UA122223C2 - Застосування резистентного до гербіциду протеїну як такого, що надає рослинам стійксть до феноксіауксинових гербіцидів - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування резистентного до гербіциду протеїну як такого, що надає рослинам стійкість до феноксіауксинових гербіцидів, де зазначений резистентний до гербіциду протеїн включає протеїн, який складається з амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 2.

Description

Галузь техніки

Представлений винахід стосується резистентного до гербіциду протеїну, гена, який його кодує, та його застосування, зокрема, резистентного до 2,4-О протеїну, гена, який його кодує, та його застосування.

Передумови створення винаходу

Бур'яни можуть швидко вичерпати цінні поживні речовини в грунті, які є необхідними для росту сільськогосподарських культур та інших цільових рослин. В даний час існує безліч типів гербіцидів для боротьби з бур'янами, серед яких особливо популярним гербіцидом є гліфосат.

Створеними були стійкими до гліфосату сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, соя, бавовник, буряк, пшениця та рис, тощо. Таким чином, можливим є розпиляти гліфосат на полях, засаджених стійкими до гліфосату сільськогосподарськими культурами, для боротьби з бур'янами без значного пошкодження цих культур.

Гліфосат широко використовується у всьому світі протягом більш ніж 20 років, що призвело до надмірної залежності від технології гліфосату та толерантних до гліфосату сільськогосподарських культур. Крім того, високий тиск відбору привів до природно більш толерантних до гліфосату рослин, серед диких видів бур'янів або рослин, які розвинули стійкість до дії гліфосату. Повідомлялося, що декілька видів бур'янів розвинули стійкість до гліфосату, в тому числі широколисті бур'яни та трав'янисті бур'яни, такі як Зм/і55 гуедгавз5, І от тийктогит,

ЕІвизіпе іпаїса, Атбгозіа апетізійоЇйа, Сопула сападепві5, Сопула Бопагієпбіз та Ріапіадо

Іапсеоїаїа. Крім того, бур'яни, які не були сільськогосподарською проблемою до широкомасштабного застосування толерантних до гліфосату сільськогосподарських культур, також поступово переважають та їх важко контролювати толерантними до гліфосату сільськогосподарськими культурами. Дані бур'яни в основному існують разом з (але не тільки) широкопоширеними бур'янами, які важко контролювати, наприклад, такими як вид Атагапійив5,

Спепородійт, Тагахасит та Соттеїїпасеає.

У зоні стійких до гліфосату бур'янів або видів бур'янів, які важко контролювати, виробники можуть викликати слабкість до гліфосату шляхом змішування в цистернах або застосування іншого гербіциду, який може контролювати пропущені бур'яни. У більшості випадків популярним та ефективним партнером зі змішування в цистернах, використовуваного для боротьби із

Зо широколистими бур'янами, є 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4-0). 2,4-О використовується для боротьби з широким спектром широколистих бур'янів більше 65 років в умовах сільськогосподарських та несільськогосподарських культур, та все ще є одним з найбільш широко використовуваних гербіцидів у світі. Межа для подальшого застосування 2,4-О0 полягає в тому, що його селективність у дводольних рослин (таких як соя або бавовник) є дуже низькою.

Таким чином, 2,4-О, як правило, не застосовується до (та, як правило, не поблизу до) чутливих дводольних рослин. Крім того, застосування 2,4-Ю на злакових культурах є обмеженим, до певної міри, потенційною здатністю пошкодження сільськогосподарських культур. Поєднання 2,4-Ю0 та гліфосату вже використовувалось для забезпечення більш сильного процесу стерилізації перед посадкою при нульовій обробці грунту сої та бавовника. Проте, через чутливість даних видів дводольних до 2,4-О, дані процеси стерилізації повинні проводитися від 14 до 30 днів перед посадкою.

Як ії МСРА, 2-метил-4-хлорпропіонова кислота та 2,4-О пропіонова кислота, 2,4-Ое також є гербіцидом - феноксіалкановою кислотою. 2,4-Ю застосовується для селективного контролю широколистих бур'янів у багатьох однодольних культурах, таких як кукурудза, пшениця та рис, без серйозного пошкодження цільових культур. 2,4-Ю представляє собою синтетичну похідну ауксину, функція якої полягає в тому, щоб порушити нормальний гомеостаз цитогормону та перешкоджати рівновазі контрольованого росту. 2,4-Ю0 демонструє різні рівні селективності на певних рослинах (наприклад, дводольні рослини є більш чутливими, ніж злаки). Різні 2,4-Ю метаболізми в різних рослинах є одним з пояснень різних рівнів селективності. Рослини зазвичай метаболізують 2,4-О повільно. Таким чином, різні активності цільових точок, швидше за все, пояснюють різні відповіді рослин на 2,4- р. Метаболізм 2,4-О у рослин, як правило, досягається через два етапи метаболізму, тобто кон'югацією з амінокислотами або глюкозою після гідроксилювання в цілому.

З часом мікробні популяції поступово розвинули ефективні, альтернативні шляхи розкладання даної конкретної сторонньої речовини, що в результаті призводить до повної мінералізації 2,4-О0. Безперервне застосування гербіцидів до мікроорганізмів може бути використане для відбору мікроорганізмів, які використовують гербіциди як джерела вуглецю, таким чином, отримуючи конкурентні переваги в грунті. З цієї причини 2,4-О на даний момент формулюють з відносно коротким періодом напіврозпаду в грунті та без явного наслідкового бо впливу на наступні сільськогосподарські культури, що сприяє застосуванню 2,4-О гербіциду.

Каїсіопіа ешгорпа представляє собою один з організмів, чию здатність до розкладання 2,4-

О широко вивчили. Ген, який кодує фермент на першій ферментативній стадії шляху мінералізації, є ЧаА. ТІДА каталізує перетворення 2,4-Ю кислоти в дихлорфенол (ОСР) за допомогою реакції а-оксоглутарат-залежної діоксигсенази. ЮСР навряд чи має гербіцидну активність у порівнянні з 2,4-0. ТІЯА використовується для створення 2,4-Ю0 стійкості в дводольних трансгенних рослинах, які у випадку трансгенних рослин, як правило, є чутливими до 2,4-О (таких як бавовник та тютюн).

Виявлено ряд генів типу НА, які кодують протеїни, які здатні розкладати 2,4-О0 в навколишньому середовищі. Багато гомологів є подібних до НаА (амінокислотна ідентичність » 8595) та мають ферментативну активність аналогічну до активності НаА. Проте, не всі протеїни, які мають структури, такі як ТашО, які мають функцію розкладання 2,4-О, та велика кількість гомологів мають значно меншу ідентичність (25-509б5) з НаА, в той час як вони містять характерні залишки, пов'язані з а-оксоглутарат-залежними діоксигеназами Бе-- діоксигеназ. Отже, субстратна специфіка даних різних діоксигеназ є невизначеною. Унікальний екземпляр, який має низьку гомологію (2895 амінокислотної ідентичності) з НЯА, представляє собою гарА з

Ззрпіпдобішт Пегрісідомогап5. Показано, що даний фермент каталізує першу стадію мінералізації (2А)-2,4-О0 пропіонової кислоти (та інших (К)-феноксипропіонових кислот) та 2,4-0 (феноксіоцтової кислоти).

З появою стійких до гліфосату бур'янів та розширеного застосування 2,4-Ю0 гербіциду, необхідним є створити стійкість до 2,4-О у цільових рослин, чутливих до 2,4-О0. До теперішнього часу не було знайдено жодних повідомлень про рівень експресії стійких до гербіцидів протеїнів 240111 в рослинах та про їх толерантність до гербіцидів.

Суть винаходу

Метою представленого винаходу є забезпечення стійкого до гербіциду протеїну, кодуючого гена та його застосування. Представлений винахід є призначеним для того, щоб забезпечити новий 240111 ген, який має більш високу толерантність до гербіциду у рослин.

Для досягнення поставленої мети представлений винахід передбачає резистентний до гербіциду протеїн, який включає: (а) протеїн, який складається з амінокислотної послідовності, показаної в ЗХЕО ІЮ МО: 2; або (б) протеїн з активністю арилоксіалканоатної діоксигенази, який є похідною від амінокислотної послідовності в (а) за рахунок заміщення та/або видалення, та/або додавання однієї або декількох амінокислот в ту саму послідовність.

Для досягнення зазначеної мети представлений винахід передбачає резистентний до гербіцидів ген, який включає: (а) нуклеотидну послідовність, яка кодує зазначений стійкий до гербіциду протеїн; або (Б) нуклеотидні послідовності, здатні до гібридизації з нуклеотидною послідовністю як визначено в (а) в жорстких умовах, та які кодують протеїн з активністю арилоксіалканоат-ді- оксигенази; або (с) нуклеотидну послідовність представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1.

Жорсткі умови можуть бути наступними: гібридизація в 6х55С (натрію цитрат), 0,595 розчин 505 (натрію додецилсульфат) при 65 "С та з наступним промиванням мембрани один раз з використанням 2х55С, 0,195 505 та 1х55С, 0,195 505, відповідно.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає касету експресії яка включає зазначений резистентний до гербіцидів ген при регулюванні функціонально зв'язаної регуляторної послідовності.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід додатково передбачає рекомбінантний вектор, який містить зазначений резистентний до гербіцидів ген або зазначену касету експресії.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід передбачає спосіб отримання резистентного до гербіциду протеїну, який включає: отримання клітин трансгенного організму-господаря, який містить резистентний до гербіциду ген або касету експресії; культивування клітин трансгенного організму-господаря в умовах які дозволяють продукування резистентного до гербіциду протеїну; виділення зазначеного резистентного до гербіциду протеїну.

Крім того, трансгенний організм-господар включає рослини, тварини, бактерії, дріжджі, бакуловірус, нематоду або водорості.

Переважно, рослина представляє собою сою, бавовник, кукурудзу, рис, пшеницю, буряк або цукрову тростину.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб розширення цільового діапазону гербіцидів, який включає: спільне експресування нуклеотиду, який кодує резистентний до гербіциду протеїн або стійкий до гербіциду протеїн, який кодується касетою експресії зі щонайменше одним другим нуклеотидом, який відрізняється від зазначеного протеїну або протеїну, який кодується зазначеною касетою експресії.

Крім того, другий нуклеотид кодує стійкий до гліфосату протеїн, стійкий до глюфосинату амонію протеїн, 4-гідроксифенілпіровиноградної кислоти діоксигеназу, ацетолактатсинтазу, протеїн цитохрому або протопорфіриногеноксидазу.

В представленому винаході, резистентний до гербіциду протеїн 240111 експресується в трансгенній рослині, що супроводжується експресіями одного або більше резистентних до глюфосинату протеїнів та/або резистентних до глюфосинату амонію протеїнів. Така спільна експресія більше, ніж одного виду резистентного до гербіциду протеїну в одній і тій самій трансгенній рослині може бути досягнута за рахунок трансформування та експресії генів, що представляють зацікавленість, у рослин з використанням генної інженерії. Крім того, резистентний до гербіциду протеїн 240111 може бути експресований в одній рослині (батьківський 1) з використанням операцій генної інженерії, та резистентний до гліфосату протеїн та/або резистентний до глюфосинату амонію протеїн може бути експресований в другій рослині (батьківський 2) з використанням операцій генної інженерії. Всі гени експресії рослин- потомства від батьківського 1 та батьківського 2 можуть бути отримані за рахунок схрещування батьківського 1 та батьківського 2.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб відбору трансформованих рослинних клітин, який включає стадії трансформування декількох рослинних клітин з геном, резистентним до гербіцидів, або касетою експресії та культивування зазначених клітин при концентрації гербіциду, яка дозволяє ріст трансформованих клітин, які експресують ген, резистентний до гербіцидів, або касету експресії, в той же час знищує нетрансформовані клітини або інгібує ріст нетрансформованих клітин, де гербіцид представляє собою феноксіауксин.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб боротьби з бур'янами, який включає стадію застосування ефективної кількості одного або

Зо декількох гербіцидів на полі, висадженому сільськогосподарськими культурами, які містять зазначений резистентний до гербіцидів ген, зазначену касету експресії або зазначений рекомбінантний вектор.

Переважно, гербіцид представляє собою феноксіауксин.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб захисту рослин від пошкодження, завданого гербіцидами, який включає стадію введення зазначеного резистентного до гербіцидів гена, зазначеної касети експресії або зазначеного рекомбінантного вектора в рослини, для того, щоб зробити отримані в результаті рослини такими, що продукують певну кількість резистентного до гербіциду протеїну, достатню для їх захисту від пошкодження, завданого гербіцидами.

Переважно, зазначений гербіцид представляє собою феноксіауксин або арилоксифеноксипропіонат, та зазначені рослини вибирають з групи, яка складається з сої, бавовника, кукурудзи, рису, пшениці, буряка та цукрової тростини.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб боротьби зі стійкими до гліфосату бур'янами на полі, висадженому толерантними до гліфосату рослинами, який включає стадію застосування ефективної кількості одного або декількох гербіцидів на полі, висадженому толерантні до гліфосату рослинами, де зазначені толерантні до гліфосату рослини містять зазначений резистентний до гербіцидів ген, зазначену касету експресії або зазначений рекомбінантний вектор.

Переважно, зазначений гербіцид представляє собою феноксіауксин, та зазначена толерантна до гліфосату рослина є однодольною або дводольною.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає спосіб забезпечення сільськогосподарських культур стійкістю до 2,4-О гербіцидів, який включає стадії введення зазначеного резистентного до гербіцидів гену, зазначеної касети експресії або зазначеного рекомбінантного вектора в рослини.

Переважно, зазначена рослина представляє собою сою, бавовник, кукурудзу, рис, пшеницю, буряк або цукрову тростину.

Для досягнення зазначеної мети, представлений винахід також передбачає застосування резистентних до гербіциду протеїнів, толерантних до феноксіауксинових гербіцидів, що включає: 60 (а) протеїн, який складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ЕО ІЮ МО: 2; або

(р) протеїн з активністю арилоксіалканоат-ді-оксигенази, який є похідною від амінокислотної послідовності в (а) за рахунок заміщення, та/або видалення, та/"або додавання однієї або декількох амінокислот в ту саму послідовність.

В рослини вводять резистентний до гербіцидів ген, зазначену касету експресії або зазначений рекомбінантний вектор. Звичайні способи, які використовуються в представленому винаході для введення чужорідної ДНК в рослинні клітини, включають, але не обмежуються цим, опосередковану агробактерією трансформацію, бомбардування частинками, безпосереднє входження ДНК в протопласт, електропорацію або опосередковане силіконом введення ДНК.

Резистентні до 2,4-О гени та наступні стійкі сільськогосподарські культури відповідно до представленого винаходу дають хороший вибір для контролю стійких до гліфосату (або високо толерантних або сукцесійних) видів широколистих бур'янів у сільськогосподарських культурах. 2,4-0 представляє собою широкого спектру дії, відносно дешевий та потужний широколистий гербіцид. Якщо б можна було забезпечити більш високу толерантність у сільськогосподарських культур як у дводольних, так і однокольних, то виробники можуть отримати гарні ефекти.

Толерантні до 2,4-О трансгенні дводольні також мають більшу гнучкість при застосуванні часу та кількості введення. Інше застосування ознаки толерантності до 2,4-О гербіцидів полягає в тому, що її можуть використовувати для запобігання пошкодженню нормально чутливих сільськогосподарських культур, таких як дрейф 2,4-О0, випаровування, трансформація (або інше явище віддаленого руху), неправильне застосування, розкладання та подібне. Різні суміші різних феноксіоксинів широко використовуються для обробки конкретного спектру бур'янів та в умовах навколишнього середовища в різних районах. Застосування гену 240111 в рослинах може забезпечити захист від більш широкого спектру феноксіауксинових гербіцидів, для того, щоб покращити гнучкість та спектр контрольованих бур'янів, та забезпечити захист у повному обсязі комерційно доступного дрейфу феноксіауксину або інших віддалених пошкоджень феноксі гербіцидів.

Феноксіауксинові гербіциди, як правило, формулюють у вигляді активних кислот, але деякі комерціалізовані препарати формулюють як один з декількох відповідних складноефірних препаратів. Оскільки загальні рослинні естерази у рослин можуть перетворювати дані складні ефіри в активні кислоти, вони також, як вважається, є субстратами 240111 фермента у рослин.

Зо Аналогічним чином, вони також можуть представляти собою органічні або неорганічні солі відповідних кислот. При представленні гербіциди, які є хіральною пропіоновою кислотою, сіллю пропіонової кислоти або пропіоновими складними ефірами, навіть якщо мають різні СА5 номери, можуть відповідати оптично чистій сполуці. При визначенні гербіцидів, ми досі вважаємо, що рацемічний (К, 5) або оптично чистий (К або 5) енантіомер представляє собою один і той самий гербіцид. Можливі діапазони дозування можуть бути такими, як ті, які використовують для обробки самостійно або в комбінації з іншими гербіцидами при застосуваннях до сільськогосподарських культур або несільськогосподарських культур.

Встановлено, що ген 240111 має характеристики, які дозволяють застосувати феноксіауксиновий гербіцид в рослині після експресії генетично сконструйованого 240111 в рослинах, властива толерантність яких не існує або її недостатньо, щоб дозволити застосування даних гербіцидів. Крім того, ген 240111 може забезпечити захист від феноксіауксинових гербіцидів, коли природної толерантності є недостатньо для того, щоб дозволити селективність у рослин. Один, два або декілька феноксіауксинових гербіцидів можуть бути комбінованими безперервно або змішуванням в резервуарі для того, щоб обробляти тільки ті рослини, які містять 240111 ген. Діапазон дозування кожного феноксіауксинового гербіциду, який використовується для контролю широкого спектра дводольних бур'янів, становить від 25 до 4000 г кис.екв./га, більш конкретно від 100 до 2000 г кис.екв./га. Комбінація даних гербіцидів, які належать до різних хімічних класів, та які мають різні механізми дії на одному й тому ж полі (безперервно або шляхом змішування в резервуарі) може контролювати більшість потенційних бур'янів, які мають намір контролюватися гербіцидами.

Гліфосат широко використовується, тому що він контролює дуже широкий спектр видів широколистих та трав'янистих бур'ян. Однак, повторне використання гліфосату при застосуванні для толерантних до гліфосату сільськогосподарських культур та несільськогосподарських культур в результаті селективно призводить (та буде продовжувати призводити) до сакцесії бур'янів до видів з біотипом більшої природної толерантності або резистентності до гліфосату. Більшість стратегій управління стійкістю до гербіцидів рекомендує використовувати ефективну кількість змішаних в резервуарі партнерів-гербіцидів, як спосіб відстрочити появу стійких бур'янів. Партнери-гербіциди забезпечують контроль одного і того ж виду, але мають різні режими дії. Накладення 240111 гену та ознаки толерантності до 60 гліфосату (та/або ознак толерантності до інших гербіцидів) може забезпечити контроль над резистентними до гліфосату видами бур'янів (видами широколистого бур'яну, які контролюються одним або декількома феноксіауксинами) у толерантних до гліфосату сільськогосподарських культур за рахунок селективного застосування гліфосату та феноксіауксину (такого як 2,4-0) до одних і тих самих сільськогосподарських культур.

Застосування даних гербіцидів може представляти собою індивідуальне застосування однієї гербіцидної композиції в резервуарній суміші, яка містить два або декілька гербіцидів з різними моделями дій: одночасно або послідовно (наприклад, перед посадкою, перед появою сходів або після появи сходів) (інтервал часу знаходиться в діапазоні від 2 годин до З місяці).

Альтернативно, композиції будь-якого числа гербіцидів, які представляють кожен клас сполук, можуть використовуватись в будь-який момент часу (від протягом 7 місяців після посадки до часу збору врожаю (або, як щодо одного гербіциду, це стосується проміжку часу перед збором врожаю серед яких вибирається найбільш короткий)).

Гнучкість є дуже важливою у боротьбі з широколистяними бур'янами, тобто час застосування, дозування одного гербіциду та здатність контролювати непіддатливі або стійкі бур'яни. Дозування гліфосату, яке накладається з резистентним до гліфосат геном/240111 геном, може знаходитись в діапазоні від 250 до 2500 г кис.екв./га; доза (одного або декількох) феноксіауксинових гербіцидів може знаходитись в діапазоні від 25 до 4000 г кис.екв./га.

Оптимальне поєднання часу застосування залежить від конкретних умов, видів та навколишнього середовища.

Гербіцидні композиції (такі як складноефірні, кислотні або сольові формули або розчинні концентрати, емульговані концентрати або розчинні розчини) та добавки суміші для резервуара (такі як ад'ювант або засіб для сумісності) можуть суттєво вплинути на боротьбу з бур'янами, на певний гербіцид або комбінацію одного або декількох видів гербіцидів. Будь-які хімічні комбінації будь-якого з наведених вище гербіцидів знаходяться в межах обсягу даного винаходу.

Як добре відомо кваліфікованому фахівцеві в даній галузі, переваги комбінації з двох або більше режимів дії для покращення контрольного спектру бур'янів та/"або природних видів з більш толерантними або стійкими видами бур'янів можуть бути поширені на хімічні речовини, здатні виробляти толерантність до інших гербіцидів крім толерантних до гліфосату в

Зо сільськогосподарських культурах, застосовуючи штучні способи (трансгенні або не трансгенні).

В дійсності, наступні характеристики резистентності можуть бути кодовані окремо або бути багаторазово накладеними таким чином, щоб забезпечити можливість ефективно контролювати або запобігати бур'янам від сакцесії в будь-якій категорії вказаних вище резистентностей до гербіцидів: резистентності до гліфосату (наприклад, стійка рослина або бактерії, ЕРБР5, ОХ,

САТ), резистентності до глуфозинату амонію (наприклад, РАТ, Ваг), резистентності до гербіциду інгібітору ацетолактатсинтази (АГ 5) (наприклад, імідазолідинон, сульфонілсечовина, триазолпіримідин, сульфонанілід, піримідину тіобензоат та інші резистентні до хімічних речовин гени, такі як АНА5Б, С5ії, ЗМйигА, тощо), резистентності до бромоксенілу (наприклад, Вхп), резистентності до інгібітору НРРО (4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази), резистентності до інгібітору фітоєндесатурази (РОБ), резистентності до гербіциду інгібітора фотосистеми ФІ (наприклад, р5БА), резистентності до гербіциду інгібітору фотосистеми І, резистентності до гербіциду інгібітору протопорфіриногеноксидази ІХ (РРО) (наприклад, РРО-1), резистентності до фенілсечовинного гербіциду (наприклад, СУР7ЄВІ1), фермента, який розкладає дікамба, тощо.

Що стосується інших гербіцидів, деякі з інших переважних інгібіторів АЇ З включають триазолопіримідин бензолсульфонамід (клорансулам-метил, диклосулам, флуметсулам, метосулам та сульфонаміди піримідинотриазолів), піримідинтіобензоат та флукарбазон. Деякі переважні інгібітори НРРО включають мезотріон, ізоксафлутол та сулкотріон. Деякі переважні інгібітори РРО включають флуміоксазин, бутафенаціл, карфентразон, сульфентразон та дифенилоксид (наприклад, ацідлуорфен, фомесафен, лактофен та оксифлуорфен).

Крім того, ген 240111 може надаватися самостійно з одним або декількома іншими компонентами (такими як резистентність до комах, резистентність до грибів, або стресова толерантність), або властивою продуктивністю (наприклад, збільшеною врожайністю, покращеною олійною масою, покращеною якістю волокон), або накладатися з одним або декількома іншими компонентами (такими як резистентність до комах, резистентність до грибів, або стресова толерантність) або властивою продуктивністю (наприклад, збільшеною врожайністю, покращеною олійною масою, покращеною якістю волокон) після накладення з іншими характеристиками стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур. Тому даний винахід може забезпечити здатність гнучко та економічно контролювати будь-яку кількість сільськогосподарських шкідників та повним агрономічним рішенням щодо підвищення якості 60 сільськогосподарських культур.

240111 ген в даному винаході може розкладати 2,4-О, що є основою важливих стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур та можливості маркерів селекції.

Майже всі комбінації гербіцидів для широколистяних бур'янів можуть контролюватися трансгенною експресією гену 240111. Ген 240111 надає надзвичайну властивість толерантній до гербіцидів сільськогосподарській культурі, яка може поєднуватися з, наприклад, іншими характеристиками толерантної до гербіцидів сільськогосподарської культури, такими як резистентність до гліфосату, резистентність до глуфозинату амонію, резистентність до інгібітору АІ 5 (такого як імідазолідинон, сульфонілсечовина та триазолопіримідинбензолсульфонаміди), резистентність до бромоксинілу, резистентність до інгібітору НРРО, резистентність до інгібітору РРО та подібне) та характеристиками резистентності до комах (СтутАб, СгутїТР, мір3, інший протеїн Ббасійи5 (Вигіпдіепсі5 або похідна резистентного до комах протеїну від непалочкоподібних бактерій). Крім того, 240111 ген може використовуватись як маркер селекції для того, щоб допомогти селекції первинного трансформанту рослин, генетично модифікованих іншим геном або геногрупою.

Феноксіалканоатна група може бути використана для введення стабільних кислотних функціональних груп в гербіциди. Кислотні групи можуть імпортувати флоємічну активність за рахунок "кислотного захоплення" (властивості, необхідної для дії гербіцидів), щоб бути інтегрованим в нові гербіциди з метою активності. Існує багато комерційно доступних та експериментальних гербіцидів як субстратів 240111. Таким чином, толерантності до інших гербіцидів можуть бути отримані, використовуючи представлений винахід.

Характеристика толерантності до гербіциду сільськогосподарської культури за даним винаходом може використовуватись в новій комбінації з іншими характеристиками толерантності до гербіциду сільськогосподарської культури (включаючи, але не обмежуючись цим, толерантність до гліфосату). Через щойно надбану резистентність або притаманну толерантність до гербіцидів (таких як гліфосат) комбінації даних характеристик дають нові способи боротьби з видами бур'янів. Таким чином, на додаток до властивостей толерантності до гербіцидів сільськогосподарської культури, представлений винахід також включає нові способи боротьби з бур'янами з використанням гербіцидів, в яких зазначену толерантність до гербіциду отримують через фермент, одержаний трансгенними сільськогосподарськими

Зо культурами.

Представлений винахід можуть застосовувати до різних рослин, таких як Агабрідорзів, тютюн, соя, бавовна, рис, кукурудза та капуста. Представлений винахід також може застосовуватись до ряду інших однодольних рослин (таких як трав'яниста трава чи трав'яний килим) та дводольних культур (таких як люцерна, конюшина та види дерев, тощо). Аналогічним чином, 2,4-Ю0 (або інші 240111 субстрати) можуть застосовуватись більш активно до трав'янистих сільськогосподарських культур з помірною толерантністю, та отримана в результаті толерантність, характеристика якої підвищується, забезпечить виробникам можливість використовувати дані гербіциди з більш ефективною дозою та більш широким часом введенням без ризику пошкодження сільськогосподарської культури.

Геноми рослин, рослинних тканин або рослинних клітин, описані в даному винаході, стосуються будь-яких генетичних матеріалів у рослинах, рослинних тканинах або рослинних клітинах та включають ядро, плазміди та мітохондріальні геноми. "Резистентність", як описано в даному документі, є спадковою, та дозволяє рослинам рости та розмножуватися під дією того, що ефективна обробка застосовується до даних рослин з використанням звичайного гербіциду. Як визнано кваліфікованими фахівцями у даній галузі, навіть якщо є очевидним певне пошкодження рослини, завдане гербіцидами, то рослину все ще можна вважати "резистентною". Термін "толерантність", описаний в даному документі, є більш широким, ніж термін "резистентність" та включає "резистентність" та покращену здатність конкретної рослини, стійкої до різного ступеня пошкоджень, викликаних гербіцидами, які в цілому призводять до пошкоджень рослин немутантного типу з такими самими генотипами при одній і тій самій дозі гербіциду.

Як описано в даному документі, полінуклеотиди та/або нуклеотиди утворюють повний "ген" та кодують протеїни або поліпептиди в клітинах-господарях, що представляють зацікавленість.

Кваліфікованим фахівцям легко зрозуміти, що полінуклеотиди та/або нуклеотиди в представленому винаході можуть бути під контролем регуляторних послідовностей цільового господаря.

Як добре відомо кваліфікованому фахівцю в даній галузі, ДНК, як правило, існує у вигляді подвійного ланцюга. В такій схемі одна гілка взаємодоповнюється іншою, та навпаки. Коли реплікується ДНК в рослинах, також утворюються інші комплементарні ланцюги ДНК. Таким 60 чином, полінуклеотиди, приведені в переліку послідовностей, та їх комплементарні ланцюги є включеними в даний винахід. "Кодуючий ланцюг", який, як правило, використовується в даній галузі, стосується ланцюгового зв'язування з антисенсовим ланцюгом. Для того, щоб експресувати протеїн іп мімо, один ланцюг ДНК, як правило, транскрибується в комплементарний ланцюг мРНК, який служить як темплата протеїнової експресії. Фактично,

МРНК транскрибується з "антисенсового" ланцюга ДНК. "Сенсовий ланцюг або "кодуючий ланцюг" містить серію кодонів (кодон представляє собою триплет нуклеотидів, який кодує певну амінокислоту), які можуть зчитуватися як відкриті рамки зчитування (ОКР) для того, щоб генерувати цільові протеїни або пептиди. РНК та ПНК (пептидна нуклеїнова кислота), які є функціонально еквівалентними з ілюстративною ДНК, також розглядалися в даному винаході.

Молекула нуклеїнової кислоти або її фрагменти були гібридизовані з резистентним до гербіциду геном в жорстких умовах в даному винаході. Будь-які регулярні способи гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот можуть використовуватись для ідентифікації існування резистентного до гербіциду гена в представленому винаході. Молекули нуклеїнових кислот або їх фрагменти є здатними специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнової кислоти за певних умов. В представленому винаході, якщо дві молекули нуклеїнової кислоти можуть утворювати антипаралельну структуру нуклеїнової кислоти з подвійними ланцюгами, то можна визначити, що дані дві молекули можуть специфічно гібридизуватися одна з одною. Якщо дві молекули нуклеїнової кислоти повністю комплементарні, одна з двох молекул називається "комплементом" іншої молекули. В даному винаході, коли кожен нуклеотид молекули нуклеїнової кислоти є комплементарним відповідному нуклеотиду іншої молекули нуклеїнової кислоти, то ідентифікованим є те, що дві молекули є "повністю комплементарними". Якщо дві молекули нуклеїнової кислоти можуть гібридизуватися одна з одною таким чином, що вони можуть анелювати та зв'язуватися одна з одною з достатньою стабільністю, принаймні у звичайних умовах "низької жорсткості"? дані дві нуклеїнові кислоти ідентифікуються як "мінімально комплементарні". Аналогічним чином, якщо дві молекули нуклеїнової кислоти можуть гібридизуватися одна з одною таким чином, що вони можуть анелювати та зв'язуватися одна з одною з достатньою стабільністю у звичайних умовах "високої жорсткості", то ідентифікуються, що дані дві нуклеїнові кислоти є "комплементарними". Відхилення від "повністю комплементарного" може бути дозволено, за умови, що відхилення не повністю

Зо запобігає утворенню двох молекул подвійної ланцюгової структури. Молекула нуклеїнової кислоти, яка може бути прийнята як праймер або зонд, повинна мати достатньо комплементарні послідовності, щоб утворити стабільну подвійноланцюгову структуру в специфічному розчиннику при певній концентрації солі.

В даному винаході в основному гомологічна послідовність стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка може специфічно гібридизуватися з комплементарним ланцюгом іншої відповідної молекули нуклеїнової кислоти в умовах "високої жорсткості". Умови жорсткості для гібридизації

ДНК є добре відомими кваліфікованим фахівцям в даній галузі, такі як обробка розчином 6,0 х хлорид натрію/цитрат натрію (555) при температурі приблизно 45 "С та промивання 2,0 х 550 при 50 "С. Наприклад, концентрацію солі на стадії промивання вибирають з 2,0 х 550 та 507 для умов "низької жорсткості" та 0,2 х 55С та 50 "С для умов "високої жорсткості". Крім того, температура на стадії промивання знаходиться в діапазоні від 22С для умов "низької жорсткості" до 65 "С для умов "високої жорсткості". Як температура, так і концентрація солі можуть змінюватися разом, або тільки одна з даних двох змінних може змінюватися.

Переважно, умови жорсткості, які використовуються в даному винаході, можуть бути такими, як показано нижче. 5ЕО ІЮ МО: 1 специфічно гібридизується при 6,0 х 55С та 0,595 розчині 505 при 65 "С. Потім мембрану промивали один раз в 2 х 55С та 0,195 розчині 505, та 1 х 552 та 0,195 розчині 5О5, відповідно.

Таким чином, певна резистентна до гербіцидів послідовність, яка може гібридизуватися з

ЗЕО ІЮ МО: 1 в жорстких умовах, була включена в даний винахід. Дані послідовності були, щонайменше, приблизно на 4095-5095 гомологічними або приблизно 6095, 6595 або 7095 гомологічними, навіть щонайменше на 7595, 8095, 8595, 9095, 9195, 9290, 9390, 94905, 9595, 9690, 9795, 9895, 9995 або більше гомологічними до послідовностей за представленим винаходом.

Представлений винахід передбачає функціональні протеїни. "Функціональна активність" (або "активність"), як описано в даному документі, означає активність протеїнів/ферментів (самостійно або в поєднанні з іншим протеїном) в даному винаході щодо розкладання гербіциду або зниження активності гербіциду. Рослини, які продукують протеїни за даним винаходом, переважно продукують таку ефективну кількість одного або декількох протеїнів, яка, коли рослини обробляють гербіцидами, рівень експресії протеїну є достатнім, щоб забезпечити рослини повною або частковою резистентністю або толерантністю до гербіцидів (загальна доза, бо якщо не існує конкретних інструкцій). Гербіциди, як правило, застосовуються в дозуванні,

здатному знищувати цільові рослини, нормальне дозування та концентрацію застосовують на полі. Переважно, рослинні клітини та рослини за даним винаходом є захищеними від інгібування росту або пошкодження завданого обробкою гербіцидом. Трансформовані рослини та рослинні клітини за представленим винаходом переважно мають стійкість або толерантність до 2,4-Ю гербіцидів, що означає, що трансформовані рослини та рослинні клітини можуть вижити в умовах з ефективною кількістю 2,4-О гербіцидів.

Гени та протеїни, описані в представленому винаході, включають не тільки конкретно проілюстровані послідовності, але також частини та/або фрагменти (включаючи делецію(ї) в та/або в кінці повнодовжинного протеїну), варіанти, мутанти, заміщення (протеїни, які містять заміщену(ї) амінокислоту(и)), химерні та злиті протеїни, які зберігають їх активність щодо резистентності до гербіцидів. Зазначені "варіанти" або "варіації! стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують один і той самий протеїн, або, які кодують еквівалентний протеїн, який має стійку до гербіцидів активність. Зазначений "еквівалентний протеїн" стосується протеїнів, які мають однакову або фактично однакову біоактивність стійкої до гербіцидів активності як така, яка у заявлених протеїнів. "фрагмент" або "усічення" послідовності ДНК або протеїну, як описано в даному винаході стосується частини або її штучно модифікованої форми (наприклад, послідовностей, прийнятних для рослинної експресії) вихідної ДНК або послідовності протеїну (нуклеотидів або амінокислот), включених в представлений винахід. Довжина зазначеної послідовності є варіабельною, але вона є достатньо довгою для того, щоб забезпечити (кодований) протеїн, який представляє собою резистентний до гербіциду протеїн. В деяких випадках (зокрема експресії у рослин), переважним є використовувати усічений ген, який кодує усічений протеїн.

Переважний, усічений ген, як правило, кодує 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, або 9995 всього протеїну.

Через надмірність генетичних кодонів різноманітність різних послідовностей ДНК може кодувати однакову амінокислотну послідовність. Для кваліфікованого фахівця в даній галузі доступним є досягнення заміняючих послідовностей ДНК, які кодують однаковий або фактично однаковий протеїн. Дані різні послідовності ДНК є включеними в даний винахід. Зазначена "фактично однакова" послідовність стосується послідовності, в якій деякі амінокислоти є заміщеними, видаленими, доданими або вставленими, але її резистентна до гербіцидів активність не знаходиться під істотним впливом, та також включає фрагменти, які зберігають резистентну до гербіциду активність.

Заміщення, делеція або додавання деяких амінокислот в амінокислотні послідовності в даному винаході є звичайною технікою в даній галузі. Переважно, така амінокислотна заміна включає: зміну другорядної характеристики, тобто заміщення резервних амінокислот, які в значній мірі не впливають на укладання та/або активність протеїну; коротку делецію, як правило, делецію з приблизно 1-30 амінокислот; коротке подовження аміно або карбоксильного кінця, таке як подовження метіонінового залишку аміно-кінця; коротке сполучення пептиду, такого як приблизно 20-25 залишків в довжину.

Приклади консервативних заміщень представляють собою заміщення, які відбуваються в наступних амінокислотних групах, таких як: основні амінокислоти (такі як аргінін, лізин та гістидин), кислотні амінокислоти (такі як глутамінова кислота та аспарагінова кислота), полярні амінокислоти (наприклад, глутамін та аспарагін), гідрофобні амінокислоти (такі як лейцин, ізолейцин та валін), ароматичні амінокислоти (наприклад, фенілаланін, триптофан та тирозин), та малі молекулярні амінокислоти (такі як гліцин, аланін, серин, треонін та метіонін).

Амінокислотні заміщення, які, як правило, не змінюють специфічну активність, є добре відомими в даній галузі та вже були описані в, наприклад, Ргоїеїіп під редакцією М. Мешгайй апа К.Г. НІЇ, яка опублікована Асадетіс Рге55, Мем/ МогК в 1979. Найбільш поширеними заміщеннями є

АІа/бег, Майїе, Авр/Ссім, Тпи/5ег, Аїа/ТНг, Зег/Авп, АІа/Маї, Зег/Ссіу, Туг/РНе, АПІа/Рго, Гуз/Аго,

Азр/Азп, І еш/Іе, І еи/маї, АІа/сіІм та Азр/су, та їх зворотні заміщення.

Очевидно, що для кваліфікованого фахівця в даній галузі таке заміщення може відбуватися за межами ділянок, які є важливими для молекулярної функції та все ще викликають продукування активних поліпептидів. Для поліпептиду за представленим винаходом амінокислотні залишки, які є необхідними для їх активності та вибрані як незаміщені залишки, можуть бути ідентифікованими відповідно до відомих в даній галузі способів, таких як сайт- спрямований мутагенез або аланін-скануючий мутагенез (дивіться, наприклад, Сиппіпапат апа

МеїІв, 1989, бсівєпсе 244: 1081-1085). Остання методика здійснюється шляхом введення мутацій в кожен позитивно заряджений залишок в молекулі та виявлення стійкої до гербіциду активності бо отриманих мутаційних молекул, з метою ідентифікації амінокислотних залишків, які є важливими для активності молекул. Сайти взаємодії ферментів та субстратів також можуть бути визначеними, аналізуючи його тривимірну структуру, яка може визначатися за допомогою деяких методів, таких як аналіз ядерного магнітного резонансу (ЯМР), кристалографія або маркування фотоафінності (дивіться, наприклад, де Моз еї аї., 1992, 5сіепсе 255: 306-312, тій еїаї!.,1992, 9. Мої. Віо! 224: 899-904; Модамег єї а!., 1992, РЕВ5 І еЦегв5 309: 59-64).

Таким чином, амінокислотні послідовності, які мають певну гомологічність з амінокислотними послідовностями, представленими в ЗЕО ІО Мо. 2 також є включеними в даний винахід. Подібність/гомологічність послідовності між даними послідовностями та послідовностями, описаними в представленому винаході становить, як правило, більше, ніж 6096, переважно більше, ніж 7595, більш переважно більше, ніж 8095, ще більш переважно більше, ніж 9095 та найбільш переважно більше, ніж 9595. Переважні полінуклеотиди та протеїни в представленому винаході також можуть бути визначеними відповідно до більш специфічних діапазонів гомологічності та/або подібності. Наприклад, вони мають гомологічність та/або подібність на 4995, 5095, 5195, 5295, 5395, 5495, 5595, 5690, 57905, 5895, 5995, 60905, 6195, 6295, бЗов, 6495, 6595, 6бов, 679Ую, 680, 6995, 7095, 7196, 7290, 7390, 74, 7590, бю, 77Ую, 789Ую, 7990, 8096, 8195, 8295, 8395, 8490, 8590, 8695, 8795, 8895, 8990, 9095, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595, 969, 9795, 9895 або 9995 до послідовностей, описаних в даному винаході.

Регуляторні послідовності, описані в даному винаході, включають, але не обмежуються цим, промотор, транзитний пептид, термінатор, енхансер, лідерну послідовність, інтрони та інші регуляторні послідовності, які можуть бути функціонально зв'язаними із зазначеним геном 240111.

Зазначений промотор представляє собою промотор, який здатний експресуватися в рослинах, причому зазначений "здатний експресуватися в рослинах промотор" стосується промотора, який забезпечує те, що кодуючі послідовності, зв'язані з промотором, можуть бути експресованими в рослинних клітинах. Здатний експресуватися в рослинах промотор може представляти собою конститутивний промотор. Приклади промоторів, здатних спрямовувати конститутивну експресію в рослинах включають, але не обмежуються цим, 355 промотор, який походить з вірусу мозаїки цвітної капусти, прі промотор, промотор гену 5052 який походить з рису та інших подібних. Альтернативно, здатний експресуватися в рослинах промотор може

Зо представляти собою тканинно-специфічний промотор, що означає, що рівень експресії, спрямованої даним промотором в деяких рослинних тканинах, таких як хлоренхіма, є більш високим, ніж в інших тканинах рослини (можуть вимірювати, застосовуючи загальноприйнятий

РНК тест), такий як промотор РЕР-карбоксилази. Альтернативно, здатний експресуватися в рослинах промотор може представляти собою також опромотори, які індукуються пошкодженням. Промотори, які індукуються пошкодженням, або промотори, які спрямовують способи індукованої пошкодженням експресії, стосуються промоторів, застосовуючи які рівень експресії кодуючих послідовностей може бути в значній мірі підвищеним в порівнянні з тими, які знаходяться в нормальних умовах росту, коли рослини піддаються механічної пошкодженню або пошкодженню, яке завдається поїданням комах. Приклади промоторів, які індукуються пошкодженням включають, але не обмежуються цим, промотори генів інгібітору протеази картоплі та помідорів (ріп І та ріп Ії) та промотори гена інгібітору кукурудзяної протеази (МРІ).

Зазначений транзитний пептид (також називається паракринальною сигнальною послідовністю або лідерною послідовністю) спрямовує трансгенозні продукти у специфічні органели або клітинні відділення. Для рецепторного протеїну, зазначений транзитний пептид може бути гетерогенним. Наприклад, послідовності, які кодують транзитний пептид хлоропласту, використовуються для отримання хлоропласту; або "КОЕЇ" зарезервована послідовність використовується для отримання ендоплазматичного ретикулуму, або СТРР гена лектину ячменю використовується для отримання вакуолі.

Зазначені лідерні послідовності включають, але не обмежуються цим, малі РНК вірусні лідерні послідовності, такі як ЕМСМ лідерна послідовність (некодуюча ділянка 5' вірусу енцефаломіокардиту); лідерні послідовності МУ вірусу картоплі, такі як лідерна послідовність

МОМУ (вірус карликової мозаїки кукурудзи); протеїн зв'язування важкого ланцюга людського імуноглобуліну (ВіР); нетрансльовану лідерну послідовність МРНК протеїну оболонки вірусу мозаїки люцерни (АММ КМА4); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТММ).

Зазначений енхансер включає, але не обмежується цим, енхансер вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), енхансер вірусу мозаїки ранника (ЕМУМ), енхансер вірусу Сагпайоп5 Еїспеа Кіпд (СЕКМ), енхансер вірусу мозаїки Саззама Меіп (С5ММУМ), енхансер вірусу мозаїки Мігабіїй5 (ММУ), енхансер вірусу скручування жовтого листка Себігит (Ст! СМ), вірус жовтої курчавості листка бавовника (С СиМУМ), вірус жовтої крапчатки Соттеїїпа (СОоОУМУМ) та енхансер вірусу бо мозаїки хлоротичної смугастості арахісу (РСІ БМ).

Для застосування у однодольних, зазначені інтрони включають, але не обмежується цим, інтрони кукурудзи п5р70, інтрони убіквітину кукурудзи, Ай інтрон 1, інтрони синтази сахарози або інтрони АсСИ рису. Для застосування у дводольних рослин, зазначені інтрони включають, але не обмежуються цим, інтрони САТ-1, інтрони РКАММІВАГ., інтрони РІМ2 та інтрони "супер убіквітину"

Зазначені термінатори можуть представляти собою властиві сигнальні послідовності поліаденилювання, які відіграють певну роль у рослин. Вони включають, але не обмежуються цим, сигнальну послідовність поліаденилювання, яка походить з гена нопалінсинтази (МОБ)

Адгорасіегічт їшптегїасіеп5, сигнальну послідовність поліааденилювання, яка походить з гена інгібітору протеази Ії (ріп Ії), сигнальну послідовність поліаденилювання, яка походить з гена 55КОВІЗСО ЕЗ9 гороху, та сигнальну послідовність поліаденилювання, яка походить з гена а- тубуліну.

Термін "функціонально зв'язаний", описаний в даному винаході, стосується зв'язування послідовностей нуклеїнових кислот, яке передбачає послідовності з необхідною функцією зв'язаних послідовностей. Термін "функціонально зв'язаний", описаний в даному винаході, може представляти собою зв'язування промотора з послідовностями, які представляють зацікавленість, що забезпечує контроль та регуляцію промотора над транскрипцією даних послідовностей. Коли послідовність, яка представляє зацікавленість, кодує протеїн, та необхідною є експресія даного протеїну, термін "функціонально зв'язаний" показує, що зв'язування промотора та зазначеної послідовності робить отриманий транскрипт ефективно трансльованим. Якщо зв'язування промотора та кодуючої послідовності в результаті призводить до транскрипційного злиття, та необхідною є експресія кодованого протеїну, то таке зв'язування створюється для того, щоб бути впевненими, що перший кодон ініціації транскрипції отриманого транскрипту представляє собою кодон ініціації кодуючої послідовності. Альтернативно, зв'язування промотора та кодуючої послідовності в результаті призводить до транскрипційного злиття, та необхідною є експресія кодованого протеїну, то таке зв'язування створюється для того, щоб бути впевненими, що перший кодон ініціації транскрипції 5' нетрансльованої послідовності є зв'язаним з промотором, та такий спосіб зв'язування встановлює взаємозв'язок між отриманими транскрипційними продуктами та відкритою рамкою зчитування, яка кодує

Зо протеїн, що представляє зацікавленість, який відповідає рамці зчитування. Послідовності нуклеїнової кислоти, які можуть бути "функціонально зв'язаними" включають, але не обмежуються цим, послідовності, які забезпечують функцію експресії гена (тобто елементи експресії гена, такі як промотор, 5' нетрансльовану ділянку, інтрони, протеїн-кодуючу ділянку, З' нетрансльовану ділянку, сайти поліаденилювання та/або термінатори транскрипції); послідовності, які забезпечують функцію перенесення та/або інтеграції ДНК (тобто, граничні послідовності Т-ДНК, сайти розпізнавання сайт-специфічного рекомбінантного ферменту, сайти розпізнавання інтегрази); послідовності, які забезпечують селективну функцію (тобто, маркери стійкості до антибіотиків, біосинтетичні гени); послідовності, які забезпечують функцію оціночних маркерів; допоміжні послідовності з функціональністю послідовностей іп мійго або іп мімо (полілінкерні послідовності, сайт-специфічні рекомбінантні послідовності) та послідовності, які забезпечують функцію реплікації (тобто походження з реплікації бактерій, автономно реплікуючих послідовностей, центромірних послідовностей).

Даний винахід може забезпечити нову(ї) властивість(ості) резистентності до гербіциду у рослин, тоді як несприятливі ефекти на фенотипи, включаючи вихід, не спостерігаються.

Рослини за представлений винахід можуть мати толерантність 2 х, З х, 4 х або 5 х загального рівня застосування щонайменше одного гербіциду, дії якого піддаються. Покращення даних рівнів резистентності знаходиться в межах обсягу представленого винаходу. Наприклад, можливою є прогнозована оптимізація та подальший розвиток багатьох видів відомих технологій в даній галузі, з тим щоб підвищити експресію наданого гена.

В представленому винаході, зазначений резистентний до гербіциду протеїн представляє собою 240111 амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО: 2 переліку послідовностей. Зазначений резистентний до гербіцидів ген представляє собою нуклеотидну послідовність 240111, як показано в ЗЕО ІЮ МО: 1 переліку послідовностей. Для того, щоб бути застосованим до рослин, зазначений резистентний до гербіцидів ген також містить, крім кодуючої ділянки протеїну, кодованого нуклеотидною послідовністю 240111, інші елементи, такі як ті, які кодують ділянки, які кодують транзитні пептиди, кодуючі ділянки, які кодують селективні маркерні протеїни або протеїни, які надають резистентність до комах.

Резистентний до гербіциду протеїн 240111, як описано в даному документі, є толерантним до більшості феноксіауксинових гербіцидів. Геноми рослин в представленому винаході містять 60 екзогенні ДНК, які містять нуклеотидну послідовність 240111. Рослини є захищеними від загрозливої дії гербіцидів за рахунок експресії ефективної кількості даного протеїну. "Ефективна кількість" стосується кількості, яка не викликає ніякого пошкодження або викликає незначні пошкодження. В той же час, рослини повинні бути морфологічно нормальними, та можуть культивуватися за звичайних засобів для споживання та/або генерування продуктів.

Рівень експресії кристалічних протеїнів з резистентністю до гербіцидів (ІСР) в рослинних матеріалах можуть визначати, використовуючи різні способи, описані в даній галузі, такі як спосіб кількісного визначення мРНК, яка кодує резистентний до гербіциду протеїн в тканині за рахунок застосування специфічних праймерів, або спосіб кількісного визначення резистентного до гербіциду протеїну безпосередньо та специфічно.

Представлений винахід передбачає резистентний до гербіциду протеїн, кодуючий його ген та його застосування з наступними перевагами: 1. Сильна активність резистентності до гербіцидів. Резистентний до гербіциду протеїн 240111 за представленим винаходом є дуже резистентним до гербіцидів, зокрема, до феноксіауксинових гербіцидів, а саме 2,4-0. 2. Широкий спектр резистентності до гербіцидів. Резистентний до гербіциду протеїн 240111 за представленим винаходом показує високу резистентність до багатьох рослинних феноксіауксинових гербіцидів, тому він має широке перспективне застосування до рослин.

Технічні рішення за даним винаходом будуть додатково описані з використанням креслень, які додаються, та прикладів, наведених нижче.

Короткий опис креслень

Фігура 1 показує схему, щоб конструювати рекомбінантний вектор клонування ЮОВМО1-Т, який містить нуклеотидну послідовність 240111, яка використовується в резистентному до гербіциду протеїні, кодуючому гені та його застосуваннях в представленому винаході;

Фігура 2 показує схему, щоб конструювати рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411, який містить нуклеотидну послідовність 240111, яка використовується в резистентному до гербіциду протеїні, кодуючому гені та його застосуванні в представленому винаході;

Фігура З показує схему, щоб конструювати рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411М, який містить контрольну послідовність, яка використовується в резистентному до гербіциду протеїні, кодуючому гені та його застосуванні в представленому винаході;

Зо Фігура 4 показує стійкий до гербіцидів ефект трансгенної рослини Агарідор5і5 Т1 резистентного до гербіциду протеїну, кодуючого гену та його застосування в представленому винаході;

Фігура 5 показує стійкий до гербіцидів ефект трансгенних рослин сої Ті, резистентного до гербіциду протеїну, кодуючого гена та його застосування в представленому винаході;

Фігура 6 показує схему, щоб конструювати рекомбінантний вектор експресії ОВМ100758, який містить нуклеотидну послідовність 240111, яка використовується в резистентному до гербіциду протеїні, кодуючому гені та його застосуванні в представленому винаході;

Фігура 7 показує схему, щоб конструювати рекомбінантний вектор експресії ОВМ100758М, який містить контрольну послідовність, яка використовується в резистентному до гербіциду протеїні, кодуючому гені та його застосуванні в представленому винаході.

Детальний опис варіантів здійснення

Технічне рішення резистентного до гербіциду протеїну, кодуючого гена та його застосування в представленому винаході буде додатково проілюстроване в наступних прикладах.

Приклад 1: Отримання та синтез генної послідовності 240111 1. Отримання генної послідовності 240111

Амінокислотна послідовність резистентного до гербіциду протеїну 240111 (292 амінокислоти) була представлена як ЗЕО ІО МО: 2 в переліку послідовностей; нуклеотидна послідовність (879 нуклеотидів), яка кодує відповідну амінокислотну послідовність резистентного до гербіциду протеїну 240111 (292 амінокислоти) була представлена як ЗЕО ІЮ

МО: 1 в переліку послідовностей. 2. Синтез нуклеотидної послідовності, як описано вище

Нуклеотидна послідовність 240111 (показана як 5ЕО ІЮО МО: 1 в переліку послідовностей) була синтезована за Сепобосгірі Со., 4. Мапіпо, Р.К. Спіпа; Синтезована нуклеотидна послідовність 240111 (5ЕО ІО МО: 1) була зв'язана з сайтом рестрикції 5реї на 5' кінці, та сайтом рестрикції Кабі на 3З' кінці.

Приклад 2: Конструювання рекомбінантних векторів експресії Агабрідорбвів Іпаїйапа та сої 1. Конструювання рекомбінантного вектора клонування ОВМО1-Т, який містить нуклеотидну послідовність 240111

Синтезовану нуклеотидну послідовність 240111 клонували в вектор клонування РОЕМ-Т (Рготеда, Мадізоп, ОБА, САТ: АЗбО0), щоб отримати рекомбінантний вектор клонування

ОВМО1-Т, дотримуючись інструкцій щодо вектора РСЕМ-Т від Рготеда, та спосіб конструювання був показаний на Фігурі 1 (на якій Атр представляє собою ген резистентності до ампіциліну; 7 представляє собою джерело реплікації фагу Я; І ас представляє собою кодон ініціації І ас/; 5Рб представляє собою промотор РНК-полімерази 5Рб; Т7 представляє собою промотор РНК- полімерази 17; 240111 представляє собою нуклеотидну послідовність 240111 (5ЕО ІЮО МО: 1);

МОЗ представляє собою декілька сайтів клонування).

Рекомбінантний вектор клонування ОВМО1-Т потім був трансформований в компетентну клітину Е. соїї Т1 (Ттапздеп, Веїїпуд, Спіпа, Ше САТ: СО5О1), застосовуючи спосіб теплового шоку. Умови теплового шоку були наступними: 50 мкл компетентної клітини ТІ1 Е. соїї та 10 мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор клонування ЮОВМО1-Т) інкубували на водяній бані при 42 "С протягом 30 секунд. Потім клітини Е. соїї були культивовані при струшуванні при 37 С протягом 1 год. (100 об./хв. в інкубаторі, який струшується) та потім вирощували на планшеті І В (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л Масі, 15 г/л агару, та рН регулювали до 7,5

Маон), на поверхню якої нанесено ІРТО (ізопропілтіо-бета-О-галактозний глюкозид), Х-гал (5- бром-4-хлор-3- індол-бета-О-галактозний глюкозид) та ампіцилін (100 мг/л), протягом ночі. Білі колонії були відібрані та культивовані в ЇВ бульйоні (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л Масі, 100 мг/л ампіциліну, та рН регулювали до 7,5 Маон) при 37 "С протягом ночі. Їх плазміди екстрагували, застосовуючи спосіб лужного лізису, як вказано далі: бактеріальну рідину центрифугували протягом 1 хв. на 12 000 об./хв., супернатант відкидали, та пелету повторно суспендували в 100 мкл в охолодженому крижаному розчині І (25 мМ Ттгі5-НОЇ, 10 мМ ЕДТО (етилендіамінтетраоцтова кислота) та 50 мМ глюкози, рнН-8,0); потім додавали 200 мкл свіжо отриманого розчину ІІ (0,2 М Ммаон, 195 505 (натрію додецилсульфат)), та пробірку перевертали 4 рази, перемішували та потім виливали на кригу протягом 3-5 хвилин; додавали 150 мкл холодного розчину І (3 М калію ацетату та 5 М оцтової кислоти), одразу ретельно перемішували та інкубували на кризі протягом 5-10 хвилин; суміш центрифугували на 12000 об./хв. при 4 "С протягом 5 хвилин, два об'єма безводного етанолу додавали в супернатант, перемішували та потім витримували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин; суміш

Зо центрифугували на 12000 об./хв. при 4 "С протягом 5 хвилин, супернатант відкидали та пелету сушили після промивання 7095 етанолом (о06./06.); 30 мкл ТЕ (10 мМ Тгтгіб5-НСІ, 1 мМ ЕДТО, рн.в8,0), який містить КМавзе (20 мкг/мл) додавали для розчинення осаду; суміш інкубували при 37 "С на водяній базі протягом 30 хв. для розщеплення РНК та зберігали при - 20 С для подальшого застосування.

Після того, як екстраговані плазміди були підтверджені рестрикційними ферментами 5реї та Казхі, позитивні клони перевіряли шляхом секвенування. Результати показали, що зазначена нуклеотидна послідовність 240111, вставлена в рекомбінантний вектор клонування ЮОВМО1-Т, представляла собою послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1 в переліку послідовностей, вказуючи на те, що нуклеотидна послідовність 240111 була правильно вставлена. 2. Конструювання рекомбінантних векторів експресії ОВМ100411 Агабідорзів ІШНаїїапа та сої, які містять нуклеотидну послідовність 240111

Рекомбінантний вектор клонування ЮОВМО1-ї та вектор експресії ЮВМВС-01 (Скелет вектора: РСАМВІА2301, доступний від установи САМВІА) розщеплювали з використанням ферментів рестрикції 5реї! та Казі. Розщеплений фрагмент нуклеотидної послідовності 240111 був лігований між сайтами рестрикції Зре! та Ка5зіІ вектора експресії ЮВМВС-01, щоб сконструювати рекомбінантний вектор експресії 0ОВМ100411. добре відомим для кваліфікованого фахівця в даній галузі є звичайний спосіб конструювання вектора експресії за рахунок розщеплення ферменту рестрикції. Схема конструювання показана на Фігурі 2 (Кап: ген канаміцину; ЕВ: права сторона; АШБІі10: промотор 10 гену убіквітину Агарідорзів (убіквітин) (ЗЕО І МО: 3); 240111: нуклеотидна послідовність 240111 (ЗЕО ІО МО: 1); Мо5: термінатор гена нопалінсинтази (ЗЕО ІЮ МО: 4); ргСсСамм355: промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 бЕО ІЮ МО:5); РАТ: ген глюфосинат ацетилтрансферази (ЗЕО ІЮ МО:6); ІСаммуз355: термінатор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 (5ЕО ІО МО: 7); І В: ліва сторона).

Рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411 трансформували в компетентні клітини Т1 Е. соїї застосовуючи спосіб теплового шоку, як вказано далі: 50 мкл компетентної клітини Т1 Е. соїї та 10 мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411) інкубували на водяній бані при 42 "С протягом 30 секунд. Потім клітини Е. соїї були культивовані при струшуванні при 37 "С протягом 1 години (100 об./хв. в інкубаторі, який струшується,) та потім вирощували в твердому планшеті І В (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л масі, 15 г/л агару, та бо рН регулювали до 7,5 Маон), який містить 50 мг/л канаміцину при 37 "С протягом 12 годин. Білі колонії були відібрані та культивовані в ЇВ бульйоні (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л Масі, 50 мг/л канаміцину, та рН регулювали до 7,5 Маон) при 37 "С протягом ночі. Їх плазміди екстрагували, застосовуючи спосіб лужного лізису. Після того, як екстраговані плазміди були підтверджені з використанням ферментів рестрикції Зреї! та Кабі, позитивні клони перевіряли шляхом секвенування. Результати показали, що нуклеотидна послідовність між сайтами рестрикції Зреї! та Казі в рекомбінантному векторі експресії ОВМ100411 представляла собою нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 1 в переліку послідовностей, тобто нуклеотидну послідовність 240111. 3. Конструювання рекомбінантних векторів експресії ОВМ100411М Агабрідорзів Шаїїапа та сої, які містять контрольну послідовність

Після процесу конструювання рекомбінантного вектора клонування ОВМО1-Т, який включає нуклеотидну послідовність 240111, як описано в частині 1 Приклада 2, рекомбінантний вектор клонування ОВМО1ТК-Т, який містить контрольну послідовність, конструювали, застосовуючи контрольну послідовність (5ЕО ІЮ МО: 8). Позитивні клони перевіряли шляхом секвенування.

Результати показали, що контрольна нуклеотидна послідовність, вставлена в рекомбінантний вектор клонування ОВМО1К-Т, представляла собою послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 8 в переліку послідовностей, вказуючи на те, що контрольна нуклеотидна послідовність була правильно вставлена.

Після процесу конструювання рекомбінантного вектора експресії ОВМ100411, який містить нуклеотидну послідовність 240111, як описано в частині 2 Приклада 2, рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411М, який містить контрольну послідовність, конструювали, застосовуючи контрольну послідовність, та структура вектора була показана на Фігурі З (Скелет вектора: рСАМВІА2301, доступний від установи САМВІА); Кап: ген канаміцину; КВ: права сторона; промотор гена 10 убіквітину АШБІі10:Агарідорзів (убіквітин) (ЗЕО ІЮ МО: 3); тМ: контрольна послідовність (ЗЕО ІЮ МО: 8); Мо5, термінатор гена нопалінсинтази (ЗЕО ІЮ МО: 4); ррсСамм355: промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 6ЕО ІО 0 МО:5) РАТ: ген гліфосинатацетилтрансферази (ЗЕО ІЮ МО:6); ІсСамму355: термінатор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 (5БО ІЮ МО: 7); ЇВ: ліва сторона). Позитивні клони перевіряли шляхом секвенування. Результати показали, що контрольна послідовність, вставлена в рекомбінантний

Ко) вектор експресії ОВМ100411М, представляла собою послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 8 в переліку послідовностей, вказуючи на те, що контрольна послідовність була правильно вставлена.

Приклад З: Отримання рослини Агарідорзі5 зі вставленою нуклеотидною послідовністю 240111 1. Трансформація Адгобасіегішт Кшптегасіеп5 з рекомбінантними векторами експресії

Коректно сконструйовані рекомбінантні вектори експресії ЮОВМ100411 та 0ОВМ100411 М (контрольна послідовність) були трансформованими в Адгобасієгішт (ЗМ3101 після способу швидкого заморожування рідким азотом, як вказано далі: 100 мкл Адгобасіегішт (ЗМУЗ3101 та З мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор експресії) занурювали в рідкий азот протягом 10 хвилин та потім інкубували на водяній бані при 37" С протягом 10 хвилин. Потім трансформовані клітини Адгобасіегішт (3У3101 інокулювали в І В бульйоні та культивували при 28 С, 200 об./хв. протягом 2 годин та розподіляли по поверхні на планшеті І В, який містить 50 мг/л рифампіцину (Рифампіцин) та 50 мг/л канаміцину до появи позитивних моно колоній.

Позитивні моно колонії збирали та культивували, та їх плазміди екстрагували. Рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411 перевіряли з використанням ферментів рестрикції 5таї! та Есо ВУ, та рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411М (контрольна послідовність) перевіряли з використанням ферментів рестрикції та! та Водії. Результати показали, що рекомбінантні вектори експресії ОВМ100411 та ОВМ100411М (контрольна послідовність) були правильними за структурою, відповідно. 2. Отримання трансгенної рослини Агарідорзів (паІапа

Насіння немутантного типу Агарідорзі5 суспендували в 0,195 (мас./об.) розчині агарози та зберігали при 4 "С протягом 2 днів таким чином, щоб задовольнити потребу в спокою, щоб забезпечити синхронне проростання насіння. Вермикуліт та кінський гній перемішували разом та зрошували до вологого стану водою під землею. Грунтова суміш обезводнювали протягом 24 годин. Попередньо оброблене насіння культивували в грунтовій суміші та накривали зволожуючою маскою протягом 7 днів. Насіння проростало, та рослини культивували в теплиці при постійній температурі 22 "С при постійній вологості 40-5095 та тривалій денній умові з інтенсивністю світла 120-150 мкмоль/мес (16 годин світла / 8 годин темряви). Рослини спочатку зрошували поживним розчином Хоагленда та потім деіонізованою водою, щоб зберегти 60 грунтову вологу, а не бути змоченим.

Спосіб квіткового провалу використовувався для перетворення Агарідорвзіх. Одне або декілька ТЕР середовищ, які містять 50 мг/л канаміцину та 10 мг/л рифампіцину, об'ємом 15-30 мл інокулювали з відібраними колоніями Адгобасіегішт, як попередню культуру. Попередню культуру інкубували при 28С та 220 об./хв. протягом ночі. Кожну попередню культуру використовували, щоб інокулювати дві культури по 500 мл МЕР середовищ, які містять канаміцин (100 мг/л) та рифампіцин (10 мг/л), та культури інкубували при 28 "С в інкубаторі, який струшується, протягом ночі. Культури центрифугували при 8700х49 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, щоб осадити клітини, та отриманий супернатант відкидали. Клітинні пелети обережно повторно суспендували в 500 мл проникного середовища, яке містить 1/2 х

М5 солі/вітамін В5, 1095 (мас./06.) сахарози, 0,044 мкМ бензиламінопурину (10 мкл/л (1 мг/мл вихідний розчин в ДМСО)) та 300 мкл/л 5іїмеї І -77. рослини віком приблизно 1 місяць просочували в середовищі протягом 15 секунд, та було забезпечено, щоб останні суцвіття були занурені. Потім занурені рослини відкладали в бік та накривали (прозорим або непрозорим матеріалом) протягом 24 годин, потім промивали водою та розташовували вертикально.

Рослини культивували при 22 "С в світловому циклі 16 годин світла / 8 годин темряви. Насіння збирали після просочення протягом 4 тижнів.

По-новому зібране Т1 насіння (нуклеотидна послідовність 240111 та контрольна послідовність) сушили при кімнатній температурі протягом 7 днів. Насіння культивували в планшетах для проростання (26,5 х 51 см), 200 мг Т1 насіння (приблизно 10000 насіння)/лпланшет. Насіння вже суспендували в 40 мл 0,195 (мас./0б.) розчину агарози та зберігали при 4 "С протягом 2 днів щоб задовольнити потребу в спокою, щоб забезпечити синхронне проростання насіння.

Вермикуліт та кінський гній змішували разом та зрошували до вологого стану водою під землею та осушувалися за рахунок гравітації. Попередньо оброблене насіння (40 мл на кожну насінину) рівномірно висівали на грунтову суміш, застосовуючи піпетку, та накривали зволожуючою маскою протягом 4 - 5 днів. Маску видаляли за 1 день до початку трансформантного відбору шляхом розпилення глуфозинату амонію (відбір спільно трансформованого гену РАТ) після проростання.

На 7 день після посадки (ВАР) та 11 ВАР, відповідно, рослини Т1 (сім'ядольна стадія та 2-4

Зо стадії листя, відповідно) обприскували 0,295 розчином гербіциду ГГ ібегіу (200 г а.і./л глуфозинату амонію), використовуючи насадку для стисненого повітря Оеміїріє5 при розпиленні об'ємом 10 мл / диск (703 л/га) для забезпечення ефективної кількості глуфозинату амонію (280 г а.і./га) для кожного застосування. Вирощувані рослини (рослини, які активно ростуть) перевіряли через 4 - 7 днів після останнього обприскування та пересаджували в квадратний горщик (7 см х7 см), виготовлений з вермикуліту та кінського навозу (3-5 рослин на горщик). Пересаджені рослини накривали зволожуючою маскою протягом 3-4 днів та розташовували в приміщення для культур при 22 "С або безпосередньо в теплиці, як описано вище. Потім маску видаляли та рослини пересаджували в теплицю (22 ж 5 "С, 50 - 30905 відн.вол., 14 годин світла: 10 годин темряви, мінімум 500 мкЕ/т251 природного світла я додаткового світла), щонайменше, за один день до дослідження здатності 240111, який забезпечує резистентність до феноксіауксинового гербіциду.

Приклад 4: Дослідження ефекту резистентності до гербіциду трансгенного Агарідорвів 240111 ген використовували вперше для трансформації Агарідорвзі5. Спочатку, трансформанти Т1 вибирали з попередника нетрансформованого насіння, застосовуючи схему відбору за глуфозинатом амонію. Піддавали скринінгу приблизно 20000 насінин Т1, серед яких було ідентифіковано 282 штамів позитивних трансформантів генів Т1 (ген РАТ), тобто ефективність трансформації становила приблизно 1,495. Дослідження ефекту резистентності до гербіциду 2,4-0О диметиламмонійної солі, та агроксон Т1 рослин Агабідорзі5, трансформованих з нуклеотидною послідовністю 240111, контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно, та немутантного типу рослини Агабрідорзі5 виконували через 18 днів після посадки.

Т1 рослини Агарідорзхізх, трансформовані з нуклеотидною послідовністю 240111, контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно, та немутантного типу рослини

Агарідорзіє обприскували 2,4-Ю0 диметиламмонійною сіллю (560 г кис.екв./га, 1-кратна концентрація на полі), агроксоном (560 г кис.екв./га, 1-кратна концентрація на полі) та порожнім розчинником (водою). Умови резистентності рослин визначали через 7 днів та 14 днів після обприскування. Рослини з умовами росту, які обробляли порожнім розчинником (водою), через 7 днів після обприскування класифікували як високо резистентні рослини; Рослини з кучерявими розетками листя через 7 днів після обприскування класифікували як помірно резистентні рослини; Рослини, які не здатні до стеблування через 14 днів після обприскування бо класифікували як низько резистентні рослини, та мертві рослини через 14 днів після обприскування класифікували як нерезистентні рослини. Оскільки кожна Т1 рослина Агабідорвів представляє собою незалежну подію трансформації, істотні відмінності індивідуальних відповідей Т1 можуть очікуватись при даній дозі. Результати показані в таблиці 1 та на фігурі 4.

Таблиця 1

Результати резистентності до гербіцидів трансгенних рослин Т1 Агабідорвів

Агарідорзів | резистентні | резистентні | резистентні

Порожній гарт | 32 | 0 | 0 1 Бюжкюо0 11 32 розчинник |Контроланий| 32 | 0 | 0 | 0 | з (Не) Немутантний| 32 | 0 2 | 0 / 0 | з2 560гкисекв/а, 240111 | 26 | 2 | 1 | 3 | з 2,4-Одиметил- Контрольний! 0 2 (| Б щю «ЙО | 0 | 32 | 32 пхааву рнемутнтний! 010 о1за |за 5богкисекв/а, 240111 | 22 | 4 | 2 | 3 | зч агроксону Контрольний! 0 2 (| 2 ЮБчтб | 0 | 32 | 32 (1ХМСОРА) (Немутантний| 0 2 КЇЖЮБЬи Б0 | 0 | 32 | з2

Для Агарідорзіх5, 560 г кис.екв./га 2,4-О та агроксону представляє собою ефективну дозу, щоб відрізнити чутливі рослини від рослин з середньою резистентністю. Результати, показані в таблиці 1 та на фігурі 4, показали, що ген 240111 забезпечує резистентність до гербіциду окремих рослин Агабрідорвзі5 (тільки частини рослин мають резистентність, оскільки сайти вставки рослин генерації Т1 є випадковими. Таким чином, рівні експресії резистентного гена є різними, що в результаті призводить до різних рівнів резистентності), зокрема до феноксіауксинових гербіцидів. Немутантного типу рослини Агабідорвхі5 та рослини Агабрідорбвів, трансформовані з контрольною послідовністю не мали ніякої резистентності до феноксіауксинового гербіциду.

Приклад 5 Отримання рослини сої зі вставленою нуклеотидною послідовністю 240111 1. Трансформація Адгобасіегішт Ішптегасієеп5 з рекомбінантними векторами експресії

Коректно сконструйовані рекомбінантні вектори експресії ОВМ100411 та ОВМ100411М (контрольна послідовність) були трансформованими в Адгобрасієгішт І ВА4404 (Іпмігдеп,

СНісадо, БА, САТ: 18313-015) після способу швидкого заморожування рідким азотом, умови трансформації є наступними: Адгобасіегішт І ВА4404 та 3 мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор експресії) занурювали в рідкий азот протягом 10 хвилин та потім інкубували на водяній бані при 37 "С протягом 10 хвилин. Потім трансформовані клітини Адгорасієгішт І ВА4404 інокулювали в ЇВ бульйоні та культивували при 28 "С, 200 об./хв. протягом 2 годин та розподіляли по поверхні планшета ІВ, який містить 50 мг/л рифампіцину (Рифампіцин) та 50 мг/л канаміцину до появи позитивних моно колоній. Позитивні моно колонії збирали та культивували, та їх плазміди екстрагували. Рекомбінантні вектори експресії ЮВМ100411 перевіряли з використанням ферментів рестрикції Зта! та ЕсокУ, та рекомбінантний вектор експресії ОВМ100411М (контрольна послідовність) перевіряли з використанням ферментів рестрикції Зтаї та ВадіІ. Результати показали, що рекомбінантні вектори експресії ОВМ100411 та

Зо рвМм100411М (контрольна послідовність) були правильними в структурі, відповідно. 2. Отримання трансгенної рослини сої

Сім'ядольний вузол немутантного типу сої (2попдопиапод 13) був стерильно культивований з

Адгорасіегішт ішптеїасіеп5, описаним в Прикладі 17 як для передачі Т-ДНК рекомбінантних векторів експресії ОВМ100411 та 0ОВМ100411М, описаних в прикладі 2 та З (що містить промоторну послідовність гену 10 убіквітину Агарідорзіб5 (йаійапа, нуклеотидну послідовність 240111, контрольну послідовність, Мо5 термінатор, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 355, ген глюфосинатацетилтрансферази та термінатор вірусу мозаїки цвітної капусти 355) в геномі сої, отримували рослини сої, які містять 240111 та контрольні нуклеотидні послідовності, та, в той же час немутантного типу рослина сої була прийнята як контроль.

Стосовно опосередкованої агробактеріями трансформації сої, коротко, зріле насіння сої проростало в середовищі для пророщування сої (3,1 г/л В5 сіль, В5 вітамін, 20 г/л сахарози, 8 г/л агару та рН 5,6) та культивували в наступних умовах: температура, 25:21 "С; фотоперіод (свігло/ллемряви), 16/8 год. Свіжа зелена асептична соя з опуклим вузлом сім'ядолі була отримана через 4-6 днів після проростання, відрізали гіпокотиль, який знаходився на 3-4 мм нижче вузла сім'ядолі, відрізали сім'яЯдолю в поздовжньому напрямку, та видаляли верхівкову бруньку, бічну бруньку та зародковий корінь із сім'ядолі, роблячи пошкодження в вузлі сім'ядолі зі зворотного боку скальпелем та приводячи агробактеріальну суспензію в контакт з пошкодженими тканинами вузла сім'ядолі, де агробактерія може переносити нуклеотидну послідовність 240111 в пошкоджені тканини вузла сім'ядолі (Стадія 1, стадія інфікування: на даній стадії, переважно, тканина вузла сім'ядолі занурювали в агробактеріальну суспензію (ООвво-0,5 - 0,68, інфекційне середовище (2,15 г/л М5 солі, В5 вітамін, 20 г/л сахарози, 10 г/л глюкози, 40 мг/л ацетосирінгона (АБ), 4г/л 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), 2 мг/л зеатину (27Т), рН 5,3)), щоб ініціювати інокуляцію. Тканину вузла сім'ядолі спільно культивували з агробактерією протягом періоду (3 дні). (Стадія 2: стадія спільного культивування). Переважно, тканини вузла сем'ядолі культивували в твердому середовищі (4,3 г/л М5 солі, В5 вітамін, 20 г/л сахарози, 10 г/л глюкози, 4 г/л 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕЗ5), 2 мг/л зеатина, 8 г/л агару та рН 5,6) після інфікування. Після даної стадії спів - культивування, може передувати стадія селективного "відновлення". На стадії "відновлення", середовище відновлення (3,1 г/л В5 сіль, В5 вітамін, 1 г/л 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), 30 г/л сахарози, 2 мг/л зеатину (27), 8 г/л агару, 150 мг/л цефалоспорину,100 мг/л глутамінової кислоти, 100 мг/л аспарагінової кислота та рН 5,6) містить щонайменше один вид відомого антибіотика, який інгібує агробактерії (цефалоспорин) без селективного агента для рослинних трансфектантів (Стадія З: стадія відновлення). Переважно, тканини культивували на твердому середовищі культури, яке містить антибіотики, але без селективного агента, таким чином, щоб усунути агробактерії, та, щоб забезпечити період відновлення для інфікованих клітин. Потім, інокульовані тканини культивували в середовищі, яке містить селективний агент (глюфосинат). Переважно, тканини культивували в селективному твердому середовищі, яке містить селективний агент (3,1 г/л В5 солі, В5 вітамін, 1 г/л 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), 30 г/л сахарози, 1 мг/л б-бензиладеніну (6-ВАР), 8 г/л агару, 150 мг/л цефалоспорину, 100 мг/л глутамінової кислоти, 100 мг/л аспарагінової кислоти, 6 мг/л глюфосинату, та рН 5,6), що в результаті призводить до селективного росту трансформованих клітин. Потім, калюс регенерований в рослинах (Стадія 5: стадія регенерації), переважно, калюс культивували в твердому середовищі, яке містить селективний агент (В5 середовище

Зо диференціювання та В5 середовище укорінення) для регенерації в рослинах.

Отриманий резистентний калюс переносили до зазначеного В5 середовища диференціювання (3,1 г/л В5 солі, В5 вітамін, 1 г/л 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), 30 г/л сахарози, 1 мг/л зеатину (27Т), 8 г/л агару, 150 мг/л цефалоспорину, 50 мг/л глутамінової кислоти, 50 мг/л аспарагінової кислоти, 1 мг/л гіберреліну, 1 мг/л ауксину, 6 мг/л глюфосинату та рН 5,6) для культивування та диференціювання при 25 "С. Диференційовані саджанці переносили в зазначене середовище для укорінення В5 (3,1 г/л В5 солі, В5 вітамін, 1 г/л. 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), 30 г/л сахарози, 8 г/л агару, 150 мг/л цефалоспорину та 1 мг/л індолмасляної кислоти (ІВА)) та культивували до приблизно 10 см у висоту при 25 "С . Далі, саджанці переносили та культивували в теплиці до плодоношення. В теплиці, рослини сої культивували при 26 "С протягом 16 годин та при 20 "С протягом 8 годин кожен день. 3. Валідація трансгенної рослини сої за способом ТадМап

Як зразок брали 100 мг листя з кожної з трансформованих рослин сої (рослина сої, трансформована з нуклеотидною послідовністю 240111 або контрольною нуклеотидною послідовністю), відповідно. Їх геномну ДНК екстрагували, застосовуючи набір ОМеавзу Ріапі Махі (Сіадеп). та кількість копій гена 240111 кількісно визначали, застосовуючи кількісний ПЛР аналіз флюоресценції на основі зонду Тадтап. Немутантний тип рослини сої брали як контрольний, та аналізували відповідно до способів, як описано вище. Експерименти проводились в трьох повторах, та результати представляли собою середні значення.

Специфічний спосіб визначення кількості копій РАТ гена описувався, як вказано далі:

Стадія 11: брали 100 мг листя з кожної трансформованої рослини сої (рослина сої, трансформована з нуклеотидною послідовністю 240111 або контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно) та немутантний тип рослини соя та подрібнювали до гомогенату в ступці в рідкому азоті, відповідно. Робили в трьох повторах для кожного зразка.

Стадія 12. геномні ДНК зразків, представлених вище, екстрагували, застосовуючи набір

ОМеазу Ріапі Міпі (СОіадеп), дотримуючись інструкції на даний продукт;

Стадія 13. концентрації геномної ДНК представлених вище зразків визначали, застосовуючи МапоОгор 2000 (Тпепто зЗсіепійіс);

Стадія 14. концентрації геномної ДНК регулювали до однакового діапазону 80-100 нг/мкл;

Стадія 15. кількості копій зразків кількісно визначали, застосовуючи кількісний ПЛР аналіз флюоресценції на основі зонду Тадтап, кількісно визначений зразок з відомою кількістю копій брали як стандартний зразок, та немутантний тип рослини сої брали як контрольний. Аналіз проводили в трьох повторах для кожного зразка, та результати представляли собою середні значення. Праймери та зонди, які використовували в флюоресцентному кількісному ПЛР аналізі, показані нижче.

Наступні праймери та зонди використовували для детектування нуклеотидну послідовність

РАТ:

Праймер 1: ОАОССТОТТОоТООсСстТОСТАТТО, як показано в 5ЗЕО ІЮ МО: 11 в переліку послідовностей;

Праймер 2: ТСТСААСТОТССААТССТААОСО, як показано в 5ЕБО ІЮ МО: 12 в переліку послідовностей;

Зонд 1: СТТАСОСТОСОСССТОСААОСОСсСТАС, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 13 в переліку послідовностей;

ПЛР-реакційна система:

Уитраваг"" Тад Кеадуміх м 10 мкл (5Бідта) 50х суміш праймер/зонд 1 мкл

Геномна ДНК З мкл

Вода (пдНгО) б мкл

Зазначена 50х суміш праймер/зонд, яка містить 45 мкл кожного праймера (1 мМ), 50 мкл зонда (100 мкМ) та 860 мкл 1х ТЕ буфера та зберігали в пробірці з темного скла при 4 "с.

Умови ПЛР реакції:

Стадія Температура Час 21 957с 5 хв. 22 957с З0с 23 60 1 хв. 24 Повернутися до стадії 22, повторити 40 разів

Дані аналізували, застосовуючи програмне забезпечення 505 2.3 (Арріїєйд Віозувієтв).

Експериментальні результати показали, що вся нуклеотидна послідовність нуклеотидної послідовності 240111 була інтегрована в зазначені виявлені рослини сої. Крім того, всі рослини сої, трансформовані з нуклеотидною послідовністю 240111 або контрольною послідовністю, яка містить одну копію гена, відповідно.

Приклад 6: Ефект резистентності до гербіцидів трансгенних рослин сої

Проводили дослідження ефектів резистентності до гербіцидів до 2,4-0 диметиламмонійної солі та агроксону рослин сої, які містять нуклеотидну послідовність 240111 та контрольну нуклеотидну послідовність, відповідно, та немутантний тип рослин сої (стадії МЗ3 - Ма4), відповідно.

Брали рослини сої, які містять нуклеотидну послідовність 240111, контрольну нуклеотидну послідовність та немутантний тип рослин соя та обприскували 2,4-О0 диметиламмонійною сіллю (2240 г кис.екв./га, чотирьох кратна концентрація на полі), агроксоном (2240 г кис.екв./га, чотирьох кратна концентрація на полі) та порожнім розчинником (водою). Візьміть статистику ступеня пошкодження кожної рослини, завданого гербіцидами, відповідно до ступеня скручування листя та ступеня пошкодження точки росту через шість годин (6бНАТ), два дні (20АТ), сім днів (7/ОАТ) та 14 днів (140БАТ) після розпилення, відповідно: якщо листя плоскі, наприклад, немутантного типу листя та точка росту є не ушкодженою, ступінь пошкодження становить 095; якщо листя скручуються та в'януть та точка росту є смертю, ступінь Пошкодження становить 10095.

Існує три штами, які містять перенесену нуклеотидну послідовність 240111 (51, 52 та 53), два штами, які містять перенесену контрольну послідовність (54 та 55), та один немутантного типу штам (СК) всього; вибирають 10-15 рослин з кожного штаму для дослідження. Результати були показані в таблиці 2 та на фігурі 5.

Таблиця 2

Експериментальні результати резистентності до гербіцидів генетично модифікованих рослин сої Ті

Середнє Середнє Середнє Середнє

Обробка Генотип сої (пошкодженнядспошкодженнядо! пошкодженнядо | пошкодженнядо бНАТ 2рАТ 7ОАТ 140АТ 81711110 1 0 1 0 1 0

Порожній 82 Її 10 1 0 1 0 1 0 " (вода) 85 щЩ |! 0 ЇЇ що0 | 0 її 0 ск Ї70 1 0 1 0 1 0 81 11117711 4 11110 1 0 зябівла 82 22770715 1.72 0 1.5015.5..5Б0. здо димемли 83333311 6 1210 аммонійної солі (4х2,4-О0) 8 111112 11177110 1 0 2240 г 82 111719 ЇЇ 5 ЇЇ Ющ МмМ0 її 0 кис.екв./га агроксон 54 | 938 2 | 69 | 87 щ | ло (ахМСРА)

Для сої, 2240 г кис.екв./га 2,4-Ю0 та агроксону представляє собою ефективну дозу щоб відрізнити чутливі рослини від рослин з середньою резистентність. Результати, показані в таблиці 2 та на фігурі 5, продемонстрували, що ген 240111 забезпечує резистентність до гербіциду індивідуальних рослин сої з високим рівнем резистентності до гербіциду, зокрема, феноксіауксинових гербіцидів, в той же час, як немутантного типу рослини сої, так і рослини сої, трансформовані з контрольною послідовністю, не мали ніякої резистентності до феноксіауксинового гербіциду.

Приклад 7: Конструювання рекомбінантного вектора експресії кукурудзи та трансформація агробактерії з рекомбінантним вектором експресії 1. Конструювання рекомбінантного вектора експресії ОВМ100758 кукурудзи, який містить нуклеотидну послідовність 240111

Рекомбінантний вектор клонування ЮОВМО1-ї та вектор експресії ЮВМВСОС-02 (Скелет вектора: РСАМВІА2301, доступний від установи САМВІА) розщеплювали з використанням ферментів рестрикції 5реї! та КазіІ. Розщеплений фрагмент нуклеотидної послідовності 240111 був лігований між сайтами рестрикції Зре! та КабіІ вектора експресії ЮВМВС-02, щоб сконструювати рекомбінантний вектор експресії 0ОВМ100758. Добре відомими є загальноприйнятий спосіб конструювання вектора експресії з використанням рестрикційного фермента розщеплення. Сайти рестрикції Зреї та Кабі в векторі експресії ОВМВС-02 також були введені, застосовуючи загальноприйнятий ферментативний спосіб розщеплення. Схема конструювання показана на фігурі 6 (Кап: ген канаміцину; КВ: права сторона; Обі: промотор гена 1 убіквітину кукурудзи (Убіквітин) (ЗЕО ІЮ МО: 9); 240111: нуклеотидна послідовність 240111 (5ЕБО ІО МО: 1); Мо5: термінатор гена нопалінсинтази (ЗЕО ІЮ МО: 4); РМІ: ген фосфоманози-ізомерази (ЗЕО ІО МО: 10); І В: ліва сторона).

Рекомбінантний вектор експресії 0ОВМ100758 був трансформований в компетентних клітинах Т1 Е. Соїї, застосовуючи спосіб теплового шоку, як вказано далі: 50 мкл компетентних клітин Т1 Е. соїї та 10 мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор експресії ЮОВМ100758) інкубували на водяній бані при 42 "С протягом 30 секунд. Потім клітини Е. соїї інкубували при

Зо культивуванні зі струшуванням при 37 "С протягом 1 години (100 об./хв. в інкубаторі, який струшується,) та потім вирощували на І В твердому планшеті (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л Масі, 15 г/л агару та рН регулювали до 7,5 Маон), який містить 50 мг/л канаміцину (канаміцин) при 37 "С протягом 12 годин. Білі колонії були вибрані та культивовані в

Ї В бульйоні (10 г/л триптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10 г/л Масі, 50 мг/л канаміцину та рн регулювали до 7,5 Маон) при 37 "С протягом ночі. Їх плазміди екстрагували, застосовуючи спосіб лужного лізису. Після того, як екстраговані плазміди були підтверджені з використанням ферментів рестрикції Зре! та Кабі, позитивні клони перевіряли шляхом секвенування.

Результати показали, що нуклеотидна послідовність між сайтами рестрикції Зре! та Кабі в рекомбінантному векторі експресії ОВМ100758 представляла собою нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1 в переліку послідовностей, тобто нуклеотидна послідовність 240111. 2. Конструювання рекомбінантного вектора експресії ОВМ100758М кукурудзи, який містить контрольну нуклеотидну послідовність

Після процесу конструювання рекомбінантного вектора клонування ОВМО1-Т, який містить нуклеотидні послідовності 240111, описані в частині 1 приклада 2, рекомбінантний вектор клонування ОВМО2ВА-Т, який містить контрольну послідовність, конструювали, застосовуючи контрольну послідовність (5ЕО ІЮ МО: 8). Позитивні клони перевіряли шляхом секвенування.

Результати показали, що контрольна нуклеотидна послідовність, вставлена в рекомбінантний вектор клонування ОВМО2К-Т, представляла собою послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 8 в переліку послідовностей, вказуючи на те, що контрольна нуклеотидна послідовність була правильно вставлена.

Після процесу конструювання рекомбінантного вектор експресії ОВМ100758, який містить нуклеотидну послідовність 240111, як описано в частині 1 приклада 7, рекомбінантний вектор експресії ОВМ100758М, який містить природну послідовність, конструювали, застосовуючи контрольну послідовність, та спосіб конструювання показано на фігурі 7 (Скелет вектора: рСАМВІА2301, доступний від установи САМВІА); Кап: ген канаміцину; КВ: права сторона; 2лШБії: промотор гена 1 убіквітину (убіквітин) кукурудзи (ЗЕО ІЮ МО: 9); тМ: контрольна послідовність (БЕО ІЮ МО: 8); Мов: термінатор гена нопалінсинтази (ЗЕ ІЮО МО: 4); РМІ: ген фосфоманози-ізомерази (ЗЕБЕО ІЮ МО: 10); ЇВ: ліва сторона). Позитивні клони перевіряли шляхом секвенування. Результати показали, що контрольна послідовність, вставлена в рекомбінантний вектор експресії ОВМ100758М, представляла собою послідовність, представлену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 8 в переліку послідовностей, вказуючи на те, що контрольна нуклеотидна послідовність була правильно вставлена.

Зо 3. Трансформація Адгобасіегішт шптеїасіеп5 з рекомбінантними векторами експресії кукурудзи

Коректно сконструйовані рекомбінантні вектори експресії ЮОВМ100758 та ЮВМ100758М (контрольна послідовність) були трансформовані в агробактерію І ВА4404 (Іпмігдеп, Спісадо,

И5БА, САТ: 18313-015) після способу швидкого заморожування рідким азотом, як вказано далі: 100 мкл Адгорасіегічшт І ВА4404 та 3 мкл плазміди ДНК (рекомбінантний вектор експресії) занурювали в рідкий азот та зберігали протягом 10 хвилин та потім інкубували на водяній бані при 37"С протягом 10 хвилин. Потім трансформовані Адгорасіегішт І ВА4404 клітини інокулювали в ЇВ пробірці та культивували при 28 С, 200 об./хв. протягом 2 годин та розподіляли по поверхні в планшеті І В, який містить 50 мг/л рифампіцину (Рифампіцин) та 50 мг/л канаміцину до появи позитивних моно колоній. Позитивні моно колонії збирали та культивували, та їх плазміди екстрагували. Рекомбінантний вектор експресії ЮОВМ100758 перевіряли з використанням ферментів рестрикції 5таї! та ЕСОКУ, та ОВМ100758М (контрольна послідовність) перевіряли з використанням ферментів рестрикції Зта! та ВоїІ. Результати показали, що рекомбінантні вектори експресії 0ОВМ100758 та 0ОВМ100758М (контрольна послідовність) були правильними за структурами, відповідно.

Приклад 8: Отримання та верифікація трансгенних рослин кукурудзи зі вставленою нуклеотидною послідовністю 240111

Відповідно до загальноприйнятного способу трансформації агробактерії, сорт 2опд 31 кукурудзи (231) культивовані в стерильних умовах та молодий ембріон спільно культивували зі штамами агробактерії, сконструйованими в частині З приклада 7, таким чином, щоб ввести Т-

ДНК в рекомбінантні вектори експресії ОВМ100758 та ОВМ100758М (контрольна послідовність), сконструйовані в частині 1 та 2 приклада 7 (включаючи послідовність промотора гена 1 убіквітину кукурудзи, нуклеотидну послідовність 240111, контрольну нуклеотидну послідовність, ген РМІ та послідовність термінатора Мо5) в геном кукурудзи. Отримували рослини кукурудзи, які містять нуклеотидну послідовність 240111 та контрольну нуклеотидну послідовність, відповідно, та в той же час немутантний тип рослини кукурудзи брали як контрольний.

Стосовно опосередкованої агробактеріями трансформації кукурудзи, коротко, незрілий молодий ембріон кукурудзи був виділений з кукурудз та приведений в контакт з агробактеріаальною суспензією, в якій агробактерії можуть доставляти нуклеотидну 60 послідовність 240111 в щонайменше одну клітину одного молодого ембріона. (Стадія 1: стадія інфекування). На даній стадії, переважно, молодий ембріон занурювали в агробактеріальну суспензію (20660 - 0,4 - 0,6, інфекційне середовище (4,3 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казуїну, 68,5 г/л сахарози, 36 г/л глюкози, 40 мг/л ацетосирінгона (АБ), 1 мг/л 2,4- дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-О03), рН--5,3)), щоб ініціювати інокуляцію. Молодий ембріон та агробактерію спільно культивували протягом періоду (3 дні) (Стадія 2: стадія спільного культивування). Переважно, молодий ембріон культивували в твердому середовищі (4,3 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казеїну, 20 г/л сахарози, 10 г/л глюкози, 100 мг/л ацетосирінгона (АБ), 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Ю0) та 8 г/л агару, рН-5,8) після стадії інфікування. Після даної стадії спільного культивування, можуть проводити стадію селективного "відновлення". На стадії "відновлення", середовище для відновлення (4,3 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казеїну, 30 г/л сахарози, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-О0) та З г/л фітагелю, рН-5,8) містить щонайменше один вид відомого антибіотика, який інгібує агробактерії (цефалоспорин) без селективного агента для рослинних трансфектантів (Стадія 3: стадія відновлення). Переважно, молодий ембріон культивували в твердому середовищі культури, яке містить антибіотики, але без селективного агента таким чином, щоб усунути агробактерію, та щоб забезпечити період відновлення для інфікованих клітин. Потім, інокулюваний молодий ембріон культивували в середовищі, яке містить селективний агент (манозу) та трансформували, вибирали зростаючий калюс (Стадію 4: стадія відбору).

Переважно, молодий ембріон культивували в селективному твердому середовищі, яке містить селективний агент (4,3 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казеїну, 30 г/л сахарози, 12,5 г/л манози, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-О)) та З г/л фітагелю, рН - 5,68), отримуючи в результаті селективний ріст трансформованих клітин. Потім, калюс був регенерований в рослини (Стадія 5: стадія регенерації). Переважно, калюс культивували в твердому середовищі, яке містить селективний агент (М5 середовище диференціювання та М5 середовище укорінення) для регенерації в рослини.

Отриманий резистентний калюс переносили в зазначене М5 середовище диференціювання (4,3 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казеїну, 30 г/л сахарози, 2 мг/л б-бензиладеніну, 5 г/л манози та Зг/л фітагелю, рН - 5,8) та культивували, та диференціювали при 25760.

Диференційовані саджанці переносили в зазначене М5 середовище укорінення (2,15 г/л М5 солі, М5 вітамінів, 300 мг/л казеїну, 30 г/л сахарози, 1 мг/л індол-З-оцтової кислоти та Зг/л фітагелю, рН - 5,8) та культивували до приблизно 10 см у висоту при 25 "С. Далі, саджанці переносили та культивували в теплиці до плодоношення. В теплиці, рослини кукурудзи культивували при 28 "С протягом 16 годин та при 20 "С протягом 8 годин кожен день. 2. Верифікація трансгенної рослини кукурудзи зі вставленим геном 240111, застосовуючи спосіб ТадмМап

Як зразок брали 100 мг листя з кожної трансформованої рослини кукурудзи (рослина кукурудзи, трансформована з нуклеотидною послідовністю 240111 або контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно), відповідно. Їх геномну ДНК екстрагували, застосовуючи набір ОМеавзу Ріапі Махі (Оіадеп), та кількість копій гена РМІ кількісно визначали, застосовуючи кількісний ПЛР аналіз флюоресценції на основі зонду для того, щоб визначити кількість копій 240111. Немутантний тип рослини кукурудзи брали як контрольний та аналізували відповідно до способів, які описані вище. Експерименти проводились в трьох повторах, та результати представляли собою середні значення.

Специфічний спосіб визначення кількості копій гена РМІ був описаний, як вказано далі:

Стадія 31: брали 100 мг листя з кожної трансформованої рослини кукурудзи (рослина кукурудзи, трансформована з нуклеотидною послідовністю 240111 або контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно) та немутантного типу рослини кукурудзи та подрібнювали до гомогенату в ступці в рідкому азоті, відповідно. Виконували в трьох повторах для кожного зразка;

Стадія 32: геномні ДНК зразків, представлених вище, екстрагували, застосовуючи набір

ОМеазу Ріапі Міпі (СОіадеп), дотримуючись інструкції на даний продукт;

Стадія 33: концентрації геномної ДНК, представлених вище зразків, визначали, застосовуючи МапоОгор 2000 (Тпепто зЗсіепійіс);

Стадія 34: концентрації геномної ДНК регулювали до однакового діапазону 80 - 100 нг/мкл;

Стадія 35: кількості копій зразків кількісно визначали, застосовуючи кількісний ПЛР аналіз флюоресценції на основі зонду Тадтап, кількісно визначений зразок з відомою кількістю копій брали як стандартний зразок, та немутантний тип рослини кукурудзи брали як контрольний.

Аналіз проводився в трьох повторах для кожного зразка, та результати представляли собою середні значення. Праймери та зонди використовували в флуоресцентному кількісному ПЛР 60 аналізі, як показано нижче:

Наступні праймери та зонди використовують для детектування РМІ нуклеотидної послідовності:

Праймер 3: ОСТОТААСАОСТТАСТОАДАААААТТААСА, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 14 в переліку послідовностей;

Праймер 4: СОАТСТОСАОСсТСОАСОС, як показано в 5БО ІЮО МО: 15 в переліку послідовностей;

Зонд 2: ТСТСТТОСТААОСТООСАССТОоОСАТСС, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 16 в переліку послідовностей;

ПЛР-реакційна система:

Уитраваг"" Тад Кеадуміх м 10 мкл (5Бідта) 50х суміш праймер/зонд 1 мкл

Геномна ДНК З мкл

Вода (пдНгО) б мкл 50х суміш праймер/зонд, яка містить 45 мкл кожного праймера (1 мм), 50 мкл зонда (100

МКМ) та 860 мкл 1х ТЕ буфера та зберігали в пробірці з темного скла при 4 "с.

Умови ПЛР реакції:

Стадія Температура Час 21 957с 5 хв. 22 957с З0с 23 60 1 хв. 24 Повернутися до стадії 22, повторити 40 разів

Застосування 5052.3 програмного забезпечення (Арріїей Віозубзієт5) для того, щоб проаналізувати дані.

Експериментальні результати показали, що всі нуклеотидні послідовності нуклеотидної послідовності 240111 та контрольна нуклеотидна послідовність були інтегровані в геноми виявлених рослин кукурудзи, відповідно. Крім того, всі рослини кукурудзи з трансформованою нуклеотидною послідовністю 240111 та контрольною нуклеотидною послідовністю, відповідно, містили одну копію гена 240111.

Приклад 9: Дослідження ефекту резистентності до гербіцидів трансгенної рослини кукурудзи

Проводили дослідження ефектів резистентності до гербіцидів до 2,4-0 диметиламмонійної солі та агроксону рослин кукурудзи, які містять нуклеотидну послідовність 240111, контрольну нуклеотидну послідовність, відповідно, та немутантний тип рослин кукурудзи (стадії МЗ3 - М4), відповідно.

Брали рослини кукурудзи, які містять нуклеотидну послідовність 240111, контрольну нуклеотидну послідовність, відповідно, та немутантний тип рослини кукурудзи та обприскували 2,А-О диметиламмонійною сіллю (8960 г кис.екв./га, 16-кратна концентрація на полі), агроксоном (8960 г кис.екв./га, 16-кратна концентрація на полі) та порожнім розчинником (водою),

Зо відповідно. Розвиток стовпоподібного кореню оцінювали через 21 день після обприскування.

Вибирали три штами (56, 57 та 58) рослин кукурудзи, трансформованих з нуклеотидною послідовністю 240111, два штами (59 та 510) рослин кукурудзи, трансформованих з контрольною нуклеотидною послідовністю та 1 штам немутантного типу (СК2) кукурудзи, та досліджували 10-15 рослин з кожного штаму. Результати показані в таблиці 3.

Таблиця З

Результати дослідження ефекту резистентності до гербіцидів трансгенних рослин кукурудзи т

Нормальний Ненормальний |Відсоток нормаль-

Обробка Генотип кукурудзи | розвиток опорних | розвиток опорних | ного розвитку коренів коренів опорних коренів

ПЕВ ПО Р ЗИ ПО с ПИ ПОН КТК оТе кН

Порожній 87 77771111117111117711117177111111101111111117111лобоб96ЮШ (Вода) ЕС ПИЛИ: Р Я ПОЛО з ПОЛЯ ПОН СТЕЖТЕ ХУЙ

ХГ ля ПО УЛ ПО з ПИ ПОН КТК оТе кН уж пиши: Роми ПИ тих ПОЛЕ СЕТ оТе хе

ПЕВ ПОН: ТЗН ПОН с ПИ НИЄ КТК оТе кН 8960гкисекв/а 57...ЮИл/ 17777711 131711171711111110111717171111711111об0096ЮШ 2АЮдиметил |58 2 юБмНкК | 77/12 | 777770 | лоб аммонійноїсолі 59... Ї/7711701171717171717171771717117131111171111111бб6с1С (16х2,4-0) ХГ ля ПО сля ПО Р ЗХ НО У тов и сто ПО РИХ ПОН У

ПЕС ПИ Є ПОЛЯ ПОН ПО ПОН Сет Т хе

Ен ПЕ Я ПО ТО ПОЛОН ГЕТЕ Ж Т хе арок 0039-32323232320---172 10 1 1000055 / (16хМСРА) ЕСИИИНЯ ПИЛИ ти Ох РУЛОН ПО се 80 11711111170111111717111111171211171111111об61С ка 171777171717701111111711711111715..... 1... 106 2 щ

Результати в таблиці З вказують на те, що ген 240111 забезпечив високу резистентність до гербіцидів у трансгенних рослин кукурудзи, зокрема, до феноксіауксинових гербіцидів (оскільки однодольні рослини властиво мають певну резистентність до феноксіауксинових гербіцидів, з'являлися високі рівні резистентності); в той же час жоден з немутантного типу рослин кукурудзи та рослин кукурудзи, трансформованих з контрольними послідовностями не показував високих рівнів резистентності до гербіцидів.

Насамперед, рослини кукурудзи, сої та Агарідорзіз Паійапа, трансформовані з нуклеотидною послідовністю 240111, мали високу здатність резистентності до гербіцидів.

Переважні кодони рослини використовували в резистентному до гербіцидів гені 240111 в представленому винаході, в результаті отримуючи те, що резистентний до гербіцидів ген за представленим винаходом, як є прийнятним, експресується в рослинах. Резистентний до гербіциду протеїн 240111 за представленим винаходом має широку резистентність до спектру гербіцидів, зокрема феноксіауксинових гербіцидів.

Нарешті, слід пояснити, що всі наведені вище приклади мають на меті ілюструвати технічні рішення представленого винаходу, а не обмежувати представлений винахід. Незважаючи на те, що докладний опис даного винаходу було надано з посиланням на переважні приклади, кваліфікований фахівець в даній галузі має розуміти, що технічні рішення винаходу можуть бути модифіковані або еквівалентно замінені, але все ще попадають в суть та обсяг представленого винаходу.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 БЕЙДЖИНГ ДАБЕІНОНГ ТЕКНОЛОДЖІ ГРУП КО., ЛТД.

БЕЙДЖИНГ ДАБЕІНОНГ БІОТЕКНОЛОДЖІ КО., ЛТД. «1205 РЕЗИСТЕНТНИЙ ДО ГЕРБІЦИДУ ПРОТЕЇН, ГЕН, ЯКИЙ ЙОГО КОДУЄ, ТА ЙОГО

ЗАСТОСУВАНН

«1305 ОовМвс7З «1605 16 «1705 РасепсІп уеквіоп 3.5 «2105 1 «2115 879 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» 240111 нуклеотидна послідовність «4005 1 асдеЕСдстьЕсс аасстааасс асрссарссеЕ ЯссдеЕссддад сададдсаєс доаоадаседдвас бо сЕдасусдсс ссссЕссСоода соадсачаєдед сдсдссдеЕса асдссдстаєс даасдаасас 120 дсСЕдЕЯСсСЕсСЯ ЕСЕсСсададд сСсаасссстс ассдсасадс аасадссдда сеЕссдсдаад 180 саєЕєсєсвєддсес сасесдаває аддастсдаач ададеЕєсєєсста ааачдасстда дсдоасеЕсдад 240 чаєчаасдд Едасадасає сеЕССаардсс даєдсссаад ддаасассдс гаддсдсдас 300 адсссааада асссеЕссааа ЄЕсСЯдссаас садеЕсЧчеЕддс ассседчаєес сеЕСЕЄЕсТа є

Зо З6о ааєсссаддчд садсдсасад басдседсає сдсодєсдаєса аассдссдед дддсддааас 420 асачаасесу садассссад асасдсдбає давєассстдда асдадсддас Єааддсадаа 480 аєссаадаєс ссааадсада асасеЕссдсд Еєдсаєасаа ддастасесст дддсдаєдвас 540 чдсдеЕасасдучд асдассадаа дааадачаєс ссасстдссд ЕСсддссссЕ єдсесдасась бо сасссоддасба дсоаддадчдаа чЧаЯасЯСсЕЧЕСсСсС дЕСсСЧддЕДдЕдс асдсасдсда аассаєс9а4ад бо гддссадедуд ссддаддссад часдсассеіс ссадасєсьЕсс єддадсасдс басаадас9дад 720 чаааасдеЕсс асдсссаєда деЕддасдссе ддасдассесд Есаєєссодддаа саасаддесс 780 ассстдсаєс дсддааддсд стаєдасаєс асгсдадсдса дачаассдсд дсддасаас 840 асаааєчасра сассададдс чаєдсеєдаєсд дсддсасад 879 «2105 2 «2115 292 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» 240Тт11 амінокислотна послідовність «4005 2

Меє бБет їец біп теп Гпув Ркго Іец Нів Рго Уа1ї Рпе С1у Аза сій Аї1а 1 5 19 15

Ззек бі1у гей Авр Гецп ТПх Агуд Рго Тей бБег Авр Аїа Авр Уаі Агд Аїа 20 25 30 уаї Авп Аї1а А1їа Ме Авп сСіц Нів А1ї1а Уаї Іїец Уа1 Рбе Агду сС1у сіп 35 40 45

Рго Гец ТПтІ АТа СсСіп сбіп сіп Гец Авр Рпбе Аїа Гуз Нів Рое С1у Рго 50 зо бо теп Авр І1е с1у Ггецп Гуз Агд Уа1 Рпе пув Агуд Рго бі Агд Гей сі1ц 65 70 75 80

Авр біш Агд Гец І1е Авр І1е бБет Авп Уаі Авр Аїа сбіп с1у Авп І1е 85 90 35

Аза Ату Агуд Авр обБет Ркго Гпув Авп Гей бехт Авп Рпе Аза Авп сСіп ТГец 1600 195 110

ТЕр Нів бек Авр бек бБет РіПе Меє Авп Рго Агуд А1ї1а А1ї1а Тук бек Меє 115 120 125

Пец Ніз Сув Маї І1ї1е пув Рго бехг Тгр бі1у С1у Авзп ТІ сі Ріе Аї1а 130 135 140

Авр теп Атуд Нів Аїа Тут Авр ТПт їец Авр сі Агуд ТБт Туз АТа с1ц 145 150 155 160

І1е сб1п Авзр Гецш Ггуз Аїа Сбіц Ніз Рібе Аїа Іїєц Нів ТБІ Агд І1е Ієц 165 170 175 теп с1у Авр Авр Аїа Тухк ТПх Авр Авр сбіп Гув Гув сі І1е Рго Рго 180 185 190

А1а Уа1 Тгр Рго теп Азїа Авр ТПІ Нів Рго с1у бек С1у Агд Кув Уаї 195 200 205

Пец Рпе Уаї сі1у Уаї Нів Аза Агд Сі І1їе І1ї1е СсС1у Тгр Рго Уаї А1а 210 215 220

Сі Аза Агуд Меє Тут їец бек Авр Тїец гейш Сіц Нів Аїа ТрІ Агд Агд

Зо 225 230 235 240

Сі Авп Уаї Тук Уаї Ніз Сі Тер ТртІ Рго б1у Авр Ієц Уаї І1е Тгр 245 250 255

Авр Авп Атуд бег ТПт їец Нів Агуд С1у Агд Агд Тут Авр І1е ТПг с1ц 260 265 270

Аг Агд бі Гей Агуд Агу ТБбї ТП Іїе Авп о Авр ТПт Рго сбіц Аїа Меє 275 280 285

Тецп Меєс Аїа А1а 290 «2105 З «2115 1322 «2125 ДНК «213» Атарідорвзів єра1іапа «4005 З дЕСсСдасстдс аддссаасддд аєсаддасає ссЕЧЕеєсаа дчасдеЕсдаас ЕСТВАВАВ єдддадо бо гЕесгЧсаєсдаа сечаєчасєсяі аддассододає аадеЕсссссс сЕссаєсадсу аасесвтаєсса 120 аадаасдеЕсс єдеЧчеаєсає ссеЕсЧЕеЕаса ЄЕДдеЕсаєтаа єдаааааава єваєстсодвесса 180

Есддассдаа сасчадсдесс ааасаєддас саддссссаа асаачаєсєсса ЄєЧаватсаєд 240 аассааасаа саадаасааа єсдадссасс ааассасст ссЕсеЕеЕсстаа сддадасет дае 300

Есассаасес дасасаааад ссасєсаєсся асдсаааєса асааєсавас ааааатвассс

З6о ааєаасасса ааааваєсааа адаааєдчає ааєсссасаа гасдеЕсаєас дасааадаад сасЕссеєсс аадаааєсса сеЕчасеєссає аадсссасес дсаєтадава аасддсаааа 480 ааагасаааа аддаааадаа асааадсасу аадааєсста даааааєїсасда аагасдасеєсс 540 ааєдсадедуд дасссасуддеЕ ссаастаєсд ссаарєсеєєса дссссассає агсасссаааа бо аасаааадсда гаасдссааа аааасасааа ссдеіаасчдає сдєтаааєсс саасддассд бо ассеЕсаєдас дассдсєсада аасссчдЕддеЕЕ дсЕсдасдадес садеаасааа сддсдеЕсааа 720 чЧчЕддеЕсдсад ссоддсасаса счадссдєдЕ ссаєсаасос ааадсасааа гасЕсеЕсссь 780 саасстаааа асааддсааєсє бадссааааа саасЕєсдсуд сдсааасаас дсесаасаса 840 сЯчагдеЕсаьєєє гассассадс сассдсесса ссдссеврадс ЕсссСЕСЯєЄДда сстадеЕСЕС 900

СЕСЯЇССЕЕСС СЕССЕССЕСС сЕСТаєаааа саасрасссаа адзсеЕсссвстьЮ яьсасааєсса 960 чаєєссаасє єсссааааєс стааааасьє ссеЕССтССВяасє сссеЕСТтассу єдаєссааддвиі 1110 аааЕессстає деЕсссьтасє сЕСЕССаааає сеесчдаєтсс даеЕесеЕесЧавеЕсС даєсссаасєся 1980

ЕСУгастасдє ссЕЄСУ4дЕЄЄ адасєстдеЕс аасєствсадає сдаадасчає ЄєеЕЕСТЧдаЧдЧЕ 1140

Ечаєсдєвтад асассассєє аасссеЕсдчає садддеЕєєса гааасаєсає ссчасеЕсдєсє 1200 сааасааєесє дадчсеЕссЧєсєсооаасааєсасєс ссеЕЄСЧаьєєє дечаєєссста ЕСТадаєсьд

Зо 1260

ЧЕДЯДЕсачуесс стачеЕсСсЧсу сдаєсдаасе сєдеЕСЧЧаєсаа ЕСтСДЧадсеЕсу асеєдаєсаас 1320 ад 1322

З5 «2105 4 «2115 253 «2125 ДНК «213» Адгорассегтіцт бцштетасієпв «4005 4 чаєсдеЕссаа асасеєсддса агаааасссс ссаачаєєча асссЕдсвдс сддЕсСЕс9со бо аєчаєстаєса баєсаасєєсеЕ деЕсдааєтас деЕсаадсаєд саасааєсаа саєдчеааєсдс 120 асєчасастає єсасочачасєсч дчсадсссеЕсаєд асврададесс содасааєсаєва сасстсаасас 180 чсдасадааа асаааасаса дсдсдсааас саддасааає гассдсдсдс даєдеЕсаєссь 240 асдеЕсастач асс 253 «2105 -Б15555 «2115 530 «2125 ДНК «213» Вірус мозаїки цвітної капусти

«4005. Ющ.5 ссаєддадсс ааадаєссаа агадчаддасс сбаасадаасс содссдсааад ассддсдаас бо адеЕссавєаса дадеЕсСсстЕвса сдасеєсааєд асаадаадаа аассеЕссаєс аасаєсдає9 120 адсасдасас дсЕсдсссас сссаааааса ссааачасас адссесадаа дассаааддд 180 саасєсдчадас ЕсссСсаасаа адддсаасає ссддааассо ссісддаєєсс саєссдсссад 240 стаєстєдеЕса сЕссасєсдчєд аачасадсдд аааадчаадд ЕддсЕССТтас аааєсдссаєс 300 асєдсдаєаа аддаааддсс аєсдсєдаад асдсссстьдс сдаасадсддс сссааачаєд

З6о часссссасс сасдаддадс ассдеєддааа аадаадасдо сссаассасд СсСЕссааадс 420 аадеєдчаєсч асдсдасаєс сссаседасд сааддчаєда содсасааєсс састарссте 480 сдасаачассс ЕсСсСсСЕСТаса сааддчаадеє саєєєсаєсс ддададдаса 530 «2105 6 «2115 552 «2125 ДНК «213» Б5БЕгерсошусез уігідосПготодепев «4005 кб асдеЕСЕссояад ададдачасс адессдадчасе аддссадсса садсадсєда басддссдасд

Зо бо чЕЕЕЧ9деєЧаста єсЯдєстаасса сСвасаєєдад асдеЕссасад єдаасессвтад дасададсса 120 сааасассас аачадчсдчдаєсє сдчаєчаєсста дададдеЕсдс аадаєгадава сссегоддевд 180 чЧЕєЧЯСЕЧдаду ЄЄєЧдададеЕаде ЕЧЕЧддстддеЕ аєсдсеТеЕтасу сеЕддодссстод дааддастсачдч 240 аасдсеєсасч асссодасадс сЄдачадртасеЕ дЕеЕсасдедес сасаєгаддса єсааадачеєвд 300 часстаддає ссасассдса сасасарєсєд сеЕєаадеЕСта єддаддсдса аддасеЕесаад

З6о

ЕСсСЕЧ9ЇЕЧЧЕеЕСЧЧ сЕдсвасада ссеЕсссааас даєссаєстд Есаддеєєсдса Едаддасесв 420 чдчасасасад сссддддсрас агсдсдсдса дсеЕддаєаса адсаєддеєда аєддсаєдває 480

ЧЕЄЧЯЧЇЕЄЕСЄ ддсаааддда ЄЕЄЕеЕдадевд ссадсесстс сааддссаде гаддссадсе 540 асссачаєсе да зз5а «2105 17 «2115 195 «2125 ДНК «213» Вірус мозаїки цвітної капусти «4005 7 сЕдааассас садсссссст свгасаааєсь ассЕсссЕсс асааєааєдеі дЕЧадеадесе бо сссадчасаач ддааєсаддда СЕСЕсСасадд Я9ЕЕЕСЯСсЕСЯ ЕЯ9ДсдЕсДдадс агасаадааа сссЕсадчтає дврсасеЕсочрає сеЕЧдсааааса сеЕЕСТтаєсаа гаааасстсть аасссстааа 180 ассааагвнсс ад 195 «2105 8 «2115» 1848 «2125 ДНКА «213» Штучна послідовність «2205 «223» контрольна послідовність «4005 8 асддасааса асссааасаєс саасчаасдс ареєссаваса ассдсесдад баасссадаа бо

ЧдЕЕЧаадтас ЕсЯдЧЕЧдддада асоаасаєєсдаа ассддевбаса ссісссаєсда сарсеЕссевд 120 гЕссЕсЄЧасас адзеЕсеЕСтдсо садсчадеЕсс десдссадаєд стдддаЕссЯє ЕСЕссСддаста 180 дЕєЧдасаєса ЕСЕдддЧараєс сЕссддеЕСсССа ссСЕСЯаєддад асдсаєєсссе ддеєдсаааєсе 240 чачсадеЕсда ссаассадад чаєссдаадад Еєсдссадда ассаддссає сесстадаєтд 300 чаадчасеєда дсааєсссста ссаааєстає дсадачадсс Есадачадед ддаадссдас

З6о сстгассаасс садсеЕсссс сдаддааасд сдрєасссаасє єсаасддасає даасадсдсс

Зо 420

Еесдассасад стаєсссасє деЕсСсСдсадес садаастасс аадзуьЕссстсс чяесдєссавд 480 тасдеєссаад садстаассі ссассеЕсадс дЕдсеЕссдад асдЕвадсадс ЯяЯЕссдддсаа 540 адчаєдддчає ссдаєсдсвдс аассаєсаає адссдеЕсаса асдчдасстстас гаддсеєчасе бо ччааассаса ссдассасудс СЄДЕсССЯЄсЯд сасаасассд дссвєддадсяа ЕДдДЕСЕЄД9вЕ бо ссЕдчаєєсста дачаєсодає садасасаас садессадда дадчаасєсдас ссесасадсе 720 гЕсддасаєєсЧ єдЕсСЕСССЕЄ сссодаастає дасессадаа сстассстає ссдасасадед 780

Есссаасеса ссададаааєс стасастаас ссадеЕссьсд адаасессда сдддасадсеес 840 сдгдЧдЕЕсСвд сссааддрає сдааддсссс ассаддадсс сасасеєєдає ддасассет 900 аасадсатстаа стасстасас сдаєсдсесас адчадчачаде ассассддеЕсС єддасассад 960 ассаєсдудсесе ссссадссдуа аєссадсуддд сссдадеЕсєса ссссеЕссеЕСЄ свгаєсддаась 1110 асддадааасуд ссдсеЕссаса асаасдртаєс деЕєдсссаас гаддеЕсаддд єдЕссСтасада 1980 ассЕсдсЕсьс ссассеєсдса садаадассс сссаасаєсд дсаєсаасаа ссадсаасесе 1140 гсСсСУуєЕсСевд асддаасада деЕссСдсстає ддаассістс сеаасеЕсдсес асссдаседеє 1200 гасадааада дсоддаассдс Єдасєсссосд дасдаааєсс сассасадаа саасааєсдед 1260 ссасссаддс ааччасєєссес ссасаддеєєд адссасдрде ссаєдеЕссся ЕЕССЯддасес адсаасадеьс ссдсдадсає саєсададсеЕ ссвтасдеЕєсс саєсддаєєса єСсЯдтсадсодсе 1380 чадеЕссааса асаєсареєсс єсссЕСЕСсСаа аєсасссааа ссссаєтєдас саадесстась 1440 аассеЕсддає срддаасьсс сдЕСЧдЕЧааа ддассаддес ссасаддачча Єчасаєрєссьс 1500 ачаачаасьс сіссЕддсса дассадсасс сісададеса асаєсасвєдс ассасеЕсессь 1550 сааачасаєс дсдссадчаєс ссассасодса ссврассаста ассвєдсаарс ссасасстісс 1620 ассдасддаа ддсстаєссаа сСсадддраас ЄссСЕССсСдсаа ссаєдссаад сддсадсаас 1680

Егдсааєссду дсадсеєсад аассдусддс єЕєсастасес сЕсссаасьє сЕСтаасоада 1740

Есаадсдєсс єсассстсад сдсісардеєд Єссаасессд дсааєдааді деасаєєсдвас 1800 сабасєчадесЕ єсЧдсєдсстдс сдаадеЕвтасс єЕссдаддсества адсаседа 1848 «2105 13 «2115 1992 «2125 ДНК «213» Кукурудза звичайна «4005 1.15 сеЕдсадсдса дсодсдасссу чдЕСЯсдсссс ссЕСТадада гааєдадсає єдсаєдесста

Зо бо адеЕнаєсаааа аассассаса сасссеЕсссЕ дссасасесд Ессдаадедсадесвтаєства 120

ЄсСЕЄсасаса гасаєссааа сеЕсстасесста сдаасаатвтає аасстасадес ассасаасаа 180 гаєсадеЕдує ссададааєс асаєсаааєда асадеЕсадас аєддсєсстааа ддасааєтсда 240 чеаЕєєсеєсдас аасаддассс басадеЕсса ссЕЕссвадес дсдсасдеЕдесвЙвссссЕсеве 300

ЕЕ дсааає адссесасстя агасаарсасе ссаєссарєє гасвтадсаса єссаєтсад

З6о дЕЕРадудадеЕє аавчддеЕсссс ж агадасетаваає ссеЕЕссадса саєстаєтвєс аєєсстаєсєсе 420 адссессааа Есаадаааас Саааасеста ссеєрадчеЕссу нтссаєссаає аассвадаєва 480

Гааавсадаа саааагсааад Єдассааааа Єбааасааає асссєсаад аааєссааааа 540 аастааддаа асасеЕсеЕсстЮ счЯєсссодваде ачаєааєдсс адссеЕдсвсаа асодссаєссда бо счадеЕссаас ддасассаас садсдаасса дсадсдісдс діЕсдддссаа дсдаадсада бо саддсасддса ЕСЕСсСЕдДЕСсСУдсС Сдссстода ссссісеЕСЧдча дадеЕЕссдЯдся ссассЯяаєсс9 720 асЕвєдсссся срдссоддсає ссачааассд сдеЕддсддад соддсадасдс дадссддсас 780 чдасаддсддсе сЕсстссЕсс ссссасудддса сддсадстас дддодадаєєссс есссассд 840

СсСЕСсСсСЕСсСуусСЕ ЕсСсСсСсСЕссс сдсссдссудЕє ааєаааєсада сасссссесс асассстстуе 900

Ессссаассе счабдЕсЧдссс ддадсдсаса сасасасаас садаєссссс ссаааєссас ссдЕСддсас сіссдсесса аддсасдссд сісдсссЕсс сссссссссс сесесстассь 1110 гЕСЕСТадаєс ддсдЕсссояддд єССсСаєддадеєЕва дддсссоддва деЕсСТасеєс тоарєсаєдчее 1980 гЕЧЕЧДЕсадаєс ссЯсуусеЕсдє ЧчеЕсачаєсся сдсЕдсвадс деЕссдсасас ддадасдсдасс 1140

Едеасдсєсад асасдссстд арсдстеаасе бдссадеЕдесс єсссЕЄсЯда даассстд49ад 1200 асддсестад ссдсеЕССсСоЯдса дасочоддЧаєсд асєєссаєдас сссеЕЕссдє єСЯДєсвєдсаєва 1260

ЧаЧЕССООДЕС Ед9дДСсССсССсСЕССЕссС сЕЄсТтаєсса асаваєсдссд гдсасеЕсдеЕс єдссдадчаєса 1320

ЄСсСеЕсесеСсСаусьд СЕУ ЕСЕЕЧДУЧЄтЧІ даєсчаєдьда ЕСЕЧУЧЕСУЧОЧдЯЯ сдссдесе 1380 ачаєсдададеі адааєсстдеЕ сЕСааасстас стЕддсддасєс басеаасЕс ддаєстдавсає 1440

ЧдЕДдЕДЕдсса гасавтаєсса садссасдаа сСсдаачаєда гєддаєддааа бассдаєста 1500 чдчавадчеає асасдеєєдчаєс дссодадЧчЕЄСсСа седаєсдсаса гасадачаьд сЕссеедеес 1550 чсСЕБЧЯЯЧЄвЧЕеЕ даєчасчєдоа СоОгоЧЕЯ9О9д9 СОЯДдЕСЧЯЕЄСЯ ЕСсССДЯДЕЄСТвад аєсдододадсад 1620 аастсасЕдеЕєє сааастасст дасдсаєєса єсаасєссоу аастдвтаєсде дедеЕдессата 1680 саєсєєссасра дессасччадес саачаєддає ддааасаєсд ассвтаддавта дасаєасаєд 1740

ЕеЕЧасчеддаач ЕсЕсасесдає дсасавєасає даєддасатвтає дсадсаєста єЕСсСавсаєсдсе

Зо 1800 сгаасссвєда дсасстасєст аєсаєсаасаа асаадсаьєдес єссаєаваєта ЄеЕседасстяе 1860 чаєасасеЕсд даєчаєсддса сбасдсадсад сстасгаєдчедд ассЕссвтад сссдссеес 1920 асасдстаєє гасєсусесу дстасЕдсесес єЕсЕЧдєСЯає дсесассстуа єсочоєсоЧед 1980 сасЕсстос ад 1992 «2105 10 «2115 1176 «2125 ДНКА «213» ЕвсПпегіспіа соїї «4005 10 асбдсаааавас єсастаассс адсдсаааас саєдссвдадд дсадсаааас ддасдЕєдась бо чаасеєссаєдд дсасоддаааа сссасссадс садссчаєдда ссдадссдед даєсдддадсдса 120 саєссдаааа дсадессас адсдсадаає дссдссддад асасєсдеЕвєсасеЕдсдєдває 180

ЧЕЧасєдчада дсдаваааєс дасістдссс ддададдссдя Есдссааася сЕссддсдаа 240 сЕдССЕЄсСсСсС гдЕєСсСааадет астаєдсдса дсасадссас ссессаєсса ддеЕєссаєсса 300 аасааасаса асссседааає сддЕсеЕсдсс ааадаааасд ссдсаддсає сссчаєсддваєс

З6о дссдссдадс дсаасстасаа адассстаас сасаадссуд аа шеЕдаєеЕс всдсдседасд сСсСЕЕссСсСЕеЕсЧд сччаєсдаасудс ЧЕСЕСЧЯєЄЧдаа ЄСЕЕССЯдада ЕсЯдЕСЕССсССсСІ ассссадссод 480 дЕСЯдсадудєд сасаєсссддс дастдсесас єЕсесвасаас адсстдаєсдс сддаасаєєта 540 адсдаасеЕдеЕ ЕСсдссадсс дЕєсЄЧаатраєд садддєдаад аааааєсссд сдсдсеЕд9асд бо арвєеєсаааає сддсссісда сбадссадсад ддеЕдаассЯдє ддасааасчає єсаєсевеєаасяе бо

ЕсЕЧЄаасьЕсс асссддаада садсуддессд ЄсСсЕСССсССсСЯдсС тасвєдссдаа єДдсддЕдЧааа 720

Еесдаассстд дсддаадсчас ч«ЕсссЕдсЕсС дсЕДааасас сддсасдсета ссудсааддс 780

ЧЕЧЯдСсСЯсСтдаЯЇ аадеєчдчаєддс ааасессдає аасдуєдстдс дЕдсдддЕсЕ дасодсстааа 840 гасасєсєдчдасра еЕсссодаасі ддеЕсдссаає дсдаааєссд аадссааасс ддастсаассад 900 гЕЕдеЕсЧдассс адссддаєдаа асааддедса даасрддасс ЕССссдасєсс ачвсоваєвчас 960 геЕгдссСЕЕсСеЕ сооссдсаєда ссесадрсдає ааадааасса ссаєтадсса дсададсдсс 1110 дссасєссвдеЕЕ ЕСЕЧдсЧдєЄСсСЯа аддсчдаєдса асдЕсдеЕдда ааддеЕссьса дсадеЕєасад 1980 сЕсааассдд деЕдааєссадс деЕстаєсдес дссаасддаає сассддедас гдЕСааадддс 1140 сасддссдсс гадсдсаєдЕ Євасаасаад сеЕдтаа 1176

Зо «2105 11 «2115 22 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність

З5 «2205 «223» праймер 1 «4005 11 чадчасаєссЯя сдоссддавтає с 22 «2105 12 «2115 23 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» праймер 2 «4005 12 гЕсСЕСЯаствдеЕ ссааєсдєаа Чсд 23 «2105 13 «2115 25 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність

Зо

«223» зонд 1 «4005 13 сЕсасдстдд дссстддаад дстад 25 «2105 14 «2115 29 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» праймер 3 «4005 14 дсЕДЧдсаадад сесаседааа ааассааса 29 «2105 15 «2115 18 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» праймер 4 «4005 15 счаєсєдсад деЕсдчас9ад

Зо 18 «2105 16 «2115 27 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «2235» зонд 2 «4005 16

ЄсСЕСЕсЧдста адссддададс ссдассс

Claims (15)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування резистентного до гербіциду протеїну як такого, що надає рослинам стійкість до феноксіауксинових гербіцидів, де зазначений резистентний до гербіциду протеїн включає протеїн, який складається з амінокислотної послідовності, показаної в 5ХЕО ІЮ МО: 2.

2. Застосування за пунктом 1, де зазначене застосування використовують для розповсюдження цільового діапазону гербіцидів, відбору трансформованих рослинних клітин, боротьби з бур'янами, захисту рослини від пошкодження, яке завдається феноксіауксиновими гербіцидами, або забезпечення рослин стійкістю до феноксіауксинових гербіцидів.

З. Застосування за пунктом 2, де зазначене застосування для розповсюдження цільового діапазону гербіцидів включає спільне експресування зазначеного резистентного до гербіциду протеїну в рослині з щонайменше другою нуклеотидною послідовністю, яка кодує протеїн, який відрізняється від зазначеного резистентного до гербіциду протеїну.

4. Застосування за пунктом 3, де зазначена друга нуклеотидна послідовність кодує резистентний до гліфосату протеїн, резистентний до глюфосинату амонію протеїн, діоксигеназу

4-гідроксифенілпіровиноградної кислоти, ацетолактатсинтазу, протеїнцитохрому або протопорфіриногеноксидазу.

5. Застосування за пунктом 2, де зазначене застосування відбору трансформованих рослинних клітин включає стадії трансформування декількох рослинних клітин з нуклеотидною послідовністю, яка кодує зазначений резистентний до гербіциду протеїн, та культивування зазначених клітин при концентрації феноксіауксинового гербіциду, яка дозволяє ріст трансформованих клітин, які експресують зазначену нуклеотидну послідовність, яка кодує зазначений резистентний до гербіциду протеїн, при цьому знищує нетрансформовані клітини або інгібує ріст нетрансформованих клітин.

6. Застосування за пунктом 5, де зазначену рослину вибирають з групи, яка складається з сої, бавовнику, кукурудзи, рису, пшениці, буряку або цукрової тростини.

7. Застосування за пунктом 2, де зазначене застосування для боротьби з бур'янами включає стадію застосування ефективної кількості одного або декількох гербіцидів на полі, на яке висаджені рослини, які містять нуклеотидну послідовність, яка кодує зазначений резистентний до гербіциду протеїн.

8. Застосування за пунктом 7, де зазначену рослину вибирають з групи, яка складається з сої, бавовнику, кукурудзи, рису, пшениці, буряку та цукрової тростини.

9. Застосування за пунктом 7, де зазначені рослини також є толерантними до гліфосатного гербіциду.

10. Застосування за пунктом 9, де зазначені гербіциди щонайменше включають феноксіауксин та гліфосат.

11. Застосування за пунктом 2, де зазначене застосування для захисту рослини від пошкодження, яке завдається гербіцидами, включає стадію введення нуклеотидної послідовності, яка кодує зазначений резистентний до гербіциду протеїн, в рослини, для того, щоб зробити отримані в результаті рослини такими, що продукують зазначений резистентний до гербіциду протеїн, достатній для їх захисту від пошкодження, яке завдається феноксіауксиновими гербіцидами.

12. Застосування за пунктом 11, де зазначену рослину вибирають з групи, яка складається з сої, бавовнику, кукурудзи, рису, пшениці, буряку або цукрової тростини. Зо

13. Застосування за пунктом 2, де зазначене застосування для забезпечення рослин стійкістю до гербіцидів включає стадію введення нуклеотидної послідовності, яка кодує зазначений резистентний до гербіциду протеїн, в рослини.

14. Застосування за пунктом 13, де зазначену рослину вибирають з групи, яка складається з сої, бавовнику, кукурудзи, рису, пшениці, буряку або цукрової тростини.

15. Застосування за пунктом 1, де зазначені феноксіауксинові гербіциди включають 2,4-О або МСРА.

Бас «М. СЗЗ РЕ З ую -ї й шо 5 р ласо гі є їх ук х в дк, Х Й Б - У , ВСЕМ Ши ІЗ е цу К Ії щі й ве ш кА, Я с кутя с в ЗИ Бе хх с Б З - Се КУ Он он ооо ооо кв оо ов, Ат ра Пан й ке я ча - ча я м й І щи й Сай Ше т я й ні З Ж Тай КТ. МОЯ

Ж. «т одн шиї вичент ед й ще Ши і ЗЕ т ую В Ж У. Кіа ве. Кан. Фігура З десни под Ж, я

М в. схо ве вві 5: МН в що шу їй Е ШИ Й ї й й : УШ ї і За: С З В Б це вано: і В Важ ї х й «Ба "й о й св є шо ер, Ей я ж З шк я НО СЕС КК ВУСА ян я ее. Хв. МНВК. вк : КАК КЕ - й и -о й М Вер каві ще бе Ж

В. ше а мк ще тк Шк РМЗ щ тк ХХ КО і ї. й -

З . ВВхНН ОЗ, ; шк Ох ИН ОК я х ще ко пе Я ВХ важ СЕМ Уест ВЕС ЕК тку як Фігура й

: КЕ. « п: НН СОЯ ЖЕ - ово ве Ко ІЛ Я ах ї в. г чі і.

і. о З й т У и ОСТ ех пок 0. ; й З їх ЕЕ ще - ж Ва че ув ьо Ко ЕК ПДК тик Же ев нь ШІ КАТ Чигура З Я о о г с с КОН пошко ПО а. ЕВ щи с с у ПИЙ ПИЛИ ИН ПТИНИКИ НИКИ ПИ И ТИКИ Я нн ПЕ о ! ОО я М ши І В М о ПН ВИ зе щПп'ооиос їхав їхщев іх» МСРА ййаннія завти планета пав зом ко ШИПИ. ПЖЦИИТ й ПИИИИНИИОВ ооо о Кох с с п о і 0 о в Б с п с о ПЕ ВЕ ВЕ ПЕсОООВ ОН с . с

5. 1 с. нн он нини я по ОО дна ин ше Пози Мала ЗЦУНИ Мамутантнини тив Фгура 4