UA45697A - Біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактеріозів "пробіоваг" - Google Patents

Abstract

Біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактеріозів містить штам Lactobacillus plantarum ВКПМ В-5002, штам молочнокислих бактерій Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ВКПМ В-3813 і наповнювач.

Description

Опис винаходу

Винахід відноситься до області біотехнології і може бути використаний в медицині, 2 акушерсько-гінекологічній практиці як біопрепарат для профілактики і лікування піхвових дисбактеріозів жінок.

У гінекологічній практиці піхвові дисбактеріози прийняли загрозливий характер. Вони характеризуються різким зниженням (до 6590), а то і повною відсутністю молочнокислих бактерій, що є стабілізуючим чинником здоров'я статевої сфери жінок. Для відновлення нормальної мікрофлори застосовують препарати, що складаються з живих клітин корисних мікроорганізмів. 70 В даний час відомі препарати, застосовувані в гінекологічній практиці для санації жінок, що страждають запальними захворюваннями геніталій: ацилакт |1), вагілак, (2), лактобактерін ІЗ). До складу цих препаратів входять штами молочнокислих бактерій, що мають антагоністичну активність у відношенні патогенних мікроорганізмів, присутніх у піхві при різних патологічних процесах. Основу цих препаратів складають види молочнокислих бактерій І асіорасіїи5 асіаорпісв, І. Ттепгпепішт, ГІ. ріапіагит. 12 Найбільш близьким по сутності і результату, що досягається, є еубіотичний лактобактерін - препарат

І асіорасіегіпит зіссцт для застосування в гінекологічній практиці (4). В основу лактобактеріну входить ліофілізована маса живих клітин лактобацил видів Іасіорасійш5 Тегтепішт 90-710-4 і І.ріапіагит В-РА-3.

Лікувальний ефект препарату обумовлений антагоністичною дією мікробних клітин лактобацил відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів - збудників запальних захворювань жіночої статевої сфери, а також жінок з порушеннями чистоти піхви ІП - ІМ ступеня. Ефект забезпечується, з одного боку, здатністю штамів лактобацил до активного кислотоутворення, з іншого боку - один зі штамів - Ї. Регтепішт 90 ТС-4 має здатність продукувати лізоцим. Йому також властива середньоадгезивна активність, відповідальна за прикріплення клітин до піхвового епітелію.

Зазначені штами здатні продукувати молочну кислоту тільки на середовищах, що містять як джерело харчування вуглеводні компоненти (такі, як глюкоза, у меншому ступені лактоза). Ці ж вуглеводи служать « середовищем для харчування умовно патогенних (УПЕ) і патогенних мікроорганізмів. По швидкості засвоєння вуглеводного субстрату УПЕ випереджають ріст лактобацил. Повноцінний ріст їх на середовищах уже через 24 години, а в лактобацил - тільки через 48 годин, що не дає можливість цим штамам швидко розмножуватися у піхвовому каналі, створити бар'єр для життєдіяльності мікрофлори, що інфікує. в

Недоліком відомого препарату лактобактеріну є також той факт, що адгезивні властивості штамів Ф) оцінювалися на моделі еритроцитів людини, а не на піхвових клітинах і були віднесені до середньоадгезивних.

Надалі один зі штамів - І. Тегптепішт 90-ТС-4 - був додатково оцінений і на моделі клітин піхвового епітелію в ке, основному як низькоадгезивний. Це підтверджується тим, що тільки 2 клітини цього штаму адгезуються на кожній (У з 50-и епітеліальних клітин піхви. Низька адгезія виявляється в 62,590 досліджених варіантах, що свідчить про їх низьку колонізувальну здатність, що створює захисний бар'єр на шляху проникнення патогенних М мікроорганізмів. Отже, лікувальний ефект такого препарату недостатньо виражений.

Крім того, необхідно враховувати той факт, що ГІ. Теппепішт 90-ТС-4 відноситься до гетероферментативних лактобацил, добре ферментує глюкозу з утворенням кислоти і газу. У той же час відомо, що газоутворення « створює умови, сприятливі для розмноження і домінування мікроорганізмів, що приводять до піхвового З дисбактеріозу. При цьому різко знижується ефективність біопрепарату. с В основу винаходу покладена задача створити такий піхвовий біопрепарат, у якому шляхом сполучення

Із» паличкоподібних і кокових клітин досягається підвищення адгезії до піхвових клітин, білків і гликопротеіїнів, відповідальних за приживлюваність молочнокислих бактерій в організмі жінок і виключення газоутворення.

Завдяки цьому препарат володіє високою антагоністичною активністю у відношенні патогенних мікроорганізмів, 49 здатністю продукувати лізоцим, вітаміни групи В, високою швидкістю росту. Для рішення задачі запропонований шк біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактеріозів, що містить молочнокислі бактерії виду 4! І асіорасійи5 ріапіагат і наповнювач, у якому, відповідно до винаходу, як молочнокислі бактерії виду

Ї асюрасійив ріапіагит він містить штам І асіобасіїїшз ріапіагит ВКПМ 8-5002 і додатково штам молочнокислих б бактерій Зігеріососсиз заїїмагіиз зирегр. (пегппорпіїиз ВКПМ В-3813, при такому співвідношенні компонентів, об 9о: о 50

І асіорасійив ріапіагит ВКПМ 8-5002 (1,0 - 5,0) х 108 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 80 - 84; "м згеріососсив ваїїмагіив зиревр. Іегторпіїив ВКПМ У-3813 (1,0 - 5,0) х 109 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) 12 - 14;

Наповнювач 2-8; 29 Штами, використовувані як основ пропонованого піхвового пробіотика, характеризуються середнім і високим у» ступенем адгезивності до піхвового епітелію, здатністю гнітити газоутворювальну мікрофлору й адсорбуються на білках і глікопротеінах, що знаходяться у тканинах організму людини і мікроорганізмах, входячи до складу клітинних оболонок, і беручи участь тим самим у міжклітинній адгезії макро- і мікроорганізму. Це й обумовлює високу ефективність пропонованого препарату. Наповнювач необхідний для захисту життєздатності клітин при 60 ліофільнім висушуванні.

Бактерії характеризуються також здатністю адсорбуватися до білків і глікопротеінів, що виконують захисну функцію. Нами вперше показано, що в ролі рецепторів для адгезинів штамів лактобацил і стрептококів пробіотика можуть бути одночасно фібронектин, трансферин, у-глобулін, конканавалин-А і муцин.

Використовували метод - реакцію адсорбції бактерій (РБС) до цих субстратів, що закріплювали на бо полістироловій поверхні (див. таблицю 1). -Д-

Штами одержували шляхом їхньої селекції по ознаці адсорбції клітин до іммобілізованих специфічних білків і глікопротеінів, а також здатності придушувати газоутворення мікроорганізмів, що викликають піхвовий дисбактеріоз.

Штами депоновані у Всеросійській колекції промислових мікроорганізмів під реєстраційними номерами

Ї асюрасійив ріапіагит В-5002, 5іг. заїїмагіиз виргр. (пеппорпйиз В-3813.

Вивчення здатності прикріплюватися до епітеліальних клітин піхви проводили, використовуючи метод Т. А.

Брилене. Про ступінь адгезивності штаму судили по індексу адгезивності мікроорганізму (ІАМ)- середній кількості мікробних клітин, що прикріпилися до піхвової епітеліальної клітини, з обліку 50-ти, що беруть 7/о участь в адгезивнім процесі клітин епітелію піхви (див. таблицю 2).

Здатність штамів пробіотика гнітити газоутворювальну мікрофлору вивчали на живильному середовищі, найбільше оптимальнім, як для росту штамів молочнокислих бактерій, так і газоутворювальних: МПБ, що містить по 195 глюкози, лактози, агар-агару і 595 дріжджового автолізату. Випробувано три концентрації суспензій клітин штамів пробіотика, що гнітять газоутворення: 10 8 - 1019 КУО в їмл. Цілком затримувала розвиток 75 газоутворювальних бактерій суміш штамів, що мала (об 905): І асіорасіїчз ріапіагит ВКПМ-В-5002 - 80 - 84, БІГ. заїїмагиз зирзр. (пегторпіїиз ВКПМ-В-3813 - 12- 14 і наповнювач 2-8 (див. таблицю 3).

Біомаса І .ріапіагит 1 х 1089 і біомаса Зігеріососсизв заїїмагіце зибер (егторпіїнв має 1 х 109 живих мікробних клітин у мл, ліофілізованих у знежиреному молоці з додаванням сахарозно - желатинового середовища в співвідношенні 1 : 1.

Спосіб одержання препарату.

Готують живильне середовище (МРС), оптимальне для росту молочнокислих бактерій. Кожен штам вирощують окремо. З цією метою в різні ємності для вирощування, що містять по 2л живильного середовища вносять по 595 посівного матеріалу. Вирощування роблять у термостаті при ї - 3770. І. ріапіагит вирощують 24 години, а Зігеріососсиз заїїмагіив вирер. (пегторпішв - 18 годин. Титр клітин склав КУО: (0,5 - 1,0) х 107 паличок 1(1,0 - 1,5) х 108 коків у 1мл. Культуральні рідини центрифугують роздільно для одержання сирих концентратів « живої біомаси, згущених у 10 разів. Біомаса відповідно склала 1,0 х 109 - |. ріапіагит і (1,5 - 2,0) х 109 вк, заїїмагіив зирер. (пегторпйи5. Сухий препарат одержували ліофільним висушуванням.

Приклад 1. Кількість живих клітин у 1г сухого препарату склала, (1,0 -5,0) х 108 - І. ріапіагит і (1,0 - 5,0) х 109 зіг. заїїмагиз зирзр (пеппорпйив5. Це найбільш оптимальне співвідношення штамів, при якому спостерігалася - найбільш висока прикріплюваність клітин до піхвового епітелію і найбільша здатність до придушення Ге) газоутворювальної мікрофлори.

Приклад 2. Сиру біомасу кожного штаму і сухий препарат одержували як описано вище, але кількість живих ї-о клітин у 1г сухого препарату одержували у межах (0,5 - 1,0) х 109 паличкоподібних клітин І. ріапіагит і (6,0- ЩО 10,0) х 109 - кокових клітин Зіг. ваїїмагіив вибер (пегторпйив. У отриманого препарату кількість клітин з «Е високою адгезивною активністю збільшилося до 8095, але на 5095 знизилася здатність гнітити ріст газоутворювальної мікрофлори.

Приклад 3. Сиру біомасу кожного штаму і сухий препарат одержували як описані вище, але кількість живих клітин у 1 г сухого препарату одержували в межах (2,5 - 7,0) х 109 паличкоподібних клітин І. ріапіагит і (0,1 - « 400 1,0) х 109 - кокових клітин Зіг. заїїмагйиве взирер (ШТепторнпйшве. В отриманого препарату кількість клітин з - с високою адгезивною активністю зменшилося до 50905, здатність гнітити ріст газоутворювальної мікрофлори а залишилася на місці. В останніх двох прикладах активність препарату знизилася. ,» Як показали іспити, препарат характеризується високою антагоністичною активністю по відношенню до патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, виділених з піхви жінок, що страждають піхвовим дисбактеріозом різної етіології. Антагоністична активність виявляється на безвуглеводному середовищі, тобто т» не тільки за рахунок молочної кислоти, яка продукується штамами пробіотика, а і за рахунок біологічно сл активних речовин, що виділяють клітини цих бактерій.

При використанні суміші штамів у препараті !. ріапіагит і біг. ваїїмагив вз(Ирер. (ПептпорпйЙив (о) спостерігається синергізм антагоністичної дії пробіотика на патогенну й умовно патогенну мікрофлору (див. с 50 таблицю 4).

Дослідження ефективності пробіотика при піхвових дисбактеріозах у жінок проводили на базі Інституту що педіатрії, акушерства і гінекології АМН України. Зміни в складі мікрофлори піхви - в Інституті мікробіології і вірусології НАНУ.

Джерела інформації: 1. В. В. Поспелова, и др., Медицинские аспекть! микробной зкологии. - М.: 1991. - С. 95 - 210. з» 2. Р. МШепецме, М. К. Іеїгтапсдії, ЇЇ. Н. Вогдеіеаш Каррогі їїпаї де Кеспегспе. Іпвійці Козвзеї| Іпс.

Зресіа|івіе еп сишгез І асіїдцев. - Сапада Мопігеа)!. 1992. - р. 40. 3. Патент КИ Мо 2133272 МПК С12М1/20, 1999. 4. И. В. Соловьева, Антибиотики и микрозкология человека и животньх. - М.: 1988. - с. 158.

Claims (1)

1. Формула винаходу Біопрепарат для лікування і профілактики піхвових дисбактеріозів що містить молочнокислі бактерії виду 65 Гасіорасіїйи5 ріапіагут наповнювач, який відрізняється тим, що як молочнокислі бактерії виду І асіораснив ріапіагит він містить штам Іасіорасіїйшз ріапіагит ВКПМ 8-5002 і додатково штам молочнокислих бактерій

   Бігеріососсиз заїїмагіиз зурегр. (пегторпіиз ВКПМ В8-3813 при такому співвідношенні компонентів, об. 9о: І асіорасіїив ріапіагот ВКПМ У-5002 (1,0-5,0)х109 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину) - 80-84 Вігеріососсиз ваїмагіив вирер. (пегторпйшв ВКПМ У-3813 (1,0-5,0)х109 живих мікробних клітин у 1 мл фізіологічного розчину). - 12-14 Наповнювач /-- 2-8 « че б» ісе) т) « -

   с . а ї о б» іс) "м 52 60 б5