UA114190C2

UA114190C2 - Methods of treating fibrosis

Info

Publication number: UA114190C2
Application number: UAA201409891A
Authority: UA
Inventors: Серджо Бароні; Сэрджо Барони; Сальваторе Беллінвія; Сальваторэ Бэллинвия; Франческа Віті; Франческа Вити
Original assignee: Ногра Фарма Лімітед; Ногра Фарма Лимитед
Priority date: 2012-02-09
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2017-05-10
Also published as: PT2811993T; DK2811993T3; ES2755091T3

Abstract

The present disclosure is directed in part to methods of treating fibrosis, e.g., hepatic fibrosis and/or intestinal fibrosis, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a disclosed compound.

Description

Дана заявка запитує пріоритет заявки ЕР1Т2425027.5, поданої 9 лютого 2012, і заявкиThis application requests the priority of the application ЕР1Т2425027.5 filed on February 9, 2012, and the application

О.5.5.М. 61/644 544, поданої 9 травня 2012, кожна з який включена в дану заявку за допомогою посилання в повному обсязі.O.5.5.M. 61/644,544, filed May 9, 2012, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

Дана заявка включає список послідовностей, що був поданий в електронному вигляді в текстовому форматі і включений у дану заявку в повному обсязі за допомогою посилання.This application includes a sequence listing that has been submitted electronically in text format and is incorporated into this application in its entirety by reference.

Вказана текстова копія, створена 21 травня 2013, названа Р5О6Б6БРСТ 5І І і має розмір 3284 байти.The specified text copy, created on May 21, 2013, is named Р5О6Б6БРСТ 5И И and has a size of 3284 bytes.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУBACKGROUND OF THE INVENTION

Фіброз полягає у формуванні надлишкової фіброзної сполучної тканини в органі або тканині у відновному або реактивному процесі, наприклад, при загоєнні, звичайно внаслідок травми або тривалого запалення. Фіброз викликає затвердіння і/або набрякання уражених тканин і зменшує потік рідин через ці тканини. У результаті тканини, уражені фіброзом, можуть втратити здатність функціонувати належним чином.Fibrosis is the formation of excess fibrous connective tissue in an organ or tissue in a regenerative or reactive process, such as during healing, usually as a result of trauma or chronic inflammation. Fibrosis causes hardening and/or swelling of affected tissues and reduces the flow of fluids through these tissues. As a result, tissues affected by fibrosis may lose their ability to function properly.

Наприклад, фіброз печінки можна описати, як реакцію загоєння у відповідь на хронічне ураження печінки, у результаті, наприклад, алкогольної або наркотичної залежності, вірусної або паразитарної інфекції (наприклад, гепатиту, такого, як гепатит В або С), неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ),, надлишку заліза або міді, а також аутоїмунних захворювань. Усі хронічні захворювання печінки можуть приводити до фіброзу печінки, причому його основними причинами є хронічний вірусний гепатит В і захворювання печінки, викликані алкоголем.For example, liver fibrosis can be described as a healing response in response to chronic liver damage, as a result of, for example, alcohol or drug addiction, viral or parasitic infection (eg, hepatitis such as hepatitis B or C), non-alcoholic steatohepatitis (NASH) ,, an excess of iron or copper, as well as autoimmune diseases. All chronic liver diseases can lead to liver fibrosis, with chronic viral hepatitis B and alcohol-induced liver disease being the main causes.

Ендоканабіоїдна система печінки опосередковує як про-, так і анти-фіброгенний ефекти за рахунок активації різних сигнальних шляхів, які по-різному впливають на проліферацію і смерть фіброгенних типів клітин. З часом ці процеси можуть приводити до цирозу печінки, при якому структурна організація функціональних одиниць печінки розбудовується до такого ступеня, що кров протікає через печінку і діяльність печінки порушується.The liver endocannabinoid system mediates both pro- and anti-fibrogenic effects by activating different signaling pathways that differentially affect the proliferation and death of fibrogenic cell types. Over time, these processes can lead to cirrhosis of the liver, in which the structural organization of the functional units of the liver is deconstructed to such an extent that blood flows through the liver and liver function is impaired.

Фіброз печінки являє собою поширену і непросту проблему світового значення. В даний час єдиним радикальним шляхом лікування цирозу на кінцевій стадії є трансплантація, але навіть у розвинутих країнах кількість донорських органів, доступних у клінічних умовах для потенційних реципієнтів, обмежує застосовність даної методики. Прогресування фіброзу і, зокрема, цирозу,Liver fibrosis is a widespread and difficult problem of global importance. Currently, the only radical way to treat end-stage cirrhosis is transplantation, but even in developed countries, the number of donor organs available in clinical settings for potential recipients limits the applicability of this technique. Progression of fibrosis and, in particular, cirrhosis,

Зо є причиною значної захворюваності і смертності. Таким чином, існує нагальна потреба в розробці стратегій боротьби з фіброзом, які застосовні при фіброзі печінки.Zo is the cause of significant morbidity and mortality. Thus, there is an urgent need to develop anti-fibrosis strategies that are applicable to liver fibrosis.

Фіброз нирок приводить до значної захворюваності і смертності як первинна набута патологія, приводячи до необхідності діалізу або трансплантації нирок. Фіброз може виникати або у фільтруючому, або в реабсорбуючому компоненті нефрону, тобто функціональної одиниці нирки. Крім того, фіброз може виникати в серці, наприклад, фіброз серця може виявлятися у вигляді стовщення серцевого клапана.Renal fibrosis leads to significant morbidity and mortality as a primary acquired pathology, leading to the need for dialysis or kidney transplantation. Fibrosis can occur either in the filtering or in the reabsorbing component of the nephron, that is, the functional unit of the kidney. In addition, fibrosis can occur in the heart, for example, cardiac fibrosis can manifest as a thickening of the heart valve.

Фіброз кишечнику є поширеним ускладненням запального захворювання кишечнику (ЗЗК), що може виявлятися у вигляді симптомів і може потребувати хірургічного втручання, якщо в результаті фіброзу формується звуження просвіту кишечнику. Більшість традиційних і нових механізмів, які лежать в основі фіброзу кишечнику, пов'язані з хронічним запаленням.Intestinal fibrosis is a common complication of inflammatory bowel disease (IBD) that may present as symptoms and may require surgery if the fibrosis results in a narrowing of the intestinal lumen. Most of the traditional and new mechanisms that underlie intestinal fibrosis are related to chronic inflammation.

СУТЬ ВИНАХОДУESSENCE OF THE INVENTION

Даний винахід стосується, наприклад, способів лікування фіброзу, що включає введення пацієнту сполук, розкритих у тексті даної заявки. Крім того, у винаході розроблені сполуки для застосування у вказаних способах. Наприклад, у винаході розроблений спосіб профілактики або лікування фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику в суб'єкта або пацієнта, що має потребу в цьому або страждає на вказані захворювання, що включає введення терапевтично і/або фармацевтично прийнятної кількості сполуки формули: ноос ехThe present invention relates, for example, to methods of treating fibrosis, which include administering to a patient the compounds disclosed in the text of this application. In addition, the invention develops compounds for use in the specified methods. For example, the invention provides a method for the prevention or treatment of liver fibrosis and/or intestinal fibrosis in a subject or patient in need of it or suffering from the indicated diseases, which includes the administration of a therapeutically and/or pharmaceutically acceptable amount of a compound of the formula: noos ex

Же в/о 11 де замісник К:о вибраний із групи, яка складається з Н і С1-Св алкілу;The same v/o 11 where the substituent K:o is selected from the group consisting of H and C1-C8 alkyl;

замісник К:: вибраний із групи, яка складається з Н, С1-Св алкілу і -0(0)-С1-Св алкілу; замісник Е5 являє собою С1-Св алкіл; а також її фармацевтично прийнятні солі.substituent K:: selected from the group consisting of H, C1-Cv alkyl and -O(0)-C1-Cv alkyl; the E5 substituent is a C1-Cv alkyl; and its pharmaceutically acceptable salts.

У деяких варіантах здійснення, придатний замісник К5 може являти собою Н.In some embodiments, a suitable K5 substituent can be H.

Придатні варіанти Сі-Сє алкільних груп для фрагментів Ко, Ні: і/або К5 можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу.Suitable variants of C-Ce alkyl groups for fragments Co, Ni: and/or K5 can be independently selected from the group consisting of: methyl, ethyl, propyl, pentyl and hexyl.

Алкільні групи можуть бути лінійними або розгалуженими. Особливо переважними є метильні і етильні алкільні групи, причому метил є найбільш переважною алкільною групою.Alkyl groups can be linear or branched. Methyl and ethyl alkyl groups are particularly preferred, with methyl being the most preferred alkyl group.

Придатними точками приєднання атома азоту до циклу можуть бути положення 2", 3, 4" або 5. Переважно, азот приєднаний за положеннями 3' або 4". Найбільш переважним є положення 4.Suitable points of attachment of the nitrogen atom to the ring can be positions 2", 3, 4" or 5. Preferably, the nitrogen is attached at positions 3' or 4". The most preferred position is 4.

Типові сполуки за даним винаходом можуть мати формули А і А", де замісники Ко, Вч: і К5 відповідають даним вище визначенням і де нос,Typical compounds according to the present invention can have the formulas A and A", where the substituents Ko, Vch: and K5 correspond to the above definitions and where the nose,

ОК ноОс щ во воOK noOs sh wo wo

Р А"; Р А".R A"; R A".

Алкільні групи можуть бути лінійними або розгалуженими. Особливо переважними є метильні і етильні алкільні групи, причому метил є найбільш переважною алкільною групою. У деяких варіантах здійснення, К5 означає метил, етил, пропіл або, наприклад, метил. У деяких варіантах здійснення, К5 означає метил, етил, пропіл або, наприклад, метил.Alkyl groups can be linear or branched. Methyl and ethyl alkyl groups are particularly preferred, with methyl being the most preferred alkyl group. In some embodiments, R5 is methyl, ethyl, propyl, or, for example, methyl. In some embodiments, R5 is methyl, ethyl, propyl, or, for example, methyl.

Крім того, даний винахід стосується способу профілактики або лікування фіброзу печінки або кишечнику, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, фармацевтичного препарату, який включає РРАКУ агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці. Винахід охоплює способи профілактики або лікування фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу і/або нефрогенного системного фіброзу, що включають уведення пацієнту, якому це необхідно, фармацевтичного препарату, що включає РРАКу агент, наприклад, сполуку,In addition, the present invention relates to a method of preventing or treating fibrosis of the liver or intestines, which includes administering to a patient in need thereof a pharmaceutical preparation that includes a PARC agent, for example, a compound disclosed in this application. The invention encompasses methods for the prevention or treatment of renal fibrosis, cardiac fibrosis, endomyocardial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, myelofibrosis, retroperitoneal fibrosis and/or nephrogenic systemic fibrosis, comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical preparation comprising a PRAC agent, e.g., a compound ,

Зо розкриту в даному винаході. Способи, розкриті в даній заявці, можуть, наприклад, включати способи, у яких пацієнт є людиною. Відповідно, сполуки, описані в даній заявці, можуть застосовуватися для лікування і/або профілактики вказаних захворювань/станів.From disclosed in this invention. The methods disclosed in this application may, for example, include methods in which the patient is a human. Accordingly, the compounds described in this application may be used for the treatment and/or prevention of the specified diseases/conditions.

Ці й інші аспекти і переваги даного винаходу стануть зрозумілі з наведеного нижче ілюстративного матеріалу, докладного опису і формули винаходу.These and other aspects and advantages of this invention will become clear from the following illustrative material, detailed description and claims.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУРBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

На фіг. 1 зображена зміна маси тіла мишей при введенні СсСіх, УМ/ Н-133 і сполуки 34.In fig. 1 shows the change in body weight of mice after the introduction of CsSikh, UM/H-133 and compound 34.

На фіг. 2 (А) наведене розшифрування балів шкали МЕТАМІК і (В) відображений вплив уведення СсСі, УМ/Н-133--ССІ 4 і сполуки 344-ССі4 на печінку, і наведені результати за шкалоюIn fig. 2 (A) the decoding of the METAMIK scale points is given and (B) the effect of the introduction of СсСи, UM/Н-133-ССИ 4 and the compound 344-ССи4 on the liver is displayed, and the results are shown according to the scale

МЕТАМІК для кожної групи.METAMIK for each group.

На фіг. З (А) відображені результати за шкалою МЕТАМІК і (В) результати за адаптованою шкалою МЕТАМІК для печінки мишей, що піддавалися дії ССіх, УМ/Н-1334-4-0С14 і сполуки 344.In fig. (A) shows the results according to the METAMIK scale and (B) the results according to the adapted METAMIK scale for the livers of mice exposed to SSikh, UM/N-1334-4-0C14 and compound 344.

На фіг. 4 відображена дія ССі4, УМ/Н-133--С СІ 4 і сполуки 34-ССі» на рівні а-ЗМА і колагену-1.In fig. 4 shows the effect of CCi4, UM/H-133--C CI 4 and compound 34-CCi" on the level of α-ZMA and collagen-1.

На фіг. 5 наведений розклад дослідження кишкового фіброзу.In fig. 5 shows the schedule of the study of intestinal fibrosis.

На фіг. 6 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.In fig. 6 shows the effect of compound 34 on the colon of mice with intestinal fibrosis.

На фіг. 7 наведена протизапальна дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.In fig. 7 shows the anti-inflammatory effect of compound 34 on the colon of mice with intestinal fibrosis.

На фіг. 8 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.In fig. 8 shows the effect of compound 34 on the colon of mice with intestinal fibrosis.

На фіг. 9 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику, визначена за результатами імуногістохімічного аналізу основних маркерів фіброзу (колагену І1-In fig. 9 shows the effect of compound 34 on the colon of mice with intestinal fibrosis, determined by the results of immunohistochemical analysis of the main markers of fibrosis (collagen I1-

І, СТОР, МАО 2/3, РОСЕ, а-5МА і ТОБЕ-В1).I, STOR, MAO 2/3, ROSE, a-5MA and TOBE-B1).

На фіг. 10 показана дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику, визначена за допомогою вестерн-блотингу.In fig. 10 shows the effect of compound 34 on the colon of mice with intestinal fibrosis, determined by Western blotting.

На фіг. 11 показана крива маси тіла мишей, яким вводили О55 і О555-0Е0.In fig. 11 shows the body weight curve of mice injected with O55 and O555-0E0.

На фіг. 12 показаний рівень розвитку фіброзу в ободовій кишці мишей, що одержували О55 іIn fig. 12 shows the level of development of fibrosis in the colon of mice that received O55 and

О05550Е0 порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду.O05550E0 compared to control mice that received plain water.

На фіг. 13 показані результати мікроскопічного дослідження ободової кишки мишей із хронічним колітом, які одержували 055 і 0555-5ЕО. Тканини ободової кишки фіксували в 4 90РЕА і поперечні зрізи (4 мкм) забарвлювали барвником Мея-Грюнвальда-Гімза (НеЕЕ) і трихромом за Масоном. Миші 055 демонстрували сильний ступінь запалення і фіброзу, як у підслизуватому шарі, так і в серозній оболонці порівняно з контрольними тваринами, у той час як уведення ЗЕЮО забезпечувало відновлення нормальної структури кишкової стінки. Дані наведені у вигляді середнє значення Ж55ЕМ (стандартна помилка середнього значення); "жр«0,05 и -р«001 і ихр«0,005 відносно НгО.In fig. 13 shows the results of microscopic examination of the colon of mice with chronic colitis that received 055 and 0555-5EO. Colon tissues were fixed in 4 90 REA and transverse sections (4 μm) were stained with May-Grunwald-Giems (NeEE) dye and Masson's trichrome. Mice 055 showed a strong degree of inflammation and fibrosis, both in the submucosal layer and in the serosal membrane compared to control animals, while the administration of ZEUO ensured the restoration of the normal structure of the intestinal wall. The data are given as the average value of Zh55EM (standard error of the mean value); "zhr"0.05 and -r"001 and ihr"0.005 relative to NgO.

На фіг. 14 показані результати імуногістохімії і імуноблотингу основних маркерів фіброзу.In fig. 14 shows the results of immunohistochemistry and immunoblotting of the main markers of fibrosis.

Мікрофотографії демонструють значне зменшення рівнів колагену І-Ш (а), 4-ЗМА (Б) у 055 мишей, яким вводили СЕО, порівняно з мишами з О55-індукованим хронічним колітом. Рівні цих маркерів вимірювали також за допомогою Вестерн-блотингу, підтверджуючи профіль експресії, індукований СЕЮО. Показано характерні результати блотингу. "-р«0,05; -р«0,01. М-6 мишей у контрольній групі, 8 мишей у групі 055, 8 мишей у групі О55505Е0.Photomicrographs show a significant decrease in the levels of collagen I-W (a), 4-ZMA (b) in 055 mice injected with CEO compared to mice with О55-induced chronic colitis. The levels of these markers were also measured by Western blotting, confirming the expression profile induced by CESO. Typical blotting results are shown. "-p"0.05; -p"0.01. M-6 mice in the control group, 8 mice in the 055 group, 8 mice in the O55505E0 group.

На фіг. 15 наведені мікрофотографії, які демонструють значне зменшення рівнів ТОЕ-В1 (а),In fig. 15 shows photomicrographs that demonstrate a significant decrease in the levels of TOE-B1 (a),

ЗМАЮ 2/3 (р), СТОК (с) у 055 мишей, яким вводили СЕО, порівняно з мишами з хронічним колітом, викликаним Ю55.ZMAYU 2/3 (p), FLOW (c) in 055 mice injected with CEO compared with mice with chronic colitis caused by Yu55.

На фіг. 16 показаний вплив уведення СЕО на рівні білка І/-13 у мишей, що постійно одержували 055, а також похідних медіаторів, а саме - ТаБ-В1 і СТОР. Рівні І--13, ТОБ-ДІ1 іIn fig. 16 shows the effect of CEO administration on the level of I/-13 protein in mice that constantly received 055, as well as derivative mediators, namely TaB-B1 and STOR. Levels I--13, TOB-DI1 and

СТОБ визначали за допомогою вестерн-блотингу. Дані виражені у відсотках від середніх значень для контрольних тварин. Показані репрезентативні результати блотингу. "-р«0,01. М-6STOB was determined using western blotting. Data are expressed as a percentage of mean values for control animals. Representative blotting results are shown. "-p" 0.01. M-6

Зо мишей у контрольній групі, 8 мишей у групі О55, 8 мишей у групі О55-СЕ0.Of the mice in the control group, 8 mice in the О55 group, 8 mice in the О55-СЕ0 group.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Даний винахід частково оснований на даних про те, що деякі сполуки, розкриті в даній заявці, мають здатність запобігати або лікувати фіброз, наприклад, печінки або ободової кишки.The present invention is based in part on the evidence that some of the compounds disclosed in this application have the ability to prevent or treat fibrosis, for example, of the liver or colon.

В одному з аспектів, винахід спрямований на способи профілактики або лікування фіброзу, наприклад фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику, у пацієнтів, яким це необхідно. Способи за даним винаходом включають уведення сполук, розкритих у даній заявці.In one aspect, the invention is directed to methods of preventing or treating fibrosis, such as liver fibrosis and/or intestinal fibrosis, in patients in need thereof. The methods of the present invention include administration of the compounds disclosed herein.

Перед подальшим описом винаходу нижче по тексту зібрані визначення деяких термінів, використовуваних в описі, прикладах і прикладеній формулі винаходу. Ці визначення варто сприймати у світлі частини опису, який залишився, і розуміти так само, як їх розуміють фахівці в даній галузі техніки. Якщо не вказане інше, усі технічні і наукові терміни, використані в описі, мають ті ж значення, що традиційно розуміються під ними рядовими фахівцями в даній галузі техніки. "Пацієнт", "суб'єкт" або "хазяїн", якого передбачається лікувати способом за даним винаходом може означати як людину, так і тварину, що не є людиною, наприклад, дрібного ссавця, такого, як щур або миша, а також кінь, корова, собака, кішка і т. д.Before the further description of the invention, the definitions of some terms used in the description, examples and the attached claims of the invention are collected below. These definitions should be read in light of the remaining portion of the description and understood as understood by those skilled in the art. Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in the description have the same meanings as are traditionally understood by ordinary specialists in this field of technology. A "patient", "subject" or "host" intended to be treated by the method of the present invention can mean either a human or a non-human animal, for example a small mammal such as a rat or mouse, as well as a horse , cow, dog, cat, etc.

Термін "терапевтичний агент" відомий у техніці і стосується будь-якої хімічної частинки, що є біологічно, або фізіологічно фармакологічно активною речовиною, яка місцево і/або системно діє в організмі суб'єкта. Приклади терапевтичних агентів, які називаються також "лікарськими засобами", описані в добре відомих літературних джерелах, таких, як Мегск Іпдех, Ше РНузісіапе ревзК Кеїегепсе і Те РІагтасоїіодіса! Вазіє ої Тпегарешіс5, і такі засоби включають, не обмежуючи вказаними, медикаменти; вітаміни; мінеральні добавки; речовини, застосовувані для лікування, профілактики, діагностики, усунення або ослаблення хвороби або захворювання; речовини, що впливають на будову або функції організму; або проліки, які набувають біологічної активності або стають активнішими після того, як їх вміщують у фізіологічне середовище.The term "therapeutic agent" is known in the art and refers to any chemical particle that is a biologically or physiologically pharmacologically active substance that acts locally and/or systemically in the subject's body. Examples of therapeutic agents, also called "drugs", are described in well-known literature sources such as Megsk Ipdeh, She RNuzisiape revzK Keiegepse and Te RIagtasoiiodisa! Vasie oi Tpegareshis5, and such means include, but are not limited to, medications; vitamins; mineral supplements; substances used for the treatment, prevention, diagnosis, elimination or attenuation of a disease or illness; substances affecting the structure or functions of the body; or prodrugs that acquire biological activity or become more active after being placed in a physiological environment.

Термін "терапевтичний ефект" відомий у техніці і стосується місцевої і/або системної дії у тварин, зокрема ссавців, і конкретніше - людей, викликаної фармакологічно активною речовиною. Таким чином, вказаний термін стосується будь-якої речовини, яка призначена для застосування в діагностиці, лікуванні, ослабленні, усуненні або попередженні захворювання, або в поліпшенні бажаного фізичного або розумового розвитку і/або стану в тварини або бо людини. Фраза "терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість даної речовини, що викликає бажану місцеву або системну дію при розумному співвідношенні користь/ризик, застосовна до будь-якого лікування. Терапевтично ефективна кількість даної речовини буде змінюватися залежно від суб'єкта і хворобливого стану, що піддається лікуванню, маси і віку суб'єкта, важкості хворобливого стану, шляху введення і подібних факторів, що може легко визначити рядовий фахівець у даній галузі техніки. Наприклад, деякі композиції за даним винаходом можна вводити в кількості, достатній для одержання ефекту при розумному співвідношенні користь/ризик, застосовному до такого лікування.The term "therapeutic effect" is known in the art and refers to a local and/or systemic effect in animals, in particular mammals, and more specifically - humans, caused by a pharmacologically active substance. Thus, the specified term refers to any substance that is intended for use in the diagnosis, treatment, weakening, elimination or prevention of disease, or in the improvement of the desired physical or mental development and/or condition in animals or humans. The phrase "therapeutically effective amount" means that amount of a given substance that produces the desired local or systemic effect with a reasonable benefit/risk ratio applicable to any treatment. The therapeutically effective amount of a given substance will vary depending on the subject and the disease state being treated, the weight and age of the subject, the severity of the disease state, the route of administration, and similar factors as can be readily determined by one of ordinary skill in the art. For example, some compositions of the present invention can be administered in amounts sufficient to produce an effect with a reasonable benefit/risk ratio applicable to such treatment.

Термін "лікування" відомий у техніці і стосується усунення захворювання, а також ослаблення принаймні одного із симптомів будь-якого стану або захворювання.The term "treatment" is known in the art and refers to the elimination of a disease, as well as the alleviation of at least one of the symptoms of any condition or disease.

Термін "алкіл" відомий у техніці й охоплює насичені аліфатичні групи, зокрема алкільні групи з лінійним ланцюгом, алкільні групи з розгалуженим ланцюгом, циклоалкільні (аліциклічні) групи, циклоалкільні групи з алкільними замісниками й алкільні групи з циклоалкільними замісниками.The term "alkyl" is known in the art and includes saturated aliphatic groups, including straight chain alkyl groups, branched chain alkyl groups, cycloalkyl (alicyclic) groups, alkyl substituted cycloalkyl groups, and cycloalkyl substituted alkyl groups.

У деяких варіантах здійснення кістяк алкільних груп з лінійним або розгалуженим ланцюгом включає приблизно 30 або менше атомів вуглецю (наприклад, С1-Сзо для лінійного ланцюга, Сз-In some embodiments, the straight or branched chain alkyl backbone comprises about 30 or fewer carbon atoms (e.g., C1-C20 for a straight chain, C3-

Сзо для розгалуженого ланцюга) і, як альтернатива, приблизно 20 або менше, наприклад, від 1 до 6 атомів вуглецю. Аналогічно, циклічна структура циклоалкілів включає від приблизно З до приблизно 10 атомів вуглецю і, як альтернативу, приблизно 5, 6 або 7 атомів вуглецю. Крім того, термін "алкіл" визначається таким чином, що він охоплює галогензаміщені алкіли.C 30 for branched chain) and, alternatively, about 20 or less, for example, from 1 to 6 carbon atoms. Similarly, the cycloalkyl ring structure includes from about C to about 10 carbon atoms and, alternatively, about 5, 6 or 7 carbon atoms. In addition, the term "alkyl" is defined to include halogen-substituted alkyls.

Крім того, термін "алкіл" (або "нижчий алкіл") включає "заміщені алкіли", що являють собою алкільні фрагменти, які включають замісники, які заміщують атоми водню в одного або декількох атомів вуглецю вуглеводного кістяка. Згадані замісники можуть включати, наприклад, гідроксил, карбоніл (наприклад, карбоксил, алкоксикарбоніл, форміл або ацил), тіокарбоніл (наприклад, тіоефір, тіосацетат або тіоформіат), алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфінат, аміно, амідо, амідин, імін, ціано, нітро, азидо, сульфгідрил, алкілтіо, сульфат, сульфонат, сульфамоїл, сульфонамідо, сульфоніл, гетероцикліл, аралкіл, або ароматичний або гетероароматичний фрагмент. Фахівець у даній галузі зрозуміє, що фрагменти, які є замісниками вуглеводневого ланцюга, самі по собі можуть бути заміщеними, якщо є відповідна можливість. Наприклад, замісники заміщеного алкілу можуть включати заміщені і незаміщені форми аміно, азидо, іміно, амідо, фосфорилу (зокрема фосфонатів і фосфінатів), сульфонілуIn addition, the term "alkyl" (or "lower alkyl") includes "substituted alkyls", which are alkyl fragments that include substituents that replace hydrogen atoms at one or more carbon atoms of the carbohydrate backbone. Said substituents may include, for example, hydroxyl, carbonyl (eg, carboxyl, alkoxycarbonyl, formyl, or acyl), thiocarbonyl (eg, thioether, thioacetate, or thioformate), alkyl, phosphoryl, phosphonate, phosphinate, amino, amido, amidine, imine, cyano , nitro, azido, sulfhydryl, alkylthio, sulfate, sulfonate, sulfamoyl, sulfonamido, sulfonyl, heterocyclyl, aralkyl, or an aromatic or heteroaromatic moiety. One skilled in the art will appreciate that moieties that are substituents on the hydrocarbon chain may themselves be substituted if appropriate. For example, substituted alkyl substituents may include substituted and unsubstituted forms of amino, azido, imino, amido, phosphoryl (including phosphonates and phosphinates), sulfonyl

Зо (зокрема сульфату, сульфонамідо, сульфамоїлу і сульфонату) і силільної групи, а також простих ефірів, алкілтіо, карбонільних сполук (зокрема кетонів, альдегідів, карбоксилатів і складних ефірів), -СМ і т. п. Типові заміщені алкіли описані нижче. Циклоалкіли можуть бути додатково заміщені алкілами, алкенілами, алкокси, алкілтіо, аміноалкілами, карбонілзаміщеними алкілами, -СМ і т. п.Zo (including sulfate, sulfonamido, sulfamoyl, and sulfonate) and silyl groups, as well as ethers, alkylthio, carbonyl compounds (including ketones, aldehydes, carboxylates, and esters), -CM, etc. Typical substituted alkyls are described below. Cycloalkyls can be additionally substituted by alkyls, alkenyls, alkoxys, alkylthios, aminoalkyls, carbonyl-substituted alkyls, -CM, etc.

Терміни "орто-", "мета-" і "пара-" відомі в техніці і стосуються 1,2-, 1,3- і 1,4-дизаміщених бензолів відповідно. Наприклад, назви 1,2-диметилбензол і орто-диметилбензол є синонімічними.The terms "ortho-", "meta-" and "para-" are known in the art and refer to 1,2-, 1,3- and 1,4-disubstituted benzenes, respectively. For example, the names 1,2-dimethylbenzene and ortho-dimethylbenzene are synonymous.

Мається на увазі, що визначення для кожного фрагмента або змінної величини, наприклад, алкілу, т, п і т. п., якщо в якій-небудь структурі вони зустрічаються більше одного разу, є незалежними від будь-яких інших визначень цієї перемінної в тій же самій структурі.It is implied that the definitions for each fragment or variable, such as alkyl, t, p, etc., if they occur more than once in any structure, are independent of any other definitions of that variable in that same structure.

Деякі сполуки, що входять у композиції за даним винаходом, можуть існувати в конкретних геометричних або стереоіїзомерних формах. Крім того, сполуки за даним винаходом можуть також бути оптично активними. Даний винахід охоплює всі такі сполуки, зокрема цис- і транси- ізомери, К- і 5-енантіомери, діастереомери, (0)-ізомери. (І)-ізомери, їх рацемічні суміші й інші суміші, які потрапляють в обсяг даного винаходу. Додаткові асиметричні атоми вуглецю можуть бути присутніми у заміснику, наприклад, алкільній групі. Мається на увазі, що всі такі ізомери, а також їх суміші включені в даний винахід.Some compounds included in the compositions of this invention may exist in specific geometric or stereoisomeric forms. In addition, the compounds of the present invention may also be optically active. The present invention covers all such compounds, in particular cis- and trans-isomers, K- and 5-enantiomers, diastereomers, (0)-isomers. (I)-isomers, their racemic mixtures and other mixtures that fall within the scope of this invention. Additional asymmetric carbon atoms may be present in the substituent, for example, an alkyl group. It is intended that all such isomers, as well as mixtures thereof, are included in the present invention.

Мається на увазі, що терміни "заміщення" або "заміщений чим-небудь" включають потенційно можливі молекули, за умови, що такі заміщення відповідають можливим валентностям заміщеного атома і замісника, і що заміщення приводить до стійкої сполуки, яка, наприклад, не піддається мимовільному перетворенню, наприклад, у результаті перегрупування, циклізації, елімінування або інших реакцій.It is intended that the terms "substitution" or "substituted by" include potentially possible molecules, provided that such substitutions correspond to the possible valences of the substituted atom and the substituent, and that the substitution results in a stable compound which, for example, does not undergo spontaneous transformation, for example, as a result of rearrangement, cyclization, elimination or other reactions.

Передбачається також, що термін "заміщений" включає всі припустимі замісники органічних сполук. У широкому аспекті, припустимі замісники включають ациклічні і циклічні, розгалужені і нерозгалужені, карбоциклічні і гетероциклічні, ароматичні і неароматичні замісники органічних сполук. Ілюстративні приклади замісників включають, наприклад, замісники, перераховані вище по тексту. Придатні органічні сполуки можуть включати один або трохи замісників, і ці замісники можуть бути однаковими або різними. Для цілей даного винаходу, гетероатоми, наприклад, азот, можуть бути заміщені воднем і/або будь-якими допустимими замісниками органічних бо сполук, описаними в тексті заявки, що насичують валентність вказаних гетероатомів. Мається на увазі що даний винахід не обмежений яким-небудь чином допустимими замісниками органічних сполук.It is also intended that the term "substituted" includes all permissible substituents of organic compounds. In a broad aspect, acceptable substituents include acyclic and cyclic, branched and unbranched, carbocyclic and heterocyclic, aromatic and non-aromatic substituents of organic compounds. Illustrative examples of substituents include, for example, the substituents listed above in the text. Suitable organic compounds may include one or more substituents, and these substituents may be the same or different. For the purposes of this invention, heteroatoms, for example, nitrogen, can be replaced by hydrogen and/or any acceptable substituents of organic compounds described in the text of the application that saturate the valence of the specified heteroatoms. It is understood that this invention is not limited in any way to acceptable substitutes for organic compounds.

Для цілей даного винаходу хімічні елементи ідентифікуються відповідно до Періодичної таблиці елементів, версія СА5, Напароок ої Спетізігу апа РПузіс5, 67" Еа., 1986-87, на розвороті обкладинки. Також для цілей даного винаходу вважається, що термін "вуглеводень" включає всі можливі сполуки, які містять принаймні один атом водню й один атом вуглецю. У широкому аспекті, можливі вуглеводні включають ациклічні і циклічні, розгалужені і нерозгалужені, карбоциклічні і гетероциклічні, ароматичні і неароматичні органічні сполуки, які можуть бути заміщеними або незаміщеними.For the purposes of this invention, chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of Elements, version CA5, Naparook oi Spetizigu apa RPuzis5, 67" Ea., 1986-87, on the front cover. Also for the purposes of this invention, the term "hydrocarbon" is considered to include all possible compounds that contain at least one hydrogen atom and one carbon atom Broadly speaking, possible hydrocarbons include acyclic and cyclic, branched and unbranched, carbocyclic and heterocyclic, aromatic and non-aromatic organic compounds, which may be substituted or unsubstituted.

Термін "фармацевтично прийнятні солі" відомий у техніці і стосується відносно нетоксичних неорганічних і органічних кислотно-адитивних солей сполук, зокрема, наприклад, таких, які входять у композиції за даним винаходом.The term "pharmaceutically acceptable salts" is known in the art and refers to relatively non-toxic inorganic and organic acid-addition salts of compounds, in particular, for example, those included in the compositions of the present invention.

Термін "фармацевтично прийнятний носій" відомий у техніці і стосується фармацевтично прийнятних матеріалів, композицій або носіїв, наприклад, рідких або твердих наповнювачів, розріджувачів, ексципієнтів, розчинників або інкапсулюючих матеріалів, які беруть участь у перенесенні або транспортуванні будь-якої композиції за даним винаходом або її компонента з одного органа або частини організму в інший орган або частину організму. Кожний з носіїв повинний бути "прийнятним" у змісті сумісності з композицією за даним винаходом і її компонентами, і відсутності шкідливості для пацієнта. Деякі приклади матеріалів, які можуть служити фармацевтично прийнятними носіями, включають: (1) цукри, наприклад, лактозу, глюкозу і сахарозу; (2) крохмалі, наприклад, кукурудзяний крохмаль і картопляний крохмаль; (3) целюлозу і її похідні, наприклад, натрій карбоксиметил целюлозу, етилцелюлозу й ацетат целюлози; (4) порошкоподібний трагакант; (5) солод; (б) желатин; (7) тальк; (8) такі ексципієнти, як олія какао і воски для супозиторіїв; (9) олії, наприклад, арахісову олія, олію насіння бавовни, сафлорову олія, кунжутну олію, оливкову олія, кукурудзяну олія і соєву олія; (10) гліколі, наприклад, пропіленгліколь; (11) поліоли, наприклад, гліцерин, сорбіт, маніт і поліетиленгліколь; (12) складні ефіри, наприклад, етилолеат і етилаурат; (13) агар; (14) буферні агенти, наприклад, гідроксид магнію і гідроксид алюмінію; (15) альгінову кислоту; (16) апірогенну воду; (17) ізотонічний сольовий розчин; (18) розчин Рингера; (19) етиловий спирт; (20) фосфатнийThe term "pharmaceutically acceptable carrier" is known in the art and refers to pharmaceutically acceptable materials, compositions or carriers, such as liquid or solid excipients, diluents, excipients, solvents or encapsulating materials, involved in carrying or transporting any composition of the present invention or its component from one organ or part of the body to another organ or part of the body. Each of the carriers must be "acceptable" in terms of compatibility with the composition according to the present invention and its components, and the absence of harm to the patient. Some examples of materials that can serve as pharmaceutically acceptable carriers include: (1) sugars, such as lactose, glucose, and sucrose; (2) starches, such as corn starch and potato starch; (3) cellulose and its derivatives, for example, sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; (4) powdered tragacanth; (5) malt; (b) gelatin; (7) talc; (8) excipients such as cocoa butter and suppository waxes; (9) oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil; (10) glycols, for example, propylene glycol; (11) polyols, such as glycerol, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol; (12) esters, for example, ethyl oleate and ethyl laurate; (13) agar; (14) buffering agents, for example, magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; (15) alginic acid; (16) pyrogenic water; (17) isotonic saline solution; (18) Ringer's solution; (19) ethyl alcohol; (20) phosphate

Зо буферний сольовий розчин; й (21) інші нетоксичні сумісні речовини, застосовувані у фармацевтичних сполуках.Zo buffer saline solution; and (21) other non-toxic compatible substances used in pharmaceutical compounds.

СполукиCompounds

Сполуки, призначені для застосування в одному або декількох способах за даним винаходом, включають сполуки формули (І) або їх фармацевтично прийнятні солі, енантіомери або стереоізомери: ау хх рCompounds intended for use in one or more methods of the present invention include compounds of formula (I) or their pharmaceutically acceptable salts, enantiomers or stereoisomers: au xx p

МА'В" (у де: кожний із замісників ВЕ' і К? незалежно вибраний із групи, яка складається з Н і С..є алкілу; або В" ії В? разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, можуть утворювати ароматичний або аліфатичний цикл, що складається з 5 або 6 атомів; замісники М ії 7 незалежно вибрані з групи, яка складається з Н, ОН, СООН, -ОНЗ, -MA'B" (where: each of the substituents БЕ' and K? is independently selected from the group consisting of H and C..is alkyl; or B" and B? together with the nitrogen atom to which they are attached can form an aromatic or aliphatic ring consisting of 5 or 6 atoms; the substituents M and 7 are independently selected from the group consisting of H, OH, COOH, -OH3, -

СН(ОВз)СООН , і замісник КЗ вибраний із групи, яка складається з Н, фенілу, бензилу, вінілу, алілу, С:-є або алкілу Сів алкілу, заміщеного одним або декількома атомами галогену; або його фармацевтично прийнятну сіль.CH(ОВ3)СООН , and the KZ substituent is selected from the group consisting of H, phenyl, benzyl, vinyl, allyl, C:-e, or alkyl C 8 alkyl substituted by one or more halogen atoms; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Придатні С.і-є алкільні фрагменти можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу. Алкільний фрагмент може бути лінійним або розгалуженим. Особливо переважними алкільними групами є метил і етил, і найбільш переважною алкільною групою є метил.Suitable C 1-6 alkyl moieties may be independently selected from the group consisting of: methyl, ethyl, propyl, pentyl and hexyl. The alkyl moiety can be linear or branched. Particularly preferred alkyl groups are methyl and ethyl, and the most preferred alkyl group is methyl.

В одному з варіантів здійснення У може означати Н або СООН. Наприклад, У може означатиIn one embodiment, Y can be H or COOH. For example, U can mean

Н, ї 7 може означати СН(ІОКУСООН, або У може означати СООН, і 7 може означати -ОНЗ. У деяких варіантах здійснення, ЕКЗ може представляти метил, етил, н-пропіл або ізопропіл.H, and 7 can be CH(IOCUSOOH), or Y can be COOH, and 7 can be -OH3. In some embodiments, ECZ can be methyl, ethyl, n-propyl, or isopropyl.

В інших варіантах здійснення фрагмент МА'В2 формули (І) може знаходитися в положенні 4" або в положенні 3". У деяких варіантах здійснення К! і К2 являють собою атоми Н.In other embodiments, the MA'B2 fragment of formula (I) can be in the 4" position or in the 3" position. In some embodiments, the implementation of K! and K2 are H atoms.

У деяких варіантах здійснення придатним замісником Кз може бути Н.In some embodiments, a suitable substituent of Kz may be H.

Типові приклади сполук включають також сполуки формул (Па) або (ПІБ) або їх фармацевтично прийнятні солі, енантіомери або стереоізомери: ее Еге ві вTypical examples of compounds also include compounds of formulas (Pa) or (PIB) or their pharmaceutically acceptable salts, enantiomers or stereoisomers:

ЕЕ ЕЕ або А зр са: М в вв'м (Па) (ПЬ) де: замісники К' ії К2 незалежно вибрані з групи, яка складається з Н і С:.6 алкілу; або Кі Кк: разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, можуть утворювати ароматичний або аліфатичний цикл, який складається з 5 або 6 атомів; замісник КУ вибраний із групи, яка складається з -МАРОН, ОН і -ОН8;EE EE or A zr sa: M in vv'm (Pa) (Pb) where: substituents K' and K2 are independently selected from the group consisting of H and C:.6 alkyl; or Ki Kk: together with the nitrogen atom to which they are attached, they can form an aromatic or aliphatic cycle consisting of 5 or 6 atoms; the KU substituent is selected from the group consisting of -MARON, OH and -OH8;

В? означає Сі.-в алкіл; замісник КЕ" вибраний із групи, яка складається з Н, галогену, фенілу, бензилу, вінілу, алілу,IN? means C-C alkyl; the KE" substituent is selected from the group consisting of H, halogen, phenyl, benzyl, vinyl, allyl,

С..-в алкілу і Сів алкілу, заміщеного одним або декількома атомами галогену; замісники Е і КЕ" незалежно вибрані з групи, яка складається з водню або галогену, абоC..-v alkyl and Civ alkyl substituted by one or several halogen atoms; the substituents E and KE" are independently selected from the group consisting of hydrogen or halogen, or

В Її 2», або В: і КУ спільно утворюють конденсований гетероцикл, який складається з 5 або 6 атомів, необов'язково заміщений галогеном С-в або алкілом; іВ Her 2", or В: and KU together form a condensed heterocycle consisting of 5 or 6 atoms, optionally substituted by a C-C halogen or alkyl; and

А являє собою конденсований гетероцикл; або його фармацевтично прийнятну сіль.A is a condensed heterocycle; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

У деяких варіантах здійснення фрагмент МК'В: сполуки (Па) може знаходитися в положенні 4 або в положенні 3'. У деяких варіантах здійснення, замісники К' і К2 являють собою атоми Н.In some embodiments, the MK'B: compound (Pa) fragment may be in position 4 or in position 3'. In some embodiments, the K' and K2 substituents are H atoms.

У деяких варіантах здійснення, ЕК? може являти собою метил, етил, н-пропіл або ізопропіл.In some embodiments, EC? can be methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl.

У деяких варіантах здійснення, сполука за даним винаходом може бути представлена формулами:In some embodiments, a compound of the present invention may be represented by the formulas:

ЗоZo

ОвOv

НьМ оNhM o

С або о роC or o ro

НМ р де р означає 1 або 2; замісник Р вибраний із групи, яка складається з ОН або -ОН", де Е? відповідає даному вище визначенню; і замісник К"О у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з Н, галогену або С.і.є алкілу, наприклад, метилу або етилу.NM p where p means 1 or 2; the substituent P is selected from the group consisting of OH or -OH", where E? is as defined above; and the substituent KO"O is in each case independently selected from the group consisting of H, halogen, or C 1-6 alkyl, for example, methyl or ethyl.

Крім того, даний винахід надає, щонайменше частково, сполуки наведених нижче формул, для застосування в розкритих способах.In addition, the present invention provides, at least in part, compounds of the following formulas for use in the disclosed methods.

Наприклад, винахід стосується застосування в розкритих способах сполук формули (ПП):For example, the invention relates to the use in the disclosed methods of compounds of the formula (PP):

ІФ)IF)

Ва, о. о К5Wow, oh. at K5

Хх 1Xx 1

ВЗ ЇVZ Y

Се 6)Se 6)

КгKg

Кк. шШ де Х означає Сі-Сз алкілен, необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, вибраними з галогену або гідроксилу; замісник БЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Свє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; замісник Кг вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Ка вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Свє алкілу; замісник Е5 являє собою Сі-Св алкіл; або з їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів.Kk шШ where X means C-C3 alkylene, optionally substituted with one, two or three substituents selected from halogen or hydroxyl; BE substituent: selected from the group consisting of C1-C8 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C2-C8 alkenyl and C0-C8 alkynyl; the Kg substituent is selected from the group consisting of hydrogen and C1-C8 alkyl; the substituent Kz in each case is independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-Cv alkoxy, C1-Cv alkyl, cyano, C3-Cv6 cycloalkyl, halogen, hydroxyl and nitro; the substituent Ka is selected from the group consisting of hydrogen and C1-C1 alkyl; the E5 substituent is a Ci-Cv alkyl; or from their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides.

У деяких варіантах здійснення придатний замісник К5 може являти собою атом Н.In some embodiments, a suitable K5 substituent may be an H atom.

В одному з варіантів здійснення, замісник К: у формулі (ІП) може являти собою Сі-в алкіл, наприклад, метил. В одному з варіантів здійснення К2 може бути воднем. В іншому варіанті здійснення замісник Кз може бути вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Свє алкілу, галогену і гідроксилу. В іншому варіанті здійснення Кз може бути воднем. В одному з варіантів здійснення кожний із замісників К. і К5 може являти собою Сі-Свє алкіл. В іншому варіанті здійснення К. може бути воднем, і К5 може бути метилом. В одному з варіантів здійснення фрагмент Х може являти собою групу (СНг)н, де п означає 1 або 2, наприклад 1.In one of the implementation options, the substituent K: in the formula (IP) can be a C-C alkyl, for example, methyl. In one embodiment, K2 can be hydrogen. In another embodiment, the substituent Kz can be selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, halogen, and hydroxyl. In another embodiment, Kz can be hydrogen. In one of the variants of implementation, each of the substituents K. and K5 can be C1-C6 alkyl. In another embodiment, K can be hydrogen and K5 can be methyl. In one of the variants of implementation, fragment X can be a group (CHn)n, where n means 1 or 2, for example 1.

В іншому варіанті здійснення фрагмент -МА2-СОВ.: формули (Ії) може знаходитися в мета- або пара-положенні відносно групи Х, що представлено формулами (Ша) і (ПІБ). (в) 6)In another embodiment, the -MA2-SOV.: formula (II) fragment can be in the meta- or para-position relative to the X group, which is represented by the formulas (Ха) and (ПИБ). (c) 6)

Ва о. т) о РеOh. t) about Re

Ше й: 5 хShe and: 5 x

Х оз з ІX oz from I

Х йKh

М Ви ра Р й в. 2 Ша о шьM Vi ra R y v. 2 Sha o sh

Зо Крім того, даний винахід надає сполуки наведеної нижче формули (ІМ), які можуть застосовуватися в розкритих у заявці способах, наприклад:In addition, the present invention provides compounds of the following formula (IM) which can be used in the methods disclosed in the application, for example:

но (в) (о); - й Ке п - (в)but (in) (o); - and Ke n - (c)

ЄIS

Ро вRo v

ІУ де замісник КЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Сє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і С2-Св алкінілу; замісник Кг вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Е5 являє собою водень або Сі-Св алкіл; а також їх фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.IU where the substituent is KE: selected from the group consisting of Ci-Ce alkyl, C3-Cv cycloalkyl, C2-Cv alkenyl and C2-Cv alkynyl; the Kg substituent is selected from the group consisting of hydrogen and C1-C8 alkyl; the substituent Kz in each case is independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-Cv alkoxy, C1-Cv alkyl, cyano, C3-Cv6 cycloalkyl, halogen, hydroxyl and nitro; the E5 substituent is hydrogen or C-Cv alkyl; as well as their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides.

Крім того, даний винахід стосується сполук наведеної нижче формули (М): (о! Ва ох х 224In addition, the present invention relates to compounds of the following formula (M): (o! Va oh x 224

Кз (в)Kz (in)

Кк.Kk

У з де замісник КЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Сє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Ка вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Е5 являє собою водень або Сі-Св алкіл; і фрагмент А являє собою конденсований п'яти- або шестичленний гетероцикл; а також їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів вказаних сполук.In z where the substituent is KE: selected from the group consisting of Ci-Ce alkyl, C3-Cv cycloalkyl, C2-Cv alkenyl and Co-Cv alkynyl; the substituent Kz in each case is independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-Cv alkoxy, C1-Cv alkyl, cyano, C3-Cv6 cycloalkyl, halogen, hydroxyl and nitro; the substituent Ka is selected from the group consisting of hydrogen and C1-C8 alkyl; the E5 substituent is hydrogen or C-Cv alkyl; and fragment A is a condensed five- or six-membered heterocycle; as well as their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides of the specified compounds.

В одному з варіантів здійснення Кі: може являти собою Сі-Св алкіл, наприклад, метил. В іншому варіанті здійснення кожний із замісників Кі і Кз може являти собою Сі-Св алкіл, наприклад, метил. В одному з варіантів здійснення ЕК» може бути воднем.In one of the variants of implementation Ki: can be a Ci-Cv alkyl, for example, methyl. In another embodiment, each of the Ki and Kz substituents can be a Ci-Cv alkyl, for example, methyl. In one embodiment, EC" can be hydrogen.

У деяких варіантах здійснення, сполука за даним винаходом може бути представлена формуламиIn some embodiments, a compound of the present invention may be represented by the formulas

Те (Ф (в)Te (F (c)

Вих. ЯК (Ф) А- і Д о Рв 1 М Р або КвEx. AS (F) A- and D o Rv 1 M R or Kv

Зо де р означає 1 або 2;Where r means 1 or 2;

замісник БЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Свє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; кожний із замісників Ка і Кз незалежно вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; або сполука за даним винаходом являє собою фармацевтично прийнятну сіль або М-оксид вказаної сполуки.BE substituent: selected from the group consisting of C1-C8 alkyl, C3-C8 cycloalkyl, C2-C8 alkenyl and C0-C8 alkynyl; each of the substituents Ka and Kz is independently selected from the group consisting of hydrogen and C1-C8 alkyl; or the compound of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt or M-oxide of said compound.

Наприклад, в одному з варіантів здійснення, сполуки за даним винаходом, придатні для застосування в розкритих способах, включають сполуки формули А: нос,For example, in one embodiment, compounds of the present invention suitable for use in the disclosed methods include compounds of formula A: nose,

ОК хх зе в/оOK xx ze v/o

Щі , де замісник К:о вибраний із групи, яка складається з Н і Сі-Сє алкілу (наприклад, метилу); замісник Ки: вибраний із групи, яка складається з Н, С1-Св алкілу і групи -С(0)-С:1-Св алкіл (наприклад, К:ї може являти собою Н, метил, -С(О)-метил або -С(О)-етил). замісник К5 являє собою Сі-Св алкіл (наприклад, К5 може бути метилом, етилом або пропілом); або їх фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.Where the substituent K:o is selected from the group consisting of H and C-Ce alkyl (for example, methyl); substituent Ky: selected from the group consisting of H, C1-C8 alkyl and the group -C(0)-C:1-C8 alkyl (for example, K:i can be H, methyl, -C(O)-methyl or -C(O)-ethyl). the K5 substituent is a C-Cv alkyl (for example, K5 can be methyl, ethyl or propyl); or their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides.

Наприклад, передбачене застосування в способах за даним винаходом сполук формул А іFor example, the intended use in the methods according to this invention of compounds of formulas A and

А": нос,A": nose,

ОК ноОс щ во воOK noOs sh wo wo

Р А: Р ІR A: R I

Типові приклади сполук, передбачених у даному винаході для застосування в розкритих способах, включають:Typical examples of compounds contemplated by the present invention for use in the disclosed methods include:

МеMe

Н Е но ме д но о ЕЕ хо но он он і, г он -N E no me d no o EE ho no on on i, g on -

МН». МН МН». МН. 00 МНо , МН», ме онMN". MN MN". MN. 00 MNo , MN", me on

МНMN

Й або їх фармацевтично прийнятні солі.And or their pharmaceutically acceptable salts.

У деяких варіантах здійснення, сполуки за даним винаходом включають: 4-аміно-М-гідрокси- 2-метоксибензамід (сполука 13); б-метокси хінолін-5-карбонову кислоту (сполука 36); б-метокси- 1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5-карбонову кислоту (сполука 37); і 5-діізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 38).In some embodiments, compounds of the present invention include: 4-amino-N-hydroxy-2-methoxybenzamide (compound 13); b-methoxy quinoline-5-carboxylic acid (compound 36); b-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-5-carboxylic acid (compound 37); and 5-diisopropylaminosalicylic acid (compound 38).

Інші типові приклади сполук включають наступні речовини: он я онOther typical examples of compounds include the following substances: on i on

МНMN

МеMe

Ме (сполука 13). МНо (сполука 14); НОМ ; онMe (compound 13). MNO (compound 14); NOM; he

МН (о) Фін! (сполука 26). НОМ : (сполука 17). НоМ , онMN (about) Finn! (compound 26). NOM : (compound 17). NoM, on

МН оMN about

О;-Рг шо (сполука 91); Нам ; (сполука 28): і) | .O;-Rg sho (compound 91); To us ; (compound 28): i) | .

Сполуки за даним винаходом включають рацемічні суміші і енантіомери сполук, наприклад: ()-2-гідроксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 29); (5)-2-метоксі-2-(4- амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 23); (ж)-2-етоксі-2-(3'-амінофеніл)уоцтову кислоту (сполука 32); (з)-2-етоксі-2-(4-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 33); ()-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 34); сполуку 34 (рацемічна форма); (ж)-2-етоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 39); (ж)-2-етоксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 40).The compounds of this invention include racemic mixtures and enantiomers of compounds, for example: ()-2-hydroxy-3-(3'-aminophenyl)propionic acid (compound 29); (5)-2-methoxy-2-(4-aminophenyl)acetic acid (compound 23); (g)-2-ethoxy-2-(3'-aminophenyl)acetic acid (compound 32); (z)-2-ethoxy-2-(4-aminophenyl)acetic acid (compound 33); ()-2-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid (compound 34); compound 34 (racemic form); (g)-2-ethoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid (compound 39); (g)-2-ethoxy-3-(3'-aminophenyl)propionic acid (compound 40).

Наприклад, сполуки, застосовувані в способах за даним винаходом, можуть являти собою енантіомери наступних рацемічних сумішей: (К, 5)-2-гідроксі-2-(3-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 10); (К, 5)-2-гідроксі-2-(4-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 11); (ЕЕ, 5)-2-гідроксі-3- (4'-амінофеніл)упропіонової кислоти (сполука 21); (Б, 5)-2-метоксі-2-(3'-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 22); (Б, 5)-2-метоксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонової кислоти (сполука 35); (В, 5)- 2-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти (сполука 34), а також енантіомери, наприклад, (у 2-5-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти; (-) 2-В-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти. У деяких варіантах здійснення переважними сполуками є (К,5)-2-гідроксі-3-(4- амінофеніл)упропіонова кислота (сполука 21) або (ж)-2-гідроксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонова кислота (сполука 20).For example, the compounds used in the methods of the present invention can be enantiomers of the following racemic mixtures: (K, 5)-2-hydroxy-2-(3-aminophenyl)acetic acid (compound 10); (K, 5)-2-hydroxy-2-(4-aminophenyl)acetic acid (compound 11); (EE, 5)-2-hydroxy-3-(4'-aminophenyl)propionic acid (compound 21); (B, 5)-2-methoxy-2-(3'-aminophenyl)acetic acid (compound 22); (B, 5)-2-methoxy-3-(3'-aminophenyl)propionic acid (compound 35); (B, 5)-2-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid (compound 34), as well as enantiomers, for example, (in 2-5-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid; (- ) 2-B-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid In some embodiments, preferred compounds are (K,5)-2-hydroxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid (compound 21) or (g )-2-hydroxy-3-(3'-aminophenyl)propionic acid (compound 20).

Інші типи рацемічних сумішей сполук за даним винаходом включають, наприклад: (хж)-2- гідроксі-2-(3'-амінофеніл)уоцтову кислоту (сполука 10); (ж)-2-гідроксі-2-(4'-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 11); (ж)-2-гідроксі-3-(4'-амінофеніл)упропіонову кислоту (сполука 21) ї (ж)-2- метоксі-2-(3'-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 22).Other types of racemic mixtures of compounds according to the present invention include, for example: (x)-2-hydroxy-2-(3'-aminophenyl)acetic acid (compound 10); (g)-2-hydroxy-2-(4'-aminophenyl)acetic acid (compound 11); (g)-2-hydroxy-3-(4'-aminophenyl)propionic acid (compound 21) and (g)-2-methoxy-2-(3'-aminophenyl)acetic acid (compound 22).

Зо Інші сполуки, застосування яких передбачено в способах за даним винаходом, включають:Other compounds, the use of which is provided in the methods according to the present invention, include:

Б5-аміносаліцил-гідроксамову кислоту (сполука 5); З-диметиламіносаліцилову кислоту (сполука 6); 2-метоксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 7); 2-метоксі-5-амінобензойну кислоту (сполука 8); б-метиламіносаліцилову кислоту (сполука 9); 4-метиламіносаліцилову кислоту (сполука 12);B5-aminosalicylic hydroxamic acid (compound 5); Z-dimethylaminosalicylic acid (compound 6); 2-methoxy-4-aminobenzoic acid (compound 7); 2-methoxy-5-aminobenzoic acid (compound 8); b-methylaminosalicylic acid (compound 9); 4-methylaminosalicylic acid (compound 12);

4-ацетиламіносаліцилову кислоту (сполука 16); 2-етоксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 18); 2-етоксі-5-амінобензойну кислоту (сполука 19); 4-диметиламіносаліцилову кислоту (сполука 24); 2-етоксі-4-амінобензоїлгідроксамову кислоту (сполука 25); б-гідроксихінолін-5--карбонову кислоту (сполука 27); 2-(2-пропіл)оксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 30); 4-(1- піперазиніл)саліцилову кислоту (сполука 41); (К, 5)-5-оксахінолін-б6-карбонову кислоту (сполука 15); б-метоксихінолін-5-карбонову кислоту (сполука 36); б-метокси-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5- карбонову кислоту (сполука 37); 5-дізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 38); і 4- діізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 42).4-acetylaminosalicylic acid (compound 16); 2-ethoxy-4-aminobenzoic acid (compound 18); 2-ethoxy-5-aminobenzoic acid (compound 19); 4-dimethylaminosalicylic acid (compound 24); 2-ethoxy-4-aminobenzoylhydroxamic acid (compound 25); b-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid (compound 27); 2-(2-propyl)oxy-4-aminobenzoic acid (compound 30); 4-(1-piperazinyl)salicylic acid (compound 41); (K, 5)-5-oxaquinoline-b6-carboxylic acid (compound 15); b-methoxyquinoline-5-carboxylic acid (compound 36); b-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-5-carboxylic acid (compound 37); 5-diisopropylaminosalicylic acid (compound 38); and 4-diisopropylaminosalicylic acid (compound 42).

Сполуки за даним винаходом і фармацевтичні композиції, які включають як мінімум одну сполуку, можуть бути вибрані з групи, яка складається з: М-ацетил-(Н)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2- метоксипропіонової кислоти, М-ацетил-(5)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2-метоксипропіонової кислоти; і рацемічної /М-ацетил-(5)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2-метоксипропіонової кислоти або сполуки, вибраної з:Compounds of the present invention and pharmaceutical compositions that include at least one compound can be selected from the group consisting of: M-acetyl-(H)-(-)-3-(4-aminophenyl)-2-methoxypropionic acid, M-acetyl-(5)-(-)-3-(4-aminophenyl)-2-methoxypropionic acid; and racemic /M-acetyl-(5)-(-)-3-(4-aminophenyl)-2-methoxypropionic acid or a compound selected from:

Мех, (в) (в) й но Ме но - но т он он о Ме, Ме , о Ме, Ме , Ме , р Мех, 6) Мн-ОоН о.Meh, (c) (c) y no Me no - no t on on o Me, Me , o Me, Me , Me , p Meh, 6) Mn-OoN o.

М он он й МмНн-оН н мM on on y MmNn-oN n m

ЖО Ар Х 07 "Ме, О7 Ме ме ,Ме Й ,ZHO Ar X 07 "Me, O7 Me me, Me Y ,

Ох ИчН-ОН Н ох, ИМН-оНOh IchN-ON H oh, IMN-oN

СгSg

Д Д ХD D H

Ме М Ме М Ме МMe M Me M Me M

Ме: че й о о ОХ меMe: che y o o OH me

Ме або їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів.Me or their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides.

Інші сполуки за даним винаходом включають сполуку 20, сполуку 21, 4-ацетамідо-М- гідрокси-2-метоксибензамід; 1-ацетил-б-метокси-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5-карбонову кислоту,Other compounds of the present invention include compound 20, compound 21, 4-acetamido-N-hydroxy-2-methoxybenzamide; 1-acetyl-b-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-5-carboxylic acid,

Б-ацетамідо-2-гідроксибензойну кислоту (наприклад, ацетальовану 5-аміносаліцилову кислоту) або їхні фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.β-acetamido-2-hydroxybenzoic acid (eg, acetalated 5-aminosalicylic acid) or their pharmaceutically acceptable salts or M-oxides.

Крім того, для застосування в способах за даним винаходом передбачається застосування композицій, які включають сполуки, представлені наведеними формулами, і, наприклад, фармацевтично прийнятний носій.In addition, for use in the methods according to the present invention, it is envisaged to use compositions that include compounds represented by the above formulas and, for example, a pharmaceutically acceptable carrier.

Способи одержання сполук за даним винаходом можна знайти, наприклад, у заявкахMethods of obtaining the compounds according to the present invention can be found, for example, in the applications

ММО2007/010516 ії УМО2007/010514, кожна з який включена в дану заявку в повному обсязі за допомогою посилання.ММО2007/010516 and УМО2007/010514, each of which is incorporated into this application in its entirety by reference.

СПОСОБИMETHODS

Частиною даного опису є способи профілактики або лікування фіброзу, наприклад, фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику. Ці способи можуть включати введення пацієнту, якому це необхідно, або для якого існує ризик захворювання, фармацевтичних препаратів, які включаютьMethods of preventing or treating fibrosis, such as liver fibrosis and/or intestinal fibrosis, are part of this description. These methods may include administering to a patient in need or at risk of the disease pharmaceuticals that include

РРАКу-агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці, наприклад, сполуку формули І, Па або ІБ, наприклад, сполуки 17, 29, 34 або 39. Наприклад, у винаході запропонований спосіб профілактики або лікування фіброзу печінки, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, сполуки за даним винаходом. Як альтернатива, у винаході запропонований спосіб профілактики або лікування фіброзу кишечнику, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, сполуки за даним винаходом.A PPRA agent, for example, a compound disclosed in this application, for example, a compound of formula I, Pa or IB, for example, compounds 17, 29, 34 or 39. For example, the invention provides a method of preventing or treating liver fibrosis, which includes administering to a patient , who needs it, compounds according to the present invention. Alternatively, the invention provides a method of preventing or treating intestinal fibrosis, comprising administering to a patient in need thereof a compound of the present invention.

Пацієнти, яких лікують із застосуванням вказаного вище способу, можуть мати або не мати фіброзу, що виявляється. У деяких варіантах здійснення в пацієнта спостерігається зменшення рівня наявного фіброзу, як мінімум, приблизно на 5 95, 10 95, 20 95, 30 95, 40 95 або навіть на 50 95 або більше після введення сполук за даним винаходом, наприклад, сполук 17, 29, 34 або 39, через, наприклад, 1 день, 2 дні, 1 тиждень, 1 місяць або 6 місяців або більше. Уведення згаданої сполуки може здійснюватися, наприклад, щонайменше на щоденній основі. Сполуки можуть вводитися перорально. Відстрочка клінічних проявів фіброзу в пацієнта унаслідок введення сполук за даним винаходом може становити, як мінімум, наприклад, 6 місяців, 1 рік, 18 місяців або навіть 2 роки або більше, порівняно з пацієнтом, якому не вводили згадану сполуку, наприклад, сполуку за даним винаходом.Patients treated with the above method may or may not have detectable fibrosis. In some embodiments, the patient has a reduction in the level of existing fibrosis of at least about 5 95 , 10 95 , 20 95 , 30 95 , 40 95 , or even 50 95 or more after administration of compounds of the present invention, e.g., compounds 17, 29, 34, or 39, after, for example, 1 day, 2 days, 1 week, 1 month, or 6 months or more. The administration of said compound can be carried out, for example, at least on a daily basis. The compounds can be administered orally. The delay in clinical manifestations of fibrosis in a patient as a result of administration of the compounds of the present invention can be at least, for example, 6 months, 1 year, 18 months, or even 2 years or more, compared to a patient who has not been administered said compound, for example, a compound of the present invention an invention

У пацієнта, якому необхідне лікування, може бути фіброз печінки, що перейшов у цироз.A patient who needs treatment may have liver fibrosis that has progressed to cirrhosis.

Пацієнти, у яких є ризик виникнення фіброзу печінки, можуть включати пацієнтів із гепатитом В, гепатитом С або неалкогольним стеатогепатитом (НАСГ). НАСГ входить у коло захворювань, пов'язаних з неалююогольним жировим переродженням печінки, що включає стеатоз і цироз.Patients at risk for liver fibrosis may include those with hepatitis B, hepatitis C, or nonalcoholic steatohepatitis (NASH). NASH is included in the circle of diseases associated with non-alloy fatty degeneration of the liver, which includes steatosis and cirrhosis.

НАСГ є складовою частиною метаболічного синдрому, що характеризується ожирінням, цукровим діабетом ІІ типу і дисліпідимією, і може поступово приводити до гепатоклітинноїNASH is a component of the metabolic syndrome, characterized by obesity, type II diabetes and dyslipidemia, and can gradually lead to hepatocellular

Зо карциноми.From carcinoma.

У даному винаході запропоновані також способи лікування розладів, пов'язаних з фіброзом печінки, наприклад, лікування щонайменше одного захворювання з-поміж деяких хвороб накопичення й уроджених порушень метаболізму, наприклад, дефіциту альфа 1-антитрипсину, хвороб накопичення міді (наприклад, хвороби Вільсона), фруктоземії, галактоземії, хвороб накопичення глікогену (наприклад, ПШ, ІМ, МІ ї Х типів), синдромів перенасичення залізом (наприклад, гемохроматозу), ліпідних аномалій (наприклад, хвороби Гоше), пероксисомних розладів (наприклад, синдрому Цельвегера) і тирозинемії; бактеріальних інфекцій (наприклад, бруцельозу); паразитарних інфекцій (наприклад, ехінококозу); НАСГ; вірусних інфекцій (наприклад, гепатиту В або гепатиту С, включаючи хронічний гепатит В або С); синдрому Бада-The present invention also provides methods of treating disorders associated with liver fibrosis, for example, treatment of at least one of certain storage diseases and inborn errors of metabolism, for example, alpha 1-antitrypsin deficiency, copper storage diseases (for example, Wilson's disease) , fructosemia, galactosemia, glycogen storage diseases (for example, PSH, MI, MI and X types), iron overload syndromes (for example, hemochromatosis), lipid abnormalities (for example, Gaucher disease), peroxisomal disorders (for example, Zellweger syndrome) and tyrosinemia; bacterial infections (for example, brucellosis); parasitic infections (for example, echinococcosis); NASH; viral infections (for example, hepatitis B or hepatitis C, including chronic hepatitis B or C); Bad syndrome

Кіари; серцевої недостатності; захворювань, пов'язаних з оклюзією печінкових вен; і тромбозу ворітної вени. Крім цього, винахід стосується способів лікування уродженого фіброзу печінки.Kiara; heart failure; diseases associated with hepatic vein occlusion; and portal vein thrombosis. In addition, the invention relates to methods of treating congenital liver fibrosis.

Композиції, застосовувані в цих способах, можна вводити перорально.The compositions used in these methods can be administered orally.

Винахід охоплює також способи лікування наркотичної і/або алкогольної залежності, у випадку, якщо ця залежність приводить до фіброзу печінки. У винаході передбачені способи лікування фіброзу печінки у пацієнта з історією наркотичної і/або алкогольної залежності.The invention also covers methods of treating drug and/or alcohol addiction, if this addiction leads to liver fibrosis. The invention provides methods of treating liver fibrosis in a patient with a history of drug and/or alcohol addiction.

Наприклад, пацієнта з історією залежності принаймні від однієї з наступних речовин: спирту, аміодарону, хлорпромазину, ізоніазиду, метотрексату, метилдопи, оксифенізатину і толбутаміду.For example, a patient with a history of dependence on at least one of the following substances: alcohol, amiodarone, chlorpromazine, isoniazid, methotrexate, methyldopa, oxyphenizatine, and tolbutamide.

Пацієнти з ризиком фіброзу кишечнику можуть включати пацієнтів з виразковим колітом, запальною хворобою кишечнику або хворобою Крона. Пацієнти з ризиком фіброзу кишечнику можуть також включати пацієнтів раннього віку, у яких діагностована хвороба Крона або коліт, велике і/або важке захворювання ободової кишки, пацієнтів із первинним склерозуючим холангітом і/або пацієнтів з випадками захворювання раком у родині.Patients at risk for intestinal fibrosis may include those with ulcerative colitis, inflammatory bowel disease, or Crohn's disease. Patients at risk for intestinal fibrosis may also include young patients diagnosed with Crohn's disease or colitis, large and/or severe colonic disease, patients with primary sclerosing cholangitis, and/or patients with a family history of cancer.

У винаході запропоновані також способи лікування розладів, пов'язаних з фіброзом кишечнику, наприклад, лікування як мінімум одного захворювання з-поміж виразкового коліту, запальної хвороби кишечнику або хвороби Крона.The invention also provides methods of treating disorders associated with intestinal fibrosis, for example, treating at least one of ulcerative colitis, inflammatory bowel disease, or Crohn's disease.

Крім того, даний винахід стосується способів профілактики або лікування фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу або нефрогенного системного фіброзу, що включає введення пацієнту,In addition, the present invention relates to methods of preventing or treating renal fibrosis, cardiac fibrosis, endomyocardial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, myelofibrosis, retroperitoneal fibrosis, or nephrogenic systemic fibrosis, comprising administering to a patient,

якому це необхідно, фармацевтичного препарату, що включає РРАКУу агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці.who needs it, of a pharmaceutical preparation that includes an anticancer agent, for example, a compound disclosed in this application.

Сполуки за даним винаходом можуть застосовуватися індивідуально або в комбінації одна з одною, коли як мінімум дві сполуки за даним винаходом застосовуються спільно в одній композиції або як складові частини схеми лікування. Сполуки за даним винаходом можуть також застосовуватися в комбінації з іншими лікарськими засобами для лікування наркотичної і/або алкогольної залежності, фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу або нефрогенного системного фіброзу.The compounds of the present invention can be used individually or in combination with each other, when at least two compounds of the present invention are used together in one composition or as components of a treatment regimen. The compounds of the present invention may also be used in combination with other drugs for the treatment of drug and/or alcohol addiction, renal fibrosis, cardiac fibrosis, endomyocardial fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, myelofibrosis, retroperitoneal fibrosis or nephrogenic systemic fibrosis.

Як правило, терапевтично ефективна кількість діючого компонента буде знаходитися в діапазоні від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, необов'язково від приблизно 1 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, необов'язково від приблизно 1 мг/кг до 10 мг/кг. Кількість, що вводиться, буде залежати від таких параметрів, як тип і ступінь захворювання або симптому, яке передбачається лікувати, загальний стан здоров'я конкретного пацієнта, відносної біологічної ефективності доставленого зв'язувального білка, складу зв'язувального білка, наявності і типів ексципієнтів, що входять до складу, а також шляху введення. Спочатку введена доза може перевищувати верхні вказані рівні для швидкого досягнення бажаних рівнів діючої речовини в крові або тканині, або ж первісне дозування може бути менш оптимальним, причому денне дозування можна послідовно збільшувати під час курсу лікування, залежно від конкретної ситуації Дозування препарату для людей можна оптимізувати, наприклад, шляхом стандартного підвищення дозувань під час фази !| клінічного дослідження з охопленням дозувань від 0,5 мг/кг до 20 мг/кг. Частоту введення препарату можна змінювати залежно від таких факторів, як шлях уведення, ввідна кількість і стан або захворювання, що піддається лікуванню. Типовою частотою введення є введення один раз на день, один раз на тиждень і один раз кожні два тижні.Typically, a therapeutically effective amount of the active ingredient will range from about 0.1 mg/kg to about 100 mg/kg, optionally from about 1 mg/kg to about 100 mg/kg, optionally from about 1 mg /kg to 10 mg/kg. The amount administered will depend on such parameters as the type and extent of the disease or symptom intended to be treated, the general health of the particular patient, the relative biological effectiveness of the binding protein delivered, the composition of the binding protein, the presence and types of excipients , included in the composition, as well as the route of introduction. The initially administered dose may exceed the upper indicated levels in order to quickly achieve the desired levels of the active substance in the blood or tissue, or the initial dosage may be less than optimal, and the daily dosage may be gradually increased during the course of treatment, depending on the specific situation Human dosage of the drug can be optimized , for example, by standard dosage increases during the !| phase of a clinical study with dosage coverage from 0.5 mg/kg to 20 mg/kg. The frequency of drug administration may vary depending on factors such as the route of administration, the amount administered, and the condition or disease being treated. Typical administration frequencies are once daily, once weekly, and once every two weeks.

Склади або композиції за даним винаходом включають розкриті в заявці сполуки, а також фармацевтично прийнятний носій.Formulations or compositions according to the present invention include the compounds disclosed in the application, as well as a pharmaceutically acceptable carrier.

Сполуки за даним винаходом можна вводити різними шляхами залежно від наміченої мети їхнього застосування, що добре відомо в техніці. Наприклад, якщо композицію за данимThe compounds of the present invention can be administered in various ways depending on the intended purpose of their use, as is well known in the art. For example, if the composition according to the data

Зо винаходом передбачається вводити перорально, їй можна надати форму таблеток, капсул, гранул, порошків або сиропів. Як альтернатива, склади за даним винаходом можна вводити парентерально у формі ін'єкцій (внутрішньовенних, внутрішньом'язових або підшкірних), препаратів для краплинних інфузій або супозиторіїв. Для введення через слизувату оболонку ока композиціям за даним винаходом можна надати форму очних крапель або очних мазей. Ці склади можна одержувати із застосуванням стандартних засобів і, якщо це бажано, композиції можна змішувати з будь-якими традиційними добавками, наприклад, ексципієнтами, зв'язувальними речовинами, дезінтегруючими агентами, змащувальними речовинами, корегуючими речовинами, солюбілізуючими агентами, суспендуючими засобами, емульгуючими агентами або покривними агентами.The invention is intended to be administered orally, it can be given in the form of tablets, capsules, granules, powders or syrups. Alternatively, the compositions of the present invention can be administered parenterally in the form of injections (intravenous, intramuscular or subcutaneous), preparations for drip infusions or suppositories. For administration through the mucous membrane of the eye, the compositions according to the present invention can be given the form of eye drops or eye ointments. These compositions can be prepared using standard means and, if desired, the compositions can be mixed with any conventional additives, for example, excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, correcting agents, solubilizing agents, suspending agents, emulsifying agents or coating agents.

У складах за даним винаходом можуть бути присутніми такі допоміжні агенти, як змочувальні агенти, емульгатори і змащувальні речовини, наприклад, лаурилсульфат натрію і стеарат магнію, а також барвники, агенти, що сприяють вивільненню, покривні агенти, підсолоджувачі, смакові й ароматичні агенти, консерванти й антиоксиданти.Such auxiliary agents as wetting agents, emulsifiers and lubricants, for example, sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, as well as dyes, release-promoting agents, coating agents, sweeteners, flavoring and aromatic agents, preservatives, may be present in the compositions according to the present invention. and antioxidants.

Композиції за даним винаходом можуть бути призначені для перорального, назального, місцевого (включаючи букальне і сублінгвальне), ректального, вагінального, аерозольного і/або парентерального введення. Зручно одержувати склади у вигляді дозованих лікарських форм, і ці форми можна одержувати будь-якими способами, добре відомими у фармацевтичній галузі техніки. Кількість композиції яку можна змішати з носієм для одержання однієї одиниці дозованої форми, змінюється залежно від суб'єкта, що піддається лікуванню, і конкретного шляху введення.Compositions according to the present invention can be prescribed for oral, nasal, local (including buccal and sublingual), rectal, vaginal, aerosol and/or parenteral administration. It is convenient to obtain the compositions in the form of dosage forms, and these forms can be obtained by any means well known in the pharmaceutical art. The amount of the composition that can be mixed with the carrier to produce one unit dosage form varies depending on the subject to be treated and the specific route of administration.

Способи одержання цих складів включають стадію змішування композиції за даним винаходом з носієм і, необов'язково, одним або декількома допоміжними інгредієнтами. Як правило, склади одержують шляхом однорідного і ретельного змішування агентів з рідкими носіями або тонкоподрібненими твердими носіями, або носіями обох типів, з наступним додаванням продукту відповідної форми, якщо це необхідно.Methods of obtaining these compositions include the stage of mixing the composition according to the present invention with a carrier and, optionally, one or more auxiliary ingredients. As a rule, the compositions are obtained by homogeneously and thoroughly mixing the agents with liquid carriers or finely divided solid carriers, or carriers of both types, followed by the addition of the product of the appropriate form, if necessary.

Склади, що підходять для перорального введення, можуть мати форму капсул, крохмальних капсул, пігулок, таблеток, льодяників (в яких використовується смакоароматична основа, звичайно сахароза і гуміарабік або трагакант), порошків, гранул, або розчинів, або суспензій у водних або неводних рідинах, або рідких емульсій масло-у-воді або вода-в-масло, або еліксиру бо або сиропу, або пастилок (в яких застосовується інертна основа, така, як желатин і гліцерин,Formulations suitable for oral administration may be in the form of capsules, starch capsules, pills, tablets, lozenges (using a flavoring base, usually sucrose and gum arabic or tragacanth), powders, granules, or solutions, or suspensions in aqueous or non-aqueous liquids , or oil-in-water or water-in-oil liquid emulsions, or elixir or syrup, or lozenges (in which an inert base such as gelatin and glycerin is used,

або сахароза і гуміарабік), кожна одиниця яких містить попередньо встановлену кількість сполуки за даним винаходом як діючий інгредієнт. Композиції за даним винаходом можна також вводити у формі болюсів, електуарію або пасти.or sucrose and gum arabic), each unit of which contains a predetermined amount of a compound of the present invention as an active ingredient. The compositions of the present invention can also be administered in the form of boluses, electuary or paste.

У твердих дозованих формах для перорального введення (капсулах, таблетках, пігулках, таблетках із плівковим покриттям, таблетках із цукровим покриттям, порошках, гранулах і т. п.) композиції за даним винаходом змішані з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, наприклад, цитратом натрію або дикальцій фосфатом і/або будь-яким з наступних компонентів: (1) наповнювачами або збільшувачами об'єму, наприклад, крохмалями, лактозою, сахарозою, глюкозою, манітом і/або кремнієвою кислотою; (2) зв'язувальними речовинами, наприклад, карбоксиметилцелюлозою, альгінатами, желатином, полівінілпіролідоном, сахарозою і/або гуміарабіком; (3) зволожувачами, наприклад, гліцерином; (4) дезінтегруючими агентами, наприклад, агар-агаром, карбонатом кальцію, крохмалем картоплі або маніоки, альгіновою кислотою, деякими силікатами і карбонатом натрію; (5) агентами, що сповільнюють розчинення, наприклад, парафіном; (6) прискорювачами абсорбції, наприклад, сполуками четвертинного амонію; (7) змочувальними агентами, наприклад, етиловим спиртом і моностеаратом гліцерину; (8) абсорбентами, наприклад, каоліном і бентонітовою глиною; (9) змащувальними засобами, наприклад, тальком, стеаратом кальцію, стеаратом магнію, твердими поліетиленгліколями, лаурилсульфатом натрію і їх сумішами; і (10) забарвлювальними агентами. У випадку капсул, таблеток і пігулок композиції можуть включати також буферні агенти. Тверді композиції аналогічного типу можуть також застосовуватися як наповнювачі у м'яких і твердих желатинових капсулах із застосуванням таких ексципієнтів, як лактоза або молочні цукри, а також поліетиленгліколі високої молекулярної маси і т. п.In solid dosage forms for oral administration (capsules, tablets, pills, film-coated tablets, sugar-coated tablets, powders, granules, etc.), the compositions of the present invention are mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers, for example, sodium citrate or dicalcium phosphate and/or any of the following components: (1) fillers or bulking agents, such as starches, lactose, sucrose, glucose, mannitol, and/or silicic acid; (2) binders, for example, carboxymethyl cellulose, alginates, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose and/or gum arabic; (3) humectants, for example, glycerin; (4) disintegrating agents, for example, agar-agar, calcium carbonate, potato or cassava starch, alginic acid, some silicates, and sodium carbonate; (5) dissolution retarding agents, such as paraffin; (6) absorption accelerators, for example, quaternary ammonium compounds; (7) wetting agents, for example, ethyl alcohol and glycerol monostearate; (8) absorbents, for example, kaolin and bentonite clay; (9) lubricants, for example, talc, calcium stearate, magnesium stearate, solid polyethylene glycols, sodium lauryl sulfate, and their mixtures; and (10) coloring agents. In the case of capsules, tablets and pills, the compositions may also include buffering agents. Solid compositions of a similar type can also be used as fillers in soft and hard gelatin capsules using excipients such as lactose or milk sugars, as well as polyethylene glycols of high molecular weight, etc.

Склади і композиції можуть включати тонкоподрібнені кристали сполук за даним винаходом.Formulations and compositions may include finely divided crystals of compounds according to the present invention.

Можна здійснювати здрібнювання кристалів індивідуальних сполук або суміші кристалів сполуки за даним винаходом з фармацевтичними ексципієнтами або носіями, або їх частиною. Середній розмір частинок тонкоподрібнених кристалів за даним винаходом може становити, наприклад, від приблизно 5 до приблизно 200 мікронів або від приблизно 10 до приблизно 110 мікронів.It is possible to grind crystals of individual compounds or a mixture of crystals of a compound according to the present invention with pharmaceutical excipients or carriers, or part thereof. The average particle size of finely ground crystals of the present invention may be, for example, from about 5 to about 200 microns, or from about 10 to about 110 microns.

Таблетки можна одержувати пресуванням або формуванням, необов'язково (із застосуванням одного або декількох допоміжних інгредієнтів. Пресовані таблетки можнаTablets can be obtained by compression or molding, optionally (with the use of one or more auxiliary ingredients. Compressed tablets can

Зо одержувати із застосуванням зв'язувальних речовин (наприклад, желатину або гідроксипропілметилцелюлози), змащувальних речовин, інертних розріджувачів, консервантів, дезінтегруючих речовин (наприклад, натрій крохмаль гліколяту або поперечно-зшитої натрій карбоксиметилцелюлози), поверхнево-активних або диспергуючих агентів. Формування таблетки можна одержувати формуванням у придатному агрегаті суміші сполуки за даним винаходом, змоченої інертним рідким розріджувачем. Таблетки й інші тверді дозовані форми, наприклад, таблетки з плівковим покриттям або таблетки з цукровим покриттям, капсули, пігулки і гранули можуть необов'язково мати насічки або оснащені покриттями й оболонками, наприклад, кишковорозчинними покриттями й іншими покриттями, добре відомими в техніці одержання фармацевтичних складів.To obtain with the use of binders (for example, gelatin or hydroxypropyl methyl cellulose), lubricants, inert diluents, preservatives, disintegrating substances (for example, sodium starch glycolate or cross-linked sodium carboxymethyl cellulose), surface-active or dispersing agents. The formation of a tablet can be obtained by forming in a suitable aggregate a mixture of the compound according to the present invention moistened with an inert liquid diluent. Tablets and other solid dosage forms, e.g., film-coated or sugar-coated tablets, capsules, pills, and granules may optionally be scored or provided with coatings and shells, e.g., enteric coatings and other coatings well known in the pharmaceutical art. made up

Рідкі дозовані форми для перорального уведення включають фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії сиропи й еліксири. Крім сполуки за даним винаходом, рідкі дозовані форми можуть містити інертні розріджувачі, традиційно застосовувані в техніці, як, наприклад, вода або інші розчинники, солюбілізуючі агенти і емульгатори, наприклад, етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, бавовняна, арахісова, кукурудзяна, зародкова, оливкова, касторова і кунжутна олії), гліцерин, тетрагідрофурфуриловий спирт, поліетиленгліколі і складні ефіри жирних кислот і сорбітану, циклодекстрини і їх суміші.Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups, and elixirs. In addition to the compound according to the present invention, liquid dosage forms may contain inert diluents traditionally used in the technique, such as, for example, water or other solvents, solubilizing agents and emulsifiers, for example, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, oils (in particular, cotton, peanut, corn, germ, olive, castor and sesame oils), glycerin, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and esters of fatty acids and sorbitan, cyclodextrins and their mixtures.

Суспензії, крім композиції за даним винаходом, можуть містити суспендуючі агенти, наприклад, етоксильовані ізостеарилові спирти, ефіри поліоксіетилену і сорбіту і сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант, а також їх суміші.Suspensions, in addition to the composition according to the present invention, may contain suspending agents, for example, ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene and sorbitol and sorbitan ethers, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, as well as their mixtures.

Склади для ректального або вагінального введення можуть мати форму супозиторіїв, які можна одержувати змішуванням сполуки за даним винаходом з одним або декількома придатними, не подразнюючими ексципієнтами або носіями, зокрема, наприклад, олією какао, поліетиленгліколем, воском або саліцилатом для супозиторіїв, які є твердими при кімнатній температурі, але рідкими при температурі тіла і, отже, будуть плавитися в порожнинах організму і вивільняти діючий агент. Склади, що підходять для вагінального введення, включають також песарії, тампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, які містять носії, що бо вважаються придатними у фармацевтичній техніці.Formulations for rectal or vaginal administration may be in the form of suppositories which may be prepared by mixing a compound of the present invention with one or more suitable non-irritating excipients or carriers, including, for example, cocoa butter, polyethylene glycol, wax or salicylate for suppositories which are solid at at room temperature, but liquid at body temperature and, therefore, will melt in body cavities and release the active agent. Formulations suitable for vaginal administration also include pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or sprays that contain carriers that are considered suitable in the pharmaceutical industry.

Дозовані форми для трансдермального або місцевого введення сполуки за даним винаходом включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластирі і склади для інгаляції. Діючий компонент можна змішати в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм, а також з будь-якими необхідними консервантами, буферами або пропелентами.Dosage forms for transdermal or local administration of the compounds of the present invention include powders, sprays, ointments, pastes, creams, lotions, gels, solutions, plasters and compositions for inhalation. The active ingredient can be admixed under sterile conditions with a pharmaceutically acceptable carrier, as well as with any necessary preservatives, buffers or propellants.

Крім сполуки за даним винаходом, мазі, пасти, креми і гелі можуть містити такі ексципієнти, як тваринні і рослинні жири, олії, воски, парафіни, крохмаль, трагакант, похідні целюлози, полієтиленгліколі, силікони, бентоніти, кремнієву кислоту, тальк і оксид цинку, або їх суміші.In addition to the compound according to the present invention, ointments, pastes, creams and gels may contain such excipients as animal and vegetable fats, oils, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide , or their mixtures.

Порошки і спреї можуть містити, на додаток до сполуки за даним винаходом, такі ексципієнти, як лактоза, тальк, кремнієва кислота, гідроксид алюмінію, силікати кальцію і поліамідний порошок, або суміші цих речовин. Спреї можуть додатково містити стандартні пропеленти, наприклад, хлорфторвуглеводні і леткі незаміщені вуглеводні, наприклад, бутан і пропан.Powders and sprays may contain, in addition to the compound according to the present invention, such excipients as lactose, talc, silicic acid, aluminum hydroxide, calcium silicates and polyamide powder, or mixtures of these substances. Sprays can additionally contain standard propellants, for example, chlorofluorocarbons and volatile unsubstituted hydrocarbons, for example, butane and propane.

Як альтернатива, композиції і сполуки за даним винаходом можна вводити у формі аерозолів. Таке введення здійснюється шляхом одержання аерозолів на водній основі, ліпосомальних препаратів або твердих частинок, що містять сполуку за даним винаходом.Alternatively, the compositions and compounds of the present invention may be administered in the form of aerosols. Such administration is carried out by the preparation of water-based aerosols, liposomal preparations or solid particles containing the compound of the present invention.

Можна застосовувати не водні суспензії (наприклад, які включають фторвуглецевий пропелент).It is possible to use non-aqueous suspensions (for example, which include a fluorocarbon propellant).

Можна застосовувати ультразвукові інгалятори, оскільки в них здійснюється мінімальний механічний вплив на лікарський агент, що може приводити до руйнування сполук, які містяться в композиціях за даним винаходом.Ultrasonic inhalers can be used, as they exert a minimal mechanical effect on the medicinal agent, which can lead to the destruction of the compounds contained in the compositions according to the present invention.

Як правило, водні аерозолі одержують шляхом формування водного розчину або суспензії композиції за даним винаходом в комбінації з традиційними фармацевтично прийнятними носіями і стабілізаторами. Можна змінювати носії і стабілізатори відповідно до вимог до конкретної композиції за даним винаходом, але, як правило, ці компоненти включають неїонніAs a rule, aqueous aerosols are obtained by forming an aqueous solution or suspension of the composition according to the present invention in combination with traditional pharmaceutically acceptable carriers and stabilizers. Carriers and stabilizers may be varied as required for a particular composition of the present invention, but typically these components include nonionic

ПАР (Туееп5, Ріигопіс5 або поліетиленгліколь), нетоксичні білки, наприклад, альбумін сироватки, складні ефіри сорбітану, олеїнову кислоту, лецитин, амінокислоти, наприклад, гліцин, буфери, солі, цукри або цукрові спирти. Як правило, аерозолі одержують з ізотонічних розчинів.Surfactants (Tweep5, Rigopis5 or polyethylene glycol), non-toxic proteins such as serum albumin, sorbitan esters, oleic acid, lecithin, amino acids such as glycine, buffers, salts, sugars or sugar alcohols. As a rule, aerosols are obtained from isotonic solutions.

Фармацевтичні композиції за даним винаходом, які підходять для парентеральногоPharmaceutical compositions of the present invention suitable for parenteral administration

Зо введення, включають власне композицію в комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними стерильними ізотонічними водними або неводними розчинами, дисперсіями, суспензіями або емульсіями, або стерильні порошки, які можна відновити до стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкції безпосередньо перед застосуванням, що можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні засоби, розчинені компоненти, які роблять склад ізотонічним крові наміченого реципієнта, або суспендуючі або загущувальні агенти.For administration, include the composition itself in combination with one or more pharmaceutically acceptable sterile isotonic aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, or sterile powders that can be reconstituted into sterile solutions or dispersions for injection immediately before use, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, dissolved components that make the composition of the blood of the intended recipient isotonic, or suspending or thickening agents.

Приклади придатних водних і неводних носіїв, що можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях за даним винаходом, включають воду, етанол, поліоли (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і їх придатні суміші, рослинні олії, наприклад, оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні складні ефіри, наприклад, етилолеат і циклодекстрини. Необхідну плинність складу можна підтримувати, наприклад, застосуванням покривних матеріалів, таких, як лецитин, підтримкою необхідного розміру частинок у випадку дисперсій, а також застосуванням ПАР. Ефективність лікування композиціями за даним винаходом можна визначити рядом способів, відомих фахівцю в даній галузі техніки.Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention include water, ethanol, polyols (eg, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, vegetable oils, such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate and cyclodextrins. The necessary fluidity of the composition can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and also by the use of surfactants. The effectiveness of treatment with the compositions of the present invention can be determined by a number of methods known to a person skilled in the art.

У тексті даного опису, якщо вказано, що композиція має, включає або містить визначені компоненти, мається на увазі, що композиція також складається в основному з, або складається зі згаданих компонентів. Аналогічно, якщо вказано, що спосіб має, включає або містить визначені стадії, цей спосіб також складається в основному з, або складається зі згаданих стадій. За винятком випадків, коли вказане інше, порядок стадій або порядок здійснення визначених дій є несуттєвим, якщо винахід залишається працездатним. Крім того, якщо не вказане інше, дві або кілька стадій або операцій можуть здійснюватися одночасно.In the text of this description, if it is indicated that the composition has, includes or contains the specified components, it is meant that the composition also consists mainly of, or consists of the mentioned components. Likewise, if a method is stated to have, include, or contain specified steps, that method also consists essentially of, or consists of said steps. Except where otherwise specified, the order of the stages or the order of carrying out the specified actions is immaterial as long as the invention remains operable. In addition, unless otherwise specified, two or more stages or operations may be performed simultaneously.

ПРИКЛАДИEXAMPLES

Даний винахід додатково проілюстрований наступними прикладами. Ці приклади наведені тільки з ілюстративними цілями, і не потрібно вважати, що вони яким-небудь чином обмежують обсяг даного винаходу.The present invention is further illustrated by the following examples. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the present invention in any way.

Приклад 1: дослідження фіброзу печінкиExample 1: study of liver fibrosis

Фіброз печінки викликали в самців мишей С57БІ6 (Спагіез Кімег, ГТАгігевіє, Егапсе) ін'єкцією чотирихлористого вуглецю (ССіл-). Перед експериментом мишей С57рІіб масою 22-25 утримували в лабораторних умовах протягом 1 тижня. Тварин розселяли по 5 особин у клітці, 60 причому їжа і вода були доступні без обмежень.Liver fibrosis was induced in male C57BI6 mice (Spaghiez Kimeg, GTAgigevie, Egapse) by injection of carbon tetrachloride (SSil-). Before the experiment, C57rIib mice weighing 22-25 were kept in laboratory conditions for 1 week. Animals were housed 5 individuals per cage, 60 and food and water were available without restrictions.

У дослідженні було задіяно 5 тестових груп (дивитися таблицю 1): контрольна група з примусовим пероральним уведенням (СС), контрольна група з інтраперитонеальним уведенням (СІР), група, що одержувала чотирихлористий вуглець (ССІ4), групи, що одержували сполуку 34 іThe study involved 5 test groups (see Table 1): a gavage control group (SS), an intraperitoneal injection (IP) control group, a carbon tetrachloride (CCl4) group, a group receiving compound 34 and

УМ Н-133 (дивитися Диїеп еї аї!., (2005) СазігоепіегоІоду 128: 742-755 (для ознайомлення з УМ/Н- 133, СВ2-специфічним агоністом і антифіброгенним агентом)).UM H-133 (see Diyep et al., (2005) SazigoepiegoIodo 128: 742-755 (for review of UM/H-133, CB2-specific agonist and antifibrogenic agent)).

Таблиця 1Table 1

Контроль, примусове Розчин карбоксиметилцелюлози (носій для . : ща тижнів мишей) оливкова олія (носій для ССіІ4 інтраперитонеальне : ще .Control, forced Carboxymethylcellulose solution (carrier for . : scha weeks of mice) olive oil (carrier for SSiI4 intraperitoneal : more .

М оливкова олія (носій для ССів) тижнів введення (5 мишей) - й (кожні два дні) (10 мишей) інтраперитонеальним шляхом (200 мкл) . протягом 25 тижнів 30 мМ розчин сполуки 34 у 0,5 95 СМС 34: Щодня протягом 5M olive oil (carrier for SS) weeks of administration (5 mice) - and (every two days) (10 mice) intraperitoneally (200 μl) . for 25 weeks 30 mM solution of compound 34 in 0.5 95 SMS 34: Daily for 5

Й вводили шляхом перорального тижнів:And administered orally for weeks:

Сполука 34 (10 мишей) примусового годування (200 мкл), і ССіх у СС: З рази на тиждень оливковій олії вводили : й протягом 25 тижнів інтраперитонеальним шляхом (200 мкл)Compound 34 (10 mice) forced feeding (200 μl), and SSh in SS: Olive oil was administered once a week: and for 25 weeks by the intraperitoneal route (200 μl)

Агент УМУН-133 (10 мишей) СОЇ у у оливковій олії вводили Сбіл: З рази на тиждень інтраперитонеальним шляхом (200 мкл) протягом 25 тижнівAgent UMUN-133 (10 mice) SOY in olive oil was administered Sbil: Z times a week intraperitoneally (200 μl) for 25 weeks

Оцінювали ефективність сполуки 34 (специфічний ліганд РРАКаЯ) порівняно з УММН-133 (антифіброгенним агентом). Сполуку 34 вводили перорально в комбінації з ін'єкціями СсСід протягом приблизно 5 тижнів. Сполуку 34 вводили щодня в кількості 200 мкл 30 мМ розчину.The effectiveness of compound 34 (a specific ligand of PRAKaY) compared to UMMN-133 (an antifibrogenic agent) was evaluated. Compound 34 was administered orally in combination with CsCd injections for approximately 5 weeks. Compound 34 was administered daily in the amount of 200 μl of a 30 mM solution.

УМ/Н-133 вводили щодня шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в кількості З мг/кг (об'єм ін'єкції-100 мкл). Модельний фіброз печінки викликали постійною дією збільшуваних доз СсСід протягом 5 тижнів. На першому тижні миші одержували інтраперитонеальну ін'єкцію СеСі», суспендованого в оливковій олії в дозуванні 80 мкл/кг маси тварини два рази на тиждень.UM/N-133 was administered daily by intraperitoneal injection in the amount of 3 mg/kg (injection volume - 100 μl). Model liver fibrosis was induced by constant action of increasing doses of CsSid for 5 weeks. In the first week, the mice received an intraperitoneal injection of CeSi» suspended in olive oil at a dosage of 80 μl/kg of animal weight twice a week.

Протягом 2-ого тижня здійснювали З ін'єкції ССІї. у дозуванні 160 мкл/кг один раз на два дні.During the 2nd week, Z injections of SSII were carried out. in a dosage of 160 μl/kg once every two days.

Протягом 3-ого тижня здійснювали З ін'єкції ССІї у дозуванні 240 мкл/кг один раз на два дні.During the 3rd week, Z injections of SSII were carried out in a dosage of 240 μl/kg once every two days.

Протягом 4-ого тижня здійснювали З інтраперитонеальні ін'єкції ССІх у дозуванні 320 мкл/кг один раз на два дні. На 5-ий тиждень через З дні після останнього введення ССі- мишей піддавали евтаназії.During the 4th week, Z intraperitoneal injections of SSIx in a dosage of 320 μl/kg once every two days were carried out. On the 5th week, 3 days after the last administration of SSi, the mice were euthanized.

Під час проведення експерименту реєстрували масу тіла тварин. Як видно на фіг. 1, не існує помітної різниці між зміною маси тіла в різних групах мишей.During the experiment, the body weight of the animals was recorded. As can be seen in fig. 1, there is no significant difference between the change in body weight in different groups of mice.

Витягували печінку тварин, здійснювали швидке заморожування аліквот тканини печінки в рідкому азоті і зберігали при -809С до проведення аналізу. Частину печінки кожної тварини фіксували в 10 95 формаліні для гістологічного дослідження.Animal livers were extracted, liver tissue aliquots were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -809C until analysis. A part of the liver of each animal was fixed in 10 95 formalin for histological examination.

Приклад 2: гістологічний аналіз у дослідженні фіброзу печінкиExample 2: histological analysis in the study of liver fibrosis

Фіксовану у формаліні тканину печінки піддавали необхідній обробці і парафіновані зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином (НУЗЕ), а також обробляли барвником пікросиріус червоний (специфічне забарвлення для виявлення колагену на зрізах тканин) для оцінки ступеня фіброзу в печінці. Кожен препарат оцінювали три різні дослідники, що не малиLiver tissue fixed in formalin was subjected to the necessary processing and paraffin-embedded sections with a thickness of 5 μm were stained with hematoxylin and eosin (NUZE), as well as treated with picrosirius red dye (specific staining for the detection of collagen on tissue sections) to assess the degree of fibrosis in the liver. Each drug was evaluated by three different independent investigators

Зо даних про його походження, для кількісного визначення ступеня фіброзу в кожній частці печінки (5), використовуючи шкалу Меїаміг (див. фіг. 2А, на якій наведений графік результатів за шкалою Меїаміг). Фотографічні зображення, показані на фіг. 28, одержували за допомогою 20х об'єктива. Контрольна група мала результат БО, і група, що одержувала Ссі":, продемонструвала результат ЕЗ, який вказує на наявність фіброзу печінки. Сполука 34 (СЕВО) продемонструвала сильніше зменшення фіброзу, порівняно з групою УМ/Н-133, з результатами відповідно Е1 для сполуки 34 і Е2 для УМУН-133.From the data on its origin, to quantify the degree of fibrosis in each lobe of the liver (5), using the Meiamig scale (see Fig. 2A, which shows a graph of the Meiamig scale results). The photographic images shown in fig. 28, obtained with the help of a 20x lens. The control group had a BO result, and the Csi": group showed an EZ result, indicating the presence of liver fibrosis. Compound 34 (SEVO) showed a greater reduction in fibrosis, compared to the UM/H-133 group, with results respectively E1 for compounds 34 and E2 for UMUN-133.

Як і очікувалося, фіброз не спостерігався в двох групах контрольних мишей (контрольне примусове пероральне введення носіїв (СО) і контрольне ІР уведення носіїв (СІР)). У групі мишей з фіброзом (група ССІх), що одержували тільки носій, був зареєстрований середній результат 2,5:20,5, що відповідає фіброзу в ступені від помірного до важкого відповідно до шкали Меїаміг (див. фіг. ЗА). Для мишей з фіброзом, що одержували УМУ/Н-133 або сполуку 34 (СЕВО), були зафіксовані результати 20 і 2,140,2 відповідно. Для обох препаратів, тобто УМУ/Н- 133 ї СЕО, спостерігалося зменшення ступеня фіброзу з важкого до помірного з приблизно аналогічною ефективністю.As expected, fibrosis was not observed in two groups of control mice (control forced oral vehicle administration (CO) and control IR vehicle administration (CIP)). In the group of mice with fibrosis (SCIx group) that received only the vehicle, a mean score of 2.5:20.5 was recorded, corresponding to moderate to severe fibrosis according to the Mayamig scale (see Fig. 3A). For mice with fibrosis receiving UMU/H-133 or compound 34 (SEVO), results of 20 and 2,140.2 were recorded, respectively. For both drugs, i.e., UMU/H-133 sEO, a reduction in the degree of fibrosis from severe to moderate was observed with approximately similar efficacy.

Ці результати підтверджували з використанням адаптованої шкали Мегїаміг (фіг. З В); кожен зріз печінки аналізували 2 дослідники, які не мали даних про його походження, з метою кількісної оцінки при низькому збільшенні (х5) більше 30 препаратів портальних трактів, класифікованих за шкалою Меїаміг від БО до Б4 (результат (для 1 зрізу)-хУ (РТЕ14РТЕ22РТЕЗАРТЕ4)). З використанням одержаних результатів було продемонстровано, що УМ/Н і СЕО знижували ступінь фіброзу на 14,2 9б5 і 12,5 95 відповідно, порівняно з тваринами, які не одержували препаратів, і що терапевтична дія двох протестованих речовин була приблизно однаковою.These results were confirmed using the adapted scale Megiamig (Fig. 3B); each liver section was analyzed by 2 investigators, who did not have data on its origin, in order to quantify at low magnification (x5) more than 30 preparations of the portal tracts, classified according to the Meiamig scale from BO to B4 (result (for 1 section)-xU (PTE14PTE22RTEZARTE4 )). Using the obtained results, it was demonstrated that UM/H and CEO reduced the degree of fibrosis by 14.2 9b5 and 12.5 95, respectively, compared to animals that did not receive the drugs, and that the therapeutic effect of the two substances tested was approximately the same.

Приклад 3: аналіз експресії генів у дослідженні фіброзу печінкиExample 3: Gene expression analysis in liver fibrosis research

Визначали вплив уведення сполуки 34 (СЕБ) і специфічного агоніста СВ2 (УМ/Н-133) на рівень експресії генів цитокінів (І--18, ТМЕ-а) і генів, залучених у механізм розвитку фіброзу, за допомогою реакції РОК у режимі реального часу.We determined the effect of the introduction of compound 34 (SEB) and the specific CB2 agonist (UM/H-133) on the expression level of cytokine genes (I--18, TME-a) and genes involved in the mechanism of fibrosis development using the ROK reaction in real time time

РНК повністю ізолювали з печінки, використовуючи набір Кпеазу (Маспегеу Мадеї, Ноегаї,RNA was completely isolated from the liver using the Kpeazu kit (Maspegeu Madei, Noegai,

Егапсе) відповідно до інструкції виробника. Кількісне визначення РНК здійснювали з використанням спектрофотометрії. Після обробки при 37 С протягом 30 хвилин 20-50 одиницями ОМабзе 1 (дезоксирибонуклеази 1), яка не містить КМазе (рибонуклеази) (КоспеEgapse) according to the manufacturer's instructions. Quantification of RNA was carried out using spectrophotometry. After treatment at 37 C for 30 minutes with 20-50 units of OMabse 1 (deoxyribonuclease 1), which does not contain KMase (ribonuclease) (Cospe

Оіадповійс5 Согрогайоп, Іпаіапароїї5, ІМ, О5БА), використовували оліго-4ї праймери (КоспеOligo-4 primers (Cospe

Оіадповійс5 Согрогайоп, Іпаіапароїїх5, ОБА) для синтезу одноланцюгової кДНК. Кількісне визначення мРНК здійснювали з використанням суміші ЗУВК дгееп Мабзієг Міх (Аррієга,Oiadpoviys5 Sogrogayop, Ipaiaparoiykh5, OBA) for the synthesis of single-stranded cDNA. Quantitative determination of mRNA was carried out using a mixture of ZUVK dgeep Mabzieg Mich (Arriega,

Соипаброецшї, Егапсе) зі специфічними для мишей олігонуклеотидами (див. таблицю 2) у термоциклері СепеАтр Абіргізт 7000 (Арріега, Сошгпароеці, Егапсе). У кожен аналіз включали калібровані і такі, що не містили матриці, контрольні зразки. Для кожного зразка проводили три паралельні аналізи. Інтенсивність барвника ЗУВЕ. дгееп визначали за допомогою програмного забезпечення Абіргізт 7000 505 (Аррієега, Соипароеші, Егапсе). Усі результати нормалізувалиSoipabroetschi, Egapse) with mouse-specific oligonucleotides (see Table 2) in a thermocycler SepeAtr Abirgizt 7000 (Arriega, Soshgparoetsi, Egapse). Calibrated and matrix-free control samples were included in each analysis. Three parallel analyzes were performed for each sample. The intensity of the ZUVE dye. dgeep was determined with the help of the software Abirgist 7000 505 (Arriega, Soiparoeshi, Egapse). All results were normalized

Зо за конститутивним геном р-актину, не залученим в аналітичні реакції.Zo by the constitutive p-actin gene, not involved in analytical reactions.

Таблиця 2Table 2

Е5У во ТСАвААвроАТТОССТАТ»-3" (БЕО ПО МО: 1) р-актин КЕ У-я6ТСТСАААСАТеАТСТов-3" (5ЕО І МО: 2)E5U in TSAvAAvroATTOSSTAT"-3" (BEO PO MO: 1) p-actin KE U-ya6TSTSAAASATeATSTov-3" (5EO AND MO: 2)

ТМЕ ЕУ-Теве Ав ТАвАСААвсоТАСААССС-3" (ЗЕОО МО: З) ч КУ САТСТІТСТСААААТТСеАвТеАСАА-3У" (5ЕО О МО: 4)TME EU-Teve Av TAvASAAvsoTASAASSS-3" (ZEOO MO: З) h KU SATSTITSTSSAAAATTSeAvTeASAA-3U" (5EO O MO: 4)

ЕУ-"АТССАСАСТСТОССА»СТеСА-3" (5ЕО ІЮ МО: 5) пр В:5-СААССААСААеТеАТАТТСТССАТо-3" (8ЕО І МО: 6) і Е: 5- САС ТАС ТО АТС САС ССТ ААС САА -3" (ЗЕОСИЮ МО: 7) колаген В: 5'- АСА САС СТС ТОА ССТ ОТО ТОСАТ-3 0 (ВЕ ПО МО: 8) а-9МА Е У- ССТ САС ССО САС СТО АТС -3 (ЗЕО І МО: 9)EU-"АТССАСАСТСТОССА»СТЕСА-3" (5EO IYU MO: 5) pr V:5-СААССАААеТеАТАТТСССАТо-3" (8EO AND MO: 6) and E: 5- САС TАС TO АТС САС ССТ AАС САА -3" (ZEOSIU MO: 7) collagen B: 5'- ASA SAS STS TOA SST OTO TOSAT-3 0 (VE PO MO: 8) a-9MA E U- SST SAS SSO SAS STO ATS -3 (ZEO and MO: 9)

КІУ- АТО ААА САТ СОС ТО ДАО АСА ОТ ТТ -3" (5БОЮ МО: 10)KIU- ATO AAA SAT SOS TO DAO ASA OT TT -3" (5 BYU MO: 10)

У різних групах мишей не спостерігалося значних змін експресії генів цитокінів. Що стосується генів, залучених у механізм розвитку фіброзу, мало місце помітне збільшення експресії 5МА і колагену-ї у тварин з фіброзом (ССі- група) порівняно з контрольними тваринами (СО і СІР групи). Як можна бачити на фіг. 4 і в таблиці 3, у групах мишей, які одержували СЕО і УМУН-133, мало місце зниження рівнів -З5МА і колагену-1 порівняно з ССід групою (контрольною групою з фіброзом). Що стосується рівня колагену-1, зниження було статистично значущим для групи мишей, що одержували сполуку 34, порівняно з мишами, що одержували СсСі», з результатами, відповідно 42,8:214,81, р-0,03 проти 75,15:255,23. Ці біологічні дані, поряд з поліпшенням результатів гістології в мишей, які одержували сполуку 34, дають підставу припустити, що сполука 34 може мати терапевтичні анти-фібротичні властивості.No significant changes in the expression of cytokine genes were observed in different groups of mice. As for the genes involved in the mechanism of development of fibrosis, there was a noticeable increase in the expression of 5MA and collagen in animals with fibrosis (CCi group) compared to control animals (CO and CIP groups). As can be seen in fig. 4 and in Table 3, in the groups of mice that received CEO and UMUN-133, there was a decrease in the levels of -Z5MA and collagen-1 compared to the SSid group (control group with fibrosis). Regarding the level of collagen-1, the decrease was statistically significant for the group of mice treated with compound 34 compared to the mice treated with CsCi, with the results, respectively, 42.8:214.81, p-0.03 vs. 75.15 :255.23. These biological data, along with the improvement in histology results in mice treated with compound 34, suggest that compound 34 may have therapeutic anti-fibrotic properties.

Таблиця ЗTable C

Приклад 4: визначення ферментів печінки в крові в дослідженні фіброзу печінкиExample 4: determination of liver enzymes in blood in the study of liver fibrosis

Оцінювали вплив перорального введення сполуки 34 (ЗЕ) і специфічного агоніста СВ2 (УМ/Н-133) на різні біохімічні параметри сироватки мишей, пов'язані з печінкою, а саме: рівні печінкових ферментів (аланінамінотрансферази (А5Т) і аспартатамінотрансферази (АЇЛТ)), гамма СТ і лужної фосфатази.The effects of oral administration of compound 34 (ZE) and a specific CB2 agonist (UM/H-133) on various liver-related biochemical parameters of mice serum were evaluated, namely: levels of liver enzymes (alanine aminotransferase (A5T) and aspartate aminotransferase (AILT)) , gamma ST and alkaline phosphatase.

Як і очікувалося, через 4 дні після останнього введення ССіїх, у всіх групах мишей не спостерігалося збільшення рівнів А5Т, АТ і АЇК Р. Сполука 34 не викликала якого-небудь підвищення рівнів печінкових ферментів у крові, що вказує на відсутність токсичності для печінки.As expected, 4 days after the last administration of SSRIs, no increase in A5T, AT, and AIC R levels was observed in all groups of mice. Compound 34 did not cause any increase in liver enzyme levels in the blood, indicating no liver toxicity.

Згідно з даними гістології і дослідження печінкових маркерів, УМУН-133 і сполука 34 мають подібну анти-фібротичну дію в мишей з фіброзом печінки, викликаним багаторазовими ін'єкціями ССіл. Як і очікувалося, УМУН знижував ураження печінки фіброзом на 1495 і нормалізував концентрацію мРНК колагену-1 у печінці. Сполука 34 здійснювала аналогічну дію, не виявляючи токсичності відносно печінки. Ці дані дозволяють припустити, що сполука 34 може бути першою сполукою, яка виявляє як протизапальні, так і анти-фібротичні властивості.According to histological data and liver marker studies, UMUN-133 and compound 34 have similar anti-fibrotic effects in mice with liver fibrosis caused by multiple injections of CCil. As expected, UMUN reduced liver fibrosis by 1495 and normalized collagen-1 mRNA concentration in the liver. Compound 34 exerted a similar effect without showing toxicity to the liver. These data suggest that compound 34 may be the first compound to exhibit both anti-inflammatory and anti-fibrotic properties.

Приклад 5: дослідження фіброзу кишечникуExample 5: study of intestinal fibrosis

У цьому прикладі описаний експеримент для оцінки впливу сполуки 34 на фіброз кишечнику.This example describes an experiment to evaluate the effect of compound 34 on intestinal fibrosis.

Хронічний коліт викликали в мишей С57ріІб, здійснюючи З цикли введення 2,5 95 055 (декстран сульфату натрію) (М.маса 40 000-50 000, ТаВв сопзиКапсу АВ, Буледеп), розчиненого в стерильній питній воді протягом 5 днів, з наступним прийомом звичайної питної води протягом 7 днів.Chronic colitis was induced in C57riIb mice by administering C cycles of 2.5 95 055 (dextran sodium sulfate) (M. mass 40 000-50 000, TaVv sopzyKapsu AV, Buledep) dissolved in sterile drinking water for 5 days, followed by ordinary drinking water for 7 days.

У дослідженні були задіяні З тестові групи (дивитися таблицю 4): контрольна група, контрольна група, яка одержувала 055, група, яка одержувала сСЕО (сполуку 34).Three test groups were involved in the study (see Table 4): a control group, a control group receiving 055, and a group receiving cSEO (compound 34).

Таблиця 4 5 днів уведення О55, 7 днів 055 контрольна група 2,5 956 055 у питній НгО відсутність О55 протягом 36 (25 мишей) днів здійснювали пероральне введення 30 мМ | спол. 34: щодня в дні 13-36; сполука 34 (25 мишей) розчину сполуки 34 у 0,5 96 СМС за р: 5 днів уведення 055, 7 допомогою примусового годування (200 |днів відсутність О55 мкл) і 2,5 96 055 у питній НгО протягом 36 днівTable 4 5 days of administration of О55, 7 days 055 control group 2.5 956 055 in drinking NgO absence of О55 for 36 (25 mice) days oral administration of 30 mM | co. 34: daily on days 13-36; compound 34 (25 mice) solution of compound 34 in 0.5 96 SMS per r: 5 days of administration of 055, 7 by means of forced feeding (200 days absence of О55 μl) and 2.5 96 055 in drinking HgO for 36 days

Сполуку 34 використовували в оптимальному дозуванні (30 мм) і здійснювали пероральне введення шляхом примусового годування щодня після другого циклу введення О55 і до моменту здійснення евтаназії. Мишей, які одержували Ю55, обстежували двічі на тиждень,Compound 34 was used in the optimal dosage (30 mm) and administered orally by force-feeding every day after the second cycle of O55 administration and until euthanasia. Mice receiving U55 were examined twice a week,

Зо виявляючи розвиток коліту шляхом спостереження за масою тіла. Евтаназію мишей здійснювали через один тиждень після третього циклу введення 055 (див. фіг. 5). Здійснювали посмертне визначення розміру і маси ободової кишки мишей.By detecting the development of colitis by monitoring body weight. Mice were euthanized one week after the third cycle of 055 administration (see Fig. 5). Postmortem determination of the size and mass of the colon of mice was carried out.

Приклад 6: аналіз результатів дослідження фіброзу кишечникуExample 6: analysis of the results of the intestinal fibrosis study

А: співвідношення маса/розмір ободової кишкиA: colon mass/size ratio

Фіброз кишечнику характеризується зменшенням довжини і стовщенням ободової кишки, а також утворенням спайок. Величина співвідношення маса/розмір ободової кишки є індикатором рівня запалення і фіброзу. Як видно на фіг. бА, статистично значуще збільшення на 124 95 співвідношення маса/розмір ободової кишки спостерігалося в мишей ОЮ55, які одержували носій, порівняно з контрольними мишами, які одержували тільки звичайну воду, при значеннях вказаного співвідношення відповідно 44,9826,31 і 20,11-3,91, р«0,05. Ці результати ілюструються істотним скороченням довжини ободової кишки в 55 мишей (фіг. 6В). Сполука 34 викликає 34 95 зменшення профібротичної дії 055, приводячи до значного зменшення співвідношення маса/розмір ободової кишки, при значеннях вказаного співвідношення 38,13257,82 проти 44,98:26,31 (р«е0,05), порівняно з 055 мишами, які одержували тільки носій (фіг. бА). Відповідно, сполука 34 зменшує морфологічні ознаки фіброзу, такі, як зменшення довжини і стовщення ободової кишки, а також зменшує відкладення колагену в ободовій кишці (фіг. 68).Intestinal fibrosis is characterized by a decrease in the length and thickening of the colon, as well as the formation of adhesions. The value of the mass/size ratio of the colon is an indicator of the level of inflammation and fibrosis. As can be seen in fig. bA, a statistically significant increase of 124 95 in the ratio of mass/size of the colon was observed in ОЮ55 mice that received the vehicle compared to control mice that received only plain water, with the values of the specified ratio being 44.9826.31 and 20.11-3, respectively .91, p«0.05. These results are illustrated by a significant reduction in the length of the colon in 55 mice (Fig. 6B). Compound 34 causes a 34 95 decrease in the pro-fibrotic effect of 055, leading to a significant decrease in the ratio of mass/size of the colon, with the values of the specified ratio 38.13257.82 versus 44.98:26.31 (r«e0.05), compared to 055 mice , who received only the carrier (fig. bA). Accordingly, compound 34 reduces the morphological signs of fibrosis, such as a decrease in the length and thickening of the colon, and also reduces the deposition of collagen in the colon (Fig. 68).

В. Рівень запалення за даними гістологічних дослідженьB. Level of inflammation according to histological studies

Відбирали кільцеві зразки поперечної ділянки ободової кишки (посмертно), фіксували в 4 95 формальдегіді і заливали парафіном для гістологічного аналізу. Зрізи (товщиною 4 мкм) забарвлювали барвником Мея-Грюнвальда-Гімзи і проводили мультипараметричну гістологічну оцінку (результат від 0 до 18) із залученням двох дослідників, які не були інформовані про походження препаратів. Проведене забарвлення давало можливість кількісної оцінки запалення. Гістологічні бали, що відбивають рівень запалення, привласнювали, виходячи з інтенсивності клітинного інфільтрату в слизуватій оболонці, його поширення в шари підслизуватої оболонки і наявності уражень епітелію (див. таблицю 5).Ring samples of the transverse section of the colon were taken (postmortem), fixed in 4 95 formaldehyde and embedded in paraffin for histological analysis. Sections (4 μm thick) were stained with May-Grunwald-Giemsa dye and multiparametric histological evaluation (score from 0 to 18) was performed by two investigators who were not informed about the origin of the drugs. The staining made it possible to quantitatively assess inflammation. Histological scores reflecting the level of inflammation were assigned based on the intensity of cellular infiltrate in the mucous membrane, its distribution in the layers of the submucosa and the presence of epithelial lesions (see Table 5).

Таблиця 5 - Ж 1 легкий ступінь вага пе . 2 помірний ступіньTable 5 - F 1 easy degree weight pe. 2 moderate degree

З важкий ступінь тешнн | 0 нн 1 слизувата оболонка поширення 27. 2 слизувата і підслизувата оболонкиWith a difficult degree of teshnn | 0 nn 1 mucous membrane spread 27. 2 mucous and submucous membranes

З наскрізне 4 немає відновлення тканинWith through 4 there is no tissue recovery

З ушкоджено поверхневий епітелій регенерація 2 регенерація з виснаженням кишкових крипт 1 практично повна регенерація 0 повна регенерація або нормальна тканина 0 відсутнє 1 уражена нижня 1/3 ураження крипт 2 уражені нижні 2/3With damaged surface epithelium regeneration 2 regeneration with depletion of intestinal crypts 1 almost complete regeneration 0 complete regeneration or normal tissue 0 absent 1 affected lower 1/3 crypts affected 2 affected lower 2/3

З не зачеплений тільки поверхневий епітелій 4 повна втрата крипт і епітелію 1 1-25 95 процентна частка 2 26-50 Фо уражених тканин З 51-75 95 4 76-100 95C not affected only the surface epithelium 4 complete loss of crypts and epithelium 1 1-25 95 percentage 2 26-50 Fo of affected tissues C 51-75 95 4 76-100 95

Ступінь запалення оцінювали на гістологічному рівні для кожного зразка ободової кишки миші, використовуючи класичне забарвлення МО. Як і очікувалося, значне і сильне запалення спостерігалося в групі мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду, при значеннях 3,77-0,80 проти 0,50-0,33, р«е0,05 (див. фіг. 7). Цей результат підтверджує, що З цикли введення Ю55 викликають запалення. Статистично значуще зниження рівня запалення спостерігалося в 055 мишей, які одержували сполуку 34, порівняно з мишами 055, які одержували тільки носій, при значеннях відповідно 2,18:20,48 проти 3,77-0,80, р-0,05.The degree of inflammation was assessed at the histological level for each mouse colon sample using classical MO staining. As expected, significant and severe inflammation was observed in the group of mice that received Yu55 compared to control mice that received plain water, with values of 3.77-0.80 vs. 0.50-0.33, p«e0.05 (see Fig. 7). This result confirms that 3 cycles of Yu55 administration cause inflammation. A statistically significant reduction in the level of inflammation was observed in 055 mice receiving compound 34 compared to 055 mice receiving vehicle alone, with values of 2.18:20.48 vs. 3.77-0.80, p-0.05, respectively.

С. Рівень фіброзуC. Level of fibrosis

С1. Оцінка при забарвлюванні барвником пікросиріус червонийC1. Evaluation by staining with picrosirius red dye

Одержані зразки тканин кишечнику швидко фіксували 10 95 буферованим формаліном у РВ5 (рН 7,4) протягом З год., дегідратували в очищеному етанолі і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Фіксовані формаліном тканини ободової кишки піддавали необхіднійThe obtained samples of intestinal tissues were quickly fixed with 10 95 buffered formalin in РВ5 (pH 7.4) for 3 hours, dehydrated in purified ethanol and embedded in paraffin with a low melting point. Formalin-fixed colon tissues were subjected to the necessary

Зо обробці і парафінові зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали барвником пікросиріус червоний для гістологічного аналізу. Зображення препаратів одержували з використанням об'єктива х20.After processing, paraffin sections with a thickness of 5 μm were stained with picrosirius red dye for histological analysis. The images of the preparations were obtained using a x20 objective.

Кожен зріз був досліджений З різними експериментаторами, які не мали інформації про його походження, для кількісної оцінки ступеня фіброзу з використанням балів від 0 до 4.Each slice was examined by a different experimenter blinded to its origin to quantify the degree of fibrosis using a score from 0 to 4.

Статистично значуще збільшення рівня фіброзу спостерігалося в ободовій кишці 055 мишей порівняно з контрольними мишами при сумі балів відповідно 2,27520,12 проти 1,12:20,07 (див. фіг. 8). Цей результат підтверджує, що хронічне запалення, викликане З циклами введення Ю55, приводить до фіброзу кишечнику. Дані експериментів підтверджують також, що введення сполуки 34 мишам 055 знижує рівень фіброзу порівняно з мишами О55, які одержували тільки носій (1,625:0,15 проти 2,2750,12, р«0,05).A statistically significant increase in the level of fibrosis was observed in the colon of 055 mice compared to control mice with a total score of 2.27520.12 versus 1.12:20.07, respectively (see Fig. 8). This result confirms that chronic inflammation caused by cycles of U55 administration leads to intestinal fibrosis. Experimental data also confirm that administration of compound 34 to 055 mice reduces the level of fibrosis compared to O55 mice that received only the vehicle (1.625:0.15 vs. 2.2750.12, p<0.05).

С2. дослідження із застосуванням забарвлення трихромом за МасономC2. research using Masson's trichrome staining

У даній оцінці рівня фіброзу ободової кишки застосовували забарвлення трихромом заIn this evaluation of the level of fibrosis of the colon, trichrome staining was used

Масоном і забарвлення колагену. Одержані зразки ободової кишки швидко фіксували 10 95 буферованим формаліном у РВ5 (рН 7,4) протягом З год., дегідратували в очищеному етанолі і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Послідовно одержані З мкм зрізи інкубували протягом 40 хвилин у метанолі і З 95 розчині пероксиду водню, після чого промивалиFreemason and collagen staining. The resulting colon samples were quickly fixed with 10 95 buffered formalin in PB5 (pH 7.4) for 3 hours, dehydrated in purified ethanol and embedded in low-melting paraffin. Consecutively obtained Z μm sections were incubated for 40 minutes in methanol and Z 95 hydrogen peroxide solution, after which they were washed

РВ5. Фіброз кишечнику оцінювали в термінах "відсутність", "помірний" або "важкий" залежно від густини і поширеності забарвлення трихром-позитивної сполучної тканини, а також порушення структури тканини.RV5. Intestinal fibrosis was assessed as "absent", "moderate" or "severe" depending on the density and prevalence of trichrome-positive connective tissue staining, as well as tissue structure disorders.

С3. визначення рівнів колагенуC3. determination of collagen levels

Для здійснення імуногістохімічного аналізу, зразки тканин з ободової кишки фіксували у свіжому 4 95 розчині параформальдегіду (РЕА) у РВЗ протягом З год. при кімнатній температурі, дегідратували в декількох порціях очищеного етанолу і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Зрізи товщиною З мкм інкубували в метанолі протягом 40 хв. і потім уFor immunohistochemical analysis, tissue samples from the colon were fixed in fresh 4 95 paraformaldehyde solution (PEA) in RVZ for 3 hours. at room temperature, dehydrated in several portions of purified ethanol and embedded in paraffin with a low melting point. Sections with a thickness of 3 μm were incubated in methanol for 40 min. and then in

З 96 пероксиді водню протягом 5 хв. Зразки інкубували протягом ночі зі специфічними антитілами проти колагену типів І-І (Абсат), фактора росту сполучної тканини (СТОР) (Абсат), тромбоцитарного фактора росту (РОСЕ), ЗМАЮ2/3, тобто основних маркерів фіброзу. Зразки промивали РВ5 протягом 5 хв. і інкубували зі стрептавідин-біотин-пероксидаза кон'югованим вторинним антитілом (ШаКко ЗАВ Согрогайоп, код КОб75, БаКо-Суїотацоп, Мііїапо). Після промивання РВ5 протягом 10 хвилин зрізи піддавали інкубуванню з 3,3-діамінобензидин тетрагідрохлоридом протягом 1-3 хвилин.With 96 hydrogen peroxide for 5 min. The samples were incubated overnight with specific antibodies against collagen types I-I (Absat), connective tissue growth factor (STOR) (Absat), platelet-derived growth factor (ROSE), ZMAYU2/3, i.e. the main markers of fibrosis. Samples were washed with RV5 for 5 min. and incubated with streptavidin-biotin-peroxidase conjugated secondary antibody (ShaKko ZAV Sogrogayop, code KOb75, BaKo-Suiotsop, Miiiiapo). After washing with PB5 for 10 minutes, the sections were incubated with 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride for 1-3 minutes.

Специфічність імунної реакції визначали, пропускаючи обробку первинними антитілами. На завершення зразки забарвлювали гематоксиліном Майєра і досліджували за допомогоюThe specificity of the immune reaction was determined by omitting treatment with primary antibodies. Finally, the samples were stained with Mayer's hematoxylin and examined using

Зо світлового мікроскопа ОїІутрив ВХ51 Гідні Місгозсоре (ОіІутривз, Оріїса! Со., Ца., ТоКуо, щдарап).From the light microscope OiIutryv VKH51 Good Misgozsore (OiIutryvs, Oriisa! So., Tsa., ToKuo, shdarap).

В імуногістохімічному аналізі (х20) колагенів І-МІ у зразках ободової кишки 055 і контрольних мишей, забарвлення колагенів І-МІ у товстому кишечнику 055 мишей було локалізоване головним чином у сполучній тканині підслизуватого шару і м'язової оболонки, де спостерігалося сильне забарвлення колагену (див. фіг. 9). Як показано на фіг. 9, уведення сполуки 34 пов'язане зі зменшенням забарвлення колагену, що вказує на зменшення фіброзу й ослаблення поширення фіброзу кишечнику.In the immunohistochemical analysis (x20) of I-MI collagens in the colon samples of 055 and control mice, the staining of I-MI collagens in the large intestine of 055 mice was localized mainly in the connective tissue of the submucosal layer and the muscularis, where strong collagen staining was observed ( see Fig. 9). As shown in fig. 9, the administration of compound 34 is associated with a decrease in collagen staining, indicating a reduction in fibrosis and attenuation of the spread of intestinal fibrosis.

На додаток до протизапальної дії, уведення сполуки 34 швидко ослаблює явища, які ведуть до фіброзу, на молекулярному рівні і попереджає фібротичне ураження кишечнику в мишей, викликані О55.In addition to the anti-inflammatory effect, administration of compound 34 rapidly attenuates events that lead to fibrosis at the molecular level and prevents fibrotic intestinal damage in O55-induced mice.

Для проведення Вестерн-блотингу, 0,5 см заморожених зразків ободової кишки гомогенізували в буфері КІРА, що містить 50 мМ Ттгі5 НСІ рН 7,6, 150 мМ Масі, 1,5 мм Масі», 5For Western blotting, 0.5 cm of frozen colon samples were homogenized in KIRA buffer containing 50 mM Ttgi5 HCI pH 7.6, 150 mM Masi, 1.5 mm Masi", 5

ММ ЕОТА, 195 Тийоп-Х і 1095 гліцерину з добавкою 100 мМ фториду натрію (Має), 2 мМ ортованадату натрію (МазмО»), 10 мМ пірофосфату натрію (МарРРі), 1 мМ фенілметансульфону (РМ5БЕ) і класичної суміші інгібіторів протеази, що містить 10 мкг/мл леупептину й апротиніну.MM EOTA, 195 Thiop-X and 1095 glycerol with the addition of 100 mM sodium fluoride (Mae), 2 mM sodium orthovanadate (MazMO), 10 mM sodium pyrophosphate (MarPPi), 1 mM phenylmethanesulfone (PM5BE) and a classic mixture of protease inhibitors, which contains 10 μg/ml of leupeptin and aprotinin.

Для кожного зразка 30 мг білка виділяли за допомогою РАСЕ і розділяли електрофорезом.For each sample, 30 mg of protein was isolated by RACE and separated by electrophoresis.

Мембрани з нітроцелюлози (з чистотою 100 95) інкубували (відповідно до окремого протоколу для кожного антитіла) з первинними антитілами, спрямованими проти СТОБЕ, колагену-ї іMembranes from nitrocellulose (purity 100 95) were incubated (according to a separate protocol for each antibody) with primary antibodies directed against STOBE, collagen and

САРОН (придбаними в Абсат, Сатрьгідде, ОК; 1:1000 протягом 2 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,195 ТВ5-ї. Потім мембрани промивали 0,1 95 ТВ5-ї і інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (анти-кролячим і анти-мишачим;SARON (purchased from Absat, Satrygidde, OK; 1:1000 for 2 h. at kt), diluted with 5 95 skim milk in 0.195 TV5. Then the membranes were washed with 0.1 95 TB5 and incubated with secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase (anti-rabbit and anti-mouse;

Зідта Аїагісп; 1:20000 протягом 1 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,1 95Zidta Ayagisp; 1:20000 for 1 hour. at kt), diluted 5 95 with skim milk to 0.1 95

ТВ5-ї. На завершення здійснювали імунологічний аналіз із хемолюмінісцентним субстратом зирегзідпа! УУебі Рісо (Тпепто зЗсіепіййс Ріегсе, Егетродедет) відповідно до протоколу виробника. Мембрани реєстрували на ауторадіографічну плівку (Еції Рпоїо Рйт Со., би5зеїдоті,TV5. At the end, an immunological analysis was carried out with the chemiluminescent substrate ziregzidpa! UUebi Riso (Tpepto zZsiepijs Riegse, Egetrodedet) according to the manufacturer's protocol. Membranes were recorded on autoradiographic film (Ecii Rpoio Ryt So., bi5zeidoti,

Септапу). Оптичну густину цільових смуг визначали за допомогою денситометра з комп'ютерним керуванням і загальнодоступною програмою Ітадеу (М/.5.,Вазбрапа, Ітаде,Septap). The optical density of the target bands was determined using a densitometer with computer control and the public program Itadeu (M/.5., Vazbrapa, Itade,

И.5.Маїйопаї! Іпзійшев ої Неанй, Веїйезаа, МО; пир://15Б.іпго.пій.дом/|/, 1997-2011). Рівні молекул, які цікавлять, у тканинах виражали в одиницях оптичної густини (00) відносно загальної кількості білка, нормалізованого за внутрішнім контролем САРОН, і результати виражали в 60 процентних частках відносно контрольної групи.I.5. Maiyopai! Ipziishev oi Neany, Veijezaa, MO; pyr://15B.ipgo.pii.dom/|/, 1997-2011). Tissue levels of molecules of interest were expressed as optical density units (00) relative to total protein normalized to the SARON internal control, and results were expressed as 60 percentiles of control.

Використовуючи ІГХ (імуногістохімічні) методики і специфічні антитіла, спостерігали зменшення рівнів основних маркерів фіброзу (колагену І-Ш, СТОР, 5МАО 2/3, РОСЕ, а-ЗМА і такг-В1) в ободовій кишці 055 мишей, які одержували СЕО, порівняно з мишами з колітом, які одержували носій (див. фіг. ЗА-9Е).Using IGH (immunohistochemical) methods and specific antibodies, we observed a decrease in the levels of the main markers of fibrosis (collagen I-Sh, STOR, 5MAO 2/3, ROSE, a-ZMA and takg-B1) in the colon of 055 mice that received SEO, compared with vehicle-treated mice with colitis (see Fig. ZA-9E).

Ці результати підтверджували з використанням методики Вестерн-блотингу, і кількісне визначення різних маркерів фіброзу проводили на цілісних зразках ободової кишки (дивіться фіг. 10). Як можна бачити з даних таблиці 6, значуще ослаблення експресії колагену І, СТОК іThese results were confirmed using Western blotting techniques, and the quantification of various markers of fibrosis was performed on whole colon samples (see Fig. 10). As can be seen from the data of Table 6, a significant weakening of the expression of collagen I, STOK and

І/-13 спостерігалося в мишей з колітом, які одержували СЗЕО, порівняно з мишами, які одержували тільки носій (колаген !| 90,75:2419,91 проти 284,4:63,86, р-0,012; для СТО 55,75:217,53 проти 115,1216,88, р-0,029; і для 1-13 88,88:-14,0 проти 189,5:28,71, р-0,007).I/-13 was observed in mice with colitis that received SZEO compared to mice that received only vehicle (collagen !| 90.75:2419.91 vs. 284.4:63.86, p-0.012; for STO 55, 75:217.53 vs. 115.1216.88, p-0.029; and for 1-13 88.88:-14.0 vs. 189.5:28.71, p-0.007).

Таблиця 6 1111111 Ї7771111111055... | о555БО | -::( РTable 6 1111111 Y7771111111055... | o555BO | -::( R

Приклад 7: дослідження фіброзу кишечникуExample 7: study of intestinal fibrosis

У цьому прикладі описаний експеримент з оцінки ефекту сполуки 34 (СЗЕБО) при лікуванні фіброзу кишечнику.This example describes an experiment to evaluate the effect of compound 34 (SZEBO) in the treatment of intestinal fibrosis.

Матеріали і методикиMaterials and methods

Експерименти іп мімоIP mimo experiments

У дослідженні використовували в цілому 60 мишей С57ВІ /6 дикого типу, придбаних у фірмиA total of 60 C57VI/6 wild-type mice purchased from the company were used in the study

Уапмієг (Ге Сепеві-5І-ІзІе, Егапсе). Усіх мишей утримували на спеціальному кормі, вільному від патогенів, Інституту Пастера в Ліллі (Франція). Експерименти над тваринами проводили відповідно до урядових директив Мо 68/609/СЕЕ.Uapmieg (Ge Sepevi-5I-IzIe, Egapse). All mice were maintained on special pathogen-free chow from the Institut Pasteur in Lille, France. Experiments on animals were carried out in accordance with government directives Mo 68/609/CEE.

Провокування хронічного колітуProvocation of chronic colitis

Хронічний коліт і фіброз у мишей викликали шляхом перорального введення 2,5 95 (маса/об'єм) 055 у питній воді протягом трьох циклів (5 днів 055, 7 днів вода). Щодня стежили за споживанням їжі і рідини тваринами, і зважували їх на початку дослідження і потім регулярно кожні три дні.Chronic colitis and fibrosis were induced in mice by oral administration of 2.5 95 (w/v) 055 in drinking water for three cycles (5 days 055, 7 days water). Animals' food and fluid intake was monitored daily, and they were weighed at the beginning of the study and regularly every three days thereafter.

План експериментуExperiment plan

Мишей випадковим чином ділили на дві групи: і. групу, що одержувала О55, і ії. групу, що одержувала О555-0Е0О. Кожна група складалася з 25 мишей і результати цих груп порівнювалиMice were randomly divided into two groups: i. the group that received O55, and ii. the group receiving O555-0E0O. Each group consisted of 25 mice and the results of these groups were compared

Зо з результатами для 10 контрольних тварин, які одержували тільки воду. СЕО (30 мг/кг/імиша) розчиняли в розчині, що містить 0,5 95 натрієвої солі карбоксиметилцелюлози (СМС; мол. маса: 90 000 Дальтон; 5ідта Аїагістп) ії 1 95 Тмееп 80, і щодня вводили за допомогою примусового годування через рот (100 мкл/миша). ЗЕО вводили на початку другого циклу.Zo with results for 10 control animals that received only water. CEO (30 mg/kg/mouse) was dissolved in a solution containing 0.5 95 carboxymethylcellulose sodium salt (CMS; mol. mass: 90,000 Daltons; 5% Aiagustp) and 1 95 Tmeep 80, and was administered daily by force-feeding through mouth (100 μl/mouse). ZEO was introduced at the beginning of the second cycle.

Оцінка перебігу колітуEvaluation of the course of colitis

Здійснювали щоденне спостереження за тваринами, визначаючи споживання рідини, зміну маси і виявляючи ознаки коліту, зокрема утрату маси, діарею, кровотечу з прямої кишки і випадання прямої кишки, а також симптоми системного запалення, наприклад, пілоерекцію, в'ялість і утворення навколоочноямкових ексудатів.Animals were monitored daily for fluid intake, weight change, and signs of colitis, including weight loss, diarrhea, rectal bleeding, and rectal prolapse, as well as symptoms of systemic inflammation, such as piloerection, lethargy, and periorbital exudates.

Відбір і приготування препаратівSelection and preparation of drugs

На завершення експерименту, через сім днів після останнього циклу введення 055, тварин усіх груп умертвляли зміщенням шийних хребців під глибокою анестезією СО» і здійснювали розкриття черевної порожнини. Знаходили пряму кишку і швидко висікали її. Визначали сумарну довжину ободової і прямої кишки і вимірювали масу дистального відрізка ободової і прямої кишки довжиною 8 см.At the end of the experiment, seven days after the last cycle of 055 administration, animals of all groups were killed by displacement of the cervical vertebrae under deep CO anesthesia and the abdominal cavity was opened. They found the rectum and quickly cut it out. The total length of the colon and rectum was determined, and the mass of the distal segment of the colon and rectum, 8 cm long, was measured.

Дослідження макроскопічних і мікроскопічних уражень ободової кишкиStudy of macroscopic and microscopic lesions of the colon

Макроскопічні ураження ободової кишки, включаючи дилатацію (розширення), стовщення і стеноз, оцінювалися незалежними спостерігачами, які не мали інформації про препарати, уведені мишам. Зразки тканин з ободової кишки висікали, негайно заморожували або фіксували у свіжоприготовленому 4 95 розчині формальдегіду (БА) у РВ5 протягом З годин при кімнатній температурі і потім заливали парафіном за стандартною методикою. Залиті парафіном тканини, розділені на поперечні зрізи товщиною З мкм, піддавали забарвленню гематоксиліном/еозином для оцінки ступеня запалення і здійснювали забарвлення трихромом за Масоном для більш точної оцінки наявності сполучної тканини і фіброзу. Потім забарвленні зрізи спостерігалися двома патоморфологами, не обізнаними про їх походження, з використанням світлового мікроскопа ОіЇутри5 ВХ51 (ОІутривз, Оріїса! Со. Ца., ТоКуо, дарап), що здійснювали гістологічну оцінку в балах за наступною шкалою: і. наявність виразок (О-відсутність, 1-невеликі виразки, 2 великі виразки); ії. ступінь запалення (0-відсутність, 1-невелике, 2-помірне і З-важке); ії. глибина ураження (О-відсутність уражень, 1-ураження поширюються в підслизувату оболонку, 2хураження в м'язовій оболонці і З-ураження в серозній оболонці); ім. ступінь розвитку фіброзу (О-відсутній, ї-легкий, 2-помірний і З-важкий). Ступінь запалення кишечнику оцінювали за густиною і величиною хронічного запального інфільтрату, втратою келихоподібних клітин і стовщенням стінки кишечнику. Загальну суму балів при мікроскопічному дослідженні одержували у вигляді суми балів за окремими позиціями (максимально можлива сума-10).Macroscopic lesions of the colon, including dilatation (enlargement), thickening, and stenosis, were scored by independent observers who had no knowledge of the drugs administered to the mice. Colon tissue samples were excised, immediately frozen, or fixed in freshly prepared 4 95% formaldehyde solution (BA) in PB5 for 3 hours at room temperature and then embedded in paraffin according to standard procedures. Paraffin-embedded tissues, divided into cross-sections with a thickness of 3 μm, were stained with hematoxylin/eosin to assess the degree of inflammation and were stained with Masson's trichrome for a more accurate assessment of the presence of connective tissue and fibrosis. Then, the stained sections were observed by two pathomorphologists, who were unaware of their origin, using a light microscope OiUtry5 VKH51 (OIutrivs, Oriisa! So. Tsa., ToKuo, Darap), who made a histological assessment in points according to the following scale: i. the presence of ulcers (O-absence, 1-small ulcers, 2 large ulcers); her degree of inflammation (0-absence, 1-slight, 2-moderate and 3-severe); her the depth of the lesion (O-absence of lesions, 1-lesions spread into the submucosa, 2-lesions in the muscular membrane and C-lesions in the serous membrane); named after the degree of fibrosis development (O-absent, I-mild, 2-moderate and Z-severe). The degree of intestinal inflammation was assessed by the density and size of the chronic inflammatory infiltrate, loss of goblet cells, and thickening of the intestinal wall. The total amount of points during the microscopic examination was obtained in the form of the sum of points for individual positions (the maximum possible amount is 10).

Фіброз кишечнику оцінювали, як відсутній, легкий або важкий залежно від густини і площі забарвлення трихром-позитивної сполучної тканини і руйнування структури тканини.Intestinal fibrosis was assessed as absent, mild, or severe depending on the density and area of trichrome-positive connective tissue staining and destruction of the tissue structure.

Імуногістохімічні дослідженняImmunohistochemical studies

Зразки тканини ободової кишки, висічені і зафіксовані у свіжому 4 95 розчині формальдегіду (ГА) у РВ5 протягом З годин при кімнатній температурі, дегідратували в декількох порціях очищеного етанолу і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Зрізи товщиноюColon tissue samples, excised and fixed in a fresh 4 95 solution of formaldehyde (HA) in PB5 for 3 hours at room temperature, were dehydrated in several portions of purified ethanol and embedded in paraffin with a low melting point. Cut in thickness

З мкм інкубували в розчині метанолу і З 95 пероксиду водню протягом 45 хвилин.C micron was incubated in a solution of methanol and C 95 hydrogen peroxide for 45 minutes.

Зразки інкубували протягом ночі зі специфічними антитілами проти альфа-актину гладких м'язів (Ї-ЗМА, Абсат), колагену типів І-Ш (Абсат), ТИБ-В1 (Абсат), фактора росту сполучної тканини (СТОР) (Абсат), р5таазЗз і 5тааз (Сеї! Бідпаїйп9д), Зтаа7 (Ітдепех), РРАКУ (СеїїThe samples were incubated overnight with specific antibodies against alpha-smooth muscle actin (Y-ZMA, Absat), collagen types I-Ш (Absat), TIB-B1 (Absat), connective tissue growth factor (STOR) (Absat), r5taazZz and 5taaz (Sei! Bidpaiip9d), Ztaa7 (Itdepeh), RRAKU (Seiyi

Зідпаїїпо). Зразки промивали РВ5 протягом 5 хвилин і інкубували зі стрептавідин-біотин- пероксидази кон'юЮюгованим вторинним антитілом (бако ЗАВ Согрогайоп, код КОб675, Бако-Zidpaiipo). Samples were washed with PB5 for 5 minutes and incubated with streptavidin-biotin-peroxidase conjugated secondary antibody (baco ZAV Sogrogayop, code KOb675, Baco-

Суїотаїйоп, Мііапо). Після одного промивання РВЗ протягом 10 хвилин зрізи інкубували з 3,3- діамінобензидин-тетрагідрохлоридом протягом 1-3 хвилин. Контрастне забарвлювання ядер здійснювали за допомогою гематоксилін еозину. Специфічності імунної реакції домагалися, усуваючи первинні антитіла. На завершення зразки забарвлювали гематоксиліном Майєра і спостерігали з використанням світлового мікроскопа Оіїутри5 ВХ51 (ОІутриз, Оріїса! Со. ЦЕ.,Suiotaiyop, Miiapo). After one washing with RVZ for 10 minutes, the sections were incubated with 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride for 1-3 minutes. Contrast staining of the nuclei was carried out using hematoxylin and eosin. The specificity of the immune response was achieved by eliminating primary antibodies. At the end, the samples were stained with Mayer's hematoxylin and observed using a light microscope Oiyutris VKH51 (Oiyutris, Oriisa! So. CE.,

ТоКуо, дарап).ToKuo, darap).

Зо Вестерн-блотингFrom Western blotting

Відрізали 0,5 см зразки замороженої ободової кишки і механічним шляхом гомогенізували в буфері КІРА, який містить 50 мМ Тті5 НСІ рН 7,6, 150 мМ Масі, 1,5 мм Маосі», 5 мМ ЕОТА, 1 950.5 cm frozen colon samples were cut and mechanically homogenized in KIRA buffer containing 50 mM Tti5 HCI pH 7.6, 150 mM Masi, 1.5 mM Maosi, 5 mM EOTA, 1 95

Тийоп-Х і 10 95 гліцерину з добавкою 100 мМ фториду натрію (Маг), 2 мМ ортованадату натрію (МазуО4), 10 мМ пірофосфату натрію (МаРРі), 1 мМ фенілметансульфону (РМЗБЕ) і класичної суміші інгібіторів протеази, що містить 10 мкг/мл леупептину й апротиніну.Thiyop-X and 10 95 glycerol with the addition of 100 mM sodium fluoride (Mag), 2 mM sodium orthovanadate (MazuO4), 10 mM sodium pyrophosphate (MaPPi), 1 mM phenylmethanesulfone (PMZBE) and a classical mixture of protease inhibitors containing 10 μg/ ml of leupeptin and aprotinin.

З кожного зразка виділяли 30 мг білка за допомогою РАСЕ і розділяли електрофорезом.From each sample, 30 mg of protein was isolated by RACE and separated by electrophoresis.

Мембрани з нітроцелюлози 100 95 чистоти інкубували (відповідно до окремого протоколу для кожного антитіла) з первинними антитілами, спрямованими проти ТОБ-В1, СТОЕ, а-З5МА, колагену-І і ЗАРОН (придбаними в Абсат, Сатьгідде, ОК; 1:1000 протягом 2 год. при кт) і І -13 (придбаного в Апііродіе5 опіїпе; 1:1000 протягом 2 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,195 ТВ5-ї. Потім мембрани промивали 0,195 ТВ5-ї і інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (анти-кролячим і анти-мишачим; 5ЗідтаNitrocellulose 100 95 membranes were incubated (according to a separate protocol for each antibody) with primary antibodies directed against TOB-B1, STOE, α-Z5MA, collagen-I, and ZARON (purchased from Absat, Satgidde, OK; 1:1000 for 2 hours at ct) and I-13 (purchased in Apiirodie5 opiipe; 1:1000 for 2 hours at ct), diluted with 5 95 skimmed milk in 0.195 TB5. Then the membranes were washed with 0.195 TB5 and incubated with secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase (anti-rabbit and anti-mouse; 5Zidta

Аїдгісп; 1:20000 протягом 1 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,1 95 ТВ5-ї.Aidhisp; 1:20000 for 1 hour. at kt), diluted with 5 95 skimmed milk in 0.1 95 TV5.

На завершення здійснювали імунологічний аналіз із хемолюмінісцентним субстратом зирегзідпа! УМевзі Рісо (Тпегто зЗсіепіййс Ріегсе, Егетродедет) відповідно до протоколу виробника. Мембрани реєстрували на ауторадіографічну плівку (Рції Рпоїо Ріїт Со., Би5зеїдогі,At the end, an immunological analysis was carried out with the chemiluminescent substrate ziregzidpa! UMevzi Riso (Tpegto zZsiepijs Riegse, Egetrodedet) according to the manufacturer's protocol. Membranes were recorded on autoradiographic film (Rcii Rpoio Riit So., Bi5zeidogi,

И.5.Маїйопаї! Іпзійшев ої Неанй, Веїйезаа, МО; пир//т5Б.іпто.пін.дом/)/, 1997-2011). Рівні молекул, які цікавлять, у тканинах виражали в одиницях оптичної густини (00) відносно загальної кількості білка, нормалізованого за внутрішнім контролем САРОН, і результати виражали в процентних частках відносно контрольної групи.I.5. Maiyopai! Ipziishev oi Neany, Veijezaa, MO; pyr//t5B.ipto.pin.dom/)/, 1997-2011). Tissue levels of molecules of interest were expressed in optical density (00) units relative to total protein normalized to the SARON internal control, and results were expressed as percentages relative to the control group.

Експерименти іп мімоIP mimo experiments

Клітинні культуриCell cultures

Клітини лінії раку ободової кишки людини НТ-29 (АТОС НТВ-38) і фібробласти ободової кишки людини (АТСС питап СВВ-18 со) вирощували в середовищі Ігла, модифікованомуCells of the human colon cancer line NT-29 (ATOS NTV-38) and human colon fibroblasts (ATSS pitap SVV-18 so) were grown in Igla medium, modified

Дульбеко (ОМЕМ) і альфа-модифікованому середовищі Ігла, відповідно, що включали 100Dulbecco's (OMEM) and Eagle's alpha-modified medium, respectively, which included 100

Од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину з додаванням 10 95 ембріональної сироватки телят (ЕВ5). Клітинні культури утримували у вологій атмосфері, яка складалася з 95 9о повітря і 5 Фо 60 Со», при 3726.Unit/ml of penicillin and 100 μg/ml of streptomycin with the addition of 10 95 embryonic calf serum (EB5). Cell cultures were maintained in a humid atmosphere consisting of 95 9o air and 5 Fo 60 So» at 3726.

Одержання клітин з пригніченою експресією РРАКУProduction of cells with suppressed expression of PRCA

Клітини НТ29 з пригніченою експресією РРАКу одержували з використанням системи рРЗОРЕК.сгеїго (ОіідоЕпдіпе). Прямі і зворотні цільові послідовності, що відповідають нуклеотидам 105-123 МРНК РРАКУу людини (5-А4СССТТСАСТАСТаттТалдс-з3) (5ЕО І МО 11)), клонували в сайти рестрикції ВоПШ/Хпо! вектора реШРЕКгеїго (рКк5), одержуючи генетичну конструкцію 5ПРРАК. Також як негативний контроль одержували плазміду рК5, яка включає послідовність 5-АСасСстаАсаТАСТТССАААТ-3 (5БО 10 МО:12), націлену проти гена люциферази (генетичну конструкцію ЗП ис). Обидві конструкції трансфікували в клітини НТ-29 іHT29 cells with suppressed expression of PRAC were obtained using the pRZOREK.sgeigo system (OiidoEpdipe). Direct and reverse target sequences corresponding to nucleotides 105-123 of the human RRAKU mRNA (5-А4ССССТСАСТАСТАТТалдс-з3) (5EO I MO 11)) were cloned into the restriction sites of VoPSh/Khpo! vector reSHREKgeigo (rKk5), obtaining the genetic construction 5PRRAK. Also, as a negative control, plasmid pK5 was obtained, which includes the sequence 5-АСасСстаАсаТАСТТССАААТ-3 (5BO 10 MO:12), targeted against the luciferase gene (genetic construct ZP is). Both designs were transfected into HT-29 cells and

Сасо-2 з використанням технології Мисіеоїтесіог фірми АтахаВіозубєієет5 відповідно до протоколу виробника. Стійко трансфіковані клони відбирали через 24 години після трансфекції з використанням повного культурального середовища з додаванням пуроміцину (5 мкг/мл).Saso-2 using Misieoitesiog technology of the AtahaViozubeieet5 company in accordance with the manufacturer's protocol. Persistently transfected clones were selected 24 hours after transfection using complete culture medium supplemented with puromycin (5 μg/ml).

Пригнічення експресії РРАКу перевіряли за допомогою кількісної ЕТ-РСК і вестерн-блотингу.Inhibition of PRAK expression was checked using quantitative ET-RSK and western blotting.

Одержані клітинні лінії ЗПРРАК і ЗП ис утримували в повному середовищі з додаванням 2,5 мкг/мл пуроміцину.The obtained cell lines ZPRRAK and ZP ys were maintained in complete medium with the addition of 2.5 μg/ml puromycin.

План експериментуExperiment plan

Появу фібротичного фенотипу викликали шляхом стимулювання пССО-18 і НТ29 дією, відповідно, 1 нг/мл і 10 нг/мл ТОЕ-ВД протягом 4 днів, розчиненого в середовищі, яке не містить сироватки. Під час періоду диференціювання, вводили ї мМ СЕО (195,22 г/мль). Крім того, потенційну залежність від активації РРАКУу досліджували з використанням 5УУ9662, тобто специфічного антагоніста цього рецептора. 109М (3УМ9662 вводили за 4 год. до початку диференціювання, викликаного ТОЕ-Д.The appearance of a fibrotic phenotype was induced by stimulation of pSCO-18 and HT29 with 1 ng/ml and 10 ng/ml TOE-VD, respectively, for 4 days, dissolved in serum-free medium. During the differentiation period, mM SEO (195.22 g/ml) was administered. In addition, the potential dependence on the activation of PRAKUu was investigated using 5UU9662, that is, a specific antagonist of this receptor. 109M (3UM9662 was administered 4 hours before the start of differentiation caused by TOE-D.

Кількісна КТ-РСК (полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією)Quantitative RT-PCR (polymerase chain reaction with reverse transcription)

Усю масу РНК витягали з використанням набору Мисіеозріп ЕМА Кії (Маспегеу-Маадеї, Ноегаї,Total RNA mass was extracted using the Missieozrip EMA Kii kit (Maspegeu-Maadei, Noegai,

Егапсе). Після інактивації РНКази усю масу РНК очищували від слідів геномної ДНК обробкоюEgapse). After RNase inactivation, the entire mass of RNA was purified from traces of genomic DNA by treatment

ДНКазою і промивали у воді, яка не містить РНКази і ЮЕРС. Чистоту РНК визначали за допомогою УФ-спектроскопії на системі Мапоагір у діапазоні 220-350 нм і аналізуючи профіль на біоаналізаторі Адіїепі 2100. Для проведення кількісної реакції КТ-РСК використовували 1 мкг загальної маси РНК і реакцію проводили за допомогою реакційної суміші ПідпСусіегРазієагіDNase and washed in water that does not contain RNase and UERS. The purity of RNA was determined using UV spectroscopy on the Mapoagir system in the range of 220-350 nm and analyzing the profile on the Adiyepi 2100 bioanalyzer. To carry out the quantitative reaction of CT-RSK, 1 μg of the total mass of RNA was used and the reaction was carried out using the reaction mixture PidpSusiegRazieagi

ОМА Мабіег 5ЗУВЕ Сгееп І виробництва Коспе Оіадповіїс5 (Іпаіапароїїє, ІМ) відповідно доOMA Mabieg 5ZUVE Sgeep I produced by Kospe Oiadpoviis5 (Ipaiaparoiie, IM) in accordance with

Зо протоколу виробника.From the manufacturer's protocol.

РезультатиThe results

Експерименти іп мімоIP mimo experiments

Клінічні і макроскопічні дані з хронічного коліту у мишейClinical and macroscopic data on chronic colitis in mice

Тривале пероральне введення О55 викликало втрату маси тіла у всіх мишей, починаючи з останнього дня першого циклу введення О55 (дня 5). На 10 день миші, які одержували О55, продемонстрували нижчу масу тіла порівняно з контрольними мишами, зі значеннями маси тіла відповідно 23,88:20,31 проти 25,2750,35, р«е0,05 (фіг. 11).Long-term oral administration of O55 caused a loss of body weight in all mice, beginning on the last day of the first cycle of O55 administration (day 5). On day 10, O55-treated mice exhibited lower body weight compared to control mice, with body weight values of 23.88:20.31 vs. 25.2750.35, respectively, p<0.05 (Fig. 11).

Діарея в ступені від помірної до важкої спостерігалася в 70 96 мишей, що одержували О55, і 5096 мишей, що одержували СЕЮО, на сьомий день перорального введення 055. У той же період часу, системні симптоми, наприклад, пілоерекція, навколоочноямковий ексудат і/або в'ялість, спостерігалися в 4095 мишей 055 і 3095 ЗЕО мишей. На жодній зі стадій не спостерігалося явної кровотечі з прямої кишки або випадання прямої кишки. Мишей умертвляли на 15 і 30 день відповідно, і робили макроскопічне обстеження ободової кишки, вимірюючи її масу (масу останніх 8 см дистальної частини товстого кишечнику), довжину і визначаючи наявність спайок, звужень, розширень, стовщень, які оцінювали за наступною шкалою: 0 - у випадку відсутності ознаки; 1 - при наявності легкої або помірної виразності ознаки; 2 - при наявності явно вираженої ознаки. Загальний результат макроскопічного обстеження обчислювали як суму балів за окремими позиціями.Moderate-to-severe diarrhea was observed in 70 96 mice treated with 055 and 5096 mice treated with CEUS on the seventh day of oral administration of 055. During the same time period, systemic symptoms such as piloerection, periorbital exudate and/or lethargy, observed in 4095 055 mice and 3095 ZEO mice. No obvious rectal bleeding or rectal prolapse was observed at any of the stages. Mice were killed on the 15th and 30th day, respectively, and a macroscopic examination of the colon was performed, measuring its mass (the mass of the last 8 cm of the distal part of the large intestine), length and determining the presence of adhesions, narrowings, expansions, thickenings, which were evaluated according to the following scale: 0 - in the absence of a sign; 1 - in the presence of mild or moderate expressiveness of the symptom; 2 - in the presence of a clearly expressed sign. The overall result of the macroscopic examination was calculated as the sum of points for individual positions.

Вплив уведення СЕО на перебіг і макроскопічні ознаки О55-індукованого хронічного коліту представлено в таблиці 7, і ці дані показують, що введення ЗЕЮО полегшує макроскопічне ураження при хронічному коліті, викликаному Ю55, і зменшує морфологічні ознаки фіброзу.The effect of CEO administration on the course and macroscopic signs of О55-induced chronic colitis is presented in Table 7, and these data show that the administration of ZEOO alleviates the macroscopic damage in О55-induced chronic colitis and reduces the morphological signs of fibrosis.

Усі макроскопічні ознаки, що спостерігаються при введенні 055, демонстрували значні варіації в обох моделях, що вказує на ефективність 055 при необхідності викликати важке ураження тканин. Усі макроскопічні ознаки полегшувалися при введенні СЕО, визначаючи статистично значущі розходження суми балів макроскопічних ознак для груп О55 і Ю0555-6Е0.All macroscopic features observed upon administration of 055 showed significant variation in both models, indicating the efficacy of 055 when required to induce severe tissue damage. All macroscopic signs were alleviated with the introduction of SEO, determining statistically significant differences in the sum of the scores of macroscopic signs for the O55 and Yu0555-6E0 groups.

Такі параметри, як маса ободової кишки і співвідношення маси ободової кишки/маса тіла не продемонстрували значущих змін у результаті введення СЕО, тоді як довжина ободової кишки, очевидно, статистично значущо поверталася до нормальних значень. Дійсно, безпосереднє обстеження ободових кишок показало явне скорочення і розширення для більшості зразків, 60 оброблених Ю55, а також ослаблення цих змін у мишей, які одержували СЕО.Parameters such as colon weight and colon weight/body weight ratio did not show significant changes as a result of CEO administration, while colon length apparently returned to normal values in a statistically significant manner. Indeed, direct examination of the colons showed marked shortening and dilation for most samples 60 treated with Yu55, and an attenuation of these changes in mice that received CEO.

Таблиця 7Table 7

Вплив уведення СЕО на перебіг і макроскопічні ознаки хронічного колітуThe influence of CEO administration on the course and macroscopic signs of chronic colitis

Смертністьтгумишей)ї | (:07717Ї..777071010712 0 |1110 кишки/маса тіла макроскопічного обстеженняMortality (:07717Ї..777071010712 0 |1110 intestine/body weight of macroscopic examination

Дані представлені у вигляді середнє значення х стандартна помилка; пр-відсутній; "-р«0,05 відносно НгО; 7р-«0,01 відносно НгО; 7" р-«0,005 відносно НгО; "-р«0,05 відносно О55;Data are presented as mean x standard error; pr-absent; "-p" 0.05 relative to HgO; 7p-"0.01 relative to HgO; 7" p-"0.005 relative to HgO; "-p" 0.05 relative to O55;

УуЕр-«0,01 відносно 055; """р-«0,005 відносно О55UuEr-«0.01 relative to 055; """р-"0.005 relative to O55

Так, наприклад, співвідношення маса/розмір ободової кишки використовували як додатковий індикатор рівня запалення і фіброзу. Статистично значуще збільшення цього співвідношення на 124 95 спостерігалося в мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували тільки звичайну воду, при значеннях вказаного співвідношення 44,9826,31 проти 20,1153,91 (р«0,053. Уведення СЕЮО приводило до статистично значущого зменшення співвідношення маса/розмір ободової кишки порівняно з мишами 055 (38,1357,82 проти 44,98:6,31 (р«0,05)), викликаючи 2695 зменшення цього співвідношення порівняно з профібротичним ефектом 055. Відповідно, СЕЮО здатний послабляти морфологічні ознаки фіброзу, такі, як зменшення довжини і стовщення ободової кишки.So, for example, the mass/size ratio of the colon was used as an additional indicator of the level of inflammation and fibrosis. A statistically significant increase in this ratio by 124 95 was observed in mice that received Yu55 compared to control mice that received only plain water, with the values of this ratio being 44.9826.31 versus 20.1153.91 (p«0.053. to a statistically significant decrease in the colon mass/size ratio compared to 055 mice (38.1357.82 vs. 44.98:6.31 (p«0.05)), causing a 2695 decrease in this ratio compared to the profibrotic effect of 055. Accordingly, SEYUO is able to weaken the morphological signs of fibrosis, such as a decrease in the length and thickening of the colon.

Мікроскопічні дані з хронічного колітуMicroscopic data from chronic colitis

Проводили оцінку ряду гістологічних параметрів, визначаючи інтенсивність клітинного інфільтрату в слизувату оболонку, поширення запалення в шари підслизуватої оболонки, а також наявність уражень епітелію і відкладення колагену. Статистично значуще і сильне запалення спостерігалося в групі мишей, які одержували 055, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду. Гістологічні характеристики для обох моделей включали виразку і дегенерацію слизуватої оболонки, зменшення кількості келихоподібних клітин, значну запальну інфільтрацію клітин і набряк підслизуватої оболонки. Усі ці ознаки були більш вираженими при хронічному коліті, викликаному Ю5З5, і значне стовщення стінки ободової кишки було очевидним. Крім того, хронічна модель продемонструвала явну регенерацію крипт і можливе мимовільне відновлення ступеня запалення при довгостроковому введенні (фіг. 12).A number of histological parameters were evaluated, determining the intensity of cellular infiltrate in the mucous membrane, the spread of inflammation in the layers of the submucosa, as well as the presence of epithelial lesions and collagen deposition. Statistically significant and severe inflammation was observed in the group of mice that received 055 compared to control mice that received plain water. Histological features for both models included mucosal ulceration and degeneration, decreased goblet cells, significant inflammatory cell infiltration, and submucosal edema. All these signs were more pronounced in chronic colitis caused by Y5Z5, and significant thickening of the colon wall was evident. In addition, the chronic model demonstrated clear crypt regeneration and possible spontaneous recovery of the degree of inflammation upon long-term administration (Fig. 12).

Рівень фіброзу визначали із використанням забарвлення трихромом за Масоном, що вибірково виявляє відкладення колагену. Статистично значуще збільшення рівня фіброзу спостерігалося не тільки в ободовій кишці 055 мишей порівняно з контрольними мишами, а також між двома групами, які одержували Ю55 (фіг. 12). Ця обставина, а також виявлення нижчого ступеня запалення, очевидно, узгоджується з припущенням про те, що фіброз починається з запальної реакції, але потім може розвиватися незалежно від неї.The level of fibrosis was determined using Masson's trichrome staining, which selectively detects collagen deposition. A statistically significant increase in the level of fibrosis was observed not only in the colon of 055 mice compared to control mice, but also between the two groups receiving U55 (Fig. 12). This circumstance, as well as the finding of a lower degree of inflammation, is apparently consistent with the assumption that fibrosis begins with an inflammatory response, but can then develop independently of it.

Результати мікроскопічних досліджень виражали у вигляді суми балів і одержані результатиThe results of microscopic studies were expressed in the form of the sum of points and the obtained results

Зо показали, що високий ступінь запалення і рівні фіброзу, викликані 1 і З циклами введення Ю55, статистично значущо знижувалися в результаті щоденного перорального введення СЕЮО (3,36:20,55 для СЕО проти 6,45:0,82 для О55, р«е0,01) (фіг. 12).2 showed that the high degree of inflammation and levels of fibrosis caused by 1 and 3 cycles of U55 administration were statistically significantly reduced as a result of daily oral administration of CEO (3.36:20.55 for CEO vs. 6.45:0.82 for O55, p "e0.01) (Fig. 12).

Визначення рівнів основних маркерів фіброзу в тканинахDetermination of the levels of the main markers of fibrosis in tissues

Рівні основних маркерів фіброзу в тканинах у хронічній моделі О55-індукованого коліту визначали за допомогою імуногістохімічного аналізу і підтверджували імуноблотингом. Так, наприклад, спостерігалося помітне зменшення рівнів колагену І-І (фіг. 1За) ії а-ЗМА (фіг. 1360), тобто специфічних маркерів диференціювання фібробластів, в ободовій кишці мишей, яким здійснювали пероральне введення СЕО, порівняно з мишами, які одержували тільки О55. Рівні експресії колагену І-Ш ї 0-5МА вимірювали в 6 контрольних мишей, 8 мишей 055 і 8 мишей р55ОЕ0О. Як імуногістохімія, так і вестерн-блотинг показали, що рівні всіх основних маркерів фіброзу значуще підвищувалися в групі мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду, і що щоденне введення ЗЕО супроводжувалося зменшенням їхньої експресії. Рівні експресії кожного з білків виражали в процентних частках відносно середнього значення для контрольної групи, і дані для кожного маркера, який цікавить, нормалізували відносно конститутивного білка, наприклад, САРОН. Спостерігалося помітне збільшення експресії колагену І-Ш (18495) у мишей, які одержували 055, порівняно з контрольною групою, а також помірне підвищення експресії для 4-5МА, що дорівнює 25 95.The levels of the main markers of fibrosis in the tissues in the chronic model of O55-induced colitis were determined by immunohistochemical analysis and confirmed by immunoblotting. So, for example, a marked decrease in the levels of collagen I-I (Fig. 13a) and α-ZMA (Fig. 1360), i.e., specific markers of fibroblast differentiation, was observed in the colon of mice that received oral administration of CEO, compared to mice that received only O55. Expression levels of collagen I-Sh and 0-5MA were measured in 6 control mice, 8 055 mice, and 8 p55OE0O mice. Both immunohistochemistry and Western blotting showed that the levels of all major markers of fibrosis were significantly increased in the group of mice that received Yu55 compared to control mice that received plain water, and that daily administration of ZEO was accompanied by a decrease in their expression. Expression levels of each protein were expressed as percentages relative to the mean value for the control group, and data for each marker of interest were normalized relative to a constitutive protein, such as SARON. There was a marked increase in the expression of collagen I-Sh (18495) in mice treated with 055 compared to the control group, as well as a modest increase in expression for 4-5MA equal to 25 95.

Пероральне введення ЗЕЮО у мишей із хронічним колітом, викликаним Ю55, приводило до зменшення рівнів експресії вказаних білків, що було більш значущим у випадку колагенів І1-ПІ (90,75 9У6ж-19,9 95 для СЕЮО проти 284.4 95-63,8 95 для Ю55, р«е0,005).Oral administration of ZEUO in mice with chronic colitis caused by U55 led to a decrease in the expression levels of the specified proteins, which was more significant in the case of collagens I1-PI (90.75 9U6j-19.9 95 for ZEUO vs. 284.4 95-63.8 95 for Yu55, p«e0.005).

СЕО регулює сигнальний шлях ТОЕгр/5Ітаай і його специфічний активатор, а саме - І -13SEO regulates the TOEgr/5Itaai signaling pathway and its specific activator, namely - I -13

Здатність СЕЮО регулювати сигнальний шлях ТОЕр/5таай при різних рівнях спостерігали з використанням імуногістохімічного аналізу, при цьому було продемонстровано помітне зменшення рівнів різних молекул, залучених у цей сигнальний шлях, наприклад, ТОЕ-Р1, зтааЗз, СТОБЕ (дані не показані).The ability of SEJU to regulate the TOEr/5taai signaling pathway at different levels was observed using immunohistochemical analysis, while a marked decrease in the levels of various molecules involved in this signaling pathway, such as TOE-P1, ztaaZz, STOBE, was demonstrated (data not shown).

Спостерігався позитивний результат від застосування СЕО при профілактиці або лікуванні фіброзу кишечнику, що стосується зміни рівнів експресії І -13 (фіг. 14а). І -13 є специфічним активатором сигнального шляху ТОЕрВ/бЗтай і ця обставина підтверджується наступним зниженням рівнів експресії ТОЕ-В1 (фіг. 145) ії СТОР (фіг. 14с). Підвищена експресія 1-13 у мишей, які одержували 055, статистично значущо поверталася у вихідний стан при пероральному введенні СЕО при значеннях 88,88 90ж214,1 95 для ЗЕО проти 189,5 9ож28,71 95 для 055, р«0,01. Наступне зменшення рівнів експресії ТОБ-В1 і СТОР підтверджувалося імуноблотингом з достатньою статистичною значущістю для СТОР (55,57 90ж-17,53 96 для СЕЮО проти 115,1 90-416,88 95 для 055, р«0,05). Рівні експресії виражали в процентних частках оптичної густини відносно контрольної групи і нормалізували відносно САРОН.A positive result was observed from the use of SEO in the prevention or treatment of intestinal fibrosis, regarding the change in the expression levels of I -13 (Fig. 14a). I-13 is a specific activator of the TOErB/bZtai signaling pathway, and this fact is confirmed by the subsequent decrease in the expression levels of TOE-B1 (Fig. 145) and STOR (Fig. 14c). The increased expression of 1-13 in mice that received 055 was statistically significantly returned to the initial state upon oral administration of CEO with values of 88.88 90x214.1 95 for CEO versus 189.5 9x28.71 95 for 055, p<0.01. The subsequent decrease in the expression levels of TOB-B1 and STOR was confirmed by immunoblotting with sufficient statistical significance for STOR (55.57 90х-17.53 96 for SEYUO vs. 115.1 90-416.88 95 for 055, p«0.05). Expression levels were expressed as percentages of optical density relative to the control group and normalized relative to SARON.

Включення за допомогою посиланняInclusion by reference

Вміст кожного з патентних документів і наукових статей, згаданих у тексті даної заявки, повністю включено в заявку у всіх змістах за допомогою посилання.The content of each of the patent documents and scientific articles mentioned in the text of this application is fully incorporated into the application in all its contents by reference.

ЕквівалентиEquivalents

Даний винахід можна втілити в інших конкретних формах, не відступаючи від його суті або основних характеристик. Таким чином, описані вище варіанти здійснення варто вважати у всіх відношеннях ілюстративними, а не такими, що обмежують описаний в заявці винахід. Тому обсяг винаходу обмежений прикладеною формулою винаходу, а не попереднім описом, і мається на увазі, що всі зміни, які за змістом і межами застосовності є еквівалентами формули винаходу, охоплені даним винаходом.The present invention can be embodied in other specific forms without departing from its essence or basic characteristics. Thus, the embodiments described above should be considered illustrative in all respects, and not limiting the invention described in the application. Therefore, the scope of the invention is limited by the appended claims, and not by the preceding description, and it is intended that all changes that are equivalent in content and scope to the claims are covered by this invention.

«ЗО» мОоЄва рнайма їТМутТЕВ «З» Способи нікування БібвВОхуУ «302 РОЗОБЕСТ «аа» вотувиа З ОВеНІУ «141» 2313-02-05 «1505 бу Бая, 544 «їх КО Е ЦЮ «ЇМ» БР БЯеЗОХИ."ZO" moEva rnaima yTMUTTEV "Z" Ways of nicking BibvVOhuU "302 ROZOBEST "aa" votuvya Z OVENIU "141" 2313-02-05 "1505 bu Baya, 544 "their KO E CYU "IM" BR BYAEZOKY.

Я «БУ Ка ца «БО а «ДИ» бакевстй тУузгяїой 3.5 «а 3 «Ха я «вай» ДНК «кож Штучна послідовність хайї» джерено о, я илнилия «сеї» /приміткає едис штучної послідовності: синтетичний праймер" «вав У зашксвваза саке сетаєо 70 «а й «ка КИ «Яїй» ДНК | І «У» штучна послідовна єт» «ах «ееїх дЖаВет | й й й . «еїз /прннітеас сопнє штучнеаї песнздевнасті: єннтетичний праннавВ" «це 4 зв зассісазає ахолеескооз в «ек» З «З1ї» 23 «ії» Штучна люеспідовнітсть «ва» клей» джепана й , Й й «йеЯ» упричіткає опиє штучної послідовності: синуетичний праймер" «Од» й смоаотяоз сазоскясня ес Її «я Я «вій» ДНЕ «МіЗ» штучна песвідевність «й хааі» джерело | ; й т каеїМ епримітиае сис штУчНОЇ послідавнесті: сянтетичний праймер"I "BU Ka tsa "BO a "DY" bakevstj tUuzgyaioi 3.5 "a 3 "Ha i "vai" DNA "kozh Artificial sequence of hayi" source o, I ilnylia "sei" /notes edis of artificial sequence: synthetic primer" "vav U zashksvvaza sake setaeo 70 "a and "ka KI "Yaiy" DNA | And "U" artificial sequential et" "ah "eeih dJaVet | y y y . "eiz /prnniteas sopne artificialeai pnszdevnasty: ennethetic pranavV" "it 4 zv zassisazae aholeeskooz in "ek" Z "Z1i" 23 "ii" Artificial luespidovnitst "va" klei" jepana y , Y and "yeYa" uprykaye opie artificial sequence: synuetic primer" "Od" and smoaotyaoz sazoskyasnya es Her "ya I "viy" DNE "MiZ" artificial identity "and haai" source | ; and t kaeiM eprimitiae sys ARTIFICIAL sequence: synthetic primer"

«а» Я І «ВЕСТ ЕсІЄ зазаттсвао свдасав «о «в» 3 «В3ї2 Кі «і» Штучна песліданніств «ие «йЕі» джерела ! і | Щ «пий» гприміткає опис штучної послідовності: синтетичний праймер" «йо» 5 сабссасасх стссвоссоє в І «М в «Вії ж ЖХ «вїЖ» днк ї г «вії» Штучна послідовність"a" I I "VEST ESIIE zazattsvao svdasav "o "in" 3 "V3i2 Ki "i" Artificial peslidannistv "ie "yEi" sources! and | Щ "piy" gnotes the description of the artificial sequence: synthetic primer" "yo" 5 sabssasasx stsssvossoye in I "M in "Via zh ХХ "viХ" dnk y g "vii" Artificial sequence

БB

«Олі» джервлю | Щі «З» гприніткає опис штучнНОЇ послідовності: сннтетичняй займе «ай» Є ! єзвассаасах дедатаєтеї ссака І «дах 7 «ад ща хаї2е» ДНЕ Е і «еаЇ» Штучна послідовність «иа» «а2і» джерело | | шо «веЯ» л/приміткає опис штучної послідовності: синтетичний прайнеюв" зашнасцюа їсозсоєтяа свй І «ее В «Щі» 53 «ее ДНК ! «Від» йтучна послідовність «Я «Кам ДЖЕОВАЄ Ї Що чех» упримітка Опис штуУчНОЇ послідовності: єкУтетавчний позна «400» асасзоцєст дасссовсєх са 23 «о» З «еїжУ ДНК «Ії» Штучна послідовність «аа «я» джерело й. КЕ ге ша ІЧ ка х ся джедя - чек мк - у я. «гої» гприміткає опис впучнНаї послідовності: свнтетнчмий пракнав" «МКК» З сстдасорос зорсдате"Oli" crane | Even "Z" begins with the description of an artificial sequence: "ai" will take the synthetic form. Yes! ezvassaasah dedataitei ssaka I "dah 7 "ad shcha hai2e" DNE E and "eaY" Artificial sequence "ia" "a2i" source | | What is the description of the artificial sequence: synthetic praineuv" zashnasti izozsoetyaa svy I "ee In "Shchi" 53 "ee DNA ! "From" relevant sequence "I "Kam JEOOVAE I What Czech" note Description of the artificial sequence: ekUtetavny "400" asaszotsest dasssovseh sa 23 "o" Z "eizhU DNA "Ii" Artificial sequence "aa" i" source i. svntetnchmiy praknav" "MKK" Zsstdasoros zorsdate

«Бо» 10 «ак аз «ві» ДНК , й «аї3» Штучна послідвиність «Ва» деерено . І й . . «дай» гпринітках опис штучнаї послідовності: синтетичний пракмев" «ще | | ще зкозазавто зссчоааоза зас Ж «Ех 3 «ом» В «ах ДНК й й «ії» штучна заспідовність ке» «еаї» дЖжевкяє й «Кай» гпринітнах опис штуна послідовність: синтетичний олігонуклевтид «ак» Що щфессттсаєт зстосс 18 «ке 15 «гі1їх і1З «ій» ДНЕ Й й «ІЗ» втУчна послідовність «зо» «пні» джерело ше я н «й2ї» упр ітка»е опис штуна пеоєвідовність: синтетичний еАтгениклеетих «0» й зсестзанта сс рнак їз"Bo" 10 "ak az "vi" DNA, and "ai3" Artificial sequence "Va" deereno. And and. . "give" gprinitkah a description of the artificial sequence: synthetic prakmev" "more | sequence: synthetic oligonucleotide "ak" What is the characteristic of 18 "ke 15 "gi1ih i1z "iy" DNE Y and "IZ" tUtU sequence "zo" "pni" source shey i n "y2y" pretka"e description of the substance identity: synthetic eAtgenykleetih "0" and zsestzanta ss rnak iz

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУFORMULA OF THE INVENTION

1. Спосіб лікування фіброзу, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз, терапевтично ефективної кількості сполуки ОМе (в) он МН, або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера, причому фіброз являє собою фіброз кишечнику або фіброз печінки.1. A method of treating fibrosis, which includes administering to a patient suffering from fibrosis, a therapeutically effective amount of the compound OMe (c) on MH, or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof, and the fibrosis is intestinal fibrosis or liver fibrosis.

2. Спосіб за п. 1, де стереоїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4'-амінофеніл)упропіонову кислоту.2. The method according to claim 1, where the stereoisomer is (5)-2-methoxy-3-(4'-aminophenyl)upropionic acid.

3. Спосіб лікування фіброзу печінки, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз печінки, фармацевтичного препарату, що включає терапевтично ефективну кількість 2-метоксі- 3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера.3. A method of treating liver fibrosis, which includes administering to a patient suffering from liver fibrosis a pharmaceutical preparation comprising a therapeutically effective amount of 2-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof.

4. Спосіб за п. 3, де фармацевтичний препарат вводять перорально.4. The method according to claim 3, where the pharmaceutical preparation is administered orally.

5. Спосіб за п. З або 4, де пацієнт є людиною.5. The method according to item C or 4, where the patient is a person.

6. Спосіб за будь-яким з пп. 3-5, де в пацієнта вже є або був гепатит В або гепатит С.6. The method according to any of claims 3-5, where the patient already has or had hepatitis B or hepatitis C.

7. Спосіб за будь-яким з пп. 3-6, де в пацієнта є цироз.7. The method according to any one of claims 3-6, wherein the patient has cirrhosis.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 3-7, де в пацієнта є також хвороба Крона, запальна хвороба кишечнику або виразковий коліт.8. The method according to any one of claims 3-7, wherein the patient also has Crohn's disease, inflammatory bowel disease or ulcerative colitis.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 3-8, де стереоїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту.9. The method according to any one of claims 3-8, where the stereoisomer is (5)-2-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid.

10. Спосіб лікування фіброзу кишечнику, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз кишечнику, фармацевтичного препарату, що включає терапевтично ефективну кількість 2-метоксі-3-(4"-амінофеніл)упропіонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера.10. A method of treating intestinal fibrosis, which includes administering to a patient suffering from intestinal fibrosis a pharmaceutical preparation that includes a therapeutically effective amount of 2-methoxy-3-(4"-aminophenyl)propionic acid or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof.

11. Спосіб за п. 10, де фармацевтичний препарат вводять перорально.11. The method according to claim 10, where the pharmaceutical preparation is administered orally.

12. Спосіб за п. 10 або 11, де пацієнт є людиною.12. The method according to claim 10 or 11, where the patient is a human.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 10-12, де в пацієнта є також хвороба Крона, запальна хвороба кишечнику або виразковий коліт.13. The method according to any one of claims 10-12, wherein the patient also has Crohn's disease, inflammatory bowel disease or ulcerative colitis.

14. Спосіб за будь-яким з пп. 10-13, де стереоіїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту. її Її ' Н . Ї і -- ші сін я пе ї - : як - І ча 4 ри: Мо: рис "пт Й ла ну ря я а яю АК т Г. х он п а ни нн ря п! те Ід т- Контроль ДМСО їж М зак Контроль СЕ Ше - я - ОСА т КН х -ж- СА УН- 133 З ї зн Ст СОБІ - х 5 х у І х 2 КІ ії 2 5 ї 1» г з ЕЯ КУ час у днях14. The method according to any one of claims 10-13, where the stereoisomer is (5)-2-methoxy-3-(4-aminophenyl)propionic acid. her Her ' N . I i -- shi sin i pe i - : how - I cha 4 ry: Mo: rys "pt Y la nu rya i a yayu AK t G. h on p a ny nn rya p! te Id t- Control of DMSO food M zak Control SE She - i - OSA t KN x -zh- SA UN- 133 Z i zn St SOBI - x 5 x y I x 2 KI ii 2 5 i 1" h z EYA KU time in days

Фіг. 1 І Бали за шкалою Меіачіг (активність І : АО-тАЗ І фіброз РО- Р Ро гннпошітннірнтнвня ст печені пчнтчнтннинниніотнтнтееттенетеснтят нт нт ї Я СОЯ Центральна нена й КО куле ! о Активність |у Я ЦЕ . | 7. Ше / (некрозі /(РІОрОВ. Ко. Зо ДЛеВ запалення) рот ; зн 7 те ня РО Ямброз порталюнолу тракту численні сет дечисленні септи (перегородки) ! ши о | іа в лає вит А Важка АХ ві ща ; й ран й у нити ть чт чт сс сс снпнесжиюююньї є . р що І Цироз міFig. 1 I Points on the Meiachig scale (activity I: AO-tAZ I fibrosis ROR Ro gnnposhitnnirntnvnya st liver pchntchntnninniniotntnteettenetesntyat nt nt i I SOY Central nena and KO kule ! o Activity |u I THIS. | 7. She / (necrosis /( RIOROV. Ko. Zo DLeV inflammation) mouth; zn 7 tenia RO Yambrose of the portal tract of the tract numerous set numerous septa (partitions) ! shi o | ia v laye vit A Heavy AH vy scha; y ran y u nyty t t t ss ss snpneszhiyuyuyunyi there is p that I Cirrhosis mi

Фіг. 2АFig. 2A

Контроль (фіброз відсутній) сей Ко ВЕК ВН ПИШНИМИ КМИН ПО ОО ОО МИХ Кен СЕНИК ПЕН ИМЕНИ КК ПЕК КК КВ НК ХНН ХК ПЕК КЕКВ КЕ КК НК КК КН КК СОПКО КК КН НК ОК ВЕКПИКН НК НК НН НН ДИМ ВК Я МО Я п а М М а Я ПЕК ПЕН я ПО Я ОК СЕП М М КОКО ОО Я ЕК В Я КЕКВ КЕ КК КЕ ЩЕ АК ВХ ОО М а ПЕКИ Ми о ПАК М А и і в ДИВНО ОО ПОКОККНя ПИЕИИИНН Кн КО КО ПЕН ПН ОО ЕК КН ПШИМЕЦИИКК НИКИ ОО ТИНИ М я ЕКС КВ КК КВК КК КК ПЕКИ НК НН КОКО ПЕ ОО ОО Я ПО С ХОККЕНННККе ок М В Я М В ПИМИЕИИМИНИЕ НИВКИ ВКЕ р ія І І ЕІ зе Ку ев т В: сон КЕ ВАННЯ каз БО УНК КУ ДННИКИНННННИВ КИМ В ОО КОМ В Я ХЕПИМШНННН НКИ А -г '''г'гФФФФч ПЕКИ ОО Я В ОО ОКО в о о я РМ оо НН ОО й ПЕ КК Ю ОО У КО Я НО А о я о Я ОО о Я КОКО М М Я СХИДИМИДИМ КИНЕ Кен ОО ООН п а КК НКЮ ОО М М КК ОК Я ОН Я ОО ОВО ОО ОО А ПН М о в і Я ПЕН ПЕКИ ПК КК, НО М М М о ня ОО М о НН о о Я ПИ НН НН Жах ОО ОО и КН я ОО Я ОК Я ПИЛИ о я ПЕКОННМНИКК КК КК КЕ КОМ КНControl (no fibrosis) sei Ko VEK VN PYSHNYMI KMYN PO OO OO MYKH Ken SENYK PEN NAMES KK PEK KK KV NK HNN KK PEK KEKV KE KK NK KK KN KK SOPKO KK KN NK OK VEKPIKN NK NK NN NN DIM VK I MO I p a M M a I PEK PEN i PO I OK SEP M M COKO OO I EK V I KEKV KE KK KE ШЧE AK ВХ OO M a PEKY We o PAK M A i i in DYVNO OO POKOKKNya PIEIIINN Kn KO KO PEN MON OO EK KN PSHIMETCIIKK NIKY OO TYNY M Я ЕКС КВ КК KVK КК КК ПЕКИ НК НН КОКО PE ОО ОО Я PO S HOKKENNNKKe ok M VYAM V PIMIEIIMINIE NIVKY VKE r ia I I EI ze Ku ev t V: son KE VANNYA kaz BO UNK KU DNNIKYNNNNNIV KIM V OO KOM V I HEPIMSHNNNN NKY A -g '''g'gFFFFch PEKY OO I V OO OKO v o o i RM oo NN OO y PE KK Y OO U KO I NO A o i o I OO o I KOKO M M I SHYDYMYDYM KINE Ken OO UN p a KK NKYU OO M M KK OK I ON I OO OVO OO OO A PN M o v i I PEN PEKY PK KK, NO M M M o nya OO M o NN o o I PI NN NN Horror OO OO i KN i OO I OK I SAW o i PEKONNNMNYKK KK KK KE KOM KN

Фіг. 28 пот лок ре га к 4 «ук че й ак УЗ З їх я о. Її рах що ПРОВ і - и г І де я ПІК і і ння, ТПУ Е. -ї ке К їн, Н ПП я ії ПИЙ р; 1 ПИЛА І-ах Н ТУ Ех ї ПЕС - | НЯ К ре ї Ж ха Ох - пу су З - з т -е у т хз г. ік св ще Ж тая сВНяо Кикі нені ш Кв х ща «з З що що й Кк з си Га Б шк: - й за рн: у їх й Тож ее : теж: ЗОБУ й Ох ПИ Але й г -к 5 МЛС :Fig. 28 pot lok reg ha k 4 "ukche and ak UZ Z ih i o. Her rakh that PROV i - i g I de i PIK i i nia, TPU E. -i ke Kyn, N PP i ii PIY r; 1 PILA I-ah N TU Eh i PES - | NYA Krei Zhha Okh - pusu Z - z t -e u t khz g. ik sve zh taya sVNyao Kiki neni sh Kv x shcha "z Z ch ch y Kk z sy Ha B shk: - y za rn : have them and Tozh ee : too: ZOBU and Oh PI But also g -k 5 MLS :

а. -ї їх ПИТАЄ, ще с ЗЛІ ї Вовщо Ю: век З АЛ КИ: х тва «І а СМ, В о; у - з ; я ен соя ССлУУн сСМ-оЕВ ная щ Ген Гр й «5МА 1 с зо яю ов їй в з а в ; : к Ба З я рт надій щ зі пк заня в в з 2 ха х. Е- щ Е г Ї шт о тю З - т а т-6О- ; - й с ОР сою сов лим сині Колаген- 1 зво. вео і М рон ДОМ ЩІ 1-6 й - 43 на з «зві щ ко В НИЙ 128 1 р: о й но З т я БЕ » я ч : во з й ща в: ЩО Е чи а мул | зн й р: я - С і. Н се ща се тес са ВУВ. «ев ій їхand. He asks them, even with ZLI and Vovscho Yu: age Z AL KY: kh tva "I a SM, V o; in - with; I am soya SSlUUn sSM-oEV naya sh Gen Gr y "5MA 1 s zo yayu ov her in z a in ; : k Ba Z i rt nadij sh zi pk zanya v v z 2 ha x. E- sh E g Y sh o tyu Z - t a t-6O- ; - and with OR soy sauce, blue collagen - 1 volume. veo i Mron DOM SCHI 1-6 y - 43 na z "zwish ko V NY 128 1 r: o y no Z t ia BE " i h : vo z y scha v: SCHO E chia a mul | zn and r: I - C and. N se shcha se tes sa VUV. "Ev iy them

Фіг. 4 25 мишей Вс ВО ЗВ о 055 ВЕН. еВ 2 миней О55 Ес т вм ан в В сх маш не НО ВВС Лв 7 двів З днів 7 їнів З днів 7 днів ЕвтавазіяFig. 4 25 mice Sun VO ZV at 055 VEN. eV 2 minei O55 Est vm an v V sh mash ne NO VVS Lv 7 dviv Z days 7 yins Z days 7 days Eutavazia

Фіг. 5Fig. 5

Співвідношення маса ободової кишки/довжина ободової кишки Ж й щої ях "пвкнва я УК ЗХ з що щ ж с п їх їі щщї зі мний м бмншей, | же но хе пове . херефдоThe ratio of the mass of the colon/the length of the colon.

Фіг. бА Бо ок реє 5 СЕ З о що ве хе» ОБО с . о т ЗЕ . о : з ОК ПИШЕFig. bA Bo ok reye 5 SE Z o what ve he" OBO s . o t ZE . o : with OK WRITE

Фіг. Б пен че диу и, но: о сш и пхуи 17 АМту па. и АХ кое ав ВЕНИ тане а жут я ПІВ Орт Ма ден тити Бо и ВИНИ ЕК ЕК Ка ДК пт пт, і: 55. сснненяннннння - . сома я ул зує ши С оххсю. | я Сума балів, шо характеризу щ- хіти я ДНК и Вимк -4 Би ор Тит ЕН дей в, Ш-ї запапення шен Маре Іс Ко МЕ М паосоовоюсе - ВЕ ракет ЛЕМ НИ Шов х КАК нс соя КВЕя ЗИМ, пол ув я КПІ Мейя Ти ЗЕ - п БО 5. нок пут ян пока ВЕН Ї кру Й ЗХ ой Хе лиш ТЕЖ КА Н Й БЕ шли. «реавАе ста ние ей ож В ад ши ИН ек НО нок о ШІ ин як ей і «ВИК. вро тва Ве ПЕДА ве Кан Яд лек ек м АН вн в ИЙ Я ва- ше жу це "Ван с НЯ ант х ------- 1. ТЕ ть я ВО СЕК СІ пек І | й що ПК Кожна: ки: ВБИВ 224 і 23 вний Пд фр аЕ и олені, фер л я А и ЯНА в Ех пе я | 22 міні Пежо АК Кент Ор Ів ВШ ТВЕН со КК пр ве щен н: в А ма вк ес В шко СК і КЕ Авия с Й був ан я ОВ кова с ДЕ ібн дини митне що Ба деко коро юна НИЙ ово 1---- ' й те реве ше ев ох сфе я КІ ке ж свя сиди на жо киев А Я сво ЕН нн ВЕЖ ена пане. ся Що Кк ст о о Й в Во ся Вкж М | я р0,05 рент пяти ос ВС еВи тнє. и вх сег Щ м их их, Бе Псел кава а я шо тя по я іх КО УНК ОК еаее 4 по ве Ех о рони До Я тр ІА МН НЮ Ка ек ОІВ Б Бр Зоя А в ВОК ни ншя Но Ко луч и ои ре- й ання й В Вуж ЗЕ сн в ОЛІЇ оди й З СДН Б о у М НЕ НЯ Пелех ОК ее ВИН ДЕли ой ду о ННЯ а ШНМ АТ ке я ВИ пло, й НН оку: УК шир . зу; І екон В с уж ЗІ : іча зизує І оди пк вва сей З Сума балів, що ханактеризу п копит ВВ по ерчлс нон у пен Ффюроз Е ск нд танк дея в ду пе ве й З ж.Fig. B pen che diu i, no: o ssh i phui 17 AMtu pa. i AH koe av VENY tane a zhut i PIV Ort Ma den titi Because i VINY EK EK Ka DK pt pt, i: 55. ssnnenyannnnnnnia - . soma i ul zue shi S ohhsyu. | The sum of points that characterizes the characteristics of DNA and Off -4 Bi or Tit EN dey v, Sh y zapapenny shen Mare Is Co ME M paosoovuse - VE rocket LEM NI Shov x KAK ns soy KVEya ZIM, half uv i KPI Meya Ti ZE - p BO 5. nok put yan poka VEN Y kru Y ZH oi He lish TESH KA N Y BE sli. "reavAe sta nie ey oz W ad shi YN ek NO nok o SHI yn as ey and "VYK. vro tva Ve PEDA ve Kan Yad lek ek m AN vn v IY I your zhu ce "Van s NYA ant h ------- 1. TE t i VO SEX SI pek I | y what PC Each: ki : KILLED 224 and 23 vny Pd fr aE i eleni, fer l ia A i YANA in Ekhpe i | 22 mini Peugeot AK Kent Or Iv VSH TWEN so KK prve shchen n: in A ma vk es Vshko SK i KE Aviya s Y was an I OV kova s DE ibn dyn customs that Ba deko koro younga NIY ovo 1---- ' y te reve she ev oh sfe I KI ke svya sit on zho kiev A I svo EN nn VEZH ena sir. sya What Kk st o o Y v Vo sia Vkzh M | i r0.05 rent pyati os ВС eVy tne. і вх seg Sh m ih ih, Be Psel kava a i sho tia po i ih KO UNK OK eaee 4 po ve Eh o rony Do Ya tr IA MN NYU Ka ek OIV B Br Zoya A in VOK ny nshya No Ko luch i oi re- y anna i V Uzh ZE sn in OILI odi i Z SDN B o u M NE NYA Peleh OK ee VIN DELY oi du o NNYA a ShNM AT ke I YOU plo, and NN oku: UK shir . zu; I econ V s uz zhi ZI : icha zizue I odi pk vva sey Z The sum of points that chanacterize p hooves VV po erchls non u pen Ffuroz Esknd tank deya v dupe ve and Z zh.

ВОК М Кей ВИК нн ДЖ о Й " ш- дм ел п ВК КК ВИ У с увів не Ом о КК МНЕ ЖЕ ЖИХ СМ МР своє ЯН ут Й ОО Ве ув ех се тай ше В Ж 4 є шо ву ев у шо Зо Ве ин пен щі ОВСЖОХ Ох ке З и т ж. : т У НН ом; мк ку омани Ко селян Кк ою ІекК у З анае п м ПІ МО ок и п ее. во п ШК ни ПЕ ДК М Ти вас ск пани Зк с Ох С кни Как «5 еся З яні пд на в 5 ЕВ пока с. ко В око ХО МО я я шо я ж во Шк х ит В неви ев о їх По вдо : Ул мимо. п ВО ВИХ КК т ВАК: 3 Не сь «ТКУ МА Й м рат ен сни востей С в В де. сосовія Бе дурно КеЖУ у НК КК УМ Кк МК я ДОЛЕ КТ ДЕ МЕ ех ВК. с Еней дну пт п но ОВ п ЕЕ Я и КОНЯ в пен, ; т нн я а кох СИХ ов В ке рууеЕю Бо лови ГК ПО я их пис на и Ах ОН УнНННЯ Кох З ах НЄ лою Де НК и пити шо а ЕК ера пн понят нн нн ПОН я же КО о ВН пляжі пня У иня сш З пою зви ІК п М Бах як и пет аекБтя ек що ах й и в Не МЕ не КВН НН ку ий Уа вин Ок о Б шк от и У ОК Кк Ве ся З ИШе Аа ос осо МН ТТ ра п ДЕ Хоктроїь Б ма -щА ше . сотні ококейн ки в Калагоні Щ пяти з і калкднь ія Се; ха ит ї СОБСАСЕМ АНІ суша й Що Й ; схіж ТИЖ ек до, Ки Кф ки мот, тя З тАссуда явних км жів Я ет КНАИ НК ПОН СЕЮОЯ незвованвзиьнйнинк слесн ме зів 5 Ж Хек - Колаген ї Ку да в ви Ки орга бе еВ ВЕ в їк нан х ж А сей с: ЗИ нин п нев а де ЖК ВО пт Я ШЕ сн ко В В : хо ве ек НИЙ Мо а Вс. кана М б Бен Ме КУ не А ек иа фе и З : З мех Мам ев. ДМА Ву «їх В дві Уа Кр о щ ВІ у ВО в. Ан МК ся у Ну ХУ сне ВЕ КН Ж : сит ж Ки и ки и по ут» Н Моне У Ме т и зві лей Ов Кия який я и. 2 і СЕК ші ко і нн со НЕ е - ЕЕ ЕХ се ВК. пеки Се Ж 4 я що Кк зе ьо Кохтрадь п Ен жо т і т чо в к. ЗОСЕ сс зверне киев нмо. СТО Сто в на Н н ми Ше я гі: п я в ут ре їй пон Дт ВЛ ВЕ ВН с о рр інн півні рнерея А БАРБІ: п ее я и Его т п оку о кВ ИЙ стає о ей шу с ЕВ вс роз . ооо МВ жк шлю дя що пиши и паху ен сих Хомко Ей Жодучн Ко Кк и М у ще КК: пд Мая кін як ті - ле ви в З; ту о ТВ ов -к " БО не і С шк шк ік де зіжько й те ке ох А й КЗ є ! і МУден К о а вет жи, ЗЛО - с жк о ТЕ ше У я кв йо : вся о в я ок КА й В ! и Зак и ей Ве в у т Ж д що ен Иу ж пав фа Ве ефе е" Вени ще не а КЕ у Кн му я а п, вв чув | пен Я в В нн й БЕ» ; ря а НН Ко дві Б «Е є с ж гуни а о ; я й Р І й саддеттндкн ; Й славне з одежерсю Ка В У ; 2/3 у ее зндфня нь ЗИ Аа ей о 5 5 я ; крива в НАВ С ЗОН споюхждк Ж дВовиеєюта В бе но БО ше Шк і я ПЕ ших ; ло ис С АК Х М жк а В Ь Ок сова МУ по ее ПК хо щх я кров Щі» Ки 4 ук АК ее я шо А о я В сей Ж я ма я да око: щй Як и є сла ВИ ЕН КАН тай: В нс зма А А в. шо и, Ех шк я ще а ХЕ ОКУ ее но, п, зх ках ТО вх З й хх ви пе а по шн в в. ра ИН і Яни а ке п, во З ня ЕН ша поп вела ве ее в Я ну всех Ох Й ПЕК пох шин м я КИ й ВО ля Ов Й Пд тн у нн Е ян й ше в о в я Кк а ож епори о у ях еле ВН поши Кн ПАКИ В У ТНО ие Ко о ЛИН ЗА Ве ож о СПЕ МЕНЯ ПаЕККт пон й Коса в МАХ пе ри он а Ж А ке я: ви ке ай св щі С а в. КМ, ше. нн ж шо ки НКТ и о ій ЗМО т Ел поуная оТшЕ тн Бена КО І г. . Сх я ноя осо а шия п я І шо же кс КО :VOK M Kay VYK nn J o Y " sh- dm el p VK KK YOU U s suviv ne Om o KK MNE ZHE ZHIH SM MR own YAN ut Y OO Ve uv eh se tai she W Z 4 is sho vu ev u sho Zo Ve in pen schi OVSZHOH Oh ke Z y t.: t U NN om; mk ku omany Ko selyan Kk oyu IekK u Z anae p m PI MO ok i p ee. vo p ShK ny PE DK M You sk pany Zk s Oh S kny Kak «5 esya Z yani pd na in 5 EV poka s. ko In eye HO MO i i sho i zh in Shk h hit In nevy ev o ih Po wdo: Ul mimo. p VO VYH KK t VAK: 3 Nes "TKU MA Y mrat en dreams S v V de. sosoviya Be stupid KeZHU u NK KK UM Kk MK i DOLE KT DE ME eh VK. s Enei dnu pt p no OV p EE I i KONYA v pen, ; t nn I a koh SYH ov V keruEyu Bo lovy GK PO i ih pis na i Ah ON UnNNNYA Koh Z ah NE loyu De NK i drink sho a EK era pn poat nn nn PON i same KO o VN beaches pnia U inya ssh With the use of IC p M Bach as i pet aekBtya ek that ah y y in Ne ME ne KVN NN ku yy Ua vin Ok o B sh ot i U OK Kk Ve sya Z ISHe Aa os oso MN TT ra p DE Hoktroi' B ma -shA she .hundreds of windows in Kalagona Sh pyati z and kalkdn iya Se; ha it yi SOBSASSEM ANI susha y Sho Y ; schizh TIZH ek do, Ky Kf ki mot, tia Z tAssuda obvious km of lives I et KNAI NK PON SEYUOYA nezvovanvzyinynink slesn me ziv 5 Z Hek - Collagen y Ku da v vy Ky orga be eV VE v ik nan x zh A sei s: ZY nin p nev a de ZHK VO pt I SHE sn ko V V : ho ve ek NY Mo a Vs. kana M b Ben Me KU ne A ek ia fe i Z : Z meh Mam ev. DMA Wu "their V two Ua Kr o sh VI in VO in. An MK sia u Nu HU sne VE KN Zh: sit z Ki i ki i po ut» N Mone U Me t i zvi ley Ov Kiya which i i. 2 and SEC shi ko i nn so NE e - EE EH se VC. Peky Se Zh 4 I that Kk ze yo Kohtrad p En zho t i t cho in k. ZOSE ss will turn to Kyiv nmo. STO Sto w na N n we She i gi: p i u tu er u mon Dt VL VE VN s o rr inn pni rnerea A BARBIE: p ee i i Ego t p oku o kVYY becomes o ey shu s EV all roz . ooo MV zhk send what you write and smell en sih Homko Hey Zhoduchn Ko Kk and M u still KK: pd Maya kin how are you in Z; tu o TV ov -k " BO not and S shk shk ik de zizhko and te ke oh A and KZ is ! and MUden K o a vetzhi, ZLO - s zhk o TE she U i kv yo: all o v i ok KA and V ! and Zak and ey Ve v u t Zh d that he Iu zh pav fa Ve efe e" Veny not yet a KE u Kn mu i a p, vv heard | pen I in V nn and BE" ; rya a NN Ko dvi B "E is s same guna a o ; I and R I and saddettndkn ; And glorious with clothing Ka V U ; 2/3 in ee zndfnya n ZY Aa ey o 5 5 i ; the curve in NAV S ZON spoyuhzhdk Zh dVovyeyuta V be no BO she Shk and I PE shih; lo ys S AK H M zhk a V b Ok sova MU po ee PK ho shkhh i blood Shchi» Ky 4 uk AK ee i sho A o i V sei Z hya ma i da eye: shchy How i is sla VI EN KANT tai : V ns zma A A v. sho y, Eh shk I still a ХЕ OKU ee no, p, zhh kah TO vh Z y xx vy pe a po shn v v v. ra YN and Yany a ke p, in Z nya EN sha pop ve ee in I nu veskh Oh Y PEK poh shin m ia KY y VO la Ov Y Pd tn u nn E yan y she v o vy i Kk a oj epory o uyah ele VN poshi Kn PAKI V U TNO ie Ko o LYN ZA Ve ozh o SPE MENYA PaEKKt pon y Kosa in MAH pery on a Z A ke i: vy ke ay sv shchi S a v. KM, she. nn zh sho ky KNT i o ii ZMO t El pounaya oTshE tn Bena KO I g. . Sh i noya oso a shiya p i I sho same ks KO:

Контроль ДІ ОБЕ ЦО БЕ альфа-ЗМА о вісі іі кий ОКО В АНЯ з ооо нев кі ор оно ЛВ ОМА тн о поко о НК си сни м ижечетих . пждікиня Щк - нт Ме сх МОН в Пасти ні Б пе в п НК Кк ик В в М В и: са НИ ВК ка тк ПЕК М щу 5 и т ОВК ОЯ 1 й А ке о Я - а о. ее еВ ша ШАРОМ ект ВВА НН У яь а СИ и НН Й Шо ие пт са ан. ах м с о а в. ж ва ма в Ве е п НО пл Ка ям по я ша - й КК о и Я В В НН деп В ВК і ХМ и в Б в ОО ус жи 6, Ши вия с ИН в Й - нтежнх п они А Ма ев ми Я жо п и ак ВО В ов КУ гхЗ Пн и Б ЛО є аа до шт ОМ в М с в и ЕЯ сеее АК Зо кеди и Мн нн в ННЯ ве, Як Коня Вк и В о нн Ко ки ви Се ОО о У В дО зв пе вн па ОК, що в КЕ КК КЕ. Кн а о КАН с ша пок і я ще Контролі Ток п Ж ЕВ тарг-бета 1 пиши нн ОО АН ЕН и М таг-бета З С Ж: и золот мене «я сснсораетм з клік мдквкдааь о А Енн не Ме о ВВ шо Б я о о б ов а й а, ще я виш З ГО Яка ке ВЕН рок у я и а М ух - они нн У САМ НИКА сн ово о ЕВ» В и Ж м Й 5 і кас Ж з кох Ж мл я Бо ее У ВО 7 Соя км В САРОН Мо о ПО ой вок КІ В дин в ак и дише ан зак 5 повин МЕЕЕУКАТ В ек Й ек С в в и іх ак ва з ее о и так ща ЕК п в о ско а ТК С ах УОИе зліва. и и и их. Я я и 5. яко им и я Ко в. о. ої пня и Ко ох Й Вк с а соні я НН БО ТІ ОК ан в і. ек шо. ди в НК и в и я М сих косий й ха Ох о У 8 1 Ме оЯ Адм Вк ши М о и М ВК Я Є Н Ван с В ж ри и м В НІК ис Бех) з дн Жив ему се и ОК а В и НЯ ТОЖ: и ев М з и ши і ий Е : о КЕ Б ух Пеня ВХ о ня Ко З Ко Я п Он АЖ Ж Й КК й ВК ня и ен в а дн : нн В ЕХ шк но я и МО Й г КА У й а осв а : ск :ЗНВВВа я й якControl DI OBE TSO BE alpha-ZMA o axis ii ki OKO V ANIA z ooo nev ki or ono LV OMA tn o poko o NK sy m izhechetyh . pzhdikinya Shk - nt Me msh MON v Paste ni B pe v p NK Kk ik V v M V y: sa NY VK ka tk PEK M schu 5 i t OVK OYA 1 y A ke o Ya - a o. ee eV sha SHAROM ect VVA NN U ya a SI i NN Y Sho ie pt sa an. ah m s o a v. zh wa ma v Ve e p NO pl Ka yam po ya sha - y KK o i Ya V V NN dep V VK i HM i v B v OO uszhi 6, Shivya s IN v Y - ntezhnkh p ony A Maev we I zho p i ak VO V ov KU ghZ Pn i BLO e aa do sht OM in M s v i EYA seee AK Zo when i Mn nn in NNYA ve, How Konya Vk i V o nn Ko ky you Se OO o In V dO zv p vn pa OK, that in KE KK KE. Kn a o KAN s sha pok and I still Controls Tok p Zh EV targ-beta 1 write nn OO AN EN and M tag-beta Z S Zh: and gold me "I ssnsoraetm z klik mdkvkdaa' o A Ann ne Me o VV sho B ia o o ob ova y a y a, I still vysh Z GO What ke VEN rock y y y a M ukhony nn U SAM NIKA s novo o EV" V y Zh m Y 5 and kas Z z koh Z ml i Bo ee U VO 7 Soya km V SARON Mo o PO oi wok KI V din v ak i dishe an zak 5 povyn MEEEUKAT V ek J ek S v y ih aqua z ee o i tak scha EK p w o sko a TK S ah UOIe on the left. and and and them. I am and 5. as im and I Ko v. at. oi stump and Ko oh Y Vks a soni i NN BO TI OK an v i. what? di v NK i v i i M sih kosyy y ha Okh o U 8 1 Me oYA Adm Vkshi M o i M VK I Y E N Van s Vzh ry i m V NIK is Beh) z dn Zhyv emu se i OK a V y NYA TOZ: i ev M zy shi i yy E : o KE Buh Penya VH o nya Ko Z Ko I p On AZH J Y KK i VK nya i en v a dn : nn V EH shk no i i MO Y g KA U y a osv a : sk :ZNVVVa i and how

Фіг. ЗЕ КСВ С. в г Пн ки В я : досві НА СИХ КВ жк ЯЯ пут вої З хх ШОМУ опт ВАН СО С КК. нн каф ОКУ нев Ор вв р о нов НН в В А Ка З хх. те у ВК ЕЕ Ге ще КК Ен м ВО і, Н ее й ють - Та Де ж ск, ді їх ее як фусеесеєтеттесттнннннинннннннннннннннняї ох. " Я кю сникжнікжря : а Н КО Е й РЕЯ ! ше це й «Фа їхFig. ZE KSV S. v g Pn ky V i : dosvi NA SIKH KV zhk YAYA put voi Z xx SHOMU opt VAN SO S KK. nn kaf OKU nev Or vv r o nov NN v VA Ka Z xx. that in VK EE Ge even KK En m VO i, N ee y yut - Ta De zh sk, di ih ee as fuseeseetettesttnnnnninnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn " I kyu snikzhnikzhrya: and N KO E and REYA! what is this and "Fa them

4. иа по ш шо ХЕ 5» межи ун вк Бо в й А дребосок я КАВИ ай с що і зо Ах Шк а пет . ЕК ех НЯ пе БЕо Ех як НН я4. ia po sh sho ХЕ 5» limits un vk Bo v y A trifle I KAVI ay s what i zo Ah Shk a pet . EK eh NYA pe BEo Eh how NN I am

5. ХМ й а 10 ро во Дні5. HM and at 10 o'clock in the day

Фіг. 11 Тривале введення - 8 ж Ж» є Її. 44 в 2 ; с но тт ке А : я БОЯР еджшоя са с 7 й КУ ий «ее дк «Fig. 11 Long introduction - 8 same Ж» is Her. 44 in 2; s no tt ke A : I BOYAR ezhshoya sa s 7 y KU iy "ee dk "

Фіг. 12Fig. 12

(з) тт ромен, ! ЯМА 00 в ово п НН ОВ я зиефа ем: ; шо ун о» нн нн КМ иа ях У ДЕК ее В ет і(from) tt romaine, ! YAMA 00 in ovo p NN OV i ziefa em: ; sho un o» nn nn KM ia yah U DEC ee V et i

М о. ГЕ. м - і ! ї ОКА СУ ИМЯ рОщо Ук вн ДКЗ, маку Н Н дня тя ДН ха и в А Я ех ї Н ер КК не ве о Ки Кк. вежу за ІЗ М ке Ов Б Не З ШОВ, А ВХ й |: ШЕ 00 вн м ШЕ 5 Б г і Титов ос КВ ОА т 1 ОО і 3 ВО в МАН УК и є і я а Н І Бе ОА пива шо; ув Б ; і шою ОО Б и. І меня МОМ Е і АТ ОВ в й Кк с Й МЕ ОХ ІЗ і п я ! а щи. БУ Я ї і КАК А - плллодлчян М кчн ННЕННВИЙ..... ЯН ГУ х - й ; ї Яд д дк КЕ. Ей В « Я ! с, в ІЗ ЛЕ їх ІЗ пі. оеикхикчжичижіючх юю пон А ХХ ллотіт не тнене ене Ке еееечеекетечеене іє ' Колаген КЕНЕ оса я ! Ат кА ДАЖКаК Ц кими мо ик ВЖЕ дк шо щк Щ ТИ 7 І НАЕК у р п у и вк В, о клтути в дао Спмюв й ; ще ЯК У ос ково п ке я Кевиец ШЕ у Бе В В о кавнеаки с ШИ Н ВХ вен ов, ВІ Ме и я З ОМ НЕ САРІ ше она: В баню з і Та КО о жк АТ фен ння яд і а с М ВЕ МУ КОР Их Как а ЖИ р . ! ПО а Кв а 2 і УВК и а в З : ; Я і по и и о ШЕ но і і ШЕ а А 8 Дек ооо кН А дя Ь и со иа НК к пи ве в ек сх : ЕК Кк си ДЯ оси с ОХ У. З КВК Е кі я ВУ СК Я УМ дкхжєюсн ЩОКУ пт ЕЕ и о в кн дк им СЯ ок и о о ся Я Вк ЯКО щи оо БО : ЯЛЕОЯ тя МЕЖ ВК нн ВИШКИ. і Е як 4 Я З, хх я го ху е Е . яM o. GE. m - and ! y OKA SU NAME rRoshto Ukvn DKZ, maku N N day tya DN ha i v A Ya eh i N er KK ne ve o Ky Kk. tower for IZ M ke Ov B Ne Z SHOV, A VH y |: SHE 00 vn m SHE 5 B g i Tytov os KV OA t 1 OO i 3 VO in MAN UK i is i a N I Be OA beer sho; University of B; and shoyu OO B i. I menya MOM E i AT OV v y Kk s Y ME OH IZ i p ia! and shchi BU Ya i i KAK A - plllodlcyan M kchn NNENNVIY..... YAN GU x - y ; i Yad d dk KE. Hey V « I! s, in IZ LE them IZ pi. oeikkhikchzhichijiyuch yuyu pon A XX llotit ne tnene ene Ke eeeecheeketecheene ie ' Collagen KENE osa i ! At ka DAZHKAK Tskymi mo yk ALREADY dk sho shk SH TI 7 I NAEK u r p u i vk V, o kltutyu in dao Spmyuv y ; more HOW IN oskovo pke i Keviets SHE u Be V V o kavneaki s SHY N VH ven ov, VI Me i i Z OM NE SARI she she ona: In banyu z i Ta KO o zhk AT fen nia yad i a s M VE MU KOR Ih Kak a ZHY r. ! PO a Kva a 2 and UVK i a in Z: ; I i po i i o SHE no i i SHE a A 8 Dec ooo kN A dya b i so ia NK k py ve v ek sh : EK Kk sy DYA osi s OH U. Z KVK E ki i VU SK I UM dkhzhyyusn CHOKU pt EE i o v kn dk im SYA ok i o o sia I Vk AS schi oo BO : YALEOYA tia MEZH VK nn TOWERS. and E as 4 I Z, xx I go hu e E . I

Фіг. 13 їв коамтрогх р дюни конт КК Ки МАМ сій Ех БО КУ Фронт нення З ї здFig. 13 ate koamtrogh r duny cont KK Ky MAM sii Eh BO KU Front nenya Z i zd

ОН. тео вою Ве Ж КЖАЯ 2 ла ся. ВК Масенся їй Її ВЕК а в ші 5 КУ і І ВО 5 ї БО ОВК 2ї ї Ве З: У: чн. ЯН. що ра С пк ани кн по і (ві МН І ОД, ід В Я о НИ НИ ШЕ ПИ двух МИ ди сівкя ех леж ікрі хатини мо нев Ше" ТОМІ ЖКТАТИх, ще ОБУ сосна оон ОО -- Ем КИ З Б ; : Ем: ММ ре ї у щ ОТ їх ВО ке ще ЕК од В КО зу В сте Бо : а Мао и Ас» В що - ОБУ и КУ о ж ше " ЖК Б щук ва ше ві Б ЛЕ Мт ВКНЖ. ВЕON. teo voi Ve Zh Kzhaya 2 la sia. VK Masensya to her Her CENTURY and in the 5th KU and I VO 5th BO OVC 2nd Ve Z: U: chn. JAN that ra S pk any kn po i (vi MN I OD, id V I o NI NIS SHE PI dvuh WE di sivkya eh lej kri hutyny mo nev She" TOMI ZKTATYh, still BOTH pine oon OO -- Em KY Z B ; : Em: MM rei u sh OT their VO ke more EK od V KO zu V ste Bo : a Mao and As» In what - OBU i KU o zhe she " ZK B pike wa she vi B LE Mt VKNZH. VE

00.2... БИ Но . а З жо с: о НН нн ня х о ї « 3 ї Га Е шо00.2... WOULD But . a Z zho s: o NN nn nya h o i « 3rd Ha E sho