und 2-Keto-L-Gulonsäure bzw. deren y - Lactone (Stufe 3) gehen unkatalysiert in L-Ascorbinsäure (Vitamin C) über.In a first process step, a mixture of D-galacturonic acid and D-glucuronic acid is obtained from lactose by chemical or enzymatic oxidation in combination with a hydrolysis step. In a second enzyme-catalyzed reduction process, a mixture of L-galactonic acid and L-gulonic acid is generated from these two D-uronic acids with configuration reversal (inversion). The 2-keto-L-galactonic acid and 2-keto-L-gulonic acid or their y-lactones (stage 3) obtainable therefrom by enzymatic oxidation go uncatalyzed into L-ascorbic acid (vitamin C).

Durch Auswahl geeigneter Enzyme (E₁ , E,) mit kompatiblen Cofaktoren lassen sich der Reduktionsschritt (Stufe 2, E.,⁾ und der Oxidationsschritt (Stufe 3, E^' ₂) miteinander zu einem kontinuierlichen Prozeß verknüpfen. Mit diesen konjugierten Redoxreaktionen wird gleichzeitig für eine kontinuierliche Regeneration der in den von -E bzw. E-, katalysierten Einzelschritten jeweils benötigten Coenzyme (Redoxsysteme) gesorgt, so daß diese nur in katal tischen Mengen eingesetzt zu werden brauchen.By selecting suitable enzymes (E ₁ , E,) with compatible cofactors, the reduction step (step 2, E., ⁾ and the oxidation step (step 3, E ^' ₂ ) can be linked together to form a continuous process. With these conjugated redox reactions, a continuous regeneration of the in -E or E-, catalyzed individual steps each required coenzymes (redox systems), so that they only need to be used in catalytic amounts.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anfallenden End¬ produkte können in an sich bekannter Weise abgetrennt werden und müssen aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Sie können beispielsweise durch Absorptionschromatogra¬ phie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromato- graphie, fraktionierte Kristallisation, Elektrodialyse oder elektrodialytische Fokussierung abgetrennt bzw. isoliert werden.The end products obtained in the process according to the invention can be separated off in a manner known per se and must be removed from the equilibrium. They can be separated or isolated, for example, by absorption chromatography, distribution chromatography, ion exchange chromatography, fractional crystallization, electrodialysis or electrodialytic focusing.

Die bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Vitamin C verwendete D-Glucuronsäure kann ebenfalls -erfindungsgemäß durch enzymatische Reduktion von D- Mannuronsäure zu D-Mannonsäure und anschließende Oxi¬ dation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure hergestellt werden. Damit kommt auch Alginsäure als preis- wertes Ausgangsmaterial in Frage (vgl. Figur 3) .The D-glucuronic acid used in the process for the production of vitamin C described above can also be added according to the invention by enzymatic reduction of D-mannuronic acid to D-mannonic acid and subsequent oxidation of the D-mannonic acid to D-fructuronic acid and isomerization of the D-fructuronic acid D-glucuronic acid can be produced. Thus alginic acid can also be used as an inexpensive starting material (cf. FIG. 3).

L-Sorbose ist ein Zwischenprodukt zur Herstellung von Vitamin C, und diese Verbindung kann aus D-Glucose oder aus D-Fructose hergestellt werden. D-Glucose oder D-Fructo- se werden enzymatisch zu D-Sorbitol reduziert, und D-Sor¬ bitol wird enzymatisch zu L-Sorbose oxidiert (vgl. Fig. 6,8)L-sorbose is an intermediate for the production of vitamin C, and this compound can be made from D-glucose or from D-fructose. D-glucose or D-fructose are enzymatically reduced to D-sorbitol, and D-sorbitol is enzymatically oxidized to L-sorbose (see FIG. 6.8).

Es ist ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens, daß eine Umwandlung der D-Formen in die ge- wünschte L-Form auf enzymatische Weise erfolgen kann. Derartige Umwandlungen sind sonst nur schwer zu errei¬ chen und werden in der Reichstein-Synthese deshalb mikro¬ biologisch vorgenommen (vgl. die obigen Reaktionsschemata). Die erfindungsgemäßen Oxidations-Reduktionsreaktionen können beispielsweise in einem Reaktor mit Ultrafiltra¬ tionsmembran durchgeführt werden, wobei ein Cofaktor- system verwendet wird, das an ein wasserlösliches Polymeres mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 5000 und 30.000 Dalton gebunden ist. über die Membran des Reaktors wird eine Druckdifferenz erzeugt, und hinter der Membran wird kontinuierlich ein Produkt¬ strom abgeführt.It is a further advantage of the method according to the invention that the D-forms can be converted into the desired L-form in an enzymatic manner. Such conversions are otherwise difficult to achieve and are therefore carried out microbiologically in the Reichstein synthesis (cf. the reaction schemes above). The oxidation-reduction reactions according to the invention can be carried out, for example, in a reactor with an ultrafiltration membrane, using a cofactor system which is bound to a water-soluble polymer with an average molecular weight between 5000 and 30,000 daltons. A pressure difference is generated across the membrane of the reactor, and a product stream is continuously removed behind the membrane.

Erfindungsgemäß kann man als Membranen Hohlfasern ver ¬ wenden, .die in ihrer Struktur asymmetrisch aufgebaut sind, wobei die für Enzyme und polymergebundene Coenzyme undurchlässige selektive Schicht der Membran auf der Außenseite der Hohlfaser liegt, während die Innenseite der Faser Poren enthält, die auch für die Enzyme und Coenzyme durchlässig sind.According to the invention, hollow fibers can be used as membranes whose structure is asymmetrical, the selective layer of the membrane impermeable to enzymes and polymer-bound coenzymes lying on the outside of the hollow fiber, while the inside of the fiber contains pores which are also suitable for the Enzymes and coenzymes are permeable.

Die Substratlösung wird dann auf der Innenseite der Hohlfasermembran eingeführt, zwischen der Innen- und Außenwand der Faser wird eine hydrostatische Druck¬ differenz erzeugt, so daß die Substratlösung durch die innere Faserwand hindurchgeht und die enzymatischen Reaktionen bevorzugt im porösen Stützmaterial zwischen Innenwand und Außenwand ablaufen.The substrate solution is then introduced on the inside of the hollow fiber membrane, a hydrostatic pressure difference is generated between the inner and outer wall of the fiber, so that the substrate solution passes through the inner fiber wall and the enzymatic reactions preferably take place in the porous support material between the inner wall and the outer wall.

Durch geeignete Wahl der hydrostatischen Druckdifferenz kann man den Durchsatz der Substrate so einstellen, daß ihre Aufenthaltszeit in der Hohlfaserwand ausreicht, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu erzielen.By a suitable choice of the hydrostatic pressure difference, the throughput of the substrates can be adjusted so that their residence time in the hollow fiber wall is sufficient to achieve the most complete possible implementation.

Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die eigentliche für Enzyme und polymergebundene Cofaktoren undurch¬ lässige selektive Schicht der Membran auf der Innenseite der Hohlfaser liegen und die enzymatische Reaktion im ^■ Lumen der Hohlfaser ablaufen. Zu der Reaktionslösung kann man gegebenenfalls ein Schutzprotein in einer Menge,According to another embodiment the actual undurch¬ permeable to enzymes and polymer-bound cofactors selective layer of the membrane can lie on the inside of the hollow fiber and effect the enzymatic reaction in ^■ lumen of the hollow fiber. If necessary, a protective protein can be added to the reaction solution in an amount

4 die dem 1- bis 10 fachen der Menge der beteiligten Enzyme entspricht, zusetzen.4 1 to 10 times the amount of participants Corresponds to enzymes.

Das Gemisch aus Restsubstrat, Produkt, Enzym und Co- faktor kann auch durch ein Membranmodul durchgeströmt 5 werden, dessen Membranporen so ausgestaltet sind, daß sie nur das Produkt sowie Restsubstrat hindurchlassen, die übrigen Komponenten jedoch zurückhalten, wobei letztere wieder in den Reaktor zurückgeführt werden.The mixture of residual substrate, product, enzyme and cofactor can also be flowed through a membrane module 5, the membrane pores of which are designed in such a way that they only allow the product and residual substrate to pass through, but retain the remaining components, the latter being returned to the reactor .

10. Die im Reaktor gemeinsam vorliegenden Enzyme können verschiedene Halbwertszeiten ihrer Inaktivierung auf¬ weisen. Um über einen längeren Zeitraum hinweg den Reaktor funktionsfähig zu halten, werden die Enzyme dem Reaktor in einem Aktivitätsverhältnis zwischen10. The enzymes present together in the reactor can have different half-lives of their inactivation. In order to keep the reactor functional over a longer period of time, the enzymes are kept in an activity ratio between the reactor

15 10:1 und 1:10 zugefügt, wobei das Enzym mit der schnelleren Inaktivierung anfangs im Überschuß vorliegt. Auch durch Nachdosierung einzelner gelöster Enzyme oder des Cofaktors während des Produktionsprozesses können die Substrat- umsatzraten je Zeiteinheit von Vorwärts- und Rückwärts-15 10: 1 and 1:10 were added, the enzyme with the faster inactivation initially being in excess. The substrate turnover rates per unit of time can also be changed from forward and backward through additional dosing of individual dissolved enzymes or the cofactor during the production process.

20 reaktion wieder aufeinander abgestimmt werden.20 reaction can be coordinated again.

Einige-der benötigten Enzyme sind wie im Falle der Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) aus Schafsleber oder Candida utilis,_oder der Lactat-DehydrogenaseSome of the enzymes required are, as in the case of sorbitol dehydrogenase (EC 1.1.1.14) from sheep's liver or Candida utilis, or lactate dehydrogenase

25 (EC 1.1.1.27) aus verschiedenen tierischen Geweben oder der Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.38) aus Schweineherz oder der Pectinasen (als Pectinol K oder rohament P) im Handel erhältlich. letztere Quellen können auch zur Reindarstellung pectinolytischer Enzyme verwendet25 (EC 1.1.1.27) from various animal tissues or malate dehydrogenase (EC 1.1.1.38) from swine heart or pectinases (as Pectinol K or Rohament P) are commercially available. the latter sources can also be used for the purification of pectinolytic enzymes

30 werden.To be 30.

Die weiteren Enzyme lassen sich z.B. aus folgenden Quellen isolieren:The other enzymes can be e.g. Isolate from the following sources:

35 Sorbitol-DH EC 1 . 1 . 1 . 1 4 Lactobacillus brevis , ( Iditol-DH) Zymomonas mobilis , Gluconobacter xylinum Acetobacter suboxydans35 Sorbitol DH EC 1. 1 . 1 . 1 4 Lactobacillus brevis, (Iditol-DH) Zymomonas mobilis, Gluconobacter xylinum Acetobacter suboxydans

Glucuronat-Peduktase 1 . 1 . 1 . 1 9 Leber, HefenGlucuronate Peductase 1. 1 . 1 . 1 9 liver, yeast

L-Hexonat-Dehydrogenase 1 . 1 . 1 .20 Erwinia carotevora, Euglenia gracilis, Erb sen, S. cerevisiae, Saccharomyces lipolytic Lipomyces starkeyi, Schwanniomyces ocσiden talis, Aspergillus nige u.a. HefenL-hexonate dehydrogenase 1. 1 . 1 .20 Erwinia carotevora, Euglenia gracilis, Erb sen, S. cerevisiae, Saccharomyces lipolytic Lipomyces starkeyi, Schwanniomyces ocσiden talis, Aspergillus nige and others. Yeast

Aldose-Reduktase 1.1.1.21 Leber, Zymomonas mobil Pichia stipidis, B. ma ceransAldose reductase 1.1.1.21 liver, Zymomonas mobil Pichia stipidis, B. ma cerans

Lactat-DH 1.1.1.27 Bacillus subtilis,Lactate DH 1.1.1.27 Bacillus subtilis,

Schweinemuskel, B. ste rothermophilusPig muscle, B. ste rothermophilus

Malat-DH 1.1.1.37 Neurospora crassa, Sch neherz, B.subtilis, B. stearσt mophilus, Thermus. ther philusMalat-DH 1.1.1.37 Neurospora crassa, Schneherz, B. subtilis, B. stearσt mophilus, Thermus. ther philus

Malat-DH, 1.1.1.38 Bakterien decarboxylierend 1.1.1.39 Streptococcus faecalisMalat-DH, 1.1.1.38 bacteria decarboxylating 1.1.1.39 Streptococcus faecalis

Fructuronat-Reduktase 1.1.1.57 BakterienFructuronate reductase 1.1.1.57 bacteria

Mannitol-DH (NAD) 1.1.1.67 Bakterien, HefenMannitol-DH (NAD) 1.1.1.67 bacteria, yeast

5-Ketogluconat-Reduk- 1.1.1.69 Gluconobacter, Kleb- tase AD (P) siella, E. coli5-ketogluconate reduc- 1.1.1.69 Gluconobacter, adhesive tase AD (P) siella, E. coli

L-Sorbose-DH 1.1.1.123 Gluconobacter sp. ,L-Sorbose-DH 1.1.1.123 Gluconobacter sp. .

Lactobacillus brevis, E.coliLactobacillus brevis, E. coli

Fructose-b-DH 1.1.1.124 Gluconobacter cerinusFructose-b-DH 1.1.1.124 Gluconobacter cerinus

Mannuronat-DH 1.1.1.131 Aeromonas Mannitol-DH (NADP) 1.1.1.138 lactobacillus brevis, Penicillium chrysogenumMannuronat-DH 1.1.1.131 Aeromonas Mannitol-DH (NADP) 1.1.1.138 lactobacillus brevis, Penicillium chrysogenum

Polyol-DH 1.1.1.139 Saccharomyce sPolyol DH 1.1.1.139 Saccharomyce s

L-Aldono-_.-lacton- 1.1.3.8 Serratia, Saccharo- Oxidase myces cerevisiae, Pseudomonas, Grün¬ algen, LeberL-Aldono -_.- lactone- 1.1.3.8 Serratia, sucrose oxidase myces cerevisiae, Pseudomonas, green algae, liver

Mannitol-DH 1.1.2.2 Aerobacter sub-Mannitol DH 1.1.2.2 Aerobacter sub-

(Fe-Cytochrom c) oxidans, Bac. poly- myxa(Fe cytochrome c) oxidans, Bac. polymyxa

Mannonat-DH 1.2.1.34 BakterienMannonat-DH 1.2.1.34 bacteria

L-Aldono-. -lacton-DH 1.3.2.3 Erbsen, Blumenkohl, HefenL-Aldono-. -lactone-DH 1.3.2.3 peas, cauliflower, yeast

myo-Inositol-Oxi- 1.13.99.1 Rattenhiere, Pflan¬ genäse zenmyo-Inositol-Oxi 1.13.99.1 rat animals, plant eyes

Phosphorylase 2.4.1.1 Kartoffeln, TomatenPhosphorylase 2.4.1.1 Potatoes, Tomatoes

Saccharose-Phos- 2.4.1.7 Pseudomonas saccha- phorylase rophiliaSucrose-Phos- 2.4.1.7 Pseudomonas sacchaporylase rophilia

Maltose-Phosphory- 2.4.1.8 Leuconostoc läse mesenteroidesMaltose-Phosphory- 2.4.1.8 Leuconostoc läse mesenteroides

Cellobiose-Phos- 2.4.1.20 Bakterien phoryla≤eCellobiose-Phos- 2.4.1.20 bacteria phoryla≤e

Phosphoglucose utase 2.7.5.5 BakterienPhosphoglucose utase 2.7.5.5 bacteria

Pectinrrethvlesterase 3.1.1.11 Aspergillus nigerPectinrrethvlesterase 3.1.1.11 Aspergillus niger

L -Aldonolac tonase 3.1.1.18 Leber, Grünalgen Phytin-3-phos- 3.1.3.8 Bakterien phataseL-aldonolac tonase 3.1.1.18 liver, green algae Phytin-3-phos- 3.1.3.8 bacteria phatase

myo-Inositol-1* 3.1.3.25 Aspergillus sp., phosphatase Hefemyo-Inositol-1 * 3.1.3.25 Aspergillus sp., phosphatase yeast

Phytin-6-phos¬ 3.1.3.26 Pflanzen phatasePhytin-6-phos¬ 3.1.3.26 plant phatase

Endo-Polygalac- 3.2.1.15 Aspergillus niger turonaseEndo-Polygalac- 3.2.1.15 Aspergillus niger turonase

Exo-Polygalacturo- 3.2.1.67 Pectinol K, Rohament nase P, Äpfel, Zitrus- früchteExo-Polygalacturo- 3.2.1.67 Pectinol K, raw nose P, apples, citrus fruits

Exo-Poly-^- 3.2.1.82 dto , Erwin iaExo-Poly - ^ - 3.2.1.82 dto, Erwin ia

GalacturonosidaseGalacturonosidase

Glucuronat- Isomerase 5 . 3 . 1 . 1 2 E.coliGlucuronate isomerase 5. 3rd 1 . 1 2 E. coli

myo-Inositol-1- 5.5.1.8 Schwanniomyces phosphat-Synthase occidentalis, Can- dida utilismyo-Inositol-1- 5.5.1.8 Schwanniomyces phosphate synthase occidentalis, Candida utilis

L-Sorbose-DH Bacillus, Hefen, Gluconobacter mela- noαenumL-Sorbose-DH Bacillus, yeast, Gluconobacter melanoenum

L-Sorboson-DH Acetobacter suboxi- dans, Gluconobacter melanogenumL-Sorboson-DH Acetobacter suboxidans, Gluconobacter melanogenum

L-Sorboson-Oxidase Pseudomonas putida,L-sorbosone oxidase Pseudomonas putida,

Gluconobacter melanogenum Älginasen ' Alginobacter, Algino- monas, Alginovibrio Actinomyces Pseudomonas maltophi- lia, Pseudomonas pu- tidaGluconobacter melanogenum Älginases' Alginobacter, Alginomonas, Alginovibrio Actinomyces Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida

Aerobacter, Aeromonas, Bacterium, Bacteroides Klebsiella, Vibrio Aerobacter, Aeromonas, Bacterium, Bacteroides Klebsiella, Vibrio

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E PATENT CLAIMS

1. Verfahren zur intrasequentiellen Cofaktor-Regeneration bei zwei- oder mehrstufigen enzymatischen Synthesen, dadurch ge ¬ k e n n z e i c h n e t , daß man im gleichen Reaktor oder auch einzeln (1) ein Substrat enzymatisch reduziert und das dabei erhaltene Reduktionsprodukt enzymatisch in ein Oxidationspro¬ dukt überführt oder1. Process for intrasequential cofactor regeneration in two- or multi-stage enzymatic syntheses, characterized in that a substrate is enzymatically reduced in the same reactor or individually (1) and the reduction product obtained is converted enzymatically into an oxidation product or

(2) ein Substrat enzymatisch oxidiert und das dabei erhaltene Oxidationsprodukt enzymatisch in ein Reduktionspro¬ dukt überführt und(2) oxidizing a substrate enzymatically and converting the oxidation product obtained enzymatically into a reduction product and

das gewünschte Endprodukt in an sich bekannter Weise iso¬ liert, wobei für die gekoppelten Vorgänge der Oxidation und Reduktion zwei Enzyme verwendet werden, die die gleiche Cofaktor- Spezifität besitzen. the desired end product is isolated in a manner known per se, two enzymes having the same cofactor specificity being used for the coupled processes of oxidation and reduction.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß die Überführung des primären Reduktionsprodukts in das oxidierte Endprodukt oder die Überführung des primären Oxidationsprodukts in das reduzierte Endprodukt über eine oder mehrere von dem jeweils betroffenen Cofaktor unabhängige Zwischenstufen abläuft, die im gleichen Reaktor oder auch einzeln durch¬ geführt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that the transfer of the primary reduction product into the oxidized end product or the transfer of the primary oxidation product into the reduced end product takes place via one or more intermediate stages which are independent of the respective cofactor and which take place in the same reactor or can also be carried out individually.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß es kontinuierlich durch¬ geführt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that it is carried out continuously.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß bei der Oxi- dations-Reduktions-Reaktion der pH-Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, gehalten wird.4. The method according to any one of claims 1, 2 or 3, characterized in that the pH value is kept between 5 and 9, preferably between 6 and 8, in the oxidation-reduction reaction.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als5. The method according to at least one of claims 1 to 4, characterized g e k e n n z e i c h n e t that as

Reduktionsenzyme beispielsweise L-Hexonat-Dehydrogenase, Aldose-Reduktase, Mannuronat-Dehydrogenase oder Lactat- Dehydrogenase, als Oxidationsenzyme L-Galactonsäure-(L- Gulonsäure)-Lacton-Dehydrogenase, Inositol-1-phosphat- Synthase, Fructuronat-Dehydrogenase oder Malat-Dehydro- genasen verwendet werden.Reduction enzymes, for example L-hexonate dehydrogenase, aldose reductase, mannuronate dehydrogenase or lactate dehydrogenase, as oxidation enzymes L-galactonic acid (L-gulonic acid) lactone dehydrogenase, inositol-1-phosphate synthase, fructuronate dehydrogenase or malate Dehydrogenases are used.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch- g e k e n n z e i c h n e t , daß der Cofaktor in katalytischen Mengen verwendet wird.6. The method according to at least one of claims 1 to 5, characterized in that the cofactor is used in catalytic amounts.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß als Cofaktor Cu /Cu in freier oder komplexierter Form oder Fe /Fe -Komplexe, wie K Fe (CN) _g/K Fe (CN) - oder Cytochrome c, Riboflavin, Benzochinon/Hydrochinon, «.-Naphthochinon, ß-Naphthochinon oder natürlich vorkom- mende oder synthetische Redoxfarbstoffe, wie 2,6-Dichlor- phenolindophenol, o-Chlorphenolindo-2,6-dichlorphenol, Methylenblau, Wurster's Blau, Triphenyltetrazolium- chlorid, Phenazinmethosulfat, oder Coenzy systeme, wie NAD⁺/NADH₂, NADP⁺/NADPH₂, Q0, Q2, Q6, Q7, FAD/FADH und FMN, verwendet werden, bevorzugt jedoch die Redox¬ systeme Nicotin_.mid-Adenin-Dinucleotid (NAD⁺/NADH₂) oder7. The method according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that as cofactor Cu / Cu in free or complexed form or Fe / Fe complexes, such as K Fe (CN) _g / K Fe (CN) - or cytochrome c , Riboflavin, benzoquinone / hydroquinone, «.-Naphthoquinone, ß-naphthoquinone or naturally occurring or synthetic redox dyes, such as 2,6-dichlorophenolindophenol, o-chlorophenolindo-2,6-dichlorophenol, methylene blue, Wurster's blue, triphenyltetrazolium chloride, phenazine methosulfate, or coenzy systems, such as NAD ⁺ / NADH ₂ , NADP ⁺ / NADPH ₂ , Q0, Q2, Q6, Q7, FAD / FADH and FMN, are used, but preferably the redox systems Nicotin_.mid-adenine dinucleotide (NAD ⁺ / NADH ₂ ) or

Nicotinamid-Adenin-Dinucleo_tid-Phosphat (NADP^' /NADPH-) ,Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP ^' / NADPH-),

2+ 3+ ^2+ 3+ ^

Fe /Fe -Cytochrome c, 2,6-Dichlorphenol-Indophenol oder Phenazinmethosulfat eingesetzt werden.Fe / Fe cytochrome c, 2,6-dichlorophenol indophenol or phenazine methosulfate can be used.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch g e k e n n z-e l e h n e t , daß der Cofaktor in freier Form oder an Partikel oder an lös- liehe Polymere oder an Enzyme gebunden und die Enzyme in freier oder in immobilisierter Form verwendet werden.8. The method according to at least one of claims 1 to 7, characterized in that the cofactor is bound in free form or to particles or to soluble polymers or to enzymes and the enzymes are used in free or in immobilized form.

9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur enzymatischen Herstellung von L-Ascorbin- säure , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Substrat D-Galacturonsäure oder D-Glucuronsäure oder ein Gemisch dieser beiden Säuren verwendet, das jeweilige Substrat enzymatisch zu L-Galactonsäure oder L-Gulon¬ säure oder einem Gemisch dieser Säuren reduziert und L-Galactonsäure oder L-Gulonsäure oder ein Gemisch dieser Säuren in die entsprechenden y-Lactone oder das Gemisch der y-Lactone enzymatisch oder chemisch in an sich bekannter Weise überführt, das erhaltene ^'-Lacton oder das Gemisch aus den ;--'-Lactonen enzymatisch zu 2-Keto-L-gulonsäure oder 2-Keto-L-galactonsäure oder einem Gemisch dieser Säuren bzw. zu den .'-Lactonen oder einem Gemisch der _'--Lactone oxidiert und in an sich bekannter Weise zu L-Ascorbinsäure umlagert und das Produkt gewinnt, wobei alle enzymatischen Reaktio- nen im gleichen Reaktor oder auch getrennt durchgeführt werden. 9. The method according to at least one of the preceding claims for the enzymatic production of L-ascorbic acid, characterized in that the substrate used is D-galacturonic acid or D-glucuronic acid or a mixture of these two acids, the respective substrate enzymatically to L-galactonic acid or L-Gulonic acid or a mixture of these acids is reduced and L-galactonic acid or L-gulonic acid or a mixture of these acids is converted into the corresponding y-lactones or the mixture of y-lactones enzymatically or chemically in a manner known per se, the resulting ^' Lactone or the mixture of the; --'- lactones enzymatically to 2-keto-L-gulonic acid or 2-keto-L-galactonic acid or a mixture of these acids or to the .'-lactones or a mixture of the _' - Lactones are oxidized and rearranged to L-ascorbic acid in a manner known per se and the product is obtained, with all enzymatic reactions being carried out in the same reactor or else separately.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß bei der Reduktion als Enzyme L-Hexonat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.20) oder Glucuronat- Reduktase (EC 1.1.1.19), bei der Oxidation L-Aldono- - lacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) oder L-Aldonsäure-^-lacton- Dehydrogenase (EC 1.3.2.3) verwendet werden und daß die Überführung der -onsäuren in die y-Lactone durch eine L-Aldonolactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure erfolgt.10. The method according to claim 9, characterized in that in the reduction as enzymes L-hexonate dehydrogenase (EC 1.1.1.20) or glucuronate reductase (EC 1.1.1.19), in the oxidation L-aldono- - lactone- Oxidase (EC 1.1.3.8) or L-aldonic acid - ^ - lactone dehydrogenase (EC 1.3.2.3) and that the conversion of the -onic acids into the y-lactones by an L-aldonolactonase (EC 3.1.1.18) or weak acid occurs.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von D-Glucuronsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß11. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the production of D-glucuronic acid, characterized g e k e n n z e i c h n e t that

i. D-Mannuronsäure enzymatisch zu D-Mannonsäure reduziert wird;i. D-mannuronic acid is reduced enzymatically to D-mannonic acid;

ii. die D-Mannonsäure anschließend enzymatisch zu D-Fructuronsäure oxidiert wird undii. the D-mannonic acid is then enzymatically oxidized to D-fructuronic acid and

iii. die Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure isomeri- siert wird,iii. the fructuronic acid is isomerized to D-glucuronic acid,

wobei^'alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- zeln durchgeführt werden.wherein ^'are all the reactions in the same reactor or conducted switched individually.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus Glucose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß12. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the enzymatic production of L-sorbose from glucose, thereby g e k e n n z e i c h n e t that

i. D-Glucose zu D-Sorbitol unter Verwendung einer Aldose-Reduktase (EC 1.1.1.21) enzymatisch re¬ duziert wird undi. D-glucose is enzymatically reduced to D-sorbitol using an aldose reductase (EC 1.1.1.21) and

ü. D-Sorbitol zu L-Sorbose enzymatisch unter Ver¬ wendung einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol- Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) oder L-Sorbose-De- hydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,ü. D-sorbitol to L-sorbose enzymatically using a sorbitol dehydrogenase, L-iditol Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) or L-sorbose dehydrogenase (EC 1.1.1.123) is oxidized,

wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder aber sepa¬ rat durchgeführt werden.the reactions being carried out in the same reactor or else separately.

13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß13. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the enzymatic production of L-sorbose from D-fructose, thereby g e k e n n z e i c h n e t that

i. . D-Fructose zu D-Sorbitol enzymatisch unter Ver¬ wendung von Sorbitol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.14) bzw. iner Polyoldehydrogenase (EC 1.1.1.139) reduziert wird.i. . D-fructose to D-sorbitol is reduced enzymatically using sorbitol dehydrogenase (EC 1.1.1.14) or its polyol dehydrogenase (EC 1.1.1.139).

ii. D-Sorbitol zu L-Sorbose unter Verwendung von einer Sorbitol-Dehydrogenase, L-Iditol-Dehydro- genase oder L-Sorbo≤e-Dehydrogenase (EC 1.1.1.123) oxidiert wird,ii. D-sorbitol is oxidized to L-sorbose using a sorbitol dehydrogenase, L-iditol dehydrogenase or L-sorbo≤e dehydrogenase (EC 1.1.1.123),

wobei die Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden.the reactions being carried out in the same reactor or individually.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur enzymatischen Herstellung von L-Sorbose aus D-Fructose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß14. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the enzymatic production of L-sorbose from D-fructose, thereby g e k e n n z e i c h n e t that

i. D-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose-Reduktase aus Gluconobacter cerinus (EC 1.1.1.124) zu 5-Keto-Fructose enzymatisch oxidiert wird ^und i. D-fructose is enzymatically oxidized to 5-keto-fructose by a 5-keto-fructose reductase from Gluconobacter cerinus (EC 1.1.1.124) ^and

ii. 5-Keto-Fructose durch eine 5-Keto-Fructose- Reduktase aus Hefe (EC 1.1.1.124) enzymatisch zu L-Sorbose reduziert wird,ii. 5-keto-fructose is enzymatically reduced to L-sorbose by a 5-keto-fructose reductase from yeast (EC 1.1.1.124),

wobei die beiden komplementären Reaktionen jeweils im gleichen Reaktor oder auch einzeln durchgeführt werden . wherein the two complementary reactions are carried out in the same reactor or individually.

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß15. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the production of 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose, characterized g e k e n n z e i c h n e t that

5 i. L-Sorbose zu L-Sorboson unter Verwendung von5 i. L-Sorbose to L-Sorboson Using

L-Sorbose-Dehydrogenase ls Enzym oxidiert wird undL-sorbose dehydrogenase is oxidized as an enzyme and

ii. L-Sorboson unter Verwendung von L-Sorboson-Oxi- 0 dase oder L-Sorboson-Dehydrogenase zu 2-Keto-L- gulonsäure oxidiert wird.ii. L-sorbosone is oxidized to 2-keto-L-gulonic acid using L-sorbosone oxide or L-sorbosone dehydrogenase.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n - 5 z e i c h n e t , daß die beiden oxidativen Dehydrcgenase-ϊteak- tionen, die zur Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sor¬ bose führen, mit der reduktiven Umsetzung von D-Fructose zu Mannitol mittels Mannitol-Dehydrogenase^' gekoppelt wird, wobei alle Reaktionen im gleichen Reaktor oder auch ein- _Q zeln durchgeführt werden.16. The method according to claim 15, characterized - 5 characterized in that the two oxidative dehydrcgenase reactions which lead to the formation of 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose with the reductive reaction of D-fructose is coupled to mannitol using mannitol dehydrogenase ^", wherein all the reactions in the same reactor or mono- _Q are performed individually.

17. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Ausgangsmaterialien17. The method according to claim 9 or 10, characterized g e ¬ k e n n z e i c h n e t that as starting materials

5 ( 1 ) D-Galacturonsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohle¬ hydrate ;5 (1) D-galacturonic acid-containing naturally occurring or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates;

(2) D-Glucuronsäure enthaltende natürlich vorkommende 0 oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;(2) D-glucuronic acid-containing naturally occurring 0 or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates;

(3) D-Mannuronsäure enthaltende natürlich vorkommende oder synthetische polymere bzw. oligomere Kohlehydrate;(3) D-mannuronic acid-containing naturally occurring or synthetic polymeric or oligomeric carbohydrates;

5 (4) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose enthaltende Disaccharide; (5) D-Galactose und/oder D-Glucose und/oder D-Fructose und/oder D-Mannose;5 (4) disaccharides containing D-galactose and / or D-glucose and / or D-fructose; (5) D-galactose and / or D-glucose and / or D-fructose and / or D-mannose;

(6) D-Glucose, D-Galactose oder D-Mannose enthaltende Homo- oder Heteropolyglykane;(6) homo- or heteropolyglycans containing D-glucose, D-galactose or D-mannose;

(7) myo-Inositol bzw. sein Hexaphosphat (Phytinsäure) oder myo-Inositol-1-phosphat;(7) myo-inositol or its hexaphosphate (phytic acid) or myo-inositol-1-phosphate;

(8) Pectine;(8) pectins;

(9) Alginsäure;(9) alginic acid;

(10) Stärke, Maltose, Cellobiose, Lactose oder Saccharose verwendet werden.(10) Starch, maltose, cellobiose, lactose or sucrose can be used.

18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von L-Ascorbinsäure -aus Pectinen durch18. The method according to at least one of claims 1 to 10 for the production of L-ascorbic acid from pectins by

(1) . enzymatische Hydrolyse des Pectins zu Pectinsäure bei pH 4-9;(1) . enzymatic hydrolysis of the pectin to pectic acid at pH 4-9;

(2) enzymatische Hydrolyse der Pectinsäure zu D-Galacturon¬ säure bei pH 4-6; (3) Lactonisierung der D-Galacturonsäure zu ihrem -Lacton;(2) enzymatic hydrolysis of the pectic acid to D-galacturonic acid at pH 4-6; (3) lactonization of D-galacturonic acid to its lactone;

(4) Reduktion der Galacturonsäure bzw. ihres -Lactons zu L-Galactonsäure bzw. dessen ι -Lacton;(4) reduction of galacturonic acid or its lactone to L-galactonic acid or its ι lactone;

(5) Oxidation des L-Galactonsäure-; -lactons zu 2-Keto- L-Galactonsäure-. -lacton sowie Umlagerung zu L-Ascorbinsäure,(5) oxidation of L-galactonic acid; lactones to 2-keto-L-galactonic acid. lactone and rearrangement to L-ascorbic acid,

dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daßbecause of the fact that

a) die Stufen (1) und (2) getrennt oder in einem ge¬ meinsamen Reaktor durchgeführt werden; b) die Stufen (3) , (4) und (5) gemeinsam in einem Reaktor durchgeführt werden;a) stages (1) and (2) are carried out separately or in a common reactor; b) stages (3), (4) and (5) are carried out together in one reactor;

c) die Hydrolyse-Reaktionen (1) und (2) enzymatisch ablaufen;c) the hydrolysis reactions (1) and (2) take place enzymatically;

d) die Bildung des L-Galactonsäure- -lactons (3) enzymatisch oder chemisch vorgenommen wird;d) the formation of the L-galactonic acid lactone (3) is carried out enzymatically or chemically;

e) die Reduktion der D-Galacturonsäure bzw. ihres )ⁱ-Lactons zu L-Galactonsäure (4) bzw. ihres y- Lactons enzymatisch erfolgt;e) the reduction of D-galacturonic acid or its ^i- lactone to L-galactonic acid (4) or its y-lactone is carried out enzymatically;

f) die Oxidation des L-Galactonsäure-,}-lactons zu 2-Keto-L-galactonsäure-γ-lacton enzymkatalysiert abläuft undf) the oxidation of the L-galactonic acid,} - lactone to 2-keto-L-galactonic acid-γ-lactone takes place under enzyme catalysis and

g) die Reaktionen (4) und (5) über ein gemeinsames Redoxsystem (Cof aktor System) miteinander verknüpft sind.g) the reactions (4) and (5) are linked to one another via a common redox system (cof actuator system).

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß der gekoppelte Reduktions- (7) und Oxidationsprozeß (5) mit Hilfe des intersequentiellen Regenerationssystems g) kontinuierlich durchgeführt werden kann.19. The method according to claim 18, characterized in that the coupled reduction (7) and oxidation process (5) can be carried out continuously with the aid of the sequential regeneration system g).

20. Verfahren nach Anspruch 10 oder 19, dadurch g e ¬ k e n n z e i c h n e t , daß als Hydrolyseenzym (1) Pectinmethylesterase (EC 3.1.1.11) , als Hydrolyseenzym (e) (2) ein Komplex oder ein Gemisch aus Endo-Polygalacturonase20. The method according to claim 10 or 19, characterized in that as hydrolysis enzyme (1) pectin methyl esterase (EC 3.1.1.11), as hydrolysis enzyme (s) (2) a complex or a mixture of endo-polygalacturonase

(EC 3.2.1.15) und Exo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.67) sowie Exo-Poly-Λ-D-Galacturonosidase (EC 3.2.1.82) , als Reduktionsenzym (4) eine L-Hexonat-Dehydrogenase oder eine D-Glucuronat-Reduktase (EC 1.1.1.19), zur Bildung des entsprechenden -Lactons (3) eine L-Aldono-(EC 3.2.1.15) and exo-polygalacturonase (EC 3.2.1.67) and exo-poly-Λ-D-galacturonosidase (EC 3.2.1.82), as reducing enzyme (4) an L-hexonate dehydrogenase or a D-glucuronate Reductase (EC 1.1.1.19), to form the corresponding lactone (3) an L-aldono-

Lactonase (EC 3.1.1.18) bzw. eine schwache Säure, und als Oxidationsenzym eine L-Galactonsäure-^'-lacton Dehydrogenase verwendet werden. Lactonase (EC 3.1.1.18) or a weak acid, and an L-galactonic acid - ^ '- lactone dehydrogenase can be used as the oxidation enzyme.

21.^" Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von Ascorbinsäure aus Alginsäure durch21. ^"The method according to at least one of claims 1 to 9 for the production of ascorbic acid from alginic acid

(1) Hydrolyse der Alginsäure zu D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure;(1) hydrolysis of alginic acid to D-mannuronic acid and L-guluronic acid;

(2) Reduktion der D-Mannuronsäure zu D-Mannonsäure;(2) reduction of D-mannuronic acid to D-mannonic acid;

(3) Oxidation der D-Mannonsäure zu D-Fructuronsäure und(3) Oxidation of D-mannonic acid to D-fructuronic acid and

(4) Isomerisierung der D-Fructuronsäure zu D-Glucuron^¬ säure;(4) the isomerization of D-fructuronic to D-glucuronic acid ^¬;

(5) Umwandlung von D-Glucuronsäure in L-Ascorbin¬ säure gemäß Anspruch 9,(5) conversion of D-glucuronic acid into L-ascorbic acid according to claim 9,

dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daßbecause of the fact that

a) die Stufen (2) , (3) und (4) gemeinsam in einem Reaktor- durchgeführt werden;a) stages (2), (3) and (4) are carried out together in one reactor;

b) die Hydrolysereaktion (1) enzymatisch oder chemisch abläuft;b) the hydrolysis reaction (1) proceeds enzymatically or chemically;

c⁾ die Reduktion von D-Mannuronsäure zu D-Mannon¬ säure (2) enzymatisch erfolgt;c ⁾ the reduction of D-mannuronic acid to D-mannonic acid (2) is carried out enzymatically;

d) die Oxidation von D-Mannonsäure zu D-Fructuron¬ säure (3) enzymatisch katalysiert wird;d) the oxidation of D-mannonic acid to D-fructuronic acid (3) is catalyzed enzymatically;

e⁾ die Isomerisierung von D-Fructuronsäure zu D-Glucuronsäure (4) sowohl chemisch als auch enzymatisch durchgeführt werden kann, unde ⁾ the isomerization of D-fructuronic acid to D-glucuronic acid (4) can be carried out both chemically and enzymatically, and

f) die Reaktionen (2) und (3) über ein gemeinsames Redoxs stem (Cofaktorsyste ) miteinander verknüpft sind. f) the reactions (2) and (3) are linked via a common redox system (cofactor system).

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß der gekoppelte Reduktions- (2) und Oxidationsprozeß (3) mit Hilfe des intrasequentiel¬ len Cofaktor-Regenerationssystems kontinuierlich durch- führbar ist.22. The method according to claim 21, characterized in that the coupled reduction (2) and oxidation process (3) can be carried out continuously with the aid of the intrasequentiel¬ len cofactor regeneration system.

23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, 21 oder 22, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß die hydrolytische Spaltung der Alginsäure (1) mit verdünnten Säuren oder enzymatisch durch alginolytische Enzyme, wie23. The method according to at least one of claims 1 to 12, 21 or 22, characterized in that the hydrolytic cleavage of the alginic acid (1) with dilute acids or enzymatically by alginolytic enzymes, such as

Polyuronasen (Alginasen), erfolgt, für den Reduktions¬ schritt (2) eine D-Mannuronat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.131) oder eine I ^___nnonat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.34) , für den Oxidationsschritt (3) eine Fructuronat-ReduktasePolyuronases (alginases), for the reduction step (2) a D-mannuronate dehydrogenase (EC 1.1.1.131) or an I ^ ___ nnonate dehydrogenase (EC 1.2.1.34), for the oxidation step (3) a fructuronate Reductase

(EC 1.1.1.57) und für die Isomerisierung zu D-Glucuron- säure (4) eine Glucuronat-iso erase (EC 5.3.1.12) oder eine verdünnte Säure verwendet werden.^' (EC 1.1.1.57) and for the isomerization to D-glucuronic acid (4) a glucuronate iso erase (EC 5.3.1.12) or a dilute acid can be used. ^'

24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zur enzymatischen Herstellung von D-Glucuronsäure aus -stärke, Saccharose, Maltose, Cellobiose oder Phytinsäure durch24. The method according to at least one of claims 1 to 9 for the enzymatic production of D-glucuronic acid from starch, sucrose, maltose, cellobiose or phytic acid

(1) phosphorolytische Spaltung der betreffenden Poly- oder Disaccharide zu Glucose- 1 -phosphat;(1) phosphorolytic cleavage of the poly- or disaccharides in question to glucose-1-phosphate;

(2) Umwandlung zu Glucose-6-phosphat ;(2) conversion to glucose-6-phosphate;

(3) oxidative Cyclisierung zu Inositol-1 -phosphat ;(3) oxidative cyclization to inositol-1 phosphate;

(4) Hydrolyse des Phosphatrests in 1 -Stellung;(4) hydrolysis of the phosphate residue in the 1 position;

(5) Oxidation des myo-Inositols zu D-Glucuronsäure oder(5) Oxidation of the myo-inositol to D-glucuronic acid or

(6) Hydrolyse der Phosphatreste von Phytinsäure (myo- Inositol-hexaphosphat ) und anschließende Oxida¬ tion gemäß (3) , dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß(6) hydrolysis of the phosphate residues of phytic acid (myo-inositol hexaphosphate) and subsequent oxidation according to (3), characterized in that

a) die phosphorolytische Spaltung (1) enzymatisch erfolgt;a) the phosphorolytic cleavage (1) is carried out enzymatically;

b) die Umwandlung (2) enzymatisch durchgeführt wird;b) the conversion (2) is carried out enzymatically;

c) die oxidative Bildung des Cyclitols (3) enzyma- tisch erfolgt;c) the oxidative formation of cyclitol (3) takes place enzymatically;

d) die Abspaltung der Phosphatreste (4) , (6) durch enzymatischen Angriff oder chemisch erfolgt undd) the phosphate residues (4), (6) are split off by enzymatic attack or chemically and

e) die Oxidationsreaktion (5) enzymatisch durchge¬ führt wird.e) the oxidation reaction (5) is carried out enzymatically.

25. Verfahren nach Anspruch 24 zusammen mit dem Ver¬ fahren der Ansprüche 9 oder 10, dadurch g e k e n n - z e i c h n e t , daß die oxidative Cyclisierung von Glucose-6-phosphat zu myo-Inositol-1-phosphat (3) mit der Reduktion von D-Glucuronsäure (bzw. ihrem y-Lacton) zu Gulonsäure (bzw.¹ ihrem ^•.^' -Lacton) über einen gemein¬ samen Cofaktor (Redoxsystem) miteinander verknüpft ist und diese beiden Reaktionen gemeinsam mit (4) und (5) im gleichen Reaktor kontinuierlich ablaufen und in diesem Fall die weitere Oxidation von L-Gulonsäure-y- lacton zu 2-Keto-L-gulonsäure- -lacton durch eine Oxidase (EC 1.1.3.8) katalysiert wird.25. The method according to claim 24 together with the method of claims 9 or 10, characterized in that the oxidative cyclization of glucose-6-phosphate to myo-inositol-1-phosphate (3) with the reduction of D- Glucuronic acid (or its y-lactone) to gulonic acid (or ¹ its ^• . ^' -Lactone) is linked together via a common cofactor (redox system) and these two reactions together with (4) and (5) in the same reactor run continuously and in this case the further oxidation of L-gulonic acid y-lactone to 2-keto-L-gulonic acid lactone is catalyzed by an oxidase (EC 1.1.3.8).

26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß die phosphorolytische Spaltung von Stärke oder Saccharose (1) mit Phosphory- lasen (EC 2.4.1.1; EC 4.2.1.7, EC 2.4.1.8) erfolgt-und die Umwandlung (2) eine Phosphoglucomutase (EC 2.7.5.5) , für den Prozeß der oxidativen Cyclisierung (3) eine myo- Inositol-1-phosphat-Synthase (EC 5.5.1.8) , für die hydrolytische Abspaltung der Phosphatreste (4), (6) spezifische Phosphatasen (EC 3.1.3.8; EC 3.1.3.25; EC 3.1.3.26), für die Oxidationsreaktionen zu D- Glucuronsäure (5) eine myo-Inositol-Oxygenase (EC 1.13.99.1) und für die Oxidation von L-Gulonsäure- y-lacton eine L-Gulonolacton-Oxidase (EC 1.1.3.8) ver¬ wendet werden.26. The method according to claim 24 or 25, characterized in that the phosphorolytic cleavage of starch or sucrose (1) with phosphorylases (EC 2.4.1.1; EC 4.2.1.7, EC 2.4.1.8) takes place - and the conversion (2nd ) a phosphoglucomutase (EC 2.7.5.5), for the process of oxidative cyclization (3) a myo-inositol-1-phosphate synthase (EC 5.5.1.8), for which hydrolytic cleavage of the phosphate residues (4), (6) specific phosphatases (EC 3.1.3.8; EC 3.1.3.25; EC 3.1.3.26), for the oxidation reactions to D-glucuronic acid (5) a myo-inositol oxygenase (EC 1.13. 99.1) and an L-gulonolactone oxidase (EC 1.1.3.8) can be used for the oxidation of L-gulonic acid-y-lactone.

27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D- Gluconsäure, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß27. The method according to at least one of claims 1 to 8 for the production of 2-keto-L-gulonic acid from D-gluconic acid, thereby g e k e n n z e i c h n e t that

i. D-Gluconsäure zu 5-Keto-D-gluconsäure durch 5-Keto- gluconat-Reduktase (EC 1.1.1.69) oxidiert wird undi. D-gluconic acid is oxidized to 5-keto-D-gluconic acid by 5-keto-gluconate reductase (EC 1.1.1.69) and

ii. 5-Ketogluconat durch eine Idonat-Dehydrogenase aus Brevibacterium oder Fusarium zu L-Idonsäure redu¬ ziert wird und nachfolgendii. 5-ketogluconate is reduced to L-idonic acid by an idonate dehydrogenase from Brevibacterium or Fusarium and subsequently

iii. L-Idonsäure durch Enzyme aus Pseudomonas, Aceto¬ bacter oder Micrococcen zu 2-Keto-L-gulonsäure oxi¬ diert wird undiii. L-idonic acid is oxidized to 2-keto-L-gulonic acid by enzymes from Pseudomonas, Aceto¬ bacter or micrococci and

iv. gleichzeitig D-Fructose durch Sorbitol-Dehydrogena¬ se (z.B. EC 1.1.1.14) zu D-Sorbitol oder durch Man¬ nitol-Dehydrogenase (z.B. EC 1.1.1.67) zu Mannitol reduziert wird.iv. at the same time D-fructose is reduced to d-sorbitol by sorbitol dehydrogenase (e.g. EC 1.1.1.14) or to mannitol by mannitol dehydrogenase (e.g. EC 1.1.1.67).

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch g e k e n n¬ z e i c h n e t , daß28. The method according to claim 27, characterized g e k e n n¬ z e i c h n e t that

i. die enzymatische Oxidation von D-Gluconsäure zu 5- Keto-D-gluconsäure mit der enzymatischen Reduktion von D-Fructose zu D-Sorbitol oder D-Mannitol gekop¬ pelt wird und dadurch der gemeinsame Cofaktor rege- neriert wird und damit kontinuierlich gearbeitet werden kann undi. the enzymatic oxidation of D-gluconic acid to 5-keto-D-gluconic acid is coupled with the enzymatic reduction of D-fructose to D-sorbitol or D-mannitol and thereby the common cofactor is actively is generated and can thus be worked continuously and

die nachfolgende Reduktion von 5-Keto-D-gluconsäu- re zu L-Idonsäure mit der vom gleichen Cofaktor ab¬ hängigen enzymatischen Oxidation von L-Idonsäure zu 2-Keto-L-gulonsäure zu einem intrasequentiellen Co- faktorregenerationssystem verknüpft wird. the subsequent reduction of 5-keto-D-gluconic acid to L-idonic acid is combined with the enzymatic oxidation of L-idonic acid to 2-keto-L-gulonic acid, which is dependent on the same cofactor, to form an intrasequential cofactor regeneration system.