UA89468C2 - Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin - Google Patents

Abstract

A pharmaceutical composition in dosage unit form adapted for modulation of excitable tissue, enhancement of cognitive function or delivery of compounds across endothelial tight junctions which comprises, per dosage unit, an effective non-toxic amount within the range from about 50,000 to 500,000 Units of EPO, an EPO receptor activity modulator, an EPO-activated receptor modulator, or a combination thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Description

амінокислот ЕРО необхідна для цих нейротрофічних ефектів в нейронних клітинах (Са трапа еї а!., 1998, Іпі. у.EPO amino acids are necessary for these neurotrophic effects in neuronal cells (Sa trapa ei a!., 1998, Ipi. u.

Мої. Меа. 1: 235-41).My. Mea. 1: 235-41).

Протягом багатьох років вважалося, що єдиною чіткою фізіологічною роллю еритропоетину (ЕРО) був контроль за продукуванням червоних кров'яних клітин. Останнім часом з'явилися декілька напрямів доведень, які передбачають, що ЕРО, як член суперсімейства цитокінів, виконує інші важливі фізіологічні функції, які опосередковані через взаємодії з рецепторами еритропоетину (ЕРО-Н). Ці дії включають мітогенез, модуляцію притоку кальцію в клітини гладкої мускулатури і в нервові клітини, і впливають на проміжний метаболізм.For many years, it was believed that the only clear physiological role of erythropoietin (EPO) was to control the production of red blood cells. Recently, several lines of evidence have emerged suggesting that EPO, as a member of the cytokine superfamily, performs other important physiological functions that are mediated through interactions with erythropoietin receptors (EPO-H). These actions include mitogenesis, modulation of calcium influx into smooth muscle cells and nerve cells, and affect intermediary metabolism.

Вважають, що ЕРО забезпечує компенсаторні реакції, які служать для поліпшення гіпоксичного клітинного мікросередовища. Хоча дослідження встановили, що внутрішньочерепні ін'єкції ЕРО захищають нейрони від гіпоксичного нейронального ураження, внутрішньочерепне введення являє собою той спосіб, що не використовується на практиці і неприйнятний спосіб введення для терапевтичного використання, особливо для здорових індивідуумів. Крім того, більш ранні дослідження анемічних пацієнтів, яким вводили ЕРО, привели до висновку, що периферійно введені ЕРО не транспортуються в мозок/(Магії єї а!., 1997, вирга).It is believed that EPO provides compensatory reactions that serve to improve the hypoxic cellular microenvironment. Although studies have shown that intracranial injections of EPO protect neurons against hypoxic neuronal injury, intracranial administration is a deficient and inappropriate route of administration for therapeutic use, especially in healthy individuals. In addition, earlier studies of anemic patients who were injected with EROs led to the conclusion that peripherally injected EROs are not transported to the brain/(Magiyi eyi a!., 1997, vyrga).

Цитування або обговорення посилань, що приводяться тут не потрібно розглядати як визнання того, що вони є відомим рівнем техніки для даного винаходу. 3. Короткий зміст винаходуCitation or discussion of references herein should not be construed as an admission that they are prior art to the present invention. 3. Summary of the invention

Даний винахід стосується композиції і способів модулювання функцій тканини, що збуджується у ссавців, а також способів і композицій для доставляння ліків до тканин, що збуджуються. Даний винахід заснований, зокрема, на відкритті заявників, що полягає в тому, що еритропоетин, (ЕРО), введений системно у високих дозах, специфічно захоплюється мозком. Зокрема, заявники виявили, що ЕРО, введений у високих дозах, може долати гематоенцефалічний бар'єр, причому він може посилити пізнавальну функцію, і захистити нервову тканину від пошкодження внаслідок стресових ситуацій, таких як гіпоксія.The present invention relates to compositions and methods of modulating the functions of excitable tissue in mammals, as well as methods and compositions for delivering drugs to excitable tissues. This invention is based, in particular, on the applicant's discovery that erythropoietin (EPO), administered systemically in high doses, is specifically taken up by the brain. In particular, the applicants found that ERO, administered in high doses, can cross the blood-brain barrier, and it can enhance cognitive function, and protect nerve tissue from damage due to stressful situations such as hypoxia.

Терміни еритропоетин і ЕРО, які тут використовуються взаємозамінно, модулятори активності ЕРО рецепторів і модулятори ЕРО-активованих рецепторів стосуються сполук, які при системному введенні (поза гематоенцефалічним бар'єром) здатні активувати ЕРО-активовані рецептори тканин, що електрично збуджуються для посилення і/або захисту від ураження і загибелі. Так, ЕРО може стосуватися будь-якої форми еритропоетину, яка може модулювати тканини, що збуджуються, а також ЕРО аналогів, фрагментів і імітацій. У переважному варіанті для використання в способах даного винаходу еритропоетин виявляє підвищену специфічність стосовно ЕРО рецепторів мозку. У іншому варіанті еритропоетин є нееритропоетичним. У ще одному варіанті еритропоетин вводять в дозі, яка перевищує дозу, необхідну для максимальної стимуляції еритропоезу.The terms erythropoietin and EPO, used interchangeably herein, modulators of EPO receptor activity, and modulators of EPO-activated receptors refer to compounds that, when administered systemically (beyond the blood-brain barrier), are capable of activating EPO-activated tissue receptors that are electrically excited to enhance and/or protection from injury and death. Thus, EPO can refer to any form of erythropoietin that can modulate excitable tissues, as well as EPO analogues, fragments and imitations. In a preferred variant for use in the methods of this invention, erythropoietin exhibits increased specificity for brain EPO receptors. In another embodiment, the erythropoietin is non-erythropoietic. In yet another variant, erythropoietin is administered in a dose that exceeds the dose necessary for maximal stimulation of erythropoiesis.

У даному винаході запропонована фармацевтична композиція в одиничній дозованій формі, адаптована для модуляції тканини, що збуджується, підвищення пізнавальної функції, або для доставляння сполуки через ендотеліальні щільні сполуки, яка включає для одиничної дози, ефективну нетоксичну кількість в інтервалі від біля 50000 до 500000 одиниць ЕРО, модулятора активності рецептора ЕРО, модулятора ЕРО-активованого рецептора, або їх комбінацій, і фармацевтично прийнятний носій. У одному з варіантів ефективна нетоксична кількість ЕРО у вказаній фармацевтичній композиції складає від 50000 до 500000 одиниць ЕРО. У іншому варіанті ефективна нетоксична кількість ЕРО вказаного фармацевтичного препарату є дозою, ефективною для досягнення циркулюючого рівня ЕРО більше за 10000мОд/мл сироватки. У іншому, варіанті циркулюючий рівень ЕРО досягається приблизно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 годин після введення ЕРО. У іншому варіанті в даному винаході запропонований фармацевтичний набір, що включає ефективну кількість ЕРО для модулювання тканини, що збуджується, посилення пізнавальної функції або доставляння сполук через ендотеліальні щільні сполуки, упаковані в один або більше контейнерів.The present invention provides a pharmaceutical composition in a unit dosage form adapted to modulate excitable tissue, enhance cognitive function, or to deliver a compound via endothelial tight junctions, which comprises, for a unit dose, an effective non-toxic amount in the range of about 50,000 to 500,000 EPO units , a modulator of EPO receptor activity, a modulator of EPO-activated receptor, or combinations thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. In one of the options, the effective non-toxic amount of EPO in the indicated pharmaceutical composition is from 50,000 to 500,000 units of EPO. In another embodiment, an effective non-toxic amount of EPO of the indicated pharmaceutical preparation is a dose effective to achieve a circulating level of EPO greater than 10,000 mU/ml of serum. In another embodiment, the circulating level of EPO is reached approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 hours after administration of EPO. In another embodiment, the present invention provides a pharmaceutical kit comprising an effective amount of EPO for modulating excitable tissue, enhancing cognitive function, or delivering compounds via endothelial tight junctions packaged in one or more containers.

У даному винаході запропонований спосіб модулювання функцій тканини, що збуджується у ссавців, який включає периферійне введення вказаному ссавцеві ефективної кількості еритропоетину. Тканина, що збуджується може бути нормальною, тканиною або тканиною, яка має патологію, хворою тканиною. У одному з варіантів тканина, що збуджується є нейрональною тканиною центральної нервової системи. У інших варіантах тканину, що збуджується - вибирають з групи, що складається з нейрональної тканини периферійної нервової системи і тканини серця.The present invention proposes a method of modulating the functions of excitable tissue in mammals, which includes peripheral administration of an effective amount of erythropoietin to the indicated mammal. The tissue that is excited can be normal tissue or tissue that has a pathology, diseased tissue. In one of the options, the excited tissue is the neuronal tissue of the central nervous system. In other variants, the excitable tissue is selected from the group consisting of neuronal tissue of the peripheral nervous system and heart tissue.

У одному з варіантів запропонований спосіб посилення функцій тканини, що збуджується у ссавців, зокрема як нормальної, так і ненормальної тканини, що збуджується, шляхом периферійного введення ефективної кількості ЕРО або модулятора активності рецептора ЕРО. Посилення функцій тканини, що збуджується приводить до поліпшення, наприклад, навчання, асоціативного навчання, або пам'яті. Нелімітуючі приклади станів, які можна лікувати відповідно до цього аспекту даного винаходу, включають розлади настрою, неспокій, депресію, аутизм, дефіцит уваги, гіперактивність, хворобу Альцгеймера, старіння і порушення пізнавальної функції.In one of the options, a method of enhancing the functions of excitable tissue in mammals, in particular both normal and abnormal excitable tissue, is proposed by peripheral administration of an effective amount of EPO or a modulator of EPO receptor activity. Strengthening the functions of the tissue that is excited leads to an improvement, for example, in learning, associative learning, or memory. Non-limiting examples of conditions that may be treated in accordance with this aspect of the present invention include mood disorders, anxiety, depression, autism, attention deficit hyperactivity disorder, Alzheimer's disease, aging, and cognitive impairment.

У іншому варіанті модуляція тканини, що збуджується забезпечує захист від патології, яка виникає внаслідок ураження тканини, що збуджується, наприклад, нейронів центральної нервової системи, периферійної нервової системи, або тканин серця. Така патологія може виникнути внаслідок уражень, включаючи (але ними не обмежуючись) гіпоксію, епілептичний напад, нейродегенеративні захворювання, отруєння нейротоксинами, розсіяний склероз, зупинку серця, радіацію або гіпоглікемію. У одному з варіантів патологія є результатом гіпоксії і може бути викликана пренатальною або постнатальною недостатністю кисню, удушенням, удушенням, майже утопленням, постопераційним розладом пізнавальної функції, отруєнням окисом вуглецю, вдиханням диму, хронічним обструктивним легеневим захворюванням, емфіземою, синдромом респіраторного дистресу у дорослих, гіпертонічним шоком, септичним шоком, інсуліновим шоком, анафілактичним шоком, гострою симптоматикою у хворих серпасто-клітинною анемією, зупинкою серця, аритмією або наркозом азотом. У тих випадках, коли патологією є напад, вона може бути (як нелімітуючий приклад) епілепсією, конвульсіями або хронічною епілепсією. У тому випадку, коли патологією є нейродегенеративне захворювання, вона може бути, наприклад, ударом, хворобою Альцгеймера, хворобоюIn another embodiment, modulation of excitable tissue provides protection against pathology resulting from damage to excitable tissue, such as neurons of the central nervous system, peripheral nervous system, or heart tissue. Such pathology may result from lesions including (but not limited to) hypoxia, epileptic seizure, neurodegenerative diseases, neurotoxin poisoning, multiple sclerosis, cardiac arrest, radiation, or hypoglycemia. In one of the options, the pathology is the result of hypoxia and can be caused by prenatal or postnatal oxygen deficiency, suffocation, suffocation, near-drowning, postoperative cognitive impairment, carbon monoxide poisoning, smoke inhalation, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, respiratory distress syndrome in adults, hypertensive shock, septic shock, insulin shock, anaphylactic shock, acute symptoms in patients with sickle cell anemia, cardiac arrest, arrhythmia or nitrogen anesthesia. In those cases where the pathology is a seizure, it may be (by way of non-limiting example) epilepsy, convulsions or chronic epilepsy. In the case when the pathology is a neurodegenerative disease, it can be, for example, a stroke, Alzheimer's disease,

Паркінсона, церебральним паралічем, травмою головного мозку або спинного мозку, АІО5 деменцією, віковою втратою пізнавальної функції, втратою пам'яті, бічним аміотрофічним склерозом, епілептичним нападом, алкоголізмом, ішемією сітчатки ока, старінням, глаукомою або загибеллю нервів. У іншому варіанті введенняParkinson's disease, cerebral palsy, brain or spinal cord injury, AIO5 dementia, age-related loss of cognitive function, memory loss, amyotrophic lateral sclerosis, epileptic seizure, alcoholism, retinal ischemia, aging, glaucoma or nerve damage. In another version of the introduction

ЕРО можна використати для запобігання ураженню або пошкодженню тканин під час хірургічного втручання, як наприклад, при видаленні пухлини або операції аневризми.ERO can be used to prevent tissue injury or damage during surgery, such as tumor removal or aneurysm surgery.

У ще одному варіанті запропоновані способи для полегшення трансцитозу молекул через бар'єр ендотеліальних клітин у ссавців шляхом введення композиції молекул в асоціації з еритропоетином. Асоціація між молекулою, яка підлягає транспорту і ЕРО може бути, наприклад, лабільним ковалентним зв'язком, стабільним ковалентним зв'язком, або нековалентною асоціацією з сайтом зв'язування для даної молекули. У одному варіанті ендотеліальними клітинними бар'єрами можуть бути гематоенцефалічний бар'єр, гематоофтальмічний бар'єр, бар'єр між кровоносною системою і сім'яниками, бар'єр між кровоносною системою і яєчниками або плацентарний бар'єр.In another variant, methods are proposed to facilitate the transcytosis of molecules through the barrier of endothelial cells in mammals by introducing a composition of molecules in association with erythropoietin. The association between the molecule to be transported and the EPO can be, for example, a labile covalent bond, a stable covalent bond, or a non-covalent association with the binding site for this molecule. In one embodiment, the endothelial cell barriers can be the blood-brain barrier, the blood-ophthalmic barrier, the barrier between the circulatory system and the testes, the barrier between the circulatory system and the ovaries, or the placental barrier.

Далі в даному винаході запропонована композиція для транспортування молекул за рахунок трансцитозу через ендотеліальний клітинний бар'єр, що включає вказану молекулу в асоціації з ЕРО, модулятором активності рецептора ЕРО, або модулятором ЕРО-активованого рецептора. У одному з варіантів ЕРО є еритропоетином, аналогом еритропоетину, імітатором еритропоетину і фрагментом еритропоетину, гібридною молекулою еритропоетину, молекулою, зв'язуючою рецептор еритропоетину, агоністом еритропоетину, ниркоподібним еритропоетином, еритропоетином мозку, їх олігомерами, їх полімерами, їх мутантами, представниками того ж роду, їх природною формою, їх рекомбінантною формою, або їх комбінаціями У іншому варіанті молекулою вказаної композиції є гормон, нейротрофічний фактор, протимікробний агент, радіофармацевтичний агент, антисмислова сполука, антитіло, імуносупресор, токсин або протираковий агент.Further, the present invention proposes a composition for the transport of molecules due to transcytosis through the endothelial cell barrier, which includes the specified molecule in association with EPO, a modulator of the activity of the EPO receptor, or a modulator of the EPO-activated receptor. In one variant, EPO is erythropoietin, erythropoietin analogue, erythropoietin mimic and erythropoietin fragment, erythropoietin hybrid molecule, erythropoietin receptor binding molecule, erythropoietin agonist, renal erythropoietin, brain erythropoietin, their oligomers, their polymers, their mutants, representatives of the same genus, their natural form, their recombinant form, or their combinations. In another variant, the molecule of the specified composition is a hormone, a neurotrophic factor, an antimicrobial agent, a radiopharmaceutical agent, an antisense compound, an antibody, an immunosuppressant, a toxin, or an anticancer agent.

Відповідні молекули для транспорту за способом даного винаходу включають (але ними не обмежуються) гормони, такі як гормон росту, антибіотики, протиракові агенти і токсини.Suitable molecules for transport by the method of this invention include (but are not limited to) hormones such as growth hormone, antibiotics, anticancer agents and toxins.

Ці ії інші аспекти даного винаходу будуть більш зрозумілі з посиланням на наступні малюнки і докладний опис. 4. Короткий опис малюнківThese and other aspects of the present invention will be better understood with reference to the following drawings and detailed description. 4. Brief description of the drawings

Фіг.1А-В. Тест водного лабіринту Морріса А. Результати тесту водного лабіринту Морріса, проведеного на мишах, яким периферійно вводили щодня або ЕРО, або фізіологічний розчин (ЗНАМ). В. Тварини, яким вводили ЕРО, діяли значно краще за тих, яким вводили З5НАМ. Лінія регресії (82-0,88) показує нахил (0,68), що значно відрізняється від нахилу 1, явно на користь ЕРО групи.Fig. 1A-B. Morris water maze test A. Results of the Morris water maze test performed on mice that were peripherally injected daily with either EPO or saline. B. Animals injected with EPO performed significantly better than those injected with Z5NAM. The regression line (82-0.88) shows a slope (0.68), which is significantly different from slope 1, clearly in favor of the ERO group.

Фіг2А-С. Стандартний тест смакової огиди А. Порівняння периферійного введення З5НАМ і ЕРО стосовно споживання води мишами, яких тестують відповідно зі стандартним тестом смакової огиди. Споживання води виражають як процент від об'єму, споживаного контрольною групою мишей, у яких не спричиняли хворобливого стану введенням хлориду літію. В ії С ілюструють значне підвищення навчання за рахунок введення ЕРО, оскільки тварини, яким вводили ЕРО, зазнали набагато більшої спраги, ніж контрольні тварини, уникаючи води, що містить добавку, яка викликає хворобливий стан, хоча проводили більше часу в пошуках води.Fig. 2A-C. Standard taste aversion test A. Comparison of peripheral administration of Z5NAM and ERO in relation to water consumption in mice tested according to a standard taste aversion test. Water consumption is expressed as a percentage of the volume consumed by a control group of mice in which the disease state was not induced by the introduction of lithium chloride. Figure C illustrates a significant enhancement of learning by EPO administration, as EPO-treated animals were significantly more thirsty than controls when avoiding water containing the pain-inducing additive, even though they spent more time searching for water.

Фіг.ЗзА-С. Результати експерименту, який демонструє, що попереднє периферійне введення ЕРО зменшує тяжкість епілептичного нападу, і захищає мишей від конвульсій і загибелі під дією нейротоксину каїнату.Fig. ZZA-C. Results of an experiment demonstrating that pre-peripheral administration of EPO reduces the severity of epileptic seizures and protects mice from convulsions and death under the influence of the neurotoxin kainate.

Цифри в дужках під кожною колонкою вказують число тварин, кожному з яких вводили дозу каїнату. В показує, що захисний ефект периферійно введеного ЕРО зростає при щоденному введенні ЕРО. С ілюструє затримку початку дії ЕРО, що є характеристикою програми індукування генної експресії. фіг4А-В зображають захисний ефект ПТЕРО проти ішемічного ураження мозку (фокальний удар). А.The numbers in parentheses under each column indicate the number of animals each dosed with kainate. B shows that the protective effect of peripherally administered ERO increases with daily administration of ERO. C illustrates the delay in the onset of action of EPO, which is a characteristic of the gene expression induction program. Fig. 4A-B depict the protective effect of PTERO against ischemic brain damage (focal stroke). AND.

Системне введення ЕРО в різні моменти часу після індукування ішемії мозку зменшує розміри інфаркту. В.Systemic administration of ERO at different time points after inducing cerebral ischemia reduces the size of the infarct. IN.

Порівняння двох форм ЕРО в захисті мозку від ураження в цій моделі; рекомбінантний людський ЕРО (ПЕРО) і похідне ЕРО, що містить 17 амінокислот (17-мер) ілюструє, що деякі ЕРО аналоги виявляються не ефективними для нейрозахисту.Comparison of two forms of ERO in protecting the brain from damage in this model; recombinant human EPO (PERO) and an EPO derivative containing 17 amino acids (17-mer) illustrates that some EPO analogues are not effective for neuroprotection.

Ффіг.5 представляє захисну дію "ПЕРО проти тупої травми, нанесеної на кору головного мозку.Figure 5 shows the protective action of the FEATHER against blunt trauma to the cerebral cortex.

ФігбА-В представляє захисну дію ЕРО від ішемічного ураження серця. А. Активність креатинкінази (СК) є індикатором пошкодження клітин міокарда. В. Активність мієлопероксидази (МРО) є мірою запалення.FigbA-B represents the protective effect of ERO against ischemic damage to the heart. A. The activity of creatine kinase (CK) is an indicator of myocardial cell damage. B. Myeloperoxidase activity (MPO) is a measure of inflammation.

Фіг.7 демонструє, що оброблення мишей ЕРО сповільнює і зменшує нейрологічні симптоми, супутні експериментально викликаному алергічному енцефаліту в моделі розсіяного склерозу.Figure 7 demonstrates that treatment of mice with ERO slows down and reduces neurological symptoms associated with experimentally induced allergic encephalitis in a model of multiple sclerosis.

Фіг.8А-В А. Мінімальна ефективна доза ЕРО для забезпечення нейрозахисту в моделі фокального удару в експерименті на пацюках. В. Рівні ЕРО в сироватці в різні моменти часу після внутрішньоочеревинного введення 5000 одиниць ПЕРО самицям мишей штаму Ваїр/с.Fig. 8A-B A. The minimum effective dose of EPO to provide neuroprotection in the focal stroke model in an experiment on rats. B. Serum ERO levels at different time points after intraperitoneal administration of 5000 units of PERO to female mice of the Vair/s strain.

Ффіг.9А-С А. Імунолокалізація ЕРО-В на капілярах і навколо них. В. Біотинілований ЕРО, введений мишам внутрішньоочеревино, виявляється через 5 годин в мозку, в безпосередньому оточенні капілярів. С. Через 17 годин мітки біотину можна виявити всередині специфічних нейронів. 5. Докладний опис винаходуFig. 9A-C A. Immunolocalization of ERO-B on capillaries and around them. B. Biotinylated EPO, injected into mice intraperitoneally, is detected after 5 hours in the brain, in the immediate vicinity of capillaries. C. After 17 hours, biotin labels can be detected inside specific neurons. 5. Detailed description of the invention

У даному винаході запропоновані композиції і способи для використання еритропоетину (ЕРО) для модуляції функцій тканин, що збуджуються, таких, як наприклад, посилення пізнавальних функцій і захист клітин, що збуджуються від впливу токсинів. Зокрема, в даному винаході запропоновані композиції, що включають ЕРО, а також способи їх використання для профілактики і лікування, включаючи доставляння ліків.The present invention provides compositions and methods for using erythropoietin (EPO) to modulate the functions of excitable tissues, such as, for example, enhancing cognitive functions and protecting excitable cells from exposure to toxins. In particular, this invention proposes compositions that include EPO, as well as methods of their use for prevention and treatment, including drug delivery.

У тому значенні, як тут використаний термін тканина, що збуджується, він включає (але цим не обмежується) нейрональні тканини центральної і периферійної нервових систем, і тканини серця.As used herein, the term excitable tissue includes (but is not limited to) neuronal tissue of the central and peripheral nervous systems, and heart tissue.

У розкритому тут винаході запропоновані способи модулювання функцій тканини, що збуджується шляхом периферійного введення ЕРО, або молекул, що активують рецептор ЕРО, або молекул, що демонструють активність ЕРО-активованого рецептора, а також молекул, що імітують активність ЕРО, впливаючи через інші, не класичні ЕРО рецептори. Не будучи зв'язаними з будь-яким конкретним механізмом дії, такі молекули можуть посилати сигнал через ЕРО рецептор, наприклад, ініціювати сигнальний каскад трансдукції, зрештою активуючи програму генної експресії що приводить до захисту або посилення функцій тканини, що збуджується. Молекули, здатні взаємодіяти з ЕРО рецепторами і модулювати активність рецептора, що тут іменуються як ЕРО або модулятори активності рецепторів ЕРО, корисні в контексті даного винаходу для захисту або посилення функцій тканин, що збуджуються. Ці молекули можуть бути, наприклад, природними, синтетичними або рекомбінантними формами ЕРО молекул, розкритими вище, або іншими молекулами, які можуть зовсім не обов'язково нагадувати ЕРО будь-яким чином, за винятком того, що вони модулюють активність ЕРО рецепторів, як тут розкрито. Ці молекули можна використати в комбінації для різних, розкритих тут цілей.In the invention disclosed here, methods of modulating the functions of tissue excited by peripheral introduction of EPO, or molecules that activate the EPO receptor, or molecules that demonstrate the activity of the EPO-activated receptor, as well as molecules that mimic the activity of EPO, influencing through other, non- classic EPO receptors. Without being linked to any specific mechanism of action, such molecules can send a signal through the EPO receptor, for example, initiate a signal transduction cascade, ultimately activating a gene expression program that leads to the protection or enhancement of the functions of the tissue being excited. Molecules capable of interacting with EPO receptors and modulating receptor activity, referred to herein as EPO or modulators of EPO receptor activity, are useful in the context of this invention to protect or enhance excitable tissue functions. These molecules may be, for example, natural, synthetic, or recombinant forms of the EPO molecules disclosed above, or other molecules that may not necessarily resemble EPO in any way, except that they modulate the activity of EPO receptors, as herein revealed These molecules can be used in combination for the various purposes disclosed herein.

Розкриті тут композиції і способи можна використати для лікування і/або захисту як нормальних, так і тканин, що мають патологію, наприклад, нейронів центральної нервової системи, нейронів периферійної нервової системи, або тканин серця. Зокрема в розділі 5.1 далі розкриті способи використання таких ЕРО композицій, придатних для використання в практиці даного винаходу. У розділі 5.2.1 розкриті способи використання таких ЕРО композицій для посилення функцій тканин, що збуджуються, таких як навчання, пам'ять і інших аспектів пізнавальної функції, і в розділі 5.2.2 розкриті способи захисту тканин, що збуджуються від пошкоджень і травм. У розділі 5.2.3 далі розкрите виявлення того факту, що несподівана здатність ЕРО долати щільні сполуки капілярних ендотеліальних клітин забезпечує способи доставляння сполук через такі бар'єри. І нарешті, в розділі 5.3 описані стани, яких може стосуватися використання способів даного винаходу, і в розділі 5.4 розкриті способи введення і ефективні дози таких ЕРО композицій. 5.1. Композиції, що включають еритропоетинThe compositions and methods disclosed herein can be used to treat and/or protect both normal and pathological tissues, for example, neurons of the central nervous system, neurons of the peripheral nervous system, or heart tissue. In particular, in section 5.1, methods of using such EPO compositions, suitable for use in the practice of this invention, are further disclosed. Section 5.2.1 discloses ways to use such EPO compositions to enhance excitable tissue functions, such as learning, memory, and other aspects of cognitive function, and Section 5.2.2 discloses ways to protect excitable tissues from damage and injury. Section 5.2.3 further discloses the discovery that the unexpected ability of EPO to cross the tight junctions of capillary endothelial cells provides ways to deliver compounds across such barriers. And finally, section 5.3 describes the conditions that may apply to the use of the methods of this invention, and section 5.4 discloses methods of administration and effective doses of such EPO compositions. 5.1. Compositions that include erythropoietin

ЕРО композиції, придатні для використання в способі даного винаходу, включають будь-які сполуки еритропоетину, які при периферійному введенні здатні активувати модуляцію ЕРО-активованих рецепторів, тобто посилювати функцію тканин, що збуджуються, або захищати їх від пошкоджень і травм, або доставляти сполуки до тканин, що збуджуються. Еритропоетин є глікопротеїновим гормоном, який у людини має молекулярну масу від 34 до З8КО. Зрілий протеїн містить 166 амінокислот, і глікозильний залишок складає біля 4095 маси молекули. Форми ЕРО, придатні для використання в практиці даного винаходу включають природні, синтетичні і рекомбінантні форми наступних молекул: еритропоетину, аналогів еритропоетину, міметиків еритропоетину, фрагментів еритропоетину, гібридних молекул еритропоетину, молекул, зв'язуючих рецептори еритропоетину, агоністів еритропоетину, ниркоподібний еритропоетин, еритропоетин мозку, їх олігомери і полімери, їх мутанти і представники його роду. Терміни "еритропоетин" і "ЕРО" можна використати взаємозамінно або спільно.EPO compositions suitable for use in the method of the present invention include any erythropoietin compounds that, when administered peripherally, are capable of activating the modulation of EPO-activated receptors, i.e. enhancing the function of excitable tissues, or protecting them from damage and injury, or delivering the compounds to excitable tissues. Erythropoietin is a glycoprotein hormone, which in humans has a molecular weight from 34 to 38KO. The mature protein contains 166 amino acids, and the glycosyl residue is about 4095 molecular weight. EPO forms suitable for use in the practice of this invention include natural, synthetic, and recombinant forms of the following molecules: erythropoietin, erythropoietin analogs, erythropoietin mimetics, erythropoietin fragments, erythropoietin hybrid molecules, erythropoietin receptor-binding molecules, erythropoietin agonists, renal erythropoietin, erythropoietin brain, their oligomers and polymers, their mutants and representatives of its genus. The terms "erythropoietin" and "EPO" can be used interchangeably or together.

У даному винаході запропоновані синтетичні і рекомбінантні молекули, такі як ЕРО мозку і ниркоподібнийThe present invention proposes synthetic and recombinant molecules such as brain EPO and renal

ЕРО, рекомбінантні форми ЕРО ссавців, а також їх природні, одержані з пухлин і рекомбінантні ізоформи, такі як рекомбінантно-експресовані молекули і молекули, одержані внаслідок гомологічних рекомбінацій. Крім того, даний винахід включає молекули, включаючи пептиди, які зв'язують ЕРО рецептори, а також рекомбінантні конструкції або інші молекули, які мають частину або всі структурні і/або біологічні властивості ЕРО, включаючи фрагменти і полімери ЕРО або їх фрагменти. Тут ЕРО охоплює молекули із зміненою активністю скріплення з ЕРО рецепторами, переважно з підвищеною спорідненістю до рецептора, особливо якщо вони підходять для посилення транспорту через бар'єри ендотеліальних клітин. Включені сюди і мутанти, що включають молекули, які мають додаткове або зменшене число сайтів глікозилування. Як було указано вище, терміни "еритропоетин", "ЕРО" і "міметик", а також інші терміни використовуються тут взаємозамінно для позначення молекул, які захищають або які посилюють тканини, що збуджуються, які здатні долати ендотеліальні щільні сполуки, і як такі, корисні для використання як засіб доставляння інших молекул. Крім того, в об'єм винаходу входять також молекули, продуковані трансгенними тваринами Потрібно зазначити, що молекули ЕРО, як включені сюди, зовсім не обов'язково нагадують ЕРО за будовою або будь-яким іншим чином, за винятком здатності взаємодіяти з ЕРО рецептором або модулювати активність ЕРО рецепторів, або активувати ЕРО-активовані сигнальні каскади, як тут розкрито.EPO, recombinant forms of mammalian EPO, as well as their natural, tumor-derived and recombinant isoforms, such as recombinantly expressed molecules and molecules obtained as a result of homologous recombination. In addition, the present invention includes molecules, including peptides, that bind EPO receptors, as well as recombinant designs or other molecules that have part or all of the structural and/or biological properties of EPO, including fragments and polymers of EPO or their fragments. Here, EPO includes molecules with altered binding activity to EPO receptors, preferably with increased affinity for the receptor, especially if they are suitable for enhancing transport across endothelial cell barriers. Included here are mutants that include molecules that have an additional or reduced number of glycosylation sites. As indicated above, the terms "erythropoietin," "EPO," and "mimetic," as well as other terms, are used interchangeably herein to refer to molecules that protect or enhance excitable tissues that are able to cross endothelial tight junctions, and as such, useful for use as a delivery vehicle for other molecules. In addition, the scope of the invention also includes molecules produced by transgenic animals. It should be noted that EPO molecules, as included herein, do not necessarily resemble EPO in structure or in any other way, except for the ability to interact with the EPO receptor or modulate the activity of EPO receptors, or activate EPO-activated signaling cascades, as disclosed herein.

Як не лімітуючий приклад форми ЕРО, придатні для цілей даного винаходу, включають ЕРО мутанти, такі як,ті, у яких змінені амінокислоти за карбоксильним кінцем, і які розкриті в патенті США 5457089 і в патентіAs a non-limiting example, forms of EPO suitable for the purposes of this invention include EPO mutants, such as those in which the amino acids at the carboxyl terminus are changed, and which are disclosed in U.S. Pat. 5,457,089 and in U.S. Pat.

США 4835260; ЕРО ізоформи з різним числом залишків сіалової кислоти в молекулі, такі як ті, які розкриті в патенті США 5856292; поліпептиди, розкриті в патенті США 4703008; агоністи, розкриті в патенті США 5767078; пептиди, які зв'язуються з ЕРО рецептором, як розкрито в патентах США 5773569 і 5830851; міметики, що мають невеликі молекули, які активують ЕРО рецептор, як розкрито в патенті США 5835382; іUSA 4835260; EPO isoforms with different numbers of sialic acid residues in the molecule, such as those disclosed in US Pat. No. 5,856,292; polypeptides disclosed in US Patent 4,703,008; agonists disclosed in US Patent 5,767,078; peptides that bind to the EPO receptor, as disclosed in US patents 5,773,569 and 5,830,851; mimetics having small molecules that activate the EPO receptor, as disclosed in US Patent 5,835,382; and

ЕРО аналоги, розкриті в УУО 9505465, УУО 9718318 і УУО 9818926. Всі вищезгадані матеріали включені сюди за посиланням, до такої міри, до якої ці розкриття стосуються різних альтернативних форм або способів одержання таких форм еритропоетинів даного винаходу.ERO analogs disclosed in UUO 9505465, UUO 9718318 and UUO 9818926. All of the foregoing materials are incorporated herein by reference to the extent that these disclosures relate to various alternative forms or methods of preparation of such forms of the erythropoietins of this invention.

ЕРО можна одержати комерційним шляхом (під торговою маркою РАВОСВІТ вони доступні від ОгоERO can be obtained commercially (under the brand name RAVOSVIT they are available from Ogo

Віогесн, і під торговою маркою ЕРОСЕМ вони доступні від Атдеп, Іпс., Тпоизапа Оакв, СА).Viogesn, and under the trademark EROSEM they are available from Atdep, Ips., Tpoizapa Oakv, SA).

У наступному варіанті даного винаходу включені сюди ЕРО молекули включають гібридні ЕРО молекули, які можна одержати, і які мають активність модулювання рецепторів ЕРО, а також іншу активність, наприклад, активність гормону росту. Такі гібридні молекули з безліччю доменів мають здатність взаємодіяти з ЕРО рецептором, а також мають активність інших молекул, таких як гормони. Способи одержання таких молекул з двома доменами відомі фахівцям. Як буде більш детально розкрито в розділі 5.2.3 далі, однією особливістю таких молекул є транспорт через бар'єри ендотеліальних клітин, що забезпечується доменом, який модулює активність ЕРО рецептора, і активністю інших молекул за потрібним сайтом.In a further embodiment of the present invention, EPO molecules included here include hybrid EPO molecules that can be obtained and which have EPO receptor modulating activity as well as other activity, for example, growth hormone activity. Such hybrid molecules with many domains have the ability to interact with the EPO receptor and also have the activity of other molecules, such as hormones. Methods of obtaining such molecules with two domains are known to specialists. As will be revealed in more detail in section 5.2.3 below, one feature of such molecules is transport through the barriers of endothelial cells, which is provided by the domain that modulates the activity of the EPO receptor and the activity of other molecules at the required site.

Будь-які з розкритих вище сполук можна тестувати для ідентифікації ЕРО сполук, здатних модулювати тканини, що збуджуються, тобто посилювати функції, захищати від ураження і травми, або доставляти до них сполуки, використовуючи розкриті тут аналізи. Наприклад, ЕРО сполуки можна тестувати за їх здатністю посилювати функції тканини, що збуджується, такі як навчання, пам'ять і інші аспекти пізнавальної функції, використовуючи способи, розкриті в розділі 5.2.1. Приклади іп мімо аналізів пізнавальної функції включають тест "водяний лабіринт" Морріса, приклад якого приведений в розділі 6, і стандартний тест смакової огиди, приклад якої детально розкритий в розділі 7. Крім того, описані вище ЕРО сполуки можна тестувати,Any of the compounds disclosed above can be tested to identify EPO compounds capable of modulating excitable tissues, ie enhancing function, protecting against damage and injury, or delivering compounds to them using the assays disclosed herein. For example, EPO compounds can be tested for their ability to enhance excitable tissue functions, such as learning, memory, and other aspects of cognitive function, using methods disclosed in section 5.2.1. Examples of ip mimo tests of cognitive function include the Morris water maze test, an example of which is given in Chapter 6, and the standard taste aversion test, an example of which is discussed in detail in Chapter 7. In addition, the EPO compounds described above can be tested,

використовуючи аналізи, розкриті в розділі 5.2.2, для ідентифікації ЕРО сполук, здатних захищати тканини, що збуджуються від пошкоджень і травм. Приклади, розкриті в розділах 8, 9, 10, 11 і 12, представляють конкретні приклади таких аналізів. ЕРО сполуки можна також аналізувати за їх здатністю доставляти сполуки через епітеліальні щільні сполуки, такі як гемато-енцефалічний бар'єр, використовуючи аналізи, такі як ті, які розкриті в розділі 5.2.3 і в розділі 9, далі. Таким чином, ЕРО сполуки, придатні для використання в даному винаході, включають кожну і всі сполуки, які при периферійному введенні здатні посилати сигнал через ЕРО- активовані рецептори для модулювання тканини, що збуджується, тобто посилити функцію цієї тканини, захистити її від пошкодження або травми, або доставити до неї сполуки. 5.2. Способи профілактичного і терапевтичного використання даного винаходуusing the assays disclosed in section 5.2.2 to identify EPO compounds capable of protecting excitable tissues from damage and injury. The examples disclosed in Chapters 8, 9, 10, 11, and 12 present specific examples of such analyses. EPO compounds can also be assayed for their ability to deliver compounds across epithelial tight junctions, such as the blood-brain barrier, using assays such as those disclosed in Section 5.2.3 and Section 9, below. Thus, EPO compounds suitable for use in the present invention include any and all compounds that, when administered peripherally, are capable of signaling through EPO-activated receptors to modulate excitable tissue, i.e., enhance the function of that tissue, protect it from damage or injury , or deliver connections to it. 5.2. Methods of prophylactic and therapeutic use of this invention

У різних варіантах даного винаходу ЕРО композиції можна використати для захисту тканини, що збуджується від пошкоджень і травм або гіпоксичного стресу, посилення функцій тканини, що збуджується, або для доставляння сполук через ендотеліальні щільні сполуки тканини, що збуджується. Як було розкрито вище, даний винахід заснований, зокрема, на виявленні того факту, що ЕРО молекули можна транспортувати з люмінальної поверхні на поверхню основ мембран ендотеліальних клітин капілярів органів з щільними сполуками ендотеліальних клітин, наприклад, мозку, сітчастої оболонки і яєчок Хоча і не бажаючи бути обмеженими будь-якою конкретною теорією, передбачають, що після трансцитозу ЕРО, ЕРО можуть взаємодіяти з ЕРО рецепторами тканини, що збуджується, такими, наприклад, як нейрони центральної нервової системи, периферійної нервової системи, тканин серця, і зв'язування з рецептором може ініціювати каскад сигнальної трансдукції, що приводить до активації програми генної експресії всередині тканини, що збуджується, забезпечуючи захист клітин від уражень, таких як ураження від нейротоксинів, в результаті гіпоксії і т.п. Способи захисту тканини, що збуджується від уражень або гіпоксичного стресу, посилення функцій тканини, що збуджується, і способи доставляння сполук через щільні сполуки тканини, що збуджується, розкриті далі більш детально. 5.2.1. Способи посилення функцій тканини, що збуджуєтьсяIn various embodiments of the present invention, the EPO compositions can be used to protect excitable tissue from damage and injury or hypoxic stress, enhance excitable tissue functions, or deliver compounds across endothelial tight junctions of excitable tissue. As disclosed above, the present invention is based, in particular, on the discovery that EPO molecules can be transported from the luminal surface to the surface of the basement membranes of endothelial cells of capillaries of organs with tight junctions of endothelial cells, for example, the brain, retina and testes. to be limited by any particular theory, postulate that after EPO transcytosis, EPO may interact with EPO receptors of an excitable tissue, such as neurons of the central nervous system, peripheral nervous system, heart tissue, and binding to the receptor may to initiate a cascade of signal transduction leading to the activation of the gene expression program within the excitable tissue, providing protection of cells from lesions, such as neurotoxin lesions, as a result of hypoxia, etc. Methods of protecting excitable tissue from injury or hypoxic stress, enhancing excitable tissue functions, and methods of delivering compounds through the tight junctions of excitable tissue are disclosed in more detail below. 5.2.1. Methods of strengthening the functions of the excited tissue

У одному аспекті даний винахід стосується способу посилення функцій тканини, що збуджується внаслідок введення ЕРО молекул, здатних активувати програму генної експресії яка посилює функції тканини, що збуджується. Посилення функцій тканини, що збуджується забезпечує поліпшення навчання, асоціативного навчання і пам'яті. Різні захворювання і стани піддаються лікуванню цим способом, і крім того, цей спосіб корисний для посилення пізнавальної функції при відсутності будь-яких хвороб, або хворобливих станів.In one aspect, the present invention relates to a method of enhancing the functions of excitable tissue due to the introduction of EPO molecules capable of activating a gene expression program that enhances the functions of excitable tissue. Strengthening the functions of the excitable tissue improves learning, associative learning and memory. Various diseases and conditions can be treated in this way, and in addition, this method is useful for enhancing cognitive function in the absence of any diseases or painful conditions.

Способи використання даного винаходу розкриті далі більш детально і включають поліпшення навчання і тренування як у людей, так і у інших ссавців.Methods of using the present invention are disclosed in more detail below and include improving learning and training in both humans and other mammals.

Стани і захворювання, які можна лікувати способами цього аспекту даного винаходу, включають будь-які стани або захворювання, для яких сприятливе посилання нейрональних функцій. Приклади таких захворювань включають захворювання центральної нервової системи, включаючи (але ними не обмежуючись) розлади настрою, неспокій, депресію, аутизм, дефіцит уваги, гіперактивність і порушення пізнавальної функції.Conditions and diseases that can be treated by the methods of this aspect of the present invention include any conditions or diseases for which the reference of neuronal functions is favorable. Examples of such disorders include disorders of the central nervous system, including but not limited to mood disorders, anxiety, depression, autism, attention deficit hyperactivity disorder, and cognitive impairment.

Інші, не лімітуючі приклади пізнавальних функцій, які можна поліпшити, використовуючи способи даного винаходу, розкриті в розділі 5.3.Other, non-limiting examples of cognitive functions that can be improved using the methods of the present invention are disclosed in section 5.3.

У одному з варіантів, наприклад, ЕРО молекули можна вводити суб'єкту або пацієнту, страждаючому порушеннями, викликаними втратою пізнавальних функцій, такими як наприклад, хвороба Альцгеймера.In one option, for example, EPO molecules can be administered to a subject or patient suffering from disorders caused by the loss of cognitive functions, such as, for example, Alzheimer's disease.

Здатність ЕРО посилювати пізнавальну функцію можна протестувати на експериментальних тваринах, використовуючи будь-які описані тут способи, або будь-які інші прийняті моделі для дослідження навчання або пізнавальних функцій. Як розкрито в прикладах, представлених в розділах б і 7, було виявлено, що периферійно введений еритропоетин посилює навчання і пізнавальні функції що продемонстровано на декількох добре відомих моделях вивчення навчання на здорових експериментальних тваринах. Прикладами таких моделей навчання є тест водного басейну Морріса, приклад якого приведений в розділі 6, і стандартний тест смакової огиди (СТА), приклад якого приведений в розділі 7. Наприклад, в одному з варіантів використовують стандартний тест смакової огиди, дуже чутливий, добре відомий стандартний тест для тестування пізнавальної функції у тварин після введення ЕРО. СТА використовують для тестування здатності тварин запам'ятовувати зв'язок хворобливих відчуттів з новим стимулом, таким як смак, таким чином, щоб тварини уникали цього нового смаку після повторного впливу цим стимулом. СТА включає мозок на різних коркових і підкоркових рівнях. Асоціацію, яка зв'язує висхідну і низхідну інформацію разом, виробляючи огиду, можна або послабити, або посилити, змінюючи вплив будь-якої з взаємозв'язаних одиниць. Як форма асоціативного навчання сила СТА визначається великим числом змінних, включаючи новизну оральних стимулів (наприклад, не новий стимул не може бути таким, що спричиняє огиду), міру "хворобливості" (токсичності), що виробляється, число повторів (тренінг), фізіологічні потреби (такі як спрага). Хоча СТА в дозозалежній формі може виробляти широке коло хімічних і фізичних агентів, хлорид літію надійно виробляє неспокій і анорексію. Подібно природним захворюванням літій викликає СТА, стимулюючи описану раніше схему, включаючи виділення цитокінів. Посилення функцій клітин, що збуджуються, наприклад, пізнавальної функції, надає ряд переваг індивідуумам в області навчання і роботи, і для посилення здібності до тренування і навчання інших ссавців (крім людини). 5.2.2. Способи захисту тканин, що збуджуються від ураженьThe ability of EPO to enhance cognitive function can be tested in experimental animals using any of the methods described herein, or any other accepted model for studying learning or cognitive function. As disclosed in the examples presented in sections b and 7, peripherally administered erythropoietin has been found to enhance learning and cognitive function as demonstrated in several well-known models of learning in healthy experimental animals. Examples of such learning models are the Morris Water Pool Test, an example of which is given in Chapter 6, and the Standard Taste Aversion Test (STA), an example of which is given in Chapter 7. For example, one variant uses the Standard Taste Aversion Test, a very sensitive, well-known a standard test for testing cognitive function in animals after EPO administration. STAs are used to test the ability of animals to remember the association of painful sensations with a new stimulus, such as a taste, so that the animals avoid that new taste after repeated exposure to that stimulus. STA involves the brain at various cortical and subcortical levels. The association that binds ascending and descending information together to produce aversion can be either weakened or strengthened by changing the influence of any of the interconnected units. As a form of associative learning, the strength of STA is determined by a large number of variables, including the novelty of the oral stimuli (eg, a non-novel stimulus cannot be aversive), the degree of "sickness" (toxicity) produced, the number of repetitions (training), physiological demands (such as thirst). Although STA can produce a wide range of chemical and physical agents in a dose-dependent manner, lithium chloride reliably produces restlessness and anorexia. Like a natural disease, lithium causes STA by stimulating the previously described circuit, including the release of cytokines. Enhancing the functions of excitable cells, for example, cognitive function, provides a number of advantages to individuals in the field of learning and work, and to enhance the ability to train and teach other mammals (except humans). 5.2.2. Ways to protect tissues that are excited from lesions

У іншому варіанті даний винахід стосується способу захисту ссавців від патологій, виникаючих внаслідок ураження тканин, що збуджуються. Такий захист забезпечується шляхом периферійного введення ссавцеві такої кількості еритропоетину, який ефективно захищає тканини, що збуджуються від ураження. Як детально показано в прикладі в розділі 8 далі, ЕРО, введене до введення токсину каїнату, надає помітну нейрозахисну дію на мишей, підвищуючи поріг настання нападу і запобігаючи загибелі. Нейрозахисна дія ЕРО значна і тривала. Потрібно зазначити, що позитивні ефекти, які тут спостерігалися, відбувалися за дуже короткий проміжок часу відносно введення ЕРО, щоб привести до підвищення гематокриту як слідства еритропоетичної активності ЕРО. Більш того як було відмічено раніше, даний винахід включає ЕРО, який не має здатності посилювати гематокрит.In another embodiment, the present invention relates to a method of protecting mammals from pathologies arising from damage to excitable tissues. Such protection is provided by peripheral administration to the mammal of such an amount of erythropoietin that effectively protects the excitable tissues from damage. As detailed in the example in Chapter 8 below, EPO administered prior to kainate toxin administration exerts a marked neuroprotective effect on mice, raising the seizure threshold and preventing death. The neuroprotective effect of ERO is significant and long-lasting. It should be noted that the positive effects observed here occurred in a very short period of time relative to the administration of EPO to lead to an increase in hematocrit as a consequence of the erythropoietic activity of EPO. Moreover, as previously noted, the present invention includes EPO that does not have the ability to increase hematocrit.

У одному з варіантів даний винахід можна з успіхом використати, як в гострих випадках, так і для профілактики і лікування неврологічних порушену, як тут розкрито, і для посилення пізнавальних функцій здорового або хворого мозку. Як було указано вище, пошкодження і загибель нейронів центральної нервової системи є серйозним фактом і часто приводить до летального випадку, що є відповідальним за високу міру захворюваності і смертності популяції. Гострі неврологічні ураження можуть відбуватися! під час або внаслідок епілептичних нападів, конвульсій, епілепсії, удару, кровотечі, пошкоджень центральної нервової системи, гіпоксії, гіпоглікемії, гіпертонії і травми головного або спинного мозку. Даний винахід пропонує швидке введення для лікування в гострих випадках.In one of the variants, this invention can be successfully used, both in acute cases, and for the prevention and treatment of neurological disorders, as disclosed here, and for strengthening the cognitive functions of a healthy or diseased brain. As indicated above, the damage and death of neurons of the central nervous system is a serious fact and often leads to a fatal case, which is responsible for the high rate of morbidity and mortality of the population. Acute neurological damage can occur! during or as a result of epileptic seizures, convulsions, epilepsy, shock, bleeding, damage to the central nervous system, hypoxia, hypoglycemia, hypertension, and brain or spinal cord injury. The present invention offers rapid administration for treatment in acute cases.

Наприклад, в одному варіанті способи даного винаходу можна використати для захисту ссавця від пошкоджень, причиною яких є радіаційне пошкодження мозку.For example, in one embodiment, the methods of the present invention can be used to protect a mammal from damage caused by radiation damage to the brain.

У іншому варіанті, серйозним станом, який можна лікувати або запобігти, відповідно способу даного винаходу, є профілактика і лікування в матці пренатальних гіпоксичних станів, лікування після народження для захисту мозку від гіпоксичних пошкоджень при тривалих пологах, а також при удушенні, утопленні і інших станах, при яких центральна нервова система випробовує ризик нейротоксичного ураження внаслідок недостатності кисню або в результаті схильності до інших нейротоксичних стимулів Як добре відомо, індивідууми, які постраждали від гіпоксії під час пологів, або внаслідок не фатальних гіпотоксичних нещасних випадків або інцидентів, можуть відчувати довічний нейрологічний дефіцит. Гіпоксія і/або припинення церебрального притоку крові, яка може виникнути після травми або під час хірургічних операцій, також загрожує можливістю викликати довічний нейрологічний дефіцит.In another embodiment, a serious condition that can be treated or prevented by the method of the present invention is prevention and treatment in utero of prenatal hypoxic conditions, treatment after birth to protect the brain from hypoxic damage during prolonged labor, as well as in strangulation, drowning and other conditions , in which the central nervous system is at risk of neurotoxic damage due to insufficient oxygen or exposure to other neurotoxic stimuli It is well known that individuals exposed to hypoxia during childbirth or as a result of non-fatal hypotoxic accidents or incidents can experience lifelong neurological deficits . Hypoxia and/or cessation of cerebral blood flow, which may occur after trauma or during surgery, also carries the potential to cause lifelong neurological deficits.

Постоперативну пізнавальну дисфункцію, включаючи дефіцит після використання апарату штучне серце- легені, також можна лікувати способами, що пропонуються тут. Крім того, способи даного винаходу можна використати для лікування гіпоксії, внаслідок отруєння окисом вуглецю або вдихання диму.Postoperative cognitive dysfunction, including deficits after the use of an artificial heart-lung machine, can also be treated by the methods proposed herein. In addition, the methods of this invention can be used to treat hypoxia due to carbon monoxide poisoning or smoke inhalation.

У іншому варіанті ЕРО використовують для захисту серцевої тканини від тривалих уражень, пов'язаних з ішемією, інфарктом, запаленням або травмою.In another embodiment, ERO is used to protect heart tissue from long-term damage associated with ischemia, infarction, inflammation, or trauma.

Це нелімітуючі приклади пошкоджень тканини, що збуджується, які можна лікувати способами даного винаходу. Інтенсивне і раннє лікування цих порушень можуть здійснити професіонали швидкої медичної допомоги, так що лікування може початися відразу після того, як встановлена підозра на можливе нейрологічне пошкодження. Ризик нейрологічного пошкодження, пов'язаний з пологами, можна знизити шляхом профілактичного лікування плоду до початку пологів або під час пологів. Фахівцям будуть зрозумілі ці і інші ситуації і можливості застосування способу даного винаходу. 5.2.3. Способи доставляння сполукThese are non-limiting examples of excitable tissue damage that can be treated with the methods of the present invention. Intensive and early treatment of these disorders can be carried out by emergency medical professionals, so that treatment can begin as soon as possible neurological damage is suspected. The risk of neurological damage associated with childbirth can be reduced by prophylactic treatment of the fetus before or during labor. Specialists will understand these and other situations and possibilities of applying the method of this invention. 5.2.3. Methods of delivery of compounds

Далі даний винахід направлений на спосіб полегшення транспорту молекул через бар'єр ендотеліальних клітин у ссавців, шляхом введення композиції, яка включає конкретні молекули, асоційовані з еритропоетином.Further, the present invention is directed to a method of facilitating the transport of molecules through the barrier of endothelial cells in mammals by introducing a composition that includes specific molecules associated with erythropoietin.

Як було указано вище, автори виявили досі несподівану і дивну активність периферійно введених ЕРО відносно тканин, що збуджуються, таких як нервові тканини центральної нервової системи, периферійної нервової системи або тканини серця, ідентифікуючи ЕРО як молекули, здатні проникати крізь щільні сполуки таких тканин, що збуджуються, як гематоенцефалічний бар'єр. Як такі, ЕРО можна використати як носії для доставляння інших молекул через гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ) і інші аналогічні бар'єри.As indicated above, the authors discovered a hitherto unexpected and surprising activity of peripherally administered EPO on excitable tissues such as central nervous system, peripheral nervous system, or heart tissue, identifying EPO as a molecule capable of penetrating the tight junctions of such tissues that are excited, like the blood-brain barrier. As such, EROs can be used as carriers to deliver other molecules across the blood-brain barrier (BBB) and other similar barriers.

У одному з варіантів молекули, зв'язуючі ЕРО рецептори, що включають молекули, кон'юговані з ЕРО молекулами, можна використати для транспорту таких молекул через гематоенцефалічний бар'єр. Тим самим можна здійснити спільне доставляння таких молекул на ЕРО для подолання ВВВ. У іншому варіанті антитіло, або інший зв'язуючий з молекулою партнер, може бути асоційований з ЕРО, або з модулятором активності рецептора ЕРО, таким чином асоціюючи підлягаючу транспорту молекулу за рахунок нековалентного зв'язування зі зв'язуючим партнером, який далі асоційований з транспортабельною молекулою ЕРО. У іншому варіанті молекули, зв'язуючі ЕРО рецептор, що включають антитіла до ЕРО рецептора, можна використати в описаному вище способі. Такі антитіла забезпечують транспортний носій, на якому можуть "подорожувати" інші молекули, головним чином таким же чином, як були використані, антитіла до трансферинового рецептора для подолання гематоенцефалічного бар'єра (Рагападе еї аїЇ, 1991, ЗеїІесіїме ігапероїї ої ап апійгапвететіп гесеріог апіїбоду (нгоцдй Ше Біоса-ргаїп Батіег іп мімо. У. Рнаптасої. Ехр. Тнегар. 27: 66).In one variant of the molecule, EPO-binding receptors, including molecules conjugated with EPO molecules, can be used to transport such molecules across the blood-brain barrier. Thus, it is possible to carry out the joint delivery of such molecules to ERO to overcome BBB. In another variant, the antibody, or another binding partner with the molecule, can be associated with EPO, or with a modulator of EPO receptor activity, thus associating the transportable molecule through non-covalent binding with the binding partner, which is further associated with the transportable EPO molecule. In another variant, molecules that bind the EPO receptor, including antibodies to the EPO receptor, can be used in the method described above. Such antibodies provide a transport carrier on which other molecules can "travel", mainly in the same way that antibodies to the transferrin receptor were used to cross the blood-brain barrier (Ragapade ei aiYi, 1991, ZeiIesiime igaperoiyi oi ap apiygapvetetip geseriog apiibodu ( ngotsdy She Biosa-rgaip Batieg ip mimo. U. Rnaptasoi. Ehr. Tnegar. 27: 66).

Фахівцям повинні бути відомі різні способи асоціації молекул з ЕРО і іншими описаними вище агентами, за рахунок ковалентних, нековалентних і інших взаємодій; крім того, можна легко визначити оцінку ефективності композиції в експериментальній системі. Асоціювання молекул з ЕРО і аналогами можна забезпечити будь- яким числом способів, включаючи лабільне, ковалентне зв'язування, зшивання, і т.д. В одному з варіантів, наприклад, асоціація між підлягаючою транспорту через бар'єр молекулою і еритропоетином може бути лабільним ковалентним зв'язком, причому в цьому випадку молекула виділяється з асоціації з ЕРО після подолання бар'єра. У одному з варіантів можна використати взаємодію біотин/авідин. У іншому варіанті, як було указано вище, можна одержати гібридну рекомбінантну або синтетичну молекулу, наприклад, таку, яка включає як домен молекули, що має необхідну фармакологічну активність, так і домен, відповідальний за модуляцію активності ЕРО рецептора. Молекула може бути кон'югована з ЕРО або модулятором активностіSpecialists should know various methods of association of molecules with EPO and other agents described above, due to covalent, non-covalent and other interactions; in addition, one can easily determine the evaluation of the effectiveness of the composition in the experimental system. Association of molecules with EPO and analogues can be provided by any number of methods, including labile, covalent binding, cross-linking, etc. In one of the options, for example, the association between the molecule to be transported through the barrier and erythropoietin can be a labile covalent bond, and in this case the molecule is released from association with EPO after overcoming the barrier. In one variant, the biotin/avidin interaction can be used. In another variant, as indicated above, it is possible to obtain a hybrid recombinant or synthetic molecule, for example, one that includes both the domain of the molecule having the necessary pharmacological activity and the domain responsible for modulating the activity of the EPO receptor. The molecule can be conjugated with EPO or an activity modulator

ЕРО рецептора через поліфункціональну молекулу, наприклад, поліфункціональний зшиваючий агент. У тому значенні, як тут використано, термін "поліфункціональна молекула" охоплює молекули, що містять одну функціональну групу, яка може реагувати більше ніж один раз послідовно, такі, як формальдегід, а також молекули, що містять більше ніж одну реакційноздатну групу. У тому значенні, як тут використано, термін "реакційноздатна група" стосується функціональної групи на зшиваючому агенті, яка реагує з функціональною групою молекули (наприклад, пептиду, білка, вуглеводу, нуклеїнової кислоти, зокрема гормону, антибіотика або протиракового агента, які необхідно доставити через ендотеліальний клітинний бар'єр), з утворенням ковалентного зв'язку між зшиваючим агентом і цією молекулою. Термін "функціональна група" зберігає своє стандартне значення, прийняте в органічній хімії. Поліфункціональні молекули, які можна використати, є, переважно, біосумісними лінкерами, тобто вони не є канцерогенними, вони не токсичні і практично не імуногенні іп мімо. Поліфункціональні зшиваючі агенти, які відомі фахівцям і тут розкриті, можна легко протестувати в моделях на тваринах для визначення їх біосумісності. Поліфункціональні молекули переважно біфункціональні. У тому значенні, як тут використано, термін "біфункціональна молекула" стосується молекули з двома реакційноздатними групами. Біфункціональні молекули можуть бути гетеробіфункціональними або гомобіфункціональними. Гетеробіфункціональний зшиваючий агент дозволяє забезпечити вертикальну кон'югацію. Він особливо, переважний для того, щоб поліфункціональні молекули були досить розчинні у воді, для забезпечення протікання реакцій зшивання у водних розчинах, таких як водні розчини, буферовані при рнб-8, і для одержання кон'югата, який залишається водорозчинним для більш ефективного біорозподілу.EPO receptor through a multifunctional molecule, for example, a multifunctional cross-linking agent. As used herein, the term "polyfunctional molecule" includes molecules containing one functional group that can react more than once in succession, such as formaldehyde, as well as molecules containing more than one reactive group. As used herein, the term "reactive group" refers to a functional group on a crosslinking agent that reacts with a functional group of a molecule (eg, a peptide, protein, carbohydrate, nucleic acid, including a hormone, antibiotic, or anticancer agent) to be delivered via endothelial cell barrier), with the formation of a covalent bond between the crosslinking agent and this molecule. The term "functional group" retains its standard meaning accepted in organic chemistry. Polyfunctional molecules that can be used are mostly biocompatible linkers, that is, they are not carcinogenic, they are not toxic, and they are practically not immunogenic. Polyfunctional crosslinking agents known to those skilled in the art and disclosed herein can be readily tested in animal models to determine their biocompatibility. Polyfunctional molecules are mostly bifunctional. As used herein, the term "bifunctional molecule" refers to a molecule with two reactive groups. Bifunctional molecules can be heterobifunctional or homobifunctional. A heterobifunctional crosslinking agent allows for vertical conjugation. It is especially preferred for polyfunctional molecules to be sufficiently soluble in water, to allow cross-linking reactions to occur in aqueous solutions, such as aqueous solutions buffered with rnb-8, and to produce a conjugate that remains water-soluble for more efficient biodistribution .

Звичайно поліфункціональна молекула ковалентно зв'язується з аміно або сульфгідрильною функціональною групою. Однак поліфункціональні молекули, реакційноздатні стосовно інших функціональних груп, таких як групи карбонових кислот або гідроксильні групи, також розглядаються в об'ємі даного винаходу.Usually, a polyfunctional molecule is covalently linked to an amino or sulfhydryl functional group. However, polyfunctional molecules reactive with other functional groups, such as carboxylic acid groups or hydroxyl groups, are also considered within the scope of this invention.

Гомобіфункціональні молекули містять, принаймні, дві однакові реакційноздатні функціональні групи.Homobifunctional molecules contain at least two identical reactive functional groups.

Реакційноздатні функціональні групи гомобіфункціональної молекули включають, наприклад, альдегідні групи і активні складноефірні групи. Гомобіфункціональні молекули, що містять альдегідні групи, включають, наприклад, глутаральдегід і субаральдегід. Використання глутаральдегіду як зшиваючого агента розкритоReactive functional groups of the homobifunctional molecule include, for example, aldehyde groups and active ester groups. Homobifunctional molecules containing aldehyde groups include, for example, glutaraldehyde and subaraldehyde. The use of glutaraldehyde as a crosslinking agent is disclosed

Рогпапеку еї аї., Зсієпсе 223, 1304-1306 (1984). Гомобіфункціональні молекули, що містять, принаймні, два активних складноефірних Фрагменти, включають складний ефір дикарбонових кислот і М-гідроксисукциніміду.Rogpapeku ei ai., Zsiepse 223, 1304-1306 (1984). Homobifunctional molecules containing at least two active ester Fragments include the ester of dicarboxylic acids and M-hydroxysuccinimide.

Деякі приклади такого М-сукцинімідильних складних ефірів включають дисукцинімідилсуберат і дитіо-біс- сукцинімідил-пропіонат, і їх розчинні сполуки з біс-сульфоновою кислотою і біс-сульфонати, такі як їх натрієві і калієві солі. Ці гомобіфункціональні реагенти доступні від Рієгсе, Носкгога, Шіпоїв.Some examples of such M-succinimidyl esters include disuccinimidyl suberate and dithio-bis-succinimidyl propionate, and their soluble compounds with bis-sulfonic acid and bis-sulfonates, such as their sodium and potassium salts. These homobifunctional reagents are available from Riegse, Noskgog, Shipoy.

Гетеробіфункціональні молекули містять, принаймні, дві різні реакційноздатні групи. Реакційноздатні групи реагують з різними функціональними групами, наприклад, присутніми в ЕРО, і в молекулі. Ці дві різні функціональні групи, які реагують з реакційноздатною групою гетеробіфункціонального зшиваючого агента, звичайно є аміногрупою, наприклад, епсилон-аміногрупою лізину; сульфгідрильною групою, наприклад, тіольною групою цистеїну; карбоновою кислотою, наприклад, карбоксилатом аспарагінової кислоти; або гідроксильною групою, наприклад, гідроксильною групою серину.Heterobifunctional molecules contain at least two different reactive groups. Reactive groups react with various functional groups, for example, present in EPO and in the molecule. These two different functional groups that react with the reactive group of the heterobifunctional crosslinking agent are usually an amino group, for example, the epsilon amino group of lysine; a sulfhydryl group, for example, a thiol group of cysteine; carboxylic acid, for example, aspartic acid carboxylate; or a hydroxyl group, for example, a serine hydroxyl group.

Якщо реакційноздатна група гетеробіфункціональної молекули утворить ковалентний зв'язок з аміногрупою, такий ковалентний зв'язок звичайно буває амідо або імідо зв'язком Реакційноздатна група, яка утворить ковалентний зв'язок з аміногрупою, може бути, наприклад, активованою карбоксилатною групою, галогенкарбонільною групою, або складноефірною групою. Переважною галогенкарбонільною групою є хлоркарбонільна група. Складноефірні групи є, переважно реакційноздатними складноефірними групами, такими як, наприклад, М-гідроксисукцинімідна складноефірна група.If a reactive group of a heterobifunctional molecule forms a covalent bond with an amino group, such a covalent bond is usually an amido or an imido bond. A reactive group that forms a covalent bond with an amino group can be, for example, an activated carboxylate group, a halocarbonyl group, or an ester group. The preferred halocarbonyl group is a chlorocarbonyl group. Ester groups are preferably reactive ester groups, such as, for example, M-hydroxysuccinimide ester group.

Іншою функціональною групою звичайно є або тіольна група, або група, здатна перетворюватися в тіольну групу, або група, яка утворить ковалентний зв'язок з тіольною групою. Ковалентний зв'язок звичайно є тіоефірним зв'язком або дисульфідним зв'язком. Реакційноздатна група, яка утворить ковалентний зв'язок з тіольною групою, може бути, наприклад, подвійним зв'язком, який реагує з тіольними групами або активованими дисульфідами. Реакційноздатна група, що містить подвійний зв'язок, здатний взаємодіяти з тіольною групою, є малеїмідогрупою, хоча можливі і інші, такі, як акрилонітрил. Реакційноздатна дисульфідна група може бути, наприклад 2-піридилдитіогрупою, або групою 5,5'-дитіо-біс-(2-нітробензойної кислоти). Деякі приклади гетеро-біфункціональних реагентів, що містять реакційноздатні дисульфідні зв'язки, включають М- сукцинімідил. 3-(2-піридилдитіо)пропіонат (Сагівбоп еї аїЇ., 1978, Віоспет .., 173: 723-737), натрій 5-4- сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метил-бензилтіосульфат, і 4-сукцинімідилокси-карбоніл-альфа-метилетил(2- піридилдитіо)толуол. М-сукцинімідил 3-(2-піридилдитіо)пропіонат переважний. Деякі приклади гетеробіфункціональних реагентів, що включають реакційноздатні групи, що містять подвійний зв'язок, який взаємодіє з тіольною групою, включають сукцинімідил 4-(М-малеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат і сукцинімідил м-малеїмідобензоат.Another functional group is usually either a thiol group, or a group capable of being converted into a thiol group, or a group that will form a covalent bond with a thiol group. The covalent bond is usually a thioester bond or a disulfide bond. A reactive group that will form a covalent bond with a thiol group can be, for example, a double bond that reacts with thiol groups or activated disulfides. A reactive group containing a double bond capable of interacting with a thiol group is a maleimido group, although others such as acrylonitrile are also possible. The reactive disulfide group can be, for example, a 2-pyridyldithio group or a 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) group. Some examples of hetero-bifunctional reagents containing reactive disulfide bonds include M-succinimidyl. 3-(2-pyridyldithio)propionate (Sagivbop et al., 1978, Viospet .., 173: 723-737), sodium 5-4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-benzylthiosulfate, and 4-succinimidyloxy-carbonyl-alpha-methylethyl (2-pyridyldithio)toluene. M-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate is preferred. Some examples of heterobifunctional reagents that include reactive groups containing a double bond that interacts with a thiol group include succinimidyl 4-(M-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate and succinimidyl m-maleimidobenzoate.

Інші гетеробіфункціональні молекули включають сукцинімідил З-(малеїмідо)пропіонат, сульфосукцинімідил. 4-(п-малеїмідофеніл)бутират, сульфосукцинімідил. 4-(М-малеїмідометилциклогексан)-1- карбоксилат, складний ефір малеїмідобензоїл-М-гідроксисукциніміду. Переважна натрійсульфонатна сіль сукцинімідил м-малеїмідобензоату. Багато які з вищезгаданих гетеробіфункціональних реагентів і їх сульфонатні солі доступні від Ріегсе.Other heterobifunctional molecules include succinimidyl C-(maleimido)propionate, sulfosuccinimidyl. 4-(p-maleimidophenyl)butyrate, sulfosuccinimidyl. 4-(M-maleimidomethylcyclohexane)-1-carboxylate, ester of maleimidobenzoyl-M-hydroxysuccinimide. The sodium sulfonate salt of succinimidyl m-maleimidobenzoate is preferred. Many of the above-mentioned heterobifunctional reagents and their sulfonate salts are available from Riegse.

Фахівці можуть легко визначити, чи є вищезгадані кон'югати оборотними або лабільними. Кон'югати можна тестувати іп мйго як на модуляторну активність стосовно ЕРО рецепторної активності, так і на необхідну фармакологічну активність. Якщо кон'югат зберігає обидві ці властивості, його, відповідно можна тестувати іп мімо. Якщо для активності молекули кон'югата необхідне його відділення від ЕРО, переважний лабільний зв'язок або оборотна асоціація з ЕРО. Характеристики лабільності можна також протестувати, використовуючи стандартні іп міо процедури перед тестуванням іп мімо.Those skilled in the art can easily determine whether the above conjugates are reversible or labile. Conjugates can be tested both for modulatory activity in relation to EPO receptor activity and for the required pharmacological activity. If the conjugate retains both of these properties, it can be tested by ip mimo. If the activity of the conjugate molecule requires its separation from EPO, a labile bond or reversible association with EPO is preferred. Lability characteristics can also be tested using standard ip mio procedures prior to ip mimo testing.

Додаткову інформацію стосовно того, як одержати і використати ці і інші поліфункціональні реагенти, можна одержати з наступних публікацій, або інших доступних фахівцям: Сагіз5оп еї аї., 1978, Віоспет. У. 173: 723-737; битрег єї аї., 1985, Метоавв іп Епгутоіоду 112: 207-224; дце єї аї., 1978, Віоспет. 17: 5399-5405; 5!Ип еїга!., 1974, Віоспет. 13: 2334-2340; Віашег еї а!., 1985, Віоспет. 24: 1517-152; Пи еї аі!., 1979, Віоснет. 18: 690- 697; Хоше апа МеміїІє, 1980, Ргос. Маї). Асад. сі. 0.5.А. 77: 5483-5486; І етег вї а!., 1981, Ргос. Маї). Асад. 5бі.Additional information on how to obtain and use these and other multifunctional reagents can be obtained from the following publications or others available to specialists: Sagiz5op ei ai., 1978, Viospet. U. 173: 723-737; bitreg eyi ai., 1985, Metoavv ip Epgutoiodu 112: 207-224; dtse eyi ai., 1978, Viospet. 17: 5399-5405; 5!Ip eiga!., 1974, Viospet. 13: 2334-2340; Viashegh ei a!., 1985, Viospet. 24: 1517-152; Pi ei ai!., 1979, Viosnet. 18: 690-697; Khoshe apa MemiiIye, 1980, Rhos. Mai). Asad si. 0.5.A. 77: 5483-5486; And eteg vy a!., 1981, Rhos. Mai). Asad 5bi.

ЦО.5.А. 78: 3403-3407; дипд апа Могої, 1983, Віоспет. Віорпуз. Асіа 761: 162; Саційеїйа аї а)!., 1984, Віоспет. 81: 7772-7776; Загов, 9у.М., 1982, Віоспет. 21: 3950-3955; Мозпйаке еїс аї. г 1979, Єишг. У. Віоспет. 101: 395-399;TSO.5.A. 78: 3403-3407; diploma apa Mogoi, 1983, Viospet. Viorpuz. Asia 761: 162; Satsyeiia ai a)!., 1984, Viospet. 81: 7772-7776; Zagov, 9u.M., 1982, Viospet. 21: 3950-3955; Mozpyake eis ai. 1979, Yeishg. U. Viospet. 101: 395-399;

Уозпаке еї а!., 1982, 9. Віоспет. 92: 1413-1424; РіїсН апа Сгесп, 1979, у. ВіоЇ. Спет. 254: 3375-3381; Моміск аї а!., 1987, уУ.Віої. Спет. 262: 8483-8487; І отапі апа Раїтфапк:х, 1976, .). Мої. ВіоІ. 104: 243-261; Натада апаUozpake eyi a!., 1982, 9. Viospet. 92: 1413-1424; RiisN apa Sgesp, 1979, u. Vio Spent 254: 3375-3381; Momisk ai a!., 1987, uU. Vioi. Spent 262: 8483-8487; And otapi apa Raitfapk:kh, 1976, .). My. VioI. 104: 243-261; Natada apa

Твигао, 1987, Апаї!. Віоспет. 160: 483-488; апа Навпіда, 1984, 9. Арріїеєа Віоспет. 6: 56-63. Додатково способи здійснення зшивань можна знайти в огляді Меап5 апа Ееєепеєу, 1990, Віосопійдагє Спет. 1: 2-12. Бар'єри, які можна подолати, використовуючи вищеописані способи і композиції, даного винаходу, включають (але ними не обмежуються): гематоенцефалічний бар'єр, гематоофтальмічний бар'єр, бар'єр між кровоносною системою і сім'яниками, бар'єр між кровоносною системою і яєчниками і плацентарний бар'єр.Tvygao, 1987, Apai!. Viospet. 160: 483-488; apa Navpida, 1984, 9. Arriiea Viospet. 6: 56-63. Additionally, methods of stitching can be found in the review of Meap5 apa Eeeepeeu, 1990, Viosopiidage Spet. 1: 2-12. Barriers that can be overcome using the above-described methods and compositions of this invention include (but are not limited to): the blood-brain barrier, the blood-ophthalmic barrier, the barrier between the circulatory system and the testes, the barrier between circulatory system and ovaries and placental barrier.

Відповідні молекули для транспорту через бар'єр ендотеліальних клітин включають, наприклад, гормони, такі як гормони росту, нейротрофічний фактор, антибіотики або протигрибкові агенти, такі як ті, які звичайно виключені з мозку і інших органів, які обмежені бар'єрами, пептидні радіофармацевтичні агенти, антисмислові ліки, антитіла до біологічно активних агентів, фармацевтичні і протиракові агенти. Нелімітуючі приклади таких молекул включають гормон росту, фактор росту нервів (МСЕ), одержаний з мозку нейротрофічний фактор (ВМЕ), циліарний нейротрофічний фактор (СТЕ), основний фактор росту фібробластів (БЕБСЕ), що трансформує фактор росту ВІ (ТОЕРрІ1), що трансформує фактор росту В2 (ТОЕрг), що трансформує фактор росту ВЗ (ТОЕВЗ), інтерлейкін 1, інтерлейкін 2, інтерлейкін 3, і інтерлейкін 6, А2Т, антитіла до фактора некрозу пухлини і імуноспівпроцесори, такі як циклоспорин.Suitable molecules for transport across the endothelial cell barrier include, for example, hormones such as growth hormone, neurotrophic factor, antibiotics or antifungal agents such as those normally excluded from the brain and other barrier-restricted organs, peptide radiopharmaceuticals agents, antisense drugs, antibodies to biologically active agents, pharmaceutical and anticancer agents. Non-limiting examples of such molecules include growth hormone, nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BME), ciliary neurotrophic factor (CTE), basic fibroblast growth factor (BFGF), transforming growth factor VI (TOERrI1), transforming growth factor growth factor B2 (TOErg), transforming growth factor VZ (TOEVZ), interleukin 1, interleukin 2, interleukin 3, and interleukin 6, A2T, antibodies to tumor necrosis factor, and immunosuppressants such as cyclosporine.

У іншому варіанті для терапевтичного доставляння токсинів для лікування вірусних захворювань або проліферативних захворювань, таких як рак, можна використати рекомбінантні химеричні молекули токсинів, що включають ЕРО. Сполуки, які можна об'єднувати з ЕРО для створення химеричного токсину, який можна використати в такому варіанті, включають (але ними не обмежуються) токсичні речовини, такі як екзотоксин рзепдотопав, токсин дифтерії і рицин, нарівні з іншими. 5.3. Необхідні умовиIn another embodiment, recombinant chimeric toxin molecules comprising EPO can be used to therapeutically deliver toxins for the treatment of viral diseases or proliferative diseases such as cancer. Compounds that can be combined with EPO to create a chimeric toxin that can be used in this embodiment include (but are not limited to) toxic substances such as rzepdotopav exotoxin, diphtheria toxin, and ricin, among others. 5.3. Necessary conditions

Як було розкрито раніше, запропоновані тут ЕРО композиції і способи їх застосування можна використати для лікування і профілактики станів, причиною яких є умови гіпоксії, які шкідливо впливають на тканини, що збуджуються, такі як тканини центральної нервової системи, тканини периферійної нервової системи, або кардіальні тканини, такі як, наприклад, тканини мозку, серця або сітчастої оболонки. Тому даний винахід можна використати для лікування або профілактики пошкоджень тканини, що збуджується, які виникають в результаті гіпоксії в різних станах і при різних обставинах. Не лімітуючі приклади таких станів і обставин приводяться далі.As previously disclosed, the ERO compositions and methods of use herein can be used to treat and prevent conditions caused by hypoxic conditions that adversely affect excitable tissues, such as central nervous system tissues, peripheral nervous system tissues, or cardiac tissues such as, for example, brain, heart or retinal tissues. Therefore, the present invention can be used for the treatment or prevention of excitable tissue damage that occurs as a result of hypoxia in various conditions and under various circumstances. Non-limiting examples of such conditions and circumstances are given below.

Приклад захисту нейрональних тканин патології, які можна лікувати відповідно 3 даним винаходом, включає такі патології, які є результатом зниженого доставляння киснем нейрональних тканин. Будь-які стани, які приводять до зниження доступу кисню до нейрональних тканин, що приводять в результаті до стресу, пошкодження, і, зрештою, до загибелі нейрональних клітин, можна лікувати способами даного винаходу.An example of the protection of neuronal tissues of a pathology that can be treated according to 3 of the present invention includes such pathologies that are the result of reduced oxygen delivery to neuronal tissues. Any condition that results in reduced oxygen access to neuronal tissue, resulting in stress, damage, and ultimately death of neuronal cells, can be treated by the methods of this invention.

Звичайно звані гіпоксією або ішемією, такі стани виникають із-за, або включають (але ними не обмежуються) удар, закупорку судин, пренатальну або пост-натальну недостатність кисню, удушення, удушення, майже утоплення, отруєння окисом вуглецю, вдихання диму, травму, включаючи хірургічне втручання і радіотерапію, асфікцію, епілепсію, гіпоглікемію, хронічні обструктивні легеневі захворювання, емфізему, синдром дихальної недостатності у дорослих, гіпертонічний шок, септичний шок, анафілактичний шок, серпасто-клітинну анемію, зупинку серця і азотний наркоз.Commonly called hypoxia or ischemia, such conditions result from, or include (but are not limited to) shock, vascular occlusion, prenatal or postnatal oxygen deprivation, suffocation, suffocation, near-drowning, carbon monoxide poisoning, smoke inhalation, trauma, including surgery and radiotherapy, asphyxia, epilepsy, hypoglycemia, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, adult respiratory distress syndrome, hypertensive shock, septic shock, anaphylactic shock, sickle cell anemia, cardiac arrest, and nitrous oxide.

У одному з варіантів, наприклад, ЕРО можна вводити для запобігання ураженням або пошкодженням тканин, які можуть виникнути внаслідок ризику ураження або пошкодження тканин під час хірургічних процедурі таких як наприклад, видалення пухлини або видалення аневризми.In one embodiment, for example, ERO can be administered to prevent injury or damage to tissues that may occur due to the risk of injury or damage to tissues during surgical procedures such as, for example, tumor removal or aneurysm removal.

Інші патології, викликані гіпоглікемією, або що є її результатом, які можна лікувати описаними тут способами, включають передозування інсуліну, звану також ятрогенною гіперинсулемією, інсуліномою, дефіцитом гормону росту, гіперкортізолізмом, передозуванням ліків, і деякими пухлинами.Other conditions caused by or resulting from hypoglycemia that can be treated by the methods described herein include insulin overdose, also called iatrogenic hyperinsulemia, insulinoma, growth hormone deficiency, hypercortisolism, drug overdose, and certain tumors.

Інші патології, які виникають внаслідок пошкодження нейрональних тканин, що збуджуються, включають такі напади, як епілепсія, судоми, або хронічні напади. Інші стани і захворювання, які можна лікувати, включають такі захворювання як удар, розсіяний склероз, гіпертонію, зупинку серця, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, церебральний параліч, травму головного або спинного мозку, АІО5 деменцію, вікову втрату пізнавальної функції, втрату пам'яті, бічний аміотрофічний склероз, напади, алкоголізм, ішемію сітчатки, пошкодження очного нерва в результаті глаукоми, і загибель нервів.Other pathologies that result from damage to excitable neuronal tissues include seizures such as epilepsy, convulsions, or chronic seizures. Other conditions and diseases that can be treated include diseases such as stroke, multiple sclerosis, hypertension, cardiac arrest, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral palsy, brain or spinal cord injury, AIO5 dementia, age-related cognitive loss, memory loss , amyotrophic lateral sclerosis, seizures, alcoholism, retinal ischemia, optic nerve damage as a result of glaucoma, and nerve death.

Способи даного винаходу можна використати для лікування хворобливих станів і пошкоджених тканин сітчатки. Такі захворювання включають (але ними не обмежуються) жовті плями на сітчатці, відшарування сітчатки, пігментний ретиніт, атеросклеротичну ретинопатію, гіпертонічну ретинопатію, блокаду артерії сітчатки, блокаду вен сітчатки, гіпотензію і діабетичну ретинопатію.The methods of this invention can be used to treat painful conditions and damaged retinal tissues. Such conditions include (but are not limited to) macular macular, retinal detachment, retinitis pigmentosa, atherosclerotic retinopathy, hypertensive retinopathy, retinal artery occlusion, retinal vein occlusion, hypotension, and diabetic retinopathy.

У іншому варіанті способи даного винаходу можна використати для захисту або лікування уражень, викликаних радіаційними ураженнями тканин, що збуджуються.In another embodiment, the methods of this invention can be used to protect or treat lesions caused by radiation damage to excitable tissues.

Подальше застосування способів даного винаходу складається в лікуванні отруєнь нейротоксинами, таких як отруєння домоєвою кислотою молюсків, нейролатиризм, гуамська (бцат) хвороба, бічний аміотрофічний склероз і хвороба Паркінсона.Further application of the methods of this invention is in the treatment of neurotoxin poisoning, such as shellfish domoic acid poisoning, neurolatyrism, Guam (bsat) disease, amyotrophic lateral sclerosis and Parkinson's disease.

Як було указано раніше, даний винахід стосується також способу посилення функцій тканин, що збуджуються у ссавців за рахунок периферійного введення еритропоетину. Різні стани і захворювання піддаються лікуванню з використанням цього способу, і, крім того, цей спосіб можна використати для посилення пізнавальної функції при відсутності будь-яких хворобливих станів або захворювань. Ці застосування даного винаходу розкриті далі більш детально, і вони включають поліпшення навчання і тренування як у людей, так і у інших ссавців.As indicated earlier, the present invention also relates to a method of enhancing the functions of tissues that are excited in mammals due to the peripheral administration of erythropoietin. Various conditions and diseases are amenable to treatment using this method, and in addition, this method can be used to enhance cognitive function in the absence of any painful conditions or diseases. These applications of the present invention are disclosed in more detail below and include improving learning and training in both humans and other mammals.

Хворобливі стани і захворювання, що піддаються лікуванню способами цього аспекту даного винаходу, що стосуються центральної нервової системи, включають (але ними не обмежуються) розлади настрою, неспокій, депресію, аутизм, дефіцит уваги, гіперактивність і пізнавальну дисфункцію. На ці стани сприятливо впливає підвищення нейрональних функцій.Diseases and conditions treatable by the methods of this aspect of the present invention involving the central nervous system include (but are not limited to) mood disorders, anxiety, depression, autism, attention deficit hyperactivity disorder, and cognitive dysfunction. An increase in neuronal functions has a beneficial effect on these conditions.

Інші захворювання, які піддаються лікуванню способами даного винаходу, включають порушення сну, наприклад, зупинку дихання під час сну, і розлади, пов'язані з подорожами; субарахноїдальна і аневризмальна кровотеча, гіпертонічний шок, контузії, септичний шок, анафілактичний шок, і наслідки різного енцефаліту і менінгіту, наприклад, запалення мозкових тканин, пов'язані із захворюваннями з'єднувальної тканини, такими як вовчанка. Інші застосування включають профілактику або захист від нейротоксинів, таких як отруєння домоєвою кислотою молюсків, нейролатиризм і гуамська хвороба, бічний аміотрофічний склероз, хворобаOther diseases amenable to treatment by the methods of this invention include sleep disorders, such as sleep apnea, and travel-related disorders; subarachnoid and aneurysmal hemorrhage, hypertensive shock, contusions, septic shock, anaphylactic shock, and sequelae of various encephalitis and meningitis, such as inflammation of brain tissues, associated with connective tissue diseases such as lupus. Other uses include prevention or protection against neurotoxins such as shellfish domoic acid poisoning, neurolatyrism and Guam disease, amyotrophic lateral sclerosis,

Паркінсона; післяопераційне лікування емболічних або ішемічних уражень; опромінення всього мозку; анемію серпастих клітин і еклампсію.Parkinson's; postoperative treatment of embolic or ischemic lesions; irradiation of the whole brain; sickle cell anemia and eclampsia.

Наступна група станів, що піддаються лікуванню способами даного винаходу, включає мітохондріальні дисфункції, як спадкові, так і придбані, які є причиною різних нейрологічних захворювань, прикладами яких є ураження і загибель нейронів., Наприклад, хвороба Лея (Піедп) (субгостра некротуюча енцефалопатія) характеризується прогресуючою втратою зору і енцефалопатією, внаслідок втрати нейронів, і міопатією. У цих випадках дефективний мітохондріальний метаболізм виявляється не в змозі доставити достатню кількість високоенергетичних речовин для забезпечення метаболізму клітин, що збуджуються. Модулятори активностіA further group of conditions amenable to treatment by the methods of the present invention include mitochondrial dysfunctions, both inherited and acquired, which cause various neurological diseases, examples of which are neuronal damage and death. For example, Leigh's disease (SLE) (subacute necrotizing encephalopathy). characterized by progressive loss of vision and encephalopathy due to loss of neurons, and myopathy. In these cases, defective mitochondrial metabolism is unable to deliver sufficient high-energy substances to support the metabolism of excitable cells. Modulators of activity

ЕРО рецепторів оптимізують недостатні функції при різних мітохондріальних захворюваннях.EPO receptors optimize insufficient functions in various mitochondrial diseases.

Як було указано вище, стани гіпоксії шкідливо впливають на тканини, що збуджуються. Тканини, що збуджуються включають (але ними не обмежуються) тканини центральної нервової системи, тканини периферійної нервової системи і тканин серця. У доповнення до вказаних вище станів, способи даного винаходу застосовні для лікування отруєнь дихальних шляхів, таких як вдихання окису вуглецю і диму, приступи астми, респіраторний дистрес-синдром дорослих, удушення і майже утоплення. Інші стани, які створюють стан гіпоксії, або іншими способами викликають пошкодження тканин, що збуджуються, включають гіпоглікемію, яка може бути викликана неправильними дозами інсуліну, або продукуючими інсулін неоплазмами (інсуліномами).As indicated above, hypoxia conditions have a harmful effect on excitable tissues. Excitable tissues include (but are not limited to) central nervous system tissue, peripheral nervous system tissue, and heart tissue. In addition to the above conditions, the methods of this invention are applicable to the treatment of respiratory tract poisoning such as carbon monoxide and smoke inhalation, asthma attacks, adult respiratory distress syndrome, suffocation and near drowning. Other conditions that create a state of hypoxia, or otherwise cause damage to excitable tissues, include hypoglycemia, which can be caused by incorrect doses of insulin, or by insulin-producing neoplasms (insulinomas).

Способами даного винаходу можна лікувати різні нейрофізіологічні порушення, які, як вважають, виникають внаслідок пошкодження тканин, що збуджуються. Хронічні захворювання, які можуть бути пов'язані з пошкодженнями нейронів, і які можна лікувати способами даного винаходу, включають захворювання, пов'язані з центральною нервовою системою і/або периферійною нервовою системою, включаючи вікову втрату пізнавальної функції і старечу деменцію, хронічні приступи, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, деменцію, втрату пам'яті, бічний аміотрофічний склероз, розсіяний склероз, туберозний склероз, хворобуThe methods of the present invention can be used to treat various neurophysiological disorders believed to result from damage to excitable tissues. Chronic diseases that can be associated with neuronal damage and that can be treated by the methods of the present invention include diseases related to the central nervous system and/or the peripheral nervous system, including age-related cognitive loss and senile dementia, chronic seizures, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, dementia, memory loss, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, tuberous sclerosis,

Вілсона, церебральний і прогресуючий супрануклеарний параліч, гуамську хворобу, Гемжу деменцію, хвороби, що викликаються пріонами, такі як губчасті енцефалопатії, наприклад, хвороба Крейтцфельдта-Якоба, хвороба Хантінгтона, міотонічна дистрофія, атаксія Фрідріха і інші атаксії а також синдром (СШев ає ІаWilson's disease, cerebral and progressive supranuclear palsy, Guam disease, Goem's dementia, diseases caused by prions, such as spongiform encephalopathies, for example, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, myotonic dystrophy, Friedrich's ataxia and other ataxias, and the syndrome

Тошгеце'5, захворювання, пов'язані з нападами, такими як епілепсія і хронічні напади, удар, травми головного і спинного мозку, АІО5 деменцію, алкоголізм, аутизм, ретинальну ішемію, глаукому, порушення автономних функцій, таких як гіпертонія і порушення сну, які включають (але ними не обмежуються) шизофренію, шизоафективні розлади, дефіцит уваги, дистимічний розлад, основний депресивний розлад, манії, обсесивно- компульсивний розлад, розлади, пов'язані з використанням психоактивних речовин, неспокій, паніку, а також однополярні або біполярні афективні розлади. Додаткові нейропсихіатричні і нейродегенеративні розлади включають, наприклад, ті, які перераховані в Атегісап Рзуспіайніс Авзосіайоп'є Юіадповіїс апа 5іаїйівіїса! тапиаї! ої Мепіа! Оізогаєг: (О5М), сама остання версія якого включена сюди як посилання.Toshgetse'5, diseases associated with seizures, such as epilepsy and chronic seizures, stroke, brain and spinal cord injuries, AIO5 dementia, alcoholism, autism, retinal ischemia, glaucoma, disorders of autonomic functions, such as hypertension and sleep disorders, which include (but are not limited to) schizophrenia, schizoaffective disorders, attention deficit disorder, dysthymic disorder, major depressive disorder, mania, obsessive-compulsive disorder, substance use disorders, anxiety, panic, and unipolar or bipolar affective disorders Additional neuropsychiatric and neurodegenerative disorders include, for example, those listed in Ategisap Rzuspiainis Avzosiaiopye Yuiadpoviis apa 5iaiiviisa! tapiai! oh Mapia! Oizogaeg: (O5M), the very latest version of which is included here as a reference.

У іншому варіанті рекомбінантні химеричні молекули токсинів, що включають ЕРО, можна використати для терапевтичного доставляння токсинів для лікування проліферативних захворювань, таких як рак, або вірусних захворювань, таких як підгострий склерозируючий паненцефаліт. 5.4. Фармацевтичні препарати і їх введенняIn another embodiment, recombinant chimeric toxin molecules comprising EPO can be used for therapeutic delivery of toxins to treat proliferative diseases such as cancer or viral diseases such as subacute sclerosing panencephalitis. 5.4. Pharmaceutical drugs and their administration

Відповідно з даним винаходом, ЕРО, його аналоги, міметики, фрагменти еритропоетину, гібридні молекули еритропоетину, молекули, зв'язуючі рецептори еритропоетину, агоністи еритропоетину, ниркоподібний еритропоетин, еритропоетини мозку, їх мутанти, і що стосуються цього класу, можна вводити парентерально, через слизову, наприклад, перорально, назально, ректально, внутрішньовагінально, під язик, під слизову або черезшкірно. Переважним способом введення є парентеральне введення, наприклад, за допомогою внутрішньовенної або внутрішньоочеревинної ін'єкції, включаючи також (але цим не обмежуючись) внутрішньоартеріальне, внутрішньом'язове, внутрішньошкірне або підшкірне введення. Переважним способом введення невеликих молекул імітаторів ЕРО є пероральне введення.In accordance with the present invention, EPO, its analogs, mimetics, erythropoietin fragments, erythropoietin hybrid molecules, erythropoietin receptor binding molecules, erythropoietin agonists, renal erythropoietin, brain erythropoietins, mutants thereof, and related to this class can be administered parenterally, via mucosal, for example, orally, nasally, rectally, intravaginally, sublingually, submucosally, or transdermally. The preferred method of administration is parenteral administration, for example by intravenous or intraperitoneal injection, including (but not limited to) intra-arterial, intramuscular, intradermal or subcutaneous administration. Oral administration is the preferred route of administration of small molecule EPO mimics.

Суб'єктом, для якого периферійне введення ЕРО є ефективним терапевтичним режимом, переважно є людина, але це може бути і будь-яка тварина, переважний ссавець. Таким чином, як легко зрозуміти фахівцям, способи і фармацевтичні композиції даного винаходу особливо придатні для введення будь-якій тварині, особливо ссавцю, включаючи (але ними не обмежуючись) домашніх тваринних, таких як кішки і собаки, сільськогосподарських тварин, таких як (але ними не обмежуючись) корови, коні, кози, вівці і свині; диких тварин (незалежно від того, зустрічаються вони в дикій природі або в зоологічному саду), тварин, що використовуються для наукових досліджень, таких як миші, пацюки, кролики, кози, вівці, свині, собаки, кішки і т.д. Як було указано вище, одомашнені тварини, включаючи домашніх тварин і робоча худоба, є кандидатами як для з'ясування нейрозахисних переваг даного винаходу, так і для оцінки посилення пізнавальних функцій.The subject for whom the peripheral introduction of EPO is an effective therapeutic regimen is mostly a human, but it can be any animal, preferably a mammal. Thus, as will be readily understood by those skilled in the art, the methods and pharmaceutical compositions of the present invention are particularly suitable for administration to any animal, particularly a mammal, including (but not limited to) domestic animals such as cats and dogs, farm animals such as (but not limited to) (not limited to) cows, horses, goats, sheep and pigs; wild animals (whether found in the wild or in a zoo), animals used for scientific research, such as mice, rats, rabbits, goats, sheep, pigs, dogs, cats, etc. As indicated above, domesticated animals, including pets and working livestock, are candidates both for elucidating the neuroprotective benefits of this invention and for evaluating cognitive enhancement.

Нейрологічні ураження, зумовлені гіпоксією, а також гострі і хронічні розлади, включаючи епілепсію, є звичайним явищем серед таких тварин, і таким чином вони є кандидатами для лікування Крім того, як указано вище, посилення пізнавальних функцій у тварин (не людей) є перевагою даного винаходу, в тому, що навчання, тренування, і збереження вивченої поведінки можна поліпшити, закріпити і зберегти, використовуючи напучення даного винаходу. У результаті витрати і психологічні зусилля власника домашніх улюбленців знижуються. Наприклад, меншає, час, необхідний для тренування собак і інших домашніх тварин.Hypoxia-induced neurological damage, as well as acute and chronic disorders, including epilepsy, are common in such animals and thus are candidates for treatment.In addition, as indicated above, cognitive enhancement in animals (not humans) is an advantage of this of the invention, in that learning, training, and retention of learned behavior can be improved, consolidated, and maintained using the teachings of this invention. As a result, costs and psychological efforts of pet owners are reduced. For example, it reduces the time needed to train dogs and other pets.

Крім того, дикі тварини, яких звичайно буває важко тренувати, можуть виявитися кращими кандидатами для тренування за способом даного винаходу. 5.4.1. Композиція і ефективна дозаIn addition, wild animals, which are usually difficult to train, may be better candidates for training according to the method of the present invention. 5.4.1. Composition and effective dose

У даному винаході запропоновані також фармацевтичні композиції. Фармацевтичні композиції, що включають ЕРО і модулятор активності ЕРО рецепторів можна вводити пацієнту в терапевтично ефективних дозах для захисту тканини, що збуджується від пошкоджень, для посилення функцій тканини, що збуджується, або для доставляння сполуки до тканини, що збуджується. Заявники виявили, що підвищена доза ЕРО переважна для модулювання тканини, що збуджується і для захисту її від ураження.The present invention also provides pharmaceutical compositions. Pharmaceutical compositions comprising EPO and a modulator of EPO receptor activity can be administered to a patient in therapeutically effective doses to protect the excitable tissue from damage, to enhance the functions of the excitable tissue, or to deliver the compound to the excitable tissue. Applicants have found that an increased dose of EPO is preferred for modulating excitable tissue and protecting it from injury.

Вибір переважної ефективної дози визначає фахівець з урахуванням декількох факторів, які повинні бути відомі фахівцеві. Такі фактори включають конкретну форму еритропоетину і її фармакокінетичні параметри,The choice of the preferred effective dose is determined by the expert taking into account several factors that should be known to the expert. Such factors include the specific form of erythropoietin and its pharmacokinetic parameters,

такі як біодоступність, метаболізм, термін напіврозпаду і т.д., які повинні бути встановлені під час звичайних процедур, які звичайно використовують для одержання регулюючих дозволів для фармацевтичних сполук.such as bioavailability, metabolism, half-life, etc., which must be established during the normal procedures normally used to obtain regulatory approvals for pharmaceutical compounds.

Інші фактори, що розглядаються для встановлення дози включають хворобливий стан або захворювання, що підлягає лікуванню, або переваги, яких необхідно досягти для здорового індивідуума, масу тіла пацієнта, спосіб введення, чи проводиться введення в гострий або в хронічний період, супутнє лікування і інші фактори, які, як добре відомо, впливають на ефективність фармацевтичних агентів, що вводяться. Таким чином, точні розміри дози повинні визначатися відповідно з думкою практикуючого лікаря і супутніх кожному пацієнту обставин, наприклад, в залежності від стану і імунного статусу кожного пацієнта, відповідно стандартній клінічній практиці.Other factors considered in setting the dose include the disease state or disease to be treated or the benefits to be achieved in a healthy individual, the patient's body weight, the route of administration, whether the administration is acute or chronic, concomitant treatment, and other factors. , which are well known to affect the efficacy of administered pharmaceutical agents. Thus, the exact size of the dose should be determined in accordance with the opinion of the practicing physician and the circumstances accompanying each patient, for example, depending on the condition and immune status of each patient, in accordance with standard clinical practice.

У одному варіанті в даному винаході запропонована фармацевтична композиція в одиничній дозованій формі, адаптована для модуляції тканини, що збуджується, посилення пізнавальної функції, або для доставляння сполук через ендотеліальні щільні сполуки, яка включає в одиничній дозі ефективну нетоксичну кількість в інтервалі від біля 50000 до 500000 Одиниць, від 60000 до 500000 Одиниць, від 70000 до 500000In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition in a unit dosage form adapted for modulating excitable tissue, enhancing cognitive function, or for delivering compounds across endothelial tight junctions, which comprises in a unit dose an effective non-toxic amount in the range of about 50,000 to 500,000 Units, from 60,000 to 500,000 Units, from 70,000 to 500,000

Одиниць, від 80000 до 500000 Одиниць, від 90000 до 500000 Одиниць, від 100000 до 500000 Одиниць, від 150000 до 500000 Одиниць, від 200000 до 500000 Одиниць, від 250000 до 500000 Одиниць, від 300000 до 500000 Одиниць, від 350000 до 500000 Одиниць, від 400000 до 500000 Одиниць, або від 450000 до 500000Units, from 80000 to 500,000 units, from 90000 to 500,000 units, from 100000 to 500,000 units, from 150000 to 500,000 units, from 200,000 to 500,000 units, from 250000 to 500,000 units, from 300,000 to 500,000 units, from 350000 to 500,000 units from 400,000 to 500,000 Units, or from 450,000 to 500,000

Одиниць ЕРО, модулятора активності рецепторів ЕРО, або модулятора ЕРО-активованого рецептора, і фармацевтично прийнятний носій. У переважному варіанті ефективна нетоксична кількість ЕРО знаходиться в інтервалі від біля 500000 до 5000000 Одиниць.Units of EPO, a modulator of EPO receptor activity, or a modulator of EPO-activated receptor, and a pharmaceutically acceptable carrier. In a preferred embodiment, the effective non-toxic amount of EPO is in the range of about 500,000 to 5,000,000 Units.

У одному варіанті таку фармацевтичну композицію ЕРО можна вводити систематично для захисту тканин, що збуджуються від уражень, посилення функцій тканин, що пошкоджуються, або для доставляння сполук до тканин, що збуджуються. Таке введення можна здійснювати парентерально, через слизову, наприклад, перорально, через ніс, ректально, внутрішньовагінально, під язик, під слизову або черезшкірно. Переважним способом введення є парентеральне, наприклад, за допомогою внутрішньовенних або внутрішньоочеревинних ін'єкцій, і також включаючи (але ними не обмежуючись) внутрішньоартеріальне, внутрішньом'язове, внутрішньошкірне і підшкірне введення.In one embodiment, such an EPO pharmaceutical composition can be administered systemically to protect excitable tissues from injury, enhance the functions of damaged tissues, or deliver compounds to excitable tissues. Such administration can be carried out parenterally, through the mucosa, for example, orally, through the nose, rectally, intravaginally, under the tongue, under the mucosa or transdermally. The preferred route of administration is parenteral, such as by intravenous or intraperitoneal injection, and also includes (but is not limited to) intra-arterial, intramuscular, intradermal and subcutaneous administration.

У переважному варіанті ЕРО можна вводити систематично в дозах від 2000 до 10000 одиниць/кг маси тіла, переважно біля 2000-5000 одиниць/кг маси тіла, і найбільш переважно 5000 одиниць/кг маси тіла, за один раз. Цієї ефективної дози повинно бути досить для досягнення рівнів ЕРО в сироватці більше ніж біля 10000, 15000 або 20000 мод/мл сироватки після введення ЕРО. Такі рівні вмісту ЕРО в сироватці можуть бути досягнуті приблизно через 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 годин після введення. При необхідності такі дози можна повторювати. Наприклад, введення можна повторювати щодня доти, поки існує клінічна необхідність, або після відповідних інтервалів, наприклад, кожні 1-12 тижнів, переважно кожні 3-8 тижнів. У одному з варіантів ефективну кількість ЕРО і фармацевтично прийнятного носія можна вмістити в одну дозову ампулу або інший контейнер. У одному з варіантів ЕРО є нееритропоетичним, тобто він здатний виявляти вказану вище активність, але не спричиняти при цьому підвищення концентрації гемоглобіну, або не викликати гематокрит.In a preferred embodiment, EPO can be administered systematically in doses of 2000 to 10000 units/kg of body weight, preferably about 2000-5000 units/kg of body weight, and most preferably 5000 units/kg of body weight, at a time. This effective dose should be sufficient to achieve serum EPO levels greater than about 10,000, 15,000 or 20,000 mod/ml of serum after administration of EPO. Such levels of EPO in the serum can be reached approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 hours after administration. If necessary, such doses can be repeated. For example, administration may be repeated daily as long as clinically necessary, or at appropriate intervals, such as every 1-12 weeks, preferably every 3-8 weeks. In one option, an effective amount of EPO and a pharmaceutically acceptable carrier can be contained in a single dosage ampoule or other container. In one of the options, EPO is non-erythropoietic, that is, it is capable of exhibiting the above activity, but not causing an increase in hemoglobin concentration, or not causing a hematocrit.

У іншому варіанті ЕРО вводять в дозі, яка перевищує дозу, необхідну для максимальної стимуляції еритропоезу.In another variant, EPO is administered in a dose that exceeds the dose necessary for maximum stimulation of erythropoiesis.

Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть включати терапевтично ефективну кількість сполуки і фармацевтично прийнятного носія. У конкретному варіанті термін "фармацевтично прийнятний" означає затверджений регулюючим органом федерального уряду або уряду штату, або перерахований в фармакопеїThe pharmaceutical compositions of this invention may include a therapeutically effective amount of the compound and a pharmaceutically acceptable carrier. In a specific embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" means approved by a regulatory agency of the federal or state government, or listed in a pharmacopoeia

США або інших загальновідомих фармакопіях для використання для тварин, і більш конкретно, для людей.US or other generally known pharmacopoeias for use in animals, and more specifically, in humans.

Термін "носій" стосується разчинювача, ад'юванта, ексципієнта або носія, з якими вводять ліки. Такі фармацевтичні носії можуть бути стерильними рідинами, такими як сольові розчини у воді або маслах, включаючи мінеральні, тваринні, рослинні або синтетичні масла, такі як арахісове масло, соєва молія, мінеральне масло, кунжутна олія і т.п. Сольовий фізіологічний розчин є переважним носієм, якщо фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенно. Фізіологічні сольові розчини і водні розчини декстрози і гліцерину можна також використати як рідкі носії особливо для розчинів для ін'єкцій. Відповідні фармацевтичні ексципієнти включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол і т.п. При бажанні композиція може також містити невеликі кількості змочувальних і емульгуючих агентів або агентів, буферуючих величину рН. Такі композиції можуть бути в формі розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, пілюль, капсул, порошків, композицій з уповільненим виділенням активної речовини і т.п. Композиції можуть бути приготовані в формі супозиторій з традиційними зв'язуючими і носіями, такими як тригліцериди. Сполуки даного винаходу можуть бути в нейтральній формі або в формі солей. Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені з вільними аміногрупами, як ті, які одержані з хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислотами і т.п., і ті, які утворені з вільною карбоксильною групою, такі, які одержані з гідроксидами натрію, калію, амонію, кальцію, заліза, ізопропіламіном, триетиламіном, 2-етиламіноетанолом, гістидином, прокаїном і т.д. Приклади відповідних фармацевтичних носіїв розкриті в "Нетіпдіоп'є Рнаппасешііса! Зсіеєпсев" ру Е.МУ. Мапіп. Такі композиції повинні містити терапевтично ефективну кількість сполуки, переважно в чистому вигляді, разом з відповідною кількістю носія, з тим, щоб забезпечити потрібну форму для відповідного введення пацієнту. Композиція повинна відповідати способу введення.The term "carrier" refers to the diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the drug is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as saline solutions in water or oils, including mineral, animal, vegetable or synthetic oils such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Saline is the preferred carrier if the pharmaceutical composition is administered intravenously. Physiological saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, especially for solutions for injections. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene glycol, water, ethanol, etc. . If desired, the composition may also contain small amounts of wetting and emulsifying agents or pH buffering agents. Such compositions can be in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, compositions with delayed release of the active substance, etc. The compositions can be prepared in the form of suppositories with traditional binders and carriers, such as triglycerides. The compounds of this invention can be in neutral form or in the form of salts. Pharmaceutically acceptable salts include salts formed with free amino groups, such as those obtained from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, and the like, and those formed with a free carboxyl group, such as those obtained with sodium hydroxides , potassium, ammonium, calcium, iron, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc. Examples of appropriate pharmaceutical carriers are disclosed in "Netipdiopye Rnappasesshiisa! Zsieepsev" ru E.MU. Mapip. Such compositions should contain a therapeutically effective amount of the compound, preferably in pure form, together with an appropriate amount of carrier, in order to provide the appropriate form for appropriate administration to the patient. The composition should correspond to the method of administration.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для перорального введення, можуть бути представлені у вигляді капсул або таблеток; у вигляді порошків або гранул; у вигляді розчинів, сиропів або суспензій (у водних або не водних рідинах); у вигляді їстівних пінок або кремів; або у вигляді емульсій. Таблетки або тверді желатинові капсули можуть містити лактозу, крохмаль або їх похідні; стеарат магнію, натрійсахарин, целюлозу, карбонат магнію, стеаринову кислоту або їх солі. М'які желатинові капсули можуть включати рослинні масла, віск, жири, напівтверді або рідкі поліоли і т.д. Розчини і сиропи можуть містити воду, поліоли і цукор.Pharmaceutical compositions adapted for oral administration can be presented in the form of capsules or tablets; in the form of powders or granules; in the form of solutions, syrups or suspensions (in aqueous or non-aqueous liquids); in the form of edible foams or creams; or in the form of emulsions. Tablets or hard gelatin capsules may contain lactose, starch or their derivatives; magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, stearic acid or their salts. Soft gelatin capsules may include vegetable oils, waxes, fats, semi-solid or liquid polyols, etc. Solutions and syrups may contain water, polyols and sugar.

Активний агент, призначений для перорального введення, може бути покритий (або може бути в суміші 3)The active agent intended for oral administration may be coated (or may be in a mixture 3)

матеріалом, який сповільнює руйнування і/або абсорбцію активного агента в шлунково-кишковому тракті (наприклад, гліцерил моностеарат або гліцерил дистеарат). Так, можна досягнути уповільненого виділення активного агента протягом багатьох годин і, при необхідності, активний агент можна захистити від розкладання всередині шлунка. Фармацевтичні композиції для перорального введення можуть бути створені так, щоб полегшити виділення активного агента в конкретному, місці шлунково-кишкового тракту за рахунок специфічних значень рН або умов ферментування.a material that slows down the destruction and/or absorption of the active agent in the gastrointestinal tract (for example, glyceryl monostearate or glyceryl distearate). Thus, it is possible to achieve a delayed release of the active agent for many hours and, if necessary, the active agent can be protected from decomposition inside the stomach. Pharmaceutical compositions for oral administration can be designed to facilitate the release of the active agent at a specific location in the gastrointestinal tract due to specific pH values or fermentation conditions.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для черезшкірного введення можуть бути представлені у вигляді окремих пластирів, які повинні залишатися в тісному контакті з епідермісом реципієнта протягом тривалого проміжку часу. Фармацевтичні композиції, адаптовані для зовнішнього застосування, можуть бути представлені у вигляді мазей, кремів, суспензій, лосьйонів, порошків, розчинів, паст, гелей, спреїв, аерозолей або масел для поверхневого нанесення на шкіру, рот, очі або інші зовнішні тканини, звичайно використовують мазь для зовнішнього застосування або крем. Якщо композиція приготована у вигляді мазі, активний інгредієнт може бути використаний або з парафіновою, або з мазевою основою, що змішується з водою. У іншому варіанті активний інгредієнт може бути введений в крем на основі масла-в-воді або води-в-масліPharmaceutical compositions adapted for transdermal administration can be presented in the form of separate patches, which must remain in close contact with the epidermis of the recipient for a long period of time. Pharmaceutical compositions adapted for external use can be presented in the form of ointments, creams, suspensions, lotions, powders, solutions, pastes, gels, sprays, aerosols or oils for surface application to the skin, mouth, eyes or other external tissues, usually using ointment for external use or cream. If the composition is prepared in the form of an ointment, the active ingredient can be used with either a paraffin or a water-miscible ointment base. Alternatively, the active ingredient may be incorporated into an oil-in-water or water-in-oil cream.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для зовнішнього введення для очей, включають очні краплі. У цих композиціях активний інгредієнт може бути розчинений або суспендований у відповідному носії, наприклад, у водному розчинювачі. Фармацевтичні композиції, адаптовані для поверхневого введення в рот, включають коржики, пастилки і полоскання для рота.Pharmaceutical compositions adapted for external administration to the eye include eye drops. In these compositions, the active ingredient can be dissolved or suspended in a suitable carrier, for example, in an aqueous solvent. Pharmaceutical compositions adapted for topical oral administration include lozenges, lozenges, and mouth rinses.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для введення через ніс, можуть включати тверді носії, такі як порошки (переважно з розміром частинок в інтервалі від 20 до 500мкм). Порошки можна вводити шляхом вдихання через ніс, тобто швидкою інгаляцією через ніс з контейнера з порошком, який тримають близько до носа. У іншому варіанті композиції, адаптовані для введення через ніс, можуть містити рідкий носій, наприклад спреї для носа або краплі для носа. Ці композиції можуть включати водні або масляні розчини активного інгредієнта. Композиції для введення шляхом інгаляцій можуть постачатися в спеціальних пристроях, включаючи (але ними не обмежуючись) аерозолі під тиском, розпилювачі або пристрої для вдування, які можуть бути сконструйовані таким чином, щоб забезпечити певну дозу активного інгредієнта. У переважному варіанті фармацевтичні композиції даного винаходу вводять через носову порожнину в легені.Pharmaceutical compositions adapted for nasal administration may include solid carriers such as powders (preferably with a particle size in the range of 20 to 500 µm). Powders can be administered by nasal inhalation, that is, rapid inhalation through the nose from a powder container held close to the nose. In another embodiment, compositions adapted for nasal administration may contain a liquid carrier, such as nasal sprays or nasal drops. These compositions may include aqueous or oily solutions of the active ingredient. Compositions for administration by inhalation may be supplied in special devices, including but not limited to pressurized aerosols, nebulizers, or insufflators, which may be designed to deliver a specific dose of the active ingredient. In a preferred embodiment, the pharmaceutical compositions of this invention are administered through the nasal cavity into the lungs.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для ректального введення, можуть бути представлені у вигляді супозиторій або клізм. Фармацевтичні композиції, адаптовані для вагінального введення, можуть бути представлені композиціями у вигляді песарій, тампонів, кремів, гелей, паст, пінок або спреїв.Pharmaceutical compositions adapted for rectal administration can be presented in the form of suppositories or enemas. Pharmaceutical compositions adapted for vaginal administration can be represented by compositions in the form of pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or sprays.

Фармацевтичні композиції, адаптовані для парентерального введення, включають водні і не водні стерильні розчини або суспензії для ін'єкцій, які можуть містити антіоксиданти, буфери, бактеріостати і розчинені речовини, які роблять композиції практично ізотоничними з кров'ю передбачуваного реципієнта. Інші компоненти, які можуть бути присутнім в таких композиціях, включають, наприклад воду, спирти, поліоли, гліцерин і рослинні масла. Композиції, адаптовані для парентерального введення, можуть бути представлені в контейнерах, що містять одиничну або множинні дози, наприклад, в запаяних ампулах і пробірках, і можуть зберігатися у висушеному заморожуванням (ліофілізованому) стані, і при цьому безпосередньо перед використанням необхідно всього лише додати стерильний рідкий носій, наприклад, стерильний фізіологічний сольовий розчин для ін'єкцій. Розчини і суспензії для негайного введення можна приготувати з стерильних порошків, гранул або таблеток.Pharmaceutical compositions adapted for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile solutions or suspensions for injection, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that render the compositions substantially isotonic with the blood of the intended recipient. Other components that may be present in such compositions include, for example, water, alcohols, polyols, glycerin, and vegetable oils. Formulations adapted for parenteral administration may be presented in single or multiple dose containers, such as sealed ampoules and tubes, and may be stored in a freeze-dried (lyophilized) state, requiring only the addition of sterile liquid carrier, for example, sterile physiological saline solution for injection. Solutions and suspensions for immediate administration can be prepared from sterile powders, granules or tablets.

У переважному варіанті композиції приготовляють відповідно до рутинних процедур приготування фармацевтичних композицій, адаптованих для внутрішньовенного введення людям. Звичайно композиції для внутрішньовенного введення є розчинами в стерильних ізотонічних водних буферах. При необхідності композиції можуть також включати сприяючі розчиненню агенти і локальні анестезуючі агенти, такі як лідокаїн, для полегшення болю на ділянці ін'єкції. Звичайно інгредієнти постачають або окремо, або змішаними разом в одиничній дозовій формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку, або концентрату, що не містить води в герметизованих контейнерах, таких як ампули або саше, з зазначенням кількості активного агента. Якщо композиції вводять за допомогою вдуваннь, вони можуть бути розподілені у флакони для вдування, які містять стерильної чистоти воду або фізіологічний сольовий, розчин. Якщо композицію вводять за допомогою ін'єкції, ампула зі стерильною водою або фізіологічним розчином для ін'єкцій може бути представлена такою, щоб інгредієнти можна було змішувати перед введенням.In a preferred embodiment, the compositions are prepared according to routine procedures for the preparation of pharmaceutical compositions adapted for intravenous administration to humans. Usually, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffers. If necessary, the composition may also include solubilizing agents and local anesthetic agents, such as lidocaine, to relieve pain at the injection site. Usually, the ingredients are supplied either separately or mixed together in a unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or concentrate that does not contain water in sealed containers, such as ampoules or sachets, with an indication of the amount of active agent. If the compositions are administered by inhalation, they may be dispensed into vials for inhalation containing sterile water or physiological saline solution. If the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water or saline for injection may be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.

Супозиторії звичайно містять активний інгредієнт в інтервалі від 0,5 до 1Оваг.9о; композиції для перорального введення переважно містять від 10 до 95ваг.9о активного інгредієнта.Suppositories usually contain an active ingredient in the range from 0.5 to 1Owag.9o; compositions for oral administration preferably contain from 10 to 95 g.9 o of the active ingredient.

У даному винаході запропоновані також фармацевтична упаковка або набір, що включає один або більше контейнерів, заповнені одним або більше інгредієнтів фармацевтичної композиції даного винаходу.The present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention.

Необов'язково такий контейнер (контейнери) супроводяться анотацією в формі, наказаній урядовим агентством, регулюючим виробництво, застосування і продаж фармацевтичних або біологічних продуктів, причому в цій анотації відображене затвердження агентством виготовлення, застосування або продажу для введення людям. 5.4.2. Способи введенняSuch container(s) need not necessarily be accompanied by an annotation in the form prescribed by the government agency regulating the manufacture, use and sale of pharmaceutical or biological products, and this annotation reflects the agency's approval of the manufacture, use or sale for human administration. 5.4.2. Methods of introduction

У даному винаході запропоновані композиції і способи периферійного введення, ЕРО для посилення функцій або захисту тканин, що збуджуються і для доставляння сполук до таких тканин. Як було указано вище, даний винахід заснований частково на виявленні того факту, що периферійно введені ЕРО мають безпосередні нейрозахисні або нейропідсилюючі властивості в тканинах, що збуджуються, таких як тканини центральної нервової системи, тканини периферійної нервової, системи або тканин серця. Тканини, що збуджуються, в тому значенні як тут використаний цей термін, включають (але ними не обмежуються) нейрональні тканини центральної і периферійної нервових систем і тканини серця. У цьому розділі розкриті такі сполуки і способи їх введення.The present invention proposes compositions and methods of peripheral administration, EPO for enhancing the functions or protection of excitable tissues and for delivering compounds to such tissues. As indicated above, the present invention is based in part on the discovery that peripherally administered EPOs have direct neuroprotective or neuroenhancing properties in excitable tissues, such as central nervous system tissues, peripheral nervous system tissues, or cardiac tissues. Excitable tissues, as used herein, include (but are not limited to) neuronal tissues of the central and peripheral nervous systems and heart tissue. This section describes such compounds and methods of their administration.

Даний винахід пропонує введення ЕРО і модуляторів активності ЕРО способом введення, який відрізняється від безпосереднього введення в центральну нервову систему, і терміни "периферійна" іThe present invention proposes the administration of EPO and modulators of EPO activity by a method of administration that differs from direct administration into the central nervous system, and the terms "peripheral" and

"системна" включають ці різні способи. Периферійне введення включає пероральне або парентеральне введення, таке як внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, ректальне, під слизову або внутрішньошкірне. Інші способи придатні для введення описаних вище агентів. Тут запропоновано введення як в гострих випадках, так і при хронічних захворюваннях."systemic" includes these various methods. Peripheral administration includes oral or parenteral administration, such as intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, rectal, submucosal, or intradermal. Other methods are suitable for administering the agents described above. It is recommended to introduce it both in acute cases and in chronic diseases.

У одному з варіантів, наприклад, ЕРО можна доставляти в системі з виділенням, що контролюється.In one embodiment, for example, ERO can be delivered in a controlled release system.

Наприклад, поліпептид можна вводити, використовуючи внутрішньовенні вливання, осмотичні насоси, що імплантуються, черезшкірні пластирі, ліпосоми або інші способи введення. У одному з варіантів можна використати насос (див. І апдег, зирга; Зейоп, 1987, САС Ст. Неї. Віотесі Епд. 14: 201; Виспмаїа еї аї., 1980,For example, the polypeptide can be administered using intravenous infusions, implantable osmotic pumps, transdermal patches, liposomes, or other methods of administration. In one of the options, you can use a pump (see I apdeg, zirga; Zeyop, 1987, SAS St. Nei. Viotesi Epd. 14: 201; Vispmaia ei ai., 1980,

Зигдегу 88: 507; Зацаек еї а!., 1989, М. Епаді. У. Мей. 321: 574). У іншому варіанті сполуки можна доставити в носії, зокрема в ліпосомі (див. І апдег, Зсієпсе 249: 1527-1533 (1990); Тгеаї єї аї., іп Прозотез іп Ше Тнегару оїZygdegu 88: 507; Zatsaek ei a!., 1989, M. Epadi. U. May. 321: 574). In another embodiment, the compounds can be delivered in a carrier, in particular in a liposome (see I apdeg, Zsiepse 249: 1527-1533 (1990); Tgeai yei ai., ip Prozotez ip She Tnegaru oi

Іп'есйоиз Оізеазе апа. Сапсег, І оре7-Вегевієїп апа РіаІєг (едв5.), 55, Мем Моїк, рр.353-365 (1989); МО 91/04014; патент США Мо.4704355; І оре2-Вегевівіп, іріа., рр.317-327; зеє депегайПу іріа.). У іншому варіанті можна використати полімерні матеріали (див. Медіса! Арріїсайопе ої СопігоПей Реїєазе, І апдег апа М/ізе (еаз.5, САС Ргевв: Воса ВНаїйоп, Ріогпда, 1974; СопігоПей Од Віоамайарійу, Огпд Ргодисі Оезідп апаIpesioiz Oizease apa. Sapseg, I ore7-Vegevieip apa RiaIeg (edv5.), 55, Mem Moik, pp. 353-365 (1989); MO 91/04014; US patent Mo. 4704355; I ore2-Vegevivip, irya., 317-327; zee depegayPu iria.). In another option, you can use polymeric materials (see Medisa! Arriisaiope oi SopigoPei Reyease, I apdeg apa M/ize (eaz.5, SAS Rgevv: Vosa VNaiiop, Riogpda, 1974; SopigoPei Od Viomaiariyu, Ogpd Rgodisi Oezidp apa

Репогптапсе, бтоїєп апа Ваї! (едв.), МПеу: Мем/ Моїк (1984); Вапдег апа Рерравз, у. Масготої. сі. Неу.Repogptapse, btoiep apa Vai! (Ed.), MPeu: Mem/ Moik (1984); Wapdeg apa Rerravs, u. Masgotoi si. Neu.

Масготої. Спет. 23: 61, 1953; див також І ему еї а!., 1985, Зсіеєпсе 228: 190; Бигіпд єї а!., 1989, Апп. Меигої. 25:351; Номага єї а!., 1989, 9. Меиговига. 7.1: 105).Masgotoi Spent 23: 61, 1953; see also I emu ei a!., 1985, Zsieepse 228: 190; Bigipd eyi a!., 1989, App. Meigoi. 25:351; Nomaga eyi a!., 1989, 9. Meigoviga. 7.1: 105).

У ще одному варіанті систему з системою виділення, що контролюється можна вмістити поблизу терапевтичної цілі, тобто поблизу мозку, що зажадає лише частину системної дози (див., наприклад, Сооазоп, рр.115-138 іп Меаїса! Арріїсайопе5 ої СопігоПей Реїєазе, моіІ.2, зирга, 1984). Інші системи з виділенням, що контролюється розкриті в огляді І опдег (1990, бсієпсе 249: 1527-1533).In yet another variant, a system with a controlled release system can be placed close to the therapeutic target, that is, close to the brain, which will require only a fraction of the systemic dose (see, for example, Soozop, pp. 115-138 ip Meais! Arriisaiope5 oi SopigoPei Reyease, moI. 2, Zirga, 1984). Other controlled release systems are disclosed in a review by Opdeg I (1990, Biopsy 249: 1527-1533).

У іншому варіанті ЕРО у відповідній формі можна вводити через ніс, перорально, ректально, вагінально або сублінгвально.In another embodiment, ERO in a suitable form can be administered nasally, orally, rectally, vaginally, or sublingually.

У специфічному варіанті може виявитися бажаним вводити ЕРО композиції даного винаходу локально в ділянку, що потребує лікування; цього можна досягти, наприклад (але не як обмеження) локальним вливанням під час хірургічного втручання, поверхневим нанесенням, наприклад, разом з пов'язкою на рану після операції, шляхом ін'єкції за допомогою катетера, за допомогою супозиторій або використовуючи імплантати, причому вказані імплантати є пористим або не пористим матеріалом, включаючи сіаластикові мембрани або волокна.In a specific variant, it may be desirable to introduce the EPO composition of this invention locally into the area requiring treatment; this can be achieved by, for example (but not limited to) local infusion during surgery, topical application such as with a post-operative wound dressing, by injection via a catheter, via suppositories or using implants, where indicated implants are porous or non-porous material, including sialastic membranes or fibers.

Даний винахід можна краще зрозуміти, звернувшись до наступних, не лімітуючих прикладів, які представлені як приклади винаходу. Наступні приклади представлені для того, щоб більш повно проілюструвати переважні варіанти винаходу. Однак їх ніяким чином не потрібно розглядати, як обмежуючі широту об'єму винаходу.The present invention can be better understood by referring to the following non-limiting examples, which are presented as examples of the invention. The following examples are presented to more fully illustrate preferred embodiments of the invention. However, they should in no way be considered as limiting the scope of the invention.

Як тут буде розкрито далі, дослідження, які були розпочаті винахідниками, є стандартними, загальноприйнятими тестами в моделях на тваринах, які дозволяють передбачити профілактичні і лікувальні переваги. 6. Приклад 1As will be further disclosed herein, the studies initiated by the inventors are standard, generally accepted tests in animal models that predict prophylactic and therapeutic benefits. 6. Example 1

Периферійне введення його підвищує пізнавальну функціюPeripheral administration of it increases cognitive function

У цьому прикладі експеримент за просторовою орієнтацією, відомий як тест водного лабіринту Морріса, демонструє ЕРО-індуковане посилення пізнавальної функції у мишей. У цьому тесті невелику прозору платформу вміщують в один сектор плавального басейну з непрозорою водою. Миші, вміщені в плавальний басейн, повинні пливти доти, поки вони не досягнуть платформи для відпочинку, поверхні, що знаходиться нижче, яка невидима для пливучих мишей. Тест зводиться до визначення часу, який потрібний тварині, щоб досягти платформи (тобто проміжку часу, який вони проводять плаваючи). У послідовних дослідах час, необхідний для кожної миші для досягнення платформи, буде зменшуватися як функція пізнавання ними місцеположення. Цей тип експерименту по навчанню включає гіпокамп, оскільки ураження гіпокампа заважають навчанню в цьому тесті.In this example, a spatial orientation experiment known as the Morris water maze test demonstrates EPO-induced enhancement of cognitive function in mice. In this test, a small transparent platform is placed in one sector of a swimming pool with opaque water. Mice placed in a swimming pool must swim until they reach the resting platform, a surface below that is invisible to swimming mice. The test boils down to determining the time it takes the animal to reach the platform (ie the amount of time they spend swimming). In successive trials, the time required for each mouse to reach the platform will decrease as a function of their knowledge of the location. This type of learning experiment involves the hippocampus because hippocampal lesions interfere with learning in this test.

Експерименти проводять в круглому чорному басейні діаметром 150см Довільно визначають чотири точки: північ, південь, захід і схід. Виразні візуальні мітки розташовують біля кожного з чотирьох секторів: наприклад спалахи світла, яскрава стрічка, вміщена в сектор, і т.д. для орієнтування мишей в басейні. Платформу довільно вміщують в один з секторів. Дослід полягає в тому, що тварину вміщують вперед головою в один з секторів басейну і відпускають. Тривалість досліду складає всього 90 секунд. Якщо тварина сама не досягає платформи, її вміщують на платформу ще на 15 секунд. Випробувані відпочивають протягом години, потім їх вміщують для тестування в інший сектор. Протягом денного досліду використовують всі 4 сектори, і тварин тестують протягом 12 послідовних днів (тобто всього 48 дослідів)Experiments are carried out in a round black pool with a diameter of 150 cm. Four points are arbitrarily determined: north, south, west and east. Distinctive visual markers are placed near each of the four sectors: for example, flashes of light, a bright ribbon placed in a sector, etc. for orienting mice in the pool. The platform is arbitrarily placed in one of the sectors. The experiment consists in the fact that the animal is placed head first in one of the sectors of the pool and released. The duration of the experiment is only 90 seconds. If the animal does not reach the platform by itself, it is placed on the platform for another 15 seconds. Subjects rest for an hour, then they are placed for testing in another sector. During the daytime experiment, all 4 sectors are used, and the animals are tested for 12 consecutive days (i.e. 48 experiments in total)

Сам експеримент складається у введенні мишам за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 5000The experiment itself consists in administering 5000 to mice by intraperitoneal injection

Одиниць/кг рекомбінантного людського ЕРО (в продажу під торговою маркою РВОСВІТ, Опіпо-Віоїеси, Іпс.) за 4 години до щоденного тестування, кожний день протягом 12 днів дослідів. Контрольним тваринам ін'єкують сольовий фізіологічний розчин (імітатор).Units/kg of recombinant human ERO (sold under the trade mark RVOSVIT, Opipo-Vioiesi, Ips.) 4 hours before daily testing, every day for 12 days of experiments. Control animals are injected with a physiological saline solution (simulator).

Міру навчання визначають, вимірюючи тривалість часу, який кожна з мишей проводить на платформі. НаThe extent of learning is determined by measuring the length of time each mouse spends on the platform. On

Фіг1А одержані результати представлені як діаграма часу, проведеного на платформі ЕРО-обробленою групою, і групою з ін'єкцією імітатора. Одержані результати показують, що обидві групи тварин проводять на платформі більше часу, тобто вони навчаються більш швидкому досягненню платформи з кожним послідовним днем навчання, але тварини, яким вводили ЕРО, роблять це швидше за групу з ін'єкцією імітатора. Тобто у оброблених ЕРО тварин спостерігається набагато більш швидка "крива навчання", ніж для групи з ін'єкцією імітатора. Якщо виразити результати як різницю між ЕРО-обробленою групою і групою з ін'єкцією імітатора і порівняти результати для цих двох груп, лінія регресії (820,88) показує нахил (0,68), помітно відрізняється від нахилу 1, що явно свідчить на користь ЕРО групи (Фіг.1В). 7. Приклад 2Fig1A results obtained are presented as a diagram of the time spent on the platform by the EPO-treated group and the group with the injection of the simulator. The obtained results show that both groups of animals spend more time on the platform, that is, they learn to reach the platform faster with each successive day of training, but the animals injected with EPO do so faster than the group injected with the simulator. That is, the ERO-treated animals have a much faster "learning curve" than for the group injected with the simulator. Expressing the results as the difference between the EPO-treated group and the simulant-injected group and comparing the results for these two groups, the regression line (820.88) shows a slope (0.68) that is significantly different from the slope of 1, which clearly indicates the benefit of the ERO group (Fig. 1B). 7. Example 2

Периферійне введення ЕРО посилює навчання в стандартному тесті смакової огидиPeripheral administration of EPO enhances learning in a standard taste aversion test

Стандартний тест смакової огиди (СТА), здійснений в цьому прикладі, демонструє, що ЕРО різко впливає на здатність мишей до запам'ятовування і навчання уникати відчуттів неприємного смаку, в цьому випадку речовини, що викликає хворобливе почуття. У цьому прикладі хлорид літію використовують для того, щоб викликати СТА, оскільки хлорид літію надійно спричиняє нездужання і анорексію дозозалежним чином.A standard taste aversion test (TA) performed in this example demonstrates that ERO dramatically affects the ability of mice to remember and learn to avoid unpleasant taste sensations, in this case a substance that causes a painful sensation. In this example, lithium chloride is used to induce STA, as lithium chloride reliably causes malaise and anorexia in a dose-dependent manner.

Подібно природному хворобливому стану, літій викликає СТА, стимулюючи описану вище схему, включаючи виділення цитокінів.Like a natural disease state, lithium induces STA by stimulating the circuitry described above, including the release of cytokines.

Самиць мишей штаму Ваїр/с тренували на обмеження їх повного денного споживання води до одного 5- хвилинного періоду пиття в день, і навчали випивати в цей проміжок часу достатню кількість води, щоб зберігати рівновагу. Тварин ділять на дві групи, і вводять їм внутрішньоочеревинно (ІР) або ін'єкцію імітатора (фізіологічний розчин), або ЕРО (5000 одиниць/кг) за 4 години перед тим, як їм дають нову цукрово-ванільну рідину. Відразу після того, як скінчене пиття цієї солодкої рідини, тваринам вводять або фізіологічний розчин, або дозу літію, що викликає хворобливі відчуття (20мг/кг 0,15М ІСІ, внутрішньоочеревинно). Після цього тварин розбивають на три групи. Першій групі (контрольній) не вводять літій після пиття. Другій групі вводять і літій і ЕРО. Третій групі (імітатор) вводять фізіологічний розчин (без ЕРО) і літій.Female Wair/c mice were trained to limit their total daily water intake to one 5-minute drinking period per day, and trained to drink enough water during this time period to maintain balance. Animals are divided into two groups and given an intraperitoneal (IP) injection of either a simulant (saline) or EPO (5000 units/kg) 4 hours before they are given a new sugar-vanilla liquid. Immediately after drinking this sweet liquid, the animals are injected with either saline or a pain-causing dose of lithium (20mg/kg 0.15M ICI, intraperitoneally). After that, the animals are divided into three groups. The first group (control) is not given lithium after drinking. The second group is administered both lithium and ERO. The third group (simulator) is injected with physiological solution (without EPO) and lithium.

Умовний рефлекс огиди (стандартний тест смакової огиди) визначають, вимірюючи зменшення споживання води після подальшого надання розчину, що викликає хворобливість нової цукрово-ванільної рідини. Після 5 днів відновлення від прийому літію або імітатора тваринам, що зазнають спраги знову надають нову цукрово-ванільну рідину. Порівняння" результатів, одержаних для груп 2 і З в порівнянні з групою 1 (контроль), представлені на Ффіг.2А. День 2 відповідає базовій лінії споживання води після мешкання в клітці для тестування. На 3 день тваринам вводять внутрішньоочеревинно ін'єкцію або фізіологічний розчин, абоThe conditioned aversion reflex (a standard test of taste aversion) is determined by measuring the decrease in water intake after the subsequent administration of a solution that causes the pain of a new sugar-vanilla liquid. After 5 days of recovery from lithium or simulant, thirsty animals are again given a new sugar-vanilla liquid. A comparison of the results obtained for groups 2 and 3 in comparison with group 1 (control) is presented in Fig. 2A. Day 2 corresponds to the baseline of water consumption after living in the test cage. On day 3, the animals are injected intraperitoneally with either saline or solution, or

ЕРО (5000 одиниць/кг) за 4 години до надання нової цукрово-ванільної рідини, з подальшим обробленням літієм або імітуючим фізіологічним розчином (стрілка). Таке оброблення приводить до невеликого зниження споживання рідини всіма групами на З день, що відповідає раніше документованому шкідливому впливу ін'єкцій і новизни рідини. Після видужання перший тест на встановлення СТА не показує будь-якого зменшення споживання рідини в контрольній групі. Однак тварини, яким вводили літій, демонструють практично повну огиду до рідини, незважаючи на відчуття спраги (день 4). Продовження позбавлення води зрештою спричиняє згасання СТА (дні 5-9), але характеризуються помітно уповільненим відновленням тварин, яким вводили ЕРО, що показує крива чорних кругів на Фіг.2А.ERO (5,000 units/kg) 4 hours before providing a new sugar-vanilla liquid, followed by treatment with lithium or simulating saline (arrow). This treatment resulted in a small decrease in fluid intake in all groups on Day 3, consistent with previously documented deleterious effects of injections and fluid novelty. After recovery, the first AST test did not show any reduction in fluid intake in the control group. However, lithium-injected animals show almost complete aversion to liquids despite feeling thirsty (day 4). Continued water deprivation eventually causes STA to fade (days 5-9), but is characterized by a markedly delayed recovery in EPO-treated animals, as shown by the curve of the black circles in Fig. 2A.

Встановлену тут стійкість СТА можна краще оцінити, враховуючи міру водного дефіциту, що спостерігається кожного дня тестування, оскільки ЕРО-оброблені тварини переносять дефіцит води приблизно в два рази краще, ніж тварини, яким вводили імітатор (Фіг.28). Незважаючи на помітно акцентованіThe persistence of STA established here can be better assessed by considering the degree of water deficit observed on each day of testing, as ERO-treated animals tolerate water deficit approximately twice as well as sham-treated animals (Figure 28). Despite being noticeably accented

СТА, продемонстровані ЕРО групою, тварини в цій групі з більшою готовністю досягали поїлки в порівнянні з групою з ін'єкцією імітатора, як видно на Фіг.2С. Стійкість СТА була продемонстрована при повторних ін'єкціях одного тільки літію (без ЕРО), що приводило до ослабленого СТА, величина якого була більша для ЕРО групи (Фіг2А, день 10). Ці результати показують, що попереднє оброблення ЕРО пов'язане з помітним потенціюванням СТА, що викликається літієм. 8. Приклад ЗSTAs demonstrated by the ERO group, animals in this group more readily reached the drinker compared to the simulant-injected group, as seen in Fig. 2C. Persistence of STA was demonstrated with repeated injections of lithium alone (without ERO), resulting in attenuated STA, the magnitude of which was greater for the ERO group (Figure 2A, day 10). These results show that ERO pretreatment is associated with a marked potentiation of lithium-induced STA. 8. Example C

Периферійно введені ЕРО захищають мозок від екситоксинуPeripherally injected EROs protect the brain from excitotoxin

Цей приклад демонструє, що ЕРО долає гематоенцефалічний бар'єр і має нейрозахисну дію для мишей, оброблених нейротоксином каїнатом. У природі існує безліч сполук, які демонструють специфічну токсичність стосовно нейронів. Ці молекули звичайно взаємодіють з ендогенними рецепторами для амінокислотного трансмітера, глутамату, викликаючи потім надмірну стимуляцію і нейрональне ураження. Одна з них, каїнат, речовина, яка широко використовується для вивчення нейрональних уражень, пов'язаних з екцитотоксичністю, є аналогом глутамату. Каїнат є ефективним нейротоксином, який специфічно руйнує нейрони, особливо ті, які розташовані в ділянках з високою щільністю каїнатних рецепторів, таких як гіпокамп, і викликає судоми, ураження мозку і смерть.This example demonstrates that EPO crosses the blood-brain barrier and has a neuroprotective effect in mice treated with the neurotoxin kainate. There are many compounds in nature that exhibit specific neurotoxicity. These molecules usually interact with endogenous receptors for the amino acid transmitter, glutamate, causing subsequent overstimulation and neuronal damage. One of them, kainate, a substance widely used to study neuronal lesions associated with excitotoxicity, is an analog of glutamate. Kainate is a potent neurotoxin that specifically destroys neurons, especially those located in areas with a high density of kainate receptors, such as the hippocampus, and causes seizures, brain damage, and death.

Дослідження нейротоксичності, що приводяться нижче проводили на мишах, використовуючи каїнат. Цю модель використовують для оцінки захисної дії для таких станів, як скронева епілепсія. Парентеральні ін'єкції експериментальним тваринам, таким як пацюки і миші, викликають часткові (лімбічні) судоми дозозалежним чином, які можуть потім розповсюдитися і привести до смерті. Експерименти, представлені в цьому розділі, здійснюють для з'ясування того, чи може периферійно введений ЕРО подолати гематоенцефалічний бар'єр, і якщо так, то чи впливає ЕРО на нейрональну енергетичну рівновагу, і конкретно, чи має він нейрозахисну дією у відношенні каїнату.The neurotoxicity studies below were conducted in mice using kainate. This model is used to evaluate the protective effect for conditions such as temporal lobe epilepsy. Parenteral injections in experimental animals such as rats and mice cause partial (limbic) convulsions in a dose-dependent manner, which can then spread and lead to death. The experiments presented in this section are designed to determine whether peripherally administered EPO can cross the blood-brain barrier, and if so, whether EPO affects neuronal energy balance, and specifically, whether it has a neuroprotective effect with respect to kainate.

Отже, самиць мишей штаму Ваїр/с (вагою в середньому 15-20г) заздалегідь обробляють дозою в 5000 одиниць/кг рекомбінантного людського еритропоетину (ПЕРО; в продажу під торговою маркою РВОСВІТ,Therefore, female mice of the Vair/s strain (weighing on average 15-20 g) are pre-treated with a dose of 5000 units/kg of recombinant human erythropoietin (PERO; sold under the trademark RVOSVIT,

Оппо-Віоїесп, Іпс.) або фізіологічним розчином (імітація), які вводять внутрішньоочеревинною ін'єкцією в конкретні моменти часу до, під час або після введення каїнату (бідта Спетісаї), також внутрішньоочеревинно, в певних концентраціях (маса/кг ваги тіла). Потім за тваринами спостерігають і оцінюють за розвитком активності конвульсій через 20 хвилин після введення каїнату. Кожний дослід закінчують через 60 хвилин після введення дози каїнату. Як представлено на фіг.ЗА, попереднє оброблення ЕРО різко знижує міру судом і затримує настання зіайшв еріієріїсиз у мишей, оброблених каїнатом. Порівняння тварин, оброблених ЕРО і імітатором, демонструє значно меншу кількість смертей тварин, якій ввели дози каїнату в інтервалі 20-3О0мг/кг, що вказує на нейрозахист, забезпечений попереднім обробленням ЕРО. Цифри в дужках під кожним стовпчиком вказують число тварин, яким ввели кожну з доз каїнату. Дозозалежний нейрозахист від каїнату внаслідок введення ЕРО представлений на Фії.ЗВ. Мишам вводили ЕРО (5000 одиниць/кг; внутрішньоочеревинно щоденно протягом п'яти днів). Нейрозахисний ефект кожної дози ЕРО оцінюють, визначаючи виживання після введення каїнату (20мг/кг), що приводить до приблизно 5095 смертності для контрольних тварин (без ЕРО; див. Фіг.ЗА). Стовпчики вказують на збільшення виживаємості ЕРО-оброблених тварин в порівнянні з симуляторно-обробленими тваринами. Як видно на Фіг.3В, нейрозахист зростає з додатковими ЕРО дозами по 5000 Одиниць/кг.Oppo-Vioiesp, Ips.) or physiological solution (imitation), which are administered by intraperitoneal injection at specific moments of time before, during or after the introduction of kainate (bidta Spetisai), also intraperitoneally, in certain concentrations (mass/kg of body weight) . Then the animals are observed and evaluated for the development of convulsive activity 20 minutes after the introduction of kainate. Each experiment is completed 60 minutes after the introduction of a dose of kainate. As shown in Fig. 3A, pretreatment with ERO dramatically reduces the extent of seizures and delays the onset of seizures in kainate-treated mice. A comparison of animals treated with EPO and the simulator shows a significantly lower number of deaths in animals administered doses of kainate in the range of 20-3O0mg/kg, indicating neuroprotection provided by pretreatment with EPO. The numbers in parentheses under each bar indicate the number of animals that received each dose of kainate. Dose-dependent neuroprotection against kainate as a result of EPO administration is presented in Fig. ZV. Mice were injected with EPO (5000 units/kg; intraperitoneally daily for five days). The neuroprotective effect of each dose of EPO was assessed by determining survival after administration of kainate (20 mg/kg), resulting in approximately 5095 deaths for control animals (without EPO; see Fig. 3A). Columns indicate increased survival of EPO-treated animals compared to simulator-treated animals. As can be seen in Fig. 3B, neuroprotection increases with additional ERO doses of 5000 Units/kg.

Нейрозахист, що забезпечується ЕРО, характеризується уповільненим наставанням, що характерно для активації програми генної експресії. Фіг.3С показує, що пов'язана з ЕРО затримка (в хвилинах) загибелі від судом, викликаних однією дозою ЕРО, введеною одночасно з введенням каїнату (20мг/кг), не забезпечує будь- якого негайного захисту, тоді як введення ЕРО за 24 години до введення каїнату підвищує латентність і знижує тяжкість судом і збільшує проміжок часу до смерті. Цей ефект триває аж до 7 днів. 9. Приклад 4The neuroprotection provided by EPO is characterized by a delayed onset, which is characteristic of the activation of the gene expression program. Fig. 3C shows that the EPO-related delay (in minutes) of death from seizures induced by a single dose of EPO administered simultaneously with kainate administration (20 mg/kg) does not provide any immediate protection, whereas administration of EPO at 24 hours before the introduction of kainate increases the latency and reduces the severity of seizures and increases the time to death. This effect lasts up to 7 days. 9. Example 4

Периферійне введення ЕРО захищає мозок від пошкоджень, пов'язаних з ішемієюPeripheral injection of ERO protects the brain from damage associated with ischemia

Дослідження, що передували іп мімо з використанням моделі загальної реперфузії на піщанках показали, що припинення притоку крові до мозку приводить до загибелі клітин і що ЕРО, введений безпосередньо в церебральні шлуночки, захищає мозок від такої загибелі клітин. (ЗаКапака еї аї., 1998, Ргос. Маї). Асай. 5сі.Previous ip mimo studies using a gerbil model of total reperfusion have shown that cessation of blood flow to the brain leads to cell death and that EPO administered directly into the cerebral ventricles protects the brain from such cell death. (ZaKapaka eyi ai., 1998, Rhos. Mai). Asai. 5

О.5.А. 95: 4635). Описані в прикладі експерименти вперше показують, що ЕРО, введений периферійно, захищає нервові клітини від загибелі іп мімо в моделі ішемії на тваринах.O.5.A. 95: 4635). The experiments described in the example show for the first time that peripherally administered EPO protects nerve cells from the death of ip mimo in an animal model of ischemia.

Експеримент, що описується далі був здійснений з використанням моделі оклюзії середньої церебральної артерії, прийнятої моделі локального ішемічного удару. За протоколом, самців пацюків (вагою 250Гг) анестезують фенобарбіталом і витримують при 37"С. Оголяють сонні артерії і перманентно перекривають іпсалатеральну сонну артерію. Іпсалатеральну середню сонну артерію (МСА) оголяють і вводять в її початок катетер. Контралатеральну артерію перекривають затиском на 1 годину. Тварин умертвляють через 24 години, мозок витягують і розрізають на послідовні шари товщиною їмм. Живі тканини візуалізують іп віш відновленням трифенілтетразолієм для того, щоб відрізнити живі тканини від некротичних ділянок. У ішемічній кірці і навколишній напівтемряві клітини загинули.The experiment described below was carried out using the model of occlusion of the middle cerebral artery, the accepted model of local ischemic stroke. According to the protocol, male rats (weighing 250 g) are anesthetized with phenobarbital and kept at 37"C. The carotid arteries are exposed and the ipsilateral carotid artery is permanently closed. The ipsilateral middle carotid artery (MCA) is exposed and a catheter is inserted into its beginning. The contralateral artery is closed with a clamp for 1 hour. . Animals are sacrificed 24 hours later, brains are removed and sectioned into serial µm-thick slices. Viable tissue is visualized by triphenyltetrazolium reconstituted ip to distinguish viable tissue from necrotic areas. In the ischemic cortex and surrounding penumbra, cells have died.

Використовуючи цю МСА модель, ЕРО вводили за допомогою парентеральних ін'єкцій в різні часи до і відразу після ураження і об'єм ураження кількісно визначали за допомогою аналізу комп'ютерного зображення.Using this MSA model, ERO was administered by parenteral injection at various times before and immediately after the lesion and the volume of the lesion was quantified by computer image analysis.

Результати цього аналізу, представлені на фіг.4А, вказують на вплив обробки ЕРО в наступні моменти часу після удару: за 24 години до удару, під час удару і через 3,6 і 9 годин після удару.The results of this analysis, presented in Fig. 4A, indicate the effect of ERO treatment at the following time points after the impact: 24 hours before the impact, during the impact, and 3.6 and 9 hours after the impact.

Як видно на Фіг.4А, ЕРО захищає тканини від некротичного ураження при введенні аж до 6 годин після удару.As can be seen in Fig. 4A, EPO protects tissues from necrotic damage when administered up to 6 hours after the shock.

Цікаво і суперечливоте, що 17-мер, одержаний з ЕРО, який, як повідомлялося раніше, має нейрозахисну активність, промотує ріст нейритів іп міо і мієлінізацію нервових клітин ех мімо (Сатрапа еї аї., 1998, Іпі. У. Мої.It is interesting and controversial that the 17-mer obtained from ERO, which, as previously reported, has neuroprotective activity, promotes the growth of neurites in the myo and myelination of nerve cells in the ex mimo (Satrapa et al., 1998, Ipi. U. Moi.

Меа. 1: 235-41; патент США 5700909, виданий 23 грудня 1997), не впливає на захист проти ураження в цій системі (Фіг.А4В, "17-мер"). Таким чином ця модель, а також інші способи оцінки впливу ЕРО на функції тканини, що збуджується, представлені даним винаходом, можна використати для ідентифікації ЕРО і модуляторів активності ЕРО рецепторів, які можна використати для модулювання функцій тканини, що збуджується, наприклад, для захисту їх від уражень, або для посилення навчання і пізнавальної функції. 10. Приклад 5Mea. 1: 235-41; US Pat. No. 5,700,909, issued Dec. 23, 1997), does not affect protection against damage in this system (Fig. A4B, "17-mer"). Thus, this model, as well as other methods of assessing the effect of EPO on the functions of excitable tissue, presented by the present invention, can be used to identify EPO and modulators of EPO receptor activity that can be used to modulate the functions of excitable tissue, for example, to protect them from lesions, or to enhance learning and cognitive function. 10. Example 5

Периферійне введення ЕРО захищає мозок від гострої травмиPeripheral injection of ERO protects the brain from acute injury

У моделі механічної травми (модель кортикального удару) попереднє оброблення ЕРО, що систематично вводиться захищає мишачий мозок від тупої травми. Для створення травми використовують пневматичний пістон (Сіїррагі Маїме5), Змм діаметром, який може завдати точного удару в череп. Кожну з мишей анестезують і вміщують, жорстко закріпивши в стереотаксичному пристрої так, щоб запобігти рухам голови.In a model of mechanical injury (cortical impact model), pretreatment with systematically administered ERO protects the mouse brain from blunt injury. To create an injury, a pneumatic piston (Siirraghi Maime5), with a diameter of Zmm, is used, which can deliver an accurate blow to the skull. Each mouse is anesthetized and placed, rigidly fixed in a stereotaxic device so as to prevent head movements.

Скальп розтинають для визначення положення тімені, що є порівняльною точкою, за допомогою якої здійснюють початкову установку пістона. Потім пістон встановлюють, переміщуючи його на 2мм назад і 2мм вниз відносно тімені, і здійснюють удар, використовуючи точний імпульс азоту. Такий пристрій дозволяє точно вибрати швидкість пістона (4м/сек.) і ударне зміщення (2мм).The scalp is dissected to determine the position of the crown, which is the reference point with which the initial setting of the piston is carried out. The piston is then set by moving it 2mm back and 2mm down relative to the crown and struck using a precise pulse of nitrogen. Such a device allows you to accurately select the speed of the piston (4m/sec.) and the impact displacement (2mm).

Мишей обробляють ЕРО (5000 Одиниць/кг) за 24 години до, під час ураження, через 3, 6 і 9 годин після, і продовжують далі як денні дози. Через 10 днів після процедури мишей умертвляють, потім досліджують мозок і визначають об'єм некрозу мозку. У мишей, оброблених ін'єкцією імітатора, спостерігається обширна площа некрозу (Фіг.5), що супроводиться сильною інфільтрацією, моноцитів. Навпаки, у тварин, яких захистили від такого ураження, визначалося небагато одноядерних клітин на ділянці ураження, якщо тварин заздалегідь обробляли ЕРО, або ЕРО вводили аж до З годин після ураження. 11. Приклад 6Mice are treated with EPO (5000 Units/kg) 24 hours before, during, 3, 6, and 9 hours after, and continue as daily doses. 10 days after the procedure, the mice are killed, then the brain is examined and the volume of brain necrosis is determined. In mice treated with an injection of the imitator, a large area of necrosis (Fig. 5), accompanied by a strong infiltration of monocytes, is observed. On the contrary, in animals that were protected from such a lesion, few mononuclear cells were determined in the lesion area, if the animals were pretreated with EPO, or EPO was administered up to 3 hours after the lesion. 11. Example 6

Периферійне введення ЕРО захищає міокард від ішемічного ураженняPeripheral injection of ERO protects the myocardium from ischemic injury

Цей приклад демонструє ефект ЕРО стосовно захисту тканин серця від гіпоксичного ураження. Для його проведення пацюків до тестування заздалегідь обробляють ЕРО (5000 Одиниць/кг) за 24 години до процедури, яку здійснюють за способом І аїпі єї аї., (1999, у). Сагаіїомазс. Рпатасої. 31: 601-8). Потім тварин анестезують, підключають до апарату штучного дихання і здійснюють торактомію. Визначають серце і його внутрішню циркуляцію, і кетгут, що видаляється вміщують навколо найближчої ділянки низхідної лівої коронарної артерії, і потім його перев'язують. Потім вводять додаткову дозу ЕРО (5000 одиниць/кг 5 і оклюзію зберігають протягом 30 хвилин. У цей час лігатуру ослабляють і тварин витримують в стані глибокого наркозу ще 6 годин, а потім умертвляють. Відразу після смерті серце витягують і частину ураженої ділянки (ААРК), а також не ураженої ділянки (перегородка) видаляють і препарують для біохімічного аналізу. Визначають два параметри: креатинкіназу (СК) як показник виживаємості міокарда (чим нижча СК, тим менша виживаємість тканини) і мієлопероксидазу, яка є продуктом інфільтрату моноядерних клітин. Результати представлені наThis example demonstrates the effect of ERO in protecting heart tissues from hypoxic injury. For its implementation, rats are pre-treated with ERO (5000 Units/kg) 24 hours before the procedure, which is carried out according to the method of I aipi eyi ai., (1999, u). Sagaiiomazs. Rpatasoi 31: 601-8). Then the animals are anesthetized, connected to a ventilator and thoracotomy is performed. The heart and its internal circulation are identified, and the removed catgut is placed around the nearest section of the descending left coronary artery, and then it is ligated. Then an additional dose of ERO is administered (5000 units/kg 5 and the occlusion is maintained for 30 minutes. At this time, the ligature is loosened and the animals are kept in a state of deep anesthesia for another 6 hours, and then they are killed. Immediately after death, the heart is removed and part of the affected area (AARC) , as well as the unaffected area (septum) is removed and prepared for biochemical analysis. Two parameters are determined: creatine kinase (CK) as an indicator of myocardial survival (the lower the CK, the lower the survival of the tissue) and myeloperoxidase, which is a product of the mononuclear cell infiltrate. The results are presented on

Фіг.бА і Фігб6В. Як видно на цих малюнків, оброблення ЕРО приводить до збереження СК активності, що відповідає підвищенню життєздатності тканини і зниженню МРО активності, в порівнянні з контролем, як в площі інфаркту (ААБР), так і вільної стінки перфузованого лівого шлуночка (ІМ), що вказує на значно меншу інфільтрацію запальними клітинами. 12. Приклад 7Fig. bA and Fig. 6B. As can be seen in these figures, ERO treatment leads to the preservation of SC activity, which corresponds to an increase in tissue viability and a decrease in MRO activity, compared to the control, both in the infarct area (AABR) and the free wall of the perfused left ventricle (IM), which indicates on significantly less infiltration by inflammatory cells. 12. Example 7

Периферійне введення ЕРО ослабляє експериментальний алергічний енцефалітPeripheral injection of ERO weakens experimental allergic encephalitis

Експериментальний алергічний (або аутоімунний) енцефаломієліт (ЕАЕ) у пацюків є прийнятою моделлю на тваринах для вивчення розсіяного склерозу (М5). Були розроблені різні моделі з ЕАЕ на тваринах з використанням різних імунологічних, вірусологічних, токсичних і травматичних параметрів для з'ясування особливостей М5.Experimental allergic (or autoimmune) encephalomyelitis (EAE) in rats is an accepted animal model for studying multiple sclerosis (M5). Various animal models of EAE have been developed using various immunological, virological, toxic and traumatic parameters to elucidate the features of M5.

Для з'ясування того, чи захищає ЕРО проти симптомів ЕАЕ, здійснюють наступний експеримент. Самиць пацюків штаму Льюїс у віці 6-8 тижнів (Спапез Вімег, Саїсо, Нау) імунізують під легкою анестезією, вводячи за допомогою ін'єкцій в подушечки стоп обох задніх лап по 50мкг мієлінового основного білка морських свинок (МВР; бідта, 51. І оці, МО) у воді, емульгованого в рівних об'ємах повного ад'юванту Фрейнда (СЕА, бідта) з 7мг/мл термічно убитих Мусобасіепйут (Шрегсціовзіз, доданих до НЗ7Ва (Оіїсо, Оеєїгоїї, МІ) в кінцевому об'ємі 10Омкл.To find out whether ERO protects against the symptoms of EAE, the following experiment is carried out. Female rats of the Lewis strain at the age of 6-8 weeks (Spapez Wimeg, Saiso, Nau) are immunized under light anesthesia by injecting 50 μg of myelin basic protein of guinea pigs (MVR; bidta, 51) into the pads of the feet of both hind paws. ochi, MO) in water emulsified in equal volumes of Freund's complete adjuvant (CEA, bidta) with 7 mg/ml heat-killed Musobasiepiut (Shregsciovziz, added to NZ7Va (Oiiso, Oeigoii, MI) in a final volume of 10Omcl.

Після оброблення пацюків щодня оцінюють за ознаками експериментального аутоімунного енцефаломієліту (ЕАЕ) і оцінюють результати таким чином: 0, немає захворювання; 1, млявий хвіст; 2, атаксія;After treatment, rats are evaluated daily for signs of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and scored as follows: 0, no disease; 1, flaccid tail; 2, ataxia;

З, повний параліч задніх кінцівок з нетриманням сечі. Контролюють також вагу тіла. Пацюкам вводять ЕРО (5000 одиниць/кг, внутрішцьоочеревино, раз в день), починаючи на З день після 5 імунізацій, і продовжують до 18 дня. Контрольним пацюкам вводять один тільки носій. Як видно на Фіг.7, пацюки, оброблені ЕРО, демонструють підвищену оцінку (тобто менший номер) і стосовно тривалості захворювання. Крім того, для пацюків, яким вводили ЕРО, відмічається помітна затримка в настанні симптомів. 13. Приклад 8C, complete paralysis of the hind limbs with urinary incontinence. Body weight is also controlled. Rats are injected with ERO (5000 units/kg, intraperitoneally, once a day), starting on the 3rd day after 5 immunizations, and continuing until the 18th day. Control rats received only vehicle. As can be seen in Fig. 7, rats treated with ERO show an increased score (i.e., a smaller number) and in relation to the duration of the disease. In addition, there was a marked delay in the onset of symptoms for rats treated with EPO. 13. Example 8

Мінімальна ефективна доза фармакокінетика ЕРО, необхідного для захисту тканин, що збуджуютьсяThe minimum effective dose of EPO pharmacokinetics required for the protection of excitable tissues

Оптимальну і ефективну дози ЕРО оцінюють, використовуючи описану вище модель ішемічного шоку на тваринах. Як видно на Фіг.8А, доза ЕРО менша, ніж 450 одиниць/кг маси тіла ненадійно захищає тканини, що збуджуються від некротичних уражень. Як видно на Фіг.8В, для досліджених тварин доза в приблизно 5000 одиниць/кг маси тіла, введена внутрішньоочеревинно чотирьом самицям мишей, приводить до циркулюючого рівня ЕРО більше ніж 20000 мОдиниць/мл сироватки через 5 годин після його введення, більше ніж 10000 мОдиниць через 10 годин після його введення, але менше ніж 5 мОдиниць через 24 години після його введення. 14. Приклад 9The optimal and effective dose of EPO is estimated using the above-described animal model of ischemic shock. As can be seen in Fig. 8A, a dose of EPO less than 450 units/kg of body weight does not reliably protect tissues that are excited from necrotic lesions. As can be seen in Fig. 8B, for the animals tested, a dose of approximately 5000 units/kg of body weight administered intraperitoneally to four female mice resulted in a circulating EPO level of more than 20,000 mUnits/ml of serum 5 hours after its administration, more than 10,000 mUnits after 10 hours after its administration, but less than 5 mUnits 24 hours after its administration. 14. Example 9

Доставляння в ЦНС за допомогою еритропоетинуDelivery to the CNS by erythropoietin

Представлені далі приклади демонструють успішний транспорт кон'югованих з ЕРО молекул через гематоенцефалічний бар'єр і їх локалізацію всередині базальної мембрани. Як видно на Ффіг.9А, зрізи мозку були забарвлені антитілами до ЕРО рецептора (ЕРО-Н), що показує, що капіляри мозку експресують високі рівні ЕРО-Н. Для з'ясування того, чи може ЕРО долати гематоенцефалічний бар'єр, ЕРО мітять біотином таким чином. Об'єм, що містить ПЕРО, концентрують, використовуючи фільтр Сепійсоп-10 (МиПрогє), і одержане вимірюють, зчитуючи значення поглинання при довжині хвилі 280нм. Потім 0,2мг біотину з довгим ланцюжком (Месіог І арх) розчиняють в 100мкл ДМСО, додають до концентрованого розчину ПЕРО і негайно обертають. Потім цю суміш інкубують при кімнатній температурі протягом чотирьох годин при обережному перемішуванні в темряві. Незв'язаний біотин видаляють з розчину, використовуючи колонку Сепіпсоп-10.The following examples demonstrate the successful transport of EPO-conjugated molecules across the blood-brain barrier and their localization within the basement membrane. As seen in Figure 9A, brain sections were stained with antibodies to the EPO receptor (EPO-H), showing that brain capillaries express high levels of EPO-H. To find out whether EPO can cross the blood-brain barrier, EPO is labeled with biotin as follows. The volume containing PERO is concentrated using a Sepiysop-10 filter (MyProgye), and the result is measured by reading the absorbance value at a wavelength of 280 nm. Then 0.2 mg of long-chain biotin (Mesiog I arch) is dissolved in 100 μl of DMSO, added to the concentrated PERO solution and immediately rotated. This mixture is then incubated at room temperature for four hours with gentle agitation in the dark. Unbound biotin is removed from the solution using a Sepipsop-10 column.

Потім біотинілований ЕРО вводять внутрішньоочеревино тваринам і через 5 годин тварин умертвляють. У зрізи мозку вводять авідин, сполучений з пероксидазою, і додають діамінобензидин доти, поки достатня кількість продукту реакції не виявляється для спостереження за допомогою світлового мікроскопа. ЕРО виявляються вздовж тих же самих капілярів, які забарвлені позитивно для ЕРО-А (фіг.98). Для більш пізніх проміжків часу мітки біотину, з'являються з локалізацією всередині специфічних нейронів (наприклад, 17 годин. Фіг.9С). Навпаки, якщо холодний ЕРО додають в 1000-кратному надлишку по відношенню до міченогоThen biotinylated EPO is injected intraperitoneally into the animals and after 5 hours the animals are killed. Peroxidase-conjugated avidin is injected into the brain sections, and diaminobenzidine is added until a sufficient amount of the reaction product is detected for observation with a light microscope. ERO are found along the same capillaries that are stained positive for ERO-A (Fig. 98). For later periods of time, biotin labels appear with localization inside specific neurons (for example, 17 hours. Fig. 9C). On the contrary, if cold ERO is added in a 1000-fold excess in relation to the labeled

ЕРО, все специфічне забарвлення зникає.EPO, all specific coloring disappears.

Одержані результати демонструють успішне доставляння системно введеної кон'югованої з ЕРО сполуки через гематоенцефалічний бар'єр.The obtained results demonstrate the successful delivery of the systemically administered EPO-conjugated compound through the blood-brain barrier.

Успішне доставляння системно введеного кон'югату ЕРО-біотин через гематоенцефалічний бар'єр в мозок демонструє, що аналогічним способом можна доставляти через гематоенцефалічний бар'єр інші терапевтичні сполуки, створюючи комплекси ЕРО з представляючою інтерес сполукою. Як один з прикладів одержаний з мозку нейротрофічний фактор (ВМЕ) можна ковалентно зв'язати з ЕРО внаслідок карбодіїмідного приєднання, використовуючи стандартні способи. Після очищення цей кон'югат можна вводити тваринам за допомогою внутрішньоочеревинних ін'єкцій. Позитивний вплив ВМЕ на центральну нервову систему можна виміряти стосовно контрольних тварин, для вимірювання успішного транспорту цієї молекули в асоціації з ЕРО, в протилежність недостатності активності центральної нервової системи при введенні не кон'югованого ВМЕ.The successful delivery of a systemically administered EPO-biotin conjugate across the blood-brain barrier into the brain demonstrates that other therapeutic compounds can be similarly delivered across the blood-brain barrier by forming complexes of EPO with the compound of interest. As one example, brain-derived neurotrophic factor (BME) can be covalently linked to EPO by carbodiimide addition using standard methods. After purification, this conjugate can be administered to animals by intraperitoneal injection. The positive effect of BME on the central nervous system can be measured in relation to control animals, to measure the successful transport of this molecule in association with EPO, in contrast to the insufficiency of activity of the central nervous system when introducing non-conjugated BME.

Даний винахід не повинен бути обмежений об'ємом розкритих тут конкретних варіантів, які повинні служити лише ілюстрацією окремих аспектів винаходу, і функціональність еквівалентних методів і компонентів включені в об'єм винаходу. Дійсно, фахівцям будуть зрозумілі різні модифікації даного винаходу в доповнення до тих, які тут представлені і розкриті в попередньому описі і в супроводжуючих малюнках. Такі модифікації повинні бути включені в об'єм прикладеної формули винаходу. Всі приведені посилальні матеріали включені сюди за посиланням в своїй повноті для всіх цілей.The present invention should not be limited by the scope of the specific embodiments disclosed herein, which should serve only to illustrate certain aspects of the invention, and the functionality of equivalent methods and components are included within the scope of the invention. Indeed, those skilled in the art will appreciate various modifications of the present invention in addition to those herein presented and disclosed in the preceding description and in the accompanying drawings. Such modifications should be included in the scope of the attached claims. All referenced materials are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

в що о я у йin what about I in and

До во т й й ХUntil now Kh

ДИDI

Й й Х 7. -- я й с 5 й йY and X 7. -- i and c 5 and y

Я ба 5 ЩЕ Що. й щ й 5 б й й я : Ле реI ba 5 MORE What. и щ и 5 b и и я : Le re

З ля ЕЕ й доз Як Ді 5 В. й Її й й й й: : 2 Пл 5Z la EE and doz Yak Di 5 V. and Her y y y y: : 2 Pl 5

З й Що В ЩЕ 2 в 5 5 б 2 Що 2 Ж й. ре ДЕ 5 п РИ й ЩО. й ді 2 ЩО 2-х ни я ХК 2 й.With and What In MORE 2 in 5 5 b 2 What 2 F and. re DE 5 p RI and WHAT. y di 2 WHAT 2-x ni I ХК 2 y.

ЩЕ да В СВ Й 2 ЩЕ й ЩЕMORE yes IN SV AND 2 MORE and MORE

ЛИ ре реLI re re

СЕ КЕ хе "В ре й І І ле Ля Й ХК й 5 й 75 2 й б ЗSE KE he "V re y I I le Lya Y ХK y 5 y 75 2 y b Z

ІЙ. й Й. РАВ ій по 4 лосліди в кожному 7 Послідовні блокиIJ y J. RAV y 4 horseshoes in each 7 Consecutive blocks

Фіг. 1АFig. 1A

ЖЕ ? 35 р 30 в 8 25- т 20 ш ї 15- й ш о ! й їв рев ше шк 0 5 10 15 20 25 30 35 40 а5 50RIGHT? 35 r 30 v 8 25- t 20 w i 15- i w o ! and ate rev she shk 0 5 10 15 20 25 30 35 40 a5 50

ЕРО (секунди на платформі)EPO (seconds on the platform)

Фів. ІВ пІтій вітій -д-- ЛАТ. «-е-- ЕРО 12 г 1 | гThebes IV fifth blessing -d-- LAT. "-e-- ERO 12 g 1 | Mr

ШИ У содннAI In sodnn

Н х У х аN x U x a

В кх г і / 7 ре, х Ех (А / -щ 08 хIn kh g i / 7 re, x Ex (A / -sh 08 x

Е | я є І - ; т : | ! ти в ; / 7 - 04 3 / г х ; .E | I am AND - ; t : | ! you're in ; / 7 - 04 3 / g x ; .

Го 4 : в ї 'Go 4 : in i '

В 02 к / і. / "М о мив порив повних пон пити зт они хни ' З 5 т. я 13 їз двіIn 02 k / i. / "I had a rush of full pon drink ztony henna" Z 5 t. i 13 iz two

Фіг. 2АFig. 2A

2- -шщ- 5Нат і.6 в - щ-2- -shsh- 5Nat i.6 in - shsh-

Бі 7 і рН Ї Ж я ов р у! 06 не 4і й 91 й Ка 04 / ,; 02. Ї і ж 7 , БЕ | Й ж 0 дж е 0 05 1 15.2 253: 554 дефіпнт води (мл)Bi 7 and рН Я Х я ов р у! 06 not 4 and 91 and Ka 04 / ,; 02. She and the same 7, BE | Y z 0 j e 0 05 1 15.2 253: 554 defipnt of water (ml)

Фіг. 25 «ж. ВНАМFig. 25 "w. VNAM

І «а- ЕРО -- Й д! 5 щеAnd "a- ERO -- Y d! 5 more

З аWith a

В 40 ,. : 5 зо ще жк. 7At 40, : 5 zo still zhk. 7

З Й ї ї 7 ка ; й а іа « КЕ Ж т 20 ; У, ;Z І і і 7 ka ; and a ia « KE Zh t 20 ; In, ;

Е Кв; ї к г ни «Ви , що. , і І яE Kv; "You, what. , and And I

Ши нн а пе й. і з о чх о; щ хх з 7 о. т :- 2Shi nn a pe y. and with o chh o; w xx with 7 o. t :- 2

Є 0-0 х 7There are 0-0 x 7

ЕЕ «30 й о їEE "30 and o i

КУ ; я Н я «во т 1 2 З 4 Б 8 7 8 в номер-тестуCU; i N i «vo t 1 2 Z 4 B 8 7 8 in the test number

Фіг, 2Fig, 2

100 ок Ге З ж Шх Щек ЕРО 90 їх е о ще І ; - то. З і їі. З100 ok Ge Z z Shh Chek ERO 90 ih e o still I ; - that. With and her. WITH

Я во. Ж КО ОК ших З йI am in Zh KO OK shih Z y

ЖІ Ш5 ши : їй |. ! Я З ; зо І С. з и и: КН бю ти тт тнянт рентЖИ Ш5 ши : her |. ! I'M FROM ; zo I S. z i y: KN byu ti tt tnyant rent

Те | У дав лк нею варив) пе тою о 7 р«0001 "радо?That | I gave it to him and cooked it) on the fifth day at 7 p.m.

Фіг, ЗА ою Ше р он ще У введена доза ЕРОFig, ZA oy She r on still Injected dose of ERO

Фіг. ЗВ т ;Fig. ZV t;

ІДД тIDD t

Е в ! й ПІКИ я 8 ЛЕК, с | : Я са ! А І о їх А без попередньої оброски попередня обробка за 74 годякиWell in! y PIKY i 8 LEK, s | : I am! And and about them A without preliminary spraying, preliminary processing in 74 days

Фіг. З3СFig. Z3C

«рей обіу порівнянні з ЗНАМ зва йо у порівнянні з групами -24, (3 годин 2гп0а- 150 я"rey obiu in comparison with ZNAM zva yo in comparison with groups -24, (3 hours 2gp0a- 150 i

Фо 100- як й ! : ' " Б0Fo 100 - as well! : ' " B0

Ж ій ж 5НАМ -24годичи о Отодино Згоднни о бтодин(Я» 9 годин) 0) (8) (8) (8)Live at 5AM - 24 hours a day Agree on a day (I" 9 hours) 0) (8) (8) (8)

Фіг. 4А те 120- ' чо0- :Fig. 4A te 120- ' cho0- :

ВОVO

В бо- 40 :In bo- 40:

Іо) тр ррIo) tr yr

ОНАМ гер ФРАГМЕНТ 17-МЕРАONAM ger FRAGMENT 17-MERA

Фіг. 485 2 1.8. ; 1.6. 1.4 | дя ше п 1.2 вх 0.8. 7 й а шеFig. 485 2 1.8. ; 1.6. 1.4 | dya she n 1.2 in 0.8. 7 and a she

З 0аї ШЕFrom 0ai SHE

КОНТРОЛЬ БЕрО пе б кожна група роCONTROL BERO pe b each group ro

Фіг, 5Fig, 5

-- Я 6 « 6: 45- ни в 00001 у І 3.5 , с ДА-- I 6 « 6: 45- ny in 00001 in I 3.5 , with YES

В 9, пи й і 5 В о5- ЩЙIn 9, pi and i 5 in o5- Shchy

Р«бо3. 70- і. - і йR"bo3. 70- and - and

Ж і м,F and m,

ВIN

530 8 хво | й я о- нини ше Х530 8 min and I am now Kh

ПЕРЕГОРОДКА НАМ ЕРОPARTITION TO US ERO

Фіг. 68 їх -ж- 5НАМ ! | «ак ЕРОFig. 68 of them are 5 for us! | "ak ERO

З рекоFrom the river

Я о Ї іI am about her and

Ї ! ' . Ж Й і, Ж г х : о шу ІїEat! '. Ж І i, Ж g х: o shu Ii

Ї волоті гомін вовни пеніс вівінвни ї - ї З 6 и) 12 14 16 ї8 20 дні шсля їмунізаціїІ voloti homin ovni penis vivinvny і - і From 6 і) 12 14 16 і8 20 days after immunization

Фіг, 7Fig, 7

. - « к :. - « to :

В, |!In, |!

ГеяGay

В тIncluding

Я 00 5I am 00 5

О й а в. ваг 5000 500 450 а 950Oh and and in. weights 5000 500 450 and 950

Одийнцьк: Одепицькі Очиницькг Одиницькг ОдиницьйеOdyntsk: Odepytsky Ochynytskyi Odynitskyi Odynitsye

Фіг. А ше | : 20000 | | М | І. - е й : 0 -ж 004.Fig. What about | : 20000 | | M | I. - e y : 0 -zh 004.

ІAND

- ! : . ! - 10000 й : | ; | Щі о І : т. що- ! : . ! - 10000 and : | ; | What about I: t. what

ЩЕ 0. 5 10 15.50 25 0 : годиниANOTHER 0. 5 10 15.50 25 0 : hours

Фіг ВВ с 7 «. т зж ; я й кй и т «в М ж ж ж дже . 4. . т ї ж х " Ге х, І а - й т і "й г, ГТ ер Я гFig. BB with 7 ". t zzh ; i ky i t "in M zh zh zh je . 4. t i zh x " Ge x, I a - y t i "y g, GT er I g

У Ши Ах е й Ге М «ж ч Яд АННИ Що з не т меч їх НИ ше. й Й Жднй: Ки. шк « я вда жк Ши м й с їх. шт жо т во и я Уа їх Же жу ши тах й. й -ї ст. я чи 0 вт Й. Ме Ж шк я пил и нн. М І НН. СВ ; я УНН. о з МК А ЯВИ фаги с В т,In Shi Ah e and Ge M «zh h Yad ANNA That with not t sword them NI she. and Y Zhdny: Ky. shk « i vda zhk Shi m and s them. Sht zho t vo i I Ua ikh Zhe zhu shi tah y. th century I or 0 Tue Y. Me Z shk I drank and nn. M I NN. SV; I am UNN. o with MK A YAVI phages with B t,

Яке Ах С кл і Як жає Вт, Як ще. у Я р і. як ї - Бе. Ще ще і - Ко й аа У в че СЯ С «В сор вв Не» НЕ Му я и, дан, м ее а. што т, и ие Ікеа чаї я в В о ее " з А я а мах Бе а в і; я й ук. са я ; їх віх в. я: зав А акт о й:What Ah C kl and How zaye Vt, How else. in Ya r i. like her - Be. Even more and - Ko y aa U v che SYA S "V sor vv Ne" NE Mu i y, dan, m ee a. what t, i ie Ikea chai i in V o ee " with A i a mah Be a in i; i and uk. sa i; their milestone in. i: zav A act o i:

Інни ЕН о ка Бе я о й | ся Я ши М в Ж, з К я кій ле Те У рій нини ланки Дню Ж в ДН у 1Inny EN o ka Be i o y | sya I shi M in F, with K ia koi le Te U riy nin link Dyu F in DN in 1

Фіг. ЗА ре Сл ван ех Я Кк ра на дх 4 я. ДИ к. н ре чу й ав ли га й: у яд Е є , І о я : в К 4 чі Ії. - В ок й я ашнокня - ох ! й тис аю У Ж. осдемевкж Кг, ве й кот й К а ШЕ ж: й в -БШИ Як КИ соя Ж жей : иЕ я ліні Як я то "В ек й я НИХFig. ZA re Sl van eh I Kk ra na dh 4 i. DY k. n re chu y av ly ha y: u yad E is , I o i: in K 4 chi Ii. - OK, and I'm an ashnoknya - oh! y tys ayu U Zh. osdemevkzh Kg, ve y cat y K a SHE zh: y v -BSHY How KY soy Х жей : иE I laziness How I that "В ек и I НХ

Сн: я ан Я Он ай че "р вс ее них не С шу: овен ши не ся «Фіг. ОВ Фіг. 96Sn: I an I On ay che "r all ee them ne S shu: ram shi ne sia "Fig. OV Fig. 96