WO1986002947A1 - Human lysozyme synthesizing gene - Google Patents

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WO1986002947A1
WO1986002947A1 PCT/JP1984/000546 JP8400546W WO8602947A1 WO 1986002947 A1 WO1986002947 A1 WO 1986002947A1 JP 8400546 W JP8400546 W JP 8400546W WO 8602947 A1 WO8602947 A1 WO 8602947A1
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Morio Ikehara
Makoto Kida
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant DNA technology for producing human lysozyme. More specifically, the present invention relates to the chemical synthesis and expression of human 'lysozyme gene, recombinant plasmids and transformed cells related to those techniques, and products resulting therefrom.
  • Lysozyme is a relatively small enzyme protein with a molecular weight of about 14,000, which is widely distributed in living organisms and has a lytic effect on many bacteria. It is thought that it is a concept. It is believed that the main function of this action is the hydrolysis of polysaccharides on the cell wall by the activity of 1-dalcosidase. Nitrile egg white contains a particularly large amount of lysozyme, and high-purity lysozyme can be isolated relatively easily, so that it can be added to cheese, sausage, seafood, or used for milk preservation. It is used for the purpose of emulsification of mothers [Katsuya Hayashi, Taiji Imoto, Lysozyme, Nankodo (1974)].
  • pharmacological actions such as hemostasis, anti-inflammatory, tissue regeneration, and antitumor properties are known (for example, "Recent New Drugs, Vol. 34", p. 107, Pharmaceutical Daily, Tokyo, 19). 8 3) It is commercially available as an anti-inflammatory enzyme agent.
  • Human lysozyme is composed of 130 amino acids (Table 1), and 53 amino acids differ from those of hen egg white lysozyme.
  • the optimal sequence was determined according to the following criteria. i) Use the most permissive codons in yeast that are deemed appropriate for the expression of the synthetic gene. ii) Placing a specific restriction enzyme recognition site (XbaI in this case) in the gene to serve as an index for cloning or to facilitate gene modification after the construction of an expression vector . iii) Avoid sequences that are self-complementary on either strand or duplex, or complementary to other sequences (other than the correct sequence). Assuming that the above conditions are satisfied, The nucleotide sequence was determined.
  • ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA
  • the present invention provides a synthetic gene for expressing human lysozyme represented by the above DNA sequence.
  • the DNA of the present invention is the same as the DNA of the present invention except that the above-mentioned synthetic arrestor itself is linked to a certain restriction enzyme recognition site, start codon, and stop codon at its 5 ′ and 3 ′ ends. It can be used for convenience of operations such as recombination of arrested children. As an example of this,
  • XhoI cleavage site has a start codon ATG, and at the 3 'end, TATAGAGC
  • XhoI cleavage site and those having TAA and TAG, which are stigcodons.
  • recombinant plasmids incorporating these DNAs are also included in the category of the present invention.
  • the gene can be produced, for example, by synthesizing a plurality (about 2 to 80) of oligodoxynucleotides and linking them, for example, as shown in Table 2. For example, by dividing into 52 oligonucleotide nucleotides' blocks, for example, [H.I to, ⁇ . ⁇ ,, I ke, S. I kuta, K. I takuraj Nucleic Acids Res., 10, 1755 (1992)). Oligonucleotide blocks are hybridized using known methods and linked enzymatically (e.g.,
  • the method of division into these fragments is not limited to the above, as long as care is taken to avoid the above-mentioned self-association, and various divisions are possible. is there.
  • the next floor is to sub-clonal the first step by incorporating it into an appropriate vector in order to increase the number of synthetic arrestors obtained in this way. Any vector may be used as long as the arresting element can be incorporated into the vector.
  • Transformation methods are known per se, and when Escherichia coli is used as a host, for example, the method of Choen et al. [Cohen, S.N.eta1.Proc.Nat1.Acad.S USA, 69, 2110 (1972)], when yeast is used as a host, for example, Hin Nat. A eta 1. Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (19778)], when using Bacillus subtilis as a host, for example, Protoplast method
  • Transformation can be carried out, respectively, according to CDubna, D. & Abelson, R. D, J. Mo1. Biol. 56, 2009 (1971)).
  • E. coli 294, E. coliw 3110, E. coli C600, B. subti 1 is 1 A1, B. subtilis 1 A33 39, B. subtilis 1A340 can be used.
  • the plasmid DNA into which the gene has been inserted is subjected to, for example, an alkaline extraction method [Birnboim, HC, & Dolly, J .: Nucleic Acids R. es., 7_, 1513 (19779)].
  • the inserted plasmid is cut out by treating the obtained plasmid DNA with an appropriate restriction enzyme, and the gene can be isolated by, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide electrophoresis. .
  • These series of operations are known, and are described in detail in the literature, for example, [Moe ecu ar CI Oning (1992), Old Spring Harbor Laboratory].
  • the simulated arrestor is indirectly ligated with the promoter downstream of the promoter of an appropriate expression vector to construct an expression plasmid.
  • an appropriate expression vector to construct an expression plasmid.
  • Any expression vector may be used as long as it can be actually used for expression of the gene.
  • the aforementioned p PHO 17, PGLD 906, P trp 770 (JP-A-58-210 796), PRC 23 (JP-A-58-18991) 9 7), P BTM 1 3 4, P TEX 2 0 but 1 and the like, PPHO 1 7 and PGLD 9 0 6 Gayo Ri preferred arbitrariness.
  • Animal cells and other eukaryotic cells can also be used as expression hosts.
  • a vector a plasmid having an XhoI cleavage site downstream of the promoter is more preferable.
  • the host cell is transformed with the obtained expression plasmid to obtain the desired recombinant.
  • the transformant thus obtained is cultured by a method known per se.
  • the culture medium may be, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Millu, J., Experiments in Molecu 1 ar Genetics, 4 3 1-4 3 3 ( C old S spring H abor L aboratory), Ne
  • the reaction is carried out at C for 10 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, and may be aerated or agitated as necessary.
  • the medium include L-broth and BHI (Brain Heart Infusion).
  • the culture temperature is usually about 15 ° C to 42 ° C, more preferably about 24: to 37 ° C, and the pH of the culture medium is about 5.0 to 9 with the initial pH. 0, and more preferably about 6.5-7.5.
  • the cultivation time is usually about 2 to 72 hours, and more preferably 3 to 48 hours. After completion of the culture, the cells and the supernatant are separated by a method known per se.
  • transformants of Escherichia coli and Bacillus subtilis are used alone or in combination with the freeze-thaw method, the lysin treatment method, the ultrasonic treatment method, etc.
  • yeast transformants the cells are destroyed by adding Zymolyase (manufactured by Kirin Brewery Co., Ltd.) or by mechanical soiling with glass beads or the like.
  • lysozyme produced by adding a surfactant such as Triton X-100, deoxycolate or a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride to this. Can be extracted.
  • Lysozyme produced in or outside the cells in this manner can be purified by conventional protein purification methods such as salting out, isoelectric focusing, crystallization, ion-exchange chromatography, and high-performance liquid chromatography. -(HPLC, FPLC, etc.) to obtain the desired lysozyme.
  • FIG. 1 and FIG. 2 show construction diagrams of the plasmids PPH0117 and PGLD906 shown in Reference Examples 1 and 2, respectively.
  • FIG. 3 is a restriction map of the promoter cloning vector PBT M126 shown in Reference Examples 3 and 4, and a restriction map of the PBTM128 incorporating the promoter.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of the promoter DNA obtained from pBT Ml28. '
  • FIG. 5 shows a construction diagram of the plasmid pBTM13 shown in Reference Example 6.
  • FIG. 6 is a restriction map of 'pBT Ml 27 incorporating a neutral protease arrestor.
  • Fig. 7 and Fig. 8 are diagrams showing a subling of a child with a neutral proteathesis.
  • Fig. 9 is a restriction map of DNA containing a neutral protease arrestor.
  • Bg is Bgin
  • T is Taql
  • Sa is Sac ac
  • Ha is HaeIH
  • S is Sau3AI
  • A is Accl
  • Be is Be1I
  • H Indicates Hind HI.
  • FIG. 10 shows a part of the nucleotide sequence of the neutral protease gene.
  • FIG. 11 and FIG. 12 show the construction diagrams of the plasmids PT ⁇ X 201 and ⁇ ⁇ 374 shown in Reference Example 10 respectively.
  • Fig. 13 and Fig. 14 show a part of the sequence coding for the mature protein of Penicillinase in ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 374.
  • FIG. 4 is a diagram showing a method for synthesizing a human lysozyme gene by assembling and linking genes.
  • the sample was electrophoresed in 0 mM Tris-HCl, 100 mM boric acid, 2 mM EDTA (pH 8.0)] at 140 V for 2 hours. After the electrophoresis, the gel fragment containing the 0.63 kb DNA fragment was sealed in a dialysis tube, submerged in a buffer for electrophoresis, and the DNA fragment was eluted from the gel electrically! : DcDonell, M.W. et al., J.Mo ".B
  • 1 g of the plasmid PSH 19 was added to 2 units of the restriction enzyme BamHI and 2 units of the restriction enzyme Sa1I in a reaction solution of 201 [10 mM MTris-HCl (pH 8 . 0), 7 m MM g C 1 2, 1 0 0 m MN a C 1, 2 m M 2- mercapto Bok ethanol] 3 7 ° C in two hours after the action, the reaction mixture 0 Electrophoresis was carried out on an 8% agarose * slab gel under the conditions described above. After electrophoresis, 8.
  • the 0 kb DNA fragment was separated from the gel by the above-described method, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol (see FIG. 1).
  • 3 g of plasmid p PH012 DNA was mixed with 2 units of restriction enzyme Sa1I in a reaction mixture of 201 (10 mM MTris-HC1 (P H 7. 5), 7 m MM g C 1 2, 1 7 5 m MN a C 1, 0. 2 MEDTA, 7 m M 2- mercapto Toeta Nord] 3 in 7. C. After acting for 2 hours, the proteins were deproteinized with phenol, and the DNA was precipitated with cold ethanol. To 3 g of this DNA, 12 units of BAL31 nuclease (Bethhesda Research Laboratories) was added to a reaction mixture of 501 [20 mM MTris-HC1 (pH 8.
  • XhoI linker d (CCTCGAGG) (New Zealand Bio Labs) was added 3 units of T4 poly, nucleotide 'kinase [Takara Shuzo Co., Ltd.].
  • a 50 1 reaction mixture C 50 mM MT ris-HCl (pH 7.6), 10 mm MM g C 12, 10 mM 2 — Menolecaptoethanol, 100 MATP] The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end.
  • Pgap 491 Holland, J. P. et al., J. Biol. Chem., 2558, 5291 (1983)
  • GLD GLD from the N-terminal side 5′—AGCAACTCTAACCAT—3 ′
  • Crea R. et al.
  • Ci was added to 1 g of the oligonucleotide.
  • Bruno - [JZ P] ATP (a mersham Co.) and 1 0 units T 4 poly Nuku Reochi de kinase and the 3 0 1 of the reaction solution [5 0 m MT ris -.
  • HC 1 (P H 7 6 ), 10 mM MM g C 12, 10 mM M 2 —mercaptoethanol] for 37, 30 minutes, and labeled at the end with, 200 mM MEDTA ( pH 8.0) was added, and the protein was deproteinized with 1 volume of phenol.Then, TEN buffer (1 Om MTris-HC1 (pH 8.0), 200 mM Na C 1, 1 m MEDTA] Sepharose 4B (? 1131: 111 & (1: 1 & Co.)) * Column (0.25 x 25 cm) ) To collect the labeled oligonucleotides that are eluted near the voidvolume was used as a probe for screening.
  • P TR26 2 (Roberts, T, M. et al., Gene 12, 123 (1980)) 0.1 g digested with Hin (i III) and DNA 0 of domain number 7 And 2 g were mixed with each other by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. Using the reaction mixture, E. coli DH1CManiatis, T. et al. loning, ColdSpring * —Harbor Laborator 2 5 4 —2 5 5 (1 9 8 2)] was transformed to obtain about 1,200 ⁇ of tetracycline shochu transformant.
  • Plasmid PGLD 9 DNA 1 0 0 g to 5 0 Yuni' Bok restriction enzyme H ind III 2 0 0 1 of the reaction solution [1 O m MT ris - HC 1 (. P H 7 5), 7 m MM g C l 2 , 60 m MN a C 1]
  • the DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on 1 g of the 0.36 kb DNA fragment under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive end of Taq I to a blunt end.
  • 1 g of this fragment and 50 ng of the phosphorylated XhoI linker described in Reference Example 1 were mixed, and T4 DNA ligase was allowed to act under the conditions described in Reference Example 1.
  • Escherichia coli-Yeast Shuttle 'vector-pSHl95 (5 g) and 6-unit restriction enzyme Sa1I in a reaction solution of 201 (1 Om MTris-HC1 (pH 7.5), . 7 m MM g C 1 2 , 1 7 5 m M a CI, 0 2 m MEDTA, 7 m M 2 - mercapto Toeta no
  • Plasmid p SHl9 Reaction solution of 50 units of 10 units of restriction enzyme BamHI and XhoI in 10 g of 1 DNA [10-m 'MTris-HCl (. p H 7 5), 7 m MM g C l 2, 1 0 0 m MN a C 1, 7 m M 2 - Menorekapu Toeta Nord] 3 in 7. C, and allowed to act for 2 hours, and then subjected to electrophoresis using 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example II. After the electrophoresis, a 8.0 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
  • the 8. O kb DNA fragment 5 0 0 ng was mixed with 0. 3 6 kb DNA fragment 2 0 0 ng and 0. 7 5 kb DNA fragment 2 0 0 n g according to 2 of Example 2, Reference The binding was effected by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Example 1. Escherichia coli DH1 is transformed using the reaction solution, and a recombinant having the plasmid pGLD906 to which three types of DNA fragments are bound is separated from the ampicillin-like transformants. did. WIPO ⁇ Reference example 3
  • Plasmid PBTM1226 was prepared as follows according to the method of Wi11ams et al. Obtained from Fermentation Research Institute
  • DNA was prepared from Bacilluspumilus NCIB 860 (IF.O-12089), and the DNA (6.5 g) was combined with 40 units of restriction enzyme EcoRI and 37, 1 hour. After the reaction and cutting, the mixture was heated at 68 for 15 minutes, and subjected to ethanol precipitation. On the other hand, plasmid PUB110 (2.0 g) was reacted with 20 units of restriction enzyme EcoRI at 37 ° C for 1 hour, cut, and then heated at 68 for 15 minutes. Ethanol precipitation was performed. Both precipitates were dissolved in water and mixed, and the reaction mixture (1001) containing SO nmole ATP, 100 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer was added.
  • Plasmid was prepared from a transformant of Chloram phenicol shochu, which was named PBTM124.
  • PBTM124 plasmid PBTM 124 (2.5 g) was reacted with 14 units of restriction enzyme Pstl for 37 hours for 37 hours, cut, and heated with _68 T1 for 15 minutes, followed by ethanol Knol precipitation was performed.
  • PBTM 125 2.5 ml of Brasmid PBTM 125 was mixed with 18 units of restriction enzyme BamHI and 15 units of restriction enzyme Bg for 1 hour at 37 ° C and 1 ° C. The mixture was cut by reaction, heated at 68 for 15 minutes, and then ethanol precipitated. After dissolving the sediment in water, 1 I in a reaction solution (1001) containing 66 nmo 1 e of ATP, 13 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer was added. : For 28 hours, and used to transform Bacillus' Sacillus MI114. Plasmid was prepared from a kanamycin shochu transformant, and the plasmid was named PBTM126 (see FIG. 3). Reference example 4
  • the promoter cloning vector pBTM126 (2.1 ⁇ g) obtained in Reference Example 3 was treated with the restriction enzyme Pstl (8 units) 37. C, cut for 1 hour, cut with restriction enzyme EcoRI (5 units) for 37, 1 hour, heat at 688 for 15 minutes to stop the reaction, Was performed.
  • the chromosome (6.2 g ) of Baci 1 1 ussubti 1 is JB — 1 166 (IFO — 141 4 4) was analyzed by P stl (24 units) and Eco RI, respectively. It was cut for one hour at 37 ° C, heat-treated at 68 ° C for 15 minutes, and then subjected to ethanol precipitation.
  • the plasmid pBT Ml28 (221g) described in Reference Example 4 was 37 with Ps ⁇ 1 (208 units) and EcoRI (220 units), respectively. After cleavage with C for 1 hour, the mixture was subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The gel was immersed in ethidium bromide solution for staining, and the promoter DNA fragment detected by an ultraviolet lamp was recovered. The DNA fragment was electrically eluted from the gel, and then extracted with ethanol and ether, and precipitated with ethanol. Slow precipitation
  • Plasmid PBTMI28 (7.7, "g) was reacted with the restriction enzyme Pstl (51 udites) for 37 hours, cut for 1 hour, and then cut into 0.75 units of E. coli alkaline phosphatase.
  • the reaction product was collected by phenol extraction and ether extraction, and then ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in a small amount of water.
  • Chromosome DNA was prepared in accordance with the following formula: MethodsinEnzymo1ogy, 68, 342 (19779). 8.8 g of the chromosomal DNA was incised by reacting with 36 units of restriction enzyme Bgin for 37, 50 minutes, heat-treated at 65 ° C for 15 minutes, and added with ethanol to add DNA. Was precipitated. On the other hand, cloning vector pBTM119 (Japanese Patent Laid-Open No. 59-55887) (2.9 g) was added to 30 units of restriction enzyme Bg1 1 and 37 ° C. C.
  • BTM127 This plasmid is located at the Bgin site of the plasmid pBTMl19, and contains a Bgin fragment containing the neutral protease gene of B. amy1 o1 iquefaciens (IFO-141). K b) is imported
  • the plasmid pBTMl27 (80, "g) obtained in Reference Example 7 was reacted with the restriction enzyme Bgin (200 units) 37 for 1 hour, followed by cleavage for 1 hour. A 7% agarose gel was electrophoresed, and the gel of the band with the smaller molecular weight was cut out. The DNA in this gel was electrophoretically eluted. , 1982), about 10 g of a Bgin fragment (3.9 kb) was obtained. The obtained Bgin fragment (3 g) was digested with restriction enzyme Hindm (6 units).
  • Plasmid PBTM 515 is a plasmid in which the A and C fragments are inserted in the Hindm site of plasmid PBTM 126 in opposite directions, and plasmid pBTM 508 is plasmid The B fragment was inserted into the Hindill site of PBTM126 (see Fig.
  • Plasmid PBTM127 (1 g) was treated with EcoRI (3 units) and Bgin (2 units), and plasmid pUB110 (l, "g) was treated with EcoRI. (3 units) and B am H
  • a halo-forming strain was selected from the kanamycin shochu transformants, and the plasmid was selected as pBTM5.
  • the EcoRI-Bg1 ⁇ fragment is composed of the Bg1 P of PBTMI27, a part of the B fragment of the fragment, and the C fragment.
  • PBTM 5 15 (100, "g) was digested with restriction enzymes Bgin (200 units) and HindE (200 units) at 37 ° C for 1 hour, and cut. After 1% agarose gel electrophoresis, about 1.9 Kb of this gel DNA was recovered by electrophoretic elution (manual for arresting children, edited by Yasutaka Takagi, Kodansha). 0 g of the C fragment was obtained.
  • FIG. 9 shows a restriction map of the C fragment.
  • B, subti 1 is 1 A2 7 4 (Bacillus subti 1 is 1 A274 / p BTM5 15), which retains the plasmid pBTM5 15 Four Deposited as 377 7 and deposited under the Budapest Treaty with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry of Japan as FERMBP-622.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequence from the Bg1 site of the C fragment and the translated amino acid sequence.
  • TTGCAG TTGCAG
  • E ⁇ gamma a promoter
  • E 6 37 AGTTTT
  • GAG AT TGCT the 10 region
  • TAGTTTTATA the 10 region
  • the fact that the Bgin—Sau3A1 fragment (530 bp) (see FIG. 9) has promoter activity is based on the fact that the promoter-cloning vector PFTB 281 (Yoshimura et al. The above-mentioned promoter is expected to be functioning because it was confirmed by using the Proceedings of the Annual Meeting of the Showa 58 Meeting, page 28). SD area and open frame exist, from 1st methionine to 27th or 28th alanine The amino acid sequence after the second alanine is the neutral protease sequence reported in the literature !; P. L. Levy et al., Proc. atl. A cad.
  • Plasmid p BTM containing the promoter of the neutral protease gene on the C fragment of BTM5115, a region encoding the signal peptide, and a region encoding the upstream of the peptide.
  • Plasmid PTR10 (see Fig. 11) formed by inserting the Sau3A1 fragment (about 530 bp) into the BamHI site of PFTB281 was digested with EcoRI. An EcoRI fragment of about 53 CTb p was isolated. This fragment is digested with the restriction enzyme Haem, and an EcoRI-Haeltl fragment (about 340 bp) containing a region encoding the promoter and signal peptide up to the C-terminal region is isolated. did. In this fragment? : Hoi linker (CTCTCGAGG) was ligated using T4DNA ligase.
  • the plasmid pMB9 [F. Bolivareta 1., Gene, 75 (1977)] has a plasmid PEN 1 (Osaka University The SacI-PstI fragment (8.5 Kb) was isolated from (obtained from Prof. Yasuji Oshima) (see Fig. 10). This fragment contains the latter part of the signal peptide of penicillinase and the region encoding the mature protein, and the PstI site corresponds to the vicinity of the middle of the region encoding the signal peptide. I do.
  • PUB110 was digested with restriction enzymes Sphl and EcoRI, and a large SP hi-EcoRI fragment (3.5 Kb) was isolated by agarose gel electrophoresis and electrophoretic elution (No. See Figure 1 1).
  • the EcoRI-XhoI fragment (340 bp, 0.5 g) containing the promoter for the neutral protease arrestor and the signal peptide-encoding region obtained above, PENX
  • the Xhol — Sphl fragment (1.9 Kb, 0.5 g) derived from 374 and the Sphl — EcoRI fragment (0.5 g) derived from pUBllO were ligated to T4 DNA ligase. Subsequent ligation was carried out to effect the transformation of B.
  • subti 1 is 1 A274, and among the resulting kanamycin shochu recombinants,
  • PTEX201 5.7 Kb
  • B. subtilisl A 274 B aci 11 ussubtilis 1 A 274 / PTEX 210
  • IF 0—1 4 3 It has been deposited as FERMBP-619 with the Ministry of International Trade and Industry under the Ministry of International Trade and Industry's Institute of Industrial Science and Technology (FRI) under the Butapest Treaty.
  • Each of the oligonucleotide blocks was prepared by solid-phase synthesis, but the nucleosides used as raw materials were immobilized.
  • thymidine resin Aminomethylpoly * styrene resin [1% divinylbenzene, amino group: 0.21 meq Zg, 100-250 mesh) known methods (for example, Miyoshi et al., N ucleic A cids Res., _8_, 5507 (1980))] and prepared by combining 5'-dimethoxytritylthymidine- 3 '-—- succinate
  • the method of dinucleotides is known by the known method [Fig. 15, C. ⁇ . Reese, L.
  • the phosphorylated oligomer solution at the 5'-position was divided into groups [I] to [V] as shown in Fig. 17 and mixed.
  • the total liquid volume was adjusted to be 2361, 66 mM MT ris hydrochloric acid (PH 7.6), 6.6 mM magnesium chloride, 500, "MATP. C for 3 minutes, quench with ice, and soak again in 75 ° C hot water.
  • the sample was left to stand at 15 ° C for 10 minutes, then 0.2 M mercaptoethanol (1311) and T4 DNA ligase (EC 6.5.1.1.1) were added. ; 2.5 U / 1, 1 ⁇ 1) and incubated for 20 hours at 15 ° C.
  • group (IV) (approximately 74 bp) showed a large number of bands due to side reactions.
  • each group (1.5-2, " g ) was ligated with T4 DNA ligase and the complete human lysozyme arrested (approx. This product was obtained on a 5% polyacrylamide gel, about 404 b.
  • both 5 'ends of the DNA were enzymatically phosphorylated by a conventional method.
  • the restriction enzyme Xhol (50 units) was added to the plasmid PGLD906-6 (10 ⁇ g) described in Example 3 in a reaction mixture of 501 (reaction solution for XhoI, supra). After working for 1 hour, the gel was subjected to 1.5% agarose 'slab gel electrophoresis (150 V, 1 hour). After the electrophoresis, the gel piece containing the 409 b DNA fragment was sealed in a dialysis tube. And immersed in the electrophoresis buffer. Eluted (Dc Done 11, M.W., et al., Supra) Extract the solution in the dialysis tube with phenol and ether, then add NaCl to 0.2 M. Subsequently, 2 volumes of cold ethanol were added and the mixture was precipitated at 120.
  • the restriction enzyme Xhol (5 units) was added to the plasmid PPHO17 (1 g) constructed in Reference Example 1 at 37 ° C in a 101 reaction mixture (Xhol reaction mixture). After allowing to act for 1 hour, the protein is deproteinized with phenol, and 50 ng of the DNA fragment containing the human lysozyme gene is mixed with the DNA (10 ng) precipitated with cold ethanol and mixed. DNA was bound according to the procedure described above. Escherichia coli DH-1 was transformed according to the method described in Example 3, and the PH05 promoter and the human lysozyme gene in the very direction were located at the XhoI site of pPHO17 from among the transformants. Into which the introduced plasmid p PH 0 1 ys 101 was obtained.
  • a plasmid PGLD906-5 was obtained in which a GLD promoter and a human lysozyme gene were inserted in the XhoI site of PGLD906.
  • the lysate was centrifuged at room temperature at 5,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant (2 ml). Then M eyer's way! : The supernatant was acidified according to J. Biol. Chem. 113, 303 (19336)], cooled ethanol was added, heat treatment was performed, and the supernatant was collected again. Further, ethanol was added thereto, and the mixture was centrifuged to collect a precipitate. To the precipitate was added 0.4 ml of 50 ⁇ -phosphate phosphate buffer ( ⁇ 7.4) to dissolve the precipitate, and 0.1 ml of the solution was used to determine the activity. Served in quantity.
  • Human lysozyme has pharmacological actions such as anti-inflammation, hemostasis, tissue regeneration, and antitumor properties, and is used as an anti-inflammatory enzyme in eye drops and as a food preservative. Moreover, when used for medical purposes, it does not cause side effects due to an immune response like lysozyme derived from nit egg white, but conventionally, only a small amount has been obtained. '' By providing the human lysozyme synthesis gene of the present invention, it has become possible to supply a large amount of human lysozyme useful as a pharmaceutical product as described above. It is.

Abstract

DNA having a human lysozyme synthesizing gene, process for its preparation, cells transformed with the DNA, process for preparing the transformant, and process for preparing human lysozyme by culturing the transformant. Human lysozyme having anti-inflammatory, hemostatic, tissue-regenerating, and antineoplastic effects and being used as anti-inflammatory enzymatic agent for eye wash or the like without side effects of immunoreaction or as food antiseptic can be produced on a large scale.

Description

明 細 書  Specification
ヒ ト · リ ゾチームの合成遺伝子  Synthetic gene for human lysozyme
技術分野  Technical field
本発明はヒ 卜 · リゾチーム製造のための組換え D N A技術に閟 する。 よ り具体的には、 ヒ ト ' リ ゾチーム遗伝子の化学合成とそ の発現、 それらの技術に関連する組換えプラスミ ド及び形質転換 された細胞及びそれらによる生成物に関する。  The present invention relates to a recombinant DNA technology for producing human lysozyme. More specifically, the present invention relates to the chemical synthesis and expression of human 'lysozyme gene, recombinant plasmids and transformed cells related to those techniques, and products resulting therefrom.
背景技術  Background art
リゾチームは分子量約 1 4 ， 0 0 0 の比較的小さい酵素蛋白で あって、 広く生体内に分布し、 多く の細菌に対して溶菌作用を示 すこ ^と によって、 細菌の感染に対する防禦,物質と して讎いている と考えられている。 その作用の本体は、 ^一ダルコシダ一ゼ活性 による細胞壁の多糖類の加水分解にある と されている。 ニヮ ト リ 卵白には特に多く リ ゾチームが含まれており、 比較的容易に純度 の高いものが単離できるため、 食品保存上、 チーズ、 ソーセージ、 水産食品に添加された り、 牛乳のヒ 卜母乳化の 目的で使用されて いる 〔林 勝哉， 井本泰治， リ ゾチーム， 南江堂 （ 1 9 7 4 ) 〕 。 又、 薬理作用と して、 止血、 抗炎症、 組織再生、 抗腫瘍性などが 知られており （例えば "最近の新薬 3 4集" 1 0 7頁、 薬事日 報.社， 東京， 1 9 8 3 ) 、 消炎酵素剤と して市販されているもの である。  Lysozyme is a relatively small enzyme protein with a molecular weight of about 14,000, which is widely distributed in living organisms and has a lytic effect on many bacteria. It is thought that it is a concept. It is believed that the main function of this action is the hydrolysis of polysaccharides on the cell wall by the activity of 1-dalcosidase. Nitrile egg white contains a particularly large amount of lysozyme, and high-purity lysozyme can be isolated relatively easily, so that it can be added to cheese, sausage, seafood, or used for milk preservation. It is used for the purpose of emulsification of mothers [Katsuya Hayashi, Taiji Imoto, Lysozyme, Nankodo (1974)]. Also, pharmacological actions such as hemostasis, anti-inflammatory, tissue regeneration, and antitumor properties are known (for example, "Recent New Drugs, Vol. 34", p. 107, Pharmaceutical Daily, Tokyo, 19). 8 3) It is commercially available as an anti-inflammatory enzyme agent.
これらニヮ ト リ卵白由来の リ ゾチームを医薬的目的で使用する 場合には、 しばしば発疹、 発赤などの過敏症状の現れる こ と があ リ、 これは異種蛋白による免疫応答による副作用とみなされる。 これらの状況に鑑み、 本発明者等はヒ 卜 · リゾチームの遣伝子操 作による大量生産を意図した。 ヒ ト轧リ ゾチームは 1 3 0個のァ ミ ノ酸から成り （第 1 表） 、 ニヮ ト リ卵白 リ ゾチームに比して 5 3個のア ミ ノ酸が異なっている。 ジスルフイ ド結合は 4 ケ所に存 在し、 活性部位は G l u — 3 5， A s p — 5 3 , T r P — 6 4 と 推定されている 〔日本生化学会編 ： 生化学データ ' ブッ ク卷 1 ， 1 8 9 ( 1 9 7 9 ) ] o When these lysozymes derived from nitrile egg white are used for a medicinal purpose, hypersensitivity symptoms such as rash and redness often appear, and this is considered as a side effect due to an immune response by a heterologous protein. In view of these circumstances, the present inventors have determined that human and lysozyme It was intended for mass production by cropping. Human lysozyme is composed of 130 amino acids (Table 1), and 53 amino acids differ from those of hen egg white lysozyme. Jisurufui de bonds exist in 4 places, active site G lu - 3 5, A sp - 5 3, T r P - 6 4 and has been estimated [Japanese Biochemical Society: biochemical data 'workbook Certificates 1, 1 89 (1 979)] o
第 1 表  Table 1
ヒ 卜乳リ ゾチーム Human milk lysozyme
1 10 Ly s— V a 1— P h e一 G 1 u— Ar g— Cy s一 G 1 u— L e u— A 1 a— A r g—  1 10 Ly s— V a 1— P he G 1 u— Ar g— Cy s G 1 u— L e u— A 1 a— A r g—
20 20
、 Th r— Leu-Ly s一 A r g-L e -G 1 y— Me t一 A s p— G 1 y— Ty r一 , Th r— Leu-Ly s-A r g-L e -G 1 y— Me t-i A s p— G 1 y— Ty r-i
30 30
A r g— G 1 y— I 1 e— S e r— Leu— Al a— A s n— T r p— Me t— Cy s— A r g— G 1 y— I 1 e— S e r— Leu— Al a— A s n— T r p— Me t— Cy s—
40 40
L e u-A 1 a— Ly s— T r p-G 1 u-S e r一 G 1 y-Ty r一 As n-Th r一 L e u-A 1 a— Ly s— T r p-G 1 u-S e r i G 1 y-Ty r i As n-Th r i
50 50
A r g— A 1 a一 T h r一 As n— Ty r— As n— A 1 a— G 1 y—A s p一 A r g— A r g— A 1 a-Thr r- As n— Ty r— As n— A 1 a— G 1 y—A s p-A r g—
60 60
S e r一 Th r— As p-Ty r一 Gl y— I 1 e-Ph e— G 1 n— I 1 e-As n-S e r-Th r— As p-Ty r-Gl y— I 1 e-Ph e— G 1 n— I 1 e-As n-
7070
S e r—A r — Ty r— T r p— C y s— As n— A s p— G 1 y— L y s— T h r— S e r—A r — Ty r— T r p— C y s— As n— A s p— G 1 y— L y s— T h r—
80 80
Pr o— G 1 一 A 1 a— V a 1—As n— A 1 a— Cy s— H i s— Leu— Se r— Pr o— G 1 A 1 a— V a 1—As n— A 1 a— Cy s— His— Leu— Ser—
OMFIOMFI
WIPO 90WIPO 90
C y s— S e r一 A 1 a— L e u— Le u— Gl n— As p一 A s n— I 1 e一 A 1 a— C y s— S e r-A 1 a— L e u— Le u— Gl n— As p-A S n— I 1 e-A 1 a—
100 100
As p—A 1 a—V a 1一 A 1 a— Cy s— A 1 a -Ly s—A r — V a 1—V a 1― As p—A 1 a—V a 1 A 1 a— Cy s— A 1 a-Ly s—A r — V a 1—V a 1—
1 10 1 10
A r g—A s p— P r o— Gi n— Gl y— I 1 e一 A r g— A 1 a— T r p— V a 1— A r g—A s p— P ro— Gi n— Gl y— I 1 e-A r g— A 1 a— T r p— V a 1—
1 20 1 20
A 1 a— T r p—A r g—A s n—A r g— Cy s— G 1 n— A s n— Ar g—A s p― A 1 a— T r p—A r g—A s n—A r g— Cy s— G 1 n— A s n— Ar g—A s p—
1 30 1 30
Va 1-Ar g-G 1 n-Ty r-Va 1-Gl n-Gl y-Cy s-G l y-Va 1 発明の開示 Va 1-Ar g-G 1 n-Ty r-Va 1-Gl n-Gly-Cy s-Gly-Va 1 Disclosure of the invention
現在のと こ'ろヒ ト · リ ゾチーム逮伝子の D N A配列は解明さ れていないが、 本発明者等はこのたび上記ア ミ ノ酸配列を基に してヒ ト ' リ ゾチームの逮伝子をデザイ ン し、 それを化学合成 した。  At present, the DNA sequence of human lysozyme arrested children has not been elucidated, but the present inventors have now arrested human lysozyme based on the above amino acid sequence. The gene was designed and chemically synthesized.
その場合、 遺伝子コ ドンの縮重によって多数の D N A配列が 可能となるが、 例えば次の基準に従って至適配列が決定された。 i ) 合成遗伝子の発現に適当と思われる酵母において最も許容 されるコ ドンを使用する。 ii) 遗伝子中に特定の制限酵素認識 部位 （本件においては X b a I ) を設けて、 ク ローニングにお ける指標と した り 、 発現用ベク ター構築後の遗伝子改造を容易 にする。 iii) いずれかの鎖または 2重鎖上に自己相補的ある いは、 他の配列 （正しい配列以外の） に相補的であるよ う な配 列は極力避ける。 以上の諸条件を満足するものと して、 次に示 す塩基配列が決定された。 In that case, many DNA sequences are possible due to the degeneracy of gene codons. For example, the optimal sequence was determined according to the following criteria. i) Use the most permissive codons in yeast that are deemed appropriate for the expression of the synthetic gene. ii) Placing a specific restriction enzyme recognition site (XbaI in this case) in the gene to serve as an index for cloning or to facilitate gene modification after the construction of an expression vector . iii) Avoid sequences that are self-complementary on either strand or duplex, or complementary to other sequences (other than the correct sequence). Assuming that the above conditions are satisfied, The nucleotide sequence was determined.
AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA
TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT
ACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TACACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TAC
TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG
CGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGTCGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGT
GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA
CTT GCT AAG TGG, GAA TCC GGC TAT AAC ACTCTT GCT AAG TGG, GAA TCC GGC TAT AAC ACT
GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA
AGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC. CGTAGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC. CGT
TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA
TCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AACTCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AAC
AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG
TCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACTTCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACT
AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA
CCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCTCCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCT
GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA
TGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCTTGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCT
ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA
GAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTCGAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTC
CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG
_O PI一 CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC_O PI CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC
GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG
GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA
GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA 本発明は第一に上記の D N A配列で示される ヒ ト · リ ゾチ一 ム発現のための合成遣伝子を有する D N Aに闋し、 本発明 D N Aと しては上記合成逮伝子自体の他、 その 5 '末端、 3 '末端に ある種の制限酵素認識部位やスター トコ ドン、 停止コ ドンを連 結したものを含み、 逮伝子組換え等の操作の便宜を計るこ と が できる。 この例と して上記 D N A配列の GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA First, the present invention provides a synthetic gene for expressing human lysozyme represented by the above DNA sequence. The DNA of the present invention is the same as the DNA of the present invention except that the above-mentioned synthetic arrestor itself is linked to a certain restriction enzyme recognition site, start codon, and stop codon at its 5 ′ and 3 ′ ends. It can be used for convenience of operations such as recombination of arrested children. As an example of this,
5 '末端に、 T C G A G A T G  At the 5 'end, TCG AGA A T G
C T A C ,  C T A C,
の X h o I 切断部位、 スタ ー トコ ドンたる A T G を持ち、 3 '末端に、 T A A T A G C  XhoI cleavage site, has a start codon ATG, and at the 3 'end, TATAGAGC
A T T A T C G A G C T  A T T A T C G A G C T
の X h o I 切断部位、 ス ト ジプコ ドンたる T A A及び T A G をもっ たものが挙げられる。 またこの他、 これら D N Aを組込 んだ組換えプラスミ ドも本発明の範畴に入るものである。  XhoI cleavage site, and those having TAA and TAG, which are stigcodons. In addition, recombinant plasmids incorporating these DNAs are also included in the category of the present invention.
該遣伝子は例えば複数個 （約 2〜 8 0個） のオ リ ゴデォキシ ヌク レオチ ドを合成し、 それら を連結するこ とによって製造す るこ と ができ、 例えば第 2表に示したよ う な、 5 2個のオ リ ゴ ヌク レオチ ド ' ブロ ック に分割して、 例えば 〔 H . I t o , Υ . 产 ΟΜΡΙ ， I k e , S . I k u t a , K . I t a k u r a j N u c l e i c A c i d s R e s . , 1 0 ， 1 7 5 5 ( 1 9 8 2 ) ) に従つ て合成する ことができる。 オ リ ゴヌク レオチ ド ' ブロ ッ クは既 知の方法でハイブリ ダィ ズ.させ、 酵素的に連結する 〔例えば The gene can be produced, for example, by synthesizing a plurality (about 2 to 80) of oligodoxynucleotides and linking them, for example, as shown in Table 2. For example, by dividing into 52 oligonucleotide nucleotides' blocks, for example, [H.I to, Υ. 产 ，, I ke, S. I kuta, K. I takuraj Nucleic Acids Res., 10, 1755 (1992)). Oligonucleotide blocks are hybridized using known methods and linked enzymatically (e.g.,
A g a r w a l 等、 N a t u r e 2 2 7 , 2 7 - 3 4 ( 1 9 7 0 ) 〕 。  Agwarwal, etc., Natture227, 27-34 (1970))].
第 2 表  Table 2
下鎖  Lower chain
番号  Number
Ul TCGAGATGAAGGTTT L26 TCGAGCTATTAAAC U2 TTGAGAGATGCGAAT L25 ACCACAACCTTGAAC U3 TAGCCAGAACTTTGAAG L24 GTATTGTCTGACATC U4 AGATTGGGTATGGAC L23 TCTATTTTGGCATCT Ul TCGAGATGAAGGTTT L26 TCGAGCTATTAAAC U2 TTGAGAGATGCGAAT L25 ACCACAACCTTGAAC U3 TAGCCAGAACTTTGAAG L24 GTATTGTCTGACATC U4 AGATTGGGTATGGAC L23 TCTATTTTGGCATCT
U5 GGCTACCGTGGTATT L22 GTTTCTCCAAGCGACU5 GGCTACCGTGGTATT L22 GTTTCTCCAAGCGAC
U6 TCTTTAGCCAACTGG L21 CCAGGCTCTAATACCCTGU6 TCTTTAGCCAACTGG L21 CCAGGCTCTAATACCCTG
U7 ATGTGTCTTGCTAAG L20 TGGGTCACGGACAACU7 ATGTGTCTTGCTAAG L20 TGGGTCACGGACAAC
U8 TGGGAATCCGGCTATAAC L19 TCTCTTAGCGCAGGC U9 ACTAGAGCTACCAAT L18 AACAGCATCAGCAATU8 TGGGAATCCGGCTATAAC L19 TCTCTTAGCGCAGGC U9 ACTAGAGCTACCAAT L18 AACAGCATCAGCAAT
U10 TACAACGCTGGCGAC L17 GTTGTCCTGAAGC U10 TACAACGCTGGCGAC L17 GTTGTCCTGAAGC
Ull CGTTCTACAGACTATGG L16 AAAGCTGAGCAAGATUll CGTTCTACAGACTATGG L16 AAAGCTGAGCAAGAT
U12 TATTTTCCAAATTAACT L15 AAGTGACAGGCGTTGACU12 TATTTTCCAAATTAACT L15 AAGTGACAGGCGTTGAC
U13 CTAGATATTGGTG L14 GGCACCTGGAGTCTTGCU13 CTAGATATTGGTG L14 GGCACCTGGAGTCTTGC
U14 TAACGATGGCAAGACTC L13 CATCGTTACACCAATATU14 TAACGATGGCAAGACTC L13 CATCGTTACACCAATAT
U15 CAGGTGCCGTCAACGCC L12 CTAGAGTTAATTTGGU15 CAGGTGCCGTCAACGCC L12 CTAGAGTTAATTTGG
U16 TGTCACTTATCTTGC Lll AAAATACCATAGTCTGT U17 TCAGCTTTGCTTCAG L10 AGAACGGTCGCCAGCU16 TGTCACTTATCTTGC Lll AAAATACCATAGTCTGT U17 TCAGCTTTGCTTCAG L10 AGAACGGTCGCCAGC
U18 GACAACATTGCTGAT L9 GTTGTAATTGGTAGCU18 GACAACATTGCTGAT L9 GTTGTAATTGGTAGC
U19 GCTGTTGCCTGCGCT L8 TCTAGTGTTATAGCCGU19 GCTGTTGCCTGCGCT L8 TCTAGTGTTATAGCCG
U20 AAGAGAGTTGTCCGT L7 GATTCCCACTTAGCAAG U21 GACCCACAGGGTATT L6 ACACATCCAGTTGGCU20 AAGAGAGTTGTCCGT L7 GATTCCCACTTAGCAAG U21 GACCCACAGGGTATT L6 ACACATCCAGTTGGC
U22 AGAGCCTGGGTCGCT L5 TAAAGAAATACCACGU22 AGAGCCTGGGTCGCT L5 TAAAGAAATACCACG
U23 TGGAGAAACAGATGC L4 GTAGCCGTCCATACCU23 TGGAGAAACAGATGC L4 GTAGCCGTCCATACC
U24 CAAAATAGAGATGTC L3 CAATCTCTTCAAAGTU24 CAAAATAGAGATGTC L3 CAATCTCTTCAAAGT
U25 AGACAATACGTTCAAGG L2 TCTGGCTAATTCGCATCU25 AGACAATACGTTCAAGG L2 TCTGGCTAATTCGCATC
U26 TTGTGGTGTTTAATAGC LI TCTCAAAAACCTTCATC な 、 この フ ラ グメ ン トへの分割の仕方は上記自己会合を避 ける等の注意をすれば、 上記のものに限定される必要はな く 、 種々の分け方が可能である。 次の 階はこのよ う にして得られ た合成逮伝子を量的に増やすために、 まず適当なベク ターに組 み込みサブク ローニングする こ とである。 ベク ターと しては該 逮伝子を組み込めれば如何なるものであってもよいが、 具体的 には大腸菌ベク ター p A C Y C 1 7 7 、 大腸菌 ， 酵母シャ トル ベク タ一 P P H 0 1 7 、 p G L D 9 0 6 、 枯草菌ベクター P T Ε X 2 0 1 などが挙げられる。 U26 TTGTGGTGTTTAATAGC LI TCTCAAAAACCTTCATC The method of division into these fragments is not limited to the above, as long as care is taken to avoid the above-mentioned self-association, and various divisions are possible. is there. The next floor is to sub-clonal the first step by incorporating it into an appropriate vector in order to increase the number of synthetic arrestors obtained in this way. Any vector may be used as long as the arresting element can be incorporated into the vector. Specifically, Escherichia coli vector p ACYC177, Escherichia coli and yeast shuttle vector PPH017, p GLD906, Bacillus subtilis vector PT @ X201, and the like.
このよ う に して得られた合成逮伝子を含むベク ターを用いて 各種宿主を形質転換する。 形質転換の方法それ自体は公知であ リ、 宿主と して大腸菌を用いる場合は、 たとえば C o h e n ら の方法 〔 C o h e n , S . N . e t a 1 . P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A , 6 9 ， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2 ) ] によって， 宿主と して酵母を用いる場合には、 たとえば H i n n e n . A e t a 1 . P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A , 7 5 ， 1 9 2 7 ( 1 9 7 8 ) 〕 によって、 宿主 と して枯草菌を用いる場合には、 たとえばプロ トプラス ト法Various hosts are transformed using the vector containing the synthetic arrestor thus obtained. Transformation methods are known per se, and when Escherichia coli is used as a host, for example, the method of Choen et al. [Cohen, S.N.eta1.Proc.Nat1.Acad.S USA, 69, 2110 (1972)], when yeast is used as a host, for example, Hin Nat. A eta 1. Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (19778)], when using Bacillus subtilis as a host, for example, Protoplast method
〔 C h a n g , S . & C o h e n S . N . G e n . G e n e t . , 1 6 8， 1 1 1 ( 1 9 7 9 ) 〕 やコ ン ビテン ト法 [Chaneg, S. & Cohen S. N. Gen. Genet., 1668, 1111 (19779)] and the competency method
C D u b n a , D . & A b e l s o n , R . D , J . M o 1 . B i o l . 5 6 , 2 0 9 ( 1 9 7 1 ) 〕 によって、 それぞ れ形質転換を行う ことができる。 宿主と してはたとえば E . c o l i 2 9 4 , E . c o l i w 3 1 1 0 , E . c o l i C 6 0 0 , B . s u b t i 1 i s 1 A 1 , B . s u b t i l i s 1 A 3 3 9 , B . s u b t i l i s 1 A 3 4 0 などを用 いる こ とができる。  Transformation can be carried out, respectively, according to CDubna, D. & Abelson, R. D, J. Mo1. Biol. 56, 2009 (1971)). As a host, for example, E. coli 294, E. coliw 3110, E. coli C600, B. subti 1 is 1 A1, B. subtilis 1 A33 39, B. subtilis 1A340 can be used.
Λ  Λ
次に該遣伝子を発現させるために ま、 まず該遺伝子が挿入さ れたプラスミ ド D N Aをたとえばアルカ リ抽出法 〔 B i r n b o i m , H . C , & D o l y， J . : N u c l e i c A c i d s R e s . , 7_, 1 5 1 3 ( 1 9 7 9 ) 〕 によって形質 転換体からた単離する。 得られるプラスミ ド D N Aを適当な制 限酵素で処理するこ とによって揷入された該遗伝子を切り出し、 たとえばァガロースゲル電気泳動あるいはポリ ァク リルア ミ ド 電気泳動によってこれを単離する ことができる。 これら一連の 操作は公知であ り、 文献たとえば 〔 M o 1 e c u 1 a r C I o n i n g ( 1 9 8 2 ) , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y 〕 に詳し く記載されている。 単雜 された該逮伝子を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に プロモーターと煩方向に連結して発現プラスミ ドを構築する。 一 ΟΜΡΙ 発現ベク ターと してはすでに多く のものが知られており 、 該遗 伝子の発現に実際に利用できるものであればいかなるものであつ てもよい。 具体的には前述の p P H O 1 7 や P G L D 9 0 6 , P t r p 7 7 1 (特開眧 5 8 - 2 0 1 7 9 6 ) ， P R C 2 3 (特開昭 5 8 — 1 8 9 1 9 7 ) ， P B T M 1 3 4 , P T E X 2 0 1 などが挙げられるが、 P P H O 1 7 および P G L D 9 0 6 がよ り好ま しい。 Next, in order to express the gene, first, the plasmid DNA into which the gene has been inserted is subjected to, for example, an alkaline extraction method [Birnboim, HC, & Dolly, J .: Nucleic Acids R. es., 7_, 1513 (19779)]. The inserted plasmid is cut out by treating the obtained plasmid DNA with an appropriate restriction enzyme, and the gene can be isolated by, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide electrophoresis. . These series of operations are known, and are described in detail in the literature, for example, [Moe ecu ar CI Oning (1992), Old Spring Harbor Laboratory]. The simulated arrestor is indirectly ligated with the promoter downstream of the promoter of an appropriate expression vector to construct an expression plasmid. One ΟΜΡΙ Many expression vectors are already known, and any expression vector may be used as long as it can be actually used for expression of the gene. Specifically, the aforementioned p PHO 17, PGLD 906, P trp 770 (JP-A-58-210 796), PRC 23 (JP-A-58-18991) 9 7), P BTM 1 3 4, P TEX 2 0 but 1 and the like, PPHO 1 7 and PGLD 9 0 6 Gayo Ri preferred arbitrariness.
なお発現の宿主と しては動物細胞や他の真核生物細胞も利用 する こ と ができる。 ベク タ ーと してはプロモーターの下流に X h o I 切断部位を有するプラスミ ドがよ り好ま しい。  Animal cells and other eukaryotic cells can also be used as expression hosts. As a vector, a plasmid having an XhoI cleavage site downstream of the promoter is more preferable.
得られた発現プラスミ ドで宿主細胞を形賓転換させ目的とす る組み換え体を得る。 このよ う して得られた形質転換体をそ れ自体公知の方法で培養する。 大腸菌を使用する場合には、 培- 地と しては例えばグルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔 M i l l u , J . , E x p e r i m e n t s i n M o l e c u 1 a r G e n e t i c s , 4 3 1 - 4 3 3 ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ) , N e  The host cell is transformed with the obtained expression plasmid to obtain the desired recombinant. The transformant thus obtained is cultured by a method known per se. When Escherichia coli is used, the culture medium may be, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Millu, J., Experiments in Molecu 1 ar Genetics, 4 3 1-4 3 3 ( C old S spring H abor L aboratory), Ne
Y o r k , 1 9 7 2 〕 ， Lブロスおよびペナセィ （ P e n a s s a y ) ブロスなどが挙げられる。 プロモータ ーを効率よ く 働かせるために、 たとえば 3 β—イ ン ド リルアク リル酸のよ う な薬剤を加える こ ともできる。 培養は、 通常 1 5 〜 4 3 °C、 好 ま し く は 2 8 〜 4 0 °Cで 2 〜 2 4 時間、 好ま し く は 4 〜 1 6 時間行い、 必要によ り通気や撹拌を加えるこ ともできる。 酵母 を使用する場合は、 培地と しては、 例えば B u r k h o l d e r 最小培地 ！； B o s t i a n , K . L . e ΐ . a 1 ： P r o c . IPOT" N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 7， 4 5 0 5 ( 1 9 8 0 ) 〕 が挙げられる。 培養は通常 1 5 °C〜 4 0 、 好ま し く は 2 4 〜 3 7。Cで 1 0〜 9 6時間、 好ま し く は 2 4〜 7 2時 間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える こともできる。 また 枯草菌を使用する場合は、 培地と して例えば、 L ブロス， B H I ( B r a i n H e a r t I n f u s i o n ) などが挙げ られる。 培養温度は、 通常約 1 5 °C〜 4 2て、 さ らに好ま し く は約 2 4 ：〜 3 7 °Cであ り、 培地の p Hは初発 p Hが約 5 . 0 〜 9 . 0 であ リ、 さ らに好ま し く は約 6 . 5〜 7 . 5 である。 培養時間は、 通常約 2〜 7 2 時間、 さ らに好ま し く は 3〜 4 8 時間である。 培養終了後それ自体公知の方法で菌体と上清と を 分離する。 菌体 適当な緩衝液に懸濁させたのち、 大腸菌'、 枯 草菌.の形質転換体の場合には凍結融解法、 溶菌 素処理法、 超 音波処理法などを単独またはこれら を組み合せて、 また酵母の 形質転換体の場合には、 ザィモリエース 〔キ リ ンビール （株） 製〕 添加法、 ガラスビーズなどによる機械的破壤によってそれ ぞれ菌体を破壊する。 さ らに必要ならばこれに ト リ 卜ン X— 1 0 0 ， デォキシコ一レー トなどの界面活性剤あるいは尿素、 塩 酸グァニジンなどの蛋白変性剤を加える こ と によっ て産生され たリ ゾチームを抽出するこ と ができ る。 このよ う に して菌体内 あるいは菌体外に産生されたリゾチームは通常の蛋白質精製法、 例えば塩析、 等電点沈澱、 結晶化、 イオン交換ク ロマ トグラ フィ 一、 高速液体ク ロマ トグラ フィ ー （H P L C , F P L C等） な ど、 にしたがって精製され、 目的とする リ ゾチームを得る こ と ができる。 図面の简単な説明 York, 1972], L-broth and Penassay broth. To make the promoter work more efficiently, it is also possible to add a drug, for example, 3β-indrillacrylic acid. Cultivation is usually carried out at 15 to 43 ° C, preferably 28 to 40 ° C, for 2 to 24 hours, preferably for 4 to 16 hours, and aeration and agitation as necessary. Can be added. When using yeast, the medium should be, for example, the Bulkholder minimum medium! Bostian, K.L.e e.a1: Proc.IPOT " Natl. Acad. Sci. USA, 77, 450 (1950)]. Culture is usually at 15 ° C to 40, preferably 24 to 37. The reaction is carried out at C for 10 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, and may be aerated or agitated as necessary. When Bacillus subtilis is used, examples of the medium include L-broth and BHI (Brain Heart Infusion). The culture temperature is usually about 15 ° C to 42 ° C, more preferably about 24: to 37 ° C, and the pH of the culture medium is about 5.0 to 9 with the initial pH. 0, and more preferably about 6.5-7.5. The cultivation time is usually about 2 to 72 hours, and more preferably 3 to 48 hours. After completion of the culture, the cells and the supernatant are separated by a method known per se. After suspending the cells in an appropriate buffer, transformants of Escherichia coli and Bacillus subtilis are used alone or in combination with the freeze-thaw method, the lysin treatment method, the ultrasonic treatment method, etc. In the case of yeast transformants, the cells are destroyed by adding Zymolyase (manufactured by Kirin Brewery Co., Ltd.) or by mechanical soiling with glass beads or the like. If necessary, lysozyme produced by adding a surfactant such as Triton X-100, deoxycolate or a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride to this. Can be extracted. Lysozyme produced in or outside the cells in this manner can be purified by conventional protein purification methods such as salting out, isoelectric focusing, crystallization, ion-exchange chromatography, and high-performance liquid chromatography. -(HPLC, FPLC, etc.) to obtain the desired lysozyme. Brief description of the drawings
第 1 図、 第 2 図はそれぞれ参考例 1 、 2 に示したプラスミ ド P P H 0 1 7 , P G L D 9 0 6 の構築図を示す。  FIG. 1 and FIG. 2 show construction diagrams of the plasmids PPH0117 and PGLD906 shown in Reference Examples 1 and 2, respectively.
第 3 図は参考例 3、 4 に示したプロモーターク ローニングべ ク タ一 P B T M 1 2 6 の制限酵素切断地図、 及びプロモーター を組込んだ P B T M 1 2 8 の制限酵素切断地図である。  FIG. 3 is a restriction map of the promoter cloning vector PBT M126 shown in Reference Examples 3 and 4, and a restriction map of the PBTM128 incorporating the promoter.
第 4 図は p B T M l 2 8 から得られるプロモーター D N Aの 塩基配列を示す。 '  FIG. 4 shows the nucleotide sequence of the promoter DNA obtained from pBT Ml28. '
第 5 図は参考例 6 に示したプラスミ ド p B T M l 3 4 の構築 図を示す。  FIG. 5 shows a construction diagram of the plasmid pBTM13 shown in Reference Example 6.
第 6 図は中性プロテア一ゼ逮伝子を組込んた' p B T M l 2 7 の制限酵素切断地図である。  FIG. 6 is a restriction map of 'pBT Ml 27 incorporating a neutral protease arrestor.
第 7 図及び第 8 図は中性プロ'テア一ゼ逮伝子のサブク 口一二 ングを示す図である。  Fig. 7 and Fig. 8 are diagrams showing a subling of a child with a neutral proteathesis.
第 9 図は中性プロテア一ゼ逮伝子を含む D N Aの制限酵素切 断地図である。 図中、 B g は B g i n， Tは T a q l , S a は S a c Π , H a は H a e IH， S は S a u 3 A I ， Aは A c c l , B e は B e 1 I , および Hは H i n d HIを示す。  Fig. 9 is a restriction map of DNA containing a neutral protease arrestor. In the figure, Bg is Bgin, T is Taql, Sa is Sac ac, Ha is HaeIH, S is Sau3AI, A is Accl, Be is Be1I, and H Indicates Hind HI.
第 1 0 図は中性プロテア一ゼ遣伝子の塩基配列の一部である。 第 1 1 図及び第 1 2 図は参考例 1 0 に示したプラスミ ド P T Ε X 2 0 1 及び Ρ Ε Ν Χ 3 7 4 の構築図を示す。  FIG. 10 shows a part of the nucleotide sequence of the neutral protease gene. FIG. 11 and FIG. 12 show the construction diagrams of the plasmids PT × X 201 and Χ Χ 374 shown in Reference Example 10 respectively.
第 1 3 図、 第 1 4 図は ρ Ε Ν Χ 3 7 4 におけるぺニシ リ ナ一 ゼの成熟蛋白をコー ドする配列の一部を示す。  Fig. 13 and Fig. 14 show a part of the sequence coding for the mature protein of Penicillinase in ρ Ε Χ Χ 374.
第 1 5 図、 第 1 6 図及び第 1 7 図はジヌ ク レオチ ドブロ ッ ク の合成法、 オ リ ゴヌ ク レオチ ドの鎖長延長、 及びオ リ ゴヌ ク レ ドの集成、 連結による ヒ ト · リ ゾチーム合成遗伝子の合成法を示 す図である。 Fig. 15, Fig. 16 and Fig. 17 show the method for synthesizing dinucleotide blocks, elongation of oligonucleotide chains, and oligonucleotides. FIG. 4 is a diagram showing a method for synthesizing a human lysozyme gene by assembling and linking genes.
発明を実施するための最良の形態  BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 参考例及び実施例にょ リ本発明を更に具体的に説明する が、 本発明はこれ ら に限定されるものではない。  Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.
参考例 1 酵母抑制性酸性ホスフ ァ タ ーゼ ' プロモーター （ P H Reference Example 1 Yeast-suppressing acidic phosphatase 'promoter (PH
0 5 — P ) を含有する発現用ベクターの作製 酵母 S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e S 2 8 8 C株由来の抑制性酸性ホスフ ァ ターゼ遺伝子 （ P H 0 5 ) と構成性酸性ホスフ ァ タ一ゼ遗伝子 （ P H 0 3 ) を含む 7 . 9 k b D N A断片を含む大腸菌プラス ミ ド （ p J A l ) C K r. a m e r , · R . A . a n "d A n d e -r s o n , N . ， P r o c , N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 7 ， 6 5 4 1 ( 1 9 8 0 )3 ， 5 0 ," g に 2.0 ユニ ッ トの制限酵素 B a m H I 〔宝酒造 （株） 製〕 と 2 0 ユニッ トの制限酵素 S a 1 I 〔宝酒造 （株） 製〕 を 1 0 0 1 の反応液 〔 1 0 m M T r i s — H C l ( p H 8 . 0 ) ， 7 m M M g C 1 2 , 1 0 0 m M N a C 1 , 2 m M 2 — メルカ ブ トエタ ノール〕 中で 3 7 eC、 3時間作用させた後、 1 . 0 %ァ ガロース （ S i g m a社製） ' スラブゲルを用いて緩衝液 〔 1 0Preparation of Expression Vector Containing 0 5 — P) The suppressive acid phosphatase gene (PH 05) derived from the yeast S accharomyces cerevisiae S288C strain and a constitutive acid phosphatase gene ( E. coli plasmid (pJAl) CK r. Amer, R. A. an "d Ande-rson, N., Proc, Natl. A cad. S ci. USA, 77, 6541 (1980) 3, 50, "2.0 g of restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Shuzo) and 20 units Reaction solution [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 7 mm Mg C 12, 10 0 m MN a C 1, 2 m M 2 -. Melka Bed Toeta Nord] 3 7 e C, 3 hours after working in, 1 0% § Garosu (S IgM a Inc.) 'buffer using a slab gel 〔 Ten
0 m M T r i s — H C l ， 1 0 0 m M ホウ酸， 2 m M E D T A ( p H 8 . 0 ) 〕 中、 1 4 0 V、 2 時間電気泳動にかけた。 泳動後、 0 . 6 3 k b D N A断片を含むゲル片を透析チューブ内 に封入し、 泳動用緩衝液内に沈め、 該 D N A断片をゲルから電気 的に溶出した ！： D c D o n e l l , M . W . ら， J . M o " . BThe sample was electrophoresed in 0 mM Tris-HCl, 100 mM boric acid, 2 mM EDTA (pH 8.0)] at 140 V for 2 hours. After the electrophoresis, the gel fragment containing the 0.63 kb DNA fragment was sealed in a dialysis tube, submerged in a buffer for electrophoresis, and the DNA fragment was eluted from the gel electrically! : DcDonell, M.W. et al., J.Mo ".B
1 o l ， 1 1 0 , 1 1 9 ( 1 9 7 7 )〕 。 透析チューブ内液を フエ ノール抽出さ らにエーテル抽出した後、 & 〇 1 を 0 . 2 Mにな るよ う に加え、 つづいて 2倍量の冷エタ ノールを加えて一 2 0 。C で D N Aを沈殿させた。 1 ol, 110, 119 (19777)]. Flue in dialysis tube After the extraction with ether and ether extraction, & 1 was added to make 0.2 M, followed by adding twice the volume of cold ethanol, and adding 120. DNA was precipitated with C.
1 g のプラ スミ ド P S H 1 9 に 2 ュニッ 卜の制限酵素 B a m H I と 2 ユニッ トの制限酵素 S a 1 I を 2 0 1 の反応液 〔 1 0 m M T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) , 7 m M M g C 1 2 , 1 0 0 m M N a C 1 , 2 m M 2—メルカプ 卜エタ ノール〕 中で 3 7 °C、 2 時間作用させた後、 該反応液を 0 . 8 %ァガロース * ス ラブゲルを用いて上述の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 8 .1 g of the plasmid PSH 19 was added to 2 units of the restriction enzyme BamHI and 2 units of the restriction enzyme Sa1I in a reaction solution of 201 [10 mM MTris-HCl (pH 8 . 0), 7 m MM g C 1 2, 1 0 0 m MN a C 1, 2 m M 2- mercapto Bok ethanol] 3 7 ° C in two hours after the action, the reaction mixture 0 Electrophoresis was carried out on an 8% agarose * slab gel under the conditions described above. After electrophoresis, 8.
0 k b D N A断片を上述の方法によってゲルから分取し、 プ ノー ルで除蛋白 し、 冷エタ ノールで D N Aを沈殿させた（第 1 図参照）。 The 0 kb DNA fragment was separated from the gel by the above-described method, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol (see FIG. 1).
該 8 . O k b D N A断片 4 (3 0 n g と前記' 0 . 6 3 k b -D N A 靳片 2 0 0 n g と を篛合し、 2 0 1 の反応液 〔 6 6 m M T r The 8.Okb DNA fragment 4 (30 ng was combined with the above-mentioned '0.63 kb -DNA fragment 200 ng, and the reaction solution of 201 was obtained (66 mM Tr
1 s - H C 1 ( p H 7 . 6 ) ， 6 . 6 m. M M g C 1 2 , 1 0 m M ジチオスレィ トール， l m M A T P , 2 ユニッ トの T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造 （株） 製） 〕 中、 1 4 °Cで一夜作用させて D N Aを結合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を前記 C o h e n らの方法に従って形質転換した。 アンピシ リ ン耐性を 指標と して選択された形質転換体の中から、 プラスミ ド D N Aを 前記アルカ リ抽出法によって単離し、 分子量と制限酵素による分 解パターンを調べ、 p S H l 9 の B a m H I - S a 1 I 部位に、 P J A I から単離された 0 . 6 3 k b D N A断片が揷入されたプ ラ スミ ド P P H 0 1 2 を分離した （第 1 図参照） 。 1 s -.. HC 1 ( . P H 7 6), 6 6 m MM g C 1 2, 1 0 m M Jichiosurei Torr, lm MATP, (manufactured by Takara Shuzo Co.) 2 Units T 4 DNA ligase ], And allowed to act overnight at 14 ° C to bind DNA. Using this reaction solution, Escherichia coli 294 was transformed according to the method of Choen et al. Plasmid DNA was isolated from the transformants selected using ampicillin resistance as an indicator by the above-described alkaline extraction method, and the molecular weight and restriction enzyme digestion pattern were examined. A plasmid PPH012 into which a 0.63 kb DNA fragment isolated from PJAI was inserted was isolated from the HI-SaI site (see FIG. 1).
3 g のプラスミ ド p P H 0 1 2 D N Aに 2 ュニ ッ 卜の制限酵 素 S a 1 I を 2 0 1 の反応液 〔 1 0 m M T r i s - H C 1 ( P H 7 . 5 ) , 7 m M M g C 1 2 , 1 7 5 m M N a C 1 , 0 . 2 M E D T A , 7 m M 2—メルカプ トエタ ノール〕 中で 3 7 。C、 2時間作用させた後、 フエ ノールで除蛋白 し、 冷エタ ノールで D N Aを沈殿させた。 この D N A， 3 g に 1 2ユニッ トの B A L 3 1 ヌ ク レア一ゼ ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s 社製） を 5 0 1 の反応液 〔 2 0 m M T r i s - H C 1 ( p H 8 . 1 )， 1 2 m M C a C 1 2 , 1 2 m M M g C l 2 , 1 m M E D T A〕 中で 3 0 、 2分間作用させた 後、 フヱ ノールで除蛋白 し、 冷エタ ノールで D N Aを沈殿させた (第 1 図参照）。 ' 3 g of plasmid p PH012 DNA was mixed with 2 units of restriction enzyme Sa1I in a reaction mixture of 201 (10 mM MTris-HC1 (P H 7. 5), 7 m MM g C 1 2, 1 7 5 m MN a C 1, 0. 2 MEDTA, 7 m M 2- mercapto Toeta Nord] 3 in 7. C. After acting for 2 hours, the proteins were deproteinized with phenol, and the DNA was precipitated with cold ethanol. To 3 g of this DNA, 12 units of BAL31 nuclease (Bethhesda Research Laboratories) was added to a reaction mixture of 501 [20 mM MTris-HC1 (pH 8. 1) after act 1 2 m MC a C 1 2 , 1 2 m MM g C l 2, 1 m MEDTA ] 3 in 0, 2 minutes, deproteinized with full We Nord, DNA with cold ethanol Was precipitated (see Fig. 1). '
2 0 0 n g の X h o I リ ンカ一 d (C C T C G A G G)〔N e w E n l a n d B i o L a b s 社製〕 に 3 ュニッ ト-の T 4ポリ ，ヌ ク レオチ ド ' キナーゼ 〔宝酒造 （株） 製〕 を 5 0 1 の反応液 C 5 0 m M T r i s - H C l ( p H 7 . 6 ) ， 1 0 m M M g C 1 2 , 1 0 m M 2 — メノレカプ トエタ ノール， 1 0 0 M A T P〕 中で 3 7 °C 、 1 時間作用させて、 5 '末端を リ ン酸化した。  To 200 ng of XhoI linker d (CCTCGAGG) (New Zealand Bio Labs) was added 3 units of T4 poly, nucleotide 'kinase [Takara Shuzo Co., Ltd.]. In a 50 1 reaction mixture C 50 mM MT ris-HCl (pH 7.6), 10 mm MM g C 12, 10 mM 2 — Menolecaptoethanol, 100 MATP] The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end.
4 n g の 5 '末端がリ ン酸化された X h o I リ ンカ一〔 5， 一 P — d (C C T C G A G G)〕と 4 0 0 n g の前述の B A L - 3 1 で 処理された P P H O I 2 D N Aと混合し、 前述の条件下で T 4 D N A リ ガーゼの作用で結合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を C o h e n らの方法に従って形賓転換した。 アンピシリ ン酎性を指標と して選択された形質転換体の中から、 プラスミ ド D N Aを前記アルカ リ抽出法によって単離し、 B a m H I と X h o I による二重消化物の大きさ が 0 . 5 5 k b であるプラスミ ド P P H 0 1 7 を選択した。 B A L — 3 1 ヌク レアーゼ処理によつ  Mix 4 ng of 5'-phosphorylated XhoI linker [5,1-P-d (CCTCGAGG)] with 400 ng of the aforementioned BAL-31-treated PPHOI 2 DNA And ligated by the action of T4 DNA ligase under the conditions described above. Using this reaction solution, E. coli 294 was transformed according to the method of Cohen et al. Plasmid DNA was isolated from the transformants selected using ampicillin shochu as an indicator by the aforementioned alkaline extraction method, and the size of the double digested product with BamHI and XhoI was reduced to 0. The plasmid PPH 0 17, which is 55 kb, was selected. B A L — 3 1 With nuclease treatment
O PI て、 P H O 5 の開始コ ドン A T Gの上流 2 0 b p が除去されたこ と が、 D i d e o x y n u c 上 e o t i d e法 〔 S a n g e r , F . ら , P r o c , N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 4 ， 5 4 6 3 ( 1 9 7 7 )〕 による D N A塩基配列の分析によって明ら かになつ た （第 1 図参照） 。 O PI The removal of 20 bp upstream of the initiation codon ATG of PHO5 was confirmed by the eotide method on Dideoxynuc [Sanger, F. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 74. , 5463 (1977)], which revealed the results (see Fig. 1).
参考例 2 酵母グリセ リルアルデヒ ド 3 — リ ン酸脱水素酵素 · プ 口モーター （G L D— P ) を含有する発現用ベク ターの作製 ①グリセ リルアルデヒ ド 3 — リ ン酸脱水素酵素遺伝子 （G L D ) のク ローニング Reference Example 2 Construction of an expression vector containing yeast glyceryl aldehyde 3 -phosphoric acid dehydrogenase and a motor (GLD-P) (1) Preparation of glyceryl aldehyde 3 -phosphoric acid dehydrogenase (GLD) Cloning
G L Dのう ちの p g a p 4 9 1 ( H o l l a n d , J . P . ら， J . B i o l . C h e m , 2 5 8 , 5 2 9 1 ( 1 9 8 3 ) 〕 の N 末端側からの 5個のア ミ ノ酸をコー ドするオ リ ゴヌク レオチドに 相補な 5 '— A G C A A C T C T A A C C A T— 3 ' を前述の C r e a , R . らの方法によって合成し、 該オ リ ゴヌク レオチ ド 1 g に 1 0 C i の — 〔JZP〕 A T P ( A m e r s h a m社製）と 1 0 ユニッ トの T 4ポリ ヌク レオチ ド · キナーゼと を 3 0 1 の 反応液〔 5 0 m M T r i s — H C 1 ( P H 7 . 6 )， 1 0 m M M g C 1 2 , 1 0 m M 2 —メルカプ トエタ ノール〕 中で 3 7 、 3 0分間作用させ、 5，末端を で標識した。 該反応液に 2 0 0 m M E D T A ( p H 8 . 0 )を 1 0 1 添加し、 1 容量のフエ ノールで除蛋白 した後、 T E N緩衝液〔 1 O m M T r i s - H C 1 ( p H 8 . 0 ) , 2 0 0 m M N a C l , 1 m M E D T A〕で平 衡化したセフ ァ ロース 4 B ( ? 11 3 1： 111 & (： 1 &社製） * カラム ( 0 . 2 5 X 2 5 c m)にかけて v o i d v o l u m e 付近に溶 出される標識された該オリ ゴヌク レオチ ドを集め、 G L D逮伝子 をスク リーニングするためのプローブと して用いた。 ニ ト ロセル ロ ース フ イ ノレタ ー（ S c h l e i c h u a n d S c h u l l 社 製）と該プローブを用いて S o xi t h e r n ブロ ッテイ ング〔 S o u t h e r n , E . M . ， J . M o 1 . B i o l . , 9 8 , 5 0 3 ( 1 9 7 5 )〕 を行ったと ころ、 プローブは 2 . 0 〜 2 . 3 k b D N A断片が含まれる分画番号 7 の試料と強くハイブリ ダィズした。 Pgap 491 (Holland, J. P. et al., J. Biol. Chem., 2558, 5291 (1983)) of GLD from the N-terminal side 5′—AGCAACTCTAACCAT—3 ′, which is complementary to the oligonucleotide encoding amino acid, was synthesized by the method of Crea, R. et al., And 10 Ci was added to 1 g of the oligonucleotide. Bruno - [JZ P] ATP (a mersham Co.) and 1 0 units T 4 poly Nuku Reochi de kinase and the 3 0 1 of the reaction solution [5 0 m MT ris -. HC 1 (P H 7 6 ), 10 mM MM g C 12, 10 mM M 2 —mercaptoethanol] for 37, 30 minutes, and labeled at the end with, 200 mM MEDTA ( pH 8.0) was added, and the protein was deproteinized with 1 volume of phenol.Then, TEN buffer (1 Om MTris-HC1 (pH 8.0), 200 mM Na C 1, 1 m MEDTA] Sepharose 4B (? 1131: 111 & (1: 1 & Co.)) * Column (0.25 x 25 cm) ) To collect the labeled oligonucleotides that are eluted near the voidvolume Was used as a probe for screening. Using the Nitrocellulos finoletor (manufactured by Schleichuand Schull) and the probe, Soxixirn blotting [Southern, E.M., J.Mol.Biol., 980,503 (19775)], the probe strongly hybridized with the sample of fraction number 7 containing the 2.0 to 2.3 kb DNA fragment.
H i n (i IIIで消化された p T R 2 6 2 ( R o b e r t s , T , M . ら， G e n e 1 2 ， 1 2 3 ( 1 9 8 0 ) 0 . 1 g と分面 番号 7 の D N A 0 . 2 g と を混合し、 参考例 1 に記載の条件下 で T 4 D N A リ ガーゼの作用によって結合させた。 該反応液を用 いて、 大腸菌 D H 1 C M a n i a t i s ， T . ら M o l e c u 1 a r C l o n i n g , C o l d S p r i n g * —H a r b o r L a b o r a t o r 2 5 4 — 2 5 5 ( 1 9 8 2 ) 〕 を形 質転換させ、 テ トラサイ ク リ ン酎性形質転換体約 1 2 0 0偭を取 得し、 コ ロ ニー · ハイブリ ダィゼーシ ョ ンによって ^ P標識プロ一 ブと強くハイプリする形質転換体を分離した。 こ の形質転換体か ら前述のアルカ リ抽出法によってプラスミ ド P G L D 9 を単離し、 H i n d lllで分解したと ころ、 2 · 2 k b イ ンサー ト D N Aが 検出され、 S o u t h e r II の方法で調べる と、 こ のイ ンサー ト D N Aは該プローブとハイ プリする こ と が確認された （第 2 図参 照） 。 P TR26 2 (Roberts, T, M. et al., Gene 12, 123 (1980)) 0.1 g digested with Hin (i III) and DNA 0 of domain number 7 And 2 g were mixed with each other by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. Using the reaction mixture, E. coli DH1CManiatis, T. et al. loning, ColdSpring * —Harbor Laborator 2 5 4 —2 5 5 (1 9 8 2)] was transformed to obtain about 1,200 偭 of tetracycline shochu transformant. Then, a transformant that strongly hybridized with the ^ P-labeled probe was separated by colony hybridization, and a plasmid PGLD9 was isolated from the transformant by the aforementioned alkaline extraction method. When digested with Hindlll, a 2.2 kb insert DNA was detected, and the insert DNA was hybridized with the probe when examined by the method of Souther II. Has been confirmed (the second sloppy irradiation).
② G L Dプロモーター断片の単離  ② Isolation of GLD promoter fragment
プラスミ ド P G L D 9 D N A 1 0 0 g に 5 0 ュニッ 卜の制限 酵素 H i n d IIIを 2 0 0 1 の反応液 〔 1 O m M T r i s — H C 1 ( P H 7 . 5 ) , 7 m M M g C l 2 , 6 0 m M N a C 1 ] Plasmid PGLD 9 DNA 1 0 0 g to 5 0 Yuni' Bok restriction enzyme H ind III 2 0 0 1 of the reaction solution [1 O m MT ris - HC 1 (. P H 7 5), 7 m MM g C l 2 , 60 m MN a C 1]
;」; "
¾JVAT10¾J 中で 3 7 °C、 3 時間作用させた後、 1 . 0 %ァガロース ' スラブ ゲルを用いて参考例 1 に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動 後、 2 ' 2 k b D N A断片を参考例 1 に記載の方法によってゲル から分取した。 該 2 · 2 k b D N A断片 1 0 g に 1 0 ユニ ッ ト の制限酵素 H i n f I 〔宝酒造 （株） 製〕 を 5 0 1 の反応液 ¾JVAT10¾J After working at 37 ° C. for 3 hours in the medium, the mixture was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 2'2 kb DNA fragment was fractionated from the gel by the method described in Reference Example 1. To 10 g of the 2.2 kb DNA fragment was added 10 units of Hinf I [Takara Shuzo Co., Ltd.] to a reaction mixture of 501.
C 1 0 m M T r i s - H C l ( p H 7 . 5 )， 7 m M M g C 1 2 , l O O m M N a C 1 , 7 m M 2 —メルカプ トエタ ノール〕 中 で 3 7 、 2 時間作用させた後、 G L D用プローブを用いて S o u t h e r n の方法によってハイブリ ダィゼーシヨ ンを行っ たと こ ろ、 該プローブは 0 . 5 k b D N A断片と結合した （第 2 図参 照） 。 C 1 0 m MT ris - HC l (. P H 7 5), 7 m MM g C 1 2, l OO m MN a C 1, 7 m M 2 - mercapto Toeta Nord] 3 in 7, 2 hours act After the hybridization, hybridization was performed by the method of Southern using a probe for GLD, and the probe bound to a 0.5 kb DNA fragment (see FIG. 2).
該 0 . 5 k b D N 靳片 5 g に、 '各 1 0 ュニ ジ 卜の制限酵素 H h a I 〔宝酒造 （株） 製〕 と T a q l ( e E n g l a n d B i o L a b s 社製） と を 3 0 1 の反応液 〔 1 0 m M T r i s - H C l ( p H 7 . 5 )， 5 0 m M N a C 1 , 1 0 m M M g C 1 2 , I m Mジチオス レイ ト一ル〕 中で 3 7 °C、 3 時間 作用させた後、 1 . 5 %ァガロース ' スラブゲルを用いて參考例 1 に記載された条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0 . 3 6 k b D N A断片を参考例 1 に記載の方法によってゲルか ら分取した。 (第 2 図参照） 。  5 g of the 0.5 kb DN fragment was mixed with 3 restriction enzymes HhaI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and Taql (manufactured by e-England Bio Labs) of 10 units each. In a reaction solution of 01 [10 mM MT ris -HCl (pH 7.5), 50 mM NaC 1, 10 mm Mg C 12, ImM dithiothrate] After operating at 37 ° C for 3 hours, the mixture was subjected to electrophoresis using 1.5% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, the 0.36 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1. (See Figure 2).
該 0 . 3 6 k b D N A断片 1 g に D N Aポリ メ ラ一ゼ I ラー ジ ' フ ラ グメ ン ト を参考例 1 に記載の条件下で作用させ、 T a q I の接着末端を平滑末端に変えた。 次に、 この断片 1 g と参考 例 1 に記載されたリ ン酸化 X h o I リ ンカ一 5 0 n g と を混合し、 参考例 1 に記載の条件下で T 4 D N A リ ガ一ゼを作用させて結合 , WHO A させた。 反応後、 過剰量の： X h o I を加え 3 7 °C , 4時間作用さ せ、 次にセフ ァ ローズ 4 Β · カラム （ P h a r m a c i a社製、 0 . 2 5 X 2 5 c m ) を用いて リ ンカ一の結合した 0 . 3 6 k b D N A斬片を分離した。 The DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on 1 g of the 0.36 kb DNA fragment under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive end of Taq I to a blunt end. Was. Next, 1 g of this fragment and 50 ng of the phosphorylated XhoI linker described in Reference Example 1 were mixed, and T4 DNA ligase was allowed to act under the conditions described in Reference Example 1. Let me join, WHO A I let it. After the reaction, add an excess amount of XhoI and allow it to work at 37 ° C for 4 hours. Then, use a Sepharose 4Β column (Pharmacia, 0.25 x 25 cm). A 0.36 kb DNA fragment bound to the linker was separated.
一方、 上述の 2 . 2 k b D N A断片 1 0 g に D N Aポリ メ ラー ゼ I ラージ ' フラグメ ン トを参考例 1 に記載の条件下で作用さ せ、 接着末端を平滑末端に変えた後、 参考例 1 に記載された条件 下でリ ン酸化された B a m H I リ ンカ一 〔 5 ' — P — d ( C G C G G A T C C G C G ) ] ( N e w E n g l a n d B i o L a b s 社製） 5 0 n g を参考例 1 に記載の条件下で T 4 D N A リ ガ一 ゼの作用によ り結合させた。 反応後、 2 0 ュニッ 卜の B a m H I 加えて、 3 7 ( 、 3 時間作用させ、、 次にセフ ァ ローズ 4 Β · 力 ラムを用いてリ ンカ一の結合した 2 . 2 k b D N A断片を分離し た。 該 D N A断片 6 g に 2 ユニッ トの制限酵素 H h a I を 5 0 ノ" 1 の反応液 〔 1 O m M T r i s - H C 1 ( p H 7 . 5 )， 5 0 m M N a C 1 , 1 0 m M M g C l 2 , 1 m M ジチオス レィ トール〕 中で 3 7 、 2 時間作用させた後、 1 . 0 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1 に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0 . 7 5 k b D N A断片を参考例 1 に記載の方法によつ てゲルから分取した （第 2 図参照） 。 On the other hand, 10 g of the above 2.2 kb DNA fragment was treated with DNA polymerase I large 'fragment under the conditions described in Reference Example 1 to change the cohesive ends to blunt ends. BamHI linker phosphorylated under the conditions described in Example 1 [5 '— P — d (CGCGGATCCGCG)] (New England BioLabs) 50 ng Reference Example 1 The binding was performed by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in (1). After the reaction, 20 units of BamHI were added, and the mixture was allowed to act for 37 hours (3 hours). Then, a 2.2 kb DNA fragment bound to the linker was separated using a Sepharose 4-tube column. To 6 g of the DNA fragment, 2 units of the restriction enzyme HhaI were added to 50 g of a reaction mixture [1 Om MTris-HC1 (pH 7.5), 50 mM NaNa]. C 1, 10 mM MM g Cl 2 , 1 mM dithiothreitol) for 37, 2 hours and then using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, the 0.75 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1 (see FIG. 2).
(D発現用べク タ 一の構築 (Construction of D expression vector)
大腸菌一酵母シャ トル ' ベク タ 一 p S H l 9 5 g に 6ュニッ 卜の制限酵素 S a 1 I を 2 0 1 の反応液 〔 1 O m M T r i s - H C 1 ( p H 7 . 5 ) , 7 m M M g C 1 2 , 1 7 5 m M a C I , 0 . 2 m M E D T A , 7 m M 2 —メルカプ トエタ ノー Escherichia coli-Yeast Shuttle 'vector-pSHl95 (5 g) and 6-unit restriction enzyme Sa1I in a reaction solution of 201 (1 Om MTris-HC1 (pH 7.5), . 7 m MM g C 1 2 , 1 7 5 m M a CI, 0 2 m MEDTA, 7 m M 2 - mercapto Toeta no
— ΟΜΡΙ— * ， ル〕 中で 3 7 、 2 時間作用させた後、 フ ノールで除蛋白 し、 冷エタ ノールで沈殿させた。 該 D N A 1 g に D N Aポリ メ ラ一 ゼ I ラージ ' フ ラ グメ ン ト を参考例 1 に記載の条件下で作用さ せ、 S a 1 I の接着末端を平滑末端に変えた。 該 D N A断片 5 0 0 n g と参考例 1 に記載されたリ ン酸化 X h o I リ ンカ一 5 0 n と を混合し、 参考例 1 に記載の条件下で T 4 D N Aリ ガ一ゼの 作用によって結合させた。 該反応液で大腸菌 D H 1 を形質転換さ せ、 アンピシ リ ン酎性の形質転換体の中から、 ？ 3 ^1 1 9 の 3 3 1 I 部位が X ii o I 部位に転換したプラスミ ド p S H l 9 — 1 を 保持する形貧転換体を得た （第 2 図参照） 。 — ΟΜΡΙ— *, For 37 to 2 hours, deproteinized with phenol, and precipitated with cold ethanol. The DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on 1 g of the DNA under the conditions described in Reference Example 1 to change the adhesive end of Sa1I to a blunt end. The DNA fragment (500 ng) was mixed with the phosphorylated XhoI linker (50 n) described in Reference Example 1, and the action of T4 DNA ligase was performed under the conditions described in Reference Example 1. Combined. Escherichia coli DH1 is transformed with the reaction solution, and? 3 3 1 I site at the 3 ^ 1 1 9 plasmid p SH l 9 was converted into X ii o I site - was obtained Katachihin transformants that holds 1 (see FIG. 2).
プラス ミ ド p S H l 9 — 1 D N A 1 0 g に各 1 0 ユニ ッ ト の制限酵素 B a m H I と X h o I と を 5 0 1 の反応液 .〔 1 0 -m ' M T r i s - H C l ( p H 7 . 5 ) , 7 m M M g C l 2 , 1 0 0 m M N a C 1 , 7 m M 2 —メノレカプ トエタ ノール〕 中で 3 7 。C、 2時間作用させた後、 1 . 0 %ァガロース · スラブゲルを 用いて参考例 Γに記载の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 8 . 0 k b の D N A断片を参考例 1 に記載の方法によってゲルから分 取した。 Plasmid p SHl9—Reaction solution of 50 units of 10 units of restriction enzyme BamHI and XhoI in 10 g of 1 DNA [10-m 'MTris-HCl (. p H 7 5), 7 m MM g C l 2, 1 0 0 m MN a C 1, 7 m M 2 - Menorekapu Toeta Nord] 3 in 7. C, and allowed to act for 2 hours, and then subjected to electrophoresis using 1.0% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example II. After the electrophoresis, a 8.0 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
該 8 . O k b D N A断片 5 0 0 n g、 参考例 2 の②に記載の 0 . 3 6 k b D N A断片 2 0 0 n g および 0 . 7 5 k b D N A断片 2 0 0 n g と を混合し、 参考例 1 に記載の条件下で T 4 D N A リ ガ一 ゼの作用によ り結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 D H 1 を形 賈転換させ、 アンピシ リ ン酎性の形質転換体の中から 3種の D N A断片が結合したプラス ミ ド p G L D 9 0 6 を保持する組み換え 体を分離した。 WIPO^ 参考例 3 The 8. O kb DNA fragment 5 0 0 ng, was mixed with 0. 3 6 kb DNA fragment 2 0 0 ng and 0. 7 5 kb DNA fragment 2 0 0 n g according to ② of Example 2, Reference The binding was effected by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Example 1. Escherichia coli DH1 is transformed using the reaction solution, and a recombinant having the plasmid pGLD906 to which three types of DNA fragments are bound is separated from the ampicillin-like transformants. did. WIPO ^ Reference example 3
プロモータ ーク ローニングベク タ ー p B T M l 2 6 の構築 プラスミ ド P B T M 1 2 6 は、 W i 1 1 i a m s らの方法に従 い以下のよ う に作製した。 財団法人発酵研究所よ り入手した  Construction of Promoter Cloning Vector pBTM1226 Plasmid PBTM1226 was prepared as follows according to the method of Wi11ams et al. Obtained from Fermentation Research Institute
B a c i l l u s p u m i l u s N C I B 8 6 0 0 ( I F .O - 1 2 0 8 9 ) よ り D N Aを調製し、 その D N A ( 6 . 5 g ) を 4 0 ユニッ トの制限酵素 E c o R I と 3 7 、 1 時間反応させ て切断したのち、 6 8 で 1 5分間加熱し、 エタ ノール沈濂を行つ た。 一方、 プラスミ ド P U B 1 1 0 ( 2 . 0 g ) を 2 0 ュニッ 卜の制限酵素 E c o R I と 3 7 °Cで 1 時間反応させて切断したの ち、 6 8 で 1 5分間加熱し、 エタ ノール沈钃を行っ た。 両沈鍰 を水に溶かして混合-し、 これに S O n m o l e の A T P , 1 0 ュ ニッ トの T 4 D N Aリ ガーゼ （宝酒造製） およびリガーゼ緩衝液 を加えた反応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 °Cで 3 0 時間保温し、 エタ ノール沈澱を行っ た。 沈鏺を T E緩衝液 （ 5 0 ^ 1 ) に溶解し、 その 2 5 1 を用いて B a c i l l u s s u b t i l i s M I 1 1 4 の形質転換を行っ た。 ク ロ ラムフエ二コール酎性の形賓 転換株よ り プラスミ ドを調製し、 該プラスミ ドを P B T M 1 2 4 と命名 した。 次にプラスミ ド P B T M 1 2 4 ( 2 . 5 g ) を 1 4 ユニ ッ トの制限酵素 P s t l と 3 7 、 1 時間反応させて切断 し、 _ 6 8 T1で 1 5分間加熱したのち、 エタ ノール沈澱を行っ た。 沈濂を水に溶解し、 6 6 11 111 0 1 6 の 丁 ？ ， 1 0ユニッ トの T 4 D N A リガ一ゼ （宝酒造製） およぴリ ガーゼ緩衝液を加えた反 応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 で 2 4 時間保温し、 エタ ノール沈澱 を行っ た。 沈澱を T E緩衝液に溶解し、 バチルス . サチルス M l 1 1 4 を形質転換させ、 カナマイシン酎性の形質転換株からプラ スミ ドを調製して、 該プラスミ ドを p B T M l 2 5 と命名 した。 本プラスミ ドはプラスミ ド p B T M 1 2 4 の C A T逮伝子のプロ モーター部位 （ P s t I 断片） が脱落したものである。 次にブラ 'ス ミ ド P B T M 1 2 5 ( 2 . 5 g ) を 1 8 ユニ ッ トの制限酵素 B a m H I および 1 5 ユニ ッ トの制限酵素 B g 1 Π と 3 7 °Cで 1 時間反応させて切断し、 6 8 で 1 5分間加熱したのち、 エタ ノー ル沈澱を行っ た。 沈雜を水に溶解したのち、 6 6 n m o 1 e の A T P , 1 3 ユニ ッ トの T 4 D N A リガーゼ （宝酒造製） およびリ ガーゼ緩衝液を含む反応液 （ 1 0 0 1 ) 中で 1 I :で 2 8 時間 保温し、 これを用いてバチルス ' サチルス M I 1 1 4 の形質転換 を行っ た。 カナマイシン酎性の形質転換株から'プラスミ ドを調製 し、 該プラスミ ドを P B T M 1 2 6 と命名 した （第 3 図参照） 。 参考例 4 DNA was prepared from Bacilluspumilus NCIB 860 (IF.O-12089), and the DNA (6.5 g) was combined with 40 units of restriction enzyme EcoRI and 37, 1 hour. After the reaction and cutting, the mixture was heated at 68 for 15 minutes, and subjected to ethanol precipitation. On the other hand, plasmid PUB110 (2.0 g) was reacted with 20 units of restriction enzyme EcoRI at 37 ° C for 1 hour, cut, and then heated at 68 for 15 minutes. Ethanol precipitation was performed. Both precipitates were dissolved in water and mixed, and the reaction mixture (1001) containing SO nmole ATP, 100 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer was added. The mixture was kept at 11 ° C for 30 hours for ethanol precipitation. The precipitate was dissolved in TE buffer (50 ^ 1), and Bacillus subtilis MI114 was transformed using the solution. Plasmid was prepared from a transformant of Chloram phenicol shochu, which was named PBTM124. Next, plasmid PBTM 124 (2.5 g) was reacted with 14 units of restriction enzyme Pstl for 37 hours for 37 hours, cut, and heated with _68 T1 for 15 minutes, followed by ethanol Knol precipitation was performed. Dissolve the precipitate in water, and add 6 6 11 11 0 16 , 10 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and a reaction solution (1001) to which ligase buffer had been added were incubated for 24 hours at 11 for ethanol precipitation. Was. Dissolve the precipitate in TE buffer and add Bacillus. 114 was transformed, a plasmid was prepared from a kanamycin-shochu transformant, and the plasmid was named pBTM125. In this plasmid, the promoter site (PstI fragment) of the CAT arrestor of plasmid pBTM124 was dropped. Next, 2.5 ml of Brasmid PBTM 125 was mixed with 18 units of restriction enzyme BamHI and 15 units of restriction enzyme Bg for 1 hour at 37 ° C and 1 ° C. The mixture was cut by reaction, heated at 68 for 15 minutes, and then ethanol precipitated. After dissolving the sediment in water, 1 I in a reaction solution (1001) containing 66 nmo 1 e of ATP, 13 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer was added. : For 28 hours, and used to transform Bacillus' Sacillus MI114. Plasmid was prepared from a kanamycin shochu transformant, and the plasmid was named PBTM126 (see FIG. 3). Reference example 4
プロモータ ーのク ローニン グ  Promoter Cloning
参考例 3 で得たプロモーターク ローニングベク ター p B T M 1 2 6 ( 2 . 1 ^ g ) を制限酵素 P s t l ( 8 ユニッ ト） で 3 7 。C、 1 時間切断したのち、 さ らに制限酵素 E c o R I ( 5 ユニッ ト） で 3 7 、 1 時間切断し、 6 8 てで 1 5分間加熱処理して反応を 停止させ、 エタ ノール沈瀕を行っ た。 一方、 B a c i 1 1 u s s u b t i 1 i s J B — 1 了 1 6 8 ( I F O— 1 4 1 4 4 )の染 色体（ 6 . 2 g )を P s t l ( 2 4 ユニッ ト）および E c o R I でそれぞれ 3 7 、 1 時間切断し、 6 8 °Cで 1 5分間加熱処理し たのちエタ ノール沈濂を行っ た。 両沈澱を水に溶解したのち混合 し、 アデノシン三リ ン酸 （ 6 6 n m o l e ) および T 4 D N A リ 一 OMH一 ガーゼ 〔宝酒造製〕 （ 1 0 ユニッ ト） 存在下で 1 1 °C、 2 4時間 反応し、 エタ ノール沈澱を行っ た。 沈濂を 1 O m M ト リ ス ' 塩酸 緩衝液 P H 8 . 0 ， 1 m M E D T A (T E緩衝液） に溶解し、 B . s u b t i l i s M I 1 1 4 の形質転換をプロ トプラス ト法 〔 S . C h a n g a n d S . N . C o h e n j M o l . G e n . G e n e t . ， 1 6 8 ， 1 1 1 ( 1 9 7 9 )〕 で行い、 1 2 . 5 g / m 1 のク ロ ラムフエニコ一ルを含む D M 3 寒天プレー ト 〔M o 1 . G e n . G e n e t . ， 1 6 8 ， 1 1 1 ( 1 9 7 9 ) 〕 で 選択すると 9 5 6株の形質転換株が得られた。 さ らに 2 0 0 g Z m 1 のク ロ ラムフ cニコ一ルを含むプレイ ン · ノヽー トイ ン ヒユー ジョ ン （ D i f c o社、 米国） の寒天プレー トでレプリ カする と 2 0株が生育した。 これ らの形賓転換株は強力なプロモーター活 性を有する D N A断片を組み込んだプラスミ ドを保有している。 The promoter cloning vector pBTM126 (2.1 ^ g) obtained in Reference Example 3 was treated with the restriction enzyme Pstl (8 units) 37. C, cut for 1 hour, cut with restriction enzyme EcoRI (5 units) for 37, 1 hour, heat at 688 for 15 minutes to stop the reaction, Was performed. On the other hand, the chromosome (6.2 g ) of Baci 1 1 ussubti 1 is JB — 1 166 (IFO — 141 4 4) was analyzed by P stl (24 units) and Eco RI, respectively. It was cut for one hour at 37 ° C, heat-treated at 68 ° C for 15 minutes, and then subjected to ethanol precipitation. After dissolving both precipitates in water, they were mixed and mixed with adenosine triphosphate (66 nmole) and T4 DNA The reaction was carried out at 11 ° C for 24 hours in the presence of gauze (Takara Shuzo) (10 units), and ethanol precipitation was performed. The precipitate was dissolved in 1 OmM Tris' hydrochloric acid buffer pH 8.0, 1mM MEDTA (TE buffer), and the transformation of B. subtilis MI114 was performed by the protoplast method [S.C. hangand S.N.Cohenj Mol.Gen.Genet., 1668, 11 1 (19779)], containing 12.5 g / m1 of chloramphenicol DM 3 agar plates [M o 1. G en. G enet., 1 6 8, 1 1 1 (1 9 7 9) ] transformants in selecting 9 5 6 shares were obtained. In addition, replicating on an agar plate of Plane-No-Toin-Hyu-Jong (Difco, USA) containing 200 g Zm1 of chloramphic nicotine yielded 20 strains. Grew up. These shape-converted strains possess plasmids that incorporate DNA fragments with strong promoter activity.
これらのう ち強い C A T活性 〔ウイ リ アムスらの方法による測 定 ： J . B a c t e r i o l . , 1 4 6 , 1 1 6 2 ( 1 9 8 1 )] を 示したプラスミ ドの一つを P B T M 1 2 8 (第 3 図参照） と した。 参考例 5  One of these plasmids that showed strong CAT activity [measured by the method of Williams et al .: J. B acteriol., 144, 116 (1 981)] was identified as PBTM1. 2 8 (see Figure 3). Reference example 5
プロモーター D N A断片の単離および性質  Isolation and characterization of the promoter DNA fragment
参考例 4 に記載のプラスミ ド p B T M l 2 8 ( 2 2 1 g )を P s ΐ 1 ( 2 0 8 ユニッ ト）および E c o R I ( 2 2 0 ユニッ ト）でそ れぞれ 3 7 。Cで 1 時間切断したのち 1 0 %ボリ アク リルア ミ ドゲ ル電気泳動にかけた。 ゲルをェチジゥムブロマイ ド溶液に浸して 染色し、 紫外線ランプで検出したプロモーター D N A断片を回収 した。 電気的に D N A断片をゲルから溶出させたのちフ X ノール 抽出、 エーテル抽出を行い、 エタ ノール沈灝した。 沈澱を T E緩  The plasmid pBT Ml28 (221g) described in Reference Example 4 was 37 with Psΐ1 (208 units) and EcoRI (220 units), respectively. After cleavage with C for 1 hour, the mixture was subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The gel was immersed in ethidium bromide solution for staining, and the promoter DNA fragment detected by an ultraviolet lamp was recovered. The DNA fragment was electrically eluted from the gel, and then extracted with ethanol and ether, and precipitated with ethanol. Slow precipitation
^Ο ΡΙ 衝液に溶かし 3 · 5 5 g のプロモーター D N A断片を単離した。 得られたプロモータ一 D N A断片の大きさ を 4 %ポリアク リル アミ ドゲル電気泳動で測定した。 プラスミ ド P B R 3 2 2 の H a e m分解物を標準とする と約 1 2 0 b p と算出された。 本断片の 塩基配列はジヌ ク レオチ ド合成鎖停止法 （前出） によって第 4 図 の様に決定された。 本断片は 1 1 7 b p からな リ 、 5 '末端に E c o R I 切断部位を、 3 '末端に P s t I 切断部位を有する。 ま た断片中には一 1 0領域および一 3 5領域と思われる塩基配列が 認め られる。 ^ Ο ΡΙ After dissolving in the buffer, 3.55 g of the promoter DNA fragment was isolated. The size of the resulting promoter-DNA fragment was measured by 4% polyacrylamide gel electrophoresis. Using the Haem digest of plasmid PBR322 as a standard, it was calculated to be about 120 bp. The nucleotide sequence of this fragment was determined by the dinucleotide synthesis chain termination method (described above) as shown in Fig. 4. This fragment consists of 117 bp, has an EcoRI cleavage site at the 5 'end and a PstI cleavage site at the 3' end. In the fragment, nucleotide sequences considered to be 110 regions and 135 regions are observed.
参考例 6 Reference example 6
発現ベク タ ー P B T M 1 3 4 の作製  Preparation of expression vector PBT M134
プラスミ ド P B T M I 2 8 ( 7 . 7 ," g ) を制限酵素 P s t l ( 5 1 ュ ジ ト） と 3 7 、 1 時間反応させて切断したのち、 0 . 7 5 ュニッ 卜の大腸菌アルカ リ フォスファ タ ーゼで 6 5 °C、 3 0 分間処理した。 反応生成物は、 反応液を フヱ ノール抽出、 エーテ ル抽出したのち、 エタ ノール沈澱を行って集めた。 沈瀕を少量の 水に溶解し、 これに 5 '末端を リ ン酸化した 8塩基の合成ヌク レ ォチ ド G G A G G T A T ( 2 0 0 n g ) 、 5，末端を リ ン酸化し た 1 4塩基の合成ヌ ク レオチ ド C G A T A C C T C C T G C A ( 3 5 0 n g ) ， 1 0 0 11 111 0 1 8 の 丁 ？ ， 2 8 ユニッ トの T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造製） およびリ ガーゼ緩衝液を加え、 反 応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 てで 2 0時間保温したのち、 エタ ノー ル沈澱を行った。 沈瀕を少量の水に溶解し、 2 5ユニッ トの C 1 a I で 3 7 。C， 1 時間処理したのちセファ ロース 4 B カラムで小 型オ リ ゴヌク レチ ドを除去し、 目的物をエタ ノール沈激して集め た。 沈澱を水に溶解し、 これに l O O n m o l e の A T P , 2 8 ユニッ トの T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造製） およびリ ガーゼ緩衝 液を加えた反応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 °Cで 2 0 時間保温して C 1 a I サイ ト を連結したのちその 5 0 1 を用いてプロ トプラス ト法 （前出） によって B a c i l l u s s u b t i' l i s M I 1 1 4 を形賓転換させた。 カナマイ シンおよびク ロラムフエ 二コール酎性の形賓転換株からプラスミ ドを単離し、 このプラス ミ ドを P B T M 1 3 4 (第 5 図参照） と命名 した。 Plasmid PBTMI28 (7.7, "g) was reacted with the restriction enzyme Pstl (51 udites) for 37 hours, cut for 1 hour, and then cut into 0.75 units of E. coli alkaline phosphatase. The reaction product was collected by phenol extraction and ether extraction, and then ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in a small amount of water. This was followed by an 8 nucleotide synthetic nucleotide GGAGGTAT (200 ng) with a 5 'phosphorylated end, and a 5, 14 synthetic nucleotide CGATACCTCCTGCA (3 50 ng), 100 11 11 18 18 丁?, 28 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer were added, and the reaction solution (1001) was added to 1 part. After incubating for 20 hours at room temperature, ethanol precipitation was performed, and the precipitate was dissolved in a small amount of water, and treated with 25 units of C1aI for 37 hours. After that, small oligonucleotides were removed with a Sepharose 4B column, and the target product was collected by ethanol precipitation. Was. The precipitate was dissolved in water, and the reaction mixture (1001) containing 100 nmole of ATP, 28 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer was added at 11 ° C. After incubating for 20 hours with the C1aI site, Bacillussubti'lis MI114 was transformed using the 501 by the protoplast method (described above). Plasmids were isolated from kanamycin and chloramphenicol shochu transformants, and this plasmid was named PBTM134 (see Fig. 5).
参考例 7 Reference Example 7
中性プロテア一ゼ逮伝子のク ローニング  Cloning of neutral proteases arrested child
B . a m y l o l i q u e f a c i e n s ( I F u — 1 4 l 1 ) '〔 I n s t i t u t e f o r F e r m e n t a t i o n , 〇's- a k s ， R e s e a r c h C o m m u n i c a t i o n s N o . 1 1 ( 1 9 8 3 ) 〕 よ り、 自体公知の方法 ！： M e t h o d s i n E n z y m o 1 o g y , 6 8 , 3 4 2 ( 1 9 7 9 ) 〕 に従い、 染色体 D N Aを調製した。 その染色体 D N A 8 . 8 g を 3 6ユニッ トの制限酵素 B g i nと 3 7 、 5 0分間反応させ て切新し、 6 5 °Cで 1 5 分間加熱処理したのち、 エタ ノールを加 えて D N Aを沈澱させた。 一方、 ク ロ一ニングべク.ター p B T M 1 1 9 (特開昭 5 9 — 5 5 8 9 7 ) ( 2 . 9 g ) を 3 0 ュニッ 卜の制限酵素 B g 1 Π と 3 7 °C、 5 0分間反応させて切断し、 0 . 5 ュニッ 卜のアルカ リ性フォスフ ァ ターゼを加えて 6 5 で、 3 0 分間保温したしちフ X ノール抽出、 エーテル抽出し、 エタ ノール 沈澱を行っ た。 両沈澱を水に溶解して混合し、 これに 6 6 n m o l e の A T P， 2 8 ュニッ トの T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造製）  B. Amy l o l i q u e f a c i en s (I F u — 14 l 1) '[I n st i t u t e f o r F E r m e n t a t i o n, 〇's-aks, R e se a r c h C o m m u n i c a t i o n s s s s s s s 8 1 9 公 知 9 9 9. Chromosome DNA was prepared in accordance with the following formula: MethodsinEnzymo1ogy, 68, 342 (19779). 8.8 g of the chromosomal DNA was incised by reacting with 36 units of restriction enzyme Bgin for 37, 50 minutes, heat-treated at 65 ° C for 15 minutes, and added with ethanol to add DNA. Was precipitated. On the other hand, cloning vector pBTM119 (Japanese Patent Laid-Open No. 59-55887) (2.9 g) was added to 30 units of restriction enzyme Bg1 1 and 37 ° C. C. Cleave by reacting for 50 minutes, add 0.5 units of alkaline phosphatase, incubate with 65 for 30 minutes, extract with ethanol, extract with ether, and precipitate ethanol with ethanol. went. Both precipitates were dissolved in water and mixed, and this was mixed with 66 nmole of ATP and 28 units of T4DNA ligase (Takara Shuzo).
一 ΟΜΡί . およびリ ガーゼ緩衝液を加えた反応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 。Cで 3 2 時間保温したのち、 エタ ノール沈灝を行った。 沈濂を T E緩 衝液に溶解し、 これを用いて B . s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 の形質転換を行っ た。 カナマイシン酎性の形質転換株の中から C P寒天培地 （酵母エキス 0 . 2 %、 ペプ トン 1 %、 食塩 0 . 2 %、 カゼイ ン 1 %、 寒天 1 . 5 %、 p H 7 . 3 ) のプレー ト上でハローOne word. And the reaction solution (1001) to which ligase buffer was added was used. After incubating for 32 hours at C, ethanol precipitation was performed. The precipitate was dissolved in a TE buffer and used to transform B. subti 1 is 1 A274. Among the kanamycin shochu transformants, CP agar medium (0.2% yeast extract, 1% peptone, 0.2% salt, 1% casein, 1.5% agar, pH 7.3) Hello on plate
〔 H . U e h a r a ら、 J . B a c t e r i o l . , 1 1 9 ， 8 2 ( 1 9 7 4 ) 〕 を形成する菌株を選択し、 その 1 株から単離し たプラスミ ドを ！） B T M 1 2 7 と命名 した。 本プラスミ ドはブラ ス ミ ド p B T M l 1 9 の B g i n部位に B . a m y 1 o 1 i q u e f a c i e n s ( I F O - 1 4 1 4 1 ) の中性プロテアーゼ逮 伝子を含む B g i n断片 （ 3 . ¾ K b ) が揷入されたものである[H. Uehara et al., J. Bacteriol., 119, 82 (1974)] were selected, and the plasmid isolated from the one strain was selected! ) This was named BTM127. This plasmid is located at the Bgin site of the plasmid pBTMl19, and contains a Bgin fragment containing the neutral protease gene of B. amy1 o1 iquefaciens (IFO-141). K b) is imported
(第 6 図参照） 。 . ' ' ' なお、 本プラスミ ド P B T M 1 2 7 を有する B . s u b t i l i s 1 A 2 7 4 - P B T M 1 2 7 は財団法人発酵研究所に I F 0— 1 4 3 0 S と して寄託されている。 (See Figure 6). '' 'B. subtilis 1 A2 7 4-PBTM 127 with this plasmid PBTM 127 is deposited with the Fermentation Research Institute as IF 0-144 S .
参考例 8 Reference Example 8
中性プロテア一ゼ遣伝子のサブク ローニング  Subcloning of neutral proteases
参考例 7 で得られたプラスミ ド p B T M l 2 7 ( 8 0 ," g ) を 制限酵素 B g i n ( 2 0 0ユニ ッ ト） と 3 7て、 1 時間反応させ て切断したのち、 0 . 7 %ァガロースゲル電気泳動にかけ、 分子 量の小さい方のバン ドのゲルを切り取つ た。 このゲル中の D N A を電気泳動溶出法 （逮伝子操作マニュアル， 高木康敬編著， 講談 社サイ ェンティ フ イ ク ， 1 9 8 2年） で回収する と約 1 0 gの B g i n断片 （ 3 . 9 k b ) が得られた。 得られた B g i n断片 （ 3 g ) を制限酵素 H i n d m ( 6 ュ ニ ッ ト） で 3 7。C、 1 時間処理して A靳片 （B g i n— H i n d H , 約 0 . 8 K b ) , B断片 （H i n d lE— H i n d lll , 約 1 . 1 K b ) および C新片 （ H i n d lE— B g i n， 約 1 . 9 K b ) の 3 つの断片に切断し、 エタ ノール沈澱を行っ た。 一方、 プラス ミ ド P B T M 1 2 6 ( 1 g ) を制限酵素 H i n d lH ( 5ュ ニ ジ ト） で 3 7 、 1 時間反応させて切断したのちエタ ノール沈澱を 行っ た。 雨沈濂を水で溶解し、 これに 1 0 0 n m o 1 e の A T P， 8 . 4ユニッ トの T 4 D N A リ ガ一ゼ （宝酒瀵製） およびリ ガ一 ゼ緩衝液を加えた反応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 てで 2 4時間保温 し、. B . s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 の形質転換を行っ た。 力 ナマイ シン酎性， ク ロ ラムフ： L二-コール感受.性の形質転換株から プラスミ ドを調製した結果、 2種鑌のプラス ミ ドが得られ、 それ ぞれを P B T M 5 0 8 ( 6 . 2 K b ) および∑> B T M 5 1 5 ( 7 . 7 K b ) と命名 した。 プラス ミ ド P B T M 5 1 5 はプラス ミ ド P B T M 1 2 6 の H i n d m部位に A断片と C断片が互に逆方向で 挿入されたものであ り、 プラス ミ ド p B T M 5 0 8 はプラスミ ド P B T M 1 2 6 の H i n d ill部位に B断片が揷入されたものであ る （第 7 図参照） 。 これらのプラス ミ ドを保持する菌株の C P培 地プレー ト上でのハロ一形成能を調べたと ころ、 p B T M 5 1 5 保持株はハロー形成能を示し、 P B T M 5 0 8 保持梂はハロー形 成能を示さなかった。 The plasmid pBTMl27 (80, "g) obtained in Reference Example 7 was reacted with the restriction enzyme Bgin (200 units) 37 for 1 hour, followed by cleavage for 1 hour. A 7% agarose gel was electrophoresed, and the gel of the band with the smaller molecular weight was cut out.The DNA in this gel was electrophoretically eluted. , 1982), about 10 g of a Bgin fragment (3.9 kb) was obtained. The obtained Bgin fragment (3 g) was digested with restriction enzyme Hindm (6 units). C, treated for 1 hour and treated with A fragment (B gin—H ind H, about 0.8 Kb), B fragment (H ind lE—H ind lll, about 1.1 Kb) and C fragment (H ind The fragment was cut into three fragments of lE-Bgin (about 1.9 Kb), and ethanol was precipitated. On the other hand, plasmid PBTM126 (1 g) was reacted with restriction enzyme HindH (5 units) for 37 hours and cut for 1 hour, followed by ethanol precipitation. The reaction was carried out by dissolving the rainfall precipitate in water and adding 100 nmo 1 e of ATP, 8.4 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) and ligase buffer. The solution (1001) was kept at room temperature for 24 hours with 11 and transformed into .B.subti1is1A274. Power Nama Shinsho, chloramph: As a result of preparing plasmid from a transformant which is L-chol sensitive, two types of plasmids were obtained, each of which was converted to PBTM508 (6). 2 K b) and ∑> BTM 5 15 (7.7 K b). Plasmid PBTM 515 is a plasmid in which the A and C fragments are inserted in the Hindm site of plasmid PBTM 126 in opposite directions, and plasmid pBTM 508 is plasmid The B fragment was inserted into the Hindill site of PBTM126 (see Fig. 7). When the halo-forming ability of the strains retaining these plasmids on a CP medium plate was examined, the pBTM 515-bearing strain exhibited halo-forming ability, and the PBTM 508-holding 梂It did not show competence.
次にプラスミ ド P B T M 1 2 7 ( 1 g ) を E c o R I ( 3 ュ ニッ 卜） および B g i n ( 2 ュニッ 卜） で、 またプラスミ ド p U B 1 1 0 ( l ," g ) を E c o R I ( 3 ュニ ジ ト ） および B a m H  Next, plasmid PBTM127 (1 g) was treated with EcoRI (3 units) and Bgin (2 units), and plasmid pUB110 (l, "g) was treated with EcoRI. (3 units) and B am H
WIPCT-彙 1 ( 5 ユニッ ト） で 3 7 °C、 1 時間それぞれ反応させて切断した のち、 6 5 °Cど 1 0分間加熱して反応を止め、 それぞれェタ ノ一 ル沈灝を行っ た。 両沈顥を水に溶解したのち混合し、 これに 1 0 O n m o l e の A T P , 8 . 4 ユニッ トの T 4 D N A リ ガ一ゼWIPCT-Vocabulary After cutting at 37 ° C for 1 hour at 1 (5 units) for 1 hour, the reaction was stopped by heating at 65 ° C for 10 minutes, and ethanol precipitation was performed for each. After dissolving both precipitates in water and mixing, add 10 O nmole of ATP and 8.4 units of T4 DNA ligase.
(宝酒造製） およびリ ガーゼ緩衝液を含む反応液 （ 1 0 0 1 ) を 1 1 てで 2 4時間保温し、 これを用いて B . s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 の形質転換を行った。 カナマイシン酎性の形質転換株 の中からハローを形成する株を選びそのプラスミ ドを p B T M 5(Takara Shuzo Co., Ltd.) and a reaction solution (1001) containing a ligase buffer were incubated at 11 for 24 hours, and used to transform B. subti 1 is 1 A2274. . A halo-forming strain was selected from the kanamycin shochu transformants, and the plasmid was selected as pBTM5.
2 3 と命名 した。 本プラス ミ ドはプラ ス ミ ド p U B 1 1 0 の E cIt was named 23. This plus is a positive Ec of p U B 110
0 R I - B a m H I 部位にプラスミ ド p B T M l 2 7 の E c o R0 R I-Bam HI Plasmid at the site pBTMl27 EcoR
1 一 B g 1 Π断片が挿入されたものである （第 8 図参照） 。 なお この E c o R I - B g 1 Π断片は P B T M I 2 7 の B g 1 Π，断片 の B断片の 1 部および C断片からなっている。 One Bg1Π fragment has been inserted (see Fig. 8). The EcoRI-Bg1Π fragment is composed of the Bg1 P of PBTMI27, a part of the B fragment of the fragment, and the C fragment.
以上の結果から、 中性プロテア一ゼ逮伝子は 断片 （ 1 . 9 K b ) の中に存在する こ と が明らかとなっ た。  From the above results, it was clarified that neutral proteases were present in fragments (1.9 Kb).
P B T M 5 1 5 ( 1 0 0 ," g ) を制限酵素 B g i n ( 2 0 0 ュ ニッ ト） および H i n d lE ( 2 0 0 ユニッ ト） で 3 7 °C、 1 時間 反応させて切断し、 1 %ァガ Π—スゲル電気泳動にかけ、 このゲ ルょ リ 1 . 9 K b の D N Aを電気泳動溶出法 （逮伝子操作マニュ アル， 高木康敬編著， 講談社） によ り 回収する と約 1 0 g の C 断片が得られた。  PBTM 5 15 (100, "g) was digested with restriction enzymes Bgin (200 units) and HindE (200 units) at 37 ° C for 1 hour, and cut. After 1% agarose gel electrophoresis, about 1.9 Kb of this gel DNA was recovered by electrophoretic elution (manual for arresting children, edited by Yasutaka Takagi, Kodansha). 0 g of the C fragment was obtained.
第 9 図にこの C断片の制限酵素切断地図を示す。  FIG. 9 shows a restriction map of the C fragment.
なお、 プラスミ ド p B T M 5 1 5 を保持する B， s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 ( B a c i l l u s s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 / p B T M 5 1 5 ) は射団法人発酵研究所に I F O— 1 4 3 7 7 と して寄託され、 また、 ブタペス ト条約に基づいて通商産 業省工業技術院微生物工業技術研究所 （ F R I ) に F E R M B P— 6 2 2 と して寄託されている。 In addition, B, subti 1 is 1 A2 7 4 (Bacillus subti 1 is 1 A274 / p BTM5 15), which retains the plasmid pBTM5 15 Four Deposited as 377 7 and deposited under the Budapest Treaty with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry of Japan as FERMBP-622.
参考例 9 Reference Example 9
塩基配列の決定  Determination of nucleotide sequence
参考例 8 で得られた C断片の塩基配列の一部をジデォキシヌク レオチ ド合成鎖停止法および M a X a m— G i 1 b o r t 法を用 いて決定した。 C靳片の B g 1 Πサイ 卜側からの塩基配列および 翻訳したァ ミ ノ酸配列を第 1 0 図に示す。 本配列中にはプロモー ターと して Ε <Γ によって認識される一 3 5領域 （T T G C A G ) と一 1 0領域 （ Τ Α Τ Τ Α Τ ) 、 Ε 637 によって認識される一 3 5領域 （A G T T T T) と一 1 0領域 （G A G A-T T G C T ) お よび Ε(^2 によって認識されると予想される一 3 5領域 （Α Α Τ T C ) と一 1 0領域 （ T A G T T T T A T A) が見出される。 な お、 B g i n— S a u 3 A l 断片 （ 5 3 0 b p ) (第 9 図参照） がプロモーター活性を有する こ とは、 プロモータ 一ク ロ一ニング ベク ター P F T B 2 8 1 (吉村ら、 日本農芸化学会昭和 5 8年度 大会講演要旨集、 第 2 8頁） を用いる こ と によつて確認する こ と が出来たので上記プロモーターが機能している と予想される。 ま た、 プロモーターの下流には S D領域およびオープン フ レームが 存在し、 1 番目のメチォニンから 2 7 または 2 8番目 のァラニン までが中性プロテアーゼのシグナルペプチ ドと思われる。 2 2 2 番目のァラニン以後のア ミ ノ酸配列は文献で報告されている中性 プロテア一ゼ ！； P . L . L e v y ら , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , 7 2 ， 4 3 4 1 ( 1 9 7 5 ) 〕 とは若干異なつ たが実施例 3 に示した中性プロテアーゼの N末端のア ミ ノ酸配列 とは完全に一致した。 この結果、 シグナルペプチ ドと思われる配 列と成熟蛋白質との間に約 2 0 0個の機能の不明なぺプタ イ ドが 存在する こ と が予想された。 A part of the nucleotide sequence of the C fragment obtained in Reference Example 8 was determined using the dideoxynucleotide synthesis chain termination method and the Maxam-Gi1 bort method. Figure 10 shows the nucleotide sequence from the Bg1 site of the C fragment and the translated amino acid sequence. One 3 5 region (TTGCAG) as one 1 0 region in this sequence recognized by E <gamma as a promoter (Τ Α Τ Τ Α Τ) , one 3 5 region recognized by E 6 37 ( AGTTTT) and the 10 region (GAG AT TGCT) and the 135 region (Α Τ TC) and the 10 region (TAGTTTTATA), which are expected to be recognized by Ε (^ 2 ). The fact that the Bgin—Sau3A1 fragment (530 bp) (see FIG. 9) has promoter activity is based on the fact that the promoter-cloning vector PFTB 281 (Yoshimura et al. The above-mentioned promoter is expected to be functioning because it was confirmed by using the Proceedings of the Annual Meeting of the Showa 58 Meeting, page 28). SD area and open frame exist, from 1st methionine to 27th or 28th alanine The amino acid sequence after the second alanine is the neutral protease sequence reported in the literature !; P. L. Levy et al., Proc. atl. A cad. S ci., 72, 4341 (19775)] However, the amino acid sequence at the N-terminus of the neutral protease shown in Example 3 was completely identical. As a result, it was expected that about 200 peptides of unknown function exist between the mature protein and the sequence considered to be a signal peptide.
参考例 1 0 Reference example 10
ぺニシ リナーゼ分泌プラスミ ドの構築  Construction of plasminide secretion plasmid
プラスミ ド p B T M 5 1 5 の C断片上の中性プロテア一ゼ遗伝 子のプロモーター、 シグナルペプチ ドをコー ドする領域およびプ 口ペプチ ドの上流をコー ドする領域を含む B g 1 Π - S a u 3 A 1 断片 （約 5 3 0 b p ) が P F T B 2 8 1 の B a m H I 部位に揷 入されて出来たプラスミ ド P T R 1 0 (第 1 1 図参照） を E c o R I で切断し、 約 5 3 CTb p の E c o R I 断片を単離した。 本断 片を制限酵素 H a e mで切断し、 プロモーターおよびシグナルぺ プチ ドの C末竭の近く までをコー ドする領域を含む E c o R I - H a e ltl断片 （約 3 4 0 b p ) を単離した。 この断片に？： h o i リ ンカ一 （ C C T C G A G G ) を T 4 D N A リ ガーゼを用いて連 結させた。  Plasmid p BTM containing the promoter of the neutral protease gene on the C fragment of BTM5115, a region encoding the signal peptide, and a region encoding the upstream of the peptide. Plasmid PTR10 (see Fig. 11) formed by inserting the Sau3A1 fragment (about 530 bp) into the BamHI site of PFTB281 was digested with EcoRI. An EcoRI fragment of about 53 CTb p was isolated. This fragment is digested with the restriction enzyme Haem, and an EcoRI-Haeltl fragment (about 340 bp) containing a region encoding the promoter and signal peptide up to the C-terminal region is isolated. did. In this fragment? : Hoi linker (CTCTCGAGG) was ligated using T4DNA ligase.
一方、 プラスミ ド p M B 9 〔 F . B o l i v a r e t a 1 . , G e n e ， 7 5 ( 1 9 7 7 ) 〕 に B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s の ニシ リナ一ゼ逮伝子を組み込んだプラ ス ミ ド P E N 1 (大阪大学 大嶋泰治教授から入手）（第 1 0 図参照） よ り S a c I - P s t I 断片（ 8 . 5 K b )を単離した。 本断片中 にはぺニシ リ ナーゼのシグナルペプチ ドの後半部分と成熟蛋白を コー ドする領域が含まれており、 P s t I 部位がシグナルぺプチ - ドを コー ドする領域の中間付近に相当する。 そこで上記の S a c 1 - P s t I 断片を 5 ユニッ トのヌク レアーゼ B A L 3 1 (B e t e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s )*^ 室温で 1 5秒間処理したのち、 X h o I リ ンカ一 （ C C T C G A G G) (N e w E n 1 a n d B i o 1 a b s )を加えて T 4 D N A リガーゼで連結させ、 E s c h e r i c h i a c o 1 i J AOn the other hand, the plasmid pMB9 [F. Bolivareta 1., Gene, 75 (1977)] has a plasmid PEN 1 (Osaka University The SacI-PstI fragment (8.5 Kb) was isolated from (obtained from Prof. Yasuji Oshima) (see Fig. 10). This fragment contains the latter part of the signal peptide of penicillinase and the region encoding the mature protein, and the PstI site corresponds to the vicinity of the middle of the region encoding the signal peptide. I do. So S ac After treating the 1-PstI fragment with 5 units of the nuclease BAL31 (Betesda Research Laboratories) * ^ for 15 seconds at room temperature, the XhoI linker (CCTCGAGG) (New En 1 and Bio 1 abs) and ligated with T4 DNA ligase, and Escherichiaco 1 i JA
2 2 1 (大阪大学 大嗨泰治教授から入手）の形質転換を行っ た。 テ トラサイク リ ン酎性を示した組み換え体のプラスミ ドの B g 1 Π - X h o I 断片の大き さ をポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動で 測定し、 シグナルペプチ ドをコー ドする領域の大部分が削除され ている と思われるい く つかのク ローンを得た。 これらのク ロ一ン の塩基配列をジデォキ ヌク レオチ ド合成鎖停止法で決定した。 ク ローンの 1 つであるプラス ミ ド p E N X 3 7 4 ( 8 . 3-K b )で はぺニシ リナーゼの、戒熟蛋白をコー ドする D N Aの 5，.末端に S e r - A r g - A 1 a をコー ドするヌク レオチ ドが結合している こ と が明らかとなった （第 1 2、 1 3 および 1 4 図参照） 。 2 2 1 (obtained from Prof. Taiji Oosaka of Osaka University) was transformed. The size of the Bg1Π-XhoI fragment of the recombinant plasmid which exhibited tetracycline shochu properties was measured by polyacrylamide gel electrophoresis, and the majority of the region encoding the signal peptide was measured. Got some clones that seem to have been deleted. The nucleotide sequences of these clones were determined by didenucleotide synthesis chain termination method. One of the clones, plasmid p ENX 374 (8.3-Kb), contains Ser-Arg- at the 5 and. The nucleotides encoding A1a were found to be bound (see Figures 12, 13, and 14).
次に、 P U B 1 1 0 を制限酵素 S p h l と E c o R I で切断し、 ァガロースゲル電気泳動および電気泳動溶出法によって大きい S P h i — E c o R I 断片（ 3 . 5 K b )を単離した（第 1 1 図参照）。 上記で得た中性プロテア一ゼ逮伝子のプロ モータ ーおよぴシグ ナルペプチ ドをコー ドする領域を含む E c o R I - X h o I 断片 ( 3 4 0 b p , 0 . 5 g ) 、 P E N X 3 7 4 由来の X h o l — S p h l 断片 （ 1 . 9 K b , 0 . 5 g ) および p U B l l O 由 来の S p h l — E c o R I 断片 （ 0 . 5 g ) を T 4 D N A リ ガ一 ゼの作用によ り連結させ、 B . s u b t i 1 i s 1 A 2 7 4 の 形質転換を行い、 得られたカナマイシン酎性の組み換え体のう ち、 すべての断片を含むプラスミ ドの 1 つを P T E X 2 0 1 ( 5 . 7 K b )と命名 した（第 1 1 図参照）。 なお、 プラスミ ド P T E X 2 0 1 を保持する B . s u b t i l i s l A 2 7 4 (B a c i 1 1 u s s u b t i l i s 1 A 2 7 4 / P T E X 2 0 1 )は財団法 人、 発酵研究所に I F 0— 1 4 3 7 5 と して寄託され、 また、 ブ タペス ト条約に基づいて通商産業省工業技術院微生物工業技術研 究所（ F R I )に F E R M B P - 6 1 9 と して寄託さ,れている。 実施例 1 Next, PUB110 was digested with restriction enzymes Sphl and EcoRI, and a large SP hi-EcoRI fragment (3.5 Kb) was isolated by agarose gel electrophoresis and electrophoretic elution (No. See Figure 1 1). The EcoRI-XhoI fragment (340 bp, 0.5 g) containing the promoter for the neutral protease arrestor and the signal peptide-encoding region obtained above, PENX The Xhol — Sphl fragment (1.9 Kb, 0.5 g) derived from 374 and the Sphl — EcoRI fragment (0.5 g) derived from pUBllO were ligated to T4 DNA ligase. Subsequent ligation was carried out to effect the transformation of B. subti 1 is 1 A274, and among the resulting kanamycin shochu recombinants, One of the plasmids containing all the fragments was named PTEX201 (5.7 Kb) (see Figure 11). In addition, B. subtilisl A 274 (B aci 11 ussubtilis 1 A 274 / PTEX 210), which retains the plasmid PTEX 201, is an IF 0—1 4 3 It has been deposited as FERMBP-619 with the Ministry of International Trade and Industry under the Ministry of International Trade and Industry's Institute of Industrial Science and Technology (FRI) under the Butapest Treaty. Example 1
5 ' C A T C G T T A C A C C A A T A T ( L 1 3鎮一へプタ デカヌク レオチ ド） の合成 ：  Synthesis of 5 'C ATC C GTT A C A C A A T A T (L13 Heptadecanucleotide):
各オ リ ゴヌ ク レオチ ド · ブロ ッ クは固相合成法によって調製さ れたが、 原料と して用いられたヌク レオシ ドを固定した.樹脂は、 例，えばチミ ジン樹脂の場合、 ア ミ ノ メチルポリ *スチレ ン樹脂 〔 1 % ジビニルベンゼン， ア ミ ノ基 ： 0 . 2 1 m e q Z g , 1 0 0 — 2 5 0 メ ッ シュ） に既知の方法 （例えば、 M i y o s h i 等、 N u c l e i c A c i d s R e s . , _8_, 5 5 0 7 ( 1 9 8 0 ) 〕 に従っ て 5 ' —ジメ ト キシ ト リ チルチミ ジン— 3 '— Ο—サク シネ一 ト を結合して調製された。 ジヌ ク レオチ ド ' ブ口 ジ ク は既知の方 法 〔第 1 5 図、 C . Β . R e e s e , L . Z a r d j N u c l e i c A c i d s R e s . ， , 4 6 1 1 ( 1 9 8 1 ) 〕 に準 じて合成したもの、 あるいは市販品 （例えば和光純薬 ： 保護ダイ マー 1 6種） を使用 した。 例と して挙げた L 1 3 に対応するオ リ ゴヌク レオチ ドの鎖長延長はチ ミ ジン固定樹脂 （ 3 O m g , 5 m o 1 ) を用い、 第 4表記載の操作を繰返すこ と によ り完結させ た （第 1 6 図参照） 。  Each of the oligonucleotide blocks was prepared by solid-phase synthesis, but the nucleosides used as raw materials were immobilized. For example, in the case of thymidine resin, Aminomethylpoly * styrene resin [1% divinylbenzene, amino group: 0.21 meq Zg, 100-250 mesh) known methods (for example, Miyoshi et al., N ucleic A cids Res., _8_, 5507 (1980))] and prepared by combining 5'-dimethoxytritylthymidine- 3 '-—- succinate The method of dinucleotides is known by the known method [Fig. 15, C. Β. Reese, L. Zardj Nucleic Acids Res.,, 461 1 (1981) )] Or a commercially available product (for example, Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: 16 types of protected dimer) corresponding to L13 shown as an example. The chain length extension of the oligonucleotide was completed by repeating the operations described in Table 4 using thymidine-fixed resin (3 O mg, 5 mo 1) (see Fig. 16). .
O PI WIPO 4 O PI WIPO Four
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0001
D C M — M : ジク ロルメ タ ン一メ タ ノール  D C M — M: Dichloromethane-Methanol
L 1 3 の場合、 T A ， A A , C C , C A , T A , G T , T C , C Aの順序でブロ ッ ク を縮合した。 反応後、 樹脂をジォキサン In the case of L13, TA, AA, CC, CA, TA, GT, TC, Blocks were condensed in the order of CA. After the reaction, dioxane
( 2 m l )で 2 回洗浄し、 1 M Ν', Ν', NJ, 3—テ トラメチルダ ァニジゥム s y n—ピリ ジン一 2—アルド キシム （ 0 . 5 m l ) , ジォキサン （ 0 , 4 m l ) および水 （ 0 . 1 m l ) を加え、 3 0 °Cで 1 6 時間振盪した。 樹脂と液と を分離し、 更に樹脂を 5 0 % ピリ ジン水 （ 2 m l ) で 4 回洗い、 分離液と洗液と を一緒に し、 濃縮乾固した。 残留物にピリ ジン（ 0 . 5 m 1 )、 次いで濃アンモ ニァ水（ 1 0 m l )を加え、 密栓容器中 5 5 - 6 0 で 5 時間加熱 したのち、 濃縮乾固した。 残留物を C 1 8 逆相ク ロマ トグラ フィ ' 〔担体 ： C 1 8 シ リ カゲル（w a ΐ e r s ) , カ ラム ： E c o n o 一 C o 1 u m n ( 0 . 7 X 1 5 c m , B i o - R a d ) 〕 で分離 精.製し最-も遅く溶出される分画を得た。 この分面を濃縮し、 8 0 %酢酸 （ 1 m l ) に溶解して、 2 0分間放置した。 醉酸を完全に , 留去し、 残留物を水溶液とな し、 酢酸ェチル （ 2 m l ) で 3 回抽 出して ト リ タノールを除去し、 C 1 8 逆相高速液体ク ロマ トグラ フィ 一 （担体 ： N u c 1 e o s i 1 S C jR ； カ ラム ： 4 X 3 0 0 m m， 梅谷精機 ； 0 . 1 M酢酸 ト リェチルアンモニ ゥム含有 水一ァセ 卜二 ト リル系） な らびにイオン交換高速液体ク ロマ トグ ラ フ ィ ー （担体 ： T S K — G E L D E A E — 2 S W ; カ ラム ： 4 . 6 X 2 5 0 m m , ギ酸アンモニ ゥムーアセ トニ 卜 リル系） に よって精製し、 5 . 2 O D クの純品を得た。 本品の塩基配列は、 二次元フィ ンガープリ ン ト法によって分析 （ R . F r a n k , H B l o c k e r , " C h e m i c a l a n d E n z y m a t i c S y n t h e s i s o f G e n e F r a g m e n t s " 2 2 5頁、 v e r l a g C h e m i e , 1 9 8 2 ) した。 実施例 2 Washed twice with (2 ml), 1 M Ν ', Ν', N J, 3 - Te Toramechiruda Anijiumu syn- pyridinium Jin one 2- aldoxime (. 0 5 ml), Jiokisan (0, 4 ml) and Water (0.1 ml) was added, and the mixture was shaken at 30 ° C for 16 hours. The resin and the liquid were separated, and the resin was further washed four times with 50% pyridin water (2 ml), and the separated liquid and the washing liquid were combined and concentrated to dryness. Pyridine (0.5 ml) and then concentrated aqueous ammonia (10 ml) were added to the residue, and the mixture was heated in a sealed container at 55-60 for 5 hours, and concentrated to dryness. The residue was subjected to C 18 reversed-phase chromatography (carrier: C 18 silica gel (wa ers ers), column: Econo-Co 1 umn (0.7 X 15 cm, Bio- Rad)]] to obtain a fraction eluted at the latest. This area was concentrated, dissolved in 80% acetic acid (1 ml), and left for 20 minutes. The drusnic acid was completely distilled off, the residue was made into an aqueous solution, extracted with ethyl acetate (2 ml) three times to remove tritanol, and C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (C18). carrier: N uc 1 eosi 1 SC jR ; column:. 4 X 3 0 0 mm , Umetani Seiki; 0 1 M acetic preparative Ryechiruanmoni © free water one § Se Bok two preparative drill system) rabbi to ion exchange high performance liquid Purified by chromatograph (carrier: TSK-GELDEAE-2 SW; column: 4.6 x 250 mm, ammonium formate / moisture nitrile system), pure product of 5.2 OD I got The nucleotide sequence of this product was analyzed by the two-dimensional finger print method (R. F rank, HB locker, "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments", p. 25, verlag Chemie, 1982). ) did. Example 2
オリ ゴヌク レオチ ド · ブロ ッ クのハイプリ ジ ド形成とその酵素 的連結 ：  Hybridization of oligonucleotide block and its enzymatic ligation:
ヒ ト · リ ゾチーム逮伝子 2重鎖構成に閧する一連の操作は、 第 1 7 図に.示してある。  The sequence of operations for a human lysozyme arrestor duplex configuration is shown in Figure 17.
5 '末端となる U 1 と L 2 6鎖を除き、 オ リ ゴヌク レオチ ド * ブロ ッ ク各 0 . につき 1 0 m M A T P ( 1 1 ) を加 え、 全液量が 9 . 5 ," 1 で、 しかも 5 0 m M T r i s塩酸 （ P H 8 . 0 ) , l O m M塩化マグネシウム， l O m Mメノレカプトェ タ ノ一ル， I m Mスペルミ ンになるよ う に調整し、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （ E C 2 . 7 . 1 . 7 8 ) ( 6 Uノ 1 , 0 . 5 1 ) を加え 3 7 °Cで 9 0分間イ ンキュベー ト した。 反応液は 9 —0 で 5分間加熱し失活させた。 5 '位の リ ン酸化されたオ リ ゴ マー溶液 （各 1 ," 1 ) を第 1 7 図の通り 〔 I 〕 から 〔V〕 群に分 割して混合し、 全液量が 2 3 6 1 で、 6 6 m M T r i s 塩酸 ( P H 7 . 6 ) ， 6 . 6 m M塩化マグネシウム， 5 0 0 , " M A T P となるよ う に調整した。 これを 9 0 °Cで 3 分間加熱し、 さ ら に氷で急冷したのち、 再び 7 5 °Cの湯に浸し、 室温になる迄ゆつ く リ アニーリ ングした。 更に 1 5 。Cで 1 0分間放置し、 0 . 2 M メルカプトエタ ノール （ 1 3 1 ) と T 4 D N A リ ガーゼ （E C 6 . 5 . 1 . 1 ; 2 · 5 U / 1 , 1 ^ 1 ) を加え、 1 5 °Cで 2 0 時間イ ンキュベー ト した。 反応液を 6 5 で 5分間加熱して酵 素を失活させたのち、 反応液の一部分 （ 2 . 5 1 ) を 1 0 %ポ リ アク リルア ミ ド · ゲル電気泳動法に付したと ころ、 群 〔 I 〕 お ょぴ 〔 Π〕 （約 7 8 b p ) はサイズマーカ一と して用いた p B R 一 ΟΜΡΙ _ 3 2 2 ' H a e ll分解物の 6 4 b p フ ラ グメ ン ト と 8 0 b p ブ ラ グメ ン 卜 との間に、 群 〔DI〕 （約 8 2 b P ) は 8 0 b p フラグメ ン ト と 8 9 b p フラグメ ン ト との間に、 群 ！： V〕 （約 9 3 b p ) は 8 9 b p フラグメ ン ト と 1 0 3 b P フラグメ ン ト との間にそれ ぞれ泳動されている こ と が判っ た。 . Except for the U1 and L26 chains at the 5 'end, add 10 m MATP (11) for each of the oligonucleotide * blocks, and the total liquid volume is 9.5, "1 And adjusted to 50 mM MT ris hydrochloric acid ( PH 8.0), lOmM magnesium chloride, lOmM menolecaptoethanol, ImM spermin, and T4 poly. Nucleotide kinase (EC 2.7.1.78) (6U, 1, 0.51) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 90 minutes, and the reaction solution was heated at 9-0 for 5 minutes. The phosphorylated oligomer solution at the 5'-position (each 1, "1") was divided into groups [I] to [V] as shown in Fig. 17 and mixed. The total liquid volume was adjusted to be 2361, 66 mM MT ris hydrochloric acid (PH 7.6), 6.6 mM magnesium chloride, 500, "MATP. C for 3 minutes, quench with ice, and soak again in 75 ° C hot water. The sample was left to stand at 15 ° C for 10 minutes, then 0.2 M mercaptoethanol (1311) and T4 DNA ligase (EC 6.5.1.1.1) were added. ; 2.5 U / 1, 1 ^ 1) and incubated for 20 hours at 15 ° C. After heating the reaction solution at 65 for 5 minutes to inactivate the enzyme, the reaction solution was added. When a part of (2.51) was subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis, the group [I] ぴ [Π] (about 78 bp) had a size marker P BR ΟΜΡΙ _ _ 3 2 2 'H ae ll between 6 4 bp off La Gume down bets decomposition products with a 8 0 bp blanking La Gume emissions Bok, the group [DI] (about 8 2 b P) is 8 0 bp Furagume down bets And between the 89 bp fragment! : V] (about 9 3 bp) is and has been found this to their respective are migrating between the 8 9 bp Furagume down door and 1 0 3 b P Furagume down door. .
しかし、 群 〔IV〕 （約 7 4 b p ) については副反応による多 数のバン ドが認め られたため、 この群については、 さ らに 2群  However, group (IV) (approximately 74 bp) showed a large number of bands due to side reactions.
(U 1 6 , U 1 7 ， U 1 8 , L 1 6 , L 1 7 と U 1 9 ， U 2 0 , L 1 8 , L 1 9 , L 2 0 ) に分け、 T 4 D N A リ ガーゼで連結し、 反応途中でそれら を混合して群 〔IV〕 を得るこ と ができた。 反 応液を飽和フヱ ノ ール水一ク ロ 口ホルム（ 1 ： 1 V Z V) で洗い、 3 M醉酸ナ ト リ ウム （ p H 5 . 6 ) とエタ ノールと を加え、 一 8 0 °Cで 5分間保ち、 D N A ¾沈澱させた。 各群の D N Aを変性条 件下 1 0 %ポリ アク リルア ミ ドゲル上で精製し、 4 5 m M T r i s 硼酸緩衝液 （ P H 8 . 4 ) を用い電気的溶出を行い、 各群 D N A ( 1 0〜 1 5 ^ g ) を得た。 更にも う一度 D M Aをエタ ノ ー ル沈澱によって精製したのち、 各群 （ 1 . 5〜 2 ," g ) を T 4 D N A リ ガーゼで連結して完全なヒ ト · リ ゾチーム逮伝子 （約 1 S ) を得た。 本品は 5 %ポリ アク リルア ミ ドゲル上で約 4 0 4 b(U 16, U 17, U 18, L 16, L 17 and U 19, U 20, L 18, L 19, L 20) and use T4 DNA ligase They were ligated and mixed during the reaction to obtain Group [IV]. The reaction solution was washed with saturated phenol water (1: 1 VZV), added with 3M sodium sulphate (pH 5.6) and ethanol, and added to the reaction solution. The mixture was kept at 5 ° C for 5 minutes to precipitate DNA. The DNA of each group was purified on a 10% polyacrylamide gel under denaturing conditions, and electroeluted with 45 mM MTris borate buffer (PH 8.4). ~ 15 ^ g). After further purification of the DMA by ethanol precipitation, each group (1.5-2, " g ) was ligated with T4 DNA ligase and the complete human lysozyme arrested (approx. This product was obtained on a 5% polyacrylamide gel, about 404 b.
P に対応する。 ク ローニングに先立って、 該 D N Aの両 5 '末端 を常法に従って酵素的に リ ン酸化した。 Corresponds to P. Prior to cloning, both 5 'ends of the DNA were enzymatically phosphorylated by a conventional method.
実施例 3 Example 3
ヒ ト · リ ゾチーム遗伝子のサブク ローニング ：  Human lysozyme: sub-cloning of the child:
参考例 2で構築したプラスミ ド P G L D 9 0 6 1 g に 5 ュ ニ ッ トの制限酵素 X h o I を 1 0 1 の反応液 〔 1 O O m M N a C 1 , 5 0 m M T r i s - H C 1 ( p H 7 . 5 ) ， 1 0 m M M g C 1 2 , 1 m M D T T〕 中で 3 7 、 1 時間作用させた後、 フエ ノールで除蛋白 し、 冷エタ ノールで沈激させた。 該 D N AA reaction mixture of 5 units of restriction enzyme XhoI and 101 of plasmid PGLD (9061 g) constructed in Reference Example 2 (1 OO m MN a After acting for 37, 1 hour in C1, 50 mM MTris-HC1 (pH 7.5), 10 mm MMg C12, 1 mMDTT], deproteinize with phenol. Then, the mixture was agitated with cold ethanol. The DNA
( 1 0 n g ) に実施例 1 で調製したヒ 卜 · リ ゾチーム遣伝子 5 0 n g と を混合し、 .1 0 1 の反応液 〔 6 6 m M T r i s - H C 1 ( p H 7 . 6 ) , 1 0 m M A T P , 1 0 m M s p e r m i d i n e , 1 0 0 m M M g C l 2 , ! 5 0 m M D T T , 2 m g / m 1 B S A , 5 u n i t s T 4 D N A 1 i g a s e(10 ng) and 50 ng of the human lysozyme gene prepared in Example 1 were mixed with each other, and a 0.101 reaction solution [66 mM MTris-HC1 (pH 7.6) ), 1 0 m MATP, 1 0 m M spermidine, 1 0 0 m MM g C l 2,! 5 0 m MDTT, 2 mg / m 1 BSA, 5 units T 4 DNA 1 igase
(宝酒造 （株） 製） 〕 中、 1 4てで一夜作用とせて D N Aを結合 させた。 この反応液を用いて大腸菌 D H 1 株を前記 C o h e II ら の方法に従って形質転換した。 アンピシ リ ン酎性を指標と して選 択した形賓転換体から、 アルカ リ抽出法 （前出） によってプラス ミ ドを単癱し、 分子量および制限酵素による分解パターンを調べ、 P G L D 9 0 6 の X h o I 部位にヒ ト · リ ゾチーム遺伝子が挿入 されたプラスミ ド P G L D 9 0 6 — 6 を得た。 該プラスミ ドでは ヒ ト ' リ ゾチーム ¾伝子は G L Dプロモーターの向きと逆方向に 揷入されていた。 (Manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)] In the middle, DNA was allowed to act overnight at 14 days. Using this reaction solution, Escherichia coli DH1 strain was transformed according to the method described above for Coh II. From the transformants selected using ampicillin shochu as an index, plasmids were isolated by the alkali extraction method (described above), and the molecular weight and the degradation pattern by restriction enzymes were examined. Thus, a plasmid PGLD906-6 having the human lysozyme gene inserted into the XhoI site was obtained. In this plasmid, the human lysozyme gene was inserted in the direction opposite to the direction of the GLD promoter.
実施例 4 Example 4
ヒ ト · リ ゾチーム遺伝子発現プラスミ ドの構築 ：  Construction of human lysozyme gene expression plasmid:
実施例 3記載のプラスミ ド P G L D 9 0 6 — 6 ( 1 0 ^ g ) に 制限酵素 X h o l ( 5 0ユニッ ト） を 5 0 1 の反応液 （X h o I 用反応液、 前出） 中で 3 7て、 1 時間作用させたのち、 1 . 5 %ァガロース ' スラブゲル電気泳動にかけた （ 1 5 0 V , 1 時間） 泳動後、 4 0 9 b D N A断片を含むゲル片を透析チューブ内に封 入し、 泳動用緩衝液内に沈め、 該 D N A断片をゲルから電気的に 溶出した （ D c D o n e 1 1 , M . W . ら 前出） 透析チューブ 内液を フエ ノール抽出、 さ らにエーテル抽出した後、 N a C l を 0 . 2 Mになるよ う に加え、 つづいて 2倍量の冷エタ ノールを加 えて一 2 0 で沈澱させた。 The restriction enzyme Xhol (50 units) was added to the plasmid PGLD906-6 (10 ^ g) described in Example 3 in a reaction mixture of 501 (reaction solution for XhoI, supra). After working for 1 hour, the gel was subjected to 1.5% agarose 'slab gel electrophoresis (150 V, 1 hour). After the electrophoresis, the gel piece containing the 409 b DNA fragment was sealed in a dialysis tube. And immersed in the electrophoresis buffer. Eluted (Dc Done 11, M.W., et al., Supra) Extract the solution in the dialysis tube with phenol and ether, then add NaCl to 0.2 M. Subsequently, 2 volumes of cold ethanol were added and the mixture was precipitated at 120.
次に参考例 1 で構築したプラスミ ド P P H O 1 7 ( 1 g ) に 制限酵素 X h o l ( 5 ユニッ ト） を 1 0 1 の反応液 （X h o l 用反応液 前出） 中で 3 7 °C、 1 時間作用させたのち、 フ エ ノ ー ルで除蛋白 し、 冷エタ ノールで沈澱させた該 D N A ( 1 0 n g ) に ヒ ト · リゾチーム遣伝子を含む D N A断片 5 0 n g を混合し前 記方法に したがい D N Aを結合させた。 実施例 3記載の方法に し たがって大腸菌 D H— 1 を形質転換し、 形賓転換体の中から p P H O 1 7 の X h o I 部位に P H 0 5 プロモーターと頗方向にヒ ト · リ ゾチーム遺伝子が揷入されたプラスミ ド p P H 0 1 y s 1 0 1 を得た。  Next, the restriction enzyme Xhol (5 units) was added to the plasmid PPHO17 (1 g) constructed in Reference Example 1 at 37 ° C in a 101 reaction mixture (Xhol reaction mixture). After allowing to act for 1 hour, the protein is deproteinized with phenol, and 50 ng of the DNA fragment containing the human lysozyme gene is mixed with the DNA (10 ng) precipitated with cold ethanol and mixed. DNA was bound according to the procedure described above. Escherichia coli DH-1 was transformed according to the method described in Example 3, and the PH05 promoter and the human lysozyme gene in the very direction were located at the XhoI site of pPHO17 from among the transformants. Into which the introduced plasmid p PH 0 1 ys 101 was obtained.
全く 同様に して P G L D 9 0 6 の X h o I 部位に G L Dプロモー タ ーと頗方向にヒ ト · リ ゾチーム遣伝子が揷入されたプラス ミ ド P G L D 9 0 6 — 5 を得た。  In exactly the same way, a plasmid PGLD906-5 was obtained in which a GLD promoter and a human lysozyme gene were inserted in the XhoI site of PGLD906.
実施例 5 Example 5
酵母形質転換体の調製 ：  Preparation of yeast transformant:
実施例 4 で得た発現プラスミ ド p P H O l y s 1 0 1 および P G L D 9 0 6 — 5 で ci a c c n a r o in y c e s c e r e v i s i a e A H 2 2 R一を H i n n e n らの方法 （前出） で形質 転換させ、 それぞれ形貧転換体 S . c e r e v i s i a e A H Using the expression plasmids pPHOlys101 and PGLD906-6 obtained in Example 4, ci accnaro in ycescerevisiae AH22R-1 was transformed by the method of Hinnen et al. Transformant S. cerevisiae AH
2 2 R— / p P H O l y s l O l , S . c e r e v i s i a e A H 2 2 R—ノ p G L D 9 0 6 — 5 を得た。 なお、 S a c c h a 2 2 R - / p PHO lysl O l, S cerevisiae AH 2 2 R- Roh p GLD 9 0 6 - to give a 5.. S accha
Ο ΡΙΟ ΡΙ
WIPO r o m y c e s c e r e v i s i a e A H 2 2 R— / p P H 〇 1 y s 1 0 1 は財団法人発酵研究所に I F O— 1 0 1 3 9 と し て寄託され、 また昭和 5 9年 1 1 月 1 4 日 から 1 1 に ？ £ 1 ^1 P — 7 9 3 9 と して寄託されている。 また、 S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e A H 2 2 R / p G L D 9 0 6 — 5 は財団法人発酵研究所に I F O — 1 0 1 4 0 と して寄託さ れ、 また昭和 5 9年 1 1 月 1 4 日 から F R I に F E R M P — 7 9 4 0 と して寄託されている。 WIPO romycescerevisiae AH22R— / pPH〇1ys101 has been deposited with the Fermentation Research Institute as IFO—11039, and has been changed from January 14, 1978 to January 11, 1991. ? £ 1 ^ 1 P — deposited as 7 9 3 9 In addition, S accharomycescerevisia e AH22R / pGLD906--5 was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-110, and since January 14, 1979, Deposited with the FRI as FERMP — 7940.
実施例 5 Example 5
B u r k h o l d e r 〔 A m e r . J . B o t . 3 0 ， 2 0 6 ( 1 9 4 3 ) 〕 低リ ン酸培地 2 0 m l を 2 0 0 m l フラスコ に分 注し， これに S . c e r e v i s i a e A H 2 2 R""V p Ρ Η· O l y s l O l を接種し、 3 0 。Cで 4 日間振と う培養した。 この 培養液を遠心分離したのち、 菌体を生塩食塩水で洗浄した。 M i y a n o a r a . A らの方法 L P r o c . a t l . A c a d S c i . U S A 8 0 ， 1 ( 1 9 8 3 ) 〕 に従って Z y m o l y a s e 〔生化学工業 （株） 製〕 によっ て菌体をスフ 口 プラス 卜 化した後、 スフエ ロプラス ト に 0 . 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 を添 加して リ ゾチームを抽出した。 溶菌液を室温で 5 ， 0 0 0 r p m 1 0 分間遠心分離にかけて上清液 （ 2 m l ) を得た。 次に M e y e r の方法 ！： J . B i o l . C h e m . 1 1 3 ， 3 0 3 ( 1 9 3 6 ) 〕 に従い上清を酸性に したのち、 冷却したエタ ノール添加、 熱処理を して再度上清を集め、 これに更にエタ ノールを加えて遠 心し沈澱物を集めた。 沈澱物に 0 . 4 m l の 5 0 πχ Μ リ ン酸カ リ 緩衝液 （ Ρ Η 7 . 4 ) を加えて溶解し、 その 0 . 1 m l を活性定 《^i∑L_ 、 量に供した。 W o r t h i n g t o n E n z y m e M a n u a 1 (W o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l C o r p o r a t i o n 1 9 7 2 P 2 0 9 ) に従い溶菌活性を調 ベたと ころ、 試料添加によ り濁度減少が認め られ、 リ ゾチーム遠 伝子の発現が認め られた。 30., 206 (1943)] Dispense 20 ml of a low-phosphoric acid medium into a 200 ml flask, and add S. cerevisiae AH 2 2 R "" V p Η Η · O lysl O l, inoculate 30. C. The cells were cultured with shaking for 4 days. After centrifuging the culture, the cells were washed with saline. Acad Sci. USA 80, 1 (1983)], and the cells were transformed with Zymolyase (manufactured by Seikagaku Corporation) to make the mouth positive. After isolation, lysozyme was extracted by adding 0.1% Triton X—100 to spheroplasts. The lysate was centrifuged at room temperature at 5,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant (2 ml). Then M eyer's way! : The supernatant was acidified according to J. Biol. Chem. 113, 303 (19336)], cooled ethanol was added, heat treatment was performed, and the supernatant was collected again. Further, ethanol was added thereto, and the mixture was centrifuged to collect a precipitate. To the precipitate was added 0.4 ml of 50 πχ-phosphate phosphate buffer (Ρ7.4) to dissolve the precipitate, and 0.1 ml of the solution was used to determine the activity. Served in quantity. When the lytic activity was measured according to Worthington Enzyme Manua 1 (Worthington Biochemical Corporation 197 2 P209), the turbidity was reduced by the addition of the sample, and the lysozyme gene transfer was observed. Expression was observed.
産業上の利用可能性  Industrial applicability
ヒ ト · リ ゾチームは、 抗炎症、 止血、 組織再生、 抗腫瘍性など の薬理作用を有し、 消炎酵素剤等と して 目薬などに用い られた り、 食品防腐剤等と して用い られ、 しかも医薬的目的で使用 した際に ニ ヮ ト リ卵白由来の リ ゾチームのよ う な免疫応答による副作用を 起こ さないものであるが、 従来、 少量しか得る こ と ができなかつ た。 . . ' ' 本発明のヒ ト · リ ゾチーム合成遺伝子の提供によ り、 上記のよ うな医薬品等と して有用なヒ ト · リ ゾチームを、 大量に供給する こ と が可能となっ たものである。  Human lysozyme has pharmacological actions such as anti-inflammation, hemostasis, tissue regeneration, and antitumor properties, and is used as an anti-inflammatory enzyme in eye drops and as a food preservative. Moreover, when used for medical purposes, it does not cause side effects due to an immune response like lysozyme derived from nit egg white, but conventionally, only a small amount has been obtained. '' By providing the human lysozyme synthesis gene of the present invention, it has become possible to supply a large amount of human lysozyme useful as a pharmaceutical product as described above. It is.

Claims

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Figure imgf000042_0001
DYD VVO iOi 工ェ OOV DDO VVO VOO VXD DYD VVO iOi Processing OOV DDO VVO VOO VXD
Dェ 9 工工 9 VDV OVV iDD DOX ODD ェェ D ェ 39 ェ V£) D ェ 9 9 9 VDV OVV iDD DOX ODD D D 39 39 V V £)
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DVェ SS OVO 3ェ V iOE> Oェェ VOV OVV DiX iDV 工 3ェ 0£>3 XVV ェ LD DOV ェ3ェ DXO VVV VVD OiXDV SS SS OVO 3 V V iOE> VO VOV OVV DiX iDV 3 0 £> 3 XVV LD LD DOV 3 3 DX DXO VVV VVD OiX
VOV OOO VX VVD 3€>ェ OV DVD ェェェ ェ： L£) DVV VOV OOO VX VVD 3 €> OV DVD: L £) DVV
31 v N a * T 31 v Na * T
H ¾ © ^ H H ¾ © ^ H
一 0 卜 Sdr/lDd 脚/ 98 O CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC1 0 Sdr / lDd Leg / 98 O CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC
GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG
GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GATGCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT
CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA
GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTTGTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT
CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA で示される ヒ ト · リ ゾチーム発現のための合成逮伝子を有するCAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA has a synthetic gene for human lysozyme expression
D N A 。D N A.
, 複数個のオ リ ゴデォキシヌ ク レオチ ド を合成および連結 し、 所望によ り ベク タ ーに揷入する こ と を特徵とする、 D N A配列 , A DNA sequence characterized in that a plurality of oligodoxynucleotides are synthesized and linked, and inserted into a vector if desired.
AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGAAAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA
TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT
ACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TACACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TAC
TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG
CGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGTCGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGT
GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA
CTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACTCTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACT
GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA
AGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGTAGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGT
TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA
TCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AACTCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AAC
AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG
O PI O PI
ノ, TCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACTNo People, TCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACT
AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA
CCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCTCCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCT
GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA
TGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCTTGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCT
ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA
GAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTCGAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTC
CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG
CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTCCGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC
GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG
GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GATGCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT
CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA
GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTTGTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT
CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA で示される ヒ ト · リ ゾチーム発現のための合成遣伝子を有する D N Aの製造法。 CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA A method for producing DNA having a synthetic gene for human lysozyme expression as indicated by CAA.
. D N A配列  . D N A array
AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA
TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT
ACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TACACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TAC
TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG VVD VDD VOV VDD XD VVO OJLV ェェ 3 ェ D工 DVD ェェ £3 iOO XOi XOD VVO XXO Vェ VV VDV DiO TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG VVD VDD VOV VDD XD VVO OJLV 3 D D DVD £ 3 iOO XOi XOD VVO XXO V D VV VDV DiO
VXD DJL Vi XXO DOV XDi OXX XOX ODV VOO ェ VOV XVV VVO 3Dェ V V OVV VOV DOi iOO VXD DJL Vi XXO DOV XDi OXX XOX ODV VOO VOV XVV VVO 3D V V OVV VOV DOi iOO
DVD DOV ODD ェ〇ェ VVi VDD D O iOO VOODVD DOV ODD VVi VDD D O iOO VOO
Dェ 3 £)£)ェ D VOV ェェ V JLOO OVO VDD DVD iOO D 3 3 £) £) D D VOV V V JLOO OVO VDD DVD iOO
DVD VVO ェ ェ D i VOO ODV ODD VVO VDD VXDDVD VVO D i VOO ODV ODD VVO VDD VXD
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VOO VVJ. 〇工ェ Sェ D OJLO VVO DVV VDD 工 ODVVOO VVJ. D OJLO VVO DVV VDD D ODV
JLD£D XXV DVV DVD DVD ェ: L 9ェェ ェ S V3i っ£)ェ JLD £ D XXV DVV DVD DVD: L 9 S S V3i
VDV iVV OJLO VDV ODD Dェェ DVD ODD VDDVDV iVV OJLO VDV ODD D e DVD ODD VDD
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VDJL 3ェェ S D VLD £)工工 VDV DOV ViV XDX VOV iDV DVV DOO VO OVV XOJL OOX XVX VOV ェ ェ  VDJL 3 S S D VLD £) Construction VDV DOV ViV XDX VOV iDV DVV DOO VO OVV XOJL OOX XVX VOV
3ェ: L VVi D OVV VVェ V VJLV DXO ェ 3ェ V )V3e: L VVi D OVV VVe V VJLV DXO 3e V) V
OVV XXV VVO D工ェ 丄： LV ∑DD iVi OVO VDV ェ Dェ OVV XXV VVO D 丄: LV ∑DD iVi OVO VDV D
VDD DiD ODD VDD DiJL OJ.V V i 〇£工 ェ ェ ェ 3D DVD ODD ェ； D£ DVV DV 工 VV DOV JLOO VOV VDD DiD ODD VDD DiJL OJ.V V i 〇 工 3 3D DVD ODD D D D DVV DV V VV DOV JLOO VOV
VDX OiX VJLV ODD DDV ェェ: D ODV ェェ VOO VVD ェ V DVV ェ Vェ D 3Dェ VVO D )ェ ェ OS XD VDX OiX VJLV ODD DDV: D ODV VOO VVD V DVV V D D 3D VVO D) OS XD
VOV ェ O V Oェェ 3 VV VDV VVJL VOO VOO ェ ェ £) LV OOX OVV OOO Vェェ ェ; 3工 ェ： LV XOO DO VOV O V O Y 3 VV VDV VVJL VOO VOO Y £) LV OOX OVV OOO V Y 3; LV XOO DO
-ε - 龍/ /Dd 膽 /980A で示される ヒ ト · リ ゾチーム発現のための合成逮伝子を有する D N Aによって形質転換した細胞。 -ε-Dragon // Dd A cell transformed with a DNA having a synthetic gene for human lysozyme expression as shown in.
4 . D N A配列  4. D N A array
AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA
TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT
ACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TACACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TAC
TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG
CGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGTCGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGT
GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA
CTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACTCTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACT
GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG · ATA TTG TGA GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCGATA TTG TGA
AGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGTAGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGT
TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA
TCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AACTCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AAC
AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG
TCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACTTCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACT
AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA
CCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCTCCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCT
GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA
TGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCTTGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCT
ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA 一 OMPI GAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTCACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA One OMPI GAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTC
CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG CTA CGA CAA CGG ACG CGA TTC TCT CAA CAG
CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTCCGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC
GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG
GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GATGCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT
CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA
GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTTGTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT
CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA で示される ヒ ト · リ ゾチーム発現のための合成逮伝子を有する D N Aを細胞に揷入する こ と を包含する こ と を特徴とする、 形 質転換した細胞の製造法。 CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA Transformation characterized by including introducing a DNA having a synthetic gene for expression of human lysozyme into a cell. Method for producing a cell.
. D N A配列  . D N A array
AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA AAG GTT TTT GAG AGA TGC GAA TTA GCC AGA
TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT TTC CAA AAA CTC TCT ACG CTT AAT CGG TCT
ACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TACACT TTG AAG AGA TTG GGT ATG GAC GGC TAC
TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG TGA AAC TTC TCT AAC CCA TAC CTG CCG ATG
CGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGTCGT GGT ATT TCT TTA GCC AAC TGG ATG TGT
GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA GCA CCA TAA AGA AAT CGG TTG ACC TAC ACA
CTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACTCTT GCT AAG TGG GAA TCC GGC TAT AAC ACT
GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA GAA CGA TTC ACC CTT AGG CCG ATA TTG TGA
AGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGTAGA GCT ACC AAT TAC AAC GCT GGC GAC CGT
TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA TCT CGA TGG TTA ATG TTG CGA CCG CTG GCA
W2PO A> ^AT10¾ TCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AACW2PO A > ^ AT10¾ TCT ACA GAC TAT GGT ATT TTC CAA ATT AAC
AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG AGA TGT CTG ATA CCA TAA AAG GTT TAA TTG
TCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACTTCT AGA TAT TGG TGT AAC GAT GGC AAG ACT
AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA AGA TCT ATA ACC ACA TTG CTA CCG TTC TGA
CCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCTCCA GGT GCC GTC AAC GCC TGT CAC TTA TCT
GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA GGT CCA CGG CAG TTG CGG ACA GTG AAT AGA
TGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCTTGC TCA GCT TTG CTT CAG GAC AAC ATT GCT
ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA ACG AGT CGA AAC GAA GTC CTG TTG TAA CGA
GAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTCGAT GCT GTT GCC TGC GCT AAG AGA GTT GTC
CTA CGA CAA CGG ACG CGA' TTC TCT CAA CAG CTA CGA CAA CGG ACG CGA 'TTC TCT CAA CAG
CGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTCCGT GAC CCA CAG GGT ATT AGA GCC TGG GTC
GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG GCA CTG GGT GTC CCA TAA TCT CGG ACC CAG
GCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GATGCT TGG AGA AAC AGA TGC CAA AAT AGA GAT
CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA CGA ACC TCT TTG TCT ACG GTT TTA TCT CTA
GTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTTGTC AGA CAA TAC GTT CAA GGT TGT GGT GTT
CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA で示される ヒ ト · リ ゾチーム発現のための合成遗伝子を有する D N Aによっ て形質転換した細胞を培養し、 培養物よ リ ヒ 卜 · リ ゾチームも採取する こ と を特徴とする ヒ ト · リゾチームの製 造法。 CAG TCT GTT ATG CAA GTT CCA ACA CCA CAA The cells transformed with DNA containing a synthetic gene for human lysozyme expression are expressed, and both the lysozyme and the culture are transformed. A method for producing human lysozyme characterized by sampling.
OMPI _ OMPI _
PCT/JP1984/000546 1984-11-14 1984-11-14 Human lysozyme synthesizing gene WO1986002947A1 (en)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kogyo Gijutsuin Kenkyu Kikan, Dai 20 Kai Kobunshi Kenkyu Seika Happyokai Shiryo "Kobunshi Zairyo to Life Science no Setten" Zaidan Hojin Nippon Sangyo Gijutsu Shinko Kyokai, 31. January. 1985 (31.01.85) Muraki Michio and three others, "Hito.Rizo Team Idenshi no Kagaku Gosei to Daichokin niokeru Hakken" p.52-59 *

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