UA22952U - Process for manufacture of ceruloplasmin - Google Patents
Process for manufacture of ceruloplasmin Download PDFInfo
- Publication number
- UA22952U UA22952U UAU200701806U UAU200701806U UA22952U UA 22952 U UA22952 U UA 22952U UA U200701806 U UAU200701806 U UA U200701806U UA U200701806 U UAU200701806 U UA U200701806U UA 22952 U UA22952 U UA 22952U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sorbent
- enzyme
- acetate buffer
- buffer solution
- differs
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 21
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical group CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 claims description 9
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 5
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 5
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920002292 Nylon 6 Polymers 0.000 description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229920004905 octoxynol-10 Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Корисна модель відноситься до медицини, а саме до одержання донорського ферменту церулоплазміну, що 2 є мідьвмісним глобулярним білком плазми крові ссавців, і може бути використаний при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові.A useful model relates to medicine, namely to the preparation of the donor enzyme ceruloplasmin, which 2 is a copper-containing globular protein of the blood plasma of mammals, and can be used in the production of enzyme drugs from the blood plasma.
Найбільш близьким є спосіб одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ функціональною групою, елюцію та наступне очищення, КО, патент Мо2087150, опубліковано 20.08.1997, кл. АЄ1КЗ5/16 11), в якому отриманий після хроматографії елюат з концентрацією білка 0,5...2,095 піддають відстоюванню протягом 6...12 годин при рн 5,1..54 і іонній силі 0,01...0,04, центрифугують та концентрують ультрафільтрацією. Сорбцію на іонообміннику, де як такий використовують ДЕАЕ-сефадекс А-50, проводять в 0,05М ацетатному буферному розчині при рН 5,5 протягом 5...7 годин. Після відстоювання промивання проводять 0,05М ацетатним буферним розчином при рН 5,5...7,0, що містить 0,07М хлористого натрію. 19 Недоліком відомого способу є вірусонебезпечність цільового продукту, оскільки спосіб не забезпечує ефективного вилучення вірусів при очистці. Так, титр цільового продукту, до якого перед очисткою було внесено 4,5і0910 ТЦІДьо/см? модельного вірусу вірусної діареї ВМОМ, становить після очистки »3,5І0494о ТЦіІДьо/смУ. Крім того, часткова денатурація білка, що відбувається під час центрифугування, приводить до зниження виходу цільового продукту.The closest is the method of obtaining ceruloplasmin, which includes dissolving the raw material in an acetate buffer solution, sorption of the enzyme on an ion exchanger with a DEAE functional group, elution and subsequent purification, KO, patent Mo2087150, published on August 20, 1997, cl. АЕ1КЗ5/16 11), in which the eluate obtained after chromatography with a protein concentration of 0.5...2.095 is subjected to settling for 6...12 hours at pH 5.1...54 and ionic strength 0.01...0, 04, centrifuged and concentrated by ultrafiltration. Sorption on an ion exchanger, where DEAE-sefadex A-50 is used as such, is carried out in a 0.05M acetate buffer solution at pH 5.5 for 5...7 hours. After settling, washing is carried out with 0.05 M acetate buffer solution at pH 5.5...7.0, containing 0.07 M sodium chloride. 19 The disadvantage of the known method is the virulence of the target product, since the method does not ensure effective removal of viruses during cleaning. Yes, the titer of the target product to which 4.5 and 0910 TCIDo/cm was added before purification? of the model virus of the VMOM viral diarrhea, after purification is »3.5І0494о TCіIDє/cmU. In addition, the partial denaturation of the protein that occurs during centrifugation leads to a decrease in the yield of the target product.
Задачею корисної моделі є удосконалення способу одержання церулоплазміну, в якому за рахунок запропонованої комплексної обробки і умов її проведення підвищується ефективність вилучення вірусів при очистці, що гарантує вірусобезпечність отриманого церулоплазміну. Крім того, запропонований спосіб є більш технологічним і дозволяє знизити денатурацію білка, що приводить до підвищення виходу цільового продукту.The task of the useful model is to improve the method of obtaining ceruloplasmin, in which due to the proposed complex processing and the conditions for its implementation, the efficiency of virus extraction during purification increases, which guarantees the virus safety of the obtained ceruloplasmin. In addition, the proposed method is more technological and allows to reduce protein denaturation, which leads to an increase in the yield of the target product.
Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання церулоплазміну, що включає 29 розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ - функціональною групою, елюцію та наступне очищення, в якому як іонообмінник з ДЕАЕ функціональною групою використовують сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ, а при очищенні фермент у вигляді розчину спочатку обробляють сольвент-детергентною сумішшю, потім оброблений фермент іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають ацетатним буфером, що містить хлорид см натрію, і проводять елюцію очищеного ферменту. ююThe task is solved by the proposed method of obtaining ceruloplasmin, which includes 29 dissolution of the raw material in an acetate buffer solution, sorption of the enzyme on an ion exchanger with a DEAE functional group, elution and subsequent purification, in which a sorbent on a rigid styrenedivinylbenzene matrix grafted with a DEAE functional group is used as an ion exchanger by the DEAE group, and during purification, the enzyme in the form of a solution is first treated with a solvent-detergent mixture, then the treated enzyme is immobilized on a sulfopropyl cationic sorbent, washed with an acetate buffer containing cm sodium chloride, and the purified enzyme is eluted. i am
Сорбція ферменту на сорбенті з жорсткою стиролдивінілбензольною матрицею з привитою групою ДЕАЕ, що має зерна фракції 200-250мкм і розмір пор ЗОнм, проводиться за допомогою колоночної хроматографії у Ф "киплячому шарі» що не дозволяє нерозчиненому матеріалу накопичуватися в хроматографічній колоні. ГеSorption of the enzyme on a sorbent with a rigid styrenedivinylbenzene matrix with a grafted DEAE group, which has grains of fraction 200-250μm and a pore size of ЗОnm, is carried out using column chromatography in Ф "fluidized bed", which does not allow undissolved material to accumulate in the chromatographic column.
Зважений стан сорбенту забезпечується організацією потоку знизу вгору та великим розміром зерна.The suspended state of the sorbent is ensured by the organization of the flow from the bottom up and the large grain size.
Іммобілізація ферменту і наступна промивка на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має зерна фракції см 100-200мкм з діаметром пор ЗОнм, також проводиться за допомогою колоночної хроматографії. Даний сорбент дозволяє іммобілізувати не менше 25мг/см ? цільового ферменту, не створює високого тиску, практично не зсідається при використанні. « 20 Краще, сольвент-детергентна суміш для обробки ферменту складається з 0,1М ацетатного буферного -о с розчину при рН 5,8, що містить 195 мас. три-н-бутилфосфату і 195 мас. полісорбату 80. Обробку ведуть шляхом перемішування сольвент-детергентної суміші з розчином ферменту в реакторі протягом 6...9 годин з наступним :з» розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л.Immobilization of the enzyme and subsequent washing on a sulfopropyl cationic sorbent, which has grains of fraction cm 100-200 μm with a pore diameter of ЗОнm, is also carried out with the help of column chromatography. Does this sorbent allow immobilization of at least 25 mg/cm? of the target enzyme, does not create high pressure, practically does not collapse during use. 20 Preferably, the solvent-detergent mixture for treating the enzyme consists of a 0.1 M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. tri-n-butyl phosphate and 195 wt. polysorbate 80. The treatment is carried out by mixing the solvent-detergent mixture with the enzyme solution in the reactor for 6...9 hours, followed by dilution with a 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. sodium caprylate, 0.05 M sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of 0.2 g/l.
Оброблений фермент, іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають у дві стадії, де наThe treated enzyme, immobilized on a sulfopropyl cationic sorbent, is washed in two stages, where
ГФ першій стадії використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію та поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Для промивки на першій стадії іме) використовують об'єм, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують 0,1М со ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить О0,05М хлориду натрію, в об'ємі, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. На першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,5...бсм/хв. о Елюція очищеного ферменту здійснюється 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3МGF of the first stage uses a 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8, containing 195 wt. sodium caprylate, 0.05 M sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of 0.2 g/l. For washing at the first stage, a volume corresponding to 7 volumes of the sorbent is used. At the second stage of washing, a 0.1 M sodium acetate buffer solution at pH 5.8 containing O0.05 M sodium chloride is used in a volume corresponding to three volumes of the sorbent. In the first and second stages, washing is carried out at a speed of 4.5...bsm/min. o Elution of the purified enzyme is carried out with 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8, containing 0.3M
Кз хлориду натрію.Kz of sodium chloride.
Спосіб здійснюється таким чином.The method is carried out as follows.
Фракції крові ІМ-І та осаду Б, що містять церулоплазмін, зміщують з ацетатним буферним розчином у ємності вв З мішалкою при 0...595 і перемішують протягом 3...5 годин. Розчин фільтрують через капронове сито. Осад утилізують. Фільтрат за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, що як с іонообмінник містить сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ з зернами фракції 200-25Омкм і розміром пор Зонм, який знаходиться у зваженому стані. Елюат збирають у ємність.Fractions of IM-I blood and sediment B containing ceruloplasmin are mixed with acetate buffer solution in a container with a stirrer at 0...595 and stirred for 3...5 hours. The solution is filtered through a kapron sieve. The sediment is disposed of. Using a pump, the filtrate is passed from the bottom up through the chromatographic column, which, as an ion exchanger, contains a sorbent on a rigid styrene-divinylbenzene matrix with a grafted DEAE group with grains of the 200-25µm fraction and a pore size of Zonm, which is in a suspended state. The eluate is collected in a container.
Елюат розбавляють 3...5 об'ємами ацетатного буферного розчину і обробляють сольвент-детергентною во сумішшю. Як сольвент використовують, наприклад, три-н-бутилфосфат, як детергент - полісорбат 80, октоксинол 10, В-пропіолактон та інші поверхнево активні речовини. Змішування проводять в реакторі. Наприклад, 01М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 195 мас. три-н-бутилфосфату і 195 мас. полісорбату 80, змішують з розчином ферменту. Суміш перемішують протягом 6...9 годин при температурі 2590. Далі суміш розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, 0,05М 65 хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості О,2г/л.The eluate is diluted with 3...5 volumes of acetate buffer solution and treated with a solvent-detergent mixture. As a solvent, for example, tri-n-butyl phosphate is used, as a detergent - polysorbate 80, octoxynol 10, B-propiolactone and other surface-active substances. Mixing is carried out in a reactor. For example, 01M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. tri-n-butyl phosphate and 195 wt. polysorbate 80, mixed with the enzyme solution. The mixture is stirred for 6...9 hours at a temperature of 2590. Then the mixture is diluted with 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8, containing 195 wt. sodium caprylate, 0.05 M 65 sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of 0.2 g/l.
Оброблений фермент іммобілізують колоночною хроматографією при лінійній швидкості елюенту 2см/хв. на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25...3Омг/см" і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор ЗОонм. Іммобілізований фермент промивають на сульфопропілкатіонітному сорбенті зі швидкістю 4,5...5см/хв. протягом 80-120 хвилин. Таке промивання краще здійснювати у дві стадії: на першій стадії 01 М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на другій - 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту на першій стадії, і об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту на другій стадії.The processed enzyme is immobilized by column chromatography at a linear eluent speed of 2 cm/min. on a sulfopropyl cationic sorbent with a sorption capacity of 25...3Omg/cm" and grains of a fraction of 100-200 μm with a pore diameter of ZOonm. The immobilized enzyme is washed on a sulfopropyl cationic sorbent at a speed of 4.5...5 cm/min. for 80-120 minutes It is better to carry out such washing in two stages: in the first stage with 01 M acetate buffer solution at pH 5.8, containing 195 mass of sodium caprylate, 0.05 M sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of 0.2 g/l; in the second - 0 .1M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 0.05M sodium chloride. Washing is carried out with a volume corresponding to 7 volumes of the sorbent in the first stage and a volume corresponding to three volumes of the sorbent in the second stage.
Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рнН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Процес 70 елюції триває 50...80хв. Елюат містить очищений церулоплазмін, який збирають до стерильної скляної тари і подають на ультрафільтрацію.Elution is carried out with 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8, containing 0.3M sodium chloride. The process of 70 elution lasts 50...80 minutes. The eluate contains purified ceruloplasmin, which is collected in a sterile glass container and submitted to ultrafiltration.
Корисна модель демонструється нижче наведеним прикладом.A useful model is demonstrated by the following example.
О,5бкг осаду Б змішували з 7,5л ацетатного буферного розчину у ємності з мішалкою при температурі 09С і перемішували протягом З годин. Розчин фільтрували через капронове сито. Осад утилізували. Одержали 7л 75 фільтрату, який за допомогою насосу пропускають знизу вгору Через хроматографічну колону, діаметром 45мм, що містить З00см3 сорбенту з привитою групою ДЕАЕ на стиролдивінілбензольній матриці фракції 200-25Омкм і розміром пор ЗОнм. Об'ємна швидкість елюенту - 1л/год. Через 7 годин у ємності зібрали О,бл елюату, що містить церулоплазмін. Елюат змішують з 2л ацетатного буферного розчину.0.5 bkg of sediment B was mixed with 7.5 l of acetate buffer solution in a container with a stirrer at a temperature of 09C and stirred for 3 hours. The solution was filtered through a kapron sieve. The sediment was disposed of. 7l 75 of filtrate was obtained, which is passed from bottom to top with the help of a pump through a chromatographic column with a diameter of 45mm, containing 300cm3 of a sorbent with a grafted DEAE group on a styrene-divinylbenzene matrix of a fraction of 200-25Ωm and a pore size of ZOnm. The volume rate of the eluent is 1 l/h. After 7 hours, 0.1 ml of eluate containing ceruloplasmin was collected in the container. The eluate is mixed with 2 liters of acetate buffer solution.
Для перевірки ефективності вилучення вірусів при реалізації запропонованого способу використовували 20 модельні віруси вірусної діареї ВРХ (ВМОМ), які були внесені до розбавленого після елюції розчину ферменту у кількості 4,5Іод1о ТЦІДео/см? вірусу ВМОМ.To check the efficiency of virus extraction when implementing the proposed method, 20 model viruses of bovine viral diarrhea (BVDV) were used, which were added to the enzyme solution diluted after elution in the amount of 4.5 Iod1o TCIDeo/cm? VMOM virus.
Згідно до вимог СМР навмисне внесення будь-якого вірусу у виробничі приміщення не допускається. Тому валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. 25 Розбавлений розчин ферменту з модельним вірусом переносили до реактору, де обробляли 0,1М ацетатним -в буферним розчином при рН 5,8, що містить 195 мас. три-н-бутилфосфату і 196 мас. полісорбату 80. Суміш перемішують протягом 7 годин при температурі 2520. Далі суміш розбавляли 5-ма об'ємами 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості О0,2г/л. Оброблений фермент колоночною хроматографією (діаметр колонки 15мм) при лінійній с 30 швидкості елюенту 2см/хв. іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність ю 25мг/см і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор ЗОнм. Одержаний розчин утилізували. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті фермент промивали зі швидкістю бсм/хв. протягом 90 хвилин у дві стадії: на б першій стадії О0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 195 мас. каприлату натрію, Ф0О5М є хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на другій - О,1М ацетатним буферним розчином при рн 35 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що с містить 0,3М хлориду натрію. Процес елюції тривав бОхв. Елюат збирали до стерильної скляної тари, піддавали ультрафільтрації з наступною стерелізуючою фільтрацією.In accordance with the requirements of the SMR, the intentional introduction of any virus into the production premises is not allowed. Therefore, the validation was carried out in a separate laboratory, equipped accordingly, using a model of the production process. 25 The diluted enzyme solution with the model virus was transferred to the reactor, where it was treated with a 0.1 M acetate-v buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. tri-n-butyl phosphate and 196 wt. of polysorbate 80. The mixture was stirred for 7 hours at a temperature of 2520. Then the mixture was diluted with 5 volumes of 0.1M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. sodium caprylate, 0.05 M sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of O0.2 g/l. The enzyme was processed by column chromatography (column diameter 15 mm) at a linear s 30 eluent speed of 2 cm/min. immobilized on a sulfopropyl cationic sorbent, which has a sorption capacity of 25 mg/cm and grains of fraction 100-200 μm with a pore diameter of ZOnm. The resulting solution was disposed of. The enzyme immobilized on sulfopropyl cationic sorbent was washed at a speed of bcm/min. within 90 minutes in two stages: at b of the first stage O0.1M acetate buffer solution at pH 5.8 containing 195 wt. sodium caprylate, F0O5M is sodium chloride and polypropylene glycol in the amount of 0.2 g/l; on the second - 0.1 M acetate buffer solution at pH 35 5.8, containing 0.05 M sodium chloride. Elution was carried out with 0.1 M acetate buffer solution at pH 5.8, which contains 0.3 M sodium chloride. The elution process continued for approx. The eluate was collected in a sterile glass container, subjected to ultrafiltration followed by sterilizing filtration.
Одержали 20мл розчину церулоплазміну, що має вміст білку 750мг з питомою біологічною активністю «We received 20 ml of ceruloplasmin solution, which has a protein content of 750 mg and a specific biological activity "
Збум.од./мг. ЗZbum.units/mg WITH
Вихід цільового продукту - 9995, співвідношення Е10/Егво - 0,045, концентрація білку - Звмг/мл. с Титр після інактивації показав відсутність вірусу ВМОМ. "з Запропонований спосіб гарантує вірусобезпечність одержаного лікарського препарату церулоплазмін і дозволяє підвищити вихід цільового церулоплазміну. іме)The yield of the target product is 9995, the E10/Egvo ratio is 0.045, the protein concentration is Zmg/ml. c The titer after inactivation showed the absence of VMOM virus. "with The proposed method guarantees the viral safety of the received drug ceruloplasmin and allows to increase the output of the target ceruloplasmin. ime)
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UAU200701806U UA22952U (en) | 2007-02-21 | 2007-02-21 | Process for manufacture of ceruloplasmin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UAU200701806U UA22952U (en) | 2007-02-21 | 2007-02-21 | Process for manufacture of ceruloplasmin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA22952U true UA22952U (en) | 2007-04-25 |
Family
ID=38137242
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAU200701806U UA22952U (en) | 2007-02-21 | 2007-02-21 | Process for manufacture of ceruloplasmin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
UA (1) | UA22952U (en) |
-
2007
- 2007-02-21 UA UAU200701806U patent/UA22952U/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH02198561A (en) | Removing process for working-chemical substance from unstable organism material mixture using hydrophobic interaction chromatography | |
US20120123002A1 (en) | Method for purification of antibody using porous membrane having amino group and alkyl group both bound to graft chain immobilized on porous substrate | |
MX2012013411A (en) | Apparatus and process of purification of proteins. | |
CN102295696A (en) | Method for preparing coagulation factor VIII, fibrinogen and fibronectin from cryoprecitation | |
JPS5944320A (en) | Preparation of c1 inactivating agent | |
JPH06107561A (en) | Preparation of intravenous compatible immunoglobulin-g-formulation | |
CN109641950B (en) | Method for preparing immunoglobulin composition | |
CN114181300A (en) | Preparation method of high-purity monoclonal antibody | |
CN113302197A (en) | Method for purifying antibody including process using activated carbon material | |
RU2372939C2 (en) | Method for producing immunoglobulin | |
UA22952U (en) | Process for manufacture of ceruloplasmin | |
RU2356560C1 (en) | Ceruloplasmin recovery method | |
RU2332247C1 (en) | Method of immunoglobulin purification (versions) | |
JP4606524B2 (en) | Polylysine, polylysine production method, polylysine composition, and pharmaceutical production method for removing endotoxin | |
Heldt et al. | Identification of trimeric peptides that bind porcine parvovirus from mixtures containing human blood plasma | |
EP2087897B1 (en) | Method for producing apyrogenic immunomodulator | |
RU2372940C2 (en) | Method of virus inactivation for immunoglobulin production | |
RU2356559C1 (en) | Method of virus inactivation in ceruloplasmin production | |
JP6517145B2 (en) | Method of producing porous cellulose beads and adsorbent using the same | |
JP2002505674A (en) | Method for removing viruses and molecular pathogens in biological material | |
JP5137491B2 (en) | Method for modifying adsorbability and / or elution of aluminum hydroxide adsorbent | |
JPS6160050B2 (en) | ||
JPWO2012036140A1 (en) | Affinity carrier for purifying or removing a protein or peptide having a kringle sequence, and purification method and removal method using the same | |
WO2013080134A2 (en) | Anti-fh aptamers, method for producing same, and uses thereof | |
CN117088962B (en) | Endotoxin removal process in recombinant human serum albumin purification process |