UA72656C2 - Set for determining the activity of no-tripsin-like proteinases in biological liquids - Google Patents

Abstract

The proposed set for determining the activity of no-tripsin-like proteinases in biological liquids contains a polystyrene case with an immobilized marking ferment that is complexly bound with the product of a proteolytic reaction, a proteinase preparation, phosphate buffer solution for preparing working solution of proteinase, control material and tested probes, detergent for preparing washing liquid, citrate buffer solution, ortophenylendiamine, hydroperite for detecting residual activity of the marking ferment, and additionally, soya tripsin inhibitor for suppressing the activity of tripsin-like proteinases.

Description

Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біології та медицині для наукових досліджень і клінічній практиці.The invention relates to biochemistry and can be used in biology and medicine for scientific research and clinical practice.

Відомий Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах (див.Known Set of reagents for the determination of primary aromatic amines in solutions and biological fluids (see

Пат. РФ Мо2097762, (5201М33/48, Аб1819/02), який містить у відповідних упаковках наважку трихлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 5О0мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які пристосовані до утворення розчину для діазотування безпосередньо перед аналізом (ех їетроге), наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин М-(1)-нафтилетилендіамінодигідрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0,018мкмоль стандартного аміну, який аналізують.Stalemate. Russian Federation Mo2097762, (5201M33/48, Ab1819/02), which contains in appropriate packages a measure of trichloroacetic acid, which when dissolved in 5O0 ml of distilled water gives a solution that leads to the precipitation of proteins, strips of paper with sodium nitric acid, which are adapted to the formation of a solution for diazotization immediately before the analysis (ex iatroge), a weight of ammonium sulfamic acid, which when dissolved in 25 ml of distilled water gives a solution for binding the remaining sodium nitric acid, a solution of M-(1)-naphthylethylenediaminodihydrochloride for the formation of a colored azo compound, strips of paper containing 0.018 μmol of the standard amine to be analyzed.

Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність, але він призначений тільки для визначення ароматичних амінів.Using the kit allows you to simplify the analysis and increase its accuracy, but it is intended only for the determination of aromatic amines.

Відомий спосіб визначення активності протеїназ або їх інгібіторів в біологічних рідинах (див. Пат. РФThere is a known method of determining the activity of proteinases or their inhibitors in biological fluids (see Pat. RF

Ме1655991, С1201/37), прототип, який містить полістироловий планшет, що іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язано із субстратом протеолітичної реакції, а саме альбуміном сироватки бика, препарат протеїнази - трипсин, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратами буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту.Me1655991, С1201/37), a prototype that contains a polystyrene tablet immobilized with a marker enzyme that is complexly associated with the substrate of the proteolytic reaction, namely bull serum albumin, a proteinase preparation - trypsin, a phosphate buffer for the preparation of a working proteinase solution, a control material and experimental samples for analysis, detergent for preparation of washing liquid, citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite for detection of residual activity of the marker enzyme.

Чутливість способу становить - 109-10719г,The sensitivity of the method is - 109-10719g,

Недоліком відомого способу є складність здійснення етапу підготовки: приготування комплексу маркерного ферменту та субстратного білка і його іммобілізація на поверхні полістиролових плашок, що потребує використання спеціальних реагентів, обладнання, високої кваліфікації оператора.The disadvantage of the known method is the complexity of the preparation stage: preparation of a complex of marker enzyme and substrate protein and its immobilization on the surface of polystyrene dies, which requires the use of special reagents, equipment, and high qualification of the operator.

Крім того, відомий спосіб не передбачає визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ (НТПП), що може бути використано в якості критерію прогнозу розвитку, перебігу захворювань різного походження та контролю ефективності лікування.In addition, the known method does not involve determining the activity of non-trypsin-like proteinases (NTPs), which can be used as a criterion for forecasting the development, course of diseases of various origins and monitoring the effectiveness of treatment.

В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна було б специфічно та простим способом визначати активність НТПП у біологічних рідинах.The basis of the invention is the task of developing a kit that would be able to specifically and simply determine the activity of NTPP in biological fluids.

Поставлена задача вирішується у наборі для визначення активності НТПП у біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет, що іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту.The task is solved in a kit for determining the activity of NTPP in biological fluids, which contains a polystyrene tablet immobilized with a marker enzyme that is complexly associated with the substrate of the proteolytic reaction, a proteinase preparation, a phosphate buffer for preparing a working proteinase solution, a control material and test samples for analysis, detergent for preparation of washing liquid, citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite for detection of residual activity of the marker enzyme.

Згідно з винаходом відрізняючими ознаками є те, що: - набір додатково містить інгібітор трипсину із сої для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, - усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів: препарат протеїнази (трипсин - 1мг), фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка, інгібітор трипсину із сої - 1мг.According to the invention, the distinguishing features are that: - the set additionally contains a trypsin inhibitor from soybeans to suppress the activity of trypsin-like proteinases, - all components are provided in separate packages with the following composition of components: proteinase preparation (trypsin - 1 mg), phosphate buffer - 12.5 ml , detergent - 0.75ml, citrate buffer - bml, orthophenylenediamine - 2mg or 1 tablet, hydroperit - 1 tablet, trypsin inhibitor from soy - 1mg.

Додатково наявність у наборі інгібітору трипсину із сої обумовлено тим, що він пригнічує активність трипсиноподібних ферментів, які здатні розщеплювати навіть глобулярні білки, такі як маркерний фермент.In addition, the presence of a soy trypsin inhibitor in the kit is due to the fact that it inhibits the activity of trypsin-like enzymes, which are capable of cleaving even globular proteins, such as the marker enzyme.

Вміст та певна кількість компонентів у наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення способу визначення активності НТПП у біологічних рідинах (40 зразків у дублікаті).The content and a certain number of components in the set provide optimal conditions for the method of determining the activity of NTPP in biological fluids (40 samples in duplicate).

Виконання любого методу складається з 2-х основних етапів: приготування реагентів, які необхідні для проведення аналізу і серії послідовних операцій здійснення методики. Від якості виконання 1-го етапу роботи в значній мірі залежить кінцевий результат аналізу. Необхідна точність вимірювань, спеціальне обладнання, висока кваліфікація оператора. З метою підвищення точності і порівнянності результатів для багатьох методів, які передбачають масові дослідження, виготовляють відповідні реагенти в спеціалізованих лабораторіях і реалізують у вигляді наборів. Придбання повного комплекту реагентів у наборі звільняє від пошуку необхідних компонентів по каталогах різних фірм-виробників та постачальників. Крім того, придбання окремих компонентів у необхідній лімітованій кількості для проведення серії аналізів потребує надлишкових фінансових витрат.The implementation of any method consists of 2 main stages: the preparation of reagents, which are necessary for the analysis and a series of consecutive operations for the implementation of the method. The final result of the analysis largely depends on the quality of the 1st stage of work. Accuracy of measurements, special equipment, and high qualification of the operator are necessary. In order to increase the accuracy and comparability of results for many methods that involve mass research, appropriate reagents are manufactured in specialized laboratories and sold in the form of kits. Buying a complete set of reagents in a set frees you from searching for the necessary components in the catalogs of various manufacturers and suppliers. In addition, the purchase of individual components in the necessary limited quantity for conducting a series of analyzes requires excessive financial costs.

Дослідження по запропонованому набору були проведені в Інституті терапії АМН України. Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами.Research on the proposed set was conducted at the Institute of Therapy of the Medical Academy of Ukraine. Calculations for the completion of sets have been verified by laboratory tests.

Використання запропонованого рішення забезпечує спрощення способу, зменшення витрат на придбання реагентів, розширення області застосування, високу відтвореність способу (не менш 95905).The use of the proposed solution provides simplification of the method, reduction of costs for the purchase of reagents, expansion of the field of application, high reproducibility of the method (at least 95905).

Набір складається із наступних компонентів: - Плашка, яка іммобілізована маркерним ферментом, що комплексно пов'язано із альбуміном сироватки бика. - Флакон Ме1 - детергент, твін-2О (0,75мл). - Флакон Ме2 - фосфатний буфер (10-15мл). - Флакон МеЗ - цитратний буфер (бмл). - Флакон Ме4 - ортофенілендіамін (2мг або 1 таблетка). - Флакон Ме5 - препарат протеїнази (1 мг трипсину). - Флакон Моб - 0,0025н НОЇ (мл). - флакон Ме7 - інгібітор трипсину із сої (1мг). - Гідроперит (1 таблетка).The set consists of the following components: - A die that is immobilized with a marker enzyme that is complexly associated with bull serum albumin. - Vial Me1 - detergent, twin-2O (0.75 ml). - Vial Me2 - phosphate buffer (10-15 ml). - Vial MeZ - citrate buffer (bml). - Vial Me4 - orthophenylenediamine (2 mg or 1 tablet). - Vial Me5 - proteinase preparation (1 mg of trypsin). - Vial Mob - 0.0025n NOI (ml). - bottle Me7 - trypsin inhibitor from soy (1 mg). - Hydroperit (1 tablet).

Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору.The analysis is carried out according to the instructions provided with the kit.

Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0,5мл детергенту із флакону Ме1 додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону Ме2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкл детергенту із флакона Ме1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують вихідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Препарат протеїнази із флаконуPreparation of reagents from the set: 1. Prepare the washing liquid: add 0.5 ml of detergent from the Me1 bottle to 1 liter of distilled water. 2. Prepare a phosphate buffer: dilute the liquid from the Me2 bottle to 250 ml with distilled water and add 0.25 μl of detergent from the Me1 bottle. 3. Wash the die 2-3 times with distilled water containing a detergent. 4. Prepare proteinase stock solution and control material (on ice): Proteinase preparation from a vial

Ме5 (трипсин), спочатку розчиняють у тїмл 0,0025н НС. Потім 1б0мкл розчину додають до 19,84мл фосфатного буферу, який містить детергент, - вихідний розчин. Надалі проводять серію послідовного розведення вихідного розчину за наступною схемою:Me5 (trypsin), first dissolve in this ml of 0.0025N NS. Then, 10 μl of the solution is added to 19.84 ml of phosphate buffer containing a detergent, the original solution. In the future, a series of serial dilutions of the original solution is carried out according to the following scheme:

ТаблицяTable

МоМо - М артів мкг/мл мл мл 1 о - 1,0 - 2 0,005 1:9 Мо4 1,8 0,2Ме4MoMo - M artiv μg/ml ml ml 1 o - 1.0 - 2 0.005 1:9 Mo4 1.8 0.2Me4

З 0,01 1:9 Мо5 1,8 0,2Ме5 4 0,05 1:3 Моб 12 0, А4Моб в 01 1:9 Ме7 1,8 0,2Ме7 6 02 1:19 Мев 1,9 0,1Ме8 17 0,2 вихідного 7 1,0 вихідного 1,4 " розчину розчину 17 0,75 8 4,0 вихідного 0,75 вихідного розчину розчину 5. Готують інгібітор трипсину із сої безпосередньо перед використанням: у флакон Ме7 додають 1мл фосфатного буферу, який приготовлено раніше по п.2, вихідний розчин. Потім розводять: у 100000 разів, наприклад, спочатку у 100 (50:495Омкл), потім у 1000 разів (50:49950мкл). б. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратний буфер із флаконумеЗ розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону Ме4 або таблетку, потім - гідроперит (готується суміш перед використанням).C 0.01 1:9 Mo5 1.8 0.2Me5 4 0.05 1:3 Mob 12 0, A4Mob in 01 1:9 Me7 1.8 0.2Me7 6 02 1:19 Mev 1.9 0.1Me8 17 0.2 source 7 1.0 source 1.4" solution solution 17 0.75 8 4.0 source 0.75 source solution solution 5. Trypsin inhibitor from soybeans is prepared immediately before use: 1 ml of phosphate buffer is added to the Me7 vial, which was prepared earlier according to p. 2, the initial solution. Then it is diluted: 100,000 times, for example, first 100 times (50:495Omcl), then 1000 times (50:49950μl). b. Prepare a mixture to detect the residual activity of the marker enzyme: the citrate buffer from the vial is diluted 2 times with distilled water, orthophenylenediamine from the Me4 vial or a tablet is added, then hydroperite (the mixture is prepared before use).

Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (п-40): зразки плазми/сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). Зразки слини людини, сироватки крові та цитозолю тканин щурів розведення не потребують. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ доданням до дослідних зразків 1:1 розчину інгібітор трипсину із сої, інкубують 5 хвилин при 37"С. 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення іммобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язано із білковим субстратом: вносять у лунки полі стиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені по п. З та інкубують 15 хвилин при 3770. 7. Усувають реакційну суміш шляхом відмивання плашки як вказано раніше. 8. Готують 50 95 сірчану кислоту (у набір не входить). 9. Визначають залишкову активність іммобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин. 10. Зупиняють реакцію додачею по 50мкл у лунку 5095 сірчаної кислоти. 11. Визначають оптичну щільність розчинів при 49О0нм за допомогою мікроспектрофотометра. 12. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активністьConducting the analysis: 1. Separately on the titration board, test samples are prepared (p-40): samples of human blood plasma/serum are diluted 250 times with phosphate buffer, for example, by sequential dilution of 25 and 10 times (add 40 μl of serum to 960 μl of buffer, then up to 180 μl of buffer - 20 μl of the 1st serum dilution). Samples of human saliva, blood serum, and rat tissue cytosol do not require dilution. 2. Put the control material into the wells of the titration board. 3. Carry out a reaction to suppress the activity of trypsin-like proteinases by adding a 1:1 solution of trypsin inhibitor from soybeans to the test samples, incubate for 5 minutes at 37"C. 4. Carry out a proteolytic reaction of cleavage of the immobilized marker enzyme, which is complexly associated with the protein substrate: wells of polystyrene dies (100 μl each) control material and test samples prepared according to item C and incubated for 15 minutes at 3770. 7. Eliminate the reaction mixture by washing the die as indicated earlier. 8. Prepare 50 95 sulfuric acid (the kit does not 9. Determine the residual activity of the immobilized marker enzyme by adding a mixture prepared from citrate buffer, orthophenylenediamine, and hydroperite. Incubate for 3-5 minutes. 10. Stop the reaction by adding 50 μl of sulfuric acid to well 5095. 11. Determine the optical density of the solutions at 49O0nm using a microspectrophotometer. 12. Construct a calibrated curve based on the results of measurements of control times and calculate the activity

НТПП за відповідною формулою (показано у прикладі).NTPP according to the appropriate formula (shown in the example).

Можливість здійснення аналізу з використанням запропонованого набору підтверджується прикладом.The possibility of performing analysis using the proposed set is confirmed by an example.

Приклад 1. Визначення НТПП у сироватці крові людини.Example 1. Determination of NTPP in human blood serum.

Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0,5мл детергенту із рлакону Ме1 додають до 1 л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону Ме2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкл детергенту із флакона Ме1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують вихідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Препарат протеїнази із флаконуPreparation of reagents from the set: 1. Prepare a washing liquid: add 0.5 ml of detergent from rlacon Me1 to 1 liter of distilled water. 2. Prepare a phosphate buffer: dilute the liquid from the Me2 bottle to 250 ml with distilled water and add 0.25 μl of detergent from the Me1 bottle. 3. Wash the die 2-3 times with distilled water containing a detergent. 4. Prepare proteinase stock solution and control material (on ice): Proteinase preparation from a vial

Ме5 (трипсин) спочатку розчиняють у тїмл 0,0025 н НС. Потім 160мкл розчину додають до 19,84мл фосфатного буферу, який містить детергент, - вихідний розчин. Контрольний матеріал готують шляхом серії послідовного розведення вихідного розчину за схемою, яка представлена у Табл. 1. 5. Готують інгібітор трипсину із сої безпосередньо перед використанням: у флакон Ме7 додають відповідноMe5 (trypsin) is first dissolved in 0.0025 N HCl. Then 160 μl of the solution is added to 19.84 ml of phosphate buffer, which contains a detergent - the original solution. The control material is prepared by a series of successive dilutions of the original solution according to the scheme presented in Table. 1. 5. Prepare a trypsin inhibitor from soybeans immediately before use: add Me7 to the vial accordingly

Тмл фосфатного буферу, що приготовлено раніше по п. 2, - вихідний розчин. Потім розводять у 100000 разів, наприклад, спочатку у 100 (50:4950мкл), потім у 1000 разів (50:49950мкл). 6. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратний буфер із флаконуTml of phosphate buffer, prepared earlier according to item 2, is the initial solution. Then it is diluted 100,000 times, for example, first 100 times (50:4950μl), then 1000 times (50:49950μl). 6. Prepare a mixture for detecting the residual activity of the marker enzyme: citrate buffer from the bottle

МоЗ розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону Ме4 або таблетку, потім - гідроперит (готується суміш перед використанням).MoZ is diluted 2 times with distilled water, orthophenylenediamine from a bottle of Me4 or a tablet is added, then - hydroperite (the mixture is prepared before use).

Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (п-40): зразки сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 9бО0мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ додаванням до дослідних зразків 17 розчину інгібітор трипсину із сої, інкубують 5 хвилин при 3770. 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення іммобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язано із білковим субстратом: вносять у лунки полістиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені по п. З та інкубують 15 хвилин при 3770. 7. Усувають реакційну суміш шляхом відмивання плашки як вказано раніше. 8. Готують 50 95 сірчану кислоту (у набір не входить). 9. Визначають залишкову активність іммобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин.Conducting the analysis: 1. Separately on the titration board, test samples are prepared (p-40): samples of human blood serum are diluted 250 times with phosphate buffer, for example, by sequential dilution of 25 and 10 times (40 μl of serum is added to 9 bO0 μl of buffer, then to 180 μl buffer - 20 μl of the 1st serum dilution). 2. Put the control material into the wells of the titration board. 3. Carry out a reaction to suppress the activity of trypsin-like proteinases by adding 17 of a trypsin inhibitor solution from soybeans to the test samples, incubate for 5 minutes at 3770. 4. Carry out a proteolytic reaction of cleavage of the immobilized marker enzyme, which is complexly associated with the protein substrate: it is introduced into the wells of polystyrene dies ( 100 μl each) control material and test samples prepared according to paragraph C and incubated for 15 minutes at 3770. 7. Remove the reaction mixture by washing the plate as indicated earlier. 8. Prepare 50 95 sulfuric acid (not included in the kit). 9. Determine the residual activity of the immobilized marker enzyme by adding a mixture prepared from citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite. Incubate for 3-5 minutes.

10. Зупиняють реакцію додачею по 5Омкл у лунку 50 95 сірчаної кислоти. 11. Визначають оптичну щільність розчинів при 49О0нм за допомогою мікроспектрофотометра. 12. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність10. Stop the reaction by adding 50 ml of sulfuric acid to the well. 11. Determine the optical density of solutions at 49O0nm using a microspectrophotometer. 12. Build a calibrated curve based on the results of measurements of control samples and calculate the activity

НП, зарюрмулию: 1000000 (г/л год), де: С зал. - концентрація НТПП, яка визначена по каліброваній кривій, мкг/мл, 250 - розведення зразків сироватки крові людини, 4 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину, 1000 - коефіцієнт перерахунку на Тл, 1000000 - коефіцієнт перерахунку у грами.NP, Zaryurmulyu: 1,000,000 (g/l h), where: Hall C. - concentration of NTPP, which is determined according to the calibration curve, μg/ml, 250 - dilution of human blood serum samples, 4 - conversion factor for 1 hour, 1000 - conversion factor for Tl, 1000000 - conversion factor in grams.

Висновок: Вказаний приклад підтверджує можливість спрощення постановки аналізу активності НТПП у біологічних рідинах.Conclusion: This example confirms the possibility of simplifying the formulation of the analysis of NTPP activity in biological fluids.

Технічний результат: Використання винаходу у порівнянні з прототипом забезпечує спрощення проведення біохімічного аналізу, зменшення витрат на придбання реагентів у 250 разів, розширення області застосування.Technical result: The use of the invention in comparison with the prototype ensures simplification of biochemical analysis, reduction of costs for the purchase of reagents by 250 times, expansion of the field of application.

Відтвореність способу не менш 9595.The reproducibility of the method is at least 9595.

Claims (1)

Набір для визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет, що іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно зв'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, який відрізняється тим, що набір додатково містить інгібітор трипсину із сої для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів: препарат протеїнази 1 мг,A kit for determining the activity of non-trypsin-like proteinases in biological fluids, which contains a polystyrene tablet immobilized with a marker enzyme that is complexly bound to the substrate of the proteolytic reaction, a proteinase preparation, a phosphate buffer for the preparation of a working proteinase solution, a control material and test samples for analysis, a detergent for the preparation of washing liquid, citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite to detect the residual activity of the marker enzyme, which is distinguished by the fact that the kit additionally contains a trypsin inhibitor from soybeans to inhibit the activity of trypsin-like proteinases, all components are provided in separate packages with the following composition of components: proteinase preparation 1 mg, (трипсин)(trypsin) фосфатний буфер 12,5 мл,phosphate buffer 12.5 ml, детергент 0,75 мл,detergent 0.75 ml, цитратний буфер 6 мл,citrate buffer 6 ml, ортофенілендіамін 2 мг або 1 таблетка,orthophenylenediamine 2 mg or 1 tablet, гідроперит 1 таблетка,hydroperit 1 tablet, інгібітор трипсину із сої 1 мг.trypsin inhibitor from soy 1 mg.