UA118470C2 - Hppd variants and methods of use - Google Patents
Hppd variants and methods of use Download PDFInfo
- Publication number
- UA118470C2 UA118470C2 UAA201610140A UAA201610140A UA118470C2 UA 118470 C2 UA118470 C2 UA 118470C2 UA A201610140 A UAA201610140 A UA A201610140A UA A201610140 A UAA201610140 A UA A201610140A UA 118470 C2 UA118470 C2 UA 118470C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- amino acid
- gfpd
- position corresponding
- methyl
- plant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 225
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 51
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 352
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 280
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 242
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 181
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 180
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 172
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 152
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 105
- -1 M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides Chemical class 0.000 claims description 79
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 71
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 70
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 68
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 66
- 239000005620 Tembotrione Substances 0.000 claims description 65
- IUQAXCIUEPFPSF-UHFFFAOYSA-N tembotrione Chemical compound ClC1=C(COCC(F)(F)F)C(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O IUQAXCIUEPFPSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 64
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 59
- KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N mesotrione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 239000005578 Mesotrione Substances 0.000 claims description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 39
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 36
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 36
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 35
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 35
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 35
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 29
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 29
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 29
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 29
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 29
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 29
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 29
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 28
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 28
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 26
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 26
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 23
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 23
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 23
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 22
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 22
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 21
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 21
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 21
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 17
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 17
- XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydropyrazole-2-carboxylic acid Chemical class OC(=O)N1CC=CN1 XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- AAILEWXSEQLMNI-UHFFFAOYSA-N 1h-pyridazin-6-one Chemical class OC1=CC=CN=N1 AAILEWXSEQLMNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 15
- 239000005618 Sulcotrione Substances 0.000 claims description 15
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 15
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 15
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 15
- 150000002244 furazanes Chemical class 0.000 claims description 15
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N sulcotrione Chemical compound ClC1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 14
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 14
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 14
- 150000002545 isoxazoles Chemical class 0.000 claims description 14
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 14
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 13
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 13
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 13
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 12
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 11
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 11
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 8
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 7
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 claims description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 6
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 6
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 6
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 6
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 5
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims description 5
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 4
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 2
- 102100028626 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 2
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 claims description 2
- 235000013528 soy cheese Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940071440 soy protein isolate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000013548 tempeh Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008256 whipped cream Substances 0.000 claims description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 18
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims 12
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 12
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims 10
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims 10
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims 8
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 2
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QBAYIBZITZBSFO-UHFFFAOYSA-N 2-(trifluoromethyl)benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1C(F)(F)F QBAYIBZITZBSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WEJHBEDHLLBJFW-UHFFFAOYSA-N 4-(trifluoromethyl)benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 WEJHBEDHLLBJFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101100495769 Caenorhabditis elegans che-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 146
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 64
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 64
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 57
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 21
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 101100339555 Zymoseptoria tritici HPPD gene Proteins 0.000 abstract 6
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 111
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 60
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 60
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 54
- ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-mesyl-4-trifluoromethylphenyl)propan-1,3-dione Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C(C#N)C(=O)C1CC1 ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 44
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 43
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 37
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 35
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 12
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 11
- 229940054066 benzamide antipsychotics Drugs 0.000 description 11
- 150000003936 benzamides Chemical class 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 10
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 8
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 8
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 8
- IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N homogentisic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC(O)=CC=C1O IGMNYECMUMZDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 8
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 7
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 7
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 6
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 6
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013037 reversible inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 3
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 3
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 3
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 235000008098 Oxalis acetosella Nutrition 0.000 description 3
- 240000007930 Oxalis acetosella Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000770 propane-1,2-diol alginate Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 3
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- AIAYSXFWIUNXRC-PHIMTYICSA-N (1r,5s)-3-[hydroxy-[2-(2-methoxyethoxymethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]methylidene]bicyclo[3.2.1]octane-2,4-dione Chemical compound COCCOCC1=NC(C(F)(F)F)=CC=C1C(O)=C1C(=O)[C@@H](C2)CC[C@@H]2C1=O AIAYSXFWIUNXRC-PHIMTYICSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MRVSUCYTMYJDQO-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-ethoxy-4-methylsulfonyl-n-(1-methyltetrazol-5-yl)benzamide Chemical compound C1=C(S(C)(=O)=O)C(OCC)=C(Cl)C(C(=O)NC=2N(N=NN=2)C)=C1 MRVSUCYTMYJDQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DDSDJJJQHOSXTM-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-methylsulfonyl-4-(trifluoromethyl)benzamide Chemical compound O1C(C)=NN=C1NC(=O)C1=CC=C(C(F)(F)F)C(S(C)(=O)=O)=C1C DDSDJJJQHOSXTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 2
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 2
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 2
- 235000009847 Cucumis melo var cantalupensis Nutrition 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001137858 Euryarchaeota Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N Plastoquinone 9 Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000000828 canola oil Substances 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000006216 methylsulfinyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)=O 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N plastoquinone-9 Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC1=CC(=O)C(C)=C(C)C1=O FKUYMLZIRPABFK-IQSNHBBHSA-N 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004299 tetrazol-5-yl group Chemical group [H]N1N=NC(*)=N1 0.000 description 2
- 238000003971 tillage Methods 0.000 description 2
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 2
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- JSMYHXFFKXKZRN-SBMIAAHKSA-N (2s,3s,4s)-3-(carboxymethyl)-4-(2-hydroxyphenyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)NC[C@@H]1C1=CC=CC=C1O JSMYHXFFKXKZRN-SBMIAAHKSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041188 2,4-dichlorophenoxyacetic acid monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- MRDBXGPLLJOSDV-UHFFFAOYSA-N 2-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamide Chemical class NC(=O)C1=CC=CC=C1C1=NON=C1 MRDBXGPLLJOSDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODYCXBCWQRQIAH-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-methylsulfonyl-n-(1-methyltetrazol-5-yl)benzamide Chemical compound C1=C(S(C)(=O)=O)C(COC)=C(Cl)C(C(=O)NC=2N(N=NN=2)C)=C1 ODYCXBCWQRQIAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFAPVJDEYHLLBG-UHFFFAOYSA-N 2-{2-chloro-4-(methylsulfonyl)-3-[(tetrahydrofuran-2-ylmethoxy)methyl]benzoyl}cyclohexane-1,3-dione Chemical compound ClC1=C(COCC2OCCC2)C(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O UFAPVJDEYHLLBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GACSIVHAIFQKTC-UPHRSURJSA-N 4-maleylacetoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)CC(=O)\C=C/C(O)=O GACSIVHAIFQKTC-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 244000226021 Anacardium occidentale Species 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000842542 Apoda Species 0.000 description 1
- 241000408923 Appia Species 0.000 description 1
- 101100237157 Bacillus cereus merB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000701459 Caulimovirus Species 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 240000004270 Colocasia esculenta var. antiquorum Species 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 235000002723 Dioscorea alata Nutrition 0.000 description 1
- 235000007056 Dioscorea composita Nutrition 0.000 description 1
- 235000009723 Dioscorea convolvulacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000005362 Dioscorea floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 235000004868 Dioscorea macrostachya Nutrition 0.000 description 1
- 235000005361 Dioscorea nummularia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005360 Dioscorea spiculiflora Nutrition 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102100031788 E3 ubiquitin-protein ligase MYLIP Human genes 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 240000002395 Euphorbia pulcherrima Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108030006517 Glyphosate oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101150005022 HST gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005206 Hibiscus Nutrition 0.000 description 1
- 235000007185 Hibiscus lunariifolius Nutrition 0.000 description 1
- 244000284380 Hibiscus rosa sinensis Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 244000267823 Hydrangea macrophylla Species 0.000 description 1
- 235000014486 Hydrangea macrophylla Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000006350 Ipomoea batatas var. batatas Nutrition 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000208467 Macadamia Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001647769 Mirza Species 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 244000230712 Narcissus tazetta Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000035028 Nucleic proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 241000587479 Opisa Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 101100187051 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NHP10 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000405119 Virga Species 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000895 acaricidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000642 acaricide Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- UGJQDKYTAYNNBH-UHFFFAOYSA-N amino cyclopropanecarboxylate Chemical compound NOC(=O)C1CC1 UGJQDKYTAYNNBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124323 amoebicide Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 239000001058 brown pigment Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 235000020226 cashew nut Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007931 coated granule Substances 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012035 limiting reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 101150109460 merB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- CKJNUZNMWOVDFN-UHFFFAOYSA-N methanone Chemical compound O=[CH-] CKJNUZNMWOVDFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 108091086836 miR1034 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940124561 microbicide Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101150061721 mmm1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003750 molluscacide Substances 0.000 description 1
- 230000002013 molluscicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QPFYXYFORQJZEC-UHFFFAOYSA-N phenazopyridine Chemical compound NC1=NC(N)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 QPFYXYFORQJZEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000003711 photoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- DWSPRBSLSXQIEJ-UHFFFAOYSA-N pyrasulfotole Chemical compound CC1=NN(C)C(O)=C1C(=O)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1S(C)(=O)=O DWSPRBSLSXQIEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002804 saturated mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004550 soluble concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003518 stress fiber Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000004546 suspension concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012747 synergistic agent Substances 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 125000002640 tocopherol group Chemical class 0.000 description 1
- 235000019149 tocopherols Nutrition 0.000 description 1
- IYMLUHWAJFXAQP-UHFFFAOYSA-N topramezone Chemical compound CC1=C(C(=O)C2=C(N(C)N=C2)O)C=CC(S(C)(=O)=O)=C1C1=NOCC1 IYMLUHWAJFXAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000004562 water dispersible granule Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
Галузь технікиThe field of technology
Винахід стосується галузі молекулярної біології рослин, особливо, нових поліпептидів ГФПД, що надають підвищену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД.The invention relates to the field of plant molecular biology, in particular, to new GFPD polypeptides that provide increased resistance to GFPD inhibitor herbicides.
Рівень техніки 4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази (ГФІПД) - це ферменти, які каталізують реакцію перетворення пара-гідроксифенілпірувату (тут і далі скорочено ГФП), продукту деградації тирозину, у гомогентизат (тут і далі скорочено ГГ), попередник токоферолу й пластохінону в рослин (Стоисі М.Р. і ін. (1997), Теїігапеагоп, 53, 20, 6993-7010, Еге і ін. (2004), Ріапі Рпузіоїоду 134:1388-1400). Токоферол відіграє роль мембранно-асоційованого антиоксиданту.State of the art 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HFIPD) is an enzyme that catalyzes the reaction of converting para-hydroxyphenylpyruvate (henceforth abbreviated as HFP), a product of tyrosine degradation, into homogenizate (henceforth abbreviated as GH), a precursor of tocopherol and plastoquinone in plants (Stoisi M .R. et al. (1997), Neuroscience, 53, 20, 6993-7010, Ege et al. (2004), Research Journal 134:1388-1400). Tocopherol plays the role of a membrane-associated antioxidant.
Пластохінон, по-перше, діє як переносник електронів між РБЗІЇ і комплексом цитохром Бб/, їі по- друге, є редоксо-кофактором фітоєндесатурази, що бере участь у біосинтезі каротиноїдів.Plastoquinone, firstly, acts as an electron carrier between RBZII and the cytochrome Bb/ complex, and secondly, it is a redox cofactor of phytoene desaturase, which participates in the biosynthesis of carotenoids.
На сьогоднішній день більше 1000 послідовностей нуклеїнових кислот у базі даних МСВІ анотовані як такі, що кодують передбачуваний білок з доменом ГФПД. Але для більшості цих білків не доведено ні того, що вони мають ферментативну активність ГФПД при аналізі іп міго або при підході іп ріапіа, ні того, що подібні білюи ГФПД можуть надати стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД при експресуванні їх у рослині. Деякі білки ГФПД і їх первинні послідовності були описані раніше в даній галузі техніки, зокрема білки ГФПД бактерій, таких як Рхеендотопах (Киеївспі і ін., Еиг. У. Віоспет., 205, 459-466, 1992, МО096/38567), Когаіа (МО2011/076889) зЗупеспососсив5 (М/О2011/076877) і Кподососсив (ММО2011/076892), протист, таких як Віерпагізта (МО2011/076882), евріархеотів, таких як Рісгорпйи5 (УМО02011/076885), рослин, таких якTo date, more than 1,000 nucleic acid sequences in the MSVI database have been annotated as encoding a putative protein with a HFPD domain. However, most of these proteins have not been shown to have GFAP enzymatic activity in an in vitro or in vitro assay, nor that similar GFAP proteins can confer resistance to GFAP inhibitor herbicides when expressed in a plant. Some HFPD proteins and their primary sequences have been described previously in the art, in particular HFPD proteins of bacteria such as Rheendotopah (Kieivspi et al., Eig. U. Viospet., 205, 459-466, 1992, MO096/38567), Kogaia (МО2011/076889) with Zupesposossiv5 (М/О2011/076877) and Kpodosossiv (ММО2011/076892), protists such as Vierpagista (МО2011/076882), euryarchaeotes such as Rishorpyi5 (УМО02011/076885), plants such as
Агарідорзіз (М/О96/38567, СЕМВАМКФ АРО47834), морква (МО 96/38567, СЕМВАМКФ 87257),Agaridorziz (M/O96/38567, SEMVAMKF ARO47834), carrots (MO 96/38567, SEMVAMKF 87257),
Ауепа займа (УО2002/046387, УМО2011/068567), пшениця (УМО2002/046387), Вгаспіагіа ріатурпуїйа /(М/02002/046387), Сепсиги5 еспіпайв (М/О2002/046387), І оїйшт гідідит (М О2002/046387), ЕРевіиса агипаіпасєа (М/О2002/046387), бЗеїапа їабей (МО 2002/046387),Auepa zaina (UO2002/046387, UMO2011/068567), wheat (UMO2002/046387), Vgaspiagia riaturpuiia /(M/02002/046387), Sepsigy5 espipaiv (M/O2002/046387), I oijsht hydidit (M O2002/046387), EReviisa agipaipasea (M/O2002/046387), bZeiapa iabei (MO 2002/046387),
ЕІеивзіпе іпаійса (М/02002/046387), сорго (М/О02002/046387, УО2012/021785), кукурудза (М/О2012/021785), Соссісоїдез (ЗЕМВАМКФ СОЇТКР), Соріїв |аропіса (МО2006/132279),Eieivzipe ipaiisa (M/02002/046387), sorghum (M/O02002/046387, UO2012/021785), corn (M/O2012/021785), Sossisoides (ZEMVAMKF SOITKR), Soriiv |aropisa (MO2006/132279),
Спатудотопазх геіппагайії (Е5 2275365; ММО2011/145015), або ссавців, таких як миша або свиня.Spathudotopazh heippagaiia (E5 2275365; IMO2011/145015), or mammals such as mouse or pig.
Інгіібування ГФІПД приводить до роз'єднання фотосинтезу, недостатності допоміжних світлозбиральних пігментів і, що найважливіше, деструкції хлорофілу Уф-випромінюванням іInhibition of GFIPD leads to the uncoupling of photosynthesis, the insufficiency of auxiliary light-harvesting pigments and, most importantly, the destruction of chlorophyll by UV radiation and
Зо активними формами кисню (знебарвлення) через недостатність фотозахисту, у нормі забезпечуваного каротиноїдами (Моггі5 і ін. (1995), Ріапі СеїЇ 7: 2139-2149). Знебарвлення фотосинтетично активних тканин приводить до інгібування росту й загибелі рослини.With active forms of oxygen (discoloration) due to the insufficiency of photoprotection, normally provided by carotenoids (Moggi5 et al. (1995), Riapi Seiyi 7: 2139-2149). Discoloration of photosynthetically active tissues leads to growth inhibition and plant death.
Деякі молекули-інгібітори ГФПД, які інгібують перетворення ГФП у гомогентизат і які зв'язуються специфічно з ферментом, довели свою ефективність як гербіциди.Some HFPD inhibitor molecules, which inhibit the conversion of HFP into homogenate and which bind specifically to the enzyme, have proven to be effective as herbicides.
У цей час більшість комерційно доступних ГФПД-інгібіторів належать до одного з наступних хімічних сімейств: 1) трикетони, напр., сулькотріон (тобто 2-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)бензоїл|-1,3- циклогександіоні, мезотріон (тобто 2-(4-(метилсульфоніл)-2-нітробензоїл|-1,3-циклогександіоні|; темботріон Ігобто 2-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)-3-((2,2,2,-трифторетокси)метилі| бензоїл|-1,3- циклогександіоні; тефурилтріон Їгобто 2-(2-хлор-4--«метилсульфоніл)-3-| (тетрагідро-2- фураніл)метокси|метилібензоїл|-1,3-циклогександіоні|; біциклопірон Ігобто 4-гідрокси-3-(2-(2- метоксіетокси)метил|-6-(трифторметил)-3-піридинілІкарбоніл|біцикло|3.2. Покт-3-ен-2-оні; бензобіциклон (гобто 3-(2-хлор-4-мезилбензоїл)-2-фенілтіобіцикло|3.2. Цокт-2-ен-4-оні; 2) дикетонітрили, напр. 2-ціано-3-циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл-4-трифторметилфеніл)- пропан-1,3-діон і 2-ціано-1-(4--(«метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3-(1- метилциклопропіл)пропан-1,3-діон; 3) ізоксазоли, напр. ізоксафлютол |гобто (5-циклопропіл-4-ізоксазоліл)(2-(метилсульфоніл)- 4-(трифторметил)феніл|Іметаноні. У рослинах ізоксафлютол швидко перетворюється в ДКН, дикетонітрильну сполуку, що виявляє властивості ГФПД-інгібітора; 4) піразолінати, напр., топрамезон тобто І3-(4,5-дигідро-3-ізоксазоліл)-2-метил-4- (метилсульфоніл) фенілі)(5-гідрокси-1-метил-1 Н-піразол-4-іл)метаноні і пірасульфотол |гобто (5- гідрокси-1,3-диметилпіразол-4-іл(2-мезил-4-трифторметилфеніл)метаноні; піразофен |гобто 2-Currently, most commercially available HFPD inhibitors belong to one of the following chemical families: 1) triketones, e.g., sulcotrione (ie, 2-(2-chloro-4-(methylsulfonyl)benzoyl|-1,3- cyclohexanedione, mesotrione ( i.e. 2-(4-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzoyl|-1,3-cyclohexanedione|; tembotrione Igobto 2-(2-chloro-4-(methylsulfonyl)-3-((2,2,2,-trifluoroethoxy) methyl|benzoyl|-1,3-cyclohexanedione; tefuryltrione; 2-(2-chloro-4--"methylsulfonyl)-3-|(tetrahydro-2-furanyl)methoxy|methylbenzoyl|-1,3-cyclohexanedione|; bicyclopyrone Igobto 4-hydroxy-3-(2-(2- methoxyethoxy)methyl|-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinylcarbonyl|bicyclo|3.2.Poct-3-en-2-one; benzobicyclone (gobto 3-(2- chloro-4-mesylbenzoyl)-2-phenylthiobicyclo|3.2.zoct-2-en-4-ones; 2) diketonitrile, e.g. 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-methylsulfonyl-4-trifluoromethylphenyl)-propane -1,3-dione and 2-cyano-1-(4--("methylsulfonyl)-2-trifluoromethylphenyl|-3-(1-methylcyclopropyl)propane-1,3-dione; 3) isoxazoles, eg isoxaflutol | hobto (5-cyclopropyl-4-isoxa zolyl)(2-(methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)phenyl|Imethanones. In plants, isoxaflutol is quickly transformed into DKN, a diketonitrile compound that exhibits the properties of a HFPD inhibitor; 4) pyrazolinates, e.g., topramesone i.e. I3-(4,5-dihydro-3-isoxazolyl)-2-methyl-4-(methylsulfonyl)phenyl)(5-hydroxy-1-methyl-1H-pyrazole-4- yl)methanone and pyrasulfotol |hobto (5-hydroxy-1,3-dimethylpyrazol-4-yl(2-mesyl-4-trifluoromethylphenyl)methanone; pyrazofen |hobto 2-
І4-(2,4-дихлорбензоїл)-1,3-диметилпіразол-5-ілоксиїацетофеноні; 5) М (1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди (М/О2011/035874) ії М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)убензаміди (МО2012/126932), напр., 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 17"); б) М-(тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксаміди (М/О2012/028579), напр., 2-хлор-14-(2,4-dichlorobenzoyl)-1,3-dimethylpyrazol-5-yloxyacetophenone; 5) M (1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides (М/О2011/035874) and M-(1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamides (МО2012/126932), e.g. 2-methyl-N-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (hereinafter also referred to as "Col. 17"); b) M-(tetrazol-5-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides (M/O2012/028579), e.g., 2-chloro-
З-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 273; 4-(дифторметил)-2-метокси-3-с«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- бо тетразол-5-іл)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 3"); 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (hereinafter also called "Spol. 273; 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3 -c"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-bo tetrazol-5-yl)benzamide (hereinafter also called "Col. 3"); 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-( 1-
метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 4"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 5"); 7) Похідні піридазинону, як описано в УМО2013/050421 і М/О2013/083774; 8) Заміщені 1,2,5-оксадіазоли, як описано в УМО2013/072300 і ММО2013/072402; і 9) Похідні оксопразину, як описано в УМО2013/054495.methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide (hereinafter also called "Spol. 4"); 2-(Methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide (hereinafter also called "Spol. 5"); 7) Pyridazinone derivatives, as described in UMO2013/050421 and M/O2013/083774; 8) Substituted 1,2,5-oxadiazoles, as described in UMO2013/072300 and MMO2013/072402; and 9) Oxoprazine derivatives as described in UMO2013/054495.
Ці інгібітори ГФПД можуть застосовуватися проти трави та/або широколистих бур'янів на полях з культурними рослинами, що демонструють метаболічну стійкість, такими як кукурудза (7еа таух), рис (Огу/а Заїїма) і пшениця (Тгйісит аевзіїмит), у яких вони швидко розкладають (Зеспиі? і ін. (1993), РЕЕВЗ ІеНегв5, 318, 162-166; Міїспеї! і ін. (2001), Резі Мападетепі Зсіепсе, Мої 57, 120-128; Сагсіа і ін. (2000), Віоспет., 39, 7501-7507; Раїей і ін. (2001), Резї МападетепіThese GFAP inhibitors can be used against grass and/or broadleaf weeds in fields with metabolically resistant crops such as maize (7ea tauh), rice (Ogu/a Zaiiima) and wheat (Tgyisit aevziimit) in which they quickly decompose (Zespii? et al. (1993), REEVZ IeNegv5, 318, 162-166; Miispei! et al. (2001), Rezi Mapadetepi Zsiepse, Moi 57, 120-128; Sagsia et al. (2000), Viospet ., 39, 7501-7507; Raiei et al. (2001), Rezi Mapadetepi
Зсіепсе, Мої 57, 133-142). З метою розширити спектр застосування цих гербіцидів-інгібіторівZsiepse, Moi 57, 133-142). In order to expand the range of application of these inhibitor herbicides
ГФПД, були початі деякі зусилля для надання рослинам, особливо рослинам без метаболічної стійкості або з недостатнім її рівнем, достатнього в польових агрономічних умовах рівня стійкості.GFPD, some efforts have been made to provide plants, especially plants with no or insufficient metabolic resistance, with a level of resistance sufficient in field agronomic conditions.
Крім спроби обходу опосередкованого ГФПД вироблення гомогентизату (05 6,812,010), виконувалася також понадекпресія чутливого ферменту з метою зробити в рослині достатню кількість цільового ферменту по відношенню до гербіциду (М/096/38567). Понадекпресія ГФПД приводила до переважної досходової стійкості дикетонітрильного похідного (ДКН) ізоксафлютолу (ІФТ), але рівень стійкості був недостатнім для виникнення стійкості при післясходової обробки (Маїгіпде і ін. (2005), Ребзі Мападетепі бсієпсе 61: 269-276).In addition to an attempt to bypass the production of homogentisate mediated by HFPD (05 6,812,010), overexpression of a sensitive enzyme was also performed in order to make a sufficient amount of the target enzyme in the plant in relation to the herbicide (M/096/38567). Overexpression of GFPD resulted in predominant pre-emergence resistance to the diketonitrile derivative (DKN) isoxaflutol (IFT), but the level of resistance was insufficient to induce post-emergence resistance (Maigipde et al. (2005), Rebzi Mapadetepi bsiepse 61: 269-276).
Третя стратегія полягала в тому, щоб мутувати ГФПД таким чином, щоб одержати цільовий фермент, який при збереженні здатності каталізувати перетворення ГФП у гомогентизат є менш чутливим до інгібіторів ГФПД, ніж природна ГФПД до мутації.A third strategy was to mutate HFPD in such a way as to produce a target enzyme that, while retaining the ability to catalyze the conversion of HFPD to homogenizate, is less sensitive to HFPD inhibitors than the native HFPD before the mutation.
Ця стратегія успішно застосовувалася у виробництві рослин, стійких до 2-ціано-3- циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл-4-трифторметилфеніл)-пропан-1,3-діону й до 2-ціано-1-|4- (метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3-(1-метилциклопропіл)упропан-1,3-діону (ЕР496630), двох гербіцидів-інгібіторів ГФПД, що належать до родини дикетонітрилів (М/099/24585).This strategy was successfully applied in the production of plants resistant to 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-methylsulfonyl-4-trifluoromethylphenyl)-propane-1,3-dione and to 2-cyano-1-|4-(methylsulfonyl )-2-trifluoromethylphenyl|-3-(1-methylcyclopropyl)upropane-1,3-dione (ЕР496630), two GFPD inhibitor herbicides belonging to the diketonitrile family (M/099/24585).
Рго215І ей, СіуЗзЗбОоїм, СІуЗ36б Пе, і більш конкретно СІуЗ36бТгр (положення мутуючих амінокислотRho215I ey, SiuZzZbOoim, SiuZ36b Pe, and more specifically SiuZ36bTgr (position of mutating amino acids
Зо позначені відносно ГФІПД Реепйдотопах Пиогезсеп5) були ідентифіковані як мутації, відповідальні за підвищену стійкість до обробки цими дикетонітрильними гербіцидами.Zo labeled relative to GFIPD Reepidotopach Pyogezsep5) were identified as mutations responsible for increased resistance to treatment with these diketonitrile herbicides.
Не дуже давно введення гена ГФПД Рзейдотопазх Пиогезсеп5 у пластидний геном тютюну й сої показало більшу ефективність у порівнянні з ядерною трансформацією, надаючи стійкість при післясходовій обробці ізоксафлютолом (Ошоигтапгеї і ін. (2007), Ріапі Віоїесппої У).5(1):118- 33).Not so long ago, the introduction of the GFPD gene Rzeidotopazh Pyogezsep5 into the plastid genome of tobacco and soybean showed greater efficiency compared to nuclear transformation, providing resistance to post-emergence treatment with isoxaflutol (Oshoigtapgei et al. (2007), Riapi Vioyesppoi U).5(1):118- 33).
В МО2004/024928 винахідники задавалися метою підсилити біосинтез пренілхінонів (напр., синтез пластохінонів, токоферолів) у клітинах рослин за допомогою підвищення припливу попередника ГФП у клітини рослин. Це досягалося шляхом приєднання синтезу згаданого попередника до "шикиматного" шляху через понадекпресію ферменту префенатдегідрогенази (ПДГ). Вони також відзначали, що трансформування рослин геном, що кодують фермент ПДІ і геном, що кодують фермент ГФПД, уможливлює підвищення стійкості згаданих рослин до інгібіторів ГФПД.In MO2004/024928, the inventors set themselves the goal of enhancing the biosynthesis of prenylquinones (e.g., the synthesis of plastoquinones, tocopherols) in plant cells by increasing the influx of the GFP precursor into plant cells. This was achieved by joining the synthesis of the mentioned precursor to the "shikimate" pathway through the overexpression of the enzyme prephenate dehydrogenase (PDH). They also noted that the transformation of plants with the gene encoding the PDI enzyme and the gene encoding the HFPD enzyme makes it possible to increase the resistance of the mentioned plants to HFPD inhibitors.
В М/О2009/144079 розкриті послідовності нуклеснових кислот, що кодують гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (ГФПД) з конкретними мутаціями в положенні 336 білка ГФПДIn M/O2009/144079, the sequences of nucleic acids encoding hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HFPD) with specific mutations at position 336 of the HFPD protein were disclosed
Рзейидотопах Пиогезсеп5 і їх використання для одержання рослин, стійких до гербіцидів- інгібіторів ГФПД.Rzeiidotopach Pyogezsep5 and their use for obtaining plants resistant to GFPD-inhibiting herbicides.
В ММО2002/046387 були ідентифіковані декілька доменів білків ГФПД, що мають походження з рослин, які можуть бути значимими для надання стійкості до різних гербіцидів-інгібіторівIn MMO2002/046387, several domains of GFPD proteins of plant origin were identified that may be relevant in conferring resistance to various herbicide inhibitors
ГФПД, але не показані ні дані іп ріапіа, ні біохімічні дані, що підтверджують вплив описаних функцій доменів.GFPD, but neither ip riapy nor biochemical data are shown to support the influence of the described domains' functions.
В М/О2008/150473 була показана комбінація двох різних механізмів стійкості - модифікований ген Амепа займа мутантний фермент, що кодує ГФПД і СУР450 монооксигеназ кукурудзи (ген пвії) - з метою одержати поліпшену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, але не були розкриті дані, що демонструють синергетичні ефекти комбінації обох білків.In M/O2008/150473, a combination of two different resistance mechanisms was shown - the modified Amep gene takes a mutant enzyme encoding GFPD and the corn monooxygenase SUR450 (pvia gene) - in order to obtain improved resistance to GFPD inhibitor herbicides, but the data were not disclosed. demonstrating the synergistic effects of the combination of both proteins.
Далі, в О052011/0173718 описаний спосіб створення рослин, стійких до інгібіторів ГФПД, шляхом понадекпресії не тільки гена, що кодує стійкий ГФПД, наприклад, від Амепа заїїма, але й комбінації З декількома генами рослин, що кодують білок гот (гомогентизатсоланезилтрансферазу). Однак рівень стійкості до деяких вибраних гербіцидів - інгібіторів ГФПД був украй обмежений. 60 В УМО2011/094199 ії О52011/0185444 була оцінена стійкість декількох сотень ліній сої дикого типу до інгібітора ГФПД ізоксафлютолу. Дуже мало ліній показували прийнятний рівень стійкості до гербіцидів. Був ідентифікований передбачуваний ЛКП (локус кількісних ознак), відповідальний за стійкість. На цій ділянці генома як основної ознаки, яка відповідає за спостережувану поліпшену стійкість до інгібіторів ГФПД, був розпізнаний ген, що кодує транспортер АВС. Однак трансгенні рослини, які експресують ідентифіковані гени, не показували ніякого поліпшення стійкості до перевірених гербіцидів-інгібіторів ГФПД.Further, in О052011/0173718, a method of creating plants resistant to HFPD inhibitors is described by overexpression of not only a gene encoding a resistant HFPD, for example, from Amep zaiima, but also a combination with several genes of plants encoding the Goth protein (homogentizazolanesyltransferase). However, the level of resistance to some selected herbicides - GFPD inhibitors was extremely limited. 60 In UMO2011/094199 and O52011/0185444, the resistance of several hundreds of wild-type soybean lines to the HFPD inhibitor isoxaflutol was evaluated. Very few lines showed an acceptable level of resistance to herbicides. A putative LCP (quantitative trait locus) responsible for resistance was identified. In this region of the genome, the gene encoding the ABC transporter was recognized as the main feature responsible for the observed improved resistance to HFPD inhibitors. However, transgenic plants expressing the identified genes did not show any improvement in resistance to the tested GFPD inhibitor herbicides.
В УМО2010/085705 були описані декілька мутантних ГФПД Амепа заїїма. Було показано, що деякі варіанти демонстрували поліпшену стійкість іп міго до трикетону "мезотріону", однак у рослинах тютюну експресувалось дуже мало мутантів. До того ж, жодна з рослин тютюну, які експресують ці мутанти, не показала підвищеної стійкості до мезотріону або ізоксафлютолу в порівнянні з рослинами тютюну, що експресують ген ГФПД Амепа заїїма дикого типу.In UMO2010/085705, several mutant GFPDs of Amepa zaziima were described. Some variants were shown to show improved resistance to the triketone mesotrione, but very few mutants were expressed in tobacco plants. In addition, none of the tobacco plants expressing these mutants showed increased resistance to mesotrione or isoxaflutol compared to tobacco plants expressing the wild-type GFPD Amep gene.
ОБ 2012/0042413 описує поліпептиди, що проявляють активність ГФПД, але також демонструють певну нечутливість до принаймні одного інгібітора ГФПД, і також пропонує певний набір мутацій у різних положеннях ферментів ГФПД, і зрештою розкриває біохімічні дані й рівні стійкості рослин, що містять деякі подібні мутовані ГФПД. В ЕР 2453012 описані декілька мутантних ГФІПД; однак не показана підвищена стійкість описаних мутантів іп ріапіа до декількох гербіцидів-інгібіторів ГФПД.OB 2012/0042413 describes polypeptides exhibiting HFPD activity but also showing some insensitivity to at least one HFPD inhibitor, and also suggests a specific set of mutations at various positions of HFPD enzymes, and ultimately discloses biochemical data and resistance levels of plants containing some such mutated GFPD In EP 2453012, several mutant GFIPDs are described; however, increased resistance of the described ip riapia mutants to several GFPD inhibitor herbicides was not shown.
Описані в цей час і частково комерціалізовані інгібітори ГФПД діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори (див. Могтізоп (1982) Тгтепаз Віоспет. сі. 7, 102-105).Described at this time and partially commercialized GFPD inhibitors act as slow binding or slow, strong binding inhibitors (see Mogtizop (1982) Tgtepaz Viospet. si. 7, 102-105).
Ці інгібітори зв'язуються повільно (тобто, з невеликою швидкістю асоціації, Коп), але не ковалентно з ферментом ГФІПД (тобто, вони дають залежне від часу зв'язування) і дуже повільне звільняються (тобто, з винятково малою швидкістю дисоціації, Кой) завдяки надзвичайно сильній взаємодії з ферментом.These inhibitors bind slowly (i.e., with a low association rate, Kop) but not covalently to the GFIPD enzyme (i.e., they give a time-dependent binding) and are released very slowly (i.e., with an extremely low dissociation rate, Koi) due to extremely strong interaction with the enzyme.
Ці інгібітори зв'язуються настільки сильно, що стають можливими стехіометричні титрування з ферментом.These inhibitors bind so strongly that stoichiometric titrations with the enzyme become possible.
Усе ясніше стає те, що повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори є не тільки винятково сильними інгібіторами ГФПД, але також мають риси, що роблять їх привабливими агрохімікатами для боротьби з бур'янами. Мала швидкість дисоціації підсилює ефективність інгібітора настільки, що в ідеальному випадку достатньо усього однієї молекулиIt is becoming increasingly clear that slow binding or slow, strong binding inhibitors are not only exceptionally strong inhibitors of GFAP, but also have features that make them attractive agrochemicals for weed control. The low rate of dissociation enhances the effectiveness of the inhibitor to such an extent that, in the ideal case, only one molecule is sufficient
Зо інгібітора на активний сайт ферменту для повного інгібування його активності й збереження цього ж ступеню інгібування на тривалий період часу навіть під час відсутності вільних молекул інгібітора в рослинній клітині. Це обумовлює малу величину дози інгібіторів, що вимагається для боротьби з небажаними бур'янами в районах вирощування сільськогосподарських культур.From the inhibitor to the active site of the enzyme to completely inhibit its activity and maintain the same degree of inhibition for a long period of time even in the absence of free inhibitor molecules in the plant cell. This results in a small dose of inhibitors required to control unwanted weeds in crop growing areas.
Властивості повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів мають перевагу в тому випадку, коли метою є досягнення інгібування ГФПД і гербіцидна активність.Properties of slow binding or slow, strong binding inhibitors have an advantage in the case when the goal is to achieve inhibition of HFPD and herbicidal activity.
Однак ці ж властивості є великим недоліком у випадку, коли необхідно проектувати стійкі до цих інгібіторів ферменти ГФПД. Мутації у ферменті ГФПД, які тільки знижують афінність інгібітора до ферменту (рібо), не можуть повністю подолати інгібування ГФПД, оскільки зв'язування інгібітора й інгібування ферменту ГФПД усе ще можуть мати місце й, відповідно, досягнутий рівень інгібування буде утримуватися довгий час навіть під час відсутності вільного інгібітора в рослинній клітині.However, these same properties are a major drawback when it is necessary to design GFPD enzymes resistant to these inhibitors. Mutations in the GFAP enzyme that only reduce the affinity of the inhibitor for the enzyme (ribo) cannot completely overcome GFAP inhibition, because inhibitor binding and inhibition of the GFAP enzyme can still occur and, accordingly, the achieved level of inhibition will be maintained for a long time even under time of absence of free inhibitor in the plant cell.
Завдяки вищеописаним кінетичним властивостям усіх описаних у цей час і частково комерціалізованих гербіцидів-інгібіторів ГФПД, до сьогоднішнього дня не було створено рослин, повністю стійких до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, незважаючи на численні зусилля в їх створенні.Due to the above-described kinetic properties of all currently described and partially commercialized GFPD inhibitor herbicides, to date no plants have been created that are fully resistant to GFPD inhibitor herbicides, despite numerous efforts to create them.
Короткий опис винаходуBrief description of the invention
У даному винаході описані ферменти ГФПД і рослини, які їх містять, що демонструють повну стійкість до декількох класів інгібіторів ГФПД. З'ясувалося, що для створення таких ферментівThe present invention describes HFPD enzymes and plants that contain them, which demonstrate complete resistance to several classes of HFPD inhibitors. It turned out that for the creation of such enzymes
ГФПД із максимальною або повною стійкістю до інгібіторів ГФПД більш важливо підвищити швидкість дисоціації (Кої) повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів, ніж понизити їх афінність до ферменту (рібо), якщо необхідно досягти стійкості до інгібітора. В ідеалі необхідно одночасно досягти зниження афінності інгібітора до ферменту ГФПД (рі5БО) і підвищити швидкість дисоціації інгібітора з ферменту ГФПД (КоОй) у мутантному ферменті, щоб одержати високий рівень стійкості до інгібітора.GFAP with maximum or complete resistance to GFAP inhibitors, it is more important to increase the dissociation rate (Koi) of slow-binding or slow, strong-binding inhibitors than to decrease their affinity for the enzyme (ribo) if resistance to the inhibitor is to be achieved. Ideally, it is necessary to simultaneously achieve a decrease in the affinity of the inhibitor to the GFPD enzyme (ri5BO) and increase the rate of dissociation of the inhibitor from the GFPD enzyme (CoOy) in the mutant enzyme in order to obtain a high level of resistance to the inhibitor.
У запропонованому винаході ця мета була досягнута розробкою комплекту ферментівIn the proposed invention, this goal was achieved by developing a set of enzymes
ГФПД, що не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, і в той же час швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту підвищену настільки, що інгібітори ГФПД більш не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але як повністю оборотні інгібітори.HFPDs that have no or significantly reduced affinity for HFPD inhibitors, and at the same time the rate of dissociation of HFPD inhibitors from the enzyme is increased to such an extent that HFPD inhibitors no longer act as slow-binding or slow, strong-binding inhibitors, but as fully reversible inhibitors.
У запропонованому винаході надані композиції й способи для одержання ферментів ГФПД, бо що мають вищезгадані властивості (тобто, що не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, підвищену швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту; інгібітори ГФПД більше не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але як повністю оборотні інгібітори). Композиції включають ГФПД і ізольовані, рекомбінантні або химерні молекули нуклеїнової кислоти, що кодують такі поліпептиди, а також вектори й клітини-хазяїни, що містять ці молекули нуклеїнової кислоти. Композиції також включають антитіла до цих поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть бути використані в конструкціях ДНК або касетах експресії для трансформації й експресії в організмах, включаючи мікроорганізми й рослини. Нуклеотидні послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, розробленими для експресії в організмі, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроорганізм або рослину.The proposed invention provides compositions and methods for obtaining HFPD enzymes, because having the above-mentioned properties (ie, having no or significantly reduced affinity for HFPD inhibitors, an increased rate of dissociation of HFPD inhibitors from the enzyme; HFPD inhibitors no longer act as slow-binding or slowly, tightly binding inhibitors, but as fully reversible inhibitors). The compositions include HFPD and isolated, recombinant or chimeric nucleic acid molecules encoding such polypeptides, as well as vectors and host cells containing these nucleic acid molecules. The compositions also include antibodies to these polypeptides. Nucleotide sequences can be used in DNA constructs or expression cassettes for transformation and expression in organisms, including microorganisms and plants. Nucleotide sequences can be synthetic sequences designed for expression in an organism, including, but not limited to, a microorganism or a plant.
Композиції включають молекули нуклеїнової кислоти, що кодують стійкі до гербіцидів поліпептиди, включаючи молекули нуклеїнової кислоти, що кодують ГФПД-білок РзендотопавThe compositions include nucleic acid molecules encoding herbicide-resistant polypeptides, including nucleic acid molecules encoding the Rzendotopav HFPD protein
Пиогезсеп5, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕО ІЮ МО-1 і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений у будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33, також як і його фрагменти.Pyogeseps5 containing a proline at a position corresponding to position 335 5EO IU MO-1 and a phenylalanine or tyrosine at a position corresponding to position 336 5EO IU MO and optionally one or more amino acid substitutions at positions corresponding to position 188, 189, 200, 215, 226, 339 and 340 5EO IU MO:1, including the GFPD protein set forth in any of the ZEO IU MO:7-33, as well as fragments thereof.
Композиції також включають трансформовані рослини, рослинні клітини, тканини й насіння, стійкі до гербіцидів-інгібіторів ГФПД завдяки введенню послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом у геном рослин, рослинних клітин, тканин і насіння. Введення послідовності дозволяє застосовувати гербіциди-інгібітори ГФПД до рослин для селективного знищення чутливих до інгібітора ГФІПД бур'янів або інших нетрансформованих рослин, але не трансформованого організму. Послідовності можуть також бути використані як маркер для селекції рослинних клітин, вирощуваних у присутності одного або більше гербіцидів-інгібіторівThe compositions also include transformed plants, plant cells, tissues and seeds resistant to GFPD inhibitor herbicides by introducing a nucleic acid sequence of the invention into the genome of the plants, plant cells, tissues and seeds. The introduction of the sequence allows applying GFIPD inhibitor herbicides to plants for the selective destruction of weeds sensitive to the GFIPD inhibitor or other non-transformed plants, but not the transformed organism. The sequences can also be used as a selection marker for plant cells grown in the presence of one or more herbicide inhibitors
ГФПД.GFPD
Додатково викладаються способи ідентифікування ферменту ГФПД із активністю стійкості до інгібіторів ГФПД.In addition, the methods of identifying the HFPD enzyme with the activity of resistance to HFPD inhibitors are described.
Композиції й способи згідно з винаходом корисні в створенні організмів з посиленою стійкістю до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Ці організми й композиції, що містять організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Рослини або насіння, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом, можуть бути вирощені в полі й зібрані для одержання рослинного продукту. Композиції згідно з винаходом також корисні у виявленні присутності стійких до інгібіторів ГФІПД білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.Compositions and methods according to the invention are useful in creating organisms with increased resistance to GFPD inhibitor herbicides. These organisms and compositions containing the organisms are desirable for agricultural purposes. Plants or seeds containing a nucleic acid sequence encoding a GFPD according to the invention can be grown in the field and harvested to obtain a plant product. The compositions of the invention are also useful in detecting the presence of GFIPD inhibitor-resistant proteins or nucleic acids in products or organisms.
Короткий опис кресленьBrief description of the drawings
На Фігурі 1 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей ГФПД видів мікробів і рослин, включаючи Рзейдотопах Пиогезсепз (РІ, 5ЕО ІЮ МО:1), Амепа займа (5ЕБО ІЮ МО:38), варіант ГФПД Амепа заїїма (ЗЕО ІО МО:39), 7еа тауз5 (5ЕО ІЮО МО:40), бБігеріотусе5 амегтійіів (ЗЕО ІЮ МО:44), Агарідорзів ІНаійапа (5ЕО ІО МО:41), Ногаєит муціІдаге (ЗЕО ІЮ МО:42), Байсив сагоїа (ЗЕО ІЮ МО:43), МусозрпаеєгеїІа дгатіпісоїа (ЗЕО ІЮ МО:45) і Соссісоїде5 іттіїй5 (ЗЕО ІЮFigure 1 shows an alignment of the amino acid sequences of the GFPD of microbial and plant species, including Rzeidotopach Pyogeseps (RI, 5EO IU MO:1), Amepa zaina (5EBO IU MO:38), the GFPD variant of Amepa zayima (ZEO IU MO:39), 7ea tauz5 (5EO IYUO MO:40), bBigeriotuse5 amegtiyiiv (ZEO IYU MO:44), Agaridorziv Inaiyapa (5EO IYU MO:41), Nogaeit muciIdage (ZEO IYU MO:42), Baisiv sagoia (ZEO IYU MO:43), MusozrpaeegeiIa dgatipisoia (ZEO IU MO:45) and Saussisoide5 ittiiy5 (ZEO IU
МО:46).MO:46).
На Фігурі 2А показаний приклад залежного від часу інгібування мутантного залежного від часу ферменту ГФПД у присутності 1 мкМ інгібітора ГФПД. На фігурі 28 показаний приклад оборотного інгібування оборотного мутантного ферменту ГФПД у присутності 10 мкМ інгібітора.Figure 2A shows an example of the time-dependent inhibition of the time-dependent mutant GFPD enzyme in the presence of 1 μM GFPD inhibitor. Figure 28 shows an example of reversible inhibition of the reversible mutant enzyme HFPD in the presence of 10 µM inhibitor.
Детальний опис винаходуDetailed description of the invention
Нижче даний винахід буде описаний більш повно з посиланнями на додані креслення, на яких показані деякі, але не всі варіанти здійснення винаходу. Насправді, дані винаходи можуть бути здійснені в багатьох різних формах і не повинні бути витлумачені як обмежені наведеними варіантами; скоріше, ці варіанти наведені для задоволення даного розкриття застосовним вимогам закону. Ті самі номерні позначення всюди позначають ті самі елементи.The present invention will be described more fully below with reference to the accompanying drawings in which some, but not all, embodiments of the invention are shown. In fact, the present invention may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the following embodiments; rather, these options are provided to satisfy applicable legal requirements for this disclosure. The same number designations denote the same elements everywhere.
Фахівцеві в галузі техніки, до якої належать ці винаходи, при наявності переваг інформації, надаваної даним документом у вищезгаданих описах і зв'язаних з ними кресленнях, можуть згадатися багато модифікацій і інших варіантів здійснення винаходів. Тому слід розуміти, що винаходи не обмежуються конкретними описаними варіантами здійснення й що модифікації й інші варіанти здійснення передбачається охопити в обсязі доданої формули. Хоча тут і далі використовуються специфічні терміни, вони використані в узагальненому й описовому розумінні й не з метою обмеження.Many modifications and other embodiments of the invention may occur to one skilled in the art to which this invention relates, having the benefit of the information provided herein in the foregoing descriptions and associated drawings. Therefore, it should be understood that the inventions are not limited to the specific embodiments described and that modifications and other embodiments are intended to be encompassed within the scope of the appended claims. Although specific terms are used herein, they are used in a generalized and descriptive sense and not for the purpose of limitation.
ОглядReview
Було почато декілька спроб для надання рослинам агрономічно прийнятного рівня стійкості 60 до широкого спектра гербіцидів-інгібіторів ГФОД, включаючи обхід опосередкованого ГФПД вироблення гомогентизату (05 6,812,010), понадекпресію чутливого ферменту з метою виробити в рослині достатню кількість цільового ферменту стосовно гербіциду (М/О96/38567), і мутацію ГФПД таким чином, щоб одержати цільовий фермент, який при збереженні здатності каталізувати перетворення ГФП у гомогентизат є менш чутливим до інгібіторів ГФПД, ніж природна ГФПД до мутації.Several attempts have been made to provide plants with an agronomically acceptable level of 60 resistance to a wide range of GFOD inhibitor herbicides, including bypassing GFPD-mediated production of homogentisate (05 6,812,010), overexpression of a sensitive enzyme in order to produce sufficient amounts of the target enzyme for the herbicide in the plant (M/O96/ 38567), and mutation of GFPD in such a way as to obtain a target enzyme that, while retaining the ability to catalyze the conversion of GFP to homogenizate, is less sensitive to GFPD inhibitors than native GFPD before the mutation.
Незважаючи на ці успіхи в розробці рослин, що демонструють стійкість декількох гербіцидів- інгібіторів ГФПД, усе ще необхідно розробити та/або поліпшити стійкість рослин до більш нових або декількох різних інгібіторів ГФПД, зокрема інгібіторів ГФПД, що належать до класів трикетонів (напр., сулькотріону, мезотріону, темботріону, бензобіциклону й біциклопірону), піразолінатів (напр., топрамезону й пірасульфотолу), М-(1,2,5-оксадіазол-З3-іл)бензамідів (М/О2011/035874), М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-іллуарилкарбоксамідів (М/О2012/028579), похідних піридазинону (М/02013/050421 і УУО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О2013/072300 ії УМО2013/072402); і похідних оксопразину (ММО2013/054495).Despite these advances in the development of plants showing resistance to several GFAP inhibitor herbicides, there is still a need to develop and/or improve plant resistance to newer or several different GFAP inhibitors, particularly GFAP inhibitors belonging to the triketone class (e.g., sulcotrione , mesotrione, tembotrione, benzobicyclone and bicyclopyrone), pyrazolinates (e.g., topramesone and pyrasulfitol), M-(1,2,5-oxadiazol-Z3-yl)benzamides (M/O2011/035874), M-(tetrazole-4 -yl)- or M-(triazol-3-ylluarylcarboxamides (M/O2012/028579), pyridazinone derivatives (M/02013/050421 and UUO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (M/O2013/072300 and УМО2013/072402); and oxoprazine derivatives (ММО2013/054495).
Таким чином, даний винахід надає поліпшені композиції й способи для регулювання стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Гербіциди-інгібітори ГФІПД, такі як клас М-(1,2,5- оксадіазол-З3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-іляуарилкарбоксамідів, таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл/бензамідів, таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3--сметилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4- (дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3--(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідні піридазинону (МИО2013/050421 і ММО2013/083774); заміщені 1,2,5-оксадіазоли (МИО2013/072300 і УМО2013/072402); і похідні оксопразину (М/О02013/054495); трикетони, такі темботріон, сулькотріон і мезотріон; клас ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або клас піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон, мають видатну гербіцидну активність проти широкого спектра економічно важливих однодольних і дводольних однолітніх шкідливих рослин.Thus, the present invention provides improved compositions and methods for regulating resistance to GFPD inhibitor herbicides. Herbicides-inhibitors of GFIPD, such as the class of M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-yllauarylcarboxamides, such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5- yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide; M-(1,3,4-oxadiazole-2 -yl/benzamides, such as 2-methyl-N-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 1); M -(tetrazol-b5-yl- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl) benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro- 3--(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M- (1-methyl-1 H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (МИО2013/050421 and ММО2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (МИО2013/ 072300 and UMO2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O02013/054495); triketones, such as tembotrione , sulcotrione and mesotrione; the isoxazole class, such as isoxaflutol; or the pyrazolinate class, such as pyrasulfotol and topramesone, have outstanding herbicidal activity against a wide range of economically important monocotyledonous and dicotyledonous annual weeds.
Зо Активні речовини також ефективно діють на багаторічні шкідливі рослини, що пускають відростки від ризом, деревної маси або інших багаторічних органів і з якими складно боротися.Z Active substances also effectively act on perennial harmful plants that grow shoots from rhizomes, woody mass or other perennial organs and are difficult to deal with.
У рамках даного винаходу "гербіцид" слід розуміти як гербіцидно активну субстанцію саму по собі або таку субстанцію, яка скомбінована з добавкою, що змінює її ефективність, таку як, наприклад агент, що підвищує активність (синергетичний агент), або обмежуючий активність агент (запобіжник). Гербіцид також може містити тверді або рідкі ад'юванти або носії, звичайно використовувані в технології приготування (напр., природні або регенеровані мінеральні субстанції, розчинники, диспергатори, змочувані агенти, агенти для надання клейкості, емульгатори, агенти посилення росту й т.п.), також як і один або більше пестицидів (напр., інсектицидів, вірицидів, мікробицидів, амебоцидів, пестицидів, фунгіцидів, бактерицидів, нематицидів, молюскоцидів і т.п.)Within the framework of this invention, "herbicide" should be understood as a herbicidally active substance by itself or such a substance that is combined with an additive that changes its effectiveness, such as, for example, an agent that increases activity (synergistic agent) or an activity-limiting agent (safe ). The herbicide may also contain solid or liquid adjuvants or carriers commonly used in formulation (e.g., natural or regenerated mineral substances, solvents, dispersants, wetting agents, tackifiers, emulsifiers, growth promoters, etc. ), as well as one or more pesticides (eg, insecticides, viricides, microbicides, amoebicides, pesticides, fungicides, bactericides, nematicides, molluscicides, etc.)
Способи включають трансформування організмів нуклеотидними послідовностями, що кодують ген стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом або іншим способом гени, що вносять такі, стійкості до інгібітора ГФПД в організми, що їх не містили (напр., спарюванням, злиттям клітин, або схрещуванням організмів, що містять введений ген інгібітора ГФПД згідно з винаходом з організмами, що його не містили, й одержанням потомства, що містить такий ген).Methods include transforming organisms with nucleotide sequences encoding a GFAP inhibitor resistance gene according to the invention or otherwise introducing genes that introduce resistance to a GFAP inhibitor into organisms that do not contain them (eg, by mating, cell fusion, or crossing organisms, containing the introduced gene of the HFPD inhibitor according to the invention with organisms that did not contain it, and obtaining offspring containing such a gene).
Нуклеотидні послідовності згідно з винаходом корисні для створення рослин, що демонструють підвищену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищену стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-Nucleotide sequences according to the invention are useful for creating plants that show increased resistance to HFPD inhibitor herbicides, especially increased resistance to HFPD inhibitor herbicides of the M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamide class; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5 -yl/benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole-
Б-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-5-іл)- абоB-yl) benzamide; M-(1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-methylsulfonyl)-4 -(trifluoromethyl)benzamide (Spol. 1); M-(tetrazol-5-yl)- or
М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4--дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 2), 4--difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-
М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3--«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметилуібензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 її УО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О02013/072300 іM-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro-3--"methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4 --trifluoromethyl)benzamide (Sol. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethylubinzamide (Sol. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and UO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (M/O02013/072300 and
УМО2013/072402); і похідних оксопразину (ММО2013/054495); трикетонів, таких темботріон, бо сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон. Ген стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом може також демонструвати стійкість до "гербіцидів-похідних кумарону" (описані в УМО2009/090401,UMO2013/072402); and oxoprazine derivatives (ММО2013/054495); triketones, such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, such as isoxaflutol; or a class of pyrazolinates such as pyrasulphotol and topramesone. The GFPD inhibitor resistance gene according to the invention can also show resistance to "coumarone-derivative herbicides" (described in UMO2009/090401,
УМОо2009/090402, УМО2008/071918, УМО2008/009908). Щодо цього будь-який з генів стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом може також експресуватися в рослині, що експресує також химерний ген гомогентизатсоланезилтрансферази (ГСТ) або мутантний ген ГСТ, як описано вUMOo2009/090402, UMO2008/071918, UMO2008/009908). In this regard, any of the GFAP inhibitor resistance genes according to the invention can also be expressed in a plant that also expresses a chimeric homogenizatolanesyltransferase (HST) gene or a mutant HST gene as described in
УМО2011/145015, УМО2013/064987, УМО2013/064964 або ММО2010/029311, для одержання рослин, стійких до гербіцидів-інгібіторів ГОСТ. Тут і далі терміни "гербіцид-похідне кумарону" або "гербіцид-інгібітор ГОСТ" охоплюють сполуки, що підпадають під номенклатури ІШРАС 5Нн- тіопірано(4,3-бБ|Іпіридин-8-ол, / 5Н-тіопіраноЇ3,4-б|Іпіразин-8-ол, оксатіїно|5,6-б|Іпіридин-4-ол.КЧ/ і оксатіїно|5, 6-б|піразин-4-ол.УМО2011/145015, УМО2013/064987, УМО2013/064964 or ММО2010/029311, for obtaining plants resistant to GOST inhibitor herbicides. Here and in the following, the terms "herbicide-coumarone derivative" or "herbicide-inhibitor of GOST" cover compounds that fall under the ISRAS nomenclature 5Hn-thiopyrano(4,3-bB|Ipyridin-8-ol, / 5H-thiopyranoY3,4-b| Ipyrazin-8-ol, oxathiino|5,6-b|Ipyridin-4-ol.KCh/ and oxathiino|5, 6-b|pyrazin-4-ol.
Таким чином, під геном "стійкості до інгібітора ГФПД" згідно з винаходом слід розуміти ген, що кодує білок, який надає клітині або організму здатність переносити більш високі концентрації інгібітора ГФПД, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити деяку концентрацію інгібітора ГФПД протягом більш тривалого часу, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж який надає клітині або організму здатність виконувати фотосинтез, рости та/або розмножуватися з меншими ушкодженнями або інгібуванням росту, ніж спостережувані в такої ж клітини або організму, які не експресують подібний білок. "Білок стійкості до інгібітора ГФПД" включає білок, який надає клітині або організму здатність переносити більш високі концентрації інгібітора ГФПД, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити деяку концентрацію інгібітора ГФПД протягом більш тривалого часу, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж який надає клітині або організму здатність виконувати фотосинтез, рости та/або розмножуватися з меншими ушкодженнями або інгібуванням росту, ніж спостережувані в такої ж клітини або організму, які не експресують подібний білок. Під "стійким" або "стійкістю" слід розуміти або здатність пережити застосування конкретного гербіциду-інгібітора ГФПД, або здатність виконувати найважливіші клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка, дихання або розмноження таким чином, який не відрізняється явно від присутнього в необроблених клітин або організмів, або ж здатність рослин, оброблених гербіцидом-інгібітором ГФПД, не мати значної різниці у врожайності або навіть мати поліпшену врожайність у порівнянні з такими жThus, a gene for "resistance to a GFAP inhibitor" according to the invention should be understood as a gene encoding a protein that gives a cell or organism the ability to tolerate higher concentrations of a GFAP inhibitor than the same cell or organism that does not express the protein, or tolerate some concentration of a GFAP inhibitor for a longer period of time than the same cell or organism that does not express the protein, or that provides the cell or organism with the ability to perform photosynthesis, grow and/or reproduce with less damage or inhibition of growth than observed in the same cell or organism that do not express a similar protein. A "GFAP inhibitor resistance protein" includes a protein that confers on a cell or organism the ability to tolerate higher concentrations of a GFAP inhibitor than the same cell or organism that does not express the protein, or to tolerate some concentration of a GFAP inhibitor for a longer period of time than the same cell or organism that does not express the protein a cell or organism that does not express the protein, or that confers on the cell or organism the ability to perform photosynthesis, grow and/or reproduce with less damage or inhibition of growth than is observed in the same cell or organism that does not express a similar protein. By "resistant" or "persistence" is meant either the ability to survive the application of a particular GFAP inhibitor herbicide, or the ability to perform essential cellular functions such as photosynthesis, protein synthesis, respiration, or reproduction in a manner that is not markedly different from that present in untreated cells, or organisms, or the ability of plants treated with a GFPD inhibitor herbicide to have no significant difference in yield or even to have an improved yield compared to the same
Зо рослинами, необробленими таким же гербіцидом (але для яких бур'яни забирали або запобігали їх появі за допомогою іншого механізму, ніж застосування гербіциду-інгібітора ГФПД, таким як способи, описані в М/О2011/100302, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання).With plants not treated with the same herbicide (but for which weeds were removed or prevented by a mechanism other than the application of a GFAP inhibitor herbicide, such as the methods described in M/O2011/100302, which is incorporated herein in its entirety in its entirety by reference).
Крім надання клітині стійкості до інгібіторів ГФПД, послідовності нуклеїнових кислот ГФПД згідно з винаходом також кодують поліпептиди, що мають ГФПДдД-активність, тобто, які каталізують реакцію, у якій пара-гідроксифенілпіруват (ГФП) перетворюється в гомогентизат.In addition to rendering the cell resistant to HFPD inhibitors, the HFPD nucleic acid sequences according to the invention also encode polypeptides having HFPDdD activity, i.e., which catalyze the reaction in which para-hydroxyphenylpyruvate (HFP) is converted into a homogenizer.
Каталітична активність ферменту ГФПД може бути визначена різними відомими в даній галузі методами. М/О2009/144079 описує різні підходящі методи скринінгу.The catalytic activity of the GFPD enzyme can be determined by various methods known in the field. M/O2009/144079 describes various suitable screening methods.
Ферментативна активність білків ГФІПД може бути виміряна будь-яким методом, що дозволяють визначити або зниження кількості ГФП або О»2 субстратів, або накопичення будь- яких продуктів ферментативної реакції, тобто гомогентизату або СО». Зокрема, активність ГФПД може бути виміряна за допомогою методу, описаного в М/О2009/144079; Сагсіа і ін. (1997),Enzymatic activity of GFIPD proteins can be measured by any method that allows determining either a decrease in the amount of GFP or O»2 substrates, or the accumulation of any products of the enzymatic reaction, i.e. homogenized or CO». In particular, the activity of GFPD can be measured using the method described in M/O2009/144079; Sagsia and others. (1997),
Віоспет. 4). 325, 761-769; Сагсіа і ін. (1999), РіІапі Рнузіої. 119, 1507-1516; або в УУМО2012/021785, які включені в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.Viospet. 4). 325, 761-769; Sagsia and others. (1999), Riiapi Rnusioi. 119, 1507-1516; or in UUMO2012/021785, which are included in this description in their entirety by reference.
Для цілей даного винаходу "еталонний" білок ГФПД (або ген ГФПД) - будь-який білок ГФПД або нуклеїнова кислота, з якої порівнюється білок ГФПД або нуклеїнова кислота ГФПД згідно з винаходом. Для цілей опису білків ГФПД згідно із запропонованим винаходом терміни "білок" і "поліпептид" використовуються взаємозамінно. Еталонним ГФПД може бути природна рослинна, бактеріальна або тваринна ГФПД, або ж мутантна ГФПД, відома з рівня техніки, така як мутанти РІР215І і РІСЗ3З36Е, описані в Публікації міжнародної заявки М/О2009/144079 і викладені тут як відповідно ЗЕО ІЮ МО:20 і 2, або ж може бути будь-яким з білків РІНРРОЄмо33,For the purposes of this invention, a "reference" GFPD protein (or GFPD gene) is any GFPD protein or nucleic acid to which the GFPD protein or GFPD nucleic acid according to the invention is compared. For the purpose of describing the GFPD proteins according to the proposed invention, the terms "protein" and "polypeptide" are used interchangeably. The reference HFPD can be a natural plant, bacterial or animal HFPD, or a mutant HFPD known from the state of the art, such as mutants РИР215И and РИСЗ3З36Е, described in the Publication of the international application M/O2009/144079 and set forth here as respectively ZEO IU MO:20 and 2, or it can be any of the proteins RINRROEmo33,
РІНРРОЕмо3б, РІНРРОЄмоз37, РІНРРОЄмо40 або РІНРРОЕмо41, викладених тут як відповідноRINRROEmo3b, RINRROEmo37, RINRROEmo40 or RINRROEmo41, set forth herein as respectively
ЗБЕО ІЮ МО:6 і 34-37, які також описані в Міжнародній патентній заявці РСТ/О52013/59598, поданій З вересня 2013 року й включеної в даний опис шляхом посилання. Подібна еталоннаZBEO IU MO:6 and 34-37, which are also described in International Patent Application PCT/O52013/59598, filed September 2013 and incorporated herein by reference. Similar standard
ГФПД може бути використана для визначення того, чи має білок або нуклеїнова кислота ГФПД згідно з винаходом особливу властивість, що представляє інтерес (напр., поліпшену, порівнянну або знижену стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД або активність ферменту ГФПД; поліпшену, порівнянну або знижену експресію в клітині-хазяїні; поліпшену, порівнянну або знижену стабільність білка й т.п.) 60 У різних варіантах здійснення винаходу стійкий до гербіциду-інгібітора ГФПД білок, який кодується нуклеїнової кислотою (включаючи його ізольовані, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяїни, рослини, частини рослини й насіння, що містять нуклеїнові кислоти, поліпептиди ГФПД і їх композиції, які кодуються нуклеїнової кислотою, також як і способи використання білка, який кодується нуклеїнової кислотою, для підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД класуGFAP can be used to determine whether a GFAP protein or nucleic acid of the invention has a particular property of interest (e.g., improved, comparable, or decreased resistance to a GFAP inhibitor herbicide or activity of the GFAP enzyme; improved, comparable, or decreased expression in the host cell; improved, comparable, or reduced stability of the protein, etc.) 60 In various embodiments of the invention, a protein encoded by nucleic acid (including its isolated, recombinant and chimeric genes, vectors, cell- hosts, plants, plant parts and seeds containing nucleic acids, HFPD polypeptides and nucleic acid-encoded compositions thereof, as well as methods of using the nucleic acid-encoded protein to increase resistance to HFPD inhibitor herbicides, especially to increase resistance to herbicides-inhibitors of the GFPD class
М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)у- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4- оксадіазол-2-іл)/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іM-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides; M-(tetrazol-4-yl)y- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole) -5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide; M-(1,3,4- oxadiazol-2-yl)/benzamides, preferably such as 2-methyl-N-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Spol 1); 1H-tetrazol-5-yl/benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3- (methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О2013/072300 і УМО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон) містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕБО ІОЮО МО і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений у будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33.UMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (М/О2013/072300 and УМО2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, such as isoxaflutol; or the class of pyrazolinates, such as pyrasulfotol and topramesone) contains proline at position corresponding to position 335 5EBO IJUO MO and phenylalanine or tyrosine at position corresponding to position 336 5EO IJU MO and, optionally, one or more amino acid substitutions at positions, corresponding to provisions 188, 189, 200, 215, 226, 339 and 340 of the 5EO IU MO:1, including the GFPD protein set forth in any of the ZEO IU MO:7-33.
Під "відповідним" слід розуміти положення нуклеотиду або амінокислоти відносно такого положення в 5ЕО ІЮО МО:1, коли дві (або більше) послідовності вирівняні з використанням стандартних алгоритмів вирівнювання, описаних тут в інших розділах. Характерне вирівнюванняBy "corresponding" should be understood the position of a nucleotide or amino acid relative to such a position in 5EO IJOO MO:1 when two (or more) sequences are aligned using the standard alignment algorithms described in other sections herein. Characteristic alignment
ЗЕО ІЮ МО:1 з амінокислотними послідовностями ГФПД різних видів мікробів і рослин показано на Фігурі 1. Наприклад, положення амінокислот 188, 215, 335, 336, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО 1 відповідають положенням амінокислот 241, 271, 412, 413, 416 їі 417, відповідно, ГФПД Амепа займа (ЗЕО ІО МО:38); положенням амінокислот 235, 265, 406, 407, 410 ї 411, відповідно, ГПДZEO IU MO:1 with the amino acid sequences of GFPD of different species of microbes and plants is shown in Figure 1. For example, the positions of amino acids 188, 215, 335, 336, 339 and 340 of 5EO IU MO 1 correspond to the positions of amino acids 241, 271, 412, 413, 416 ii 417, respectively, GFPD Amepa occupies (ZEO IO MO:38); by the position of amino acids 235, 265, 406, 407, 410 and 411, respectively, GPA
Ногдешт миЇдаге (ЗЕО ІЮ МО:42) і положенням амінокислот 242, 272, 413, 414, 417 їі 418, відповідно, ГФПД еа таухє (ЗЕБЕО ОО МО:40). Вирівнювання безлічі амінокислотних послідовностей ГФПД різних видів також можна знайти в Таблицях 2а й 265 Європейської патентної публікації Мо ЕР2453012, яка включена в даний опис шляхом посилання. Відповідно, залежно від довжини розглянутої амінокислотної послідовності ГФОПД, що має більше або менше залишків, ніж послідовність зЕО ІЮ МО:1 відповідне положення може розташовуватися в положенні, що відрізняється від положень 188, 189, 200, 215, 226, 335, 336, 339 і 340 у такому розглянутому білку ГФПД.Nogdesht myYidage (ZEO IU MO:42) and the position of amino acids 242, 272, 413, 414, 417 and 418, respectively, GFPD ea tauhye (ZEBEO OO MO:40). Alignment of multiple amino acid sequences of GFPD of different species can also be found in Tables 2a and 265 of European Patent Publication Mo EP2453012, which is incorporated herein by reference. Accordingly, depending on the length of the considered amino acid sequence of HFOPD, which has more or fewer residues than the sequence of ZEO IU MO:1, the corresponding position may be located in a position different from positions 188, 189, 200, 215, 226, 335, 336, 339 and 340 in this considered GFPD protein.
В одному варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn one embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 ЗЕО ІЮ МО:1, ії фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1.HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 ZEO IU MO:1, and phenylalanine or tyrosine in the position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕБЕО ІЮ МО, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО :1 і іі. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і іі. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200GFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing both proline in the position corresponding to the position of the amino acid 335 5EBEO IU MO, and phenylalanine or tyrosine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 ZEO IU MO:1 and ii. alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or valine in a position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IO MO :1; and II. alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or valine in a position corresponding to the position of amino acid 189 5EO IU MO:1 ; and them isoleucine, leucine, or methionine at the position corresponding to amino acid position 200
ЗЕО ІЮ МО:1; і 60 м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислотиZEO IU MO:1; and 60 m alanine, leucine, proline or asparagine in the position corresponding to the position of the amino acid
215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІЮ215 ZE IU MO:1; and mi. histidine or glutamine in the position corresponding to the position of amino acid 226 ZEO IU
МО:1; і міі. гістидин, ізолейцин, лейцин, метіонін, глутамін, аргінін, аланін, лізин, серин, треонін або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і мії. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.MO:1; and mii. histidine, isoleucine, leucine, methionine, glutamine, arginine, alanine, lysine, serine, threonine, or valine in a position corresponding to the position of amino acid 339 5EO IU MO:1; and mine alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, or valine in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO ІЮ MO :1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮО МОЛ, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО :1 і і. аланін, гліцин, гістидин, серин або триптофан у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮ МО-:1; і ії. аргінін, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, гістидин, фенілаланін або серин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing both proline in the position corresponding to the position of the amino acid 335 5EO IUO MOL, and phenylalanine or tyrosine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 ZEO IU MO :1 and i. alanine, glycine, histidine, serine or tryptophan in the position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IU MO-:1; and her arginine, cysteine, glutamine, glutamic acid, aspartic acid, glycine, histidine, phenylalanine or serine in a position corresponding to the position of amino acid 189 5EO ІЮ MO:1; and them isoleucine, leucine, or methionine at the position corresponding to amino acid position 200
ЗЕО ІЮ МО:1; і м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІЮZEO IU MO:1; and m. alanine, leucine, proline or asparagine in the position corresponding to the position of amino acid 215 ZE IU MO:1; and mi. histidine or glutamine in the position corresponding to the position of amino acid 226 ZEO IU
МО:1; і мі. серин, аланін, треонін, глутамін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і мії. аланін, аргінін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин або лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО 10 МО 1.MO:1; and mi. serine, alanine, threonine, glutamine or lysine in the position corresponding to the position of amino acid 339 5EO IU MO:1; and mine alanine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, glycine or leucine in a position corresponding to the position of amino acid 340 ZEO 10 MO 1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕБО ІЮ МО/1, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЕС 10 МО: і іі. аланін, або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і іі. аргінін, цистеїн, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing both proline in the position corresponding to the position of the amino acid 335 5EBO IU MO/1, and phenylalanine or tyrosine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 EC 10 MO: and ii. alanine, or glycine in the position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IO MO:1; and II. arginine, cysteine, glutamic acid, aspartic acid or glycine in the position corresponding to the position of amino acid 189 5EO IU MO:1; and them isoleucine, leucine, or methionine at the position corresponding to amino acid position 200
ЗЕО ІЮ МО:1; і м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮZEO IU MO:1; and m. alanine, leucine, proline or asparagine in the position corresponding to the position of amino acid 215 ZE IU MO:1; and mi. histidine or glutamine in the position corresponding to the position of amino acid 226 5EO IU
МО:1; і міі. аланін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 ЗЕО ІО МО:1; і мії. аланін, глутамінову кислоту, глутамін або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО І МО:1.MO:1; and mii. alanine or lysine in the position corresponding to the position of amino acid 339 ZEO IO MO:1; and mine alanine, glutamic acid, glutamine or glycine in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO I MO:1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5БЕО ІО МО:1.HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. alanine in the position corresponding to the position of amino acid 339 5EO IU MO:1; and her glutamine in the position corresponding to the position of amino acid 340 5BEO IO MO:1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- 60 хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the implementation of HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 ЗЕО ІО МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5БЕО ІО МО:1; і глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing proline in a position corresponding to the position of amino acid 335 ZEO IO MO:1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5BEO IO MO:1; and glutamic acid in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU MO:1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮ МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО І МО1.HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO IU MO:1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and and leucine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5EO I MO1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 ZEO IU MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and and leucine in a position that corresponds to the position of amino acid 215 5EO IO MO-:1; and her glutamic acid in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮО МО:1; і ім. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і м. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 ZEO IU MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. glycine in the position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IYUO MO:1; and her cysteine in the position corresponding to the position of amino acid 189 5EO IYUO MO:1; and named after leucine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5EO IU MO:1; and m. glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮО МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IYUO MO:1; and II. glycine in the position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IYUO MO:1; and her cysteine in the position that corresponds to the position of amino acid 189 5EO IO MO:1; and named after glutamic acid in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 ZEO IU MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. asparagine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5EO IU MO:1; and her glutamic acid in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує 60 ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding 60 HFPD according to invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 ZEO IU MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. alanine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5EO IU MO:1; and her glutamic acid in a position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.HFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 ZEO IU MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and and leucine in a position that corresponds to the position of amino acid 215 5EO IO MO-:1; and her glycine in the position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU MO:1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. ізолейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО-:1; і ії. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5БЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. isoleucine in a position that corresponds to the position of amino acid 200 5EO IO MO-:1; and her leucine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5BEO IO MO-1; and named after glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. ізолейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО-:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. isoleucine in a position that corresponds to the position of amino acid 200 5EO IO MO-:1; and her glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО І МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of amino acid 336 5EO I MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. methionine in the position corresponding to the position of amino acid 200 5EO IU MO:1; and her glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. methionine in the position corresponding to the position of amino acid 200 5EO IU MO:1; and her leucine in a position that corresponds to the position of amino acid 215 5EO IO MO-1; and named after glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- 60 хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the implementation of HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. гістидин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and and leucine in a position that corresponds to the position of amino acid 215 5EO IO MO-:1; and her histidine in the position corresponding to the position of amino acid 226 5EO IO MO-1; and named after glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5БЕО ІО МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ім. аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5БЕО ІО МО-:1; і м. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO ИО МО-1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5BEO IO MO:1; and II. glycine in the position corresponding to the position of amino acid 188 5EO IYUO MO:1; and her cysteine in the position that corresponds to the position of amino acid 189 5EO IO MO:1; and named after asparagine in the position corresponding to the position of amino acid 215 5BEO ИО MO-:1; and m. glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 5EO IU
МО-1.MO-1.
В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодуєIn another embodiment, the HFPD according to the proposed invention (including the nucleotide sequence encoding it and its recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing the nucleotide sequence encoding
ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮ МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. гістидин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІО МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮHFPD according to the invention) consists of an amino acid sequence containing and. proline in the position corresponding to the position of amino acid 335 5EO IU MO:1; and a. phenylalanine in the position corresponding to the position of the amino acid 336 5EO IO MO:1; or p. tyrosine in a position corresponding to the position of amino acid 336 5EO IU MO:1; and II. histidine in the position corresponding to the position of amino acid 226 ZEO IO MO:1; and her glutamic acid in the position corresponding to the position of amino acid 340 of ZEO IU
Зо МО-1.From MO-1.
Відповідні положення амінокислот еталонних білків ГФПД і білків ГФПД згідно з винаходом, що містять одну або більше заміщень амінокислот, підсумовані в Таблиці 1.The corresponding amino acid positions of reference GFPD proteins and GFPD proteins according to the invention containing one or more amino acid substitutions are summarized in Table 1.
Таблиця 1Table 1
Заміщення амінокислот еталонних білків ГФПД і білків ГФПД згідно з винаходом, відносно 5ЕОSubstitution of amino acids of reference proteins of HFPD and proteins of HFPD according to the invention, relative to 5EO
ІО МО/:1, також містить колонку 1 з ідентифікаційним номером клону й відповідним ЗЕО ІЮ МО згідно з переліком послідовностей і посилань в описі. У випадку порожньої комірки в цьому положенні знаходиться амінокислотна послідовність дикого типу (РІНРРО).IO MO/:1, also contains column 1 with the clone identification number and the corresponding ZEO IU MO according to the list of sequences and references in the description. In the case of an empty cell, this position contains the wild-type amino acid sequence (RINRRO).
РІНРРО | (1 А |в | Р (0 в | (ік А рРОЗЗВЕ |! 7772 11117171 ТТRINRRO | (1 A |in | R (0 in | (ik A rROZZVE |! 7772 11117171 TT
РОЗВ! 77 з 7117 Г17111111ГМDISSOLVE! 77 of 7117 G17111111ГМ
РОЗМ |! 4 11717171 мМм1 6959... | ..5 |! ГГ її РROZM |! 4 11717171 mmm1 6959... | ..5 |! GG her R
РЕМЗ3З3 | 6 | / / ГГ РМ 1REMZ3Z3 | 6 | / / GG RM 1
РЕМАЗ | 7 2 Щ | Її 1 її Р в їїREMAZ | 7 2 Sh | Her 1 her P in her
РЕМА. | (ФВ ЇЇ 11711711 РМ 1 їїRhema. | (FV HER 11711711 RM 1 her
РІО! 779 ЦЮ 1 1 1 Р |в А ОО вРІЗО ЇЇ 77ло 17 Г171717717171111711Р (є | 1RIO! 779 CYU 1 1 1 R |v A OO vRIZO HER 77lo 17 Г171717717171111711Р (is | 1
РІЗ Її 11711171 Р є ЇїRIZ Her 11711171 R is Her
РО | 7712 | 17 ГГ Р (є | ЕЕRO | 7712 | 17 GG R (is | EE
Кізі Г777711377 ГГ Г1117171771717171111711Р ДМ ФА 0 кІз2 7 Г7771714 17171171 Р1МKizi Г777711377 ГГ Г1117171771717171111711Р DM FA 0 kIz2 7 Г7771714 17171171 Р1М
КкІ37 7 Г77711115 1717 Г171711111ГР М ЄС 1КкИ37 7 Г77711115 1717 Г171711111ГР M EU 1
Кгоз 7777716 11711711 Р ЇМ | г го | 717 (а |сС | 1-4 Її Р (є | сKgoz 7777716 11711711 R YIM | g go | 717 (a |sS | 1-4 Her R (is | p
Таблиця 1Table 1
Кг55 | 777718 17117117 лА ЇЇ Р (є | ЕЕKg55 | 777718 17117117 lA ІІ R (is | EE
Кг58 ЇЇ 77777197 17111711 ГР (є | ЕЕKg58 HER 77777197 17111711 GR (is | EE
Кг3я/ Ї777712го 11711111 ко Г777717211 11711171 Р є Її с кзо3 7 Г77771122 | 11711111 ГР (є | 0 кзо4 7 Ї77777723 117111 1мМ 1 Її Р (є | ЕЕ кзоб6 7 Ї 77777724 17 Ї171171717711111- 13. Р (є | ЕЕ ках | 725 (а |С | м Її Р | | ГЕ кз57 | 26 (а |С | 171 Р | | ГЕ ко Ї777711127 17111711 1Р (є | 1 кв 77771728 117117 1мМ 17717 ЇЇ Р (є | ЕЕ кзв3 7 Ї777771729 117 Ї111717177171717171111113. Р (є | 0 као5 | 30 2 2 (а |С | А | Р | | (ГЕ каб | 777731 (а (6 | м ЇЇ Р | | ГЕ као7 | 732 (а (ЕЕ | м ЇЇ Р | | ГЕ ка | 33 2 (а (0 |! м Її Р |(є | ГЕКг3я/ Ї777712го 11711111 ko Г777717211 11711171 Р is Her s kzo3 7 Г77771122 | 11711111 GR (is | 0 kzo4 7 Ї77777723 117111 1мМ 1 Her R (is | EE kzob6 7 І 77777724 17 І171171717711111- 13. R (is | EE kah | 725 (a |S | m Her R | | GE kz57 | 26 ( A | C | 171 P | | He K Ї7777111127 17111711 1r (there are | 1 kV 77771728 117117 1mm 17717 its p (there is | it | EE KV3 7 Ї777771729 117. Р | GE
В іншому варіанті здійснення послідовність білків ГФПД згідно з винаходом принаймні на 53 95, принаймні на 60 95, принаймні на 65 95, принаймні на 70 95, принаймні на 75 95, принаймні на 80 95, принаймні на 85 95, принаймні на 90 95, принаймні на 91 95, принаймні на 92 95, по меншій мері на 93 95, принаймні на 94 95, принаймні на 95 95, принаймні на 96 95, принаймні на 97 95, принаймні на 98 95 або принаймні на 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності, викладеної тут як БЕО ІЮ МО:1.In another embodiment, the sequence of GFPD proteins according to the invention is at least 53 95, at least 60 95, at least 65 95, at least 70 95, at least 75 95, at least 80 95, at least 85 95, at least 90 95, at least 91 95, at least 92 95, to a lesser extent 93 95, at least 94 95, at least 95 95, at least 96 95, at least 97 95, at least 98 95, or at least 99 95 identical to the amino acid sequence , presented here as BEO IU MO:1.
Типові послідовності ГФПД, які можуть бути модифіковані згідно із запропонованим винаходом, включають такі бактерій, наприклад, типу Рхейпдотопавх 5р., або ж ціанобактерій, наприклад, роду Зупеспосубії5. Послідовність також може мати рослинне походження, зокрема походити від однодольних або дводольних рослин. Як корисні приклади можна процитувати такі рослини, як тютюн, Агарідорвзі5 Іпаіййапа (М/096/38567), ЮБайсив сагоїа (М/096/38567), 7є6єа тауз (кукурудза, УМО2012/021785), пшениця (Тиййсит аевзімит, УМО2002/046387), ячмінь (ЕР2453012), Амепа бваїйма (МмО2002/046387ЛМО2011/068567), Вгаспіага ріадзурпуйа (МО2002/046387),Typical sequences of GFPD that can be modified according to the proposed invention include such bacteria, for example, of the type Rheipdotopavkh 5r., or cyanobacteria, for example, of the genus Zupesposubiya5. The sequence may also be of plant origin, particularly from monocotyledonous or dicotyledonous plants. As useful examples, we can cite such plants as tobacco, Agaridorvzi5 Ipaiyapa (M/096/38567), Yubaisiv sagoia (M/096/38567), 7e6ea tauz (maize, UMO2012/021785), wheat (Tiyysit aevzimit, UMO2002/046387) , barley (ER2453012), Amepa bvaiima (MMO2002/046387LMO2011/068567), Vgaspiaga riadzurpuia (MO2002/046387),
Сепснгив еспіпайи5 (МО2002/046387), І от гідідит (М/02002/046387), Ревіиса аппаіпасеа (ММО2002/046387), беїагіа Ттабегі (М/О2002/046387), ЕІвизіпе іпаіса (М/О2002/046387), або сорго (МИО2002/046387, УМО2012/021785). У конкретному варіанті здійснення винаходу ГФПД, яка може бути модифікована згідно із запропонованим винаходом, має бактеріальне або протистне походження, зокрема від Рзепдотопа5 5р., більш конкретно від Рхеидотопа5 Пиогезсепв,Sepsngiv espipai5 (MO2002/046387), Iot hydidit (M/02002/046387), Reviisa appaipasea (MMO2002/046387), Beiagia ttabegi (M/O2002/046387), Eivizipe ipaisa (M/O2002/046387), or sorghum ( MIO2002/046387, UMO2012/021785). In a specific embodiment of the invention, the GFPD, which can be modified according to the proposed invention, has a bacterial or protist origin, in particular from Rzepdotop5 5r., more specifically from Rheidotop5 Pyogezsepv,
Реєпдотопаз риїйда, Рвепдотопаз аегидіпозва, Рвбецйдотопавз іевіовівгопі (СотатопавReepdotopaz riyida, Rvepdotopaz aegidipozva, Rvbecydotopavz ieviovivgopi (Sotatopav
Іевіовіегопі), НПодососсив в5р. (УММО2011/076892), Віернагвта |аропісит (МО2011/076882), зЗупеспососси5 5р. (ММО2011/076877), Когаїа аїдісіда (М/02011/076889), від евриархеотаIevioviegopi), NPodosossiv v5r. (UMMO2011/076892), Viernagvta |aropisit (MO2011/076882), from Zupesposossi5 5 years. (ММО2011/076877), Kogaia aidisida (М/02011/076889), from Euryarchaeota
Рісгорпйив5 їоггідиб5 (ММО2011/076885), або ж рослинне походження, включаючи від АгабрідорвівRisgorpiyiv5 yoggidib5 (ММО2011/076885), or plant origin, including from Agabridorvy
Таїїапа, Зогопйит бБісоїог, Огула 5аїїма, Тгйісит аевіїмит, Ногдешт мцідаге, Гоїїшт гідійшт абоTaizhapa, Zogopyit bBisoiog, Ogula 5aihima, Tgyisit aeviimit, Nogdesht msidage, Goiisht gidiysht or
Ауепа заїїма.Auepa is busy.
Для цілей даного винаходу ГФПД згідно з винаходом може також включати подальші модифікації, наприклад, у яких деякі амінокислоти (напр., від 1 до 10 амінокислот) замінені, додані або вилучені для цілей клонування, злиття транзитних пептидів і т.п., зберігаючи приFor purposes of the present invention, the GFPD of the invention may also include further modifications, for example, in which certain amino acids (eg, from 1 to 10 amino acids) are replaced, added or removed for purposes of cloning, transit peptide fusion, etc., while maintaining
Зо цьому активність ГФПД, тобто здатність каталізувати перетворення пара-гідроксифенілпірувату в гомогентизат, або ж може бути будь-який інший ГФПД, що може бути далі вдосконалена.From this, the activity of HFPD, that is, the ability to catalyze the transformation of para-hydroxyphenylpyruvate into homogenizate, or it can be any other HFPD, which can be further improved.
Наприклад, ГФПД, яка може бути далі вдосконалена описаними тут модифікаціями, може бути варіантом ГФПД, отриманою від Рзхендотопах ПЙпиогезсеп5, викладеною тут як будь-яка з ЗЕО ІЮFor example, a GFPD that can be further improved by the modifications described herein can be a variant of the GFPD obtained from Rzhendotopes PYpyogezsep5, set forth herein as any of the ZEO IU
МО:34-37, варіантом ГФПД, отриманою отАмепа заїїма, викладеною тут як 5ЗЕО ІЮ МО:38, варіантом послідовностей ГФПД, викладених тут як будь-яка з БЕО ІЮ МО:3-326, 383-389, 393, 395 і 397-459 в УМО2012/021785, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; послідовностями ГФПД, викладеними як будь-яка з ЗЕО ІЮ МО:2-14 і 20-50 вMO:34-37, a variant of the GFPD derived from Amepa loan, listed here as 5ZEO IU MO:38, a variant of the GFPD sequences listed here as any of the BEO IU MO:3-326, 383-389, 393, 395 and 397 -459 in UMO2012/021785, which is incorporated into this description in its entirety by reference; by sequences of GFPD, laid out as any of ZEO IU MO:2-14 and 20-50 in
ММО2011/068567, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; послідовностями ГФПД, викладеними як будь-яка з 5ЕО ІЮ МО:15-26 в УМО2010/08570, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних в УМО2009/144079 або Патенті США 6,245,968, кожний з яких включений у даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних у Таблицях 1, 2, 5 або 6 УМО2010/085705; та/"або ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних у Таблиці 1 М/О2011/068567.МОО2011/068567, which is incorporated in this description in its entirety by reference; GFPD sequences set forth as any of 5EO IU MO:15-26 in UMO2010/08570, which is incorporated herein by reference in its entirety; GFPD having one or more substitutions described in UMO2009/144079 or US Patent 6,245,968, each of which is incorporated herein by reference in its entirety; GFPD having one or more substitutions described in Tables 1, 2, 5 or 6 of UMO2010/085705; and/or GFPD having one or more substitutions described in Table 1 of M/O2011/068567.
У деяких варіантах здійснення нуклеотидна послідовність згідно з винаходом (включаючи її ізольовані, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяїни, рослини, частини рослини й насіння, що містять послідовності нуклеїнових кислот, амінокислотні послідовності і їх композиції, які кодуються послідовністю нуклеїнової кислоти, також як і способи використання послідовності нуклеїнової кислоти для підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-3- іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл"арилкарбоксамідів, переважно таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-5-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іIn some embodiments, the nucleotide sequence of the invention (including its isolated, recombinant and chimeric genes, vectors, host cells, plants, plant parts and seeds containing nucleic acid sequences, amino acid sequences and compositions thereof encoded by the nucleic acid sequence, as well as methods of using a nucleic acid sequence to increase resistance to HFPD inhibitor herbicides, especially increasing resistance to HFPD inhibitor herbicides of the class M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)/benzamides; M-(tetrazol-4 -yl)- or M-(triazol-3-yl"arylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-N-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide;N-(1,3,4-oxadiazol-2-yl) benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-"(trifluoromethyl)benzamide (Col. 1); M- (tetrazol-5-yl)y- or M-(triazol-3-ylaryl). arboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4--"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl/benzamide (Spol. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro-3-(methylsulfanyl) -M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H - tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide (Spol. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
МО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон) кодує амінокислотну послідовність, викладену в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33, а також її фрагменти й варіанти, що кодують поліпептид стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД.MO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (ММО2013/072300 and ММО2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, such as isoxaflutol; or of the pyrazolinates class, such as pyrasulfotol and topramesone) encodes the amino acid sequence set forth in any of ZEO IU MO:7-33, as well as its fragments and variants encoding the GFPD herbicide resistance polypeptide.
А. Методи вимірювання стійкості до інгібітора ГФПДA. Methods of measuring resistance to the HFPD inhibitor
Для оцінки послідовностей ГФПД згідно з винаходом може бути застосований будь-який підходящий метод вимірювання стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Стійкість може бути виміряна шляхом відстеження здатності клітини або організму пережити застосування конкретного гербіциду-інгібітора ГФПД, або здатності виконувати найважливіші клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка, дихання або розмноження таким чином, який не відрізняється явно від присутнього в необроблених клітин або організмів, або ж здатність рослин, оброблених гербіцидом-інгібітором ГФПД, не мати значної різниці у врожайності або навіть мати поліпшену врожайність у порівнянні з такими ж рослинами, необробленими таким же гербіцидом (але для яких бур'яни забирали або запобігали їх появі за допомогою іншого механізму, ніж застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). У деяких варіантах здійснення стійкість може бути виміряна за видимим індикаторним фенотипом клітини або організму, трансформованого нуклеїнової кислотою, що містить ген, що кодує відповідний білок ГФПД, або в аналізі іп міго білка ГФПД, у присутності різних концентрацій різних інгібіторів ГФПД. Реакції на дози й відносні зсуви в реакціях на дози, пов'язані з такими індикаторними фенотипами (утворення коричневого кольору, інгібування росту, знебарвлення, гербіцидний ефект і т.д.), для зручності виражені, наприклад, значеннями СК50 (концентрація, що викликає 50 95-е інгібування росту) або МІК (мінімальна інгібуюча концентрація), де підвищення значень відповідає підвищенню стійкості, властивої експресованому ГФПД, звичайним способом, грунтуючись на ушкодженні рослин, симптомах знебарвлення меристеми і т.д. у діапазоні різних концентрацій гербіцидів. Ці дані можуть бути виражені, наприклад, значеннями СК50, отриманими із кривих доза/реакція, де на осі х нанесена "доза" і на осі в нанесені "відсоток загибелі", "гербіцидний ефект", "кількість зелених рослин, що зійшли " і т.д., де підвищені значення ЗК50 відповідають підвищенню рівня стійкості, властивої експресованому ГФПД. Гербіциди можуть бути застосовані підходящим чином до сходів або після сходів.Any suitable method for measuring resistance to GFPD inhibitor herbicides can be used to evaluate GFPD sequences according to the invention. Persistence can be measured by monitoring the ability of a cell or organism to survive application of a particular GFAP inhibitor herbicide, or the ability to perform essential cellular functions such as photosynthesis, protein synthesis, respiration, or reproduction in a manner that does not differ markedly from that present in untreated cells or organisms. or the ability of plants treated with a GFAP inhibitor herbicide to have no significant difference in yield or even improved yield compared to the same plants not treated with the same herbicide (but for which weeds were removed or prevented by some other mechanism, than the use of herbicide-inhibitor GFPD). In some embodiments, resistance can be measured by a visible indicator phenotype of a cell or organism transformed with a nucleic acid containing a gene encoding a corresponding HFPD protein, or in an ip migo assay of the HFPD protein, in the presence of various concentrations of various HFPD inhibitors. Dose responses and relative shifts in dose responses associated with such indicator phenotypes (browning, growth inhibition, discoloration, herbicidal effect, etc.) are conveniently expressed, for example, as SC50 values (concentration causing 50 95th growth inhibition) or MIC (minimum inhibitory concentration), where increasing values correspond to increasing resistance inherent to the expressed GFPD, in the usual way, based on plant damage, symptoms of meristem discoloration, etc. in the range of different concentrations of herbicides. These data can be expressed, for example, as SC50 values obtained from dose/response curves, where "dose" is plotted on the x-axis and "percentage killed", "herbicidal effect", "number of green plants emerged" and etc., where the increased values of ZK50 correspond to an increase in the level of resistance characteristic of the expressed HFPD. Herbicides can be applied appropriately pre-emergence or post-emergence.
У різних варіантах здійснення рівень стійкості нуклеїнової кислоти або гена, що кодує білокIn various embodiments, the level of stability of the nucleic acid or protein-encoding gene
ГФПД згідно з винаходом, або білка ГФПД згідно з винаходом, може бути перевірений переносом генів, регенерацією, розмноженням і розпилювальними тестами тестової рослини, такої як тютюн, або сільськогосподарської рослини, такої як соя, кукурудза або бавовник. Згідно з результатами такої перевірки, подібні рослини більш стійкі бажано переносять дозу принаймні в 2 рази більше нормальної дози, рекомендованої для застосування в полі, ще більш переважно переносять дозу до 4-х раз більше нормальної дози, рекомендованої для застосування в полі, гербіцидів-інгібіторів ГФПД (напр., гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М- (1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-З3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і бо 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-A GFPD according to the invention, or a GFPD protein according to the invention, can be tested by gene transfer, regeneration, propagation and spray tests of a test plant, such as tobacco, or a crop plant, such as soybean, corn or cotton. According to the results of such testing, such plants are more resistant and preferably tolerate a dose of at least 2 times the normal dose recommended for field use, even more preferably tolerate a dose of up to 4 times the normal dose recommended for field use, of inhibitor herbicides GFPD (e.g., GFPD inhibitor herbicides of the M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides), preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-N-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)- M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide; M-(1,3,4-
оксадіазол-2-іл)/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іoxadiazol-2-yl)/benzamides, preferably such as 2-methyl-N-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-"(trifluoromethyl)benzamide ( Commun. 1); M-(tetrazol-b-yl)y- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol- 5-yl/benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2 -chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)- M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон), ніж подібні рослини, що не містять ніякого екзогенного гена, що кодує білок ГФПД, або чим рослини, що містять ген, що включає еталонну ГФПД-кодуючу ДНК, наприклад, ГФПД- кодуючу ДНК Рзейдотопав5 Пиогезсеп5, під контролем того ж промотору, що й у нуклеїнової кислоти, що кодує білок ГФПД згідно з винаходом. Відповідно, термін "здатний підвищувати стійкість рослини до принаймні одному гербіциду, що діє на ГФПД" означає стійкість рослини, що експресує ГФПД згідно з винаходом, до дози принаймні в 1, в 2, або в 3, або в 4 або більше разів більше нормальної польової дози гербіциду-інгібітора ГФПД у порівнянні з рослиною, що експресує тільки власний ендогенний ГФПД або рослиною, що експресує еталонний ферментUMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (ММО2013/072300 and ММО2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, such as isoxaflutol; or of the pyrazolinate class, such as pyrasulfotol and topramesone) than similar plants containing no exogenous gene encoding a GFPD protein, or than plants containing a gene that includes a reference GFPD-encoding DNA, such as the HFPD-encoding DNA of Rzeidotopav5 Pyogesep5, under the control of the same promoter as the nucleic acid encoding the GFPD protein according to the invention. Accordingly, the term "capable of increasing the resistance of a plant to at least one herbicide acting on GFPD" means the resistance of a plant expressing GFPD according to the invention to a dose of at least 1, 2, or 3, or 4 or more times the normal of the field dose of the HFPD inhibitor herbicide compared to a plant expressing only its own endogenous HFPD or a plant expressing a reference enzyme
ГФПД. Щодо цього термін "гербіцид, що діє на ГФПД" не обмежується субстанціями, відомими та/або використовуваними як гербіциди, але стосується також будь-яких субстанціям, які інгібують каталітичну активність білків ГФПД.GFPD In this regard, the term "herbicide that acts on GFPD" is not limited to substances known and/or used as herbicides, but also refers to any substance that inhibits the catalytic activity of GFPD proteins.
Альтернативно, на кількісному рівні дані, подібні ріго (значення ріго означає логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 95 ферментативної активності, у молярній концентрації), можуть бути отримані для білка ГФПД згідно з винаходом і зрівняні з егалонною послідовністю ГФПД у присутності або відсутності будь-яких відповідних гербіцидів-інгібіторівAlternatively, on a quantitative level, data similar to Rigo (the value of Rigo means the logarithm of the concentration of inhibitor required to inhibit 50 95 enzymatic activity, in molar concentration) can be obtained for the GFPD protein of the invention and compared to the reference sequence of GFPD in the presence or absence of any - what appropriate inhibitor herbicides
ГФПД.GFPD
Спеціальним, хоча й не обмежуючим, типом аналізу, який може бути використаний для оцінки послідовностей ГФПД згідно з винаходом, є колориметричний аналіз. У цьому аналізі культуральне середовище типу триптон-дріжджового бульйону (У1-ЮОгоїй) з 1 95 агарози, 5 мМ /1-A specific, although not limiting, type of assay that can be used to evaluate GFPD sequences according to the invention is a colorimetric assay. In this assay, a tryptone-yeast broth-type culture medium (U1-UOgoi) with 1 95 agarose, 5 mM /1-
Зо тирозину й 42 мМ сукцинату, що містить селективний агент для вектора ро5Е420 (Іпмігодеп,From tyrosine and 42 mM succinate, containing a selective agent for the vector ro5E420 (Ipmigodep,
Карлерує, Німеччина) або модифіковану версію роЕ420 (р5Е429(ЕІ)МХ), заливають у планшети із глибокими лунками. У кожну лунку вносять культуру Е. соїї в експонентній фазі росту, що містить вектор р5Е420-НРРОХ (НРРОХ означає будь-який ген, що кодує передбачуваний фермент/білок ГФІД). Після 16 годин при 37 "С лунки, що не містять культурального середовища, ті, які були засіяні культурою Е. соїї, що містить порожній вектор рЗЕ420, є прозорими, або ж ті, які були засіяні культурою Е. соїї, що містить вектор РЗЕ420-НРРОХ, що включає ген, який кодує неактивну ГФПД, є прозорими, у той час як лунки, засіяні культурою Е. соїї, що містить вектор РЗЕ420-НРРОХ, що кодує активну ГФПД, є коричневими. Попередньо було показано, що цей тест відображає активність ГФПД, яким би не було джерело цієї активності, і дозволяє ідентифікувати активності ГФПД (05 6,768,044), тобто на якісному рівні.Karlerue, Germany) or a modified version of roE420 (p5E429(EI)MX), poured into tablets with deep wells. Into each well is introduced a culture of E. soya in the exponential phase of growth containing the p5E420-HRPOX vector (HRPOX means any gene encoding a putative GFID enzyme/protein). After 16 hours at 37 °C, wells containing no culture medium, those inoculated with E. soya culture containing the empty rZE420 vector are clear, or those inoculated with E. soya culture containing the RZE420 vector -HRROX, which includes the gene that encodes an inactive GFPD, are clear, while wells inoculated with E. soya culture containing the RZE420-HRROX vector, which encodes an active GFPD, are brown.This test has previously been shown to reflect GFPD activity, whatever the source of this activity may be, and allows identification of GFPD activity (05 6,768,044), that is, at a qualitative level.
Б. Методи внесення мутацій у послідовності ГФПДB. Methods of introduction of mutations in the sequence of HFPD
У мутантному білюу ГФПД, що кодується нуклетсовою кислотою згідно з винаходом, принаймні одна амінокислота була замінена як визначено вище.In the mutant white GFPD encoded by a nucleic acid according to the invention, at least one amino acid has been replaced as defined above.
Заміна може бути здійснена в послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує еталонний ГФПД, як визначено вище, будь-якими засобами, що підходять для заміни у вказаній послідовності кодону, що кодує замінну амінокислоту, кодоном, що відповідає замінюючій амінокислоті; вказані кодони широко описані в літературі й добре відомі фахівцеві.The replacement can be carried out in the nucleic acid sequence encoding the reference GFPD, as defined above, by any means suitable for replacing in the indicated sequence the codon encoding the replacement amino acid with the codon corresponding to the replacement amino acid; the indicated codons are widely described in the literature and are well known to those skilled in the art.
Для досягнення заміни можуть бути використано декілька методів молекулярної біології.Several methods of molecular biology can be used to achieve replacement.
Практичний метод підготовки мутантної послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і відповідного білка включає виконання сайт-направленого мутагенезу кодонів, що кодують одну або більше заздалегідь вибраних амінокислот. Способи одержання таких сайт-направлених мутацій добре відомі фахівцеві й широко описані в літературі (зокрема: Оігесівєй Миїадепевів: АA practical method of preparing a mutant nucleic acid sequence according to the invention and a corresponding protein involves performing site-directed mutagenesis of codons encoding one or more preselected amino acids. The methods of obtaining such site-directed mutations are well known to the expert and are widely described in the literature (in particular: Oigesivei Miiadepeviv: A
Ргасіїса! Арргоасі, 1991, Едйей Бу М.О). Мерпегзоп, ІК РКЕ55), або є методами, для яких можливо використовувати комерційні набори (наприклад, набір для мутагенезу ОШІКСНАМОЕ МRgasiisa! Arrgoasi, 1991, Edye Bu MO). Merpegzop, IR RKE55), or are methods for which it is possible to use commercial kits (for example, the kit for mutagenesis OSHIKSNAMOE M
Ідичепіпд від Оіадеп або Зігаїадепе). Після сайт-направленого мутагенезу не зайво також відібрати клітини, що містять мутантний ГФПД, що є менш чутливим до інгібітора ГФПД, використовуючи відповідний механізм відбору. Відповідні методи відбору для досягнення цієї мети були описані вище.Idychepipd from Oiadepe or Zigaiadepe). After site-directed mutagenesis, it is not superfluous to also select cells containing a mutant HFPD, which is less sensitive to the HFPD inhibitor, using an appropriate selection mechanism. Appropriate selection methods to achieve this goal have been described above.
Альтернативно, послідовність ДНК, що кодує еталонний ГФПД, може бути модифікована іп 60 зійсо так, щоб кодувати білок ГФПД, що містить одну або більше перерахованих тут заміщень, і потім синтезована де помо. Нуклеотидна послідовність, що кодує мутантний білок ГФПД, може бути введена в клітину-хазяїн так, як описано тут в інших розділах.Alternatively, the DNA sequence encoding the reference GFPD can be modified by ip 60 ziso to encode a GFPD protein containing one or more of the substitutions listed here, and then synthesized de pomo. The nucleotide sequence encoding the mutant GFPD protein can be introduced into the host cell as described herein in other sections.
В. Ізольовані полінуклеотиди, їх варіанти й фрагментиB. Isolated polynucleotides, their variants and fragments
У деяких варіантах здійснення даний винахід включає ізольовані або рекомбінантні полінуклеотиди. "Рекомбінантний" полінуклеотид або поліпептид/білок, або його біологічно активна частина, тут визначений як не присутній більше у своєму оригінальному, природному організмі, такий як міститься в гетерологічній клітині-хазяїні або в трансгенній рослинній клітині, насінню або рослині. В одному варіанті здійснення рекомбінантний полінуклеотид є вільним від послідовностей (наприклад, що кодують білок, або регуляторних послідовностей), які природно обрамляють нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розташованих на 5" і 3" кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого взятий полінуклеотид. Термін "рекомбінантний" означає полінуклеотиди або поліпептиди, з якими проводилися маніпуляції стосовно природного полінуклеотиду або поліпептиду, так що полінуклеотид або поліпептид відрізняється (напр., за хімічним складом або структурою) від такого, що зустрічається в природі. В іншому варіанті здійснення "рекомбінантний" полінуклеотид вільний від внутрішніх послідовностей (тобто інтронів), які зустрічаються в природі в геномній ДНК організму, з якого отриманий полінуклеотид. Типовим прикладом такого полінуклеотиду є так звана комплементарна ДНК (кднк). Наприклад, у різних варіантах здійснення ізольований полінуклеотид, що кодує стійкість гербіциду-інгібітора ГФПД, може містити менше, ніж 5 кб, 4 кб,In some embodiments, the present invention includes isolated or recombinant polynucleotides. A "recombinant" polynucleotide or polypeptide/protein, or a biologically active portion thereof, is defined herein as no longer present in its original, native organism, such as found in a heterologous host cell or in a transgenic plant cell, seed, or plant. In one embodiment, the recombinant polynucleotide is free of sequences (eg, protein-coding or regulatory sequences) that naturally frame the nucleic acid (ie, sequences located at the 5" and 3" ends of the nucleic acid) in the genomic DNA of the organism from which taken polynucleotide. The term "recombinant" refers to polynucleotides or polypeptides that have been manipulated with respect to a naturally occurring polynucleotide or polypeptide such that the polynucleotide or polypeptide differs (eg, in chemical composition or structure) from that found in nature. In another embodiment, the "recombinant" polynucleotide is free of internal sequences (ie, introns) that occur naturally in the genomic DNA of the organism from which the polynucleotide is derived. A typical example of such a polynucleotide is the so-called complementary DNA (cDNA). For example, in various embodiments, an isolated polynucleotide encoding GFPD inhibitor herbicide resistance may comprise less than 5 kb, 4 kb,
З кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб або 0,1 кб нуклеотидної послідовності, яка природно обрамляє полінуклеотид у геномній ДНК клітини, з якої отриманий полінуклеотид. Молекули нуклеїнових кислот згідно з винаходом включають ті, які кодують ГФПД згідно з винаходом. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом функціонально зв'язана із промотором, здатним направляти експресію молекули нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні (напр., рослинній клітині-хазяїні або бактеріальній клітині-хазяїні).With kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequence that naturally frames the polynucleotide in the genomic DNA of the cell from which the polynucleotide is derived. Nucleic acid molecules of the invention include those that encode the GFPD of the invention. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the invention is operably linked to a promoter capable of directing expression of the nucleic acid molecule in a host cell (eg, a plant host cell or a bacterial host cell).
Даний винахід також передбачає варіанти й фрагменти будь-якої послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотні послідовності, викладені в будь-якій з 5ЕО ІЮ МО:7-33. "Фрагмент" полінуклеотиду може кодувати біологічно активну частину поліпептиду, або ж це може бути фрагмент, який може бути використаний як гібридизаційний зонд або ПЛР-праймер,The present invention also provides for variants and fragments of any nucleic acid sequence encoding amino acid sequences set forth in any of 5EO IU MO:7-33. A "fragment" of a polynucleotide can encode a biologically active part of a polypeptide, or it can be a fragment that can be used as a hybridization probe or PCR primer,
Зо використовуючи методи, описані тут в інших розділах. Полінуклеотиди, що є фрагментами полінуклеотиду, включають принаймні близько 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 суміжних нуклеотидів, або ж до кількості нуклеотидів, присутнього в описаному тут повнорозмірному полінуклеотиді, залежно від передбачуваного призначення (напр., описана тут нуклеїнова кислота ГФПД). Під "суміжними" нуклеотидами слід розуміти залишки нуклеотидів, розташовані безпосередньо поруч один з одним.Using the methods described in other sections here. Polynucleotides that are polynucleotide fragments include at least about 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 contiguous nucleotides, or up to the number of nucleotides present in the full-length polynucleotide described herein, depending on the intended purpose (eg, the HFPD nucleic acid described herein). "Contiguous" nucleotides should be understood as nucleotide residues located directly next to each other.
Фрагменти полінуклеотидів згідно із запропонованим винаходом у загальному кодують фрагменти поліпептиду, що зберігають біологічну активність повнорозмірного білка стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД; тобто, активність стійкості до гербіциду. Під "збереженням активності стійкості до гербіциду" слід розуміти, що фрагмент має принаймні близько 30 95, принаймні близько 50 95, принаймні близько 70 95, принаймні близько 80 95, 8595, 90 95, 95 95, 100 95, 110965, 125965, 15095, 17595, 200 95, 250 95, принаймні близько 300 95 або більш активності стійкості до гербіциду повнорозмірного білка стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД, викладеного тут як ЗЕО ІЮ МО:7-33. Методи вимірювання активності стійкості до гербіциду добре відомі в даній галузі техніки, а ілюстративні методи описані тут. У необмежуючому прикладі фрагмент згідно з винаходом буде стійким до тієї ж дози гербіциду-інгібітора ГФПД, або буде стійким до дози в 1, в 2, в 3, в 4 раз вище або ще більш високій дозі гербіциду-інгібітора ГФПД, або ж фрагменти будуть такими ж або більш стійкими на основі рібо або Кі між фрагментом і ЗЕО ІЮFragments of polynucleotides according to the proposed invention generally encode fragments of a polypeptide that preserve the biological activity of the full-length protein of resistance to the herbicide-inhibitor GFPD; ie, herbicide resistance activity. By "retaining herbicide resistance activity" is meant that the fragment has at least about 30 95, at least about 50 95, at least about 70 95, at least about 80 95, 8595, 90 95, 95 95, 100 95, 110965, 125965, 15095 , 17595, 200 95, 250 95, at least about 300 95 or more of the herbicide resistance activity of the full-length herbicide resistance protein GFPD inhibitor set forth herein as ZEO IU MO:7-33. Methods for measuring herbicide resistance activity are well known in the art, and illustrative methods are described herein. In a non-limiting example, a fragment according to the invention will be resistant to the same dose of the herbicide-GPD inhibitor, or will be resistant to a dose of 1, 2, 3, 4 times higher or even higher dose of the herbicide-GPD inhibitor, or the fragments will be the same or more stable based on ribo or Ki between the fragment and ZEO IU
МО:7-33.MO:7-33.
Фрагмент полінуклеотиду, що кодує біологічно активну частину поліпептиду згідно з винаходом, кодують принаймні близько 150, 175, 200, 250, 300, 350 суміжних амінокислот, або ж до загальної кількості амінокислот, що присутні в повнорозмірному поліпептиді згідно з винаходом. У необмежуючому прикладі фрагмент полінуклеотиду, що кодує біологічно активну частину білка ГФПД, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕО ІЮ МО:1 і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО: і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений в будь-якій з БЕО ІЮ МО:7-33.A polynucleotide fragment encoding a biologically active part of a polypeptide according to the invention encodes at least about 150, 175, 200, 250, 300, 350 contiguous amino acids, or up to the total number of amino acids present in a full-length polypeptide according to the invention. In a non-limiting example, a fragment of a polynucleotide encoding a biologically active part of a GFPD protein containing a proline at a position corresponding to position 335 5EO IU MO:1 and a phenylalanine or tyrosine at a position corresponding to position 336 5EO IU MO: and, optionally, one or more amino acid substitutions in positions corresponding to positions 188, 189, 200, 215, 226, 339 and 340 of 5EO IU MO:1, including the GFPD protein set forth in any of BEO IU MO:7-33.
Винахід також охоплює варіанти полінуклеотидів, як описано 5ирга. "Варіанти" 60 полінуклеотиду також включають послідовності, що кодують ГФПД згідно з винаходом, однак консервативно відмінні через дегенерацію генетичного коду, а також ті, які є достатньо ідентичними. Варіанти даного винаходу зберігають активність ферменту ГФПД і стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД. Термін "достатньо ідентичні" означає, що послідовність поліпептиду або полінуклеотиду є принаймні на приблизно 53 95, принаймні на приблизно 60 95 або 65 95 ідентичною, на приблизно 70 95 або 75 95 ідентичною, на приблизно 80 95 або 85 95 ідентичною, на приблизно 90 95, 91 95, 92 95, 93 о, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичною в порівнянні з еталонною послідовністю, при використанні однієї із програм вирівнювання зі стандартними параметрами. Фахівцеві буде зрозуміло, що ці значення можуть бути підходящим чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, кодованих двома полінуклеотидами, беручи до уваги дегенерацію кодонів, подібність амінокислот, положення рамки зчитування й т.п.The invention also encompasses variants of polynucleotides as described above. "Variants" of the 60 polynucleotide also include sequences encoding HFPD according to the invention, but conservatively different due to degeneracy of the genetic code, as well as those that are sufficiently identical. Variants of the present invention retain GFPD enzyme activity and resistance to the GFPD inhibitor herbicide. The term "sufficiently identical" means that the polypeptide or polynucleotide sequence is at least about 53 95, at least about 60 95 or 65 95 identical, about 70 95 or 75 95 identical, about 80 95 or 85 95 identical, about 90 95, 91 95, 92 95, 93 o, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Fo, 98 95 or 99 95 identical compared to the reference sequence, when using one of the alignment programs with standard parameters. One skilled in the art will appreciate that these values can be suitably adjusted to determine the respective identity of the polypeptides encoded by the two polynucleotides, taking into account codon degeneracy, amino acid similarity, reading frame position, and the like.
Бактеріальні гени дуже часто мають численні ініціаторні кодони метіоніну близько від початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції на одному або більше із цих стартових кодонів приводить до утворення функціонального білка. Такі стартові кодони можуть включати кодони АТО. Однак бактерії, такі як Васійи5 5р., також розпізнають як стартовий кодонBacterial genes very often have multiple methionine initiation codons close to the start of the open reading frame. Often, initiation of translation at one or more of these start codons results in the formation of a functional protein. Such start codons may include ATO codons. However, bacteria such as Bacilli5 5r also recognize as a start codon
СТО, і білки, що ініціюють трансляцію на кодонах СТО, містять як першу амінокислоту метіонін.STO, and proteins that initiate translation at STO codons, contain methionine as the first amino acid.
Більше того, часто не можна а ргіогі визначити, який із цих кодонів використовується бактеріями в природі. Тому слід розуміти, що використання одного з альтернативних кодонів метіоніну може привести до утворення варіантів, що надають стійкість до гербіцидів. Ці білки стійкості до гербіцидів охоплюються даним винаходом і можуть бути використані в способах згідно із даним винаходом. Що зустрічаються в природі алельні варіанти можуть бути визначені за допомогою добре відомих технік молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і гібридизація, так, як вказано нижче. Варіантні полінуклеотиди також включають полінуклеотиди синтетичного походження, утворені, приміром, з використанням сайт-направлених або інших стратегій мутагенезу, але які усе ще кодують поліпептид, що має бажану біологічну активність.Moreover, it is often impossible to determine which of these codons is used by bacteria in nature. Therefore, it should be understood that the use of one of the alternative methionine codons can lead to the formation of variants that confer resistance to herbicides. These herbicide resistance proteins are encompassed by the present invention and may be used in the methods of the present invention. Naturally occurring allelic variants can be determined using well-known molecular biology techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and hybridization, as described below. Alternative polynucleotides also include polynucleotides of synthetic origin, generated, for example, using site-directed or other mutagenesis strategies, but which still encode a polypeptide having the desired biological activity.
Фахівцеві також зрозуміло, що подальшою мутацією полінуклеотидів згідно з винаходом можуть бути внесені зміни, у такий спосіб приводячи до подальших змін в амінокислотній послідовності кодованих поліпептидів, без зміни біологічної активності поліпептидів. Таким чином, варіанти ізольованих полінуклеотидів можуть бути створені введенням одного або більше додаткових нуклеотидних заміщень, додавань або делецій у відповідний полінуклеотид, що кодує ГФПД згідно з винаходом, так що в кодований поліпептид вводять 1-5, 1-10 або 1-15 заміщень, додавань або делецій амінокислот, або ж 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 заміщень, додавань або делецій амінокислот. Подальші мутації можуть бути введені стандартними техніками, такими як сайт-направлений мутагенез і ПЛР-опосередкований мутагенез, або техніками генної перестановки. Подібні варіанти полінуклеотидів також охоплюються винаходом.It is also clear to an expert that further mutation of polynucleotides according to the invention can make changes, thus leading to further changes in the amino acid sequence of the encoded polypeptides, without changing the biological activity of the polypeptides. Thus, variants of isolated polynucleotides can be created by introducing one or more additional nucleotide substitutions, additions or deletions into the corresponding polynucleotide encoding HFPD according to the invention, so that 1-5, 1-10 or 1-15 substitutions are introduced into the encoded polypeptide, additions or deletions of amino acids, or 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 substitutions, additions or deletions of amino acids. Further mutations can be introduced by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis, or by gene rearrangement techniques. Similar variants of polynucleotides are also covered by the invention.
Варіанти полінуклеотидів можуть бути створені введенням мутацій у випадковому порядку по всій кодуючій послідовності або її частині, таким насичувальний мутагенез або перестановочний мутагенез, і отримані в результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу на здатність надавати активність стійкості до гербіцидів для виявлення мутантів, що зберігають активність.Variants of polynucleotides can be created by randomly introducing mutations in all or part of the coding sequence, such as saturation mutagenesis or permutation mutagenesis, and the resulting mutants can be screened for the ability to confer herbicide resistance activity to identify mutants that retain the activity.
Додаткові способи утворення варіантів включають піддавання клітини, яка експресує описаний тут білок (або їх бібліотеку) спеціальним умовам, що створюють навантаження на активність білка. Спеціальні умови можуть включати (але не обмежуються цим) зміни в температурі, зміни в рН і зміни в концентраціях субстратів або інгібіторів. Бібліотека білків може бути піддана цим умовам протягом часу експресії білка (напр., в Е. соїї або іншому хазяїні) або ж після створення білкового екстракту, або після очищення білка.Additional ways of generating variants include subjecting a cell that expresses the protein described here (or a library thereof) to special conditions that create a stress on the activity of the protein. Special conditions may include (but are not limited to) changes in temperature, changes in pH, and changes in substrate or inhibitor concentrations. The protein library can be subjected to these conditions during the time of expression of the protein (eg, in E. soybean or another host) or after the generation of the protein extract, or after purification of the protein.
Функціональна або ферментативна активність бібліотеки білків, підданої стресовим умовам, потім може бути порівняна з еталонним білком для виявлення білків з поліпшеними властивостями. Це порівняння активностей може виконуватися як частина скринінгу росту або альтернативно як частина ферментативного аналізу, що кількісно визначає активність білка.The functional or enzymatic activity of a protein library exposed to stress conditions can then be compared to a reference protein to identify proteins with improved properties. This comparison of activities can be performed as part of a growth screen or alternatively as part of an enzymatic assay that quantifies protein activity.
Властивості, які можуть бути визначені як поліпшені, можуть включати стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД, зміни в кінетичних константах (включаючи Кт, Кі, Кс), стабільність білка, термостабільність білка або оптимум температури й рН для білка.Properties that may be identified as improved may include resistance to GFAP inhibitor herbicides, changes in kinetic constants (including Kt, Ki, Ks), protein stability, protein thermal stability, or temperature and pH optimum for the protein.
Г. Ізольовані білки, їх варіанти й фрагментиD. Isolated proteins, their variants and fragments
Поліпептиди стійкості до гербіцидів також охоплюються даним винаходом. Поліпептид стійкості до гербіцидів включає препарати поліпептидів, що містять менше, ніж приблизно 30 95, 20 96, 10 95 або 5 95 (за сухою вагою) поліпептиду не-стійкості до гербіцидів (тут і далі також позначається "забруднюючий білок"). У рамках даного винаходу "білок стійкості до гербіцидів" 60 означає описаний тут поліпептид ГФПД. Також надаються його фрагменти, біологічно активні частини й варіанти, які можуть бути використані в практичному втіленні способів згідно із даним винаходом. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" включають фрагменти поліпептиду, що містять частину амінокислотної послідовності, що кодує білок стійкості до гербіцидів і що зберігає активність стійкості до гербіцидів. Біологічно активна частина білка стійкості до гербіцидів може бути поліпептидом довжиною, наприклад, в 10, 25, 50, 100 або більш амінокислот. Подібні біологічно активні частини можуть бути приготовлені техніками рекомбінації й оцінені на активність стійкості до гербіцидів.Herbicide resistance polypeptides are also encompassed by the present invention. A herbicide resistance polypeptide includes polypeptide preparations containing less than about 30 95 , 20 96 , 10 95 , or 5 95 (by dry weight) of a non-herbicide resistance polypeptide (also hereinafter referred to as "contaminant protein"). As used herein, "herbicide resistance protein" 60 refers to the GFPD polypeptide described herein. Also provided are its fragments, biologically active parts and variants that can be used in the practical embodiment of the methods according to the present invention. "Fragments" or "biologically active parts" include fragments of a polypeptide containing a portion of the amino acid sequence that encodes a herbicide resistance protein and that retains herbicide resistance activity. The biologically active part of the herbicide resistance protein can be a polypeptide with a length of, for example, 10, 25, 50, 100 or more amino acids. Similar biologically active parts can be prepared by recombination techniques and evaluated for herbicide resistance activity.
Під "варіантами" слід розуміти білки або поліпептиди, амінокислотна послідовність яких принаймні на приблизно 53 95, 60 95, 65 95, приблизно 70 95, 75 95, приблизно 80 95, 85 Ов, 90 9, 91 Фо, 92 95, 93 о, 94 Фо, 95 Фо, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентична до будь-якої з ЗЕО ІЮ МО:7- 33, при цьому вказаний варіант має ферментативну активність ГФПД і стійкість гербіцидів- інгібіторів ГФПД. Фахівцеві буде зрозуміло, що ці значення можуть бути підходящим чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, кодованих двома полінуклеотидами, беручи до уваги дегенерацію кодонів, подібність амінокислот, положення рамки зчитування й т.п.By "variants" should be understood proteins or polypeptides whose amino acid sequence is at least about 53 95, 60 95, 65 95, about 70 95, 75 95, about 80 95, 85 Ov, 90 9, 91 Fo, 92 95, 93 o , 94 Fo, 95 Fo, 96 95, 97 U, 98 95 or 99 95 is identical to any of the ZEO IU MO:7- 33, while the specified variant has GFPD enzymatic activity and resistance to GFPD inhibitor herbicides. One skilled in the art will appreciate that these values can be suitably adjusted to determine the respective identity of the polypeptides encoded by the two polynucleotides, taking into account codon degeneracy, amino acid similarity, reading frame position, and the like.
Наприклад, консервативні заміщення амінокислот можуть бути зроблені в одному або більше несуттєвих амінокислотних залишків. "Несуттєвий" амінокислотний залишок - це залишок, який може бути змінений в еталонній послідовності поліпептиду без зміни біологічної активності, у той час як "істотний" амінокислотний залишок необхідний для біологічної активності. "Консервативне заміщення амінокислоти" - це заміщення, при якому амінокислотний залишок заміщають залишком, що мають подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислот з подібними бічними ланцюгами визначені в галузі техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (напр., лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (напр., аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (напр., гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (напр., аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (напр., треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (напр., тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин).For example, conservative amino acid substitutions can be made in one or more non-essential amino acid residues. A "non-essential" amino acid residue is a residue that can be changed in the reference sequence of a polypeptide without changing biological activity, while an "essential" amino acid residue is required for biological activity. "Conservative amino acid substitution" is a substitution in which an amino acid residue is replaced by a residue having a similar side chain. Families of amino acids with similar side chains are defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine , tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), and aromatic side chains ( e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
Зо Заміщення амінокислот можуть бути зроблені на неконсервативних ділянках, що зберігають свою функцію. У цілому, подібні заміщення не роблять для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків усередині консервативного мотиву, коли такі залишки істотні для активності поліпептиду. Однак фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні зміни в консервативних залишках.Substitutions of amino acids can be made at non-conservative sites that retain their function. In general, such substitutions are not made for conserved amino acid residues or for amino acid residues within a conserved motif when such residues are essential for the activity of the polypeptide. However, one skilled in the art will appreciate that functional variants may have minor conservative or non-conservative changes in conserved residues.
Також охоплюються антитіла до ГФПД згідно із даним винаходом, або до її варіантів або фрагментів. Методи одержання антитіл добре відомі в даній галузі техніки (див., напр., Нагіом/ апа Гапе (1988) Апіїродієв: А Іарогаюту Мапиаї, Со брііпуд Нагбог Іарогаїогу, Со 5ріїпдAntibodies to GFPD according to the present invention, or to variants or fragments thereof, are also encompassed. Methods for obtaining antibodies are well known in the art (see, e.g., Nagyom/apa Gape (1988) Apiirodiev: A Iarogayutu Mapiai, So briipud Nagbog Iarogaiogu, So 5riipd
Нагбог, МУ; Патент США Мо 4,196,265).Nagbog, MU; US Patent Mo 4,196,265).
Таким чином, один з аспектів винаходу стосується антитіл, одноланцюгових антигензв'язувальних молекул або інших білків, що специфічно зв'язуються з однією або більше молекулою білка або пептиду згідно з винаходом і їх гомологами, химерами або фрагментами.Thus, one aspect of the invention relates to antibodies, single-chain antigen-binding molecules or other proteins that specifically bind to one or more protein or peptide molecules according to the invention and their homologues, chimeras or fragments.
В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, амінокислотна послідовність якого викладена в 5ЕБЕО ІЮ МО:7-33, або його фрагментом. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з химерним білком, що містять амінокислотну послідовність, вибрану з послідовностей, викладених в ЗЕО ІЮ МО:7-33, або її фрагмент. У деяких варіантах здійснення антитіло специфічно зв'язується з ділянкою білка, що відповідає положенням амінокислот 188 і 189 5ЕО ІО МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положеннюIn a particularly preferred embodiment, the antibody specifically binds to the protein, the amino acid sequence of which is set forth in 5EBEO IU MO:7-33, or its fragment. In another embodiment, the antibody specifically binds to a chimeric protein containing an amino acid sequence selected from the sequences set forth in ZEO IU MO:7-33, or its fragment. In some embodiments, the antibody specifically binds to a region of the protein corresponding to amino acid positions 188 and 189 of 5EO IU MO:1, or to a region of the protein corresponding to amino acid position 200 5EO IU MO:1, or to a region of the protein corresponding to the position
БО амінокислоти 215 ЗЕО ІЮ МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положенням амінокислот 335- 340 5ЕО І МО.BO amino acids 215 ZEO IU MO:1, or a section of the protein corresponding to the position of amino acids 335-340 5EO I MO.
Антитіла згідно з винаходом можуть бути використані для кількісного або якісного визначення молекул пептиду або білка згідно з винаходом, або ж для виявлення посттрансляційних модифікацій білків. Тут і далі антитіло або пептид вважається ", що специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду згідно з винаходом, якщо таке зв'язування не інгібується конкурентно присутністю неспоріднених молекул.Antibodies according to the invention can be used for quantitative or qualitative determination of peptide or protein molecules according to the invention, or for detection of post-translational modifications of proteins. Hereinafter, an antibody or peptide is considered to "specifically bind" to a protein or peptide molecule according to the invention, if such binding is not competitively inhibited by the presence of unrelated molecules.
Д. Накопичення генівD. Accumulation of genes
У комерційному виробництві сільськогосподарських культур бажано знищити небажані рослини (тобто "бур'яни" на полі зернових рослин шляхом надійного пестицидного 60 регулювання. Ідеальною обробкою стала б така, яку можна було б застосувати до цілого поля,In commercial crop production, it is desirable to eliminate unwanted plants (i.e., "weeds" in a crop field through reliable pesticide regulation. An ideal treatment would be one that could be applied to an entire field,
але яка знищувала б тільки небажані рослини, не виявляючи впливу на культурні рослини.but which would destroy only unwanted plants without affecting cultivated plants.
Одна з подібних систем обробки включає використання стійких до гербіцидів сільськогосподарських рослин, так що при розпиленні гербіциду над полем гербіцидостійких культур вони продовжують розростатися, у той час як нестійкі до гербіциду бур'яни гинуть або серйозно ушкоджуються. В ідеалі подібні системи обробки повинні користуватися перевагою варіювання властивостей гербіцидів, так що боротьба з бур'янами була б найкращою з можливих комбінацій гнучкості й економії. Наприклад, окремі гербіциди мають різну довговічність у польових умовах, і деякі гербіциди зберігаються і є ефективними протягом відносно довгого часу після застосування на полі, у той час як інші гербіциди швидко розпадаються на інші та/або неактивні сполуки. Ідеальна система обробки дозволила б застосовувати різних гербіцидів, так що виробники могли б підганяти вибір гербіцидів під конкретну ситуацію.One such treatment system involves the use of herbicide-resistant crops, so that when the herbicide is sprayed over a field of herbicide-resistant crops, they continue to grow, while herbicide-resistant weeds are killed or severely damaged. Ideally, such treatment systems should take advantage of the variation in herbicide properties so that weed control is the best possible combination of flexibility and economy. For example, individual herbicides have varying longevity in the field, and some herbicides persist and are effective for a relatively long time after field application, while other herbicides rapidly degrade into other and/or inactive compounds. An ideal treatment system would allow the application of different herbicides, so that growers could tailor the choice of herbicides to the specific situation.
У той час як на сьогоднішній день комерційно доступно деяка кількість гербіцидостійких сільськогосподарських культур, проблемою в застосуванні багатьох комерційних гербіцидів і комбінацій гербіцид/культура є те, що окремі гербіциди звичайно мають неповний спектр активності по відношенню до поширених видів бур'янів. Для більшості окремих гербіцидів, використовуваних уже якийсь час, сталі переважати популяції гербіцидостійких видів і біотипів бур'янів (див., напр., Тгапе!Ї апа Уугідні (2002) М/еєйд 5сіепсе 50: 700-712; Омеп апа 7еїІауа (2005)While a number of herbicide-resistant crops are commercially available today, a problem with the use of many commercial herbicides and herbicide/crop combinations is that individual herbicides usually have an incomplete spectrum of activity against common weed species. For most of the individual herbicides that have been used for some time, populations of herbicide-resistant weed species and biotypes have come to predominate (see, e.g., Tgape!Yi apa Uugidni (2002) M/eyed 5siepse 50: 700-712; Omep apa 7eiIaua (2005 )
Резі Мапад. 5сі. 61: 301-311). Описані трансгенні рослини, стійкі до більше ніж одного гербіциду (див., напр., М/02005/012515). Проте, постійно необхідні вдосконалення в кожному аспекті виробництва сільськогосподарських культур, можливостях боротьби з бур'янами, продовження залишкового контролю бур'янів і поліпшення врожайності зернових.Rezi Mapad. 5 61: 301-311). Transgenic plants resistant to more than one herbicide have been described (see, e.g., M/02005/012515). However, improvements are constantly needed in every aspect of crop production, weed control capabilities, continued residual weed control, and improved grain yields.
Білок ГФПД або нуклеотидна послідовність згідно з винаходом переважно скомбінована в рослинах з іншими генами, що кодують білки або РНК, що надають таким рослинам корисні агрономічні властивості. Серед генів, що кодують білки або РНК, що надають трансформованим рослинам корисні агрономічні властивості, можна згадати послідовності ДНК, що кодують білки, які надають стійкість до одному або більше гербіцидів, які за своєю хімічною структурою відрізняються від гербіцидів-інгібіторів ГФПД, і інш, що надають стійкість до деяких комах, що надають стійкість до деяких хвороб, ДНК, що кодують РНК, що забезпечують боротьбу зThe GFPD protein or the nucleotide sequence according to the invention is preferably combined in plants with other genes encoding proteins or RNAs, which give such plants useful agronomic properties. Among the genes that encode proteins or RNAs that provide useful agronomic properties to transformed plants, we can mention DNA sequences that encode proteins that confer resistance to one or more herbicides that differ in their chemical structure from GFPD-inhibiting herbicides, etc. that provide resistance to some insects, that provide resistance to some diseases, DNA that encodes RNA, that provide the fight against
Зо нематодами або комахами, і т.п.With nematodes or insects, etc.
Подібні гени, зокрема, описані в опублікованих заявках РСТ УМО91/02071 ії М/О95/06128, а також у Патенті США 7,923,602 і Публікації патентної заявки США Мо 20100166723, кожна з яких включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.Similar genes, in particular, are described in published PCT applications UMO91/02071 and M/O95/06128, as well as in US Patent 7,923,602 and US Patent Application Publication No. 20100166723, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, що надають трансформованим рослинним клітинам і рослинам стійкість до певних гербіцидів, можна згадати гени Баг або РАТ, або ген зігеріотусев соеїїсоЇог, описаний в У/О2009/152359, що надає стійкість до глюфозинатних гербіцидів, ген, що кодує підходящу ЕРБР5, що надає стійкість до гербіцидів, метою яких єAmong the DNA sequences that encode proteins that confer resistance to certain herbicides in transformed plant cells and plants, we can mention the Bag or PAT genes, or the Zygeriotus soeiissog gene described in U/O2009/152359 that confers resistance to glufosinate herbicides, a gene that encodes a suitable ERBR5 conferring resistance to targeted herbicides
ЕРБ5БРЗ, таким як гліфозат і його солі (05 4,535,060, 05 4,769,061, 05 5,094,945, 05 4,940,835, 5 5,188,642, 05 4,971,908, 005 5,145,783, Ш5 5,310,667, 05 5,312,910, 005 5,627,061, 5 5,33,435), ген, що кодує гліфозат-н-ацетилтрансферазу (наприклад, 05 8,222,489, 05 8,088,972, 005 8,044,261, 005 8,021,857, 05 8,008,547, 005 7,999,152, 05 7,998,703, 05 7,863,503,ЕРБ5БРЗ, таким як гліфозат і його солі (05 4,535,060, 05 4,769,061, 05 5,094,945, 05 4,940,835, 5 5,188,642, 05 4,971,908, 005 5,145,783, Ш5 5,310,667, 05 5,312,910, 005 5,627,061, 5 5,33,435), ген, що кодує гліфозат -n-acetyltransferase (eg, 05 8,222,489, 05 8,088,972, 005 8,044,261, 005 8,021,857, 05 8,008,547, 005 7,999,152, 05 7,998,703, 05 7,863,503,
ОБ 7,714,188, 005 7,709,702, 5 7,666,644, ОБ 7,666,643, 05 7,531,339, ОБ 7,527,955, і 05 7,405,074), ген, що кодує гліфозатоксидоредуктазу (наприклад, О5 5,463,175).OB 7,714,188, 005 7,709,702, 5 7,666,644, OB 7,666,643, 05 7,531,339, OB 7,527,955, and 05 7,405,074), a gene encoding glyphosate oxidoreductase (eg, О5 5,463,175).
Серед послідовностей ДНК, що кодують підходящу ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРБР5, можна більш конкретно згадати ген, що кодує рослиннуAmong the DNA sequences encoding suitable ERBR5 conferring resistance to herbicides targeting ERBR5, more specifically mention can be made of the gene encoding the plant
ЕРБР5, зокрема ЕРБРБЗ кукурудзи, зокрема ЕРБР5 кукурудзи, що містить дві мутації, зокрема мутацію в положенні амінокислоти 102 і мутацію в положенні амінокислоти 106 (М/О2004/074443), і яка описана в Патентній заявці 05 6566587, тут і далі позначається подвійною мутантною ЕРЗР5 кукурудзи або 2пЕРБ5БР5Б, або ж ген, що кодує ЕРБОР5, ізольовану з Адгорасіегішт і описувану послідовностями ІЮ Мо. 2 і ІЮ Мо. З Патенту США 5,633,435, також позначувану СРА.ERBR5, in particular ERBRBZ of maize, in particular ERBR5 of maize, containing two mutations, in particular a mutation at amino acid position 102 and a mutation at amino acid position 106 (M/O2004/074443), and which is described in Patent Application 05 6566587, is hereinafter referred to as double mutant EPZR5 of maize or 2pERB5BR5B, or the gene encoding ERBOR5, isolated from Adhorasiegisht and described by IU Mo sequences. 2 and IU Mo. From US Patent 5,633,435, also referred to as SRA.
Серед послідовностей ДНК, що кодують підходящу ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРЗР5, можна більш конкретно згадати ген, що кодує ЕРБРЗ СКО23 зAmong the DNA sequences encoding suitable ERBR5 conferring resistance to herbicides targeting ERBR5, one can more specifically mention the gene encoding ERBRZ SKO23 with
Агіпгорасіег діобітогітіх5, але також і мутантні ОКО23 АСЕ1, СКО23 АСЕ2, або СКС23 АСЕЗ, особливо мутанти або варіанти СКОС23 як описано в УУО2008/100353, такі як оКОо23(асе3)К17ЗК 5ЕО ІЮ Мо. 29 в ММО2008/100353.Ahiphorasieg diobitogitih5, but also mutant OKO23 ACE1, SKO23 ACE2, or SKS23 ACEZ, especially mutants or variants of SKOS23 as described in UUO2008/100353, such as oKOo23(ase3)K17ZK 5EO IU Mo. 29 in IMO2008/100353.
У випадку послідовностей ДНК, що кодують ЕРБР5Б, і які зокрема кодують перераховані вище гени, послідовності, яка кодує ці ферменти, переважно передує послідовність, що кодує транзитний пептид, зокрема "оптимізований транзитний пептид", описаний у Патенті США 60 5,510,471 або 5,633,448.In the case of DNA sequences encoding ERBR5B, and which in particular encode the genes listed above, the sequence encoding these enzymes is preferably preceded by a sequence encoding a transit peptide, in particular an "optimized transit peptide" described in US Patent 60 5,510,471 or 5,633,448.
Типові риси стійкості до гербіцидів, які можуть бути скомбіновані з послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, також включають принаймні один інгібітор АЛС (ацетолактатсинтази). (М/О02007/024782); мутантний ген Агарідорзіз АЛС/АГКС (Патент США 6б,855,533); гени, які кодують 2,4-д-монооксигенази, що надають стійкість до 2,4-Ю0 (2,4- дихлорфеноксіоцтової кислоти) шляхом метаболізування (Патент США 6,153,401); і гени, які кодують монооксигенази Юісатра, що надають стійкість до дикамби (3,6б-дихлор-2- метоксибензойної кислоти) шляхом метаболізування (5 2008/0119361 ії 05 2008/0120739).Typical herbicide resistance traits that can be combined with a nucleic acid sequence of the invention also include at least one ALS (acetolactate synthase) inhibitor. (M/O02007/024782); mutant gene Agaridorziz ALS/AGKS (US Patent 6b,855,533); genes that encode 2,4-d-monooxygenases that confer resistance to 2,4-H0 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) by metabolism (US Patent 6,153,401); and genes encoding Juisatra monooxygenases that confer resistance to dicamba (3,6b-dichloro-2-methoxybenzoic acid) by metabolism (5 2008/0119361 and 05 2008/0120739).
У різних варіантах здійснення ГФПД згідно з винаходом зібрана з одним або більше генів стійкості до гербіцидів, включаючи один або більше додаткових генів стійкості до гербіцидів- інгібіторів ГФПД, та/або один або більше генів, стійких до гліфозату та/"або глюфозинату. В одному варіанті здійснення ГФПД згідно з винаходом скомбінована з 2птЕРЗРЗ і Баг.In various embodiments, the GFAP according to the invention is assembled with one or more herbicide resistance genes, including one or more additional genes for resistance to GFAP inhibitor herbicides, and/or one or more genes resistant to glyphosate and/or glufosinate. In one variant implementation of HFPD according to the invention is combined with 2ptERZRZ and Bag.
Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, що стосуються властивостей стійкості до комах, варто згадати білки Ві, широко описані в літературі й добре відомі фахівцям у даній галузі. Також варто згадати білки, виділені з бактерій, таких як Рпоїотптараив (М/097/17432 8Among the DNA sequences encoding proteins related to insect resistance properties, it is worth mentioning the Vi proteins, widely described in the literature and well known to those skilled in the art. It is also worth mentioning the proteins isolated from bacteria, such as Rpoiotptaraiv (M/097/17432 8
МО98/08932).MO98/08932).
Серед таких послідовностей ДНК, що кодують цільові білки, що надають нові властивості стійкості до комах, варто більш конкретно згадати білки Ві Сту або МІР, широко описані в літературі й добре відомі фахівцям у даній галузі. Вони включають білок Стуї1Е або отримані з нього гібриди (напр., гібридні білки Сту1тА-сгу1!Е, описані в 05 6,326,169; 05 6,281,016; 5 6,218,188, або їх токсичні фрагменти), білки типу СтутА або їх токсичні фрагменти, переважно білок Сту1Ас або отримані з нього гібриди (напр., гібридний білок СтутАб-сгуТАс, описаний в О5 5,880,275), або білок СтгутАБ або ВІ2 або їх інсектицидні фрагменти, як описано в ЕР451878, білки Сту2Ає, Сту2Аї або Стгу2Ад як описано в УМО2002/057664 або їх токсичні фрагменти, білокAmong such DNA sequences encoding target proteins conferring novel insect resistance properties, it is worth mentioning more specifically the Wi Stu or MIR proteins, widely described in the literature and well known to those skilled in the art. They include Stu1E protein or hybrids derived from it (e.g. Stu1tA-Sgu1!E hybrid proteins described in 05 6,326,169; 05 6,281,016; 5 6,218,188, or their toxic fragments), StutA-type proteins or their toxic fragments, preferably Stu1Ac protein or hybrids obtained from it (e.g., StutAb-sguTAs hybrid protein described in O5 5,880,275), or StgutAB or VI2 protein or their insecticidal fragments as described in EP451878, Stu2Ae, Stu2Ai or Stgu2Ad proteins as described in UMO2002/057664 or their toxic fragments, protein
СтутА.105, описаний в УУО 2007/140256 (5ЕО ІО Мо. 7) або його токсичний фрагмент, білокStutA.105, described in UUO 2007/140256 (5EO IO Mo. 7) or its toxic fragment, protein
МІРЗАа19 під номером у каталозі МСВІ АВО20428, білок МІРЗАаг0 під номером у каталозі МСВІMIRZAa19 under the catalog number AVO20428, MIRZAag0 protein under the catalog number of the Ministry of Internal Affairs and Communications
АВОС20429 (5ЕО ІЮ Мо. 2 в УМО 2007/142840), білки МІРЗА, які виробляються в подіях бавовниAVOS20429 (5EO IYU Mo. 2 in UMO 2007/142840), MIRZA proteins produced in cotton events
СОТ202 або СОТ203 (МО2005/054479 і ММО2005/054480, відповідно), білюи Сгу як описано вСОТ202 or СОТ203 (МО2005/054479 and ММО2005/054480, respectively), white Sgu as described in
УО2001/47952, білок МІРЗАа або його токсичний фрагмент як описано в Евбігисі і ін. (1996), РгосUO2001/47952, MIRZAa protein or its toxic fragment as described in Evbigis et al. (1996), Rhos
Маї! Асай 5сі 0 5 А. 28:93(11):5389-94 і 05 6,291,156, інсектицидні білки зі штамів ХепопарадивMai! Asai 5si 0 5 A. 28:93(11):5389-94 and 05 6,291,156, insecticidal proteins from Hepoparadiv strains
Зо (як описано в М/О98/50427), Зеїтайна (особливо з 5. епіоторпійа) илиРНоіїогнараив, такі як То- білки з Ріпоїогпарди5 як описано в УУО98/08932 (напр., Умаїегієїй і ін., 2001, Аррі ЕпмігопZo (as described in M/O98/50427), Zeitain (especially from 5. epiothorpia) or RNOiignoraiv, such as Tobelki from Ripoiogparda5 as described in UUO98/08932 (e.g., Umayiegiy et al., 2001, Arry Epmigop
Містобріо!. 67(11):5017-24; Ептепсп-сопвіапі апа Воуеп, 2000, Сеїї Мої Ме з5сі.; 57(5):828-33).Mistobrio!. 67(11):5017-24; Eptepsp-sopviapi apa Woep, 2000, Seiyi Moi Me z5si.; 57(5):828-33).
Також тут включені будь-які варіанти й мутанти будь-якого із цих білків, що відрізняються декількома (1-40, переважно 1-5) амінокислотами від будь-якої з наведених вище послідовностей, особливо послідовності їх токсичного фрагмента, або які злиті із транзитним пептидом, таким як пластидний транзитний пептид або будь-який інший білок або пептид.Also included here are any variants and mutants of any of these proteins that differ by several (1-40, preferably 1-5) amino acids from any of the above sequences, especially the sequence of their toxic fragment, or that are fused to the transit a peptide such as a plastid transit peptide or any other protein or peptide.
У різних варіантах здійснення послідовність ГФІД згідно з винаходом може бути скомбінована в рослинах з одним або більше геном, що надають бажану властивість, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до посух, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, поліпшена живильна цінність, стійкість до хвороб, поліпшений фотосинтез, поліпшена якість волокон, стійкість до стресів, поліпшене розмноження й т.п.In various embodiments, the GFID sequence of the invention can be combined in plants with one or more genes conferring a desired trait, such as herbicide resistance, insect resistance, drought tolerance, nematode control, water use efficiency, nitrogen use efficiency , improved nutritional value, disease resistance, improved photosynthesis, improved fiber quality, stress resistance, improved reproduction, etc.
Особливо корисні трансгенні події, які можуть бути скомбіновані з генами згідно із запропонованим винаходом у рослинах того ж виду (напр., схрещуванням або ретрансформацією рослини, що містить іншу трансгенну подію, з химерним геном згідно з винаходом), включають подію 531/ РУ-СНВКО4 (бавовник, боротьба з комахами, описану вParticularly useful transgenic events that can be combined with genes according to the proposed invention in plants of the same species (eg, by crossing or retransforming a plant containing another transgenic event with a chimeric gene according to the invention) include event 531/ RU-СНВКО4 (cotton, insect control, described in
УМО2002/040677), подію 1143-14А (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану вUMO2002/040677), event 1143-14A (cotton, insect control, not deposited, described in
МО2006/128569); подію 1143-5188 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану вMO2006/128569); event 1143-5188 (cotton, insect control, not deposited, described in
УМО2006/128570); подію 1445 (бавовник, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в Ш5-А 2002-120964 або УМО2002/034946; подія 17053 (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА- 9843, описану в УМО2010/117737); подію 17314 (рис, стійкість до гербіцидам, депоновану якUMO2006/128570); event 1445 (cotton, resistance to herbicides, not deposited, described in Sh5-A 2002-120964 or UMO2002/034946; event 17053 (rice, resistance to herbicides, deposited as PTA-9843, described in UMO2010/117737); event 17314 ( rice, resistance to herbicides, deposited as
РТА-9844, описану в УМО2010/117735); подію 281-24-236 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-6233, описану в УМО2005/103266 або И5-А 2005- 216969); подію 3006-210-23 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-6233, описану в Ш5-А 2007-143876 або УМО2005/103266); подію 3272 (кукурудза, якісна властивість, депонована як РТА-9972, описану в МУМО2006/098952 або О5-А 2006-230473); подію 33391 (пшениця, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-2347, описану в МО2002/027004), подію 40416 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-11508, описану в УМО 11/075593); подію 43А47 (кукурудза, боротьба з 60 комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-11509, описану в МЛО2011/075595);PTA-9844, described in UMO2010/117735); event 281-24-236 (cotton, insect control - resistance to herbicides, deposited as PTA-6233, described in UMO2005/103266 or I5-A 2005-216969); event 3006-210-23 (cotton, insect control - resistance to herbicides, deposited as PTA-6233, described in Sh5-A 2007-143876 or UMO2005/103266); event 3272 (maize, quality property deposited as PTA-9972, described in MUMO2006/098952 or О5-А 2006-230473); event 33391 (wheat, resistance to herbicides, deposited as PTA-2347, described in MO2002/027004), event 40416 (corn, insect control - resistance to herbicides, deposited as ATSS PTA-11508, described in UMO 11/075593); event 43A47 (maize, control of 60 insects - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-11509, described in MLO2011/075595);
подію 5307 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-9561, описану вevent 5307 (maize, insect control, deposited as ATCC PTA-9561, described in
ММО2010/077816); подію А5К-368 (тонконіг, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА- 4816, описану в ШШ5-А 2006-162007 або М/О2004/053062); подію В16 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в О5-А 2003-126634); подію ВРУЗ-СМ127-9 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ Мо. 41603, описану в М/О2010/080829); подію ВІ К1 (олійний рапс, відновлення стерильності чоловічих особин, депоновану як МСІМВ 41193, описану вMMO2010/077816); event A5K-368 (tonconig, resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-4816, described in ShSh5-A 2006-162007 or M/O2004/053062); event B16 (maize, resistance to herbicides, not deposited, described in O5-A 2003-126634); event VRUZ-SM127-9 (soybean, resistance to herbicides, deposited as MSIMV Mo. 41603, described in M/O2010/080829); event VI K1 (rapeseed oil, recovery of male sterility, deposited as МСИМВ 41193, described in
УММО2005/074671), подію СЕ43-67В (бавовник, боротьба з комахами, депоновану як Ю5МUMMO2005/074671), event СЕ43-67В (cotton, insect control, deposited as Ю5М
АСС2724, описану в Ш5-А 2009-217423 або УМО2006/128573); подію СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в И5-А 2010-0024077); подію СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2006/128571); подію СЕ46-0О2А (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2006/128572); подію СОТ102 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в ИШ5-А 2006-130175 абоACC2724, described in Sh5-A 2009-217423 or UMO2006/128573); event CE44-690 (cotton, insect control, not deposited, described in I5-A 2010-0024077); event CE44-690 (cotton, insect control, not deposited, described in UMO2006/128571); event СЕ46-0О2А (cotton, insect control, not deposited, described in UMO2006/128572); event SOT102 (cotton, insect control, not deposited, described in Ш5-А 2006-130175 or
УО2004/039986); подію СОТ202 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5-UO2004/039986); event SOT202 (cotton, insect control, not deposited, described in O5-
А 2007-067868 або УМО2005/054479); подію СОТ203 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2005/054480);); подію ОА521606-3 / 1606 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11028, описану в УМО2012/033794), подію ОА540278 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-10244, описану в М/О2011/022469); подію ОА5З-44406-6 / рорАВ8264.44.06.1 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11336, описану вА 2007-067868 or UMO2005/054479); event SOT203 (cotton, insect control, not deposited, described in UMO2005/054480);); event OA521606-3 / 1606 (soy, resistance to herbicides, deposited as PTA-11028, described in UMO2012/033794), event OA540278 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATSS PTA-10244, described in M/O2011/022469) ; event OA5Z-44406-6 / рорАВ8264.44.06.1 (soybean, resistance to herbicides, deposited as PTA-11336, described in
ММО2012/075426), подію ЮМАБ5Б-14536-7 /ррАВ8291.45.36.2 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11335, описану в ММО2012/075429), подію ОА5-59122-7 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА 11384, описану в О5-А 2006- 070139); подію ЮАБ-59132 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2009/100188); подію РБАБЗБб8416 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-10442, описану в ММО2011/066384 або ММО2011/066360); подію ОР- 098140-6 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8296, описану в О5-А 2009-137395 або УМО 08/112019); подію ОР-305423-1 (соя, якісна властивість, не депоновану, описану в Ш5З-А 2008-312082 або У/О2008/054747); подію ЮР-32138-1 (кукурудза, система гібридизації депоновану як АТСС РТА-9158, описану в И5Б-А 2009-0210970 абоММО2012/075426), event ЮМАБ5Б-14536-7 /прАВ8291.45.36.2 (soybeans, resistance to herbicides deposited as PTA-11335, described in ММО2012/075429), event OA5-59122-7 (corn, insect control - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA 11384, described in O5-A 2006-070139); event YuAB-59132 (maize, insect control - resistance to herbicides, not deposited, described in UMO2009/100188); event RBABZBb8416 (soybean, herbicide resistance, deposited as ATCC PTA-10442, described in IMO2011/066384 or IMO2011/066360); event ОР-098140-6 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATSS PTA-8296, described in О5-А 2009-137395 or UMO 08/112019); event ОР-305423-1 (soy, quality property, not deposited, described in Sh5Z-A 2008-312082 or U/O2008/054747); event YuR-32138-1 (maize, hybridization system deposited as ATSS PTA-9158, described in I5B-A 2009-0210970 or
УМО2009/103049); подію ЮОР-356043-5 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-UMO2009/103049); event YOR-356043-5 (soybean, resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-
Ко) 8287, описану в Ш5-А 2010-0184079 або УМО2008/002872); подію ЕЕ-1 (баклажан, боротьба з комахами, не депоновану, описану в МО 07/091277); подію РІ117 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209031, описану в О5-А 2006-059581 або МО 98/044140); подіюKo) 8287, described in Sh5-A 2010-0184079 or UMO2008/002872); event EE-1 (eggplant, insect control, not deposited, described in MO 07/091277); event RI117 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATSS 209031, described in O5-A 2006-059581 or MO 98/044140); the event
ЕС72 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11041, описану в ММО2011/063413), подіюEC72 (soybean, herbicide resistance, deposited as PTA-11041, described in MMO2011/063413), event
СА21 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС 209033, описану в ШЗ-А 2005- 086719 або УМО 98/044140); подію 5525 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209032, описану в О5-А 2005-188434 або УМО 98/044140); подію СНВ119 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8398, описану в ММО2008/151780); подію ЗНВО614 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-6878, описану в 05-CA21 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATS 209033, described in ShZ-A 2005-086719 or UMO 98/044140); event 5525 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATCC 209032, described in O5-A 2005-188434 or UMO 98/044140); event START119 (cotton, insect control - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-8398, described in ММО2008/151780); event ЗНВО614 (cotton, resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-6878, described in 05-
А 2010-050282 або ММО2007/017186); подію 511 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209030, описану в Ш5-А 2005-188434 або М/098/044140); подію СМ К213 (цукровий буряк, стійкість до вірусів, депоновану як МСІМВ-41601, описану в УМО2010/076212); подію Н7-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ 41158 або МСІМВ 41159, описану в О5-А 2004-172669 або УМО 2004/074492); подію ЗОРІ ІМ1 (пшениця, стійкість до хвороб, не депоновану, описану в О5-А 2008-064032); подію ГІ 27 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ41658, описану в М/О2006/108674 або Ш5-А 2008-320616); подію ГІ 55 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ 41660, описану в УМО 2006/108675 або О5-А 2008-196127); подію ГІсойоп25 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-3343, описану вА 2010-050282 or ММО2007/017186); event 511 (maize, resistance to herbicides, deposited as ATCC 209030, described in Sh5-A 2005-188434 or M/098/044140); event SM K213 (sugar beet, virus resistance, deposited as МСИМВ-41601, described in UMO2010/076212); event H7-1 (sugar beet, resistance to herbicides, deposited as МСИМВ 41158 or МСИМВ 41159, described in О5-А 2004-172669 or UMO 2004/074492); event ZORI IM1 (wheat, disease resistance, not deposited, described in O5-A 2008-064032); event GI 27 (soybean, resistance to herbicides, deposited as МСИМВ41658, described in М/О2006/108674 or Ш5-А 2008-320616); event GI 55 (soybean, resistance to herbicides, deposited as МСИМВ 41660, described in UMO 2006/108675 or О5-А 2008-196127); event GIsoyop25 (cotton, herbicide resistance, deposited as ATCC PTA-3343, described in
УМО2003/013224 або И5-А 2003-097687); подію ГІ КІСЕОб (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 203353, описану в 5 6,468,747 або М/О2000/026345); подію І Ігісеб2 (мал, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 203352, описану в УМО2000/026345), подіюUMO2003/013224 or I5-A 2003-097687); event GI KISEOb (rice, herbicide resistance, deposited as ATCC 203353, described in 5 6,468,747 or M/O2000/026345); event I Igiseb2 (mal, resistance to herbicides, deposited as ATSS 203352, described in UMO2000/026345), event
ГЕКІСЕбОТ1 (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-2600, описану в Ш5-А 2008- 2289060 або УМО2000/026356); подію І 038 (кукурудза, якісна властивість, депонована як АТССHEKISEbOT1 (rice, resistance to herbicides, deposited as ATSS PTA-2600, described in Sh5-A 2008-2289060 or UMO2000/026356); event I 038 (corn, quality property, deposited as ATSS
РТА-5623, описану в И5-А 2007-028322 або УМО2005/061720); подію МІК162 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як РТА-816б6, описану в И5-А 2009-300784 абоPTA-5623, described in I5-A 2007-028322 or UMO2005/061720); event MIK162 (maize, insect control, deposited as PTA-816b6, described in I5-A 2009-300784 or
УМО2007/142840); подію МІКбО4 (кукурудза, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5-UMO2007/142840); event MIKbO4 (maize, insect control, not deposited, described in O5-
А 2008-167456 або УМО2005/103301); подію МОМ15985 (бавовник, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-2516, описану в ШВ-А 2004-250317 або УМО2002/100163); подіюA 2008-167456 or UMO2005/103301); event IOM15985 (cotton, insect control, deposited as ATSS PTA-2516, described in SHV-A 2004-250317 or UMO2002/100163); the event
МОМ810 (кукурудза, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5З-А 2002-102582); подіюIOM810 (corn, insect control, not deposited, described in О5З-А 2002-102582); the event
МОМ863 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-2605, описану в бо УМО2004/011601 або О5-А 2006-095986); подію МОМ87427 (кукурудза, боротьба із запиленням,IOM863 (maize, insect control, deposited as ATSS PTA-2605, described in bo UMO2004/011601 or O5-A 2006-095986); event IOM87427 (maize, pollination control,
депоновану як АТС РТА-7899, описану в УМО2011/062904); подію МОМ87460 (кукурудза, стресостійкість, депоновану як АТСС РТА-8910, описану в МУМО2009/111263 або 0О5-А 2011- 0138504); подію МОМ87701 (соя, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-8194, описану в О5-А 2009-130071 або М/О2009/064652); подію МОМ87705 (соя, якісна властивість - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-9241, описану в И5-А 2010-0080887 абоdeposited as ATS PTA-7899, described in UMO2011/062904); event МОМ87460 (maize, stress tolerance, deposited as ATSS PTA-8910, described in MUMO2009/111263 or 0О5-А 2011-0138504); event IOM87701 (soybean, insect control, deposited as ATCC PTA-8194, described in O5-A 2009-130071 or M/O2009/064652); event MOM87705 (soybean, quality trait - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-9241, described in I5-A 2010-0080887 or
МО2010/037016); подію МОМ87708 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-9670, описану в УМО2011/034704); подію МОМ87712 (соя, урожайність, депоновану як РТА-10296, описану в УМО2012/051199), подію МОМ87754 (соя, якісна властивість, депонована як АТОСMO2010/037016); event IOM87708 (soybean, herbicide resistance, deposited as ATCC PTA-9670, described in UMO2011/034704); event IOM87712 (soybean, yield, deposited as PTA-10296, described in UMO2012/051199), event IOM87754 (soybean, quality trait, deposited as ATOS
РТА-9385, описану в УМО2010/024976); подію МОМ87 769 (соя, якісна властивість, депонована якPTA-9385, described in UMO2010/024976); event IOM87 769 (soybean quality property deposited as
АТОСС РТА-8911, описану в И5-А 2011-0067141 або М/02009/102873); подію МОМ88017 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-5582, описану в ШВ-А 2008-028482 або М/О2005/059103); подію МОМ88913 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-4854, описану в УМО2004/072235 або О5-А 2006-059590); подію МОМ88302 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-10955, описану вATOSS PTA-8911, described in I5-A 2011-0067141 or M/02009/102873); event IOM88017 (maize, insect control - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-5582, described in SHV-A 2008-028482 or M/O2005/059103); event IOM88913 (cotton, resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-4854, described in UMO2004/072235 or O5-A 2006-059590); event MOM88302 (canola oil, herbicide resistance, deposited as PTA-10955, described in
МО2011/153186), подію МОМ88701 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11754, описану в М/О2012/134808), подію МОМ89034 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану якМО2011/153186), event IOM88701 (cotton, herbicide resistance, deposited as PTA-11754, described in M/O2012/134808), event IOM89034 (maize, insect control, deposited as
АТОСС РТА-7455, описану в УМО 07/140256 або 05-А 2008-260932); подію МОМ89788 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-6708, описану в О5-А 2006-282915 абоATOSS RTA-7455, described in UMO 07/140256 or 05-А 2008-260932); event IOM89788 (soybean, herbicide resistance, deposited as ATS PTA-6708, described in O5-A 2006-282915 or
МО2006/130436); подію М511 (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-850 або РТА-2485, описану в М/О2001/031042); подію М58 (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-730, описану вMO2006/130436); event M511 (oil rape, pollination control - resistance to herbicides, deposited as ATS PTA-850 or PTA-2485, described in M/O2001/031042); event M58 (canola oil, pollination control - herbicide resistance, deposited as ATCC PTA-730, described in
УМО2001/041558 або 05-А 2003-188347); подію МКбОЗ (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-2478, описану в О5-А 2007-292854); подію РЕ-7 (рис, боротьба з комахами, не депоновану, описану в М/О2008/114282); подію КЕЗ (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-730, описану в М/О2001/041558 або 0О5-А 2003-188347); подію КТ7З3 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2002/036831 або И5-А 2008-070260); подію ЗУНТОН2 / 5ММ-000Н2-5 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11226, описану в М/О2012/082548), подію Т227-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2002/44407 або Ш5-АUMO2001/041558 or 05-A 2003-188347); the MKbOZ event (maize, resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-2478, described in O5-A 2007-292854); event RE-7 (rice, insect control, not deposited, described in M/O2008/114282); KEZ event (oil rape, pollination control - resistance to herbicides, deposited as ATS PTA-730, described in M/O2001/041558 or 0О5-А 2003-188347); event KT7Z3 (oil rape, resistance to herbicides, not deposited, described in UMO2002/036831 or I5-A 2008-070260); event ZUNTON2 / 5MM-000Н2-5 (soybean, resistance to herbicides, deposited as PTA-11226, described in M/O2012/082548), event T227-1 (sugar beet, resistance to herbicides, not deposited, described in UMO2002/44407 or Sh5-A
Зо 2009-265817); подію Т25 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в О5-А 2001-029014 або УМО2001/051654); подію 7304-40 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8171, описану в ШВ-А 2010-077501 або ММО2008/122406); подію Т342-142 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в М/О2006/1285658); подію ТС1507 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в 0О5-А 2005-039226 або УМО2004/099447); подію МІР1034 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-3925., описану в М/О2003/052073), подію 32316 (кукурудза, боротьба з насекомими-стійкость до гербіцидів, депоновану як РТА-11507, описану в УМО2011/084632), подію 4114 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11506, описану в ММО2011/084621), подію ЕЕ-СМ3З / ЕС72 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11041) необов'язково зібрана с: подія ЕЕ-From 2009-265817); event T25 (maize, resistance to herbicides, not deposited, described in O5-A 2001-029014 or UMO2001/051654); event 7304-40 (cotton, insect control - resistance to herbicides, deposited as ATCC PTA-8171, described in SHV-A 2010-077501 or ММО2008/122406); event T342-142 (cotton, insect control, not deposited, described in M/O2006/1285658); event TC1507 (corn, insect control - resistance to herbicides, not deposited, described in 0О5-А 2005-039226 or UMO2004/099447); event MIR1034 (maize, insect control - herbicide resistance, deposited as ATCC PTA-3925. described in M/O2003/052073), event 32316 (maize, insect control - herbicide resistance, deposited as PTA-11507, described in UMO2011/084632), event 4114 (maize, insect control - resistance to herbicides, deposited as PTA-11506, described in MMO2011/084621), event EE-СМ3З / ЕС72 (soybean, resistance to herbicides, ATS registration number PTA- 11041) optionally collected from: event EE-
СМ1/Л1 27 або подія ЕЕ-СМ2/Л/І.55 (М/О2011/063413А2), подію ЮА5З-68416-4 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-10442, УМО2011/066360А1), подію ЮА5З-68416-4 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-10442, УМО2011/066384А1), подію ОрР- 040416-8 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТСС РТА-11508,СМ1/Л1 27 or event EE-СМ2/Л/И.55 (М/О2011/063413А2), event ЯА5З-68416-4 (soybean, resistance to herbicides, ATS registration number РТА-10442, УМО2011/066360А1), event ЯА5З -68416-4 (soybean, resistance to herbicides, ATCC registration number PTA-10442, UMO2011/066384А1), ОРР event- 040416-8 (corn, insect control, ATCC registration number PTA-11508,
УМО2011/075593А1), подію ЮР-043А47-3 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номерUMO2011/075593А1), event ЮР-043А47-3 (corn, insect control, registration number
АТОСС РТА-11509, ММО2011/075595А1), подію ЮР-004114-3 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТСС РТА-11506, УМО2011/084621А1), подію ОР-032316-8 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТС РТА-11507, УМО2011/084632А1), подію. МОМ- 88302-9 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-10955,ATOSS РТА-11509, ММО2011/075595А1), event ЮР-004114-3 (maize, insect control, registration number АТСС РТА-11506, УМО2011/084621А1), event ОР-032316-8 (corn, insect control, registration number ATS PTA-11507, UMO2011/084632А1), the event. IOM-88302-9 (rapeseed oil, resistance to herbicides, ATCC registration number PTA-10955,
МО2011/153186А1), подію ЮА5-21606-3 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТССМО2011/153186А1), event ЯА5-21606-3 (soybean, resistance to herbicides, registration number ATSS
РТА-11028, УМО2012/033794А2), подію МОМ-87712-4 (соя, якісна властивість, обліковий номерРТА-11028, УМО2012/033794А2), event IOM-87712-4 (soybean, qualitative property, registration number
АТОСС РТА-10296, М/О2012/051199А2), подію ОБАБ5З-44406-6 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11336, УМО2012/075426А1), подію ЮА5-14536-7 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-11335, МО2012/075429А1), подію ЗУМ-000Н2-5 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-11226,ATOSS РТА-10296, M/О2012/051199А2), event OBAB5Z-44406-6 (soybean, accumulated resistance to herbicides, registration number ATS РТА-11336, УМО2012/075426А1), event ЯА5-14536-7 (soybean, accumulated resistance to herbicides, ATCC registration number PTA-11335, МО2012/075429А1), event ZUM-000Н2-5 (soy, resistance to herbicides, ATCC registration number PTA-11226,
УММО2012/082548А2), подію ЮР-061061-7 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, УМО2012071039А1), подію ОР-073496-4 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, И52012131692), подію 8264.44.06.1 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер РТА-11336, УМО2012075426А2), подію 60 8291.45.36.2 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер РТА-11335,UMMO2012/082548А2), event ЮР-061061-7 (oilseed rape, resistance to herbicides, deposit number unavailable, УМО2012071039А1), event ОР-073496-4 (oilseed rape, resistance to herbicides, deposit number unavailable, И52012131692), event 8264.44. 06.1 (soybean, accumulated resistance to herbicides, registration number PTA-11336, UMO2012075426А2), event 60 8291.45.36.2 (soybean, accumulated resistance to herbicides, registration number PTA-11335,
УМО2012075429А2), подію 5МУНТОН2 (соя, обліковий номер АТСС /РТА-11226,UMO2012075429А2), event 5MUNTON2 (soybean, registration number ATSS /РТА-11226,
УМО2012/082548А2), подію МОМ88701 (бавовник, обліковий номер АТСС РТА-11754,UMO2012/082548A2), event МОМ88701 (cotton plant, ATCC registration number РТА-11754,
УМО2012/134808А1), подію КК179-2 (люцерна, обліковий номер АТСС РТА-11833,UMO2012/134808А1), event KK179-2 (alfalfa, registration number ATSS RTA-11833,
МО2013/003558А1), подію ррАВ8264.42.32.1 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11993, МУО2013/010094А1), подію М2ОТО9У (кукурудза, обліковий номерМО2013/003558А1), event прАВ8264.42.32.1 (soybean, accumulated resistance to herbicides, registration number ATS РТА-11993, МУО2013/010094А1), event М2ОТО9У (corn, registration number
АТСС РТА-13025, ММО2013/012775А1).ATCC RTA-13025, ММО2013/012775А1).
Е. Полінуклеотидні конструкціїE. Polynucleotide constructions
Полінуклеотиди поліпептиди, що кодують, ГФПД згідно із запропонованим винаходом, можуть бути модифіковані для одержання або посилення експресії в рослинних клітинах.Polynucleotide polypeptides encoding GFPD according to the proposed invention can be modified to obtain or enhance expression in plant cells.
Полінуклеотиди, що кодують ідентифіковані тут поліпептиди, можуть бути забезпечені в касетах експресії для експресії в рослині, що представляє інтерес. "Рослинна касета експресії" включає конструкцію ДНК, включаючи рекомбінантну конструкцію ДНК, здатну приводити до експресії полінуклеотиду в рослинній клітині. Касета може включати в напрямку транскрипції 5'-3' ділянку ініціації транскрипції (тобто, промотор, зокрема гетерологічний промотор), функціонально з'єднаний з одним або більше потрібних полінуклеотидів, та/або ділянку переривання трансляції й транскрипції (тобто, ділянку переривання), які функціонують у рослинах. Касета також може додатково містити принаймні один додатковий полінуклеотид, що вводиться в організм, такий як ген селективного маркера. Альтернативно, додатковий полінуклеотид (-и) може бути забезпечений у касеті множинної експресії. Подібна касета експресії забезпечена безліччю сайтів рестрикції для вставки полінуклеотиду (-ів) так, щоб він підпадав під регуляцію транскрипції в регуляторних ділянках.Polynucleotides encoding the polypeptides identified here can be provided in expression cassettes for expression in a plant of interest. "Plant expression cassette" includes a DNA construct, including a recombinant DNA construct, capable of leading to the expression of a polynucleotide in a plant cell. The cassette may include, in the 5'-3' direction of transcription, a transcription initiation site (ie, a promoter, particularly a heterologous promoter) operably linked to one or more required polynucleotides, and/or a translation and transcription termination site (ie, a termination site), which function in plants. The cassette may also additionally contain at least one additional polynucleotide introduced into the organism, such as a selectable marker gene. Alternatively, additional polynucleotide(s) may be provided in the multiple expression cassette. Such an expression cassette is provided with many restriction sites for the insertion of polynucleotide(s) so that it is subject to transcriptional regulation in the regulatory regions.
В подальшому варіанті здійснення даний винахід стосується химерного гену, що містить кодуючу послідовність, яка включає гетерологічну нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, функціонально зв'язану з експресованим у рослинах промотором і необов'язково ділянкою переривання транскрипції й поліаденілування. "Гетерологічний" у загальному стосується полінуклеотиду або поліпептиду, що не є ендогенним для клітини або, що не є ендогенним для розташування в природному геномі, у якому він є в наявності, і доданому в клітку шляхом інфекції, трансфекції, микроіїн'єкції, електропорації, мікропроекції або т.п. Під " функціональним зв'язком" мається на увазі функціональний зв'язок між двома полінуклеотидами. Наприклад,In a further embodiment, the present invention relates to a chimeric gene containing a coding sequence that includes a heterologous nucleic acid according to the invention, functionally linked to a plant-expressed promoter and optionally a transcription termination and polyadenylation site. "Heterologous" generally refers to a polynucleotide or polypeptide that is not endogenous to the cell or that is not endogenous to the location in the natural genome in which it is present and that is added to the cell by infection, transfection, microinjection, electroporation, microprojections or the like By "functional linkage" is meant a functional linkage between two polynucleotides. Example,
Зо коли промотор функціонально зв'язаний з послідовністю ДНК, то послідовність промотору ініціює й виступає проміжною ланкою в транскрипції послідовності ДНК. Слід усвідомлювати, що функціонально з'єднані полінуклеотиди можуть бути суміжними, а можуть і не бути, і там, де цей термін використовується для позначення з'єднання двох ділянок, що кодують поліпептид, поліпептиди експресуються в одній і тій же рамці зчитування.Since the promoter is functionally linked to the DNA sequence, the promoter sequence initiates and acts as an intermediate link in the transcription of the DNA sequence. It should be understood that functionally linked polynucleotides may or may not be contiguous, and where this term is used to denote the joining of two regions encoding a polypeptide, the polypeptides are expressed in the same reading frame.
Промотором може бути будь-яка полінуклеотидна послідовність, що демонструє транскрипційну активність в вибраних рослинних клітинах, частинах рослин або рослинах.The promoter can be any polynucleotide sequence that exhibits transcriptional activity in selected plant cells, plant parts, or plants.
Промотор може бути природним або аналогічним, або ж чужорідним і гетерологічним, по відношенню до рослини-хазяїна та/або послідовності ДНК згідно з винаходом. Якщо промотор є "природним" або "аналогічним" по відношенню до рослини-хазяїна, то мається на увазі, що промотор присутній у природній рослині, у яку його вводять. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" по відношенню до послідовності ДНК згідно з винаходом, то мається на увазі, що промотор не є природнім або промотором, що зустрічається в природі, для функціонально зв'язаної з ним послідовності ДНК згідно з винаходом. Промотор може бути індукованим або конститутивним. Він може зустрічатися в природі, бути складеним із частин різних промоторів, що зустрічаються в природі, або ж може бути частково або повністю синтетичним. Посібник із проектування промоторів надає дослідження структури промоторів, такі як в Нагіеу апа Кеупоїд5 (1987) Мисієїс Асійб5 Нев5. 15:2343-2361. Крім того, розташування промотору щодо старту транскрипції може бути оптимізоване. Див., напр., Кобегіз і ін. (1979) Ргос. Май). Асай. сі. ОБ5А, 76:760-764. Для використання в рослинах у цій галузі техніки добре відомі багато підходящих промоторів.The promoter can be natural or analogous, or foreign and heterologous, in relation to the host plant and/or DNA sequence according to the invention. If a promoter is "natural" or "analogous" in relation to the host plant, it is meant that the promoter is present in the native plant into which it is introduced. When a promoter is "foreign" or "heterologous" to a DNA sequence of the invention, it is meant that the promoter is not the natural or naturally occurring promoter of the DNA sequence of the invention operably linked thereto. A promoter can be inducible or constitutive. It may occur in nature, be composed of parts of various naturally occurring promoters, or may be partially or fully synthetic. A guide to promoter design provides studies on the structure of promoters such as in Nagyeu apa Keupoid5 (1987) Misieis Asiib5 Nev5. 15:2343-2361. In addition, the location of the promoter relative to the start of transcription can be optimized. See, for example, Kobegiz and others. (1979) Rhos. May). Asai. si. OB5A, 76:760-764. Many suitable promoters are well known in the art for use in plants.
Наприклад, підходящі конститутивні промотори для використання в рослинах включають: промотори вірусів рослин, таких як промотор каулімовірусу хлоротичної смугастості арахісу (Рсібєм) (Патент США Мо 5,850,019); промотор 355 вірусу мозаїки кольорової капусти (Сату) (оОаеї ї ін. (1985) Маїшге 313:810-812); промотори метилтрансферазних генів вірусу СпПіогейПа (Патент США Мо 5,563,328) і повнорозмірний промотор транскрипції вірусу мозаїки ранника (ЕМУ) (Патент США Ме 5,378,619); промотори таких генів, як рисовий актин (Мсеїгоу і ін. (1990)For example, suitable constitutive promoters for use in plants include: promoters of plant viruses, such as the promoter of peanut chlorotic stripe caulimovirus (Rsibyem) (US Patent Mo 5,850,019); promoter 355 of cauliflower mosaic virus (Satu) (Oaei et al. (1985) Maishge 313:810-812); the promoters of the methyltransferase genes of SpPiogepa virus (US Patent No. 5,563,328) and the full-length transcriptional promoter of morning mosaic virus (EMU) (US Patent No. 5,378,619); promoters of such genes as rice actin (Mseigou et al. (1990)
Ріапі СеїІ 2:163-171 і Патент США Мо 5,641,876); убіквітин (Спгістепзеп і ін. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619-632 і Спгізтепзеп і ін. (1992) Ріапі Мої. Віої. 18:675-689); рети (Гаві і ін. (1991) Тпеог. Аррі.Reapi Sci. 2:163-171 and US Patent No. 5,641,876); ubiquitin (Spgistepzep et al. (1989) Riapi Moi. Vioi. 12:619-632 and Spgiztepzep et al. (1992) Riapi Moi. Vioi. 18:675-689); rety (Gavi et al. (1991) Tpeog. Arri.
Сепеї. 81:581-588); МАЗ (Мекеп і ін. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730 і Патент США Мо 5,510,474); бо гістон НЗ кукурудзи (І ереїй і ін. (1992) Мої. Сеп. Сепеї. 231:276-285 і Агапаззома і ін. (1992) РіапіSepoys 81:581-588); MAZ (Makep et al. (1984) EMVO 3. 3:2723-2730 and US Patent Mo 5,510,474); for histone NZ of maize (I ereii et al. (1992) Moi. Sep. Sepei. 231:276-285 and Agapazzoma et al. (1992) Riapi
У. 2(3):291-300); Вгаззіса пари АІ 53 (РСТ-заявка МУО97/41228); ген малої субодиниці рослинної рибулозо-біскарбоксилази/оксигенази (Кибібхс; цирковірус (А 689 311) або вірус мозаїки прожилок маніоки (Свмітпм, 05 7,053,205); а також промотори різних генів Адгобасіегішт (див.U. 2(3):291-300); Vgazzisa pair AI 53 (PCT application MUO97/41228); the gene for the small subunit of plant ribulose-biscarboxylase/oxygenase (Kibibhs; circovirus (A 689 311) or cassava vein mosaic virus (Svmitpm, 05 7,053,205); as well as the promoters of various Adgobasiegisht genes (see
Патенти США Мо 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; і 5,428,147).US Patent Mo 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; and 5,428,147).
Підходящі індуковані промотори для використання в рослинах включають: промотор із системи АСЕТ, що відповідає на мідь (Мей і ін. (1993) РМАБ 90:4567-4571); промотор гена кукурудзи Іп2, що відповідає на бензенсульфонамідні запобіжники від гербіцидів (НегеПеу і ін. (1991) Мої. Сеп. Сепеїйсв 227:229-237 і Саї» і ін. (1994) Мої. Сеп. Сепеїїс5 243:32-38); а також промотор репрессора Теї з Тп10 (Саї; і ін. (1991) Мої. Сбеп. Сепеї. 227:229-237). Іншим індукованим промотором для використання в рослинах є той, який реагує на індукуючий агент, на який рослини в нормі не реагують. Прикладом індукованого промотору такого типу є індукований промотор гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого індукується гормоном-глюкокортикостероїдом (5спепа і ін. (1991) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 88:10421), або недавнє застосування химерного активатора транскрипції, ХМЕ, для використання в заснованій на рецепторі естрогену індукованої системи експресії в рослинах, що активується естрадіолом (2цо ії ін. (2000) Ріапі 9., 24:265-273). Інші індуковані промотори для використання в рослинах описані в ЕР 332104, РСТ УМО 93/21334 і РСТ УМО 97/06269, які включені в даний опис у повному обсязі шляхом посилання. Можуть бути також використані промотори, складені із частин інших промоторів, і частково або повністю синтетичні промотори. Див., напр., Мі і ін. (1995) Ріапі 9. 7:661-676 і РСТ УМО 95/14098, що описують такі промотори для використання в рослинах.Suitable inducible promoters for use in plants include: a promoter from the copper-responsive ASET system (May et al. (1993) RMAB 90:4567-4571); the promoter of the Ip2 gene of corn, which responds to benzenesulfonamide herbicides (NegePeu et al. (1991) My. Sep. Sep. Sep. 227:229-237 and Sai" et al. (1994) My. Sep. Sep. Sep. 5 243:32-38) ; as well as the promoter of the repressor Tei from Tp10 (Sai; et al. (1991) Moi. Sbep. Sepei. 227:229-237). Another inducible promoter for use in plants is one that responds to an inducing agent to which plants do not normally respond. An example of an inducible promoter of this type is the inducible promoter of a steroid hormone gene, the transcriptional activity of which is induced by a glucocorticosteroid hormone (5spepa et al. (1991) Rhos. Mai!. Asai. 5si. OBA 88:10421), or the recent use of a chimeric transcription activator, HME , for use in an estrogen receptor-based inducible expression system in plants activated by estradiol (2tso et al. (2000) Riapi 9., 24:265-273). Other inducible promoters for use in plants are described in EP 332104, PCT UMO 93/21334 and PCT UMO 97/06269, which are incorporated herein in their entirety by reference. Promoters composed of parts of other promoters and partially or fully synthetic promoters may also be used. See, for example, Mi et al. (1995) Riapi 9. 7:661-676 and PCT UMO 95/14098 describing such promoters for use in plants.
В одному варіанті здійснення даного винаходу для експресії білків ГФПД згідно з винаходом може бути використана послідовність промотору, специфічна для конкретних ділянок або тканин рослин, така як промотори, специфічні для насіння (Оайа, К. і ін., 1997, ВібїесппоіодуIn one embodiment of the present invention, a promoter sequence specific to specific regions or plant tissues, such as seed-specific promoters (Oaya, K. et al., 1997, Vibiespoiodu) may be used to express the GFPD proteins of the invention
Апп. Вем. 3, 269-296), особливо промотор напіну (ЕР 255 378 А1), промотор фазеоліну, промотор глютеніну, промотор геліантиніну (М/092/17580), промотор альбуміну (МУО98/45460), промотор олеозину (ММО98/45461), промотор 5АТІ1 або промотор ЗАТЗ (РСТ/О598/06978).App. Vem. 3, 269-296), especially napin promoter (ER 255 378 A1), phaseolin promoter, glutenin promoter, gelatininin promoter (М/092/17580), albumin promoter (МУО98/45460), oleosin promoter (ММО98/45461), promoter 5ATI1 or ZATZ promoter (PCT/O598/06978).
Також можна використовувати індукований промотор, переважно вибраний з фенілаланінамоніаліази (ФАЛ), НМО-КоА редуктази (НМ), хітинази, глюканази, інгібітораIt is also possible to use an inducible promoter, preferably selected from phenylalanine ammonia-lyase (FAL), NMO-CoA reductase (NM), chitinase, glucanase, inhibitor
Зо протеїнази (ІП), гена сімейства РК1, нопалінсинтази (по5) і промоторів мерВ (005 5 670 349,From proteinase (IP), RK1 family gene, nopaline synthase (po5) and merB promoters (005 5 670 349,
Таблиця 3), промотору НМО2 (05 5 670 349), промотору яблучної бета-галактозидази (ЯБГ1) і промотору яблучної аміноциклопропанкарбоксилатсинтази (Ацк-синтази) (М/098/45445).. У конструкціях згідно з винаходом можуть бути використані численні промотори, у тому числі наступні один за одним.Table 3), the promoter of HMO2 (05 5 670 349), the promoter of apple beta-galactosidase (YABG1) and the promoter of apple aminocyclopropanecarboxylate synthase (Ack-synthase) (M/098/45445).. In the constructions according to the invention, numerous promoters can be used, including the following one after the other.
Промотор може включати, або бути модифікованим так, щоб включати один або більше елементів-енхансерів. У деяких варіантах здійснення промотор може включати безліч елементів-енхансерів. Промотори, що містять елементи-енхансери, забезпечують більш високі рівні транскрипції в порівнянні з промоторами, що їх не містять. Підходящі для використання в рослинах елементи-енхансери включають елемент-енхансер Ресізм (Патент США Мо 5,850,019), елемент-енхансер Сатм 355 (Патент США Мо 5,106,739 і 5,164,316) і елемент-енхансер ЕММ (Майї і ін. (1997) Тгапздепіс Ке5. 6:143-156); активатор трансляції вірусу тютюнової мозаїки (ТММ), описаний у заявці УУО87/07644, або вірусу тютюнового гравірування (ТЕМ), описанихA promoter may include, or be modified to include, one or more enhancer elements. In some embodiments, a promoter may include multiple enhancer elements. Promoters containing enhancer elements provide higher levels of transcription compared to promoters that do not contain them. Suitable enhancer elements for use in plants include the Resism enhancer element (US Patent No. 5,850,019), the Satm 355 enhancer element (US Patent Nos. 5,106,739 and 5,164,316), and the EMM enhancer element (Mayi et al. (1997) Tgapzdepis Ke5. 6 :143-156); activator of translation of tobacco mosaic virus (TMV), described in the application UUO87/07644, or tobacco engraving virus (TEM), described
Сатіпдіоп 4. Егевей 1990, 9. Мігої. 64: 1590-1597, наприклад, або інтронів, таких як інтрон аднп1 кукурудзи або інтрон 1 рисового актину. Див. також РСТ УУО96/23898, МО2012/021794,Satipdiop 4. Egevey 1990, 9. Migoi. 64: 1590-1597, for example, or introns such as the maize adnp1 intron or rice actin intron 1. See also PCT UUO96/23898, MO2012/021794,
УМО2012/021797, ММО2011/084370 і УМО2011/028914.UMO2012/021797, MMO2011/084370 and UMO2011/028914.
Часто подібні конструкції можуть містити 5' і 3' нетрансльовані ділянки. Подібні конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення ко- трансляційного або посттрансляційого транспорту розглянутого пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласти (або інші пластиди), ендоплазматичного ретикулуму або апарата Гольджи, або ж на секрецію. Наприклад, конструкція може бути спроектована таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переходу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Під " сигнальною послідовністю" слід розуміти послідовність, про яку відомо або передбачається, що результатом її дії є ко-трансляційний або посттрансляційний транспорт пептиду через клітинну мембрану. В еукаріотів це звичайно включає секрецію в апарат Гольджи, з деяким результуючим глікозилуванням. Під "лідерною послідовністю" слід розуміти будь-яку послідовність, яка при трансляції дає амінокислотну послідовність, достатню для запуску ко-трансляційного транспорту пептидного ланцюгу в субклітинну органелу. Таким чином, це охоплює лідерні послідовності, націлені на транспорт та/або глікозиловані через перехід в ендоплазматичний ретикулум, перехід у вакуолі, пластиди, включаючи хлоропласти, бо мітохондрії й т.п. Може також виявитися переважним сконструювати рослинну касету експресії,Often, similar structures can contain 5' and 3' untranslated regions. Such constructs may contain a "signal sequence" or "leader sequence" to facilitate co-translational or post-translational transport of the peptide in question to certain intracellular structures, such as chloroplasts (or other plastids), the endoplasmic reticulum or Golgi apparatus, or for secretion. For example, the construct can be designed to contain a signal peptide to facilitate translocation of the peptide into the endoplasmic reticulum. "Signal sequence" should be understood as a sequence known or assumed to result in co-translational or post-translational transport of a peptide across a cell membrane. In eukaryotes this usually involves secretion into the Golgi apparatus, with some resulting glycosylation. "Leader sequence" should be understood as any sequence that, upon translation, provides an amino acid sequence sufficient to initiate co-translational transport of a peptide chain into a subcellular organelle. Thus, this includes leader sequences targeted for transport and/or glycosylated through endoplasmic reticulum transition, vacuole transition, plastids including chloroplasts, mitochondria, etc. It may also be advantageous to construct a plant expression cassette that
що містить інтрон, так що для експресії необхідний процесинг цього інтрона в мрнк.containing an intron, so that expression requires the processing of this intron in mRNA.
Під "3" нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований нижче кодуючої послідовності. Сигнальні послідовності поліаденілування й інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на додавання ділянок поліаденілової кислоти до 3'-кінця прекурсору мрнк, є З'-нетрансльованими ділянками. Під "5" нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований вище кодуючої послідовності.By "3" untranslated region" should be understood the polynucleotide located below the coding sequence. Polyadenylation signal sequences and other sequences encoding regulatory signals capable of influencing the addition of polyadenylic acid regions to the 3'-end of the mRNA precursor are 3'-untranslated regions. By "5" untranslated region" should be understood the polynucleotide located above the coding sequence.
Інші нетрансльовані елементи вище або нижче включають енхансери. Енхансери - це полінуклеотиди, дія яких підсилює експресію ділянки-промотора. Енхансери добре відомі в даній галузі техніки й включають, але не обмежуються ними, ділянку-енхансер 5М40 і ділянку- енхансер 355.Other nontranslated elements upstream or downstream include enhancers. Enhancers are polynucleotides whose action enhances the expression of the promoter region. Enhancers are well known in the art and include, but are not limited to, the 5M40 enhancer site and the 355 enhancer site.
Ділянка переривання може бути властива ділянці ініціації транскрипції, властива послідовності згідно із даним винаходом, або може бути отримана з іншого джерела. Підходящі ділянки переривання є в наявності в Ті-плазміди А. їштегїасієп5, такі як ділянки переривання октопінсинтази й нопалінсинтази. Див. також Сиегіпеаи і ін. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144;The interruption site may be inherent to the transcription initiation site, inherent to the sequence according to the present invention, or may be derived from another source. Suitable termination sites are available in A. yshtegiasiep5 Ti-plasmids, such as octopine synthase and nopaline synthase termination sites. See also Siegipeai and others. (1991) Mine. Sept. Sepoys 262:141-144;
Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп і ін. (1991) Сепе5 Оем. 5:141-149; Модеп і ін. (1990)Rgotsagooi (1991) Sei! 64:671-674; Zapiasop and others. (1991) Sepe5 Oem. 5:141-149; Modep and others. (1990)
Ріапі СеїІ 2:1261-1272; Мипгое і ін. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїазх і ін. (1989) Мисіевїс Асід5 Кезв. 17:7891-7903; дов5пПі і ін. (1987) Мисієїс Асіа Кез. 15:9627-9639; і Європейську патентну заявку ЕР 0 633 317 АТ.Riapi SeiI 2:1261-1272; Mypgoe and others. (1990) Sep 91:151-158; Vaiazh and others. (1989) Mysiewis Asid5 Kezv. 17:7891-7903; dov5pPi, etc. (1987) Mysieis Asia Kez. 15:9627-9639; and the European patent application EP 0 633 317 JSC.
В одному з аспектів винаходу синтетичні послідовності ДНК проектують для заданого поліпептиду, такого як поліпептиди згідно з винаходом. Експресія відкритої рамки зчитування синтетичної послідовності ДНК у клітині приводить до вироблення поліпептиду згідно з винаходом. Синтетичні послідовності ДНК можуть бути корисні для простого усунення небажаних сайтів рестрикції ендонуклеаз, для сприяння стратегіям клонування ДНК, для зміни або усунення будь-якого потенційного зсуву кодонів, для зміни або поліпшення вмісту ГЦ, для усунення або зміни альтернативних рамок зчитування, та/або для усунення або зміни сайтів розпізнавання сплайсингу інтронів/екзонів, сайтів поліаденілування, послідовностей Шайна-In one aspect of the invention, synthetic DNA sequences are designed for a given polypeptide, such as the polypeptides of the invention. Expression of the open reading frame of the synthetic DNA sequence in the cell leads to the production of the polypeptide according to the invention. Synthetic DNA sequences may be useful for simple elimination of unwanted restriction endonuclease sites, for facilitating DNA cloning strategies, for altering or eliminating any potential codon shift, for altering or improving GC content, for eliminating or altering alternative reading frames, and/or for elimination or changes of intron/exon splicing recognition sites, polyadenylation sites, Shine sequences
Дальгарно, небажаних елементів-промоторів і т.п., які можуть бути присутні у нативній послідовності ДНК. Можливо також використання синтетичних послідовностей ДНК для введення інших поліпшень у послідовність ДНК, таких як введення інтронної послідовності,Dalgarno, unwanted promoter elements, etc., which may be present in the native DNA sequence. It is also possible to use synthetic DNA sequences to introduce other improvements into the DNA sequence, such as introducing an intronic sequence,
Зо створення послідовності ДНК, яка експресується як злитий білок до націлених на органели послідовностям, таким як транзитні пептиди хлоропластів, націлені на апопласти/вакуолі пептиди, або пептидні послідовності, що приводять до утримання результуючого пептиду в ендоплазматичному ретикулумі. Синтетичні гени можуть також бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для поліпшеної експресії, або можуть бути синтезовані з використанням кодонів із частотою, переважною для хазяїна. Див., наприклад, СатрбеїЇ апа Сзом/угі (1990) Ріапі РпузхіоЇ. 92:1-141; Патенти США Мо 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; і 5,436,391, опубліковані патентні заявки США Мо 20040005600 і 20010003849, і Мигау і ін. (1989) Мисівїс Асійд5 Кев5. 17:477-498, включені в даний опис за допомогою посилання.From the creation of a DNA sequence that is expressed as a fusion protein to organelle-targeted sequences such as chloroplast transit peptides, apoplast/vacuole-targeted peptides, or peptide sequences that result in retention of the resulting peptide in the endoplasmic reticulum. Synthetic genes can also be synthesized using host-preferred codons for improved expression, or can be synthesized using host-preferred codons. See, for example, Satrbeiyi apa Szom/ugi (1990) Riapi RpuzhioY. 92:1-141; US Patent Mo 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; and 5,436,391, published US patent applications Moe 20040005600 and 20010003849, and Mygau et al. (1989) Mysivys Asiyd5 Kev5. 17:477-498, incorporated herein by reference.
В одному з варіантів здійснення цільові полінуклеотиди для експресії націлені на хлоропласт. У цьому способі, якщо цільовий полінуклеотид не вводиться прямо в хлоропласт, то касета експресії додатково містить полінуклеотид, що кодує транзитний пептид, для напрямку цільового нуклеотиду в хлоропласти. Подібні транзитні пептиди відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неїі/|пе і ін. (1991) Ріапі Мої. Віої!. Нер. 9:104-126; СіагкК і ін. (1989) 9.In one embodiment, the target polynucleotides for expression are targeted to the chloroplast. In this method, if the target polynucleotide is not directly introduced into the chloroplast, the expression cassette additionally contains a polynucleotide encoding a transit peptide to direct the target nucleotide into the chloroplast. Similar transit peptides are known in the art. See, for example, Mop Neii/|pe and others. (1991) Riapi Moi. Cheers! Ner. 9:104-126; SiagkK and others. (1989) 9.
ВіоІ. Снет. 264:17544-17550; РеїІа-сіорра і ін. (1987) Ріапі Рпузіо!. 84:965-968; Коптег і ін. (1993)VioI. Snet 264:17544-17550; Reiia-siorra and others. (1987) Riapi Rpuzio!. 84:965-968; Kopteg and others. (1993)
Віоспет. Віорпуз. Ве5. Соттип. 196:1414-1421; ії Пан і ін. (1986) Зсіепсе 233:478-481.Viospet. Viorpuz. Be5. Sottype 196:1414-1421; and Pan and others. (1986) Zsiepse 233:478-481.
Цільові полінуклеотиди, що направляються в хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропласті з урахуванням різниці у використанні кодонів у рослинному ядрі й цієї органелі. Таким способом цільові полінуклеотиди можуть бути синтезовані з використанням переважних для хлоропластів кодонів. Див., наприклад, Патент США Мо 5,380,831, включений у даний опис за допомогою посилання.Target polynucleotides directed to the chloroplast can be optimized for expression in the chloroplast, taking into account the difference in codon usage in the plant nucleus and this organelle. In this way, target polynucleotides can be synthesized using codons preferred for chloroplasts. See, for example, US Patent No. 5,380,831, incorporated herein by reference.
Така рослинна касета експресії може бути введена у вектор трансформації рослини. Під "вектором трансформації" слід розуміти молекулу ДНК, що робить можливою трансформацію клітини. Подібна молекула може складатися з однієї або більше касет експресії й може бути організована в більше ніж одну векторну молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори - це вектори трансформації рослин, що використовують два несуміжні вектори ДНК для кодування всіх необхідних цис- і транс-діючих функцій для трансформації рослинних клітин (НеїЇеп5 апаSuch a plant expression cassette can be introduced into a plant transformation vector. A "transformation vector" should be understood as a DNA molecule that makes cell transformation possible. Such a molecule may consist of one or more expression cassettes and may be organized into more than one vector DNA molecule. For example, binary vectors are plant transformation vectors that use two non-contiguous DNA vectors to encode all the necessary cis- and trans-acting functions for the transformation of plant cells (NeiYep5 apa
МийПпеаих (2000) Ттепав іп Ріапі Осіепсе 5:446-451). "Вектор" означає полінуклеотидну конструкцію, розроблену для переносу між різними клітинами-хазяїнами. "Вектор експресії" бо означає вектор, що має здатність включати, інтегрувати й експресувати гетерологічну послідовність ДНК або її фрагменти в чужорідній клітині.MiiPpeaih (2000) Ttepav ip Riapi Osiepse 5:446-451). "Vector" means a polynucleotide construct designed for transfer between different host cells. "Expression vector" means a vector capable of including, integrating and expressing a heterologous DNA sequence or its fragments in a foreign cell.
Вектор трансформації рослини містить один або більше вектор ДНК для досягнення трансформації рослини. Наприклад, загальноприйнятою практикою в даній галузі техніки є використання векторів трансформації рослини, що містять більш ніж один суміжний сегментA plant transformation vector contains one or more DNA vectors to achieve plant transformation. For example, it is common practice in the art to use plant transformation vectors that contain more than one contiguous segment
ДНК. Ці вектори часто позначаються як бінарні вектори. Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найбільш часто використовуються для опосередкованої Адгобасієгійт трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, що потрібні для досягнення ефективної трансформації, дуже великі, і вигідно розділяти функції на окремі молекули ДНК. Бінарні вектори звичайно містять плазмідний вектор, що містить цис-діючі послідовності, необхідні для переносу Т-ДНК (такі як лівий прикордонний район і правий прикордонний район), селективний маркер, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, і "цільовий полінуклеотид" (полінуклеотид, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, для якої бажано створення трансгенних рослин). Також у цьому плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для бактеріальної реплікації. Цис-діючі послідовності розташовані так, щоб дозволити ефективний трансфер у рослинні клітини й експресію в них. Наприклад, послідовність селективного маркера й цільова послідовність розташовані між лівим і правим прикордонними районами. Часто другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, що виконують роль проміжної ланки в переносі Т-ДНК із Адгорасіегішт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить функції вірулентності (гени Міг), що роблять можливим інфікування рослинних клітинDNA. These vectors are often denoted as binary vectors. Binary vectors, like vectors with helper plasmids, are most often used for Adgobasiegiit-mediated transformation, where the size and complexity of the DNA segments required to achieve efficient transformation is very large and it is advantageous to separate the functions into individual DNA molecules. Binary vectors typically contain a plasmid vector containing cis-acting sequences required for T-DNA transfer (such as a left border region and a right border region), a selectable marker designed to be expressed in a plant cell, and a "targeting polynucleotide" (polynucleotide , designed with the possibility of expression in a plant cell, for which it is desirable to create transgenic plants). This plasmid vector also contains sequences necessary for bacterial replication. The cis-acting sequences are arranged to allow efficient transfer into and expression in plant cells. For example, the selectable marker sequence and the target sequence are located between the left and right border regions. Often, the second plasmid vector contains trans-acting factors that play the role of an intermediate link in the transfer of T-DNA from Adhorasiegisht to plant cells. This plasmid often contains virulence functions (Mig genes) that make it possible to infect plant cells
Адгорасіегішт, і перенос ДНК шляхом розщеплення на прикордонних послідовностях і міг- опосередкований перенос ДНК, як це розуміють у даній галузі техніки (НеїПеп5 апа МийПпеаих (2000) Тгєпавз іп Ріапі бсієпсе, 5:446-451). Для трансформації рослин можуть бути використано декілька типів штамів Адгобасіегішт (напр., І ВА4404, 5МУЗ3101, ЕНА1ТО1, ЕНАТО5, ії т.д.) Другий плазмідний вектор не є необхідним для введення полінуклеотидів у рослини іншими методами, такими як мікропроекція, мікроін'єкція, електропорація, полієтиленгліколь і т.д.Adhorasiegisht, and DNA transfer by cleavage at border sequences and mig-mediated DNA transfer, as understood in the art (NeiPep5 apa MiiPpeaih (2000) Tgepavz ip Riapi bsiepse, 5:446-451). Several types of Adgobasiegisht strains can be used for plant transformation (eg, I BA4404, 5MUZ3101, ЕНА1ТО1, ЕНАТО5, etc.) The second plasmid vector is not necessary for the introduction of polynucleotides into plants by other methods, such as microprojection, microinjection , electroporation, polyethylene glycol, etc.
Є. Трансформація рослинE. Transformation of plants
Способи згідно з винаходом включають введення нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" слід розуміти презентацію нуклеотидної конструкції рослині таким способом, що згадана конструкція одержує доступ усередину клітини рослини. Способи згідно з винаходом неMethods according to the invention include introducing a nucleotide construct into a plant. By "introduction" is meant the presentation of a nucleotide construct to a plant in such a way that said construct gains access to the interior of a plant cell. The methods according to the invention do not
Зо вимагають використання особливого методу для введення нуклеотидної конструкції в рослину, тільки того, щоб нуклеотидна конструкція одержала доступ усередину принаймні однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструкцій у рослини відомі в даній галузі, включаючи, але не обмежуючись або, методи стабільної трансформації, тимчасової трансформації й опосередковані вірусами методи. Див., наприклад, способи трансформації рослинних клітин і регенерації рослин, описані в: 05 4,459,355, 5 4,536,475, 5 5,464,763, 05 5,177,010, 005 5,187,073, ЕР 267,159 АТ, ЕР 604 662 АТ, ЕР 672 752 АТ, 5 4,945,050, 05 5,036,006, 005 5,100,792, 05 5,371,014, 005 5,478,744, 005 5,179,022, 05 5,565,346, 05 5,484,956, 05 5,508,468, 05 5,538,877, 05 5,554,798, 05 5,489,520, 05 5,510,318, 05 5,204,253, 05 5,405,765, ЕР 442 174 АТ, ЕР 486 233 АТ, ЕР 486 234 АТ, ЕР 539 563 АТ, ЕР 674 725 А1,These require the use of a special method for introducing the nucleotide construct into the plant, only that the nucleotide construct gains access to at least one cell of the plant. Methods for introducing nucleotide constructs into plants are known in the art, including, but not limited to, stable transformation, transient transformation, and virus-mediated methods. See, for example, methods of transformation of plant cells and plant regeneration, described in: 05 4,459,355, 5 4,536,475, 5 5,464,763, 05 5,177 , 005 5,100,792, 05 5,371,014, 005 5,478,744, 005 5,179,022, 05 5,565,346, 05 5,484,956, 05 5,508,468, 05 5,538,877, 05 5,554,798, 05 5,489,520, 05 5,510,318, 05 5,204,253, 05 5,405,765, ЕР 442 174 АТ, ЕР 486 233 АТ, ER 486 234 JSC, ER 539 563 JSC, ER 674 725 A1,
МО91/02071, М/О95/06128 і М/О2011/095460, кожний з який включений у даний опис шляхом посилання, особливо відносно описаних методів трансформації.MO91/02071, M/O95/06128 and M/O2011/095460, each of which is incorporated herein by reference, particularly with respect to the described transformation methods.
У цілому методи трансформації рослин включають перенос гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (напр., незрілі або зрілі ембріони, суспензійні культури, недиференційваний калус, протопласти і т.д.), за яким іде застосування максимального граничного рівня підходящого селектора (залежно від гена селективного маркера) для виділення трансформованих клітин рослин з нетрансформованої клітинної маси. Експлантати звичайно переносять у таке ж свіже середовище й культивують у плановому порядку. Після цього трансформовані клітини диференціюють у паростки після поміщення в регенераційне середовище з додаванням максимального граничного рівня селективного агента. Паростки потім переносять на селективне середовище для вкорінення з метою одержання вкоріненого паростка або саджанця. Трансгенні саджанці потім вирощують до зрілих рослин і збирають схожі насіння (напр., Нієї і ін. (1994) Те Ріапі доигпа! 6:271-282; Ібпіда їі ін. (1996) МаїшгеIn general, methods of plant transformation include the transfer of heterologous DNA into target plant cells (e.g., immature or mature embryos, suspension cultures, undifferentiated callus, protoplasts, etc.), followed by the application of the maximum threshold level of a suitable selector (depending on the selective gene marker) to isolate transformed plant cells from untransformed cell mass. Explants are usually transferred to the same fresh medium and cultured as planned. After that, the transformed cells are differentiated into sprouts after being placed in a regeneration medium with the addition of the maximum limiting level of the selective agent. The sprouts are then transferred to a selective rooting medium to produce a rooted sprout or seedling. The transgenic seedlings are then grown to mature plants and similar seeds are harvested (eg, Nyei et al. (1994) Te Riapi doigpa! 6:271-282; Ibpida et al. (1996) Maishge
Віотесппоїоду 14:745-750). Експлантати звичайно переносять у таке ж свіже середовище й культивують у плановому порядку. Загальний опис технік і методів створення трансгенних рослин можна знайти в Ауге5 апа Рагк (1994) Стйіса! Кеміему5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 апаViotesppoiodu 14:745-750). Explants are usually transferred to the same fresh medium and cultured as planned. A general description of the techniques and methods of creating transgenic plants can be found in Auge5 apa Ragk (1994) Styisa! Kemiemu5 ip Riapi Zsiepse 13:219-239 apa
Воттіпепі апа дашнаг (1997) Маудіса 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, то в будь-якій частині, що цільового калусу, що піддається обробці, або тканині або групі клітин присутні як трансформовані, так і нетрансформовані клітини. Здатність убивати нетрансформовані клітини й дозволяти трансформованим клітинам розростатися приводить до бо трансформованих культур рослин. Часто здатність забирати нетрансформовані клітини є обмеженням швидкого виділення трансформованих клітин і успішного створення трансгенних рослин. Для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного цільового гена в геномі трансгенного рослини можуть бути використані молекулярні й біохімічні методи.Wottipepi apa dashnag (1997) Maudisa 42:107-120. Since the transformed material contains many cells, both transformed and non-transformed cells are present in any part of the target callus to be treated, or tissue or group of cells. The ability to kill untransformed cells and allow transformed cells to grow leads to transformed plant cultures. Often, the ability to harvest untransformed cells is a limitation to the rapid isolation of transformed cells and the successful creation of transgenic plants. Molecular and biochemical methods can be used to confirm the presence of an integrated heterologous target gene in the genome of a transgenic plant.
Створення трансгенних рослин може бути виконано одним або декількома методами, включаючи, але не обмежуючись, введення гетерологічної ДНК у клітини рослин за допомогоюGeneration of transgenic plants can be accomplished by one or more methods, including, but not limited to, introducing heterologous DNA into plant cells using
Адгорасієгішт (Аагорасієгійт-опосередкована трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, прикріпленої до частинок, і різні інші прямі або опосередковані методи переносу ДНК без участі частинок (напр., Ніеєї і ін. (1994) Тпе Ріапі ота! 6:271-282; ІзПпіда і ін. (1996) Маїшге Віоїесппоїоду 14:745-750; Ауге5 апа Раїк (1994)Adgorasiegiist (Agorasiegiit-mediated transformation), bombardment of plant cells with heterologous foreign DNA attached to particles, and various other direct or mediated methods of DNA transfer without the participation of particles (eg, Nieei et al. (1994) Tpe Riapi ota! 6:271- 282; IzPpida et al. (1996) Maishge Vioyesppoiodo 14:745-750; Auge5 apa Raik (1994)
Стіса! Вемівемув іп Ріапі 5сіепсе 13:219-239; Воттіпепі апа дашйНаг (1997) Маудіса 42:107-120)Stisa! Vemivemuv ip Riapi 5siepse 13:219-239; Vottipepi apa dashiNag (1997) Maudisa 42:107-120)
Методи трансформації хлоропластів відомі в даній галузі техніки. Див., напр., змаб і ін. (1990) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 87:8526-8530; 5маб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 90:913-917; мав апа Маїїда (1993) ЕМВО 4). 12:601-606. Метод заснований на доставці ДНК, що містить селективний маркер, за допомогою генної гармати, і націлюванні ДНК на пластидний геном через гомологічну рекомбінацію. Крім того, трансформація пластид може бути виконана трансактивацією мовчазного стійкого пластидою трансгену шляхом переважної тканинної експресії ядернокодованої пластидонаправленої РНК-полімерази. Про таку систему повідомлялося в Мебгіае і ін. (1994) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 91:7301-7305.Methods of chloroplast transformation are known in the art. See, for example, zmab, etc. (1990) Rhos. Mai! Asad si. BOTH 87:8526-8530; 5mab apa Mayida (1993) Rhos. Mai). Asad bsi BOTH 90:913-917; had apa Mayida (1993) EMVO 4). 12:601-606. The method is based on the delivery of DNA containing a selectable marker using a gene gun and the targeting of the DNA to the plastid genome through homologous recombination. In addition, plastid transformation can be performed by transactivation of a silent plastid-resistant transgene by preferential tissue expression of a nuclear-encoded plastid-directed RNA polymerase. Such a system was reported in Mebgiae et al. (1994) Rgos. May Asai. 5 BOTH 91:7301-7305.
Трансформовані рослинні клітини можуть бути вирощені до рослин згідно зі стандартними методиками. Див., напр., МеосоптіскК і ін. (1986) Ріапі Сеї! Керогів 5:81-84. Ці рослини можуть бути вирощені й обпилені таким же трансформованим штамом або іншими штамами, з одержанням гібриду, що має конститутивну експресію бажаної фенотипічної характеристики.Transformed plant cells can be grown into plants according to standard techniques. See, for example, MeosoptiskK and others. (1986) Riapi Sei! Kerogov 5:81-84. These plants can be grown and pollinated with the same transformed strain or other strains to produce a hybrid that has constitutive expression of the desired phenotypic characteristic.
Можуть бути вирощено два або більш поколінь, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипічної характеристики стабільно підтримується й успадковується, а потім можуть бути зібрані насіння для того, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипічної характеристики досягнута. Таким способом даний винахід надає трансформоване насіння (також позначається "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію згідно з винаходом, наприклад, касету експресії згідно з винаходом, стабільно включену в геном. У різних варіантах здійснення насіння може бути покрите принаймні одним фунгіцидом та/або принаймні одним інсектицидом,Two or more generations may be grown to ensure that expression of the desired phenotypic characteristic is stably maintained and inherited, and then seeds may be harvested to ensure that expression of the desired phenotypic characteristic is achieved. In this way, the present invention provides a transformed seed (also referred to as a "transgenic seed") containing a nucleotide construct according to the invention, for example, an expression cassette according to the invention, stably incorporated into the genome. In various embodiments, the seed may be coated with at least one fungicide and/or at least one insecticide,
Ко) принаймні одним гербіцидом, та/або принаймні одним запобіжником, або будь-якою їх комбінацією.Co) with at least one herbicide, and/or at least one preservative, or any combination thereof.
Ж. Оцінка трансформації рослинZh. Assessment of plant transformation
Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у клітини рослин трансформацію або інтегрування гетерологічного гена в геном рослини підтверджують різними методами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків і метаболітів, пов'язаних з інтегрованим геном.After the introduction of heterologous foreign DNA into plant cells, the transformation or integration of the heterologous gene into the plant genome is confirmed by various methods, such as the analysis of nucleic acids, proteins and metabolites associated with the integrated gene.
Швидким способом скринінгу трансформованих клітин, тканин або паростків на присутність включеного гена на ранній стадії перед пересадженням у грунт є ПЛР-аналіз (Затбгоок апаA quick method of screening transformed cells, tissues or sprouts for the presence of the included gene at an early stage before transplanting into the soil is PCR analysis (Zatbgook apa
Виззеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї (Соїд 5ргіпд Натог І арогаїогу Ргев5, Соїа зргіпд Нагброг, МУ)). ПЛР виконують, використовуючи олігонуклеотидні праймери, специфічні для цільового гена, або векторний фон Адгобрасіегіцт і т.п.Wizzy! (2001). PCR is performed using oligonucleotide primers specific for the target gene, or the vector background Adgobrasiegist, etc.
Трансформація рослин може бути підтверджена саузерн-блот-аналізом геномної ДНК (ЗатргооК апа Киззеї! (2001) зирга). У цілому, загальну ДНК екстрагують із трансформанту, розщеплюють за допомогою підходящих ферментів-рестриктаз, фракціонують в агарозному гелі й переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрана або "блот" потім може бути зондована, наприклад, міченим радіоактивним ЗР фрагментом цільової ДНК для підтвердження включення введеного гена в геном рослини відповідно до стандартних методик (ЗатбгоокК апа Риззеї, 2001, зирга).Plant transformation can be confirmed by Southern blot analysis of genomic DNA (ZatrgooK apa Kizzei! (2001) zirga). In general, total DNA is extracted from the transformant, cleaved with suitable restriction enzymes, fractionated in an agarose gel, and transferred to a nitrocellulose or nylon membrane. The membrane or "blot" can then be probed, for example, with a radioactive ZR-labeled fragment of the target DNA to confirm the incorporation of the introduced gene into the plant genome according to standard techniques (ZatbgookK apa Rizzei, 2001, zirga).
У нозерн-аналізі ізолюють РНК із конкретних тканин трансформанту, фракціонують у формальдегід-агарозному гелі й наносять на нейлоновий фільтр відповідно до стандартних процедур, звичайно використовуваних в даній галузі (затргоокК апа КиззеїЇ, 2001 зирга).In Northern analysis, RNA is isolated from specific tissues of the transformant, fractionated in a formaldehyde-agarose gel, and applied to a nylon filter according to standard procedures commonly used in this field (ZatrgookK apa KizzeiYi, 2001 zirga).
Експресію РНК, кодованої нуклеотидними послідовностями згідно з винаходом, потім перевіряють гібридизацією фільтра з радіоактивним зондом, отриманим з БОС відомими методами (ЗатргооК апа Кивхзеїї (2001) вирга)» РНК також може бути виявлена та/або визначена кількісно з використанням ПЛР зі зворотною транскриптазою, як відомо в галузі техніки (напр., сгееп апа ЗБатьгоок (2012) МоїІесшаг СіІопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї, 4 Еайоп,The expression of the RNA encoded by the nucleotide sequences according to the invention is then verified by hybridization of the filter with a radioactive probe obtained from BOS by known methods (ZatrgooK apa Kyvkhzeii (2001) virga)" RNA can also be detected and/or quantified using reverse transcriptase PCR, as known in the art (eg, Sgeep apa Zbatgook (2012) MyIesshag SiIopipd: A Garogaiogu Mapiai, 4 Eyop,
Соа 5ргіпд Натог І арогаїогу Ргез55, ММоодригу, МУ).Soa 5rgipd Natog I aroghaiogu Rgez55, MMoodrigu, MU).
Трансгенні рослини можуть бути проаналізовані методами вестерн-блотингу, ЕГІЗА, тестами із краплею рідини, що розтікається, й біохімічними аналізами, для визначення присутності білка, який кодується геном стійкості до гербіциду, шляхом стандартних процедур 60 (бБатргооК апа Виззеї! (2001) зирга), використовуючи антитіла, що зв'язуються з одним або більше епітопом, присутнім на білку стійкості до гербіциду.Transgenic plants can be analyzed by Western blotting, EHISA, liquid drop assays, and biochemical assays for the presence of the protein encoded by the herbicide resistance gene by standard procedures 60 (bBatrgooK apa Vizzei! (2001) zirga) , using antibodies that bind to one or more epitopes present on the herbicide resistance protein.
В одному з аспектів винаходу описані тут гени ГФПД корисні як маркери оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. 3. Використання як маркер трансформаціїIn one aspect of the invention, the GFPD genes described herein are useful as markers for assessing the transformation of bacterial or plant cells. 3. Use as a transformation marker
Винахід також стосується використання в способі трансформації рослин нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом, як маркерного гена або кодуючої послідовності, що робить можливим надання рослині стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, і використання одного або більше інгібітора (-ів) ГФПД на рослинах, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом. Див., напр., Патент США 6,791,014, включений у даний опис у повному обсязі шляхом посилання.The invention also relates to the use in a method of plant transformation of a nucleic acid encoding GFPD according to the invention, as a marker gene or coding sequence, which makes it possible to confer resistance to GFPD inhibitor herbicides in a plant, and the use of one or more GFPD inhibitor(s) in plants , containing the nucleic acid sequence encoding HFPD according to the invention. See, e.g., US Patent 6,791,014, incorporated herein by reference in its entirety.
У цьому варіанті здійснення інгібітор ГФПД може бути введений у культуральне середовище компетентних рослинних клітин, щоб знебарвити згадані клітини перед трансформацією.In this embodiment, a GFAP inhibitor can be introduced into the culture medium of competent plant cells to decolorize said cells prior to transformation.
Знебарвлені компетентні клітини потім трансформують геном стійкості до інгібіторів ГФПД як селективним маркером, і трансформовані клітини, що включили вказаний маркер у свій геном, стають зеленими, роблячи можливим їх виділення. Подібний процес може зменшити час, необхідний на відбір трансформованих клітин.The depigmented competent cells are then transformed with a gene for resistance to GFAP inhibitors as a selectable marker, and transformed cells that have incorporated this marker into their genome turn green, making it possible to isolate them. Such a process can reduce the time required to select transformed cells.
Таким чином, один з варіантів здійснення даного винаходу полягає в способі трансформування рослинних клітин введенням гетерологічного гена в вказані рослинні клітини з геном стійкості до інгібіторів ГФОД як селективного маркера, при цьому спосіб включає підготовку й культивування компетентних рослинних клітин, здатних прийняти гетерологічний ген, на підходящому середовищі, і введення достатньої кількості інгібітора ГФПД у підходяще культуральне середовище з компетентними рослинними клітинами. Потім компетентні клітини трансформують гетерологічним геном і селективним маркером, і трансформовані клітини, що містять гетерологічний ген, вирощують на підходящому середовищі й відбирають трансформанти. Трансформовані клітини потім можуть бути регенеровані до плодоносної трансформованої рослини.Thus, one of the variants of the implementation of this invention consists in the method of transforming plant cells by introducing a heterologous gene into the specified plant cells with a gene for resistance to HFOD inhibitors as a selective marker, while the method includes the preparation and cultivation of competent plant cells capable of accepting the heterologous gene on a suitable medium medium, and introducing a sufficient amount of GFAP inhibitor into a suitable culture medium with competent plant cells. Competent cells are then transformed with a heterologous gene and a selectable marker, and the transformed cells containing the heterologous gene are grown in a suitable medium and transformants are selected. The transformed cells can then be regenerated into a fruiting transformed plant.
И. Рослини й частини рослинI. Plants and plant parts
Під "рослиною" слід розуміти цілу рослину, органі рослин (напр., листя, стебла, коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони і їх нащадки. Рослинні клітини можуть бути"Plant" should be understood as the whole plant, plant organs (e.g., leaves, stems, roots, etc.), seeds, plant cells, shoots, embryos, and their offspring. Plant cells can be
Зо диференційованими або недиференційованими (напр., калус, клітини в суспензійній культурі, протопласти, клітини листя, клітини коренів, клітини флоеми, пилок). Даний винахід може бути використаний для введення полінуклеотидів у будь-які види рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, однодольні й дводольні. Приклади цільових рослин включають, але не обмежуються ними, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс, види Вгаззіса, люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніоку, кава, кокос, ананас, цитрусові дерева, какас, чай, банани, авокадо, фігу, гуаву, манго, оливу, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини й хвойні дерева.With differentiated or undifferentiated (eg, callus, cells in suspension culture, protoplasts, leaf cells, root cells, phloem cells, pollen). The present invention can be used to introduce polynucleotides into any type of plant, including, but not limited to, monocotyledons and dicotyledons. Examples of target plants include, but are not limited to, corn (maize), sorghum, wheat, sunflower, tomatoes, crucifers, peppers, potatoes, cotton, rice, soybeans, sugar beets, sugar cane, tobacco, barley, oilseed rape, Vgazzis species , alfalfa, rye, millet, safflower, peanut, sweet potato, cassava, coffee, coconut, pineapple, citrus trees, cacas, tea, bananas, avocado, fig, guava, mango, olive, papaya, cashew, macadamia, almond , oats, vegetables, ornamental plants and conifers.
Овочі включають, але не обмежуються ними, томати, латук, зелений горошок, лімську квасолю, горох і види роду Сигситів, такі як огірок, канталупа й диня. Декоративні рослини включають, але не обмежуються ними, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, нарциси, петунії, гвоздики, пуансетію й хризантеми. Також можуть становити інтерес сільськогосподарські культури, включаючи, приміром, кукурудзу, сорго, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс і ін.Vegetables include, but are not limited to, tomatoes, lettuce, green peas, lima beans, peas, and species of the Sigsit family such as cucumber, cantaloupe, and cantaloupe. Ornamental plants include, but are not limited to, azalea, hydrangea, hibiscus, roses, tulips, daffodils, petunias, carnations, poinsettias, and chrysanthemums. Agricultural crops may also be of interest, including, for example, corn, sorghum, sunflower, tomatoes, crucifers, peppers, potatoes, cotton, rice, soybeans, sugar beets, sugar cane, tobacco, barley, oilseed rape, etc.
Цей винахід пасує будь-якому члену родини однодольних рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, кукурудзу, рис, ячмінь, овес, пшеницю, сорго, жито, цукровий очерет, ананас, ямс, цибуля, банани, кокос і фініки.This invention is suitable for any member of the monocot plant family, including but not limited to corn, rice, barley, oats, wheat, sorghum, rye, sugar cane, pineapple, yam, onion, bananas, coconut and dates.
І. Способи підвищення врожайності рослинI. Methods of increasing plant productivity
Забезпечуються способи підвищення врожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини, що містить полінуклеотид, або введення в рослину або рослинну клітку полінуклеотиду, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД згідно з винаходом, вирощування рослини або її насіння в польових умовах і збору врожаю із цих рослин або насіння. Тут і далі "урожайність" рослини позначає якість та/або кількість біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" слід розуміти будь-який вимірюваний рослинний продукт. Підвищення вироблення біомаси - це будь-яке поліпшення врожайності вимірюваного рослинного продукту. Підвищення врожайності рослин має декілька комерційних застосувань.Ways to increase plant productivity are provided. The methods include providing a plant containing a polynucleotide, or introducing into a plant or a plant cell a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a GFPD according to the invention, growing the plant or its seeds in the field, and harvesting these plants or seeds. Here and further, the "yield" of a plant refers to the quality and/or quantity of biomass produced by the plant. "Biomass" should be understood as any measurable plant product. An increase in biomass production is any improvement in the yield of a measurable plant product. Increasing plant yield has several commercial applications.
Приміром, підвищення біомаси рослинних листків може підвищити врожайність листових овочів для вживання людиною й тваринами. Крім того, підвищення біомаси листя може бути використане для збільшення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів з бо рослин. Підвищення врожайності може включати будь-яке статистично значиме підвищення,For example, increasing the biomass of plant leaves can increase the yield of leafy vegetables for human and animal consumption. In addition, the increase in leaf biomass can be used to increase the production of pharmaceutical or industrial products from bo plants. An increase in yield may include any statistically significant increase,
включаючи, але не обмежуючись цим, підвищення принаймні на 1 95, підвищення принаймні наincluding, but not limited to, an increase of at least 1 95, an increase of at least
З 96, підвищення принаймні на 5 95, підвищення принаймні на 10 95, підвищення принаймні на 2095, принаймні на 30 95, принаймні на 50 95, принаймні на 70 95, принаймні на 100 95 або більше підвищення.From 96, an increase of at least 5 95, an increase of at least 10 95, an increase of at least 2095, an increase of at least 30 95, an increase of at least 50 95, an increase of at least 70 95, an increase of at least 100 95 or more.
У конкретних способах рослину, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, обробляють ефективною концентрацією гербіциду-інгібітора ГФПД, такого як один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів- інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-In specific methods, a plant comprising a HFPD nucleotide sequence of the invention is treated with an effective concentration of a HFPD inhibitor herbicide, such as one or more HFPD inhibitor herbicides selected from the group consisting of Class M-(1,2) HFPD inhibitor herbicides ,5-oxadiazole-3-yl)benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5 -yl/benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole-
Б-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-5-іл)- абоB-yl) benzamide; M-(1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-methylsulfonyl)-4 -(trifluoromethyl)benzamide (Spol. 1); M-(tetrazol-5-yl)- or
М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4--дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 2), 4--difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-
М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3--«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметилуібензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 її УО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О02013/072300 іM-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro-3--"methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4 --trifluoromethyl)benzamide (Sol. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethylubinzamide (Sol. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and UO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (M/O02013/072300 and
МО2013/072402); і похідних оксопразину (М/02013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, де застосування гербіциду приводить до підвищення врожайності рослини.MO2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/02013/054495); triketones, mainly such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, mainly such as isoxaflutol; or the class of pyrazolinates, mainly such as pyrasulfotol and topramezone, where the use of the herbicide leads to an increase in the yield of the plant.
Також забезпечуються способи надання стійкості до гербіцидів рослині або частині рослини.Also provided are methods of imparting herbicide resistance to a plant or part of a plant.
У подібних способах у рослину вводять нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД згідно з винаходом, де експресія полінуклеотиду приводить до стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД.In similar methods, a nucleotide sequence encoding HFPD according to the invention is introduced into the plant, where the expression of the polynucleotide leads to resistance to HFPD inhibitor herbicides.
Рослини, створені таким способом, можуть бути оброблені ефективною концентрацією гербіциду-інгібітора ГФПД (такого як один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М- (тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-Plants generated in this manner may be treated with an effective concentration of a GFAP inhibitor herbicide (such as one or more GFAP inhibitor herbicides selected from the group consisting of M-(1,2,5-oxadiazole-Z -yl)benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-yl)arylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-
Зо (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл/бензамід (Спол. З), 2-хлор-3-«(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іZo (methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole -5-yl)benzamide; M-(1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)- 4-(trifluoromethyl)benzamide (Spol. 1); M-(tetrazol-b5-yl- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides), preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5- yl)benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl/benzamide (Col. C), 2- chloro-3-"("methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl) -M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і УМО2013/072402); і похідних оксопразину (УММО2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон), і демонструвати підвищену стійкість до гербіциду. "Ефективна концентрація" гербіциду в рамках даної заявки означає кількість, достатню для вповільнення або зупинки росту рослин або частин рослин, які не мають вроджену або набуту стійкість до гербіциду.UMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (ММО2013/072300 and УМО2013/072402); and oxoprazine derivatives (UMMO2013/054495); triketones, mainly such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, mainly such as isoxaflutol; or the class of pyrazolinates, mainly such as pyrasulphotol and topramesone), and show increased resistance to the herbicide. "Effective concentration" of a herbicide as used herein means an amount sufficient to slow or stop the growth of plants or plant parts that do not have innate or acquired resistance to the herbicide.
Ї. Способи боротьби з бур'янами в польових умовахY. Methods of weed control in field conditions
Даний винахід також стосується способу боротьби з небажаними рослинами або регулювання росту рослин у посівах рослин, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, де один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, наприклад, один або більшеThe present invention also relates to a method of controlling unwanted plants or regulating plant growth in plant crops comprising a GFPD nucleotide sequence according to the invention, wherein one or more GFPD inhibitor herbicides, for example, one or more
БО гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається із класу М-(1,2,5-оксадіазол-3- іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл"арилкарбоксамідів, переважно таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«-трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- бо тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іBO herbicides-inhibitors of GFPD selected from the group consisting of the class M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)/benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-yl"arylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole) -5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide; M-(1,3,4- oxadiazol-2-yl)benzamides, preferably such as 2-methyl-N-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-"-trifluoromethyl)benzamide (Spol 1); 1H-tetrazol-5-yl/benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Col. 3), 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3- (methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-bo tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, застосовують до рослин (наприклад, рослин- шкідників, таких як однодольні або дводольні бур'яни або небажані культурні рослини), до насіння (наприклад, зерну, насіння або вегетативних пагонів, таких як бульби або паросткові частини із бруньками) або до зони вирощування рослин (наприклад, зони культивування). У цьому контексті ефективна концентрація одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, наприклад, одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М- (триазол-3-іл)яуарилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)/бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5- метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4-(трифторметилубензамід (Спол. 1); М- (тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4--(дифторметил)-2-метокси-UMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (ММО2013/072300 and ММО2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, mainly such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, mainly such as isoxaflutol; or of the pyrazolinate class, preferably such as pyrasulphotol and topramesone, are applied to plants (e.g. plant pests such as monocotyledonous or dicotyledonous weeds or unwanted crop plants), to seeds (e.g. grain, seeds or vegetative shoots such as tubers or sprouting parts with buds) or to the plant growing area (e.g. cultivation area). In this context, an effective concentration of one or more GFAP inhibitor herbicides, e.g., one or more GFAP inhibitor herbicides selected from the group consisting of class M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl) GFAP inhibitor herbicides / benzamides; M-(tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-yl)yaurylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol- 5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-N-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)/benzamide; M-(1,3,4-oxadiazol-2-yl/benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)- 4-(trifluoromethylubenzamide (Col. 1); M-(tetrazol-5-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M -(1-methyl-1 H-tetrazol-5-yl)benzamide (Spol. 2), 4--(difluoromethyl)-2-methoxy-
З-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. З), 2-хлор-3- (метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 4), -2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О02013/050421 і УМО2013/083774); заміщених 1,2,5- оксадіазолів (МУМО2013/072300 і МО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон), може бути застосована, приміром, до посадки (якщо потрібно, то й включенням у грунт), до сходів або після сходів, і може бути застосована в комбінації з іншими гербіцидами, до яких культура має вроджену стійкість або стійка через експресію одного або більше трансгенів стійкості до гербіцидів. Див., напр., Опубл. пат. заявку США Мо 2004/0058427 і Опубл. пат. заявку РСТ Мо М/О98/20144. Під " ефективною концентрацією" слід розуміти концентрацію, що контролює ріст або поширення бур'янів або інших нетрансформованих рослин без значного3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide (Spol. C), 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole -5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide (Spol. 4), -2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1 H-tetrazol-5-yl)-4- -trifluoromethyl)benzamide (Spol. 5); pyridazinone derivatives (M/O02013/050421 and UMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (MUMO2013/072300 and MO2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, mainly such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, mainly such as isoxaflutol; or the class of pyrazolinates, preferably such as pyrasulphotol and topramesone), can be applied, for example, before planting (if necessary, then incorporated into the soil), before emergence or after emergence, and can be applied in combination with other herbicides to which the culture is innately resistant or resistant due to the expression of one or more herbicide resistance transgenes. See, for example, Publ. stalemate. US application Mo. 2004/0058427 and Publ. stalemate. application PCT Mo M/O98/20144. "Effective concentration" shall be understood as the concentration which controls the growth or spread of weeds or other non-transformed plants without significant
Зо впливу на стійку до інгібітора ГФПД рослину або насіння. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що застосування гербіцидів може мати багато різних форм і може здійснюватися в різний час до та/або під час посіву насіння і процесу росту. "Досходове" застосування - застосування гербіциду в бажаній зоні (напр., полі або зоні культивування) до видимих сходів рослини із грунту. "Післясходове" застосування - застосування гербіциду в бажаній зоні після видимих сходів рослини із грунту. У деяких випадках терміни "досходовий" і "післясходовий" застосовують по відношенню до бур'янів у бажаній зоні, а в деяких випадках ці терміни застосовують по відношенню до культурної рослини в бажаній зоні. При вживанні по відношенню до бур'яну ці терміни можуть стосуватися конкретного типу або виду бур'яну, що присутні або передбачуваному в цільовій зоні. "Допосадкове включення" гербіциду включає примішування сполук до грунту до висадження.From the effect on a plant or seed resistant to the HFPD inhibitor. Those skilled in the art will appreciate that herbicide applications can take many different forms and can be made at various times prior to and/or during the seeding and growth process. "Pre-emergent" application - the application of herbicide in the desired area (eg, a field or cultivation area) before the visible emergence of the plant from the soil. "Post-emergence" application - the application of the herbicide in the desired area after the visible emergence of the plant from the soil. In some cases, the terms "pre-emergent" and "post-emergent" are used in relation to weeds in the desired zone, and in some cases these terms are used in relation to the cultivated plant in the desired zone. When used in relation to weeds, these terms may refer to a specific type or species of weed present or anticipated in the target area. "Preplant incorporation" of herbicide involves mixing the compounds into the soil prior to planting.
Таким чином, даний винахід включає спосіб боротьби з бур'янами в полі, що включає висадження в полі рослини або її насіння, що містить ГФПД згідно з винаходом, і застосування до вказаної рослини або зони, що її оточує, ефективної концентрації одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД.Thus, the present invention includes a method of controlling weeds in a field, comprising planting in a field a plant or its seed containing a GFPD according to the invention, and applying to said plant or an area surrounding it an effective concentration of one or more herbicides - GFPD inhibitors.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу поле, яке повинне бути засіяне рослинами (такими як соя, бавовник, кукурудза або пшениця й т.п.), що містять нуклеотидну послідовністьIn one embodiment of the present invention, a field to be planted with plants (such as soybeans, cotton, corn or wheat, etc.) containing a nucleotide sequence
ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблене гербіцидом-інгібітором ГФПД, таким як ізоксафлютол (ІФТ), до посадки рослин або посіву насіння, що очищає поле від бур'янів, знищуваних інгібітором ГФПД і дозволяє використовувати практики нульової обробки грунту, з наступною посадкою або посівом рослин на цьому ж попередньо обробленім полі (контактне застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). Залишкова активність ІФТ також буде захищати сходи й зростаючі рослини від конкуренції з бур'янами на ранніх стадіях росту. Коли рослини виростають до певного розміру, і бур'яни схильні з'являтися заново, поверх рослин може бути застосований глюфозинат або гліфозат, або ж інгібітор ГФПД або суміш інгібітора ГФПД із іншим гербіцидом, таким як гліфозат, якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.GFPD according to the invention can be treated with a GFPD inhibitor herbicide, such as isoxaflutol (IFT), before planting or seeding, which clears the field of weeds killed by the GFPD inhibitor and allows for zero-tillage practices, followed by planting or by sowing plants on the same pre-treated field (contact application of the GFPD inhibitor herbicide). The residual activity of IFT will also protect seedlings and growing plants from competition with weeds in the early stages of growth. When plants grow to a certain size and weeds tend to re-emerge, glufosinate or glyphosate, or a GFAP inhibitor or a mixture of a GFAP inhibitor with another herbicide, such as glyphosate, can be applied over the plants if those plants are resistant to those herbicides.
В іншому варіанті здійснення винаходу поле, засіяне насіннями, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблене гербіцидом-інгібітором ГФПД, таким як ізоксафлютол (ІФТ), до сходів рослин, але після посіву насіння (поле може бути попередньо очищене від бур'янів іншими засобами, звичайно стандартними практиками 60 обробки грунту, такими як орання, глибоке орання або підготовка посівних місць), при цьому залишкова активність буде підтримувати поле вільним від бур'янів, знищених гербіцидом, так що рослини, що сходять і ростуть, не мають конкуренції з бур'янами (досходове застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). Коли рослини виростають до певного розміру, і бур'яни схильні з'являтися заново, поверх рослин може бути застосований глюфозинат або гліфозат, або ж інгібітор ГФПД або суміш інгібітора ГФПД із іншим гербіцидом, таким як гліфозат, якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.In another embodiment of the invention, a field sown with seeds containing the nucleotide sequence of GFPD according to the invention can be treated with a GFPD inhibitor herbicide, such as isoxaflutol (IFT), before plant emergence, but after sowing the seeds (the field can be pre-cleaned of borers 60 by other means, usually standard tillage practices such as plowing, deep plowing, or seedbed preparation), while the residual activity will keep the field free of herbicide-killed weeds, so that emerging and growing plants do not have competition with weeds (pre-emergence application of herbicide-inhibitor GFPD). When plants grow to a certain size and weeds tend to re-emerge, glufosinate or glyphosate, or a GFAP inhibitor or a mixture of a GFAP inhibitor with another herbicide, such as glyphosate, can be applied over the plants if those plants are resistant to those herbicides.
В іншому варіанті здійснення винаходу рослини, що містять нуклеотидну послідовністьIn another embodiment of the invention, plants containing a nucleotide sequence
ГФПД згідно з винаходом, можуть бути оброблені гербіцидом-інгібітором ГФПД поверх рослин, що зійшли з посіяних насіння, що очищає поле від бур'янів, знищених інгібітором ГФПД, якась обробка може проводитися разом з (напр., у баковій суміші розпилювального приладу), з наступною або попередньою обробкою гліфозатом або глюфозинатом як післясходовим гербіцидом поверх рослин (післясходове застосування гербіциду-інгібітора ГФПД (з або без гліфозату)), якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.GFPDs according to the invention can be treated with a GFPD inhibitor herbicide on top of plants emerging from sown seed, which clears the field of weeds killed by the GFPD inhibitor, some treatment can be carried out together with (e.g., in a sprayer tank mix), with subsequent or prior treatment with glyphosate or glufosinate as a post-emergence herbicide over plants (post-emergence application of a GFPD inhibitor herbicide (with or without glyphosate)), if such plants are resistant to these herbicides.
Приклади окремих представників однодольних і дводольних бур'янів, з якими можна боротися гербіцидами-інгібіторами ГФПД, включають:Examples of selected monocotyledonous and dicotyledonous weeds that can be controlled with GFAP inhibitor herbicides include:
Однодольні рослини-шкідники родів: Аедіїор5, Адгоругоп, Адговії5, АІоресиги5, Арега, Амепа,Monocot plants-pests of genera: Aediior5, Adgorugop, Adgovii5, AIoresygi5, Arega, Amepa,
Вгасніапа, Вготив, Сепспгиб5, Соттеїїпа, Суподоп, Сурегиз5, Оасіуіосієпішт, Оіднапа,Vgasniapa, Vgotiv, Sepspgyb5, Sotteiipa, Supodop, Suregiz5, Oasiuiosiepisht, Oidnapa,
ЕсПіпоспіІоа, ЕїІеосНагі5, ЕІвивіпе, Егадгобії5, Епоспіоа, Ревіиса, Рітбіізіуї5, Неїегапіпега,EsPipospiIoa, EiIeosNagi5, EIvivipe, Egadgobii5, Epospioa, Reviisa, Ritbiiziui5, Neiegapipega,
Ітрегаїа, Ізспаеєтит, І ерюоспіса, І от, Мопоспогіа, Рапісит, Разра!шт, РНаїагі5, Рпієит, Роа,Itregaia, Izspaeetit, I eryuospisa, I ot, Mopospogia, Rapisit, Razra!sht, RNaiagi5, Rpieit, Roa,
Войбоеіа, Ззадіната, осігрив, Зеїагіа, 5огапит.Voiboeia, Zzadinata, warmed, Zeiagia, 5ogapyt.
Дводольні рослини-шкідники родів: Аршіоп, Атагапійи5, Атрбгозіа, Апода, Апіпетів,Dicotyledonous plants-pests of the genera: Arshiop, Atagapiyi5, Atrbgozia, Apoda, Apipetiv,
Арпапез, Апетівіа, Айріех, Веїїї5, Відеп5, СарзеїПа, Сагдци5, Саввзіа, Сепіаштєа, Спепородійт,Arpapez, Apetivia, Airiech, Veiii5, Videp5, SarzeiPa, Sagdtsi5, Savvzia, Sepiastea, Speporodiit,
Сіквішт, Сопмоїмиіив, Оаїшта, ЮОевтодійт, Етех, Егузітит, Еирпогбіа, СаїІеорзів5, Саїїпзода,Siquisht, Sopmoimiiiv, Oaishta, JuOevtodiit, Etech, Eguzitit, Eirpogbia, SaiIeorziv5, Saiiipzoda,
Саїїшт, Нірізсив, Іротоєа, Коспіа, Іатіит, І еріаіїшт, І іпдетіа, Майсагіа, Мепійа, Мегситпіаїв5,Saiisht, Nirizsiv, Irotoea, Cospia, Iatiit, I eriaiisht, I ipdetia, Maisagia, Mepia, Megsitpiaiv5,
Миїїшдо, Муозоїї5, Рарамег, РНагбії5, Ріапіадо, Роуудопит, Ройшіаса, Напипсши5, Нарпапив,Miiiishdo, Muozoiii5, Rarameg, RNagbiii5, Riapiado, Rouudopit, Royshiasa, Napipsshi5, Narpapyv,
Вогірра, Роїаїа, Витех, зЗаївоїа, Зепесіо, Зезбрапіа, зіда, б5іпарі5, Зоїапит, 5опспив5, Зрпепосіва, зіеїЇагіа, Тагахасит, ТНІазрі, Титоїйшт, Опіса, Мегопіса, Міоіїа, Хапіпіт.Vohirra, Roiaia, Vitekh, zZaivoia, Zepesio, Zezbrapia, zida, b5ipari5, Zoiapit, 5opspyv5, Zrpeposiva, zieiYagia, Tagahasit, TNIazri, Titoiisht, Opisa, Megopisa, Mioiia, Hapipit.
Гербіциди-інгібітори ГФІПД, що підходять для даного винаходу, включаючи, але не обмежуючись ними, гербіциди-інгібітори ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-GFIPD inhibitor herbicides suitable for this invention, including, but not limited to, GFIPD class M-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamide herbicides; M-
Зо (тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл/бензамід (Спол. З), 2-хлор-3-«(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 іZo (tetrazol-4-yl)- or M-(triazol-3-ylarylcarboxamides, preferably such as 2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol- 5-yl)benzamide and 2-chloro-3-(methoxymethyl)-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide; M-(1,3,4-oxadiazole -2-yl)benzamides, preferably such as 2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 1 ); 5-yl)benzamide (Col. 2), 4-(difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl/benzamide (Col. C), 2-chloro-3-"("methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4), 2-(methoxymethyl)-3-( methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide (Col. 5); pyridazinone derivatives (M/O2013/050421 and
УММО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (МИО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, можуть бути зроблені в вигляді різних рецептур, залежно від переважних біологічних та/або фізико-хімічних параметрів. Прикладами можливих рецептур є: змочувані порошки (СП), водорозчинні порошки (ВП), водорозчинні концентрати, емульгувальні концентрати (ЕК), емульсії (ЕВ), такі як емульсії типу "масло-в-воді" або "вода-в-маслі", розпилювані розчини, концентрати суспензій (КС), дисперсії на основі масла- або води, розчини, що змішуються з маслом, суспензії капсул (СК), пудри (ПП), продукти для обробки насіння, гранули для застосування врозкид і на грунті, гранули (ГР) у вигляді мікрогранул, що розпорошуються гранул, гранул з покриттям і адсорбційних гранул, вододисперговані гранули (ВГ), водорозчинні гранули (РГ), рецептури наднизького об'єму (ОЇ М), мікрокапсули й воски.UMMO2013/083774); substituted 1,2,5-oxadiazoles (МИО2013/072300 and МОО2013/072402); and oxoprazine derivatives (M/O2013/054495); triketones, mainly such as tembotrione, sulcotrione and mesotrione; class of isoxazoles, mainly such as isoxaflutol; or a class of pyrazolinates, preferably such as pyrasulphotol and topramesone, can be made in the form of different formulations, depending on the prevailing biological and/or physicochemical parameters. Examples of possible formulations are: wettable powders (SP), water-soluble powders (WP), water-soluble concentrates, emulsifying concentrates (EC), emulsions (EV), such as oil-in-water or water-in-oil emulsions , sprayable solutions, suspension concentrates (CS), oil- or water-based dispersions, oil-mixable solutions, capsule suspensions (SC), powders (PP), products for seed treatment, granules for spreading and on the ground, granules (GR) in the form of microgranules, sprayable granules, coated granules and adsorption granules, water-dispersible granules (VG), water-soluble granules (RG), ultra-low volume formulations (OLM), microcapsules and waxes.
Ці індивідуальні форми рецептур у принципі відомі й описані, наприклад, в: Уміппаскег- каспіег, "Спетізспе Тесппоїодіє" |Спетіса! Тесппоіоду|, моїште 7, С. Напзег Мепйад Мипісн, АтThese individual forms of recipes are in principle known and described, for example, in: Umippaskeg- kaspieg, "Spetisspe Tesppoiodije" |Spetisa! Tesppoiodu|, moishte 7, S. Napseg Mepyad Mypisn, At
Еа. 1986; У/аде мап МаІКепригу, "Ревіїсіде Еоптиїайопв", Магсе! ОеккКег, М.У., 1973; К. Мапепв, "Бргау Огуіпа" Напароок, Зга Еа. 1979, Сх. Сюоодм/іп Ца. І опдоп.Eh. 1986; U/ade map MaIKeprigu, "Reviiside Eoptiiaiopv", Magse! Oekkeg, M.U., 1973; K. Mapepv, "Brgau Oguipa" Naparook, Zga Ea. 1979, Sh. Xuoodm/ip Tsa. And opdop.
Додаткові речовини, необхідні в рецептурах, такі як інертні речовини, поверхнево-активні речовини, розчинники й інші добавки, також відомі й описані, наприклад, в: Умаїкіп5, "Напабоок ої Іпзесіїсіде Биві Оіїшепів апа Сапієгв", 2па Еа., бапапа ВоокК5, Саідмжеї! М.9)., Н.м. Оірнеп, 60 0 "Ппштодисіоп о Сіау СоПоід Спетівігу"; 2па Еа., 9). М/Пеу б 5оп5, М.У.; б. Магзаєп, "ЗоїмепівAdditional substances required in formulations, such as inert substances, surface-active substances, solvents and other additives, are also known and described, for example, in: Umaikip5, "Napabook oi Ipsesiiside Bivi Oiishepiv apa Sapiegv", 2pa Ea., bapapa VookK5, Saydmzhey! M.9)., N.m. Oirnep, 60 0 "Ppshtodysiop o Siau SoPoid Spetivigu"; 2pa Ea., 9). M/Peu b 5op5, M.U.; b. Magzayep, "Zoimepiv
ЗоZo
Спціде"; 2па Еа., Іпіегесіепсе, М.М. 1963; МеСшспеоп'є "Оєвівєгдепів апа Етиївіїєгтв Аппиа!", МОSpcyde"; 2pa Ea., Ipiegesiepse, M.M. 1963; MeSshspeopye "Oeviveyegdepiv apa Etyiviyegtv Appia!", MO
Рибі. Согр., Віддежмоса М..).; 5ізвієу апа М/оса, "Епсусіореєдіа ої Зипасе Асіїме Адепів", Спет. Рибі.Fish Sogr., Viddezhmosa M.).; 5izvieu apa M/osa, "Epsusioreedia oi Zipase Asiime Adepiv", Spet. Fish
Со. Іпс., М.М. 1964; бспбпгеїді, "Сгеплпаспепакіїме Атуіепохідаадикіе" ГІпіегасе-асіїме еіпуїеєпе охіде аддисів|, Мі. Мепадзаезеї!., еїиндапй 1976; МіппасКег-каспег, "Спетібзспе Тесппоїодіе"Co. Ips., M.M. 1964; bspbpgeidi, "Sgeplpaspepakiime Atuiepokhidaadikie" HIpiegase-asiime eipuiieepe ohide addisiv|, Mi. Mepadzaezei!., eiindapy 1976; MippasKeg-kaspeg, "Spetibzspe Tesppoiodie"
ІСпетіса! Тесппоіоду), моїште 7, С. Напзег Мепйад Мипісн, 4 Еа. 1986.ISpetisa! Tesppoiodu), moishte 7, S. Napseg Mepyad Mypisn, 4 Ea. 1986.
На основі цих рецептур також можливо приготувати комбінації з іншими пестицидно активними субстанціями, такими як, наприклад, інсектициди, акарициди, гербіциди, фунгіциди, і із запобіжниками, добривами та/або регуляторами росту, наприклад, у вигляді готової суміші або бакової суміші.Based on these formulations, it is also possible to prepare combinations with other pesticidally active substances, such as, for example, insecticides, acaricides, herbicides, fungicides, and with preservatives, fertilizers and/or growth regulators, for example, in the form of a ready mix or a tank mix.
Й. Способи введення гена згідно з винаходом в інша рослинуJ. Methods of introducing a gene according to the invention into another plant
Також тут забезпечені способи введення нуклеотидної послідовності ГФПД згідно з винаходом в іншу рослину. Нуклеотидна послідовність ГФІПД згідно з винаходом або її фрагмент може бути введена в інша рослину шляхом повторюваного відбору, зворотного схрещування, сортового розведення, лінійної селекції, масової селекції, мутаційного розведення та/або селекції, посиленої генетичним маркером.Methods of introducing the nucleotide sequence of HFPD according to the invention into another plant are also provided here. The nucleotide sequence of GFIPD according to the invention or its fragment can be introduced into another plant by repeated selection, backcrossing, varietal breeding, linear selection, mass selection, mutational breeding and/or selection enhanced by a genetic marker.
Таким чином, в одному з варіантів здійснення способи згідно з винаходом включають схрещування першої рослини, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, із другою рослиною для одержання рослин-нащадків ЕТ, і відбір рослин-нащадків Е1, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом.Thus, in one embodiment, the methods of the invention include crossing a first plant containing a GFPD nucleotide sequence according to the invention with a second plant to produce ET progeny plants, and selecting E1 progeny plants resistant to a GFPD inhibitor herbicide or containing the nucleotide sequence of HFPD according to the invention.
Способи можуть також включати схрещування відібраних рослин-потомства з першою рослиною, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, для одержання рослин-нащадків зворотного схрещування, і відбір рослин-нащадків зворотного схрещування, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом. Способи оцінки стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД описані тут в інших розділах.The methods may also include crossing the selected progeny plants with a first plant containing the GFPD nucleotide sequence of the invention to produce backcross progeny plants, and selecting backcross progeny plants resistant to the GFPD inhibitor herbicide or containing the GFPD nucleotide sequence according to the invention. Methods for assessing resistance to the GFPD inhibitor herbicide are described in other sections here.
Способи можуть також включати повторення цих етапів один або більше раз послідовно для одержання відібраних рослин-нащадків зворотного схрещування другого покоління або вище, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом.The methods may also include repeating these steps one or more times in succession to obtain selected progeny plants of the second generation or higher backcross, resistant to the GFPD inhibitor herbicide or containing the GFPD nucleotide sequence according to the invention.
У способі згідно із даним винаходом може бути використаний будь-який метод розведення,In the method according to the present invention, any dilution method can be used,
Зо що включає селекцію рослин за бажаним фенотипом. У деяких варіантах здійснення рослиниWhich includes the selection of plants according to the desired phenotype. In some embodiments, the plant
Е1 можуть самозапилюватися для одержання виділеного покоління 2. Потім у кожному поколінні (ЕЗ, Е4, Е5, і т.д.) можуть бути відібрані окремі рослини, що представляють бажаний фенотип (напр., стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД), поки ознаки не стануть гомозиготними або закріпленими в популяції, яку розводять.E1s can self-pollinate to produce a selected generation 2. Then, in each generation (EZ, E4, E5, etc.), individual plants representing the desired phenotype (eg, resistance to a GFAP inhibitor herbicide) can be selected until the traits will not become homozygous or fixed in the breeding population.
Другою рослиною може бути рослина, що має бажану властивість, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до посух, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, поліпшена живильна цінність, стійкість до хвороб, поліпшений фотосинтез, поліпшена якість волокон, стійкість до стресів, поліпшене розмноження й т.п. Друга рослина може бути елітною подією, як описано тут в інших розділах.The second plant may be a plant having a desired property such as herbicide resistance, insect resistance, drought tolerance, nematode control, water use efficiency, nitrogen use efficiency, improved nutritional value, disease resistance, improved photosynthesis, improved quality fibers, stress resistance, improved reproduction, etc. The second plant can be an elite event, as described in other sections here.
У різних варіантах здійснення частини рослин-результатів схрещувань (цілі рослини, органі рослин (напр., листи, стебла, коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони й т.п.) можуть бути зібрані для подальшого розмноження або обробки (таке як виробництво їжі, корму, біопалива, масла, борошна, вживання в їжу й т.п.)In various embodiments, parts of plants resulting from crosses (whole plants, plant organs (e.g., leaves, stems, roots, etc.), seeds, plant cells, shoots, embryos, etc.) can be collected for further propagation or processing (such as production of food, feed, biofuel, oil, flour, consumption, etc.)
К. Способи одержання рослинного продуктуK. Methods of obtaining a plant product
Даний винахід також стосується процесу одержання товарного продукту, що включає збір та/або помел зерна культури, що включає нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, для одержання товарного продукту. Агрономічно й комерційно доступні продукти та/або композиції, що включають, але не обмежувані ними, корми для тварин, товари, а також рослинні продукти й побічні продукти, які призначені для використання як продуктів харчування для споживання людиною або для використання в композиціях і товарах, призначених для споживання людиною, особливо позбавлених життєздатності насіння / зернових продуктів, у тому числі (напів-) оброблених продуктів, отриманих з таких зерен / насіння, де вказаний продукт або містить цільні або оброблені насіння або зерно, корми для тваринних, кукурудзяне або соєве борошно грубого помелу, кукурудзяне або соєве борошно, кукурудзу, кукурудзяний крохмаль, соєвий шрот, соєве борошно, пластівці, концентрат соєвого білка, ізоляти соєвого білка, текстурований концентрат соєвого білка, косметику, засоби з догляду за волоссями, масло соєвих горішків, натто, темпі, гідролізований соєвий білок, збиті вершки, шортенінги, лецитин, цільні харчові соєві боби (сирі, смажені, або як едамаме), соєвий йогурт, соєвий сир, тофу, фучжу, а також приготовлене, поліроване, ошпарене, запечене або пропарене зерно й бо т.п., слід розуміти як охоплювані суттю даного винаходу, якщо ці продукти й композиції містять,The present invention also relates to the process of obtaining a commercial product, which includes the collection and/or grinding of a culture grain, which includes the nucleotide sequence of GFPD according to the invention, to obtain a commercial product. Agronomically and commercially available products and/or compositions, including but not limited to animal feed, commodities, and plant products and by-products, which are intended for use as food for human consumption or for use in compositions and commodities, intended for human consumption, especially non-viable seeds / grain products, including (semi-) processed products obtained from such grains / seeds, where the specified product either contains whole or processed seeds or grain, animal feed, corn or soybean meal coarsely ground, corn or soy flour, corn, corn starch, soy meal, soy flour, flakes, soy protein concentrate, soy protein isolate, textured soy protein concentrate, cosmetics, hair care products, soybean oil, natto, tempeh, hydrolyzed soy protein, whipped cream, shortening, lecithin, whole edible soybeans (raw, roasted, or k edamame), soy yogurt, soy cheese, tofu, fuchu, as well as cooked, polished, scalded, baked or steamed grains, etc., should be understood as covered by the essence of this invention, if these products and compositions contain,
кількості нуклеотидної та/або амінокислотної послідовності, що виявляються, викладеної тут і далі як діагностична для будь-якої рослини, що містить такі нуклеотидні послідовності.number of detectable nucleotide and/or amino acid sequences set forth herein hereinafter as diagnostic of any plant containing such nucleotide sequences.
Нижченаведені приклади наведені в ілюстративних цілях і не для обмеження.The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to be limiting.
Експериментальна частинаExperimental part
Приклад 1. Бібліотека точкових мутантів першого покоління.Example 1. Library of point mutants of the first generation.
Мутантну ГФПД РІЄмМо33 (описана в Міжнародній патентній заявці Ме РСТ/О52013/59598 (подано 13 вересня 2013 року) і викладена тут як 5БЕО ІЮ МО:5) мутували в положеннях 334 і 336. Насичений мутагенез цих положень здійснювали за допомогою набору ОШІКСНАМОСЕФMutant GFPD RIEMMo33 (described in International Patent Application Me PCT/O52013/59598 (filed September 13, 2013) and set forth herein as 5BEO IU MO:5) was mutated at positions 334 and 336. Saturated mutagenesis of these positions was performed using the OSHIKSNAMOSEF kit
Ідйіліпу. Мутанти накопичували й трансформували в клітини ОНзЗаїрна Е. соїї. Шістсот окремих клонів перевіряли на стійкість до інгібітора ГФПД темботріону (ТБТ). Клони вирощували на середовищі І.В плюс канаміцин при 37 градусах С у шейкері до досягнення ОГбООнм 0,3. Потім культури переводили на 30 градусів С і інкубували протягом додаткових 17 годин. Культури центрифугували й клітинні гранули ресуспендували в 10 мМ Нерез/КОН рі 7,6, 4 мМ Моаосі», 1Idylip The mutants were accumulated and transformed into ОНзЗайрна E. soybean cells. Six hundred individual clones were tested for resistance to the GFAP inhibitor tembotrione (TBT). Clones were grown on IV medium plus kanamycin at 37 degrees C in a shaker until reaching OGbOOnm of 0.3. The cultures were then transferred to 30 degrees C and incubated for an additional 17 hours. Cultures were centrifuged and cell pellets were resuspended in 10 mM Nerez/KOH r 7.6, 4 mM Moaosi", 1
ММ ОТТ. Клітини піддавали лізису шляхом розбивання кульками, і після центрифугування одержували розчинні клітинні екстракти.MM OTT. Cells were lysed by pelleting, and soluble cell extracts were obtained after centrifugation.
Мутанти аналізували методом коричневого кольору. Більш конкретно, екстракти ГФПД аналізували в 9б-лунковому форматі на стійкість до інгібітора ГФПД шляхом нанесення на тверде середовище, що містить І Бр-агар, канаміцин, 5 мм тирозин, 42 мм сукцинат і інгібіторMutants were analyzed by the brown color method. More specifically, HFPD extracts were assayed in a 9b-well format for resistance to HFPD inhibitor by plating on solid medium containing I Br agar, kanamycin, 5 mM tyrosine, 42 mM succinate, and inhibitor
ГФПД. В основному скринінгу 20 мкл екстракту наносили в трьох повтореннях на планшети, що містять 250, 500, 1000 або 2000 мкМ темботріону. Планшети покривали повітропроникною стрічкою й інкубували при 37 градусах С. Після закінчення 24 годин утворення бурого пігменту візуально порівнювали зі зразками, що містять РІНРРО і РІЄмо33. Варіанти, що демонструють у присутності ТБТ утворення більш темного коричневого кольору, ніж РІЕмо33, аналізували заново на 0, 500, 1000, 2000 мкм ТБТ і 500, 1000, 2000 мкМ дикетонітрилу (ДКН, активної сполуки ізоксафлютолу (ІФТ)), і 500, 1000, 2000 мкМ мезотріону. Варіанти, які знову демонстрували більш темний коричневий колір, знову експресували, і екстракт титрували на всіх протестованих інгібіторах ГФПД, щоб визначити ступінь поліпшення.GFPD In the main screening, 20 μl of the extract was applied in triplicate to plates containing 250, 500, 1000 or 2000 μM tembotrione. The tablets were covered with an air-permeable tape and incubated at 37 degrees C. After 24 hours, the formation of brown pigment was visually compared with samples containing RINRRO and RIEmo33. Variants showing a darker brown color in the presence of TBT than RIEmo33 were re-assayed at 0, 500, 1000, 2000 μM TBT and 500, 1000, 2000 μM diketonitrile (DKN, the active compound of isoxaflutol (IPT)), and 500, 1000, 2000 μM 1000, 2000 μM mesotrione. Variants that again showed a darker brown color were reexpressed and the extract titrated against all GFAP inhibitors tested to determine the degree of improvement.
Найтемніший колір демонстрували подвійні мутанти Ріез35Р-336Е і РіеЗз35Р-336У (які тут і далі позначені як РІЄмо43 (5ЕО ІЮО МО:7) і РІЄмо44 (ЗЕО ІЮ МО:8), відповідно). Ці білкиThe darkest color was shown by the double mutants Riez35R-336E and Riez35R-336U (which are hereafter denoted as RIEmo43 (5EO IUO MO:7) and RIEmo44 (ZEO IU MO:8), respectively). These proteins
Зо виробляли в Е. сої), очищали й перевіряли їх активність за допомогою нижчеописаних аналізівZo was produced in E. soya), purified and tested for their activity using the assays described below
ГФПД.GFPD
Приклад 2: Виготовлення й очищення білків ГФПД і визначення активності ГФПД у присутності гербіцидів-інгібіторів ГФПДExample 2: Production and purification of HFPD proteins and determination of HFPD activity in the presence of HFPD inhibitor herbicides
Білки ГФПД виготовляли й очищали як описано в М/О2011/076882. Активність білків ГФПД під час відсутності або в присутності інгібіторів ГФПД визначали, використовуючи або так званий ОЮО-аналіз, або НОЮО-аналіз. а) Об-аналіз: Активність ГФПД визначали колориметрично шляхом вимірювання кількостейGFPD proteins were produced and purified as described in M/O2011/076882. The activity of GFAP proteins in the absence or presence of GFAP inhibitors was determined using either the so-called OGD-assay or OGD-assay. a) Over-analysis: The activity of HFPD was determined colorimetrically by measuring the quantities
ГФП, що залишається в аналітичній суміші наприкінці інкубаційного періоду після дериватизаціїHFP remaining in the analytical mixture at the end of the incubation period after derivatization
ГФП 2,4-динітрофенілгідразином (ДНФ) для утворення в лужних умовах янтарно-коричневого 2,4-динітрофенілгідразону. Аналіз виконували при кімнатній температурі в 96б-лункових планшетах Сгеїіпег з Е-подібним профілем дна. Аналітична суміш містила 50 мМ Ттгі5-НОЇ рн 7,8, 0,5 мМ ГФП, 10 мм аскорбату, 650 одиниць каталази й належні кількості очищеного ферментуHFP with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNF) for the formation of amber-brown 2,4-dinitrophenylhydrazone under alkaline conditions. The analysis was carried out at room temperature in 96b-well plates of Segiipeg with an E-shaped bottom profile. The analytical mixture contained 50 mM Ttgi5-NOI pH 7.8, 0.5 mM GFP, 10 mM ascorbate, 650 units of catalase, and appropriate amounts of the purified enzyme
ГФПД загальним об'ємом аналізу 100 мкл. Реакцію починали додатком ферменту. Після інкубаційного періоду 24 хвилини реакцію зупиняли додаванням 50 мкл розчину 0,04 95 ДНФ в 3,8 Н НОЇ. Після подальшого інкубаційного періоду 15 хвилин до реакційної суміші додавали 100 мкл 5 Н розчину КОН, і кількість непрореагованого ГФП вимірювали фотометрично при 405 нм.HFPD with a total analysis volume of 100 μl. The reaction was started with the addition of an enzyme. After an incubation period of 24 minutes, the reaction was stopped by adding 50 μl of a solution of 0.04 95 DNF in 3.8 N NOI. After a further incubation period of 15 minutes, 100 μl of 5 N KOH solution was added to the reaction mixture, and the amount of unreacted GFP was measured photometrically at 405 nm.
Активність ферменту розраховували як різницю в Е405 між аналізом без ферменту (негативний контроль) і аналізом, що містять фермент (ДЕ405-Е405(негативний контроль) - Е405).Enzyme activity was calculated as the difference in E405 between the analysis without enzyme (negative control) and the analysis containing the enzyme (DE405-E405(negative control) - E405).
Активність ферменту (нмоль переробленого субстрату за хвилину) розраховували за калібрувальною кривою, зробленою на ГФП. Значення рі5о (негативний логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 96 ферментативної активності, у молярному вираженні) визначали за графіком доза-реакція активності ГФПД проти тестованої концентрації інгібітора (5,0 х 10-6,1,0 х 10-5,2,5 х 10-5, 4,0 х 10-5, 7,0 х 10-5, 1,0 х 10-4,2,0 х 10-4 ії 5,0 х 10-4М), використовуючи Логістичну регресію з 4-ма змінними або Сигмоїдну модель дози-реакції з пакету програмного забезпечення ХНИ ІЮ Вивзіпе55 ЗоіІшіоп5 ЦЯ. Результат "»5,6" означає, що інгібування при найменшій тестованій концентрації було більше 85 95, і тому значення рі5о не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. Результат "«2,5" означає, що інгібування при найбільший тестованій концентрації було менше 25 95, і тому значення рібо не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. "не бо визн." означає "не визначене".Enzyme activity (nmol of processed substrate per minute) was calculated according to the calibration curve made on GFP. The value of ri5o (the negative logarithm of the concentration of the inhibitor required to inhibit 50 96 enzymatic activity, in molar terms) was determined by the dose-response graph of GFPD activity against the tested concentration of the inhibitor (5.0 x 10-6.1.0 x 10-5.2 .5 x 10-5, 4.0 x 10-5, 7.0 x 10-5, 1.0 x 10-4, 2.0 x 10-4 and 5.0 x 10-4M), using Logistic 4-variable regression or the Sigmoid dose-response model from the software package KhNI IU Vyvzipe55 ZoiIshiop5 TSY. The result "5.6" means that the inhibition at the lowest tested concentration was greater than 85 95, and therefore the value of ri50 could not be accurately determined over the entire range of tested concentrations. A result of "2.5" means that the inhibition at the highest tested concentration was less than 25 95, and therefore the ribo value could not be accurately determined over the entire range of tested concentrations. "don't admit it." means "undefined".
р) НнаО-аналіз: При Ноб-аналізі активність ГФПД вимірювали при кімнатній температурі додаванням належних кількостей ГФПД до розчину 200 мМ Ттгі5-НСЇІ рн 7,6, 10 мм аскорбату, 20p) HnaO-analysis: In the Nob-analysis, the activity of HFPD was measured at room temperature by adding the appropriate amounts of HFPD to a solution of 200 mM Ttgi5-HCII pH 7.6, 10 mM ascorbate, 20
МКМ РезО4, 650 одиниць каталази, 8 мкг ГГА-діоксигенази (ГГА: гомогентизат) і 600 мкм ГФпП загальним об'ємом 1 мл. Початкові швидкості реакції під час відсутності або в присутності інгібіторів визначали по збільшенню поглинання при 318 нм завдяки утворення малеїлацетоацетату (є318-11,900 М-1 см-1). Значення рібо (негативний логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 95 ферментативної активності, у молярнім вираженні) визначали за графіком доза-реакцчя активності ГФПД проти тестованої концентрації інгібітора, використовуючи Логістичну регресію з 4-ма змінними або Сигмоїдну модель дози-реакції з пакета програмного забезпечення ХИйЙ ІЮ Вивзіпе55 Боішіоп5 4. Через Уф-поглинання тестованих інгібіторів ГФПД концентрації інгібіторів понад 100 мкМ не могли бути протестовані.MKM RezO4, 650 units of catalase, 8 μg of HGA-dioxygenase (HGA: homogentisate) and 600 μm of HFpP in a total volume of 1 ml. Initial reaction rates in the absence or presence of inhibitors were determined by the increase in absorbance at 318 nm due to the formation of maleyl acetoacetate (e318-11,900 M-1 cm-1). The ribo value (the negative logarithm of the inhibitor concentration required to inhibit 50 95 enzymatic activity, in molar terms) was determined from a dose-response plot of GFAP activity against the tested inhibitor concentration using 4-variable Logistic Regression or the Sigmoid Dose-Response Model from the software package provision of ХЙЙ ЙУ Vyvzipe55 Boishiop5 4. Due to the UV absorption of the tested HFPD inhibitors, concentrations of inhibitors above 100 µM could not be tested.
Результат "«4" означає, що інгібування при концентрації інгібітора 100 мкМ було менше 25 95, і тому значення рі5бБо не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. "не визн." означає "не визначене".The result ""4" means that the inhibition at the inhibitor concentration of 100 μM was less than 25 95, and therefore the value of ri5bO could not be accurately determined over the entire range of tested concentrations. "not recognized." means "undefined".
Нар-аналіз дозволяє безперервно відслідковувати каталізоване ГФПД утворення ГГА протягом деякого періоду часу й тому використовувався для визначення типу інгібуваннятестованих інгібіторів ГФПД. Коли в присутності інгібітора активність ГФПД зменшувалася залежним від часу чином, характерним для повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів (для визначення див. Моїтізоп (1982) Тгепаз Віоспет. Зсбі. 7, 102- 105), інгібітор називали залежним від часу (скорочено "зв"). Коли в присутності інгібітора активність ГФПД інгібувалася, але інгібування не зменшувалося залежним від часу образом, інгібітор називали оборотним (скорочено "обор").Nar-assay allows continuous monitoring of HFPA-catalyzed formation of HGA over a certain period of time and was therefore used to determine the type of inhibition of the tested HFPA inhibitors. When, in the presence of an inhibitor, the activity of HFPD decreased in a time-dependent manner, characteristic of slow-binding or slow-binding inhibitors (for definition, see Moitisop (1982) Tgepaz Viospet. Ssbi. 7, 102-105), the inhibitor was called time-dependent (abbreviated as "zv"). When, in the presence of an inhibitor, the activity of HFPD was inhibited, but the inhibition did not decrease in a time-dependent manner, the inhibitor was called reversible (abbreviated as "reversible").
Скорочення "по-іп" означає, що тип інгібування неможливо було визначити через те, що при концентрації інгібітора 100 мкМ не спостерігалося інгібування відповідного варіанта ГФПД.Abbreviation "po-ip" means that the type of inhibition could not be determined due to the fact that no inhibition of the corresponding variant of GFPD was observed at a concentration of 100 μM inhibitor.
Коли стійкість білків ГФПД РіІЄмо43 і РІіЄмо44 до дикетонітрилу (ДКН) і мезотріону (МЗТ) визначили з використанням ОЮ-аналізу, стало очевидно, що їх стійкість поліпшилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІСЗ3З3бУ, РІЗЗЗбУМ, С959 і РІємоЗ3З3 (див. Таблицю 2).When the resistance of the HFPD proteins RiIEmo43 and RIiemo44 to diketonitrile (DKN) and mesotrione (MZT) was determined using the OI analysis, it became obvious that their resistance was improved in comparison with the reference HFPD proteins RINRRO, РИСЗбЕ, РИСЗ3З3бУ, РИZZЗбУМ, С959 and РИемоЗ3З3 (see . Table 2).
Таблиця 2Table 2
Оцінка стійкості (ріІ5О) білків ГФПД першого покоління до дикетонітрилу (ДКН) і мезотріону (МЗТ) з використанням ОО-аналізуEvaluation of the resistance (riI5O) of the first generation HFPD proteins to diketonitrile (DKN) and mesotrione (MZT) using OO-analysis
ФЕОЮ ПоложенняFEOJ Regulations
Клон МО амінокислоти Активність в РІНРРОClone MO amino acid Activity in RINRRO
Рекаг/24хв МКГ 711» |в реве зно 0Rekag/24 min ICG 711" | in reve zno 0
РІЗУ 2 |Е | | 066 | 53 | 56RIZU 2 |E | | 066 | 53 | 56
РІЗУ! З |Е ЇМ | 066 9 Щ | 52 | 55 себя | 5 |Р |6 (| 009 2 | 55 | »56RIZO! WITH |E HIM | 066 9 Sh | 52 | 55 seba | 5 | P | 6 (| 009 2 | 55 | »56
РЕМОЗЗ|Ї 6 |Р | | 025 | 43 | 5REMOZZI 6 |R | | 025 | 43 | 5
РЕМАЗ| 7 |Р | | 039 | 4 | 46REMAZ 7 |P | | 039 | 4 | 46
РЕМЯ4|, 8 |. ЇМ | 01 9 Щ | 40 | 46BELT 4|, 8 |. to them 01 9 Sh | 40 | 46
Коо)Coo)
Коли стійкість білків ГФПД Р'іЄЕмо43 і РіЄмо44 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) визначали з використанням НОоЮ-аналізу, було виявлено, що їх стійкість значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД (деталі в Таблиці 7 нижче). Що ще більш важливо, аналіз часової динаміки інгібування дикетонітрилом (ДКТ), темботріоном (ТБТ) і мезотріоном (МЗТ) показав, що механізм інгібування білків ГФПД РіЄмо43 і РІіЄмо44 значно відрізнявся від механізму інгібування еталонних білків ГФПД у тому розумінні, що він змінився із залежного від часу інгібування, характерного для повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів, до повністю оборотного інгібування (деталі в Таблиці 11 нижче).When the resistance of the GFPD proteins RiEEmo43 and RiEmo44 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT) was determined using the HOoU assay, it was found that their resistance was significantly improved compared to the reference GFPD proteins (details in Table 7 lower). More importantly, analysis of the time dynamics of inhibition by diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT), and mesotrione (MZT) showed that the mechanism of inhibition of the RiEmo43 and RiiEmo44 GFAP proteins was significantly different from that of the reference GFAP proteins in that it changed from a time-dependent from the inhibition time characteristic of slow binding or slow, strong binding inhibitors to fully reversible inhibition (details in Table 11 below).
Приклад 3: Бібліотека точкових мутантів другого поколінняExample 3: Library of point mutants of the second generation
РІЄмо43 і РІЄмо44, отримані як описано в Прикладі 1, використовували для створення білківRIEmo43 and RIEmo44, obtained as described in Example 1, were used to create proteins
ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 339 і 340 за допомогою наборуGFPDs containing further amino acid substitutions at positions 339 and 340 using a set
ОШІКСНАМСЕФ Іднпіпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено вOSHIKSNAMSEF Idnpipipod. Their resistance to HFPD inhibitors, determined by OO-analysis, is given in
Таблиці 3.Tables 3.
Таблиця ЗTable C
Оцінка стійкості (ріІ5О) білків ГФПД другого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл)бензамід) з використанням ОЮО-аналізу. яю ее Де ою анбеее р Тег ет (ее. мкг Білок 2Evaluation of the resistance (riI5O) of second-generation GFPD proteins to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (MZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-N-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide) using OD analysis. yayu ee De oyu anbeee r Tag et (ee. mcg Protein 2
РЕМАЗ | 7 | Р | Е | Кк | А | 039 | 41 |556| 46 | 556 щРІгО /ї 9 | Р | Е | А | 0 | 036 33 | 48 | 37 | 54REMAZ | 7 | R | E | Kk | And | 039 | 41 |556| 46 | 556 shRIgO /i 9 | R | E | And | 0 | 036 33 | 48 | 37 | 54
ЕСРІЗО | ло | Р | в | Кк | Е | 039 / зе | 48 | 37 | 55 тент ик яю рвві зв визн. «11151815 15581 визн. се ||| кт сю 11 визн.ESRIZO | lo | R | in | Kk | E | 039 / ze | 48 | 37 | 55 tent ik yayu rvvi zvzn. "11151815 15581 recognized se ||| kt syu 11 recognized
Стійкість білків ГФПД РІГ/РІ29, РІГР1ІЗ30, К131 і К132 до дикетонітрилу (ДКТ) та/або темботріону (ТБТ) та/або мезотріону (МЗТ) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІЗЗ33б6У, РІЗЗбУУ, С959, і РІЕЄмо33. Коли стійкість білківThe resistance of HFPD proteins RIH/RI29, RIGR1IZ30, K131 and K132 to diketonitrile (DKT) and/or tembotrione (TBT) and/or mesotrione (MZT) has significantly improved in comparison with reference HFPD proteins RINRRO, РИСЗБЕ, РИЗЗ33б6У, РИЗЗбУУ, С959, and REEEEmo33. When the stability of proteins
ГФПД БГРІ129 і РІ РІ130 до дикетонітрилу (ДКТ) та/або темботріону (ТБТ) та/або мезотріону (МЗ3Т) визначали з використанням НОоО-аналізу, було виявлено, що їх стійкість також значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІСЗЗбУ, РІСЗЗбМУ,HFPD BHRI129 and RI RI130 to diketonitrile (DKT) and/or tembotrione (TBT) and/or mesotrione (MZ3T) were determined using HOoO analysis, it was found that their resistance was also significantly improved in comparison with reference proteins HFPD RINRRO, РИСЗЗбЕ, RISZZBU, RISZZBMU,
С959, і РІЄємо33 (деталі в Таблиці 7 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування показав, що дикетонітрил (ДКТ), темботріон (ТБТ) і мезотріон (МЗТ) були повністю оборотними інгібіторами білків ГФПД РІГ Р129 і РІ Р130 (деталі в Таблиці 11 нижче). Аналіз часової динаміки інгібуванняС959, and РІЕемо33 (details in Table 7 below). Analysis of the temporal dynamics of inhibition showed that diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT) were fully reversible inhibitors of HFPD proteins RIH P129 and RI P130 (details in Table 11 below). Analysis of temporal dynamics of inhibition
Спол. 2 білків ГФПД К131 і К1І32 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білківSpol. 2 GFPD proteins K131 and K1I32 showed that Spol. 2 was a fully reversible protein inhibitor
ГФПД КІ131 і К132 (деталі в Таблиці 12 нижче).HFPD КИ131 and К132 (details in Table 12 below).
Приклад 4: Бібліотека точкових мутантів третього поколінняExample 4: Library of point mutants of the third generation
Варіанти ГФПД, отримані як описано в Прикладі 3, використовували для створення білківVariants of GFPD, obtained as described in Example 3, were used to create proteins
ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 215 за допомогою наборуGFPDs containing further amino acid substitutions at position 215 using a kit
ОШІКСНАМСЕФ Іідніпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено вOSHIKSNAMSEF Iidnipipod. Their resistance to HFPD inhibitors, determined by OO-analysis, is given in
Таблиці 4. Як другий еталон додатково до РІНРРО використовували К299, що несе тільки мутацію Р2151І.Table 4. K299, which carries only the P2151I mutation, was used as a second standard in addition to RINRRO.
Таблиця 4Table 4
Оцінка стійкості (рІ5О) білків ГФПД третього покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (М3ЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-Evaluation of resistance (pI5O) of third-generation HFPD proteins to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (M3ZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole-
Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу. яю рев | хеТвю вітки Тег т |. в мкг Білок 2B-yl)benzamide) using Ob-analysis. I roar | heTview threads Tag t |. in µg Protein 2
РІНРРО у 1 / Р | Е | а | Кк | А | 0,76 | 556 | 55,6 | 55,6 | 55,6RINRRO in 1 / R | E | and | Kk | And | 0.76 | 556 | 55.6 | 55.6 | 55.6
РЕМЯЗ | 7 | Р | Р | Е | Кк | А | 039, | 41 |556.| 46 | 556REMYAZ | 7 | R | R | E | Kk | And | 039, | 41 |556.| 46 | 556
ЕШР2О2 | 12 1 | Р | є | Кк | Е | 0,09. | «25 36 | «25 45ESHR2O2 | 12 1 | R | is | Kk | E | 0.09. | "25 36 | "25 45
ЕСРІЗ6 | 11 1 2 ЇЇ Р | є | к | А / 009 / 26 | 47 | 33 | 48ESRIZ6 | 11 1 2 HER R | is | to | A / 009 / 26 | 47 | 33 | 48
ЕРІг3 | 9 | Р | Р | Е | А | 0 | 0,936 / 33 | 48 | 37 | 54ERIg3 | 9 | R | R | E | And | 0 | 0.936 / 33 | 48 | 37 | 54
ЕСРІЗО | ло | Р | Р | є | к | Е | 039 | зе | 48 | 37 | 55ESRIZO | lo | R | R | is | to | E | 039 | ze | 48 | 37 | 55
Таблиця 4Table 4
ЗЕО І Положення амінокислоти в . дк 215 | 335 | 336 | 339 з4о |СейаБ/аях!дкн о |тБто|мзто|Спол. в мкг Білок 2 тер ві и|и 1 кі |овврав в визн.ZEO I Amino acid position in . dk 215 | 335 | 336 | 339 z4o |SeyaB/ayah!dkn o |tBto|mzto|Spol. in μg Protein 2 ter vi i|y 1 ki |ovvrav in rezn.
Фе |в: |и кв |25 |з визн.Feb | in: | and quarter | 25 | with recognition
СЕЗНИ НЕ НН СНИ ЕТАПУ НУ НСХУ НЯ ПЕУЧИСсІ визн.SEZNY NE NN SNY STAGE NU NSHU NI PEUCHISSI recognized.
СЕН НЕСТИ НС С НО НЕ ОСТ НОСА ВЕ НЕ НЕСЛО визн. че ||| і1кТк сю |і визн.SEN NESTI NS S BUT NOT OST NOSA VE NOT NESLO recognized. che ||| i1kTk syu |i recognized.
Стійкість білків ГФПД с мутацією Р215Ї до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗ3Т) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Коли стійкість білків ГФПД РІ Р136 і РІГ Р202 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗ3Т) визначали з використанням НОоЮ-аналізу, було виявлено, що їх стійкість значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД (деталі в Таблиці 7 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування показав, що дикетонітрил (ДКТ), темботріон (ТБТ) і мезотріон (МЗТ) були повністю оборотними інгібіторами білків ГФПД РІ /РІ136 і РІ Р202 (деталі в Таблиці 11 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К137 і К2О3 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К137 і К20О3 (деталі в Таблиці 12 нижче).The resistance of HFPD proteins with the P215Y mutation to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT), and mesotrione (MZ3T) was significantly improved compared to reference HFPD proteins. When the resistance of HFPD proteins RI P136 and RIH P202 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZ3T) was determined using the HOoU assay, it was found that their resistance was significantly improved compared to the reference HFPD proteins (details in Table 7 lower). Analysis of the temporal dynamics of inhibition showed that diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT) were fully reversible inhibitors of HFPD proteins RI /RI136 and RI P202 (details in Table 11 below). Analysis of the temporal dynamics of inhibition of Spol. 2 GFPD proteins K137 and K2O3 showed that Spol. 2 was a fully reversible inhibitor of GFPD proteins K137 and K20O3 (details in Table 12 below).
Приклад 5: Бібліотека точкових мутантів четвертого поколінняExample 5: Library of point mutants of the fourth generation
Варіант ГФПД ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 215 за допомогою наборуThe HFPD variant EGR202, obtained as described in Example 4, was used to generate HFPD proteins containing further amino acid substitutions at position 215 using a kit
ОШІКСНАМСЕЄФ Іопіпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОЮр-аналізом, наведено вOSHIKSNAMSEEF Iopipipod. Their resistance to HFPD inhibitors, determined by UR-analysis, is given in
Таблиці 5.Tables 5.
Таблиця 5Table 5
Оцінка стійкості (рІ5О) білків ГФПД четвертого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-Evaluation of the resistance (pI5O) of fourth-generation HFPD proteins to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (MZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole-
Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу.B-yl)benzamide) using Ob-analysis.
Ми ННЯ НЕСЛИ в мкг Білок 2We CARRY NNYA in µg Protein 2
РсРІЗО | 10 | Р | Р | Р | Е | 039 | 32 | 48 3/7 | 55RSRIZO | 10 | R | R | R | E | 039 | 32 | 48 3/7 | 55
РР2О2 | 12 | і | Р | в | Е | 009 |-«25)| 36 «25| 45РР2О2 | 12 | and | R | in | E | 009 |-«25)| 36 "25| 45
Каб | 18 | А | Р | Е | Е | 009 | 30 45 | 37 | 50Kab | 18 | And | R | E | E | 009 | 30 45 | 37 | 50
Кка;в | 19 | м | Р | ЕР | Е | 05 |-25) 44 | 34 | 54Kka; in | 19 | m | R | ER | E | 05 |-25) 44 | 34 | 54
Стійкість білків ГФПД К255 і К258 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (М3ЗТ) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К255 і К258 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К255 і К258 (деталі в Таблиці 12 нижче).Resistance of GFPD proteins K255 and K258 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (M3ZT) was significantly improved compared to reference GFPD proteins. Analysis of the temporal dynamics of inhibition of Spol. 2 GFPD proteins K255 and K258 showed that Spol. 2 was a fully reversible inhibitor of GFAP proteins K255 and K258 (details in Table 12 below).
Приклад 6: Бібліотека точкових мутантів п'ятого поколінняExample 6: Library of point mutants of the fifth generation
Варіанти ГФПД РГГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, і ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 226 і 340 за допомогою набору ОШІКСНАМСЕФ Ідніпіпд. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена Ор-аналізом, наведено в Таблиці 6.Variants of HFPD RGGR130, obtained as described in Example 3, and EGR202, obtained as described in Example 4, were used to create HFPD proteins containing further amino acid substitutions at positions 226 and 340 using the OSHIKSNAMSEF Idnipipd kit. Their resistance to HFPD inhibitors, determined by Or-analysis, is shown in Table 6.
Таблиця 6Table 6
Оцінка стійкості (рІ50О) ферментів ГФПД четвертого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід) з використанням ОО-аналізу.Evaluation of resistance (pI50O) of fourth-generation HFPD enzymes to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (MZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide) using OO analysis.
Репаєг/24х Спол.Repay/24x Spol.
Пере реєроє р р рнесввя Ге ет ек.Pere reeroe r r rnesvvya Ge et ek.
Р2О2 | 12 | | ОРЕ | КЕ 009 / «25 36 | «25 45 кзоо її 21 | ОРІ ЕК || 001 / «25| ЗЛ | «25 38 кзоб 1 24 | | 3. РЕ | КЕ 001 / «251 48 | 37 | 5 кз63 | 29 | Р | 3. | Р | є | К | Е | 020 | 38 | 55 | 43 | 54Р2О2 | 12 | | ORE | KE 009 / "25 36 | "25 45 kzoo her 21 | ORI EC || 001 / "25| ZL | "25 38 kzob 1 24 | | 3. RE | KE 001 / "251 48 | 37 | 5 kz63 | 29 | R | 3. | R | is | K | E | 020 | 38 | 55 | 43 | 54
Стійкість білків ГФПД КЗО0 і К306 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД КЗО0, КЗ306 і КЗ63 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД КЗО0, КЗ306 і КЗ363 (деталі в Таблиці 12 нижче).The resistance of HFPD proteins KZO0 and K306 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT) improved in comparison with reference HFPD proteins. Analysis of the temporal dynamics of inhibition of Spol. 2 GFPD proteins KZO0, KZ306 and KZ63 showed that Spol. 2 was a fully reversible inhibitor of HFPD proteins KZO0, KZ306 and KZ363 (details in Table 12 below).
Приклад 7: Стійкість варіантів ГФПД, створених, як описано в Прикладах 1-6, до інгібіторівExample 7: Resistance of GFPD variants generated as described in Examples 1-6 to inhibitors
ГФПД, визначена НОоО-аналізомGFPD determined by HOoO analysis
Стійкість варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ), визначена НОб-аналізом, наведено в Таблиці 7.The resistance of HFPD variants created in Examples 1-6 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT), determined by HOb analysis, is shown in Table 7.
Таблиця 7Table 7
Оцінка стійкості (рі5О) варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) з використанням НоО-аналізу 7711... |2151|3935| 336 | 339 | з40 ДдКн. тБТ //- |м3тEvaluation of the resistance (ri5O) of GFPD variants created in Examples 1-6 to diketonitrile (DKT), tembotrione (TBT) and mesotrione (MZT) using the NoO analysis 7711... |2151|3935| 336 | 339 | from 40 DdKn. tBT //- |m3t
РІНРРО у 1 | Р | Е | а | Кк | А | 58 | 64 | 58 рРІЗЗ3бМІ 4 | Р | Е | М'| Кк | А | 53 | 6 | 55 /RINRRO in 1 | R | E | and | Kk | And | 58 | 64 | 58 rRIZZ3bMI 4 | R | E | M'| Kk | And | 53 | 6 | 55 /
РІЗУ! 2 | Р | Е | є | Кк | А | 51 | 59 | 51 рРІЗЗвМІ З | Р | Е | М | Кк | А | 49 | 55 | 50RIZO! 2 | R | E | is | Kk | And | 51 | 59 | 51 rRIZZvMI Z | R | E | M | Kk | And | 49 | 55 | 50
РЕМОЗЗ | 6 | Р | Р | М | Кк | А | 46 | 62 | 55REMOZZ | 6 | R | R | M | Kk | And | 46 | 62 | 55
РЕМАЗ | 7 | Р | Р | є | Кк | А Ї 40 | 60 | 51REMAZ | 7 | R | R | is | Kk | And I 40 | 60 | 51
РЕМЯА4 | 8 | Р | Р | М | Кк | А Ї 41 | 59 | 52REMYAA4 | 8 | R | R | M | Kk | A Y 41 | 59 | 52
РІгО ї 9 | Р | Р | Е | А. | 2 | 46 | 62 | 50RIgO i 9 | R | R | E | A. | 2 | 46 | 62 | 50
ЕСРІЗО | 10 | Р | Р | є | Кк | ЕЕ Її 43 | 62 | 53ESRIZO | 10 | R | R | is | Kk | EE Her 43 | 62 | 53
РІЗ | 11 | 4 | Р | Е | Кк | А ЇЇ 40 | 53 | 45CUT | 11 | 4 | R | E | Kk | And she is 40 53 | 45
Р2О2г | 12 | Її | Р | є | Кк |! ЕЇ «4 | 42 | «4Р2О2g | 12 | Her | R | is | Kk |! EI "4 | 42 | "4
Стійкість варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до Спол. 1 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. З (4--(дифторметил)-2-метокси-Stability of the GFPD options created in Examples 1-6 to Spol. 1 (2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide), Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide), Spol. C (4-(difluoromethyl)-2-methoxy-
З-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. 4 (2-хлор-3- (метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) і Спол. 5 (2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід), визначена НОоО-аналізом, наведено в Таблиці 8.3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide), Spol. 4 (2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide) and Spol. 5 (2-(Methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide), determined by HOoO analysis, is given in Table 8.
Таблиця 8Table 8
Оцінка стійкості (рі5О) варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, з використанням НОор-аналізуEvaluation of the stability (pi5O) of the GFPD variants created in Examples 1-6, using HOr-analysis
ЗЕО І не . годZEO And not. hours
Клон МО Положення мутацій в РІНРРО Гербіциди-інгібітори ГФПД 71 ..ю.юЮ |215|226 | 335 | 336 | 339 | 340 | Спол. 2| Спол. 1| Спол. З|Спол. 4| Спол. 5Clone MO Position of mutations in RINRRO Herbicides-inhibitors of GFPD 71 ..yu.yuyu |215|226 | 335 | 336 | 339 | 340 | Spol. 2| Spol. 1| Spol. Z|Spol. 4| Spol. 5
РІНРРО | 1 |Р ОО |Е |с0 |кК А | 67 | 63 | 66 | 70 | б ріазз3бу| 4 |Р |О |Е |М |К А | 68 | бе | 64 | 67 | бRINRRO | 1 |P OO |E |c0 |kK A | 67 | 63 | 66 | 70 | b riazz3bu| 4 |R |O |E |M |K A | 68 | be | 64 | 67 | b
Р.РІ2гУ | 9 |Р ОО |Р |Е ТА (0 | 58 | би | 59 66 | бR.RI2gU | 9 |R OO |R |E TA (0 | 58 | b | 59 66 | b
РсРІЗО | ло |Р 0 |Р |Е |К є | 62 | бе | 64 | 66 | 60 се Гете ке ее тн (тн (Мн Гн визн. |визн. |визн. |визн.RSRIZO | lo |P 0 |P |E |K is | 62 | be | 64 | 66 | 60 se Gete ke ee tn (tn (Mn Hn recognized | recognized | recognized | recognized
СЕЗНН НЕСЛО СТИ С СТВО СУНОСУНО ВЕСТ ПСИ НСБ визн. визн.SEZNN NESLO STI S STVO SUNOSUNO VEST PSY NSB recognized. recognized
СЕЗНИНЕСНО ЗНО СНИСВО СОСНИ СУС ЕН визн. |визн. |визн. |визн. се и ГЕ Є ЮЕ зе т» б б б визн. |визн. |визн. |визн.SEASONAL KNOWN DECLINE OF PINE SUS EN recognized. | recognized | recognized | recognized se and GE E UE ze t» b b b recognized. | recognized | recognized | recognized
Р.РІЗБ | 11 |- ТО |Р |Е |К А | 59 | 56 | 56 | 60 | 56R. RIZB | 11 |- TO |R |E |K A | 59 | 56 | 56 | 60 | 56
РрР2гоО2г | 12 | 0 |Р | |К Е | 47 | 41 | 43 | 57 | 43 св Ге ер єю ен (чн (тн (тн визн. |визн. |визн. |визн. ее Гео ЄЮ м р» Гн Гн визн. |визн. |визн. |визн. се Ге фе Є | зе Ін (нн визн. |визн. |визн. |визн. се Ге ЄЮ зе рн Гб» Гн визн. |визн. |визн. |визн. ее Ге ЄЮ т ер Те Те визн. |визн. |визн. |визн.РрР2гоО2г | 12 | 0 |P | |K E | 47 | 41 | 43 | 57 | 43 st Ge er yeu en (chn (tn (tn recognized | recognized nn recognition |recognition |recognition |recognition se Ge ЕЮ ze rn Gb» Hn recognition |recognition |recognition |recognition ee Ge ЕЮ t er Te Te recognition |recognition |recognition |recognition
Приклад 8: Бібліотека точкових мутантів шостого поколінняExample 8: Library of point mutants of the sixth generation
Варіанти ГФПД РГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, і К255 і К258, отримані як описано в Прикладі 5, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 188 і 189 за допомогою набору ОШІКСНАМОЕФ ІІпіпіпу. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ООр-аналізом, наведено в Таблиці 9.The HFPD variants RGR130, obtained as described in Example 3, EGR202, obtained as described in Example 4, and K255 and K258, obtained as described in Example 5, were used to generate HFPD proteins containing further amino acid substitutions at positions 188 and 189 using set OSHIKSNAMOEF IIpipipu. Their resistance to GFAP inhibitors, determined by OOR analysis, is shown in Table 9.
Таблиця 9Table 9
Оцінка стійкості (рі5О) білків ГФПД шостого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл)бензамід) з використанням ОЮО-аналізуEvaluation of the resistance (ri5O) of the sixth-generation GFPD proteins to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (MZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide) using OD analysis
ЗЕО І . . пд:ZEO I. . south:
Клон МО: Положення амінокислоти в РІНРРО | Активність Інгібітори ГФПД 1 ре реа оо вю ревсова мкг Білок 2Clone MO: Amino acid position in RINRRO | Activity Inhibitors of GFPD 1 re rea oo vu revsova mcg Protein 2
РР2О2 | 12 | А | в | СГ | Р | Е | Е | 009 |-25)/36 25 45РР2О2 | 12 | And | in | SG | R | E | E | 009 |-25)/36 25 45
Ка58 | 19 | А | В | М | Р | Е | Е | 05 |-25)| 44 | 34 | 54 каб7 | 26 | а | с | Р | РЕ |Е | 047 |35|53| А | 5А4Ka58 | 19 | And | In | M | R | E | E | 05 |-25)| 44 | 34 | 54 kab7 | 26 | and | with | R | RE |E | 047 |35|53| And | 5A4
КкагБбо | 17 | а/с | РІ |Е | 007 |-25)| 38 30 | 46 кзагх; | 25 | а | с | м /|РІЕ|Е | 041 |-25)|46| 36 | 56 ко5 | 30 | а | С | А | Р | ЕЕ | Е | 06 | 33 | 48 | 37 | 49 коб | 31 | а са | м | РІ | Е | 052 /|-25)|45| 35| 56 ко7 | 32 | й Е | М | Р | Е | ЕЕ | 041 |«25)| 46 | 36 | 57 ков | з3 | с | 0 | мМ Р | ЕР | Е | 056 |«25) 46) 365KkagBbo | 17 | JSC | RI |E | 007 |-25)| 38 30 | 46 kzagh; | 25 | and | with | m /|RIE|E | 041 |-25)|46| 36 | 56 ko5 | 30 | and | C | And | R | EE | E | 06 | 33 | 48 | 37 | 49 kob | 31 | and sa | m | RI | E | 052 /|-25)|45| 35| 56 ko7 | 32 | and E | M | R | E | EE | 041 |«25)| 46 | 36 | 57 kov | with 3 | with | 0 | mm R | ER | E | 056 |«25) 46) 365
Комбінація мутацій у положеннях 188 і 189 з мутаціями в положеннях 215, 335, 336 і 340 позитивно впливає на рівень активності ферментів, які усе ще показують високий рівень стійкості до інгібіторів. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К250, КЗ25 іThe combination of mutations at positions 188 and 189 with mutations at positions 215, 335, 336, and 340 positively affects the activity level of enzymes that still show a high level of inhibitor resistance. Analysis of the temporal dynamics of inhibition of Spol. 2 GFPD proteins K250, KZ25 and
КЗ357 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К250, КЗ325 і К357.KZ357 showed that Spol. 2 was a fully reversible inhibitor of HFPD proteins K250, KZ325 and K357.
Значення рібо Спол. 2 проти білків ГФПД К250, КЗ325 і КЗ3З57 минулого визначені як «4, 5,51 5,1, відповідно.The value of ribo Spol. 2 against GFPD proteins K250, KZ325 and KZ3Z57 of the past defined as "4, 5.51 5.1, respectively.
Приклад 9: Бібліотека точкових мутантів сьомого поколінняExample 9: Library of point mutants of the seventh generation
Варіанти ГФПД РГГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, і ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 200 за допомогою набору ОШІКСНАМСЕФ Іідпіпіпд. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено в Таблиці 10.Variants of HFPD RGGR130, obtained as described in Example 3, and EGR202, obtained as described in Example 4, were used to create HFPD proteins containing further amino acid substitutions at position 200 using the OSHIXNAMSEF Idpippd kit. Their resistance to HFPD inhibitors, determined by OO analysis, is shown in Table 10.
Таблиця 10Table 10
Оцінка стійкості (рІ50) ферментів ГФПД сьомого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (М3ЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-Evaluation of the resistance (pI50) of the seventh-generation HFPD enzymes to diketonitrile (DKN), tembotrione (TBT), mesotrione (M3ZT) and Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-"methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazole-
Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу.B-yl)benzamide) using Ob-analysis.
ЗЕО І . . ск яв ре в рвевю Іевое ле Тег рег ети мкг Білок 2ZEO I. . skjav re v rvevu Ievoe le Teg reg ety m g Protein 2
ШР2О2 | 12 | 4 | 1 7 Р | є | Е | 009 /|25)136 25|45 кзо3 1 22 | І! | 4 1 Р | є | ЕЕ | 0008 |25142 32 | 46 кзо4 1 23 | М | її Р | є | Е | 001 /|25142 32| 46 кЗзбо 1 27 | І | Р | Р | Е | ЕЕ | 028 /|36153 43|53 збі | 28 | М | Р | Р | Є | Е | 021 |з34/| 51140 | 52SHR2O2 | 12 | 4 | 1 7 R | is | E | 009 /|25)136 25|45 kzo3 1 22 | AND! | 4 1 R | is | EE | 0008 |25142 32 | 46 kzo4 1 23 | M | her R | is | E | 001 //25142 32| 46 kZzbo 1 27 | And | R | R | E | EE | 028 //36153 43|53 zbi | 28 | M | R | R | There is | E | 021 |z34/| 51140 | 52
Комбінація мутацій у положенні 200 з мутаціями в положеннях 215, 335, 336 і 340 приводить до варіантів ГФПД, які усе ще показують високий рівень стійкості до інгібіторів ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД КЗ303, К304, КЗ360 і КЗ61 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД КЗ303, К304, КЗ60 і КЗ61 (деталі в Таблиці 12 нижче). Значення рі5Бо Спол. 2 проти білків ГФПД КЗО03, К304, КЗ360 і КЗ61 минулого визначені як 5,0, 4,7, 5,5 і 5,3, відповідно.The combination of mutations at position 200 with mutations at positions 215, 335, 336, and 340 results in GFAP variants that still show high levels of resistance to GFAP inhibitors. Analysis of the temporal dynamics of inhibition of Spol. 2 GFPD proteins KZ303, K304, KZ360 and KZ61 showed that Spol. 2 was a fully reversible inhibitor of HFPD proteins KZ303, K304, KZ60 and KZ61 (details in Table 12 below). The meaning of ri5Bo Spol. 2 against GFPD proteins KZO03, K304, KZ360 and KZ61 of the past were determined as 5.0, 4.7, 5.5 and 5.3, respectively.
Приклад 10: Аналіз типу інгібування варіантів ГФПД інгібіторами ГФОДExample 10: Analysis of the type of inhibition of HFPD variants by HFOD inhibitors
Тип інгібування варіантів ГФПД, отриманих як описано в Прикладах 1-9, різними інгібіторамиThe type of inhibition of the HFPD variants obtained as described in Examples 1-9 by different inhibitors
ГФПД, визначений з використанням вищеописаного НОО-аналізу, наведено в Таблицях 11 і 12.The GFPD determined using the above-described NOA analysis is shown in Tables 11 and 12.
Таблиця 11Table 11
Тип інгібування варіантів ГФПД ДКН (дикетонітрилом), ТБТ (темботріоном) і МЗТ (мезотріоном), визначений з використанням НОоЮ-аналізу.The type of inhibition of HFPD variants by DKN (diketonitrile), TBT (tembotrione) and MZT (mesotrione) was determined using the HOoU analysis.
ЗЕО І г. . од 777 ..ю.юЮю | 215| 335 | 336 | 339 | з40 |ДКН |тБТ (мзтZEO I g. from 777 ..yu.yuyuyu | 215| 335 | 336 | 339 | z40 |DKN |tBT (mzt
РІНРРО | 1 | Р | Е | б | Кк | А (зв (зв (зв рРІЗЗ3БМ | 4 | Р | Е | М | Кк | А зв (зв (зв рРЗЗВЕ | 2 | Р | Е | ЕЕ | Кк | А зв (зв (зв рРІЗЗ3БМ | З | Р | Е | М | Кк | А зв (зв (звRINRRO | 1 | R | E | b | Kk | And | M | Kk | A zv (zv (zv
РЕМОЗЗ | 6 | Р | Р | М | Кк | А зв (зв (звREMOZZ | 6 | R | R | M | Kk | And zv (zv (zv
РЕМАЗ | 7 | Р | Р | Е | Кк | А (обор (|обор |обор,//REMAZ | 7 | R | R | E | Kk | A (revolution (|revolution |revolution,//
РЕМА. | 8 | Р | Р / У | Кк | А (обор (|обор |обор,//Rhema. | 8 | R | R / U | Kk | A (revolution (|revolution |revolution,//
ЕщРІгО | 9 | Р | Р | Е | А | ОО (обор (|обор |обор,//EshRIgO | 9 | R | R | E | And | OO (revolution (|revolution |revolution,//
ЕШРІЗО | ло | Р | Р / Е | КК | Є Цобор (|обор, |обор,/7/ESHRIZO | lo | R | R / E | CC | There is Tsobor (|obor, |obor,/7/
ЕШРІЗ6 | 711 | Є Ї Р в 1 КО А (обор, |обор |обор,//ESHRIZ6 | 711 | E Y R in 1 KO A (turn, |turn |turn,//
ЕШР2О2 | 712 | | Р | в | Кк | є Цпо-п // |обор,(|по-п/ЗESHR2O2 | 712 | | R | in | Kk | is Tspo-n // |obor,(|po-n/Z
Таблиця 12Table 12
Тип інгібування варіантів ГФПД Спол. 1 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. З (4--дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. 4 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) і Спол. 5 (2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід), певний НОр-аналізом.Type of inhibition of variants of GFPD Spol. 1 (2-methyl-M-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)-3-(methylsulfonyl)-4-(trifluoromethyl)benzamide), Spol. 2 (2-chloro-3-ethoxy-4-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide), Spol. C (4--difluoromethyl)-2-methoxy-3-(methylsulfonyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)benzamide), Spol. 4 (2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide) and Spol. 5 (2-(methoxymethyl)-3-(methylsulfinyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4--trifluoromethyl)benzamide), determined by HOr analysis.
ЗЕОZEO
Клон ІО Положення мутацій в РІНРРО Гербіциди-інгібітори ГФПДClone IO The position of mutations in RINRRO Herbicides-inhibitors of GFPD
МОMo
. Тго0|215|226|335|336| 3391340 | Спол. 2 | Спол. 1 | Спол. З | Спол. 4 | Спол. 5. Tgo0|215|226|335|336| 3391340 | Spol. 2 | Spol. 1 | Spol. With | Spol. 4 | Spol. 5
РІНРРО | 1 | (Р ТО |Е (с |кК ТА (зв. зв. (зв, |зв (зв рРІШЗЗ6МУ| 4 | (Р ТО (ЕЕ |М/ |К ТА (зв. зв, (зв (зв (звRINRRO | 1 | (R TO |E (s |kK TA (zv. zv. (zv, |zv (zv rRISHZZZ6MU| 4 | (R TO (EE |M/ |K TA (zv. zv. (zv (zv)
ЕщРІ2го | 9 | Р ТО |Р Р ТА ЩО Цобор |обор )|обор |обор |оборEshRI2go | 9 | R TO |Р R TA WHAT Tsobor |obor )|obor |obor |obor
ЕшРІЗО | ло | Р ТО |Р Р |К ТЕ Собор |обор )|обор |обор |обор кіз |з (Р ТО |(Р ЇМ ТА 0 (обор |/не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кІза | 14 (С (Р ТО (Р ЇМ |К ТЕ Собор |обор )|невизн.обор |не визн. кіз7 |15|- | То (Р ЇМ |К ТА Ообор |/не визн.|не визн.| не визн.| не визн.EshRIZO | lo | R TO |Р R |K TE Cathedral | 14 (S (R TO (R YIM |K TE Cathedral |obor )|unrecognized obor |not recognized kiz7 |15|- | To (R YIM |K TA Oobor |/not recognized|not recognized| not recognized | not recognized
Кгоз | 16 | о (Р ЇМ |К ТЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн.Kgoz | 16 | o (R YIM |K TE Oobor |/|not recognised|not recognised| not recognised| not recognised
ЕшРІЗб6 | 1117 (С То (Р Р |К ТА О(обор |обор )|обор |обор |оборEshRIZb6 | 1117
ЕШР2Ог | 12 |. (С То (Р Р |К ТЕ Собор |обор )|обор |обор |оборESHR2Og | 12 |. (S To (Р R |K TE Cathedral |turn)|turn |turn |turn
Кго5 |18 | ТА ТО |Р |Е |К ЦЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн.Kgo5 |18 | TA TO |R |E |K THIS Oobor |/|not recognized|not recognized| not recognized not recognized
Кг58 | 19| |м ТО (Р Р |К ЦЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кз0о |2г1 | | То (Р Р |кК (б Ообор |/не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кз63 | 29| |Р 3. (Р |Е |К ЦЕ Цобор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кзо6 | 24 | | (3. (Р Р |К ТЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кзоз | 22|1 | ТО (Р Р |К ТЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кзо4 | 2гз|Мм | То (Р Р |К ТЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн. кзбо | 27 |! |Р ТО |Р |Е |К ЦЕ Ообор |/|не визн.| не визн.| не визн.| не визн. кзбї |28|м (Р (ТО |Р |є |К ЦЕ Ообор не визн.| не визн.| не визн.| не визн.Kg58 | 19| |m TO (Р R |K CE Oobor |/|not recognized|not recognized| not recognized| not recognized kz0o |2g1 | | To (Р R |kK (b Oobor |/not recognized|not recognized .| not recognized| not recognized kz63 | 29| |R 3. (R |E |K ČE Tsobor |/|not recognized|not recognized| not recognized| not recognized kzo6 | 24 | | (3 . | not recognized| not recognized kzo4 | 2gz|Mm | To (Р R |K TE Oobor |/|not recognized|not recognized| not recognized| not recognized kzbo | 27 |! |Р TO |Р |E |K THIS Oobor |/|not recognized| not recognized| not recognized| not recognized because |28|m (TO |R |is |K THIS Oobor not recognized| not recognized| not recognized | not recognized
Усі варіанти ГФПД, отримані як описано в Прикладах 1-9, не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, і в той же час швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту підвищену настільки, що інгібітори ГФПД більш не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але стають повністю оборотними інгібіторами.All variants of HFPD obtained as described in Examples 1-9 have no or significantly reduced affinity for HFPD inhibitors, and at the same time the rate of dissociation of HFPD inhibitors from the enzyme is increased to such an extent that the HFPD inhibitors no longer act as slow-binding or slowly, tightly binding inhibitors, but become fully reversible inhibitors.
Приклад 11. Трансформація соїExample 11. Transformation of soybeans
Трансформація сої досягається використанням добре відомих методів, таких як описаний для трансформації напівнасінних експлантатів сої, опосередкованої Адгобасієгішт ішптегасіепв, використовуючи в основному метод, описаний Ра; і ін. (2006), Ріапі се Вер. 25:206.Transformation of soybeans is achieved using well-known methods, such as those described for the transformation of semi-seed explants of soybeans, mediated by Adgobasiegisht ishptegasiepv, using mainly the method described by Ra; etc. (2006), Riapi se Ver. 25:206.
Трансформанти ідентифікували, використовуючи як селективний маркер темботріон або ізоксафлютол. Спостерігалася поява зелених паростків, задокументована як індикатор стійкості до гербіцидів ізоксафлютолу або темботріону. Стійкі трансгенні паростки демонстрували нормальне позеленіння в порівнянні з паростками сої дикого типу, не обробленими ізоксафлютолом або темботріоном, у той час як паростки сої дикого типу, оброблені тими ж кількостями ізоксафлютолу або темботріону, повністю знебарвилися. Це вказує, що присутність білка ГФПД створює можливість стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, на зразок ізоксафлютолу або темботріону.Transformants were identified using tembotrione or isoxaflutol as a selective marker. Green sprouting was observed, documented as an indicator of resistance to the herbicides isoxaflutol or tembotrione. Resistant transgenic sprouts showed normal greening compared to wild-type soybean sprouts not treated with isoxaflutol or tembotrione, while wild-type soybean sprouts treated with the same amounts of isoxaflutol or tembotrione were completely decolored. This indicates that the presence of the HFPD protein creates the possibility of resistance to HFPD inhibitor herbicides such as isoxaflutol or tembotrione.
Стійкі зелені паростки переносили в середовище для вкорінення або прищеплювали.Resistant green sprouts were transferred to a medium for rooting or grafted.
Укорінені саджанці поміщали в грунт і переносили в теплицю після періоду акліматизації. Потім рослини, що містять трансген, обприскували гербіцидами-інгібіторами ГФПД, для прикладу - темботріоном у кількості 100 г Ага або мезотріоном у кількості 300 г АІ/га з додаванням сульфату амонію й метилового ефіру рапсової олії. Через десять днів після застосування гербіциду симптоми, що з'явилися, оцінювали й порівнювали із симптомами, що спостерігалися в рослин дикого типу в тих же умовах.The rooted seedlings were placed in the soil and transferred to the greenhouse after a period of acclimatization. Then, the plants containing the transgene were sprayed with GFPD inhibitor herbicides, for example, tembotrione in the amount of 100 g of Aga or mesotrione in the amount of 300 g of AI/ha with the addition of ammonium sulfate and rapeseed oil methyl ether. Ten days after the application of the herbicide, the symptoms that appeared were evaluated and compared with the symptoms observed in wild-type plants under the same conditions.
Приклад 12. Стійкість рослин сої до мезотріонуExample 12. Resistance of soybean plants to mesotrione
Рослини сої ТО, які експресують стійкий до інгібіторів ГФПД фермент згідно із даним винаходом, разом з геном, що надає стійкість до гліфозату й геном, що надає стійкість до глюфозинату або що мають " рослинну касету експресії"? що включає тільки стійкий до інгібіторів ГФПД фермент, перевіряли на стійкість до мезотріону. До тепличних випробувань трансгенних рослин трансформанти сої регулярно перевіряли на експресію й присутність трансгенів за допомогою методу виявлення білка ЕГ І5А (детальний опис див. у розділах Г і Е).TO soybean plants that express a GFAP inhibitor-resistant enzyme according to the present invention together with a gene conferring resistance to glyphosate and a gene conferring resistance to glufosinate or having a "plant expression cassette"? containing only the enzyme resistant to GFAP inhibitors, was tested for resistance to mesotrione. Prior to greenhouse trials of transgenic plants, soybean transformants were routinely screened for the expression and presence of transgenes using the EG I5A protein detection method (see Sections G and E for a detailed description).
Для аналізу стійкості до гербіцидів використовували тільки рослини, виділені на селективному середовищі і які мають експресією трансгенного білка ГФПД, що виявляється. РозпилювачFor the analysis of resistance to herbicides, only plants isolated on a selective medium and having the expression of the transgenic protein GFPD, which is detectable, were used. Sprayer
Оемгіеє ТгасКкег Зргауег калібрували перед кожним обприскуванням. Хімічною рецептурою, використаною в перевірці на мезотріон (МЗТ), була рецептура СаїйсіоФ 4 КС із додаванням сульфату амонію й метилованої рапсової олії (Асійгор). Тести з обприскуванням проводили, використовуючи ЗХ польової кількості (еквівалентно 9 рідких унцій на акр тієї ж рецептури гербіциду, що містить 40 95 активного інгредієнта (АЇ) мезотріону), що дорівнює 316 грам АЇ на гектар. Стійкість оцінювали через тиждень після обприскування. Рослини сої дикого типу, обприскані тією ж рецептурою гербіциду, повністю знебарвилися й показували 100 95 ушкодженого листя. Рейтинг стійкості "О" присвоювали рослинам, у яких повністю знебарвилися верхівки паростків, нововипущені трилисники й деякі пазушні бруньки. Рейтинг "1" присвоювали рослинам з низькою стійкістю, тобто наймолодші тканини паростка мали деяке зелене листя й не були повністю знебарвлені. Рейтинг "2" присвоювали рослинам із середньою стійкістю, тобто більш 50 95 площі листя трьох верхніх трилисників не показували хлорозу або знебарвлюючих ушкоджень. Рейтинг "3" присвоювали рослинам з майже зробленою стійкістю, тобто менше 10 95 площі листя показували хлороз або знебарвлення. Результати показано в Таблиці 13.Oemgieee TgasKkeg Zrgaueg was calibrated before each spraying. The chemical formulation used in the test for mesotrione (MZT) was the formulation of SaiysioF 4 KS with the addition of ammonium sulfate and methylated rapeseed oil (Asiyhor). Spray tests were conducted using a 3X field rate (equivalent to 9 fluid ounces per acre of the same herbicide formulation containing 40 95 active ingredient (AI) mesotrione), which equates to 316 grams AI per acre. Resistance was assessed one week after spraying. Wild-type soybean plants sprayed with the same herbicide formulation were completely discolored and showed 100 95 damaged leaves. The resistance rating "O" was assigned to plants in which the tops of sprouts, newly released shamrocks and some axillary buds were completely discolored. A rating of "1" was assigned to plants with low resistance, meaning the youngest shoot tissues had some green leaves and were not completely discolored. The rating "2" was assigned to plants with medium resistance, that is, more than 50 95 of the leaf area of the three upper shamrocks did not show chlorosis or discoloring damage. A rating of "3" was assigned to plants with almost complete resistance, that is, less than 10 95 of the leaf area showed chlorosis or discoloration. The results are shown in Table 13.
Таблиця 13Table 13
Оцінка ушкоджень площі листя подій трансгенної сої ТО, які експресують різні варіанти ГФПД, через сім днів обробки мезотріоном у кількості ЗХ від польового, еквівалентно 316 грам АїЇ на гектар. Рейтинг "1" присвоювали рослинам з низькою стійкістю, тобто наймолодші тканини паростка мали деяке зелене листя й не були повністю знебарвлені. Рейтинг "2" присвоювали рослинам із середньою стійкістю, тобто більш 50 95 площі листя трьох верхніх трилисників не показували хлорозу або знебарвлюючих ушкоджень. Рейтинг "3" присвоювали рослинам з майже зробленою стійкістю, тобто менше 10 95 площі листя показували хлороз або знебарвлення. Різні рослинні касети експресії конструювали або з ферментом (-ами), що надають стійкість тільки до гербіцидів-інгібіторів ГФПД (Нт-одинарний), або, що надають стійкість за трьома різними за механізмами дії гербіцидами (Нт-потрійний), тобто, інгібіторамEvaluation of damage to the leaf area of transgenic TO soybean events expressing different variants of GFPD after seven days of treatment with mesotrione at an amount of ZX from the field, equivalent to 316 grams of AiY per hectare. A rating of "1" was assigned to plants with low resistance, meaning the youngest shoot tissues had some green leaves and were not completely discolored. The rating "2" was assigned to plants with medium resistance, that is, more than 50 95 of the leaf area of the three upper shamrocks did not show chlorosis or discoloring damage. A rating of "3" was assigned to plants with almost complete resistance, that is, less than 10 95 of the leaf area showed chlorosis or discoloration. Different plant expression cassettes were constructed either with enzyme(s) conferring resistance only to GFPD-inhibiting herbicides (Ht-single) or conferring resistance to three herbicides with different mechanisms of action (Ht-triple), i.e., inhibitors
ГФПД, гліфозату й глюфозинату. гФПД МО: експресїї 0 | 1 | 2 | 3 | рослинGFPD, glyphosate and glufosinate. gFPD MO: expression 0 | 1 | 2 | 3 | plants
РІЕМО43 | 7 |НТпотрйнийї// | 6 | 718 | 26 | 20 | 7RIEMO43 | 7 |NTtriple// | 6 | 718 | 26 | 20 | 7
РІЕМОД4Д | 8 |НТпотрйнийї// | 4 | 22 | 19 | 26 | лRIEMOD4D | 8 |NTtriple// | 4 | 22 | 19 | 26 | l
РІЕМО44 | 8 |НТодинарлий.їу/ | 7 | 714 | 43 | 21 | 85RIEMO44 | 8 |NTodinarly.iu/ | 7 | 714 | 43 | 21 | 85
ЕШРІ2 | 19 |НТпотрійнийї// | 13 | 718 35 | 12 | 78ESHRI2 | 19 |NTtriple// | 13 | 718 35 | 12 | 78
ШР2О2 | 12 |НТпотрйнийї// | 7 | 8 | ло | 14 | 39SHR2O2 | 12 |NTpotrynyi// | 7 | 8 | lo | 14 | 39
З 713 регенерованих і відібраних трансгенних трансформантів більше 25 95 показало високий рівень стійкості з менше ніж 10 95 ушкоджень від загальної площі листя. У загальному -70 95 перевірених трансгенних рослин візуально були оцінені як такі, що мають рейтинг стійкості від середнього до високого.Of the 713 regenerated and selected transgenic transformants, more than 25 95 showed a high level of resistance with less than 10 95 lesions per total leaf area. A total of -70,95 tested transgenic plants were visually rated as having a moderate to high resistance rating.
Крім того, експресія трьох різних ферментів, що надають стійкість до трьох різних класів механізмів дії (сполуки-інгібітори ГФПД, гліфозат і глюфозинат), не заважала прояву стійкості до інгібітора ГФПД. Трансгенні рослини, трансформовані тільки стійким до інгібітора ГФПДIn addition, the expression of three different enzymes conferring resistance to three different classes of mechanisms of action (GFPD inhibitor compounds, glyphosate and glufosinate) did not interfere with the manifestation of resistance to the GFPD inhibitor. Transgenic plants transformed only with resistance to the GFPD inhibitor
Зо ферментом - варіантом згідно із даним винаходом, показали розподіл рейтингів, схожу з таким у накопичених подій.With the enzyme variant according to the present invention, they showed a distribution of ratings similar to that of accumulated events.
Приклад 13: Створення й селекція ТО рослин бавовнику.Example 13: Creation and selection of TO cotton plants.
Трансформації бавовнику досягали використанням добре відомих методів, віддаючи особливу перевагу методу, описаному в патентній публікації МУО 00/71733. Регенеровані рослини переносили в теплицю. Після періоду акліматизації достатньо підрослі рослини обприскували гербіцидами-інгібіторами ГФПД, наприклад, еквівалентом темботріону від 100 до 200 г АІ/га з додаванням сульфату амонію й метилового ефіру рапсової олії. Через сім днів після застосування обприскування симптоми, що з'явилися, оцінювали й порівнювали із симптомами, що спостерігалися в рослин бавовнику дикого типу, що зазнали такої ж обробки в тих же умовах.Cotton transformations were achieved using well-known methods, giving particular preference to the method described in patent publication MUO 00/71733. The regenerated plants were transferred to the greenhouse. After the acclimatization period, sufficiently grown plants were sprayed with GFPD inhibitor herbicides, for example, the equivalent of tembotrione from 100 to 200 g AI/ha with the addition of ammonium sulfate and rapeseed oil methyl ether. Seven days after the application of the spray, the symptoms that appeared were evaluated and compared with those observed in wild-type cotton plants subjected to the same treatment under the same conditions.
Приклад 14. Трансформація рослинних клітин кукурудзи Адгобасіегіит-опосередкованою трансформацієюExample 14. Transformation of corn plant cells by Adgobasiegiite-mediated transformation
Конструювання рослинної касети експресії для стабільної експресії в рослині кукурудзи й трансформація кукурудзи добре відомі в даній галузі техніки, і в даному конкретному прикладі описані й використані методи з патентних публікацій УУ02014/043435 і УМ/О2008/100353.The construction of a plant expression cassette for stable expression in a maize plant and the transformation of maize are well known in the art, and this particular example describes and utilizes methods from patent publications UU02014/043435 and UM/O2008/100353.
Полінуклеотидні послідовності, що кодують варіанти ГФПД у даній заявці, були об'єднані з послідовністю ДНК, що кодує варіант більа ЕРБР5 для надання стійкості до гербіцидів, що націлюються на ЕРБР5. Ген ЕРБР5 був ізольований і мутований з Агіпгобасіег діорітогтів (МУО2008/100353) і приєднаний усередині рамки до послідовності транзитного пептиду для напрямку транслокації трансльованого білка на хлоропласт. Стабільної експресії досягали за допомогою загальнопоширеного промотору (убіквітин-4-промотор із цукрового очерету, ПатентThe polynucleotide sequences encoding the GFPD variants in this application were fused to the DNA sequence encoding the ERBR5 pain variant to confer resistance to ERBR5-targeting herbicides. The ERBR5 gene was isolated and mutated from Agipgobasieg dioritogts (MUO2008/100353) and joined in-frame to a transit peptide sequence for the direction of translocation of the translated protein to the chloroplast. Stable expression was achieved using a common promoter (ubiquitin-4 promoter from sugar cane, Patent
США Мо 6,638,766) і послідовністю переривання 355 з вірусу мозаїки кольорової капусти, які відповідно клонували вище й нижче гена ЕРБР5.US Mo 6,638,766) and the interruption sequence 355 from the cauliflower mosaic virus, which were respectively cloned upstream and downstream of the ERBR5 gene.
Відповідні варіанти ГФПД клонували з таким же промотором, хлоропластним транзитним пептидом і послідовністю переривання, які описані для касети експресії гена ЕРБР5. Кодуючі послідовності обох генів кодон-оптимізували для експресії в кукурудзі. Для трансформації кукурудзи качани найкраще збирати через 8-12 днів після запилення. З качанів ізолювали ембріони, і для трансформації переважно використовували ембріони розміром 0,8-1,5 мм.The corresponding variants of HFPD were cloned with the same promoter, chloroplast transit peptide and interruption sequence as described for the ERBR5 gene expression cassette. The coding sequences of both genes were codon-optimized for expression in corn. For corn transformation, the cobs are best harvested 8-12 days after pollination. Embryos were isolated from cobs, and embryos 0.8-1.5 mm in size were mainly used for transformation.
Ембріони накладали щитком догори на підходяще інкубаційне середовище й інкубували на ніч при 25 "С у темряві.Embryos were placed shield-side up on a suitable incubation medium and incubated overnight at 25 °C in the dark.
Однак, інкубувати ембріони саме на ніч не було обов'язковим рег зе. Ембріони приводили в контакт зі штамом Адгобасіегішт, що містять потрібні вектори, що включають нуклеотидну послідовність згідно із даним винаходом для опосередкованого Ті-плазмідою переносу,However, it was not mandatory to incubate the embryos overnight. Embryos were contacted with Adgobasiegisht strain containing the desired vectors comprising the nucleotide sequence of the present invention for T-plasmid-mediated transfer,
Зо протягом близько 5-10 хв, і потім накладали на середовище для спільного культивування приблизно на З дні (при 25"С у темряві). Після спільного культивування експлантати переносили на середовище періоду відновлення приблизно на 5 днів (при 25 "С у темряві).Zo for about 5-10 min, and then put on the medium for co-cultivation for about 3 days (at 25 "C in the dark). After co-cultivation, the explants were transferred to the medium of the recovery period for about 5 days (at 25 "C in the dark) .
Експлантати інкубували на селективному середовищі із гліфозатом протягом до 8 тижнів, залежно від природи й характеристик конкретного використаного селективного середовища.Explants were incubated on selective medium with glyphosate for up to 8 weeks, depending on the nature and characteristics of the specific selective medium used.
Після періоду селекції отриманий калус переносили в середовище дозрівання ембріонів, поки не спостерігалося утворення зрілих соматичних ембріонів. Отримані зрілі соматичні ембріони потім поміщали під слабке освітлення й ініціювали процес регенерації, як відомо в даній галузі.After the selection period, the resulting callus was transferred to the embryo maturation medium until the formation of mature somatic embryos was observed. The resulting mature somatic embryos were then placed under low light and initiated the regeneration process as is known in the art.
Отриманим паросткам дозволяли вкоренитися в середовищі для вкорінення, і отримані рослини переносили в горщики для розсади й розмножували як трансгенні. Рослини регулярно аналізували на експресію й присутність трансгенів, використовуючи метод виявлення білківThe resulting sprouts were allowed to root in a rooting medium, and the resulting plants were transferred to seedling pots and propagated as transgenics. Plants were regularly analyzed for the expression and presence of transgenes using the protein detection method
ЕГІБА. Для аналізу стійкості до гербіцидів використовували тільки рослини, виділені на селективному середовищі, і які мають експресію трансгенного білка ГФПД, що виявляється.EGIB. For the analysis of resistance to herbicides, only plants isolated on a selective medium and having a detectable expression of the transgenic protein GFPD were used.
Приклад 15. Стійкість ТО-рослин кукурудзи до гербіцидів ГФПД у тепличних дослідженняхExample 15. Resistance of TO plants of corn to GFPD herbicides in greenhouse studies
Регенеровані події ТО із клітинної культури пересаджували у квадратні горщики площею 2 дюйми із синтетичним грунтом (РаїагафФ Міх) і добривом з контрольованим вивільненням (НаїйїаRegenerated TO events from cell culture were transplanted into 2-inch square pots with synthetic soil (Raiagaf Mich) and a controlled-release fertilizer (Naiiia
Мийісоїейт; покрите полімером добриво з контрольованим вивільненням, МРК Рго 18-6-12 мікронутрієнти) і вирощували в теплиці (ТП) під додатковими натрієвими лампами високого тиску впродовж 12 днів при максимальній температурі 30 "С днем і мінімальній 22 "С уночі.Miyisoieit; polymer-coated fertilizer with controlled release, MRK Rgo 18-6-12 micronutrients) and grown in a greenhouse (TP) under additional high-pressure sodium lamps for 12 days at a maximum temperature of 30 "C during the day and a minimum of 22 "C at night.
Повністю відновлені рослини переносили у квадратні горщики площею 5 дюймів із синтетичним грунтом і добривом з контрольованим вивільненням за тих самих умов навколишнього середовища. Після закінчення семи днів ТО-рослини обприскували 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-Fully recovered plants were transferred to 5-inch square pots with synthetic soil and controlled-release fertilizer under the same environmental conditions. After the end of seven days, TO-plants were sprayed with 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-
М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамідом (Спол. 4); в агрономічно значимій концентрації 100 г АйЇ/га (при цьому "г Ага" означає "грам активного інгредієнта на гектар", приготовленому з рецептури СП20 (змочуваний порошок 2095), з додаванням суміші етерифікованих рослинних олій (Назіепіт ад'юванти для спреїв, 0,578 95 об./06.) і сульфатом амонію (АМС, 0,97 95 мас/ об). Обробку гербіцидом проводили в системі ЮОемгіє5 ТгасКег 5ргауег за стандартними протоколами застосування, добре відомими у даній галузі. Як контроль подіїM-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide (Col. 4); in an agronomically significant concentration of 100 g AI/ha (while "g Aha" means "gram of active ingredient per hectare", prepared from the recipe SP20 (wettable powder 2095), with the addition of a mixture of esterified vegetable oils (Naziepit adjuvants for sprays, 0.578 95 vol./06.) and ammonium sulfate (АМС, 0.97 95 wt/vol). Herbicide treatment was carried out in the UOemgie5 TgasKeg 5rgaueg system according to standard application protocols well known in this field. As a control event
ТО обприскували сумішшю ад'ювантів без гербіциду. Усі події ТО, обприскані цією сумішшю, не мали знебарвлених листів. бо Якщо не вказано інше, через шість днів після обробки (ДПО) 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-TO was sprayed with a mixture of adjuvants without herbicide. All MOT events sprayed with this mixture had no discolored sheets. bo Unless otherwise specified, six days after treatment (DPO) 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-
(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)/бензамідом оцінювали ушкодження трансгенних подій ТО.(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)/benzamide was used to assess damage to transgenic TO events.
Події ТО, які експресують ген селективного маркера ЕРБР5, і які не мають варіанту типуTO events that express the ERBR5 selectable marker gene and that do not have a type variant
ГФПД, використовувалися як контрольні рослини кукурудзи й показували 100 Уо-е ушкодження листя уже при 25 г Аїга 2-хлор-3-«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду.GFPD, were used as control corn plants and showed 100 Uo-e of leaf damage already at 25 g of Aiga 2-chloro-3-methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl ) of benzamide.
Нетрансформовані рослини кукурудзи також показували 100 У5-е ушкодження листя уже при 25 г АІ/га 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензаміду.Non-transformed corn plants also showed 100 U5-e leaf damage already at 25 g AI/ha of 2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-trifluoromethyl)benzamide .
Таблиця 14 підводить підсумки трансгенних рослин кукурудзи, які експресують мутантиTable 14 summarizes the transgenic maize plants expressing the mutants
ЕГР2О2 їі БГ/Р136 білка ГФПД Рзейидотопах Пшиогезсеп5, отриманих як описано в Прикладі 14.EGR2O2 and BG/P136 of the protein HFPD Rzeiidotopakh Psiogesep5, obtained as described in Example 14.
Рослини із присвоєним рейтингом "0" показували серйозне знебарвлення листя в діапазоні від 41 95 до 100 95 ушкодження від загальної площі листя. Рейтинг "1" присвоювався рослинам, що мають середню стійкість з 16-40 95 ушкоджень від загальної площі листя. Рейтинг "2" присвоювався рослинам, що мають гарну стійкість з 6-15 906 ушкоджень від загальної площі листя. Рослини із привласненим рейтингом "3" майже не показували знебарвлення, з 5 95 або менше площі листя, ушкоджених обробкою гербіцидом.Plants rated "0" showed severe leaf discoloration ranging from 41 95 to 100 95 damage per total leaf area. The rating "1" was assigned to plants with average resistance with 16-40 95 injuries from the total leaf area. A rating of "2" was assigned to plants with good resistance with 6-15,906 lesions per total leaf area. Plants assigned a rating of "3" showed almost no discoloration, with 5 95 or less leaf area damaged by the herbicide treatment.
Результати в Таблиці 14 демонструють, що значна частина незалежних подій ТО кукурудзи стійкі до гербіциду ГФПД /2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду в агрономічно значимих дозах 100 г АІ-га в порівнянні з контрольними рослинами.The results in Table 14 demonstrate that a significant part of the independent events of TO of corn are resistant to the herbicide GFPD /2-chloro-3-(methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1 H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl) benzamide in agronomically significant doses of 100 g AI-ha in comparison with control plants.
Приблизно 40 95 тестованих подій, які експресують РІ Р136 (п-84), показували гарну або високу стійкість із 15 95 або менше знебарвленої площі листя після обробки 100 г АІ/га Спол. 4.Approximately 40 95 tested events expressing RI P136 (p-84) showed good or high resistance with 15 95 or less discolored leaf area after treatment with 100 g AI/ha Spol. 4.
Із усіх перевірених рослин кукурудзи, які експресують ЕГР136, «15 95 показують менше, ніж 5 Фо або взагалі не показують видимого ушкодження листя.Of all EGR136-expressing corn plants tested, 15,95 show less than 5 Fo or no visible leaf damage.
Та ж картина слушна й для ТО рослин кукурудзи, які експресують РІ Р202. Більше 30 95 від загального числа тестованих подій (п-89), показували також гарну або високу стійкість із 15 95 або менше знебарвленої площі листя після обробки 100 г АЇ/га гербіциду, а «13 95 показували менше, ніж 5 95 або взагалі не показували видимого ушкодження листя.The same picture is valid for the TO of corn plants that express RI P202. More than 30 95 of the total number of events tested (p-89) also showed good or high resistance with 15 95 or less discolored leaf area after treatment with 100 g AI/ha herbicide, and 13 95 showed less than 5 95 or none at all. showed visible leaf damage.
Таблиця 14Table 14
Оцінка ушкодженої площі листя у трансгенних подій ТО кукурудзи через шість днів після застосування 2-хлор-3--(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду (Спол. 4) у кількості 100 г АІ/га. Трансгенні рослини кукурудзи, які експресують варіанти РІ Р202 або РІ Р136 білка ГФПД Рзейдотопавх Пиогезсепо, одержували як описано в Прикладі 4. Були визначені наступні класи стійкості до гербіцидів: "0": незначна стійкість; 41 95 - 100 95 площі листя ушкоджене; "17: середня стійкість; 16 95 - 41 95 площі листя ушкоджене; "2": гарна стійкість; 6 95 - 15 95 площі листя ушкоджене; "3"- висока стійкість; 0 9 - 5 95 площі листя ушкоджене.Assessment of damaged leaf area in transgenic maize TO events six days after application of 2-chloro-3-("methylsulfanyl)-M-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4-(trifluoromethyl)benzamide ( Society 4) in the amount of 100 g AI/ha. Transgenic corn plants that express variants RI P202 or RI P136 of the GFPD protein of Rzeidotopavh Pyogessepo were obtained as described in Example 4. The following classes of resistance to herbicides were determined: "0": slight resistance; 41 95 - 100 95 areas of leaves are damaged; "17: medium resistance; 16 95 - 41 95 leaf areas damaged; "2": good resistance; 6 95 - 15 95 leaf areas damaged; "3" - high resistance; 0 9 - 5 95 leaf areas damaged.
ЕШР2О2 77777771 171712 | 49 | 16, 1712 | 7777778984ДЮюЮ:ESHR2O2 77777771 171712 | 49 | 16, 1712 | 7777778984Thank you:
Коо)Coo)
Усі публікації й патентні заявки, згадані в описі, вказують на рівень навичок фахівців в галузі техніки, до якої належить цей винахід. Усі публікації й патентні заявки включені в даний опис шляхом посилання в такому ж ступені, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно й окремо позначена як включена шляхом посилання.All publications and patent applications mentioned in the description indicate the level of skill of those skilled in the art to which this invention belongs. All publications and patent applications are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and individually designated as being incorporated by reference.
Хоча викладений винахід описаний з деяким ступенем деталізації шляхом ілюстрації й прикладу з метою ясності розуміння, очевидно, що в рамках доданої формули можуть практикуватися певні зміни й модифікації.Although the disclosed invention has been described in some degree of detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, it will be apparent that certain changes and modifications may be practiced within the scope of the appended formulae.
Claims (30)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461951039P | 2014-03-11 | 2014-03-11 | |
EP14159634 | 2014-03-13 | ||
PCT/EP2015/054858 WO2015135881A1 (en) | 2014-03-11 | 2015-03-09 | Hppd variants and methods of use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA118470C2 true UA118470C2 (en) | 2019-01-25 |
Family
ID=74214410
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAA201610140A UA118470C2 (en) | 2014-03-11 | 2015-09-03 | Hppd variants and methods of use |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
MX (1) | MX2018014301A (en) |
UA (1) | UA118470C2 (en) |
-
2015
- 2015-09-03 UA UAA201610140A patent/UA118470C2/en unknown
-
2016
- 2016-09-09 MX MX2018014301A patent/MX2018014301A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX2018014301A (en) | 2020-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3116992B1 (en) | Hppd variants and methods of use | |
UA119532C2 (en) | Hppd variants and methods of use | |
CN105637091B (en) | Plants with enhanced tolerance to herbicides | |
JP6873979B2 (en) | HPPD mutants and usage | |
EP3117003B1 (en) | Hppd variants and methods of use | |
US20200063155A1 (en) | Hppd variants and methods of use | |
UA118470C2 (en) | Hppd variants and methods of use | |
US11279944B2 (en) | Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean | |
US11624076B2 (en) | TAL-effector mediated herbicide tolerance | |
CA3055396A1 (en) | Hppd variants and methods of use | |
US20210254091A1 (en) | Herbicide tolerant plants expressing a cyanobacterial plastoquinone biosynthetic pathway | |
US20200040313A1 (en) | Hppd variants and methods of use | |
EA045758B1 (en) | GFAP OPTIONS AND METHODS OF APPLICATION |