UA74557C2

UA74557C2 - A method for producing a heterologous secreted protein from chinese hamster ovaries cells grown on microcarriers

Info

Publication number: UA74557C2
Application number: UA2002042650A
Authority: UA
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-01-09
Publication date: 2006-01-16
Also published as: AU779406B2; CN1240831C; EE200200108A; DE60031689D1; BR0013753A; KR20020029103A; JP2003509022A; HK1050380A1; ZA200201119B; EA200200327A1; EP1208192A1; KR100675473B1; PT1208192E; EA005312B1; ES2272320T3; CN1373799A; MXPA02002393A; DE60031689T2; NO20021015L; AU7097700A

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до способу одержання секретованого білка в культурі прикріплених клітин ссавця. 2 Більшість промислових виробничим процесів, які використовують як клітини-хазяїни клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), застосовують клітинні лінії, адаптовані до зростання в суспензії, наприклад, 1-РА

ЇМУегпег еї аї., 1993 ї І иріпіескі еї аІ., 1994), для яких безсироваткові середовища були доступні протягом останніх 10 років (Сопіеп еї аї., 1991). Однак альтернативною стратегією для культури клітин СНО є підтримка зростання прикріплених до субстрату клітин, де клітини прикріпляються до матрикса, наприклад, до мікроносія 70 ІКадоишгі, 1994). Клітини СНО можуть рости успішно на таких носіях, і були розроблені промислові процеси, що використовують культури мікроносіїв СНО, наприклад, Рітедипа (Оїї|ме еї а!., 1996).

Зростання прикріплених клітин СНО на мікроносіях звичайно виконують подачею сироватки в культуру, в формі фетальної телячої сироватки (ФТС) ЇХіао еї аїЇ.,, 1994; Сіагк ей Я., 1981; Мікоїаії еї аї., 1992;

Аззеїрегоз еї аїЇ., 1982; Іеміп еї аїЇ., 1992; МУаївоп еї аїЇ.,, 1994 і ОНівоп еї аїЇ.,, 1994). Ця комплексна 72 добавка до культурального середовища містить необхідні фактори прикріплення і зростання, необхідні для стимуляції прикріпленого фенотипу, наприклад, фібронектин, ламінін (Ламжогекі еї аіІ., 1993 і Міїззоп, 1989).

Повідомлялося, що у відсутності сироватки деякі клітинні лінії не будуть рости на мікроносіях |Зсптій еї аї., 1992) або що відсутність сироватки є шкідливим для утворення продукту |Геіде еї аї., 1994). Хоча безсироваткове прикріплене зростання клітин СНО досягалося з використанням базального середовища, доповненого інсуліном, трансферином і селеном |Саззег еї аі!., 1985), це зростання одержували в умовах дуже пасивного середовища в Т-колбі, умовах середовища, які, як відомо, істотно відрізняються від умов середовища у разі прикріпленого зростання на мікроносіях в біореакторі |СНегтгу еї аї!., 19851.

У промислових процесах на основі мікроносіїв клітини звичайно підживлюють (за допомогою безперервної перфузії) культуральним середовищем, доповненим сироваткою, поки ці клітини не заповнять доступну площу с поверхні, що забезпечується мікроносієм (фаза зростання). Потім середовище, яке перфузується, перемикають Ге) на інше середовище, звичайно безсироваткове, оскільки клітини в цій точці не діляться і можуть задовольнятися існуючим позаклітинним матриксом для підтримки їх прикріплення. Саме під час цієї другої фази (фази утворення продукту) кондиціоновану фазу збирають для витягання і очищення рекомбінантного білка. Однак в такій двофазній системі перемикання від зростання до утворення продукту може призводити до драматичної в клітинної відповіді, такої як втрата клітин і зменшена об'ємна продуктивність рекомбінантного білка |Создгоме ю еї аІ., 1995). Альтернативно, може мати місце лаг-фаза, коли клітини реагують на це драматичне перемикання в середовищі, яке потім призводить до періоду низької продуктивності рекомбінантного білка, поки ці клітини не о відновляться до нормального стану. «І

Цитування тут будь-якого документа не є визнанням того, що такий документ є документом попереднього

Зо рівня техніки, що відноситься до даного питання або матеріалом, що враховується відносно - патентоспроможності якого-небудь пункту формули винаходу даної заявки. Будь-яке твердження, наприклад, відносно змісту або дати будь-якого документа засновується на інформації, доступній для заявника під час подання, і не є визнанням, наприклад, відносно коректності такого твердження. «

Метою даного винаходу є усунення проблем і труднощів, що зустрічаються в попередньому рівні техніки, що З 70 обговорювались вище. с Даний винахід забезпечує спосіб одержання гетерологічного секретованого білка з трансформованих клітин

Із» СНО, що вирощуються на мікроносіях в безсироватковому середовищі для культури клітин. Цей спосіб має перевагу, що полягає в подоланні проблеми лаг-фази в утворенні продукту, що спостерігається при перемиканні від середовища, що містить сироватку, до без сироваткового оточення.

На Фіг.1 показане схематичне представлення рецептора р40 ІЕМ-А/В в РСМУ. РА. і На Фіг.2 показане зростання клітин клону СНО 1-1-31 на мікроносіях Суіїороге 2, які підживлюються або «» середовищем, що містить сироватку (режим Мо4 біореактора, підживлення середовищем ЮОМЕМ/Е12, доповненим 595 фетальною телячою сироваткою), або безсироватковим середовищем (режим Мо12 біореактора, і-й підживлення середовищем ОМЕМ/Е12, доповненим ІРЄСЗТЕ). сл 20 На Фіг.3 показана кінетика утворення розчинного рецептора інтерферону А/В (зІЕМАК2) в двофазній системі, де має місце перемикання від середовища, що містить сироватку, до безсироваткового середовища, і в системі з тм єдиним поживним середовищем і без перемикання в середовищі. Експлуатацію (режим) Ме4 реактора проводили у вигляді двофазної системи з фазою зростання ОМЕМ/Е12, доповненого 595 ФТС, і перемиканням на фазу утворення продукту ОМЕМ/Е12, доповненого ІЕСЗТЕ. Перемикання представлене вертикальною пунктирною 22 лінією під час 0. В режимі експлуатації Мо12 біореактора використали єдине поживне середовище ОМЕМ/Е12,

ГФ) доповнене ІЕЄСЗТЕ.

Ніа Фіг.4А-4С показані клітини СНО (клон 1-1-31), зростаючі на мікроносіях Суїороге 2 в день 4 (Фіг.АА), о день б (Фіг4ЩВ) і день 10 (Фіг.4С) після фідингу (підживлення) сироватковою композицією ОМЕМ/Е12, доповненого 595 ФТС. Життєздатні клітини, що зросли на мікроносії забарвлюються флуоресцентним 60 барвником. Дні, вказані на Фіг4АА-4С, є днями експлуатації реактора, тобто днями після інокуляції біореактора, але не днями утворення продукту.

На Фіг.5А-50 показані клітини СНО (клон 1-1-31), зростаючі на мікроносіях Суїороге 2 в день 1 (Фіг.5А), день З (Фіг.58), день 6 (Фіг.5С) і день 10 (Фіг.50)) після фідингу безсироватковою композицією ОМЕМ/Е12, доповненого ІЕСЗТЕ. Життєздатні клітини, що зросли на мікроносії, забарвлюються флуоресцентним барвником. бо Дні, вказані на Фіг.5А-5О0, є днями експлуатації реактора, тобто днями після інокуляції біореактора, але не днями утворення продукту.

Даний винахід заснований на розробці стратегії безсироваткового фідингу (підживлення) для вирощування клітин СНО на мікроносіях, яка дає можливість уникнути потреби в сироватці для стимуляції прикріпленого клітинного фенотипу. Ця стратегія безсироваткового фідингу відповідно до способу даного винаходу значно поліпшує витягання бажаного секретованого білкового продукту за допомогою елімінації лаг-фази, пов'язаної з видаленням сироватки, тобто перемиканням від середовища, що містить сироватку (сироваткового), до безсироваткового середовища.

Спосіб одержання гетерологічного секретованого білка з клітин СНО, що вирощуються на мікроносіях, /о Відповідно до даного винаходу включає в себе інокуляцію клітинного біореактора, що містить мікроносії як тверду підкладку для зростання прикріплених клітин, інокулятом живительних клітин СНО, трансформованих для експресії гетерологічного секретованого білка. Хоча це і не є абсолютно необхідним, інокульовані клітини вирощують переважно без перфузії в сироватковому середовищі для культури клітин, такому як ОМЕМ/Е12, доповненому 596 фетальною телячою сироваткою (ФТС), протягом періоду приблизно одного-трьох днів, /5 переважно приблизно двох днів. Приблизно Через два дні, тобто 48 годин, ці клітини потім підКхивлюють шляхом перфузії безсироваткового середовища для культури клітин, яка є переважно середовищем ОМЕМ/Е12 |номер за каталогом 1330-032, бірсо ВК, Сайпегериго, МОЇ, доповненим ІРС5ТЕ (акроним для композиції інсуліну, цитрату заліза(Ії), селену і мікроелементів, склад якої показаний в таблиці 71 нижче), при початковій швидкості потоку фідингу в діапазоні приблизно від 0,1 до 0,4 об'єм/об'єм/день (об./об./д.) перед збільшенням 2о швидкості фідингу безсироваткового середовища для культури клітин в стадіях протягом приблизно шести-десятиденного періоду, переважно семи-дев'яти днів, поки не досягається швидкість подачі фідингу приблизно 1-3,5об/об/д для утворення і секреції бажаного гетерологічного секретованого білка з культури клітин СНО в культуральне середовище. Утворення і секреція бажаного гетерологічного секретованого білка підтримується, після того як досягається кінцева швидкість подачі середовища, за допомогою безперервної сч ов перфузії безсироваткового культурального середовища, доповненого ІЕСЗТЕ. Бажаний гетерологічний білок, продукований і секретований у безсироваткове культуральне середовище, може бути легко витягнутий і і) очищений з використанням загальноприйнятих способів витягання і очищення, добре відомих фахівцям в даній області. у

Таблиця 1

Робоча концентрація добавки ІРСЗТЕ в середовищі для культури клітин І в) тунсулія ю 2) Цитрат залізації!) 12,24мг/л 3) Натрій/селен « 4) Мікроелементи А 15, 1000х (номер Ме99-182 за каталогом Сірсо ВВІ), розведені 1:1000 для робочої концентрації в мікрограмах | 1,60 - на літр 863,00

Си8Од-5НоО 17,30 7пвоОд-ТНноо 1155,10

Селеніт.2Ма «

Цитрат залізації) 5) Мікроелементи В16, 1000х (номер Ме99-175 за каталогом Сірсо ВР), розведені 1:1000 для робочої концентрації в мікрограмах 9,17 - с на літр 140,00

МпзОд-НгО 1,24 з мавіогеНго 01

Молібденова кислота сіль амонію 012

МНАМОЗ , мівОд-внго -І Зпсі» (безводний) їз 6) Мікроелементи с16, 1000х (номер Ме99-176 за каталогом Сірсо ВЕ), розведені 1:1000 для робочої концентрації в мікрограмах| 1,20 на літр 017 «сл АІСІз-вНоО 2,55 5000 МОЗ г2в

Ва(СонНзо ' о не 2Н302)2 2 38 "м с с 0,32 осі» 4,20

Сосі»-вНоО о БЗ

СгсіІз (безводний) 0,17 маг 121 ' бе? 3,22 о кі. вЬсІ ко 7госіІ»ВнНоО во Фахівцям в даній області буде зрозуміло, що початкова швидкість потоку фідингу і період часу для збільшення швидкості потоку фідингу від стадії до стадії до кінцевої швидкості потоку фідингу може варіюватися в залежності від розміру інокуляту. У переважному варіанті, інокулят приблизно 2. х1Оклітин/мл використовують для біореактора на 4,8 літри, і клітини культивують протягом приблизно двох днів перед перфузією з початковим фідингом безсироваткового культурального середовища при початковій швидкості 65 потоку фідингу близько 0,206./об./д. Швидкість потоку фідингу для безперервної перфузії культури прикріплених клітин в переважному варіанті збільшують в день З приблизно до 0,3об./об./д., в день 4 - приблизно до

О,Боб./об./д., в день 5 - приблизно до 0,806./об./д. в день б - приблизно до 1,2о06./о0б./д., в день 7 - приблизно до 1,5об./06б./д. поки кінцева швидкість потоку 2,0об./0б./д. не досягається в день 8. Як буде зрозуміло фахівцям з кваліфікацією в даній області, що мають керівництво, забезпечене цим переважним варіантом даного винаходу, якщо розмір інокуляту є великим, то може бути потрібна більш висока початкова швидкість потоку фідингу, і може бути потрібна відповідна зміна періоду часу для збільшення швидкості потоку.

Кінцева швидкість потоку фідингу може бути між 1 і 3,5об./об./д. але переважно вона складає близько 2о06./об./д., наприклад, знаходиться в діапазоні приблизно від 1,5 до 2,506./об./д.

Хоча спосіб згідно з винаходом може бути звичайно застосовний для утворення і секреції гетерологічних /о бекретованих білків в клітинах СНО, де термін "гетерологічний секретований білок" означає секретований білок, що не є ендогенним для клітин СНО, переважним варіантом, приведеним як приклад в прикладах, є розчинний рецептор інтерферону А/В (зІЕМАК2). Розчинний ІЕМАК2 людини є глікозильованим білком, який зв'язує як інтерферон а, так і інтерферон В, і його існування у вигляді розчинної форми рецептора ІРМА/В надає можливість використання цього рецептора терапевтично як антагоніст ІМ.

Твердою підкладкою, на якій вирощують прикріплені клітини СНО, є переважно мікроносії Суороге 2 (Атегепат РІагтасіа Віоїесі, Різсаїамжау, МУ), які с мікроносіями зі структурованим матриксом з целюлози бавовнику, гідрофільнім покриттям ДЕАЕ, щільністю заряду 1,в8мекв/г і середнім діаметром пор ЗОмкм. Однак інші відповідні мікроносії, відомі в даній області для застосування в культурі прикріплених клітин, можуть також служити як альтернативна тверда підкладка для прикріпленого зростання клітин СНО.

Переважним безсироватковим середовищем для культури клітин є ОМЕМ/Е12, доповнене ІРСЗТЕ.

Після опису даного винаходу в загальному вигляді все описане буде більш легко зрозуміле з посиланням на наступні приклади, які приведені як ілюстрація і не призначені для обмеження даного винаходу яким-небудь чином.

Приклад 1 сч

Виділяли і характеризували клональні лінії клітин СНО, що експресують рекомбінантний розчинний рецептор

ІЕРМА/В людини (ІЕМАКЗ). Два потенційних клони були відібрані для подальшої оцінки в дослідженні подвоєння (8) стабільності на 100 популяціях. На основі рівнів експресії ІЕМАК2 і аналізу мРНК, з панелі клонів були вибрані наступні клони. СНО-ІЕМАК1-1-50 мав найвищу питому продуктивність з рса 34,48. СНО-ІЕМАК.1-1-31 (клон СНО 1-1-31) мав найвищу об'ємну продуктивність, експресуючи 18,71мкг/мл в колбі 775 протягом періоду М зо 24 год. Обидва клони виявляли єдиний основний тип мРНК при випробуванні за допомогою Нозерн-блот-аналізу.

Способи юю

Конструювання вектора ю

ДНК плазміди рСЕМ9-ОМ27, що містить кКДНК розчинного рецептора ІЕМА/В людини, одержану у лікаря

Рубінштейна, використали як матрицю для ПЛР-ампліфікації. Пару ПЛР-праймерів використали для ампліфікації «

КДНК рецептора ІРМА/В людини від стартового кодона АТС сигнального пептиду до стоп-кодона ТАС. Сайт Хваї ї- був включений в обидва праймери. ПЛР проводили при стандартних умовах протягом 25 циклів. Після очищення від гелю і розщеплення Хвраї, ПЛР-продукт в 7ЗОп.н лігували в розщеплений Хваї, оброблений СІР експресуючий вектор РСММ.РА4. Розщеплення ХраЇ і Маеі! використали для скринінгу МС1061-трансформантів. Клон 11

РСОММ.РА-ПЕМ А/В рецептор підтверджували розщепленням рестриктазами і аналізом послідовності ДНК. У « районі сигнального пептиду був виявлений фенілаланін замість валіну в положенні амінокислоти 10, що з с відрізняється від опублікованої послідовності (Кибіпзівїпй, 1994). Та ж сама заміна була виявлена д-ром

Рубінштейном в його вихідній клонуючій конструкції розчинної форми. ;» Трансфекція і відбір в клітинах СНО

Клітини СНО-ВБИКХ котрансфікували конструкцією ПІЕМА/ВК-СММ.РАА (5Омкг) і конструкцією ЮА (1Омкг) у співвідношенні 5:11 рутинним способом СаРО,)-преципітації Експресуючий вектор ОА містить ген -І дигідрофолатредуктази (ОНЕК), що робить можливими відбір і ампліфікацію з використанням лікарського засобу метотрексату (МТХ). Ця трансфекція була названа ІЕМК1. Середовище для вирощування, що використовується ве до і відразу ж після трансфекції, складалось з середовища альфа-МЕМ (к) (з дезокси- і рибонуклеозидами бірсо «сл вк, доповненого 1095 сертифікованою фетальною телячою сироваткою (ФТС, бірсо ВК) і 195 І -глутаміном 5о (Зібсо ВК). Через сорок вісім годин після трансфекції кожну чашку промивали забуференим фосфатом о сольовим розчином (ЗФР), при рН7,О, і обробляли 2мл розчину 0,0595 трипсин - 0,53мММ ЕДТА (сСірсо ВК.)

І протягом чотирьох хвилин при 37 С. Трипсин гасили додаванням Змл селективного середовища, що складається з середовища альфа-МЕМ (-) (без дезокси- і рибонуклеозидів, Сібсо ВКІ), доповненого 1095 діалізованою фетальною телячою сироваткою (дФТС, бірсо ВК), 195 І -глутаміном (Сібсо ВКІ) і 0,02мкМ МІХ (Зідта). Дисоційовані клітини ресуспендували, розподіляли у відношенні 1:10 і висівали в десять культуральних чашок Р100. У чашки подавали свіже селективне середовище кожні 3-4 дні. іФ) Звичайно після 10-14 днів під час відбору утворюються великі колонії. Потім чашки трипсинізували для ко перерозподілу цих клітин у вигляді пулів, так, щоб могла утворитися багатошарова культура без надмірного зростання локалізованих зон. Як тільки чашки досягали 8096 конфлюентності, їм подавали свіже селективне бо середовище. Через двадцять чотири години брали пробу супернатанту для аналізу експресії, клітини трипсинізували і рахували за допомогою гемоцитометра. Два флакони, що містять 1-3 мільйони клітин, кріоконсервували в селективному середовищі, що містить 1096 диметилсульфоксид (ДМСО, зЗідта), для кожного з десяти пулів. Проби в середовищі зберігали при -2026.

Ампліфікація клітин СНО-ІЕМАК1 65 Оскільки вектор СА містив ген ОНЕК, можна було спробувати ампліфікувати експресію клітин СНО-ІЕМАКТ1.

Після відбору при 0,02мкМ МТХ трансфіковані клітини ампліфікували в "пулах" відповідно до стандартної схеми ампліфікації О,їмМкМ--»0,5мкМ--»1,0мкМ--»5,0мкМ МТХ. Після двадцяти чотирьох годин експресії брали проби при рівні 0,02мкМ МТУ, інші клітини використали для ампліфікації. На кожній стадії ампліфікації одну чашку РТО0 для кожного пулу засівали при 7 х10? клітин в середовищі альфа-МЕМ (-), доповненому 1095 діалізованою фетальною телячою сироваткою (дФтТС, Сібсо ВК), 195 І -глутаміном (бірсо ВК) і відповідною концентрацією

МТХ (Зідта). Клітини підтримували на кожній з послідовних стадій ампліфікації щонайменше протягом семи-десяти днів.

Визначення 24-годинної експресії, де рівні експресії розраховували на клітину, проводили на кожній стадії ампліфікації таким чином. Коли клітини досягали приблизно 70-8095 конфлюентності, в чашки подавали свіже 70 культуральне середовище (що містить відповідну концентрацію МТХ). Через двадцять чотири години брали проби супернатантів, клітини трипсинізували і визначали загальне число клітин. Після проведення визначень експресії, на кожній стадії ампліфікации, 7х10? клітин використали для засіву Р100 в середовищі, що містить рівень МТХ для наступної стадії ампліфікації, а інші клітини кріоконсервували в середовищі, що містить відповідну концентрацію лікарського засобу для даної стадії ампліфікації і 1095 ДМСО. Всі кількісні визначення |ЕМАКЗ виконували з використанням ЕГІЗА для розчинного ІЕМАК2 людини.

Протокол ЕГІБЗА для розчинного рецептора ІЕМ людини

Планшети Іттиіоп ІМ з ЮОупаїесй покривали асцитами з моноклональним антитілом анти-ІЕМАК2 34.1, розведеними 1:5000 в 0,195 Твині 20 в ЗФР, рН7,4 (ЗФР/Т) при 10Омкл на ямку, протягом 2 годин при 37 20.

Планшети промивали двічі ЗФР/". Всі промивки проводили при кімнатній температурі (КТ) з використанням автоматичного аспіратора/промивача Шгамжазі Ріиз з бупаїеснй.

Планшети блокували протягом ночі при 42С 200мкл на ямку 1,095 БСА в ЗФР/Т. Планшети можуть зберігатися в холодному вигляді в блоках аж до семи днів. їх промивали три рази ЗФР/ЇІ перед подальшим використанням.

Стандарт і проби розводили в ЗФР/Т. Стандартом був афінно очищений рецептор ПІЕМ А/В, що зберігається при -202С або відталий і що зберігається при 02С протягом періоду, що не перевищує один тиждень. Цей с 29 рецептор був нестабільним при низьких концентраціях, так що його розбавляли до робочої концентрації ге) безпосередньо перед використанням. Стандарт використали при 200, 100, 50, 25, 12,5 і 6,25нг/мл і при 100мкл на ямку, причому кожну концентрацію використали в трьох повторюваностях. Розведені проби також використали при 100мкл на ямку в двох повторюваностях (або трьох повторюваностях, якщо дозволяв простір на планшеті). Стандарти і проби інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі. Планшети - промивали три рази в ЗФР/1т. ю

Поліклональну кролячу сироватку проти ІЕМАК2 розводили 1:5000 в ЗФР/!. 100мкл на ямку використали протягом однієї години при кімнатній температурі. Планшети промивали три рази з використанням ЗФР/Т. о

Біотинільоване антикроляче антитіло (Вектор, ВА-1000) розводили 1:10000 в ЗФР/ї. 100мкл на ямку « використали протягом однієї години при кімнатній температурі. Планшети промивали три рази ЗФР/1.

АВсС-реагент (Месіог АВС ЕїШе Кі0Ю готували таким чином: 1 краплю реагенту А додавали до 1Омл ЗФРЛ/ і - змішували перевертанням. До цього додавали 1 краплю реагенту В і змішували перевертанням. Цю суміш інкубували як мінімум 30 хвилин при кімнатній температурі, потім розводили до кінцевого об'єму не більше 5Омл безпосередньо перед використанням. 100мкл на ямку розведеного АВС давали інкубуватись тридцять хвилин « при кімнатній температурі. Планшети промивали три рази в ЗФР/Т. 100мкл на ямку субстрату пероксидази ТМВ Місгожеї! (Кігкедаага 45 Регту Гар, Сайпетгзриго, МО) давали но) с інкубуватись в темряві протягом п'яти хвилин, потім додавали 5Омкл на ямку 0,3М сірчаної кислоти для "з зупинення розвитку забарвлення. " Планшети зчитували при 450 нм з використанням пристрою для зчитування мікропланшет ОМ тах Кіпеїйіс тісгоріа(ге геадег з МоЇІесшаг ЮОемісев.

Клонування СНО-ІЕМВІ-1 ш- З використанням ІРМАК2-ЕГІЗА рівні БІЕМАК2 людини, що детектуються, були виявлені тільки при 0,5, 1,0 і ї» 5,0МкМ МТХ для невеликої частини пулів ТЕМК1. На основі цих результатів ІЕМК1-1 при рівні їмкМ був відібраний для клонування. Один флакон пулу ІЕМК1-1 відтавали в колбу 775, що містить середовище з їмкМ іні МТУ. Клітини пасували в колби Т75 в ОМЕМ/Е12, що містить 595 ФТС, і проводили клонування з використанням «сл 20 лімітуючою розведення. П'ять 96-ямкових планшетів інокулювали 0,25, 0,5 і Іклітин/ямку. Клонування виконували у відсутності лікарського засобу. Всі ямки обстежували під мікроскопом для гарантії однієї клітини на ямку

Що. Будь-які ямки, які містили численні клітини, виключали. Опісля щонайменше 11 днів вирощування колонії з 82 ямок переносили в 24-ямкові планшети. Як тільки клітини досягали 50-70956 конфлюентності, визначали об'ємну продуктивність з використанням ІЕМАК2-1 І 15А. Тільки клони з високими рівнями експресії (50905 від всіх клонів) 22 переносили в колби Т25, де проводили визначення 24-годинної об'ємної експресії. Два флакони кожного клону

Ф! кріоконсервували в ОМЕМ/Е12, що містить 595 ФТС, 196 І -глутамін і 10956 ДМСО.

Підтвердження експресії клонів після відтавання о Один флакон кожної з п'ятнадцяти найвищих експресій відтавали і використовували для інокуляції колби Т25.

Потім клітини ділили на дві колби 175, де проводили 24-годинні експресії в двох повторюваностях, а додаткові 60 десять флаконів кріоконсервували.

Нозерн-аналіз клонів

Тотальну РНК виділяли безпосередньо з клітин, що вирощуються в колбах Т-75, з використанням реагенту

ТКЇ20ї (Сібсо ВК) згідно з процедурою, що рекомендується виготовлювачем. Тотальну РНК, 5мкг на доріжку, фракціонували за розміром в агарозних гелях, які містили формальдегід як денатуруючий агент. Потім РНК бо переносили капілярним блотом на найлонові мембрани СЕМЕ 5СЕЕЕМ РІЗ і гібридизували з З2Р-міченим зондом ПІЕМАК2 з ПЛР-фрагмента кКДНК. Сигнали смуг визначали кількісно на моделі 603 Бетаскопа; розміри оцінювали з радіоавтографів цих блотів.

Результати

Ампліфікація

Проби аналізували за допомогою ЕІ ІЗА на всіх стадіях ампліфікації. Тільки два пули, ІЕМК1-1 і: ІЕМК1-6 були детектованими при рівнях 0,5-5,0 і 1,0 і 5,О0мкМ МТУ, відповідно. Всі інші рівні експресії були дуже низькими для детектування.

Й

Підсумовуванні результати продуктивності (мкг/мл) об'ємного продукування під час ампліфікації т

Пул ІРМК1-1 при рівні їмкМ МТХ мав найвищу об'ємну продуктивність, 9,4Омкг/мл, і був вибраний для 20 клонування. Питома продуктивність цього пулу відповідала 5,99рса.

Підтвердження експресії клонів після відтавання сч 25 о т зо ю вв 0вв ю « з Як « щ св от щ с , , :з» Клоном з найвищою експресією був ІРМК1-1-50 з питомою продуктивністю 34,48рса. Продуцентом з найвищою експресією з розрахунку на об'ємну експресію був клон ІЕМК1-1-31 (клон СНО 1-1-31) з рівнем експресії 18,7 мкг/мл.

Приклад 2 -і . Я Я - Я .

У цьому прикладі зІЕМАКа є гетерологічно секретованим білком, який продукується і секретується в культурі

ЧК» прикріплених клітин СНО. ІРМКА? є бета-субодиницею рецептора інтерферону типу І (ІЕРМАК), який являє собою гетеромультимерний рецепторний комплекс, що складається щонайменше з двох різних поліпептидних й ланцюгів, названих альфа і бета. Як і бета-субодиниця, альфа-субодиниця була перейменована і відома також (9) 50 як ІЕМАКІ. 5ІЕМАКО є розчинним і не мембранозв'язаним, оскільки він позбавлений щонайменше «мч трансмембранного домена ІРМАК2. Два режими біореактора з клітинами СНО, здатними продукувати і секретувати ЗІЕМАК2, як представлено нижче, демонструють звичайний "класичний" підхід (режим Мо4 біореактора) і нову стратегію фідингу сироватки відповідно до даного винаходу (режим Мо12 біореактора), використовуючу культуру прикріплених клітин. 59 Режим Мо4 біореактора (стратегія фідингу, що містить сироватку)

ГФ) Клон СНО 1-1-31 (експресу є звІЕМАК2) вирощували в ОМЕМ/Е12, доповненому 595 ФТС, в Т-колбах і 7 ролерних флаконах доти, поки не утворилося досить клітин для інокуляції біореактора на 4,вл. Потім клітини трипсинізували з ролерних флаконів і використовували для інокуляції реактора, що містить 2г/л мікроносіїв

Суороге 2 в 4,88л ОМЕМ/Е12, доповненого 595 ФТС. Після 24-годинного періоду починали фідинг ОМЕМ/Е12, бо доповненого 5956 ФТС, при швидкості потоку 0,3 об'єму середовища фідингу/об'єм реактора/день (об./об./д.). Цю швидкість фідингу збільшували постадійно протягом 8-денного періоду, поки не досягалася швидкість потоку 2 об./об./д. (тобто 9,бл/день). У день 0 утворення продукту (день 9 роботи реактора) середовище фідингу перемикали на ОМЕМ/Е12, доповнене мг/л рекомбінантного інсуліну, приблизно 12мг/л цитрату залізації!),

О,00б8мг/л селену і ї1Х розчину мікроелементів (ІЕСЗТЕ). Швидкість потоку фідингу близько 2о0о6./об./д. бо підтримували протягом всього періоду утворення продукту. Зростання клітин на мікроносіях і утворення зІЕМАК2 піддавали моніторингу.

Режим Мо12 біореактора (стратегія фідингу, що не містить сироватку)

Клон СНО 1-1-31 (експресує вІРЕМАК2) вирощували в ОМЕМ/Е12, доповненому 5956 ФТС, в Т-колбах і

Волерних флаконах доти, поки не утворилося досить клітин для інокуляції біореактора на 4, вл. Потім клітини трипсинізували з ролерних флаконів і використовували для інокуляції реактора, що містить 2г/л мікроносіїв

Суіюороге 2 в 4, фл ОМЕМ/Е12, доповненого 595 ФТС. Після 48-часового періоду починали фідинг ОМЕМ/Е12, що не містить сироватки, доповненого ІЕЄС5ТЕ, при швидкості потоку 0,2 об'єму середовища фідингу/об'єм реактора/день (об./об./д.). Цю швидкість фідингу збільшували постадійно протягом 8-денного періоду, поки не /о досягалася швидкість потоку 2о06./об./д. "День утворення продукту" в цій системі пов'язували з початком фідингу (день 2 роботи біореактора), оскільки цей режим не був "класичним" двофазним протоколом. Зростання клітин на мікроносіях і утворення БІЕМАКЗ піддавали моніторингу.

Результати

Як показано на Фіг.2, швидкість клітинного розподілу і щільність насичення в обох режимах Мо4 і Мо12 7/5 біореактора були порівнянними. Клітини, одержуючі підживлення (фідинг) композицією, що містить сироватку (режим Мо4), збільшувались в кількості з 1,4х1ОУклітин/мл до 6,7х1Обклітин/мл (5,5 генерацій клітин), а клітини, одержуючі підживлення (фідинг) безсироватковою композицією, збільшувалися в кількості з 2,5 х109 клітин/мл до 5,1х10клітин/мл (4,4 генерацій клітин).

Фігура З ілюструє кінетику утворення продукту ЗІЕМАКІ в режимах Мо4 і Мо12 біореактора. Клітини з фідингом

ОМЕМІ/Е12, доповненим 595 ФТС, спочатку демонстрували об'ємну продуктивність приблизно 8Омг/л/день. Однак при перемиканні на безсироваткову композицію ОМЕМ/Е12, доповненого ІЄСЗТЕ, спостерігали лаг-фазу, в якій продуктивність падала менше, ніж до 4Омг/л/д, повертаючись зворотно до 8Омг/л/д після 10-денного періоду (день 20 роботи біореактора). У протилежність цьому, клітини, одержуючі з самого початку фідинг середовища

ОМЕМІ/Е12, доповненого ІРС5ТЕ, не виявляли лаг-фази і досягали 8Омг/л/д в день 14 роботи біореактора. се

Зростання клону СНО 1-1-31 на мікроносіях Суїороге 2, з фідингом або середовищем, що містить сироватку, о або безсироватковою композицією середовища, піддавали моніторингу, як показано на Фіг.4А-4С і фігурах

ЗА-5О, відповідно, де спостерігали життєздатні клітини, забарвлені зеленим флуоресцентним барвником.

Фіг.4А-4С і Фіг.5БА-50 разом ілюструють, що обидві стратегії фідингу режимів Мо4 і Мо12 біореактора підтримують зростання клітин на мікроносіях із збільшеннями флуоресценції, що спостерігається протягом часу. о

Тепер, після повного опису даного винаходу, фахівцям з кваліфікацією в даній області буде зрозуміло, що ю те ж саме можна здійснювати в широкому діапазоні еквівалентних параметрів, концентрацій і умов, не відхиляючись від ідеї і не виходячи за рамки даного винаходу, і без надмірного експериментування. Іс)

Хоча даний винахід був описаний в зв'язку з його характерними варіантами, повинне бути зрозуміле, що його « можна додатково модифікувати. Передбачається, що дана заявка охоплює будь-які варіації, застосування або адаптацію даного винаходу відповідно до, в загальних рисах, принципів даного винаходу і включає в себе такі - відхилення від даного опису, які знаходяться в межах відомої або загальноприйнятої практики в області, до якої відноситься даний винахід, і які можуть бути застосовані до істотних ознак, викладених тут вище, згідно з об'ємом прикладеної формули винаходу. «

Всі посилання, що цитуються тут, в тому числі і опубліковані журнальні статті або реферати або відповідні заявки США або інших країн, патенти США або іноземні патенти, або інші посилання, включені посиланнями, що - с приводяться тут в повному вигляді, в тому числі з всіма результатами, таблицями, фігурами і текстом, "» представленими в посиланнях, що цитуються. Крім того, повний зміст посилань, що цитуються в посиланнях, що " приводяться тут, також в повному вигляді включено як посилання.

Посилання на відомі стадії способів, загальноприйняті стадії способів, відомі способи або загальноприйняті способи ні в якій мірі не є визнанням того, що будь-який аспект, опис або варіант даного і винаходу описується, затверджується або передбачається в релевантній області. їз Попередній опис характерних варіантів повністю розкриває загальний характер даного винаходу, який інші дослідники можуть, з використанням знань в межах кваліфікації в даній області (в тому числі змісту посилань, о що цитуються тут), легко модифікувати і/або пристосувати для різноманітних застосувань таких характерних сл 20 варіантів, без надмірного експериментування, без відхилення від загальної концепції даного винаходу. Таким чином, передбачається, що така адаптація і модифікації знаходяться в межах задуму і діапазону еквівалентів "м описаних варіантів здійснення і засновані на поясненні і керівництві, представленому тут. Повинне бути зрозуміло, що фразеологія або термінологія в описі служить меті опису і не є обмеженням, так що термінологія або фразеологія даного опису повинна інтерпретуватися кваліфікованим фахівцем в світлі приведених тут го вказівок і керівництва, в поєднанні зі знаннями фахівця із звичайною кваліфікацією в даній області. о Посилання

Аззеїрегоз еї аї.,, Зсаіед-ир Ргодисіоп ої Кесотбріпапі Нитап Кепіп іп СНО СеїЇв Тог Епгутаїйіс апа Х-гау ю зігисішге Апаїузів, У.Віоїесппої! 32:191-202 (1992).

СпПегту еї аіЇ., Рпузісаї Меспапізте ої СеїЇ Юатаде іп Місгосагтіег Сей Сийиге Віогеасіогв, ВіоФесппоіоду 60 апа Віоепдіпеегіпд 32:1001-1014 (1988).

Сіагк еї аї.,, Оріїтігіпд Сийиге Сопаййопе бог (йе Ргодисіоп ої Апіта! СеїЇв іп Місгосагтієег Сийиге,

Аппаїз Мем ХогК Асадету ої Зсіепсез 33-46 (1981).

Создгоме еї аї., "Ригіїісайоп апа Ргорепієев ої Іпзціп Кесеріог Есіодотаіїп їйот І агде-5сае Маттаїап

Сеїї Сийиге, Ргоїеіп ехргезвіоп апа Ригіїсайоп 6:789-798 (1995). б5 Саззег еї аїЇ.,, Гопо-Тепт МийКіріїсайоп ої (Ше СПпіпезе Натвіег Омагу (СНО) СеїЇ І іпе іп а бегит-Егее

Меадіит, Іп Міго Сеїшаг апа ОемеІортенпіа! Віоіоду 21(10): 588-592(1985).

Сопіеп еї аЇ,, Сгомлй апа гпМА Ргоївіп Ргодисіоп іп ап Ітргомей бегит-їтее Медішт Еогтшиїайоп, 9.СеїЇ

Віої. 115(3) Рагі 2, З58а (1991).

Кадоцгі, Сиймайоп ої Апспогаде-дерепдепі Маттарйап Сеїв апа Ргодисіоп ої Магіосиз Мег(ароїйев.

СоПоідв апа 5!ипасез В, Віоіпіепасез 2:265-272 (1994).

Їеміп еї аї.,, Ригійсайоп ої Кесотбріпапі Нитап Зесгейагу РПозрпоїразе А? (Сгоцр ІІ) Ргодисейд іп

Гопд-їегт Ітторбіїгеа сеї! Сийиге, Ргоївіп Ехрг. Ригії. (1) 27-35 (1992).

Ї оБіпіесКкі ей аїЇ., Ригйей Ргоївіїпй Ргодисів ої гОМА Тесппоіїоду Ехргеззей іп Апіта! Сей Ситге,

Віоіодісаів 22:161-169 (1994). 70 Мікоїаії еї аїЇ.,, СиШмайоп ої Маттарйап Сеїв оп Масгорогоиз Місгосагтіеге, Еплуте Місгор. Тесппої. 14:203-208 (1992).

Міївзоп, Місгосаїгтіег Се! Синиге, Віоїесппоіоду апа Сепеїйїс Епдіпеегіпд Кеміємув 6 (11): 403-439 (1989).

Опізоп еї аї.,, Веад-ю-Веай Тгапеїег ої Спіпезе Натвіег Омагу СеїЇв Овіпд Масгорогоив Місгосаї!гтіегв,

СуіюгесппоЇїоду 14:57-80 (1994).

ОНіме еї аї., Моіесцшіаг Віооду апа Віоспетівігу ої Нитап Кесотрбіпапі Роїйсіе Зітшаєйпуд Ногтопе,

Епйгореап 5осіеіу тог Нитап Кергодисіоп апа Етргуоіоду 372-382 (1996).

Кибіпзіейп, Сеїї, 77:391-400 (1994).

Зсптій еї аїЇ.,, Кереафїєй Ваїсп СиШмайоп ої гВНК СеїЇїв оп Судех З Місгосагтіеге; Апійпготбіп І,

Атіпо Асід, апа Рану Асіа Месабоїїс Оцо(епів, Аррі. Місгобіо!. Віотесппої. 38:328-333 (1992).

Теїде еї аї.,, Ргобіетв м/йй Зегит-Ргее Ргодисіоп ої Апіі-Тпиготбріп ПП Кедагаїоу Ргоіеоіуїс Асіїмйу апа

Ргодисі Омаїйу, 9.Віогесппої. 34: 101-105 (1994).

УМУаївоп еї аї,, Сотрагізоп ої М-ІПпКей ОІідозасспагідез ої Кесотбріпапі Нитап КаїйїКгеіп Ргодисей Бу

Спіпезе Натвіег Омагу сеїв оп Місгосагтіег Веадз апа іп Зегит-Ргее Зивзрепвзіоп Сийиге, Віобесппої. Ргод. 19(1) (1994). с

Уептег еї аі., Маттаїйап СеїЇ СиМигев, Аггпеіт. Рогесп./Огид Кев. 43(11); 1134 (1993).

Хіао еї а, Нідпй Оепейу Сиймайоп ої СепеїйісаПу-епдіпеегеа СНО Се І іпез МУУйАи Місгосагтіег Сийиге і)

Бузіетв, Спіп. Меа. Зеї. у). 9 (2):71-74 (1994). 7амжмогекі еї аі., Зегит-Ргее ігапвзівесіоп апа Зеіесіоп іп Спіпезе Натвіег Омагу (СНО) Сеїв,

ВіоТесппідцев. 15 (5);863-865 (1993). М ю

Claims

Формула винаходу ІС)

1. Спосіб одержання гетерологічного секретованого білка з клітин СНО, що вирощуються на мікроносіях, що « 35 передбачає стадії: чн інокуляції клітинного біореактора, що містить мікроносії як тверду підкладку для росту прикріплених клітин і безсироваткове середовище для культивування клітин, доповнене мікроелементами, інокулятом клітин-хазяїнів СНО, трансформованих для експресії гетерологічного секретованого білка, де інокулят одержують шляхом вирощування трансформованих клітин-хазяїнів СНО в клітинному культуральному « середовищі, що містить сироватку; ш-в с культивування інокульованих клітин-хазяїнів СНО в культурі прикріплених клітин без перфузії середовища для культури клітин; :з» ініціації живлення безсироваткового середовища для культури клітин, доповненого інсуліном, цитратом заліза (ІП), селеном і мікроелементами, в клітинний біореактор шляхом безперервної перфузії; збільшення швидкості живильного потоку безсироваткового середовища для культури клітин, доповненого - мікроелементами, в стадіях протягом приблизно шести-десятиденного періоду, поки не буде досягнута кінцева швидкість живильного потоку в діапазоні приблизно 1-3,5 об./об/день, для одержання і секреції ве гетерологічного білка з клітин-хазяї СНО в безсироваткове середовище для культури клітин; і сл культивування клітин-хазяїв СНО в культурі прикріплених клітин при кінцевій швидкості живильного потоку.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що інокульовані клітини-хазяїни у вказаній стадії культивування 1 інокульованих клітин-хазяїнів СНО культивують в культурі прикріплених клітин на мікроносіях протягом періоду «М в межах приблизно одного-трьох днів.

3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний період складає приблизно 2 дні.

4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що стадія ініціації живлення починається з живлення при швидкості вв Потоку в діапазоні приблизно 0,1-0,4 об./об/день безсироваткового середовища для культури клітин, доповненого інсуліном, цитратом заліза (ІІІ), селеном і мікроелементами. (Ф; 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що живлення починають при швидкості живильного потоку в ГІ діапазоні приблизно 0,2-0,3 об./об./день.

б. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що живлення починають при швидкості живильного потоку во приблизно 0,2 об./об./день.

7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що швидкість живильного потоку збільшують від стадії до стадії протягом приблизно семи-дев'ятиденного періоду.

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що швидкість живильного потоку збільшують від стадії до стадії протягом приблизно восьмиденного періоду. 65 9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кінцева швидкість живильного потоку знаходиться в діапазоні приблизно 1,5-2,506./об./день.

10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кінцева швидкість живильного потоку становить приблизно 2 об./об./день.

11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково передбачає стадію вилучення гетерологічного білка З безсироваткового середовища для культури клітин.

12. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що гетерологічний білок є розчинним рецептором інтерферону ов (вВІРМАКЗ).

13. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мікроносії являють собою Суфюороге 2.

14. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що безсироватковим середовищем для культури клітин є 70 ОМЕМ/Е12. с о ча ІС) ІС)

«

м. -

с . и? -І щ» 1 с 50 що Ф) іме) 60 б5