UA104467C2 - Рекомбінантна бактерія deіnococcus та її застосування для одержання етанолу - Google Patents
Рекомбінантна бактерія deіnococcus та її застосування для одержання етанолу Download PDFInfo
- Publication number
- UA104467C2 UA104467C2 UAA201114836A UAA201114836A UA104467C2 UA 104467 C2 UA104467 C2 UA 104467C2 UA A201114836 A UAA201114836 A UA A201114836A UA A201114836 A UAA201114836 A UA A201114836A UA 104467 C2 UA104467 C2 UA 104467C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- gene
- bacterium
- ros
- ethanol
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 115
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 25
- 241000192093 Deinococcus Species 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 83
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 42
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 17
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 17
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 14
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 12
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 6
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 101150042287 ros gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OSWRVYBYIGOAEZ-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)C(O)=O OSWRVYBYIGOAEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 150000003893 lactate salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 2
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N pararosaniline free base Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=N)C=C1 AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CABMTIJINOIHOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-methyl-5-oxo-4-(propan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl]quinoline-3-carboxylic acid Chemical compound N1C(=O)C(C(C)C)(C)N=C1C1=NC2=CC=CC=C2C=C1C(O)=O CABMTIJINOIHOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- -1 AUN nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WJJMNDUMQPNECX-UHFFFAOYSA-N Dipicolinic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=N1 WJJMNDUMQPNECX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 229910016006 MoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000549435 Pria Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150045848 Tmbim6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 1
- KPKHVFGABLTMTR-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butanedioic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)C(O)=O.OC(=O)CCC(O)=O KPKHVFGABLTMTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N ethanol etoh Chemical compound CCO.CCO OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N spizofurone Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)C)=CC=C2OC21CC2 SETMGIIITGNLAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001870 spizofurone Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід належить до бактеріїяка містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує ген PDC та ADH, конструкцій нуклеїнової кислоти, прийнятних для одержання бактерії за даним винаходом, а також застосування бактерії, для одержання технічного етанолу.
Description
Фіг. 1: Конструювання і структура інтегративної конструкції РОК-І Онавєеї для часткової делеції ІОН.
Вставку з гомологічними областями і хлорамфенікольною касетою синтезували і клонували в
ПТМИиБа28і. Сат", стійкість до хлорамфеніколу; Атр", стійкість до ампіциліну; СОР. їепт85, передбачуваний термінатор транскрипції ЮОеїпососси5 гадіодигапе; Р 0. гад., передбачуваний промотор Оеїіпососси5 гадіодигапе; 5'НЕ, 5'-гомологічна область; З'НЕ, 3'-гомологічна область; Е. соїї
ОКІ, точка початку реплікації Е5сПегіспіа соїї.
Фіг. 2: Гомологічні області послідовностей 5' (ЗЕО ІЮ МО: 1) і 3' (ЗЕО ІЮ МО: 2).
Фіг. 3: Спосіб конструювання І -лактатдегідрогеназних (локус ЮК 2364) мутантів Оеїпососси5 гадіодаигап5 за допомогою гомологічної рекомбінації. Сат", стійкість до хлорамфеніколу; Атр", стійкість до ампіциліну; 5'НВ, 5'-гомологічна область; З'НЕ, 3-гомологічна область; Е. соїї ОКІ, точка початку реплікації ЕзсПегіснпіа соїїЇ.
Фіг. 4: Послідовності нуклеїнових кислот генів ТРОС (5ЕО ІЮ МО: 3) і 2тАОН ІІ (ЗЕО ІЮО МО: 4).
Фіг. 5: Конструювання і структура плазмід рІЗ-ОВ-Р-РОС-АСОН (а), рІЗ-ОВ-Р-РОСТад-АОнНІаз (Б), різ-
ОВ-Р-РОС-Р-АВН (с) і рІЗ-ОВ-Р-РОСТаа-Р-АОНІад (4). Оперон ЕВ5 агоЕЗІ,, область сайту зв'язування рибосом, розташована проти ходу транскрипції відносно оперона дгоЕ5і ОЮОеїіпососси5 гадіодигап5 (Меїта єї а, 2001); Атр", стійкість до ампіциліну; Сат", стійкість до хлорамфеніколу; Е. соїї ОВІ, точка початку реплікації ЕбсПпегіспіа соїї; РішША, 432 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена їшТА; РішВ, 234 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена їшїВ; 2тРОС, ген піруватдекарбоксилази 7утотопав тпорБії5; гпАОН, ген алкогольдегідрогенази | 7утотопа5 торбі; Тепт85, міжгенна послідовність, розташована між локусом ОК 1184 і ОК 1185, що містить передбачуваний термінатор транскрипції;
Тепт116, термінатор транскрипції Тепт!116 (І есоїпіє еї аїЇ, 2004); 0. гад. ОКІ, точка початку реплікації
Оеїпососсиз гадіодигапе; Р 0. гаа., промотор Оеїіпососси5 гадіодигапв.
Фіг. 6: Активність алкогольдегідрогенази для 0. гадіодигап5, трансформованої за допомогою ріЗ-
ОВ-Р-РОС-Р-АВН (а) або рІЗ-ОВ-Р-РОСТад-Р-АОНІая (Б).
Фіг. 7: Перебудований метаболічний шлях.
Фіг. 8: Трикомпонентне лігування продуктів ПЛР для створення мутанта РОС-АОНАГ ОН. Сату, стійкість до хлорамфеніколу; РІША, 432 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена їшТА; РішВ, 234 п.о., розташовані вище відносно передбачуваного стартового кодона трансляції гена їшШїВ; 2тРОС, ген піруватдекарбоксилази 7утотопа5 тобійв; 2тАОН, ген алкогольдегідрогенази Ії 2утотопа5 торБіїїє; Тепт85, міжгенна послідовність, розташована між локусом ОК 1184 і Ом 1185, що містить передбачуваний термінатор транскрипції; Тегпт!116, термінатор транскрипції Тепт11б6 (Іесоїпіе еї аЇ), 2004); Р 0. гад., передбачуваний промотор
Овіпососсиз гадіодигапв; 5'НЕ, 5'-гомологічна область; З'НЕ, 3-гомологічна область.
Таблиця 1: Назви рекомбінантів, що використовуються для метаболічного аналізу.
Таблиці 2-5: Рекомбінанти ЮОеїіпососси5: отримання метаболітів в комплексному середовищі або середовищі певного складу.
Докладний опис винаходу
Даний винахід стосується рекомбінантних стресостійких бактерій і їх застосувань для отримання біопалива або інших метаболітів.
У контексті даного винаходу термін "стресостійка бактерія" означає більш конкретно бактерію, яка має здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, коли він зруйнований стресом. Стрес може являти собою будь-який руйнуючий клітину ушкоджуючий ДНК вплив, тобто вплив, якого достатньо, для того щоб викликати смерть 90 95 клітин або більше в культурі бактерій Е. соїї. Ще більш переважно руйнуючий клітину ушкоджуючий ДНК вплив являє собою вплив, якого достатньо, для того щоб зменшити на щонайменше 2 порядки бактерійний титр в культурі Е. соїї. Приклади такого впливу включають опромінення, переважно багаторазове і послідовне УФ опромінення, і/або застосування генотоксичних речовин. Переважним стресовим впливом є УФ вплив між 0,5 і 400 мДж/см7, більш переважно між 1 і 200 мДж/см7, звичайно між 1 і 100 мДж/см7, прикладений протягом періоду часу приблизно від 5 секунд до 5 хвилин. Переважно УФ вплив становить 4 мДж/см? протягом секунд, який можна повторювати з інтервалом між 1 і 8 годинами, переважно від З до 5 годин і більш переважно приблизно 4 години. Конкретні стресові впливи на клітину відповідно до даного винаходу описані в патентній заявці Мо ЕРОЗ9 305041.7, неопублікованій, яка включена в даний опис за допомогою посилання.
Стійкі до клітинного стресу бактерії відповідно до даного винаходу включають більш конкретно бактерії Оеєїпососси5, бактерії Терідітопа5, бактерії Тгиерега, бактерії Рогрпугабрасієг, бактерії
Момозрпіпдобішт або бактерії Ехіднобасіеєгішт. Переважними бактеріями за даним винаходом є бактерії Оеєїіпососси5, зокрема, екстремофільні бактерії Оеіпососси5, більш переважно бактерії
Оеїіпососси5 вибрані з О. гадіодигап5, Ю. деоїпегтаїйх, Ю. Миггауі, ЮО. сейПишозйпйуйсиє або О. аевзенгії, переважно термофільна бактерія ЮОеіпососсив5.
Було показано, що бактерії Овіпососси5 мають здатність наново збирати свій геном, повністю або частково, коли він зруйнований стресом. Як відмічено вище, було запропоновано застосовувати вказані бактерії, зокрема, ОО. гадіодигап5, для біоремедіації. Здатність бактерій Оеїіпососси5 отримувати біоенергетичні продукти з біомаси розкрита в М/О2009/063079, неопублікованої на дату пріоритету даної заявки. Тепер в даному винаході показано, що продуктивність стресостійких бактерій, таких як бактерії Оеіпососси5, можна поліпшити за допомогою перебудови метаболічних шляхів за допомогою рекомбінантних методів. Більш конкретно, даний винахід пропонує нові рекомбінантні стресостійкі бактерії, у яких перебудований шлях біосинтез етанолу.
У зв'язку з цим автори даного винаходу розробили і створили нові біосинтетичні шляхи в стресостійких бактерійних штамах, які основані на зміні шляху перетворення пірувату. Більш конкретно, автори розробили нові рекомбінантні штами, в яких піруват ефективно використовується як субстрат для отримання етанолу. У зв'язку з цим автори ввели один або декілька ферментів (або відповідних генів), які викликають або каталізують перетворення пірувату в етанол. Автори також видалили ендогенний шлях, який використовує піруват, для того щоб отримати лактат, за допомогою цього збільшивши кількість пірувату, що бере участь в дорозі синтезу етанолу.
Мета даного винаходу, таким чином, стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оєіпососси5, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС.
Термін "рекомбінантна бактерія" означає бактерію, яка містить модифікований геном в результаті або делеції і/або вставки гетерологічної (наприклад, відсутньої в природі у вказаної бактерії) послідовності або молекули нуклеїнової кислоти. "Рекомбінантна нуклеїнова кислота", отже, означає нуклеїнову кислоту, яка була сконструйована і не виявляється як така в бактеріях дикого типу.
Інша мета даного винаходу стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оєіпососсив5, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує АН.
У ще одному переважному варіанті здійснення даний винахід стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососси5, причому вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС і АОН.
Інша мета даного винаходу стосується (рекомбінантної або генетично модифікованої) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оєіпососси5, причому вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген лактатдегідрогенази (І ОН).
Найбільш переважною метою даного винаходу є (рекомбінантна або генетично модифікована) стресостійка бактерія, зокрема, бактерія ЮОеіпососси5, причому вказана бактерія має модифікований геном, який містить інактивований ген лактатдегідрогенази (ОН), і причому, крім того, вказана бактерія містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС і/або АН.
Піруватдекарбоксилаза (РОС, ЕС: 4.1.1.1) каталізує моно-окислювальне декарбоксилування пірувату до ацетальдегіду і діоксиду вуглецю. Алкогольдегідрогеназа (АОСН, ЕС: 1.1.1.1) каталізує перетворення ацетальдегіду в етанол.
Для того щоб створити або поліпшити вказаний метаболічний шлях, молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує РОС і/або АЮН, клонували і успішно ввели в стресостійку бактерію, зокрема, штаму
Оеїіпососси5. Термін нуклеїнова кислота означає переважно ДНК, хоч рекомбінантна нуклеїнова кислота може являти собою РНК. У залежності від ситуації молекула нуклеїнової кислоти може бути дво- або одноланцюжковою.
Більш конкретно, була отримана молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує функціональну РОС.
Така молекула нуклеїнової кислоти може повністю або частково містити послідовність природного або синтетичного або мутантного гена РОС, при умові, що молекула нуклеїнової кислоти кодує білок, який каталізує моно-окислювальне декарбоксилування пірувату до ацетальдегіду і діоксиду вуглецю.
РОС присутній в рослинах, грибах і дріжджах, але рідко зустрічається в бактеріях. У геномі 0. гадіодигапво, який був повністю секвенований, не було знайдено явної РОС. Гени РОС були виявлені в різних штамах, як наприклад, в 2утотопаз побіїз (Вгашйм і Запт, 1986; Сопугау єї аї, 1987а; Меаїе еї аї, 1987), в АсеїобБасіег равіеигіапи5 (Сепрапк: АЕЗ368435) (Спапага еї аї, 2001), в Загсіпа мепігісції (Сепрапк: АЕ354297) (І омге і 2еїКив, 1992) і в 2утобасіег раїтає (Сепрапк: АЕ474145) (Ка) еї аї, 2002).
У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота РОС містить повністю або частково послідовність бактерійного гена РОС. У певному варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить послідовність гена РОС з 7утотопах тобіїїз (2тРОС, 2МО 1360). Послідовність гена 7тРОС містить 1707 пар основ і подана на фіг. 4.
Крім того, для того щоб створити АОРН активність у стресостійких бактерій, таких як Оеіпососсив5, отримали молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує функціональну АЮН. Така молекула нуклеїнової кислоти може повністю або частково містити послідовність природного або синтетичного або мутантного гена АЮН, при умові, що молекула нуклеїнової кислоти кодує білок, який каталізує перетворення ацетальдегіду в етанол.
Гени АСН клонували з різних організмів, включаючи, без обмеження, 7утотопах торії (Іпдгат еї аІ, 1987), І асіорасійи5 ргемі5 (іш еї аі, 2007) або СеобасшШи5 5іеагоїтепторнійшв (Ссепрапк: 2725544) (Таїагісо єї аї, 2005). Передбачуваний ген АСН (ОК 2279) був також виявлений в геномі 0. гадіодигапв.
Проте, його експресія окремо, як представляється, не дозволяє здійснити ефективне отримання етанолу.
У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота АЮН містить повністю або частково послідовність бактерійного гена АЮН. У певному варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить послідовність гена АЮН з 7утотопавз тпобіїї5 (2тАОН, 2МО 1596). 7тАрОН ІІ містить 1152 пар основ, і його послідовність зображена на фіг. 4.
Вказані нуклеїнові кислоти можуть додатково містити регуляторні послідовності або області, такі як, наприклад, промотор (наприклад, промотор ішіВ) і термінатор. Промотор може бути ендогенним для хазяя (наприклад, промотор з гена ЮОеіпоссоси5 для клонування рекомбінантної нуклеїнової кислоти за даним винаходом в штамі Оеїіпососсив5) або гетерологічним (наприклад, з іншого джерела, такого як інша бактерія, фаг, синтетичний або гібридний промотор і т. д.). Переважними промоторами є ендогенні. У зв'язку з цим були вивчені і застосовані для експресія генів промотори Оеїпососсив5.
Приклади таких промоторів включають РІШшА і РішВ з генів ТИТА (0КОЗ309) і їшїВ (0К2050) факторів елонгації трансляції Ти, промотор гена ге5)у, що кодує передбачувану резольвазу, розташований в ріЗ, і область промотору РоагоЕ5І. оперону дгоЕЗ5І (І есоїпієе еї аї, 2004; Міета еї аї, 2001).
Нуклеїнові кислоти можуть бути клоновані як окремі одиниці (наприклад, різні конструкції нуклеїнової кислоти), або в одній і тій же конструкції, під керуванням різних областей промотору або в опероні.
Запропоновані в даній заявці приклади розкривають створення нових конструкцій, в яких генів
ТРОС ії генів алкогольдегідрогенази ІЇ з Хутотопав5 тобіїї5 (2тптАОН) клонували в одній і тій же конструкції, або під керуванням окремих промоторів, або в опероні. Вказані конструкції успішно вводили в штами ЮОеіпососси5, що приводило до отримання етанолу з вказаних рекомбінантних штамів, в той час як немодифікований (батьківський) штам зовсім не виробляв етанол в досліджених умовах.
Нуклеїнова(ї) кислота(и) може бути вставлена в геном бактерії або вставлена як (автономно) репліковані молекули, наприклад, на плазміді, епісомі, штучній хромосомі і т. д.
У типовому варіанті здійснення рекомбінантну нуклеїнову кислоту(и) клонують у відповідний вектор, який може реплікуватися в Юеіпососси5. Типові плазміди містять, в доповнення до клонованої вставки, ген відбору (наприклад, стійкість до антибіотика, барвник і т. д.) і точку початку реплікації, ефективну в Юеїпососси5 або допускаючу інтеграцію в геном Оеїпососсиб5. Плазміда (або рекомбінантні нуклеїнові кислоти) може додатково містити регуляторні послідовності, такі як, наприклад, промотори, термінатори і/або енхансери.
Приклади таких векторів включають рРМОбб, ріЗ, рРКАЮІ і рОЕеЕ30. рМОбб являє собою великий вектор (27 т.н.) для 0. гадіодигап5 і Е. соїї, що містить фрагмент різ розміром 12 ріЗ був описаний
Мабхіеге і Міпіоп (1992). РКАЮ1Т являє собою 0. гадіодигап5-Е. соїї човникову плазміду, що містить мінімальний реплікон для Ю. гадіодигап5 (Меїйта і Гідеїтот, 2000). рОЕЗО являє собою ендогенну плазміду, яка походить зі штаму 0. Кадіоридпап5, яка здатна реплікуватися в Оеєіпососси5 (дивіться
О52003/0175977).
Конкретною метою даного винаходу є плазмідна конструкція, причому вказана плазміда реплікується в стресостійкій бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососсив, і містить нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС і/або АОН. Кодуючі РОС і АОСН нуклеїнові кислоти можуть розташовуватися в опероні або являти собою різні одиниці експресії в одній і тій же плазміді або в різних плазмідах. Переважні плазміди за даним винаходом кодують РОС і/або АСН з 7утотопа5. Конкретними прикладами плазмід за даним винаходом є рІЗ-ЮВ-Р-РОС-АВН, ріІЗ-ОВ-Р-РОСТад-АОНІая, ріІЗ-Р-РОС-Р-АБН і різ-
ОВ-Р-РОСТад-Р-АОНІад.
Рекомбінантну нуклеїнову кислоту можна також клонувати в інтегративній касеті, прийнятній для інтеграції в геном бактерії Оеіпососси5. Така интегративна касета містить, як правило, рекомбінантну нуклеїнову кислоту, пов'язану з (або фланковану) однією або декількома послідовностями, що допускають інтеграцію, переважно сайт-специфічну інтеграцію. Такі послідовності можуть являти собою, наприклад, послідовності нуклеїнових кислот, гомологічні цільовій області геному, що допускають інтеграцію за допомогою кроссинговера. У зв'язку з цим певна бактерія за даним винаходом містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС і/або АОБН, інтегровану в свій геном, замість всього або частини ендогенного гена, що кодує ГГ ОН. У цьому контексті термін "частина гена ГОН" означає будь-яку частину гена, делеція якої достатня, для того щоб викликати інактивацію гена в клітині.
Для того щоб вставити рекомбінантну(ї) молекулу(и) нуклеїнової кислоти в стресостійкі бактерії, зокрема, ЮОеіпососси5, можна використати різні методи. Зокрема, їх можна вставити за допомогою природної трансформації (яка може бути додатково посилена в присутності хлориду кальцію) або електропорації.
У зв'язку з цим даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососси5, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Овіпососсив5;
- введення у вказану бактерію молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує РОС і/або
АРН, і - відбір бактерії, яка експресує вказану нуклеїнову кислоту.
Рекомбінанти, в які відбулося введення нуклеїнових кислот, можуть бути відібрані відповідно до методів, відомими рег 5е, такими як стійкість до антибіотиків.
Експресію відповідних РОС або АЮСН можна перевірити за допомогою кількісної ПЛР, а отримання вказаних ферментів можна перевірити за допомогою вестерн-блотингу або за допомогою ферментних аналізів, відомими рег 5е в рівні техніки. Активність РОС можна виміряти за допомогою аналізу відновлення МАЮ» а активність АОН можна виміряти за допомогою аналізу відновлення МАЮ» або окислення МАЮОН внаслідок активності вказаних ферментів (Сопугау еї аї, 1987а і Б).
Як розкрито в експериментальному розділі, були отримані бактерії ЮОеіпососси5, що містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту, яка кодує РОС і АОН. Вказані бактерії можна культивувати, вони життєздатні і постійно містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту. Стабільність рекомбінантів переважно така, що більше ніж 95 95 трансформованих бактерій все ще містять вектор після 2 циклів росту. Результати демонструють, що геномна вставка РОС і АОН стабільна навіть після 2 циклів росту.
Вказані бактерії виробляють етанол і з'єднують в собі багато переваг з точки зору субстратної специфічності, умов культивування і отримання метаболіту.
Крім того, для того щоб додатково поліпшити отримання етанолу, також були отримані стресостійкі бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососси5, в яких генів лактатдегідрогенази інактивований.
Ген ГОН (лактатдегідрогенази) бере участь в перетворенні пірувату в лактат. Ген ІОН 0. гадіодигапе клонували в 1996 році Магиті і МУаїапаре. Даний фермент являє собою тетрамер, і визначена його кристалографічна структура (Содивеїпе еї аї, 2007).
Тепер автори створили нову бактерію, в якій вказаний фермент неактивний. У конкретному варіанті здійснення ген ГОН видалений повністю або частково і не кодує функціональний білок. Ген
МОН може бути інактивований у вказаній бактерії або її предку за допомогою гомологічної рекомбінації, заміщення гена або направленого мутагенезу або будь-якого іншого методу, відомого рег 5е в рівні техніки.
У переважному варіанті здійснення генів ІОН інактивований за допомогою делеції щонайменше частини вказаного гена, яка може бути заміщена гетерологічною нуклеїновою кислотою (наприклад, селекційним маркером).
Ген ГОН містить 915 пар основ. Він розташований між координатами 2362890 і 2363804 в геномі
Оеїпососси5. Послідовність вказаного гена доступна, наприклад, як депезед1799712. У переважному варіанті здійснення бактерія за даним винаходом не має частини вказаного гена, переважно щонайменше 100 його послідовних нуклеотидів, більш переважно щонайменше 200, 300, 400 або 500.
У прикладах був отриманий дефектний штам Оеїіпососси5, який не має 589 послідовних нуклеотидів гена ГОН. Вказаний штам був отриманий шляхом подвійного кроссинговера із застосуванням певної конструкції, що містить маркерний ген, фланкований двома областями, гомологічними частинам гена
ГОН ї (необов'язково) частинам областей, які фланкують ген ГОН (дивіться фіг. 3). Типові гомологічні області повинні мати достатню довжину, для того щоб зробити можливими гібридизацію і кроссинговер, наприклад, понад 200 нуклеотидів, переважно понад 300 нуклеотидів, як правило між 300 і 700. Такі конструкції являють собою конкретну мету даного винаходу (дивіться фіг. 1 і2).
У зв'язку з цим даний винахід також стосується способу отримання рекомбінантної стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососси5, визначеної вище, або її предка, що включає: - отримання (батьківської) стресостійкої бактерії, зокрема, бактерії Оеіпососсив5; - обробку бактерії з метою інактивації гена! ОН і - відбір бактерії з інактивованим геном І ОН.
Бактерію за даним винаходом можна культивувати і/або зберігати в будь-якому відповідному культуральному середовищі і пристрої. Приклади такого середовища включають комплексне глюкозне середовище або середовище певного складу, як розкрито в прикладах, таке як, наприклад, середовище певного складу з сахарозою, середовище певного складу з крохмалем. Прийнятні середовища також комерційно доступні.
Інша мета даного винаходу стосується застосування бактерії, визначеної вище, для отримання етанолу або інших метаболітів.
Даний винахід також стосується способу отримання біопалива, зокрема, етанолу, що включає культивування бактерії, визначеної вище, в присутності відповідного субстрату і збір біопалива.
Субстрат може являти собою будь-яке культуральне середовище, або різні типи біомаси, або продукти, які походять від них. Зокрема, біопаливо можна отримувати з відновлюваних ресурсів, особливо рослинної або тваринної біомаси, або з міських і промислових відходів.
Термін біопаливо відповідно до даного винаходу включає "біопаливо першого покоління" і/або "біопаливо другого покоління". Біопалива першого покоління отримують з рослинного або тваринного органічного матеріалу, переважно з цукру, крохмалю, рослинної олії або тваринних жирів. Основним джерелом отримання біопалив першого покоління є їстівні рослини або їх частини. Біопалива першого покоління включають рослинну олію, біодизельне паливо, біоспирти, біогаз, синтез-газ і тверді біопалива. Біоспирти включають етанол, пропанол і бутанол. Біопалива другого покоління отримують переважно з неїстівних рослин або неїстівних частин рослин. Вони включають непродовольчі культури, відходи біомаси, стебла пшениці, кукурудзу і деревину.
Більш переважно спосіб за даним винаходом застосовують для отримання етанолу.
Спосіб за даним винаходом можна здійснювати в реакторі перетворення. Під "реактором" розуміється звичайний ферментаційний чан або будь-який апарат або система для перетворення біомаси, спеціально розроблений для того, щоб здійснювати винахід і, отже, що складається, зокрема, з біореакторів, біофільтрів, дискових біологічних контакторів і інших газових і/або рідкофазних біореакторів, особливо пристосованих для обробки біомаси або похідних біомаси. Апарат, який можна застосовувати відповідно до даного винаходу, можна застосовувати безперервно або із завантаженнями порціями.
У реакторі, для того щоб здійснювати спосіб за даним винаходом, використовується щонайменше одна бактерія за даним винаходом, або її бактерійний екстракт, в той час як вказаний реактор розташовують і живлять, так щоб в ньому були встановлені і підтримувалися фізико-хімічні умови, так щоб вказана бактерія виявляла активність для застосування, що розглядається, і так щоб, необов'язково, в ньому було можливе і переважно активізоване бактерійне зростання.
Вказаний спосіб можна здійснювати в умовах аеробіозу, анаеробіозу або в умовах мікроаеробіозу, в залежності від субстрату і бактерії. Перевага даного винаходу стосується здатності бактерій за даним винаходом бути стійкими по відношенню до стресових умов, включаючи присутність етанолу в культуральному середовищі. Спосіб за даним винаходом, таким чином, можна переважно здійснювати при температурі, яка дорівнює приблизно 402С або вище, зокрема, при температурі в діапазоні між 409 і 709С; в умовах кислого рН і/або в присутності етанолу.
Інші аспекти і переваги даного винаходу будуть розкриті в наступних прикладах, які потрібно розглядати як ілюстративні і які не обмежують об'єм даної заявки.
ПРИКЛАДИ
Матеріали і методи
Бактерійні штами і умови зростання
Використовували штами Езспегіспіа соїї (Е. сої) 505110, 9УМ109 або ОН5бБа, для того щоб розмножати плазміди. Їх культивували при 372С і 200 об./хв. в середовищі Лурія-Бертані (І.В) (на літр: триптон 10 г, дріжджовий екстракт 5 г, хлорид натрію 10 г). Тверді середовища отримували шляхом додавання 1,5 95 агару.
Реїіпососси5 гадіодигапе КІ (0. гадіодигап5) вирощували при 302С і 200 об./хв. в ТОМУ або РОУ.
Середовище ТОУ має наступний склад, на літр: триптон (5 г), дріжджовий екстракт (1,5 г) і глюкоза (1 г). Склад твердих середовищ, на літр: триптон (5 г), дріжджовий екстракт (2,5 г), глюкоза (1 г) і агар (15 г). Середовище РОУ має наступний склад, на літр: пептон (10 г), дріжджовий екстракт (5 г) і глюкоза (1 г). Склад твердих середовищ на літр: пептон (10 г), дріжджовий екстракт (5 г), глюкоза (1 г) і агар (15 г).
Середовища ІВ або ТОУ доповнювали, при необхідності, відповідними антибіотиками (хлорамфеніколом в кінцевій концентрації З мкг/мл для трансформантів 0. гадіодигапе5 і ампіциліном 100 мкг/мл для трансформантів Е. соїЇ).
Трансформація
Трансформацію Е. соїї здійснювали за допомогою комерційних компетентних клітин 525110 від оЗігаїадепе або УМ109 від Рготеда.
Для отримання компетентних клітин 0. гадіодигап5 свіжу культуру в стаціонарній фазі розбавляли в 100 разів в 50 мл ТОУ. Клітини вирощували до ранньої експонентної фази (ОЮвоонм-0,3); осад ресуспендували у відповідному об'ємі охолодженої до нуля суміші 2хТ(У/10 95 об./об. гліцерину/30
ММ Сасі». Для трансформації додавали необхідну кількість плазмідної ДНК до 100 мкл клітин. Суміш інкубували 30 хвилин на льоду до того, як пробірки переносили в 302С. Після 90 хвилин інкубування при 302С до клітин додавали 900 мкл заздалегідь нагрітої 2х ТУ. Трансформанти струшували при 200 об./хв. і 309С протягом 20 годин. Їх послідовно розводили і наносили на відповідні планшети з неселективною або селективною ТО.
Маніпуляція з ДНК тМИизЗа8і отримали від Мем Епдіапа Віоїабв.
Плазмідні мініпрепарати з клітин Е. соїї виготовили за допомогою набору УмігагаоРіи5 ЗМ тіпіргер5
ДНК ригійсайоп 5узіет від Рготеда, а мідіпрепарати виготовили за допомогою набору для очищення плазмідної ДНК МисіеоВопаФф Хіга Міаї Ріи5 ЕЕ від Маспегеу-Мадеї. Вказані препарати виготовили з 3- 100 мл культури Е. соїї в стаціонарній фазі.
Для отримання плазмід з 0. гадіодигап5 50 мл клітин в стаціонарній фазі ресуспендували в 0,5 М
ЕДТА і бутанолі, насиченому 0,5 М ЕДТА. Після 15 хвилин інкубації при кімнатній температурі осад ресуспендували в 0,5 М ЕДТА і клітини залишали при 702С протягом 30 хвилин. Осад промивали двічі в лізоцимовому буфері (10 мМ тріс-НСІ, 5 мМ ЕДТА, 0,5 М МасіЇ) перед додаванням лізоциму при 5 мг/мл (в лізоцимовому буфері). Зразок інкубували протягом 30 хвилин при 37"С перед додаванням
РНКази і протеїнази К. Суміш інкубували протягом 1 години при 562С. Потім додавали 200 мм Ммаон до зразка, який декілька разів перевертали, для того щоб перемісити; додавали 3 М ацетат калію до зразка, який перевертали, для того щоб перемісити; суміш інкубували протягом 10 хвилин на льоду перед тим як додали етанол до супернатанту; дану суміш інкубували протягом 10 хвилин на льоду і осад промивали 70 95 етанолом. Висушений осад ДНК ресуспендували у воді.
Екстракцію геномної ДНК з 0. гадіодигап5 здійснювали, використовуючи комерційний набір
ОМеазуФфФ Віоой апа Тіззце від Оіадеп. Вказані препарати виготовили з 5 мл культур в стаціонарній фазі.
Олігонуклеотиди синтезовані Еигодепіес. Полімеразами, використаними для ПЛР-ампліфікації, були СуМмАгуте ЕХТ ДНК-полімераза від Ріпплутев5 або Ехіепзог Ні-Рідейу РСК Епгуте від Тпегто
Зсіепійіс. Фрагменти ПЛР очищали, використовуючи набір М/і7ага 5М сеї апа РСК СіІвап-Ор Зу«ет від
Рююотеда.
Для лігування ДНК застосовували Т4 ДНК-лігазу (Мем Епдіапа Віоїіарв).
Плазмідну ДНК або продукти ПЛР розщеплювали за допомогою рестрикційних ферментів, отриманих від Мем Епдіапа Віоїарв».
Генетичний матеріал (продукти ПЛР або розщеплення) розділяли за допомогою агарозного гель- електрофорезу. Кількість ДНК визначали за допомогою біофотометра від Еррепаогі.
Вставки ДНК були синтезовані Сепесивії Ешигоре і клоновані у відповідний вектор.
Перевірка активності алкогольдегідрогенази 4 мл парарозаніліну (Зідта) при 2,5 мг/мл в абсолютному етанолі додавали до 200 мл І В агару, що містить 50 мг бісульфіту натрію (Сопмжау еї аї, 19875). Клітини 0. гадіодигап5 дводенного віку, вирощені в планшетах з агаром ТОМУ (доповнених при необхідності відповідним антибіотиком), висівали на індикаторні планшети і інкубували при 372С протягом 2-3 годин.
Отримання метаболітів
Даний спосіб дозволяє оцінити здатність генетично модифікованих мікроорганізмів виробляти метаболіти, які представляють інтерес, з біомаси або похідних біомаси.
Випробування проводять при 302С.
З прекультур (в стаціонарній фазі), отриманих в комплексному середовищі з глюкозою, висівали 6 мл збагаченого середовища (посів при 1 95 об./об.).
Були протестовані збагачені культуральні середовища, такі як комплексне середовище з глюкозою, середовище певного складу з сахарозою, середовище певного складу з крохмалем.
Комплексне середовище з глюкозою містить: пептон 2 г/л, дріжджовий екстракт 5 г/л і глюкозу 10 г/л в осмотичній воді: розчин стерилізований за допомогою автоклавування (15 хвилин при 1202). До даного розчину додані наступні розчини: буферний розчин МОР5 (10х) рН 7 (кислота МОР5 400 мМ,
МН:СІ 200 мМ, Маон 100 мм, КОН 100 мм, Сасі» 5 мкМ, Ма»5О» 2,76 мМ, МосСі» 5,28 мМі|; поживні мікроелементи (10000х) (МНа)в(Мо7)24 300 мМ, НзВОз 4 мМ, Сосі» 0,3 мМ, СизО» 0,1 мМ, Мпсі» 2,5
ММ, 2п505 0,1 мМі; гесіз (100х) 2 мМ в СеНьМазО; 20 мМ; К»НРО»х 1 г/л: розчини стерилізовані за допомогою фільтрації (0,2 мкм).
Середовище певного складу містить: джерело вуглецю 10 г/л в осмотичній воді: розчин стерилізований за допомогою автоклавування (15 хвилин при 12022). До даного розчину додані наступні розчини: буферний розчин МОР5 (10х) рН 7 (кислота МОРБ5 400 мМ, МНе:СІ 200 мм, маон 100 мм, КОН 100 мМ, Сасі» 5 мкМ, Ма»50» 2,76 мМ, Мосі» 5,28 мМі; поживні мікроелементи (10000х)
КМНа)в(Мо7)24 300 мМ, НзВО:з 4 мМ, Сосі» 0,3 мМ, СизО» 0,1 мМ, МпсСі» 2,5 мМ, 2п505 0,1 мМіІ; Ресіз (100х) 2 мМ в СеНьМазО; 20 мМ; К»НРО: 1 г/л: розчини стерилізовані за допомогою фільтрації (0,2
МКМ).
До вказаних культуральних середовищ, за винятком призначених для штамів дикого типу, додавали перед посівом хлорамфенікол: З мкг/мл культурального середовища.
З культурами працювали як в умовах аеробіозу, так і анаеробіозу (Віотегівих, сепбрад).
Культури в умовах аеробіозу залишали в інкубаторі при 302С при струшуванні протягом 7 днів.
Потім культури центрифугували протягом 10 хвилин при 4000 об./хв. Супернатанти фільтрували (0,2 мкм), переливали в інші пробірки і залишали при -802С.
Культури в умовах анаеробіозу залишали в інкубаторі при 302С протягом 4 тижнів. Потім культури центрифугували протягом 10 хвилин при 4000 об./хв... Супернатанти фільтрували (0,2 мкм), переливали в інші пробірки і залишали при -8096С.
Для кількісного визначення спиртів застосовували аналіз за допомогою газової хроматографії з
ПІД (колонка Магіап СР-УУАХ 57 СВ 25 мх0,32 мм). Кількість органічних кислот визначали за допомогою капілярного електрофорезу (5 мМ 2,6-піридиндикарбонова кислота 0,5 мМ цетилтриметиламонійбромід; буфери з 5,6 рН/капіляр Адіїепі довжиною 61 см, діаметром 50 мкм).
Кількість залишкової глюкози визначали за допомогою ВЕРХ, з'єднаної з рефрактометрією (колонка
Рпепотепех ГОМА З мкм МН» 100 А 150х4,6 мм, рухома фаза ацетонітрил/НгО 85:15).
Приклад 1
Делеція І -лактатдегідрогенази (ІОН) у Оєвіпососсиз гадіодигап5 К1
ГОН-мутанти Оеїіпососсиз гадіодигап5 КІ (0. гадіодигап5) дикого типу отримували таким чином. а. Конструкція для делеції (ОН (рок-І она!)
Автори створили нову конструкцію, названу роОКк-ГОНаєї, для часткової делеції гена ГОН (ОК 2364) в 0. гадіодигап5 дикого типу (дивіться фіг. 1). Для цього автори використали основу
ГІТМИиЗа28і, реплікативну в Е. соїї, але не в 0. гадіодигап5. Синтезовану вставку ДНК клонували в
ІІТМИ528і; вказану вставку виготували з касети стійкості до хлорамфеніколу (Сат") (1344 нуклеотиди) і з 5- і 3'і'-фланкуючих гомологічних областей (537 нуклеотидів і 615 нуклеотидів), розташованих відповідно вище і нижче по ходу транскрипції відносно вказаної касети (фіг. 2).
Конструкцію рок-І ОНаєеї! створили так, щоб замінити 589 нуклеотидів гена ІОН (причому деякі з 589 нуклеотидів кодують залишки, що беруть участь в каталізі) касетою Сату". р. Створення мутантів, позбавлених І ОН
О. гадіодигап5 дикого типу трансформували за допомогою рок-іОНаеї, слідуючи способу, описаному в розділі "Матеріали і методи", для того щоб створити нокаутні мутанти. Трансформанти відбирали на середовищі ТОУ, доповненому хлорамфеніколом. Заміщення частини гена ІОН касетою стійкості до хлорамфеніколу (фіг. З) контролювали за допомогою ПЛР, застосовуючи відпал відповідних праймерів на хлорамфенікольній касеті. Для аналізу метаболітів відібрали два клони, отриманих інтеграцією за допомогою подвійного кроссинговера, з назвами 03-04/8-1 ії 03-04/11-2 (таблиця 1).
Після гомологічної рекомбінації отримана бактерія містить делецію 589 нуклеотидів, які заміщені касетою Сат". Геномні області 03-04/8-1 і 03-04/11-2, в яких частина гена ІОН заміщена касетою
Сат", були частково секвеновані.
Приклад 2
Отримання піруватдекарбоксилази і алкогольдегідрогенази в 0. гадіодигапо
Штами 0. гадіодигап5, які продукують піруватдекарбоксилазу (2тРОС) і алкогольдегідрогеназу (2тАОН), з Хутотопавз тобіїї5 отримували таким чином. а. Створення конструкцій, які несуть гени для отримання етанолу
Для того щоб отримувати етанол в клітинах 0. гадіодигап5, було створено чотири конструкції (дивіться фіг. 2).
Для першої конструкції, яка називається рІЗ-ОВ-Р-РОС-АОН, ген піруватдекарбоксилази (7тпРОС, 2МО1360) і ген алкогольдегідрогенази ІІ (2тАОН, 2МО1596) з 2утотопах тобіїї5 зир5р. Морбіїї 2М4 (фіг. 4) вміщували в оперон і клонували в Ватні і заїЇ реплікативною в 0. гадіодигап5 плазміди різ (Мазієї5 апа Міпіоп, 1992) (дивіться фіг. 5). Вектор різ додає 0. гадіодигап5 стійкості до хлорамфеніколу. Область з 432 пар основ, яка розташована вище відносно стартового кодона трансляції фактора елонгації ТО їшТА (ОК 0309) і містить активність промотору (І есоїпіє сеї аї, 2004), поміщали до оперона 2ОІРОС-АОН. Між генами 2тРОС і 2тАБВН присутній спейсер з послідовністю зв'язування рибосом (КВ5) з оперона дгоЕбі 0. гадіодигап5 (Меїта еї аї, 2001), поміщеної перед ініціюючим кодоном трансляції 27пАОН. Термінатор транскрипції О. гадіодигап5 Тегт!116 (І есоїпіє еї аї, 2004) вміщували вище відносно гена 2птАОН. Була створена друга конструкція, яка походить від ріЗ-
ОВ-Р-РОС-АОСН, і названа ріЗз-ОВ-Р-РОСІад-АЮОНіад. У даній конструкції Піб-мітку (6 гістидинів) поміщали в С-кінець 27тРОС і с-тус-мітку (ЕОКГІЗЕЕОІ) поміщали в С-кінець 2пАВН (фіг. 5).
Для конструкції ріЗз-бВ8-Р-РОС-Р-АЮОН область, що містить передбачуваний термінатор транскрипції, який називається Тепт85, вміщували вище по ходу транскрипції відносно гена 7тРОС, і 234 нуклеотиди, розташованих нижче по ходу транскрипції відносно стартового кодона трансляції фактора елонгації ТО їШїВ (ОК 2050) (який відповідає області промотору ШіВ, І есоїпіє еї аї, 2004), вміщували між Тептв85 і геном 27тАОН (фіг. 5). Остання конструкція є похідною від рІЗ-Р-РОС-Р-АСН і називається рІЗ-ОВ-Р-РОСТаа-Р-АОНІасд; в даному векторі Впі5-мітку (6 гістидинів) вміщували в С-кінець гена 2тРОС і с-тус-мітку (ЕОКГ ІЗЕЕОІ)) вміщували в С-кінець гена 2тАСН (фіг. 5). р. Створення штамів 0. гадіодигап5, які продукують 2тТРОС і 7тАОН
Компетентні клітини 0. гадіодигапх трансформували за допомогою різних конструкцій, які несуть гени 2тРОС і 27тАОН. Трансформанти відбирали на основі стійкості до хлорамфеніколу. Наявність плазміди контролювали за допомогою ПЛР-ампліфікації зі специфічними праймерами або ферментативного розщеплення конструкцій, екстрагованих з клонів Ю. гадіодигап5. Для кожної з 4 конструкцій два клони використовували для метаболічного дослідження (таблиця 1).
Приклад З
Створення інтергативних І ОН-мутантів ЮОеіпососсиз гадіодигап5, які продукують 20ТРОС і 2тАОН 589 нуклеотидів гена ОН (ОК 2364) р. гадіодигап5 дикого типу замінювали касетою стійкості до хлорамфеніколу з наступними генами 2тРОС і 7тАВН відповідно під керуванням промоторів РІіША і
РІШІВ.
Для того щоб створити даний РОС-АОН-чЇ ОН-мутант, ампліфікували за допомогою ПЛР 3 наступні нуклеотидні послідовності:
- Б'і-фланкуючу гомологічну область, за якою йде касета стійкості до хлорамфеніколу, ампліфікували з праймерами ЕСЗ1Е і ЕС32К (дивіться список нижче), використовуючи рОоК-І Онаеї як матрицю, - послідовність Р-РОС-Р-АЮОН ампліфікували з праймерами ЕСЗЗЕ і ЕСЗ34МК (дивіться список нижче), використовуючи ріІЗ-Р-РОС-Р-АРН як матрицю, - 3-фланкуючу гомологічну область ампліфікували з праймерами ЕСЗ5Е і ЕОЗ6бК (дивіться список нижче), використовуючи рок-іІ Онавеї як матрицю.
Список праймерів:
Продукт лігування вказаних З ампліконів використовували для трансформації 0. гадіодигапв5, для того щоб отримати мутант РОСяАЮОН-Ї ОН- (фіг. 8). Трансформанти відбирали на основі стійкості до хлорамфеніколу. Часткову делецію гена ГОН, геномну вставку хлорамфенікол-стійкого гена і генів 2гтТРОС ї 2пАБСН контролювали за допомогою ПЛР, використовуючи відповідні праймери. Два клони, отримані інтеграцією за допомогою подвійного кроссинговера, з назвами 18-06/1-1 ї 18-06/1-3 відібрали для аналізу метаболітів (таблиці 1 і 4).
Приклад 4
Рекомбінанти Оеїпососсиз гадіодигап5 К1: активність алкогольдегідрогенази
Автори визначили виробництво альдегіду і активність АН за допомогою колориметричного аналізу відповідно до Сопулау і співробітників (19870) в різних рекомбінантах, трансформованих плазмідами з генами 7тРОС ії 7тптАОН. Даний аналіз оснований на утворенні фіолетової основи
ШифФфа, що утворюється після взаємодії ацетальдегіду, що виробляється АН з етанолу, і лейкобарвника. Як показано на фіг. б, рекомбінанти за даним винаходом забарвлюються в фіолетовий після 2-3 годин інкубації при 37"С на планшетах з ЇВ агаром, доповнених етанолом, парарозаніліном і бісульфітом натрію. Дане фарбування вказує на АОН активність в кожному клоні рекомбінантів, трансформованих плазмідою ріЗ-ЮОВ-Р-РОС-Р-АОСН або ріЗ-ОВ-Р-РОСтТад-Р-АОНІавд. У вказаних рекомбинантах транскрипцію гена 27тАОН контролювали за допомогою промотору їшіВ.
Приклад 5
Рекомбінанти Оеїпососсиз гадіодигап5 К1: отримання метаболітів
Аналізували метаболіти, отримані за допомогою рекомбінантів за даним винаходом.
Автори могли детектувати зміну в метаболітах, які продукуються рекомбінантами за даним винаходом (наприклад, клонами 24-03/4-2, 03-04/4-1, 03-04/4-2), в порівнянні з дикого типу або контрольним рекомбінантом, трансформованим контрольною векторною основою ріЗ (дивіться таблиці 2-5). Зокрема, було детектоване отримання етанолу в різних умовах культивування, в той час як батьківський штам не продукує етанол.
Таблиця 1
Назва рекомбінантів рансформований штам й Назва клонів конструкція 24-03/1-2 р. гадіодигапео НІ Немає конструкції 03-04/1-1 20-04/1-2 ! 03-04/8-1 24-03/2-2 р. гадіодигапео НІ різ 03-04/2-1 20-04/3-1 ! 24-03/4-2 ! 20-04/4-3
! 03-04/5-1 р. гадіодигапе5 ВІ ріІЗ-ОВ-Р-РОСтТад-Р-АОНІад 03-04/6-1 : 03-04/4-1 р. гадіодигань В ріІз-ЮВ-Р-РОС-Р-АВН 03-04/4-2 ! 18-06/1-1 р. гадіодигапео НІ Продукти ПЛР 18-06/1-3
Таблиця 2
Рекомбінанти Оеїпососсиз гадіодигап5 К1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("СМ") при культивуванні в умовах аеробіозу 111111 шШтам///// | КлоннЇ 71111111 11111111 |Виробництво кислоти (г/л) нн
Витрата
Етанол
Сукцинат | Ацетат | Лактат й глюкози (е) (г/л)
Огай ВІ дикого типу 24-03/1-2|. 043 | 021 | 0 | 0 0
Огасй ВІ ріЗ 24-03/2-2|. 043 | 023 | 0 | 0 | 06 /
Огай ВІ дикого типу оз-04/1-43| 042 | 02 | 0 | 0 0
Огасй ВІ ріЗ о3-04/л2-4|. 037 | 02 | 0 | 0 1 09 /
Огай ВІ рІЗ ОВ-Р-РОС-Р-АОН |03-04/4-4Ї.. 025 | 014 | 0 1Мм 0,016
Огаа ВІ рІЗ ОВ-Р-РОС-Р-АОН. 103-04/4-2 0,016 гай НТ ріЗ ОН-Р-РОСТаЯРІ 03. о4/в-я 029 "НЕ 0,006 о
АОНІаа
Огад ВІ роВ--ОНаєї 7. 028 | 08 | 0 | 0 | 04
Огай ВІ роВ-Г она | 083 | 039 | 0 | 0 | 0 / х Фо етанолу означає г етанолу на г культурального середовища (тобто звичайно 1 95 етанолу - 1 гетанолу/100 г середовища - 10 г етанолу/л).
Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах.
Таблиця З
Рекомбінанти Реїіпососсизх гадіодигап5 К1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("СМ") при культивуванні в умовах аеробіозу
Виробництво кислоти(г/л)
Витрата
Етанол
Сукцинат | Ацетат Лактат (9б)" глюкози
Й г/л
Огай ВІ дикого типа 066 / 064 | 0 | о | зиз
Огає ВІ ріЗ (пуста плазміда 053 | б | 0 | о | 177
Огай ВІ ріЗ ОВ-Р-РОС-АОН 046 | 051 | 0 | бо
Огасй ВІ рІіЗ ОВ-Р-РОС-АОН 049 | 05 | 0 | 0,006
Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах.
Таблиця 4
Інтегративні рекомбінанти ЮОеїіпососсиз5 гадіодигап5 К1: отримання метаболітів в комплексному середовищі з глюкозою ("СМ") при культивуванні в умовах аеробіозу инші Виробництво кислоти(г/л).
Витрата
Етанол
Сукцинат Ацетат Лактат ж глюкози ренні нено век пи им
Огаакідикоотипа | 044 | 053 | 032 | 0 | 055
ОгаавіСатеРОСАрнНА ОНА | 046 | 055 | 0 | 0026 | 06 (ОгаавіСатеРОСАрНА ОоНА-. | 04 | 04 | 0 | 0026 | 108
Для кожного клону з культурами працювали в трьох повторах.
Таблиця 5
Рекомбінанти Оеїпососсиз гадіодигап5 К1: отримання метаболітів в середовищі певного складу з сахарозою ("ОМ") при культивуванні в умовах аеробіозу 11111110 Виробництвокислоти(луЇГ | б
Витрата
Етанол
Сукцинат | Ацетат Лактат ж глюкози п СУ
Огаакідикоотипа 777 | 002 | 01 1 003 | 004 | 0
ОгаавтріЗ 77777717 111002 | лі 1 003 | 004 | 0
ОгаавіріЗОв-Р-РОС-АСН.Ї | 0 ЇЇ 0 1 ро 1 0 | 0009
Огаа ві ріЗОв-Р-РОС-АСН. | 002 | из 0 | 0 | 0012
Огай в! різ Ов-Р-РОСТад-Р-АОНІв | 001 | 017 / 007 | 0 | 000 (Огай в! різ Ов-Р-РОСтаа-Р-АОНІвЯЇ | 0 | 005 | 0 | о | по
Вказані результати, таким чином, демонструють, що продукцію етанолу можна індукувати або посилити в стресостійких бактеріях за допомогою інженерії нових метаболічних шляхів. Результати, крім того, показують, що ІГОН-дефектні штами є життєздатними, і що інактивація даного гена ще більш посилює продукцію етанолу в бактеріях за даним винаходом. Також результати показують, що штами можуть використовувати різні типи субстратів і рости на різних типах культуральних середовищ, для того щоб виробляти етанол.
Рекомбінантні штами за даним винаходом, таким чином, обз'єднують в собі переваги стресостійкости, умов культивування, прийняття субстрату і виробництва метаболітів.
Джерела інформації:
Апдегзоп АМУ, Могдоп НС, Саїп КЕ, Раїтіпй б, Юиддап ОО (1956) ещшаїе5 оп а гадіо-гезівїапі тістососсив. І. Івоїайоп, тогрпоіоду, сийига! сНагасієгівіїс5, апа гезібтапсе 0 датта гадіайоп. Еоса
Тесппої. 10, 575-578
Вгашм В апа запт Н (1986) Сіопіпд апа ехргеззіоп ої Те зігисішга! депе ог ругимасе десагрохуїазе ої 2утотопавз тобіїв іп ЕбзсПептісніа соїї. Агсп Містобіо!. 144, 296-301
СНапага Ваї К, Іпдгат І 0, Машріп-Ригіоу УА. (2001) Ругимаїе десагрохуїазе: а Кеу еплуте Гог Те охідаїме теїароїївт ої Іасіїс асій ру Асеїобасієг равзівшпапив. Агсп Містобіо!. 176,443-451
Сопулау Т, О5тап МА, Коппап ДІ, Нойтапп ЕМ, Іпдгат ГО (1987а) Рготоїег апа писіеоїіде взедиепсез ої Ше 7утотопавз тобіїв ругимаїе десатохуїазе. у Вас!іегіо! 169, 949-954
Сопулау Т, Земе!! СМУУ, О5тап МА, Іпоагат ГО (19875) Сіопіпд апа 5едиепсіпд ої (Ше аїсопої депуадгодепавзе ІІ депе їтот 7утотопав торбіїїв. / Васіегіо!. 169, 2591-2597
Содиеїе М, Ріогамапії Е, М/еік М, МеїШеих Е, Мадет О (2007) Асіїміу, гїарійу апа вігисішга! війаїіев5 ої
Іасіаїе депудгодепазез адарієйд ю ехігете Шептаї епмігоптепів. / Мої! Віо! 374, 547-562
Баїу МУ, Огчуапод Г, Риср5 Р, Міпіоп КУМ (1994) Іп мімо датаде апа гесА-дерепавепі гераїг ої ріазтій апа спготозотаї ОМА іп їйе гадіайноп-гевзівїапі расієгшт Оєіпососсиз гадіодигапв. У Васіегіо!. 176, 3508- 3517
Іпоагат ГО, Сопулау Т, Сіаїк ОР, беумеїЇ СУМ, Ргезіоп У (1987) Сепеїйс епдіпеегіпд ої етйапоїЇ ргодисійп іп Е5сПетісніа соїї. Аррі Епмігоп Місгобіо!. 53, 2420-2425
І есоіпіє Е, Совів С, боттег 5, Вайопе А (2004) Месіог5 їТог гедшіаєтеа депе ехргезвзіоп іп Ше гадіогевзівїапі басіепцт Овєіпососсизв гадіодигапв. Ссепе 336,25-35
Пи 5, Оієп В5, Міспоївє ММ, Візспой КМ, Нидпез 5В8, СонНа МА. (2007) Соехргеззіоп ої ругимаїє десагрохуїазе апа аїЇсоної депудгодепазе депез іп І асіобасійи5 Бгемів. ЕЕМ5 Місгобіо! І ей. 274, 291-297
Гоме 5Е апа 7еїКив Уа (1992) Ригіїісайоп апа сНагасієгігайоп ої ругимаїе десагрохуїазе їот зЗагсіпа мепійсції. У Сеп Місгобіо!. 138, 803-807
Мавієгз СІ апа Міпюп КМУ (1992) Рготоїег ргобе апа зпише ріазтіав їог ЮОєіпососсив гадіодитапв.
Ріазтіа 28, 258-261Меїта К апа Гіавігот МЕ (2000) Спагасіегігайноп ої (пе тіпітаї! геріїсоп ої а сгуріїс
Оєіїпососсив гадіодигтапе ЗАВК ріазтій апа демеІортепі ої мегзайе ЕвспПегісніа соїЇ-О. гадіодигапе
5пиШе месіюг5. Аррі Епмігоп Містобіо!. 66, 3856-3867
Меїта В, Воїйптив55 НМ, Сем/іп І, Гідвітот МЕ (2001) Рготоїег сіопіпу іп їйе гадіогезівтапі Басієгійт
Оеїіпососсиз гадіодигапв. У ВасіеєгіоІ.183, 3169-3175
Магиті І апа УМаїапаре Н (1996) Зедшиепсе апаїувзів ої Пе І-Іасіаїе депудгодепазе-епсодіпуд депе ої
Оеіпососсиз гадіодигап5, а зийаріє тезорпйїйс соипіеграгі ог Тпегтив. Сепе 172, 117-119
Меаіе А, Зсорез ВК, М/еНепнаї! ВЕ, Ноодепгаай М. (1987) Мисіеоїіде зедоепсе ої Ше ругимаїе десагброхуїазе депе їот 7утотопавх тобіїї5. Мисівїс Асід5 Нев. 15, 1753-1761
Ва)| КС, Таїайсо ГА, Іпдгат ГО, Маиріп-Рипом УА. (2002) Сіопіпд апа сНагасієгігайоп ої Ше 7утобасієг раїтає ругимаїє адесагтохуїазе депе (рас) апа сотрагібзоп 10 Басієтла! потоіодиев5. Аррі
Епмігоп Містобіо!. 68, 2869-2876
Таїагісо І А, дії МА, Мотапо І Р, Іпдгат ГО, Мацшріп-Ршпом УА. (2005) Сопвігисіюп апа ехргезвіоп ої ап еїШапої ргодисіюп орегоп іп Стат-розійме Басієїа. Місгобіо!. 151, 4023-4031.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» БВЕЇМОМЕ «180» Бекомбіначтні бакторії 3 їх застосування для отримання єтанолу «1305 Вір «1502 10 «ї70» Басепттй узхвістпо3,3 «тій» 1 «8112 5357 «віх ДНК «2135 Штучна послідовність ос «два» ! : «223» Геном р. Вайіодухапеа Кі. Послідовчості 5! «Од» 1 срооссоусог содвассесу Ссоссдссао адссспобесо басссесоцо зсаєдассса 65о цессаїЕссї сесосовосеа цдоберісосо ссссодадсдов Зак рткЕсаде састастоацу 123 спачахєсаає ссспсзсось собсЗсвЧса соссоїставаа дбуусосода сосусттосе 18585 суасусчеця сіддсодесеа ссоасаєцає судсодвоссує ососучЧеасая стссссаєцу 40 чдусоадсадс ЯдЕсасусєсцев бсасбусосов ссспоудеке стссвзаєце бсуладасає 320 сзаєтссаво сдпсстскосзЯ чЧетдЧасссо соувссоєтас сазвадссяос Бастоосооо 3655 спассссакс асудфучевоис сосасоеуде сосауссаєво дасосасасс гдасссвуче 120 псдсасосаєс ссусвуудеа суссоочваса сьсектсарс одосвусвуса ссбачавасх а8О спстсдцасосазт сЧсусадвас сапеоскссто субасессхоя чуаосасаса ззеЕчала 557 «їх «211» 518 «ій» ДЕК «132 Штучна послідовність «Сип «Вей» Генсве Б. Вадіоботайв о Ві. Поспідовноєті 3 «ах 5 сддагсоаос вашсассосос сСвазеаїсцає дацдосассо дсазсассус саосацевес во акссачузсов засузаесас сстастасддс ассчссусад сдсесоссся састсассдад 128 сессцедстцо дЕдасочЧеог саесутсово асоуєседео сдссдасессо сааасасуоє ї8о чЧедвдссссв дестоасодсоп соБсссцссс собсасудоу Єусєсєссас ссбосвессос 240 зачекчассая зсдассваса асадаауесо увасацезея сеоуцаєсї всдсудевее ЗО звасадсвоас ссуусссоєв асоссувсяс пссадасеої стасододву дочсачссос зка ссзвесуссЕ Чдедссссаес ссссассссу асозочосча зассусезео Зчсудовеою «20 сзасссаосе сасасзудоа дуссодуєвад ссаддаєксо дувасесасу сосдусаваа «ва авсоассассса доадавсоссс уссуадезус асчссочачія сосовсувос чдссоасосав що сочасссузу ссччуосчсоадо саазстсцодс сдосовзаєву дачавсесосо дасассосос 5БО0 соесеЕсасксв одоцЕ 515 «105 З
«21ї» 1707
«ах НЕ.
«вах Штучна послідовність й «ей
«223 Послідовність нуклаїнової кислати рана ЯшрОоС чапОх 3 зсцастсаеаєсв ссчукедовас скасттазчеч чадедуєсссе всесадчаєкує бесксавуцсде 50 дасетвсЗсад ссачсдацчеда ссасявесто чЕсскесско всазессЗсї сесуавсава 149 звасзесозвас аачгоасст сочсвасова седчавсооса ЗзУсЕслосуєС вазазастає і183 ссесЧсасса васососвос азусадосабо Чдебсасосасв ссосцтсодіос особі свсоаса 259 ктсдасоока гсудсяпсус ссасосауяна агсоксссоя ставоссває сєссадсосу 300 росдвасавов ахдаксасас Есссссссає чес сасаєс асасуссрусє садввассоас зво ївхсастаєс воссодаває ддосязсавс згссасудесо ссзссбдавос двсстасасс 425 ссудлаздааш стсооустав аабодасовс зЕЧавтсназа ссзсссвсо сдговадаао 4580 ссадессакс сСссаввссоЯє сідсаясаєт зсесссаєас сстуссєсує ссстчаассу Бай псавосуває садхесавіца созвшескує часззадстс схсссвзасуєс восауєсессваа оо чагассостса васгсассус Сеассостас аавабевсосу госпісусоаа саосзадста во сдсусавоето човдстсзада азорустУєє ваассєЗсва застосу созсоасавье 720 врвастаец скоекасява вастесктссве ссздвадавза асссоосаєса сзезодсасе 789 ксасодочсо зауссвассв сесодусуєє давааовоув совавоваде сувсоесоуєе 84 зесостссва сессвасоке бсвзассастає бссабсасся шстушасоща састсстчає асо сссавзаває басетсссас бсавсоаспє сосасссссп сбавсочевЕ соепсебсосс 950 ачсціссаєс гцааввсвста Ксгзассрає стодсісвче задскстссаа Чазвасосоє т020 чсассадасе боссісвааєт себсаватсоса сдптдвассча адавачосЯяо босодссове това сачачкасто сассусссва сдсаздаваєо досседссвод седавоєсоє ЕсгсасоосЯ 1150 даасасчаєсод Евасбостоав звассчабдає хсІБоЧєтсва асдстсвося сасовадесс 1200 сезавсцасо сгсоссстда втасуавзасо свабосодсс асассуяеєсо дсссассосе 1250 дососсткод чітабассоуї сеабоссосу даасобсаса асаєсстсає чес овесаєх ТЗ20 чаті осттсс воассодасуцо всвбдазоєв чЧерсацаєчо соссссстова астчссудчеов І380 агсасстжосс гсасозатаа зпабсоаЗссас ассассоуавау Ссабсдчатосв Єдасазвсосо ТАКО тасвасавса сСсзацавстч здпассасдес Чоссгдаєаа аадтасссав сачезасучі 1550 зчЕкаєцасз доспсточстоо базапдосто запастазаа седоатодсда асеудсачав 1550 чесассаачч сСтузсссозус ваасасодає чдчусссавсос Есвтїсдсвов сссоазбоаУє 1620 счссазуаст зсвссувача абтудссава созоусвадо зс9кБосгос соссавсвас во сочкавчоссв ствасвауєск сеобокад Мо «ій» 4 «гів 1152 «ВІ2 ДНЕ «21й» Штучна послідовність хво» «2335 Лосліцовність нуклеїнової кислоти рена єюдОнН їх «айд збадежезсв сааствсЕса свВсеесрЕКо цссаводаза саЗЧодаата сссчсссува БО «вадсваєсв зучаїссЕєваа сосозусосо сЕсТазазеста састцчавсяе єкебонбоее 159 тесвасЗайса зассезакоає косчааосав уссоаседЧасс сессогзазс везувусаєє ї82 аавткехсустт ктсасвасаа сессасасоу вассодаста бсасспсацчє кессаавауа 240 шссСвазцасос ссазацаєав свзасєсвзуао Єбвсассаєсі ссссозусУ сода есвосе Зоо савєсасрчсо Ссевзуссає сусьстоабЕс Зсвассаасо зсодснваЗ сваваассас збо чааоугаєсу асаваєстав двевсеуусс стосесссЧа босбсаассва свсозсовссе 4253 зеттватсазчсс ссочававссає чеовсЕсвЧе астсаксаєссу асавазссоя схсасаєтаво: зно закоуессастЗ сесассцеса суєсвессссос абоЗсстссЯ сбсавсцаїсс ссокоссовох чо педа кагсс савазачесе дасососасе асепататоад ахзасусстуве ссасдсаєхке ОХ чавасксаКЕ сссосвасоцо зустассссвсо абсассовсу себасасієЄ сававусвосх БО
Бссаєсчаєся сбазазаєесх чаговссясі гусчасався ддсгазодасає чосудосЯв 720 чазчстасау сьгасоссса абссстсуцсев дагтасччсся ссвасаводсе скоаесвсоуЕ 758о єзтасосата ссасуусвся ссачсбдуєи Здобсвассбаса восгоабсаса соч ссщо 850 азсосстдеєкео сасесевуса буссссоцоуєт тасвассосє стсессдесос стосеасова о аазсвсЧїєта чкЧсгостат састессдає ассЯссваєсс базова воавадсуєса зо свадесвоса БрсашаскУє соОсечдаєсоса чссусссссв сучас сс аусвавосву. 1020 асеоачосоЗ зкоссвадаа взчдавачавоєсо соУстЕсеко сеЕаєсасує ксеваачає ОО аебсЧечсос єцассвасос сеобсапачс чассвоваву ааусссвадеа асесвссоста ДАО васосвексо ав 1157 «рідх 5 хаті» 27
«роя ДНК крІах ЩШвучна послідовність киг0? «2235 ОЗ «Ой 5 . гісосоцссь чочбсаксасу ке 22 «210х 5 «йті» 31 «122 ДЕК «213 Штучна поснпідовність І «Ед «сиг ВО3ЙВ «05 я стсчавеест ссвовассосє сспрсосоето с зії «в «МЕ 32 коїше ДНК «2332: Штучна послідовність «Еш» са?» ЖКОЗЗЕ «4005 7 чвззадвІсосп ссаЧасчсЯ адваєсаков сто 2 «во В «г21їз 45 «відо» ДНК «13» Шеучна побСлідовність
ЕзЗО» І «РЕ БазЗЯвВ «кап в соссосвсво бос сос вагоавасааа васааасазва соесее 45 «го» З «12 1 «вій ДНК «вій Штучна послідовність «йец» «23» КОЗАК «дО» 8 - чачассосаа Епдвасовує задесдосзсяс со зх соках 10 «вії» т «війт ДНК «рії» Штучна послідовніств кор» ї «?23з КОаЗбВ. «Оз ТО всчсусададс завуцоасаас а ах в йо за: дою. Батн г з я рай я є т, КК й . шт г ко ср бен У :
Еш ТМ ї о итьивав
Тер кон нев вари за внаа В
Фіг. 1
(81 Геномні координати 23. гайіобцтану В: 2362359:2302595 ,
ТТССССОССТОБСТАТСДССТоСССОССАСАВССОСТСТОТАОСТВОБОСОСАТоАСОСА
ОСоСотТтТСтТссоттсСсоосСтостТІСосттТесссеоосАеотттусАоСсСАстостося
СОССАТССАТІТСТОВСОоСстТосТосттосАСоСссттоавотоссвоооВсОСОСтІоЄ сСебсососоостосоастевсесАсстТовссвАСсосСссесосостоосоостоссвАсо оотовОСсосоотосАсесобАТСсВТОСССвАСССвОВОСТаСТОСАВАСОСТООААвАСОС
СЄАТТССААССООСТСТСОВООСТВАТОСВОБАСВОТОАОСАВвОоСодОоСстТастоотТово
СПАТСССАТСАСОвВОСТОСТОовАСОСВОСОСОбОСсТООООСОСОБАССТОАТССТОВЕ
СВОСАСССАСССССАСВОСОСОСТООААСАСТТТТТСВТСООСАССАсСОСовАВВАОСЯ
ПОРО ССОСАССОСОБТОССОСТОСТоТОСОТОССстовОпАВСАСАСАСАТОААА (Б) ГСеномні косрлявати 7). гафіодйнтаня НА: 2353484-2354098
ТОБААССАССАССТОСОСОССАДВАТОССАТОВОСОСАСОСОСАВСОССОССПОСАССАТСАТСО
ДОСОСВАБСССОССАССТАСТАСООСАТОСОСОСОССОСТСОСССОСАТОАСССАВОСССТОСТ бЕСТОАСОВОСОСОСССТОСТОАСССТОАОТОСОССОАССССССЛАТАСОСССТОоВОССТОДОС стососбеототостооессстодоооостостоТссАСОСТОСАССССВАбСТОвССОВоСЄВеЄ
АССААСАСААССТООААСАСЛОТОССВОсСтОСТОСосБОсттоААасАВСАССТоСССОтОоТо
АСОСОсАСаСтТоСАВАССОТСТАСВОСОЗОбСВСАВССОСтТовАСТООСТОТОССТОСОСОоСо
ВЕСССВАССАСОСССАВАТСО ОСС ПОСОССАСОСТОАТССОССТООСоСАСВСоСОоССвОво
ВСТОСОБАТТСТООААСТоАСоССоСТСААААосоСАССсСАсССТВСОСССОоСОСВОоССссВВ еССАСТОВОТОВОСОСО ССС ОООСТСАТОВАССТОАОСТОВООСООССкАСТОВОВСТОСОСЬ
АТОБССААСТОоССсАСАССССВБОСОСТЕТОСТОАОоСоТ
Фіг. 2
Кепактатеде ірогеназа рт Ж ня те ; ЕН НК о Гоа енаня готов чт 5 чи Цільова область ДНЮ Дівінасевеня Клен
ЮК, Кі РО СК ВК 2 Й дихого лий хромоєота '
ЕВ Її ке РОоКАОноя у «Поляійний кросинговер: клю М Гео -М ОН ЗБ » Я
ВВА і ОН
Послідовності 2ИРОСіаВ І йтАБНВ (а) Сеномні координати 2утотопах товнія вмбхр. Мова ЯМ: 1375111 1373405
АТОАОТТАТАСТОТСССТАССТАТТТАССССАОСООСТТОТОСАСАТТОСТСТОААВСАТСАСТТСОСАС
ТСОСОООСОВСТАСАВССТОСТОСТІСТТОАСАВССТОСТТТТОААСАЛААВСАТОСАССАОСТІТАТТО
СТОТААССАВСТОВАСТОСОСТТТСАОТОСАОАЛОСТТАТОСТОСТОССАААООСВОАОСАССЬВССОТО
СТЕАССТАСАОСОТСОСТОСОСТТТССОСАТТТОАТОСТАТОСОТООССОСТАТОСЛСАААДССТРОСВО
ТТАТССТОВУСТССОСТОСТОССААСВАСААТОАТСАСССТОСТОСТСАСОТОТТОСвТОАСоСТСТТО
САААВССВАСТАТСАСТАТСАВТТОСВААТОВОССААСААСАТСАСОВССОССОСТАВССОАТТТАСАСС
ПССОПААСАВОСТОССССТАВААТОСАТСВОСТСАТТАВААСТОСТСТТОСстТоВОоааСАВеСОоСтттТАТС
ТСОААВТСОСТТОСААСАТТОСТТОСАТОСССТОСОССОСТОСТОВАССВОСЛАБСОСАТЕСТТСААТОА
СЕКАОССАССОАСОАЛОСТІСТТТОААТОСАВСОС ТТ С АЛОАААСОСТОВААТТСАТСОССААСОСССАС
АХАСТТОССОТССТСОТОСОСАОСАВОСТОСОСОСАССТОСТССТЗААПААССТОСТОТСАДАТРТОСТО
АТОСТОТСОСТООСОСВСТ ОСТ ВООАТООСТОСТОСВАВАВОСТЕСТТОССЬОСААВАААВОССОСЬТТА
САТОБОСАССТОАТООВОТОААОТСВОСТАТОСОСОСО ТТ ОААААОАССАТОАЛАСААССОСАТОССОЇТ
АТСОСТОТЮСТОСТОТСТІСВАССАСТАСТОСАОСАСТОСТТОВАСОСАТАТТОСТОАТССТААСАКАС тОСТТОТСОСТОААССОСОТТСТОТОО СОТ ТАС ССАТТСОСТТОСОСАОСОТСАТСТОААВСАСТА
ТСТОАСССОТТТООСТСАСАВАСТ ТО СВАСАХААСОСОТОСАТТОВАСТТОТТСАВАТСССТСААТОСА
ОССТОААСТОВАБАВАСССОСТОСООСТОАТОССАСТОСТОСОКТОСТОВАСОСАСВАТСОСОССтТеоо
ТОсСААССТОСТТСТОАСОСССАВСАССАССОТТАТТОСТОВААССОСТОАСТО ТТ ОСТ СААТОСТСВОоСо
САТСВАССТОСССААСССТОСТССОСТТОААТАТОВААТОСАСТОСОСТСАСАТТООЕТОСТОСОТТоС
ООСОССТТСООТТАТОССОТОООТОСТОСООАВССТСОСААСАТССТСАТОСТТОСТОоАТОСтТТоСтТТоС
ВОСТОАСОБСТСВАСОААСТСОСТСАЗАТОСТТСОССТОАААСТОССОСТТАТСАТСТТСТТСАТСААТАА
СТАТООТТАСАССАТОВААОТТАТОАТОСАТОАТООТОСОТАСААСАВСАТСАВОВАСТОООАТТАТОСО
ОСТОТОАТОСАЛСТОКТСААСОСТААСООТОСТТАТСАСАОСОСТОСТОСТАААСВОСТОВАСССТААВА
ССОСТОБСОВАСТОБСАСААССТАТСААССТТОСТСТОССЬАВСАСССАССОСССААСОСТОАТССААТО
СТТСАТСОСТССТОААСАСТОСАСТОВАОВАТТССТОВААТОСССТАСОССТТВСТОССОССАВСАЄС
СОТАОССТОКТВАСАВОСТОСТСТАЄ
Фіг. 4
(8) Геномні координати гутотоенах торік вабяр, Моріня ЯМА: 1634679-1635830
АТОССТІСТТСААСТТТТТАТАТТССТТТСОТСААСОВААТОСОССАЛОСТТООСТІСАВАВАССААТСВ.
АБОДТСТТААСООСАОССОСТЕТАААААТОСОСТОАТССТТТОТОАТОСТТТОВАТОААСАААТССоВОоТОЇ
ТОТЧАВОСАИСТТОСТОАССТОТТОАААОСАСВОСОТАТТААТІСТОСТОТТТАТСАТОВОСТТАТОСОЯ
ААССОСАСТОТТАССССАОТТСТОСААСОССТТААСАТОСТОААБСАТААСЛАТТСВСАСТЕСОТСАТСЯ
СССТОбОтОсТОоСТІСтТоСосАТОАСТОСОССААЛОССАТСОСТОТОСТООСААССААТОСТОСТоААОоТ
САДАСАСТАССВАССТАТССАСАЛАТСТААСАВАССТОСССТОССТІТОАТОТСВАТСВВСАССВСОСТ
ОСТАССОСТТСТОАЛАТОАСОСОТТТОТОСАТСАТСАСТОАТОВАСТОСОТСЬСОТТЛАСАТОВССАТТИ
ТТОАССИТОАСОТТАССССОАТОСТТТСССТСААСОАТОСТСТОТТОАТООТТООТАТОССАВАВОВССТ
ПАССОССОССАССОСТАТОСАТОСТОТОДСССВСОСАТТТСААОСТТАТТСТТСААОСоСАЄСТАЄТОСО
АТСАСССАТОСТТОСОСТТТОВВАССАССТІССАТОАТСОСТАДОЛАТОТОААСАССОСТТОССВСВАОС
СТААОСАТАТаСОСООСТСОТОААССТАТОЮСТТАРОСОСАВТТОСТООСТООТАТОВССТТСААСААСОС
ТТСОСТТОСТТАТОТОСАТОСТАТОССТОВССАОТТОбОСОСТТАСТАСАВССТОССССАТОСТОТОТОС
ААСОСтТатТтсТОСТТССОСАТОТІСТОоССТТАТААСОССТоТатОвттТОстатТоОТстЗАвАВАССТТО
ОТОТТОСТАТОООТОТОСАТАТОСОСААТСТООСТОАТАААСКАВОСОСАВАЛОССАССАТТСАСОСТОЇ
ТСОССАТСТООСТОСТІССАТТОСТАТТОСАОСАААССТОВСССВОСТОСОТОСТАВОВААСААСАТОТО
ССОСТІСТТОСТОАССАСОСТСТОВААПАТОСТТОТОСТОТОАССААСССОССТОАООСТЗАТСАСАААЙ
ВАСТТСВАСААСТСТТОСТСАССОСТТТСТАК
Фіг. 4-продовження й удо ах
Бані рр Кевдаі дя ве Р ніж да оз ; рт Тет: і Ну еся Тех з ся ; з . ! ; І 4 а с-г вир В) С не
Я | я І у І Й т»: я « що Як я ит тку й с те: Ше ШЕ вир 0 фФЗ(Менег зкалию 1992 Яся ши У В с ММ В пл ще рек бояров ріж скітнх педнк 9
Шк З я. так я Кран ее ей рок ОСтон бух вич різбнеевревіеАоне я ве.
Вт ст
З; : їхтяй. -й сану ат вк щі. змі Він РБК мікка т Мити а : ок ет їжте ще : У. ке ся Тен (0) чт рмлютьни (в) 00 Ул ню з. У че й - пх жк хх ж я Я в а пе и т 7. бані ці ша ' ї і : і
Бей: щи сн ! Мк пря, ди ; ся і Ед (Вадень я МБЖея, 1990) як се ВІЗ Первреех ваі Міг, 052 о «як бі, лав у и яко ве бшко баки
І з Тех зи не іль її р. нк конк р вк р вен де вки ще г Ал Як тн; ;. вив і й. т ВІЗОРЄТЬАрН я се МеОВР: оба тАСНЬЯ ня
У ння СК - | в ВИ з 2 бик І ка «ріг. 5 а Б ві Ов-еоРОстечАВН ззсвеної У ОМ ЕС в Ре АЇЖНИЯ вав ; З лквом БІК . 5 6 НО З Б: Ще п ЩЕ 82 г я т ЗДО ей ПИ св Е і ; аа ОАЕ ше т
ШЕ но, вв оо ВН ШЕ ех З е їй у Ин її й Ж сення Же 0000 БАС 0: ши: 00 а: ШИ г а ж ШЕ дев й Тхафрія (кн За-ОАКа-Яу (клі ПОЗА)
Фіс. 6
Глюкоза ій , у Ро кон
Лактат ж БИруват о сен Аретвльнегій о 000 Етанол 4
Ацетип-свА
Анетат
Фіг. 7 во За вані РКДА вив яр 2 » Тен. Че я | вра й и - ща я 1316 Й з ї : К веб дані РЕА ре лк 73 Тевірня їжте ге які - Я дення -к ши и ен
Фіг. 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09160284A EP2251415A1 (en) | 2009-05-14 | 2009-05-14 | Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol |
| PCT/EP2010/056592 WO2010130806A1 (en) | 2009-05-14 | 2010-05-12 | Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA104467C2 true UA104467C2 (uk) | 2014-02-10 |
Family
ID=41110522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201114836A UA104467C2 (uk) | 2009-05-14 | 2010-12-05 | Рекомбінантна бактерія deіnococcus та її застосування для одержання етанолу |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9034619B2 (uk) |
| EP (2) | EP2251415A1 (uk) |
| JP (1) | JP5766181B2 (uk) |
| CN (1) | CN102421890B (uk) |
| AU (1) | AU2010247330B2 (uk) |
| BR (1) | BRPI1010810A2 (uk) |
| CA (1) | CA2760727A1 (uk) |
| DK (1) | DK2430150T3 (uk) |
| EA (1) | EA024979B1 (uk) |
| ES (1) | ES2642795T3 (uk) |
| UA (1) | UA104467C2 (uk) |
| WO (1) | WO2010130806A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201108288B (uk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2923491B1 (fr) * | 2007-11-14 | 2012-12-14 | Deinove Sa | Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie |
| EP2210935A1 (en) | 2009-01-19 | 2010-07-28 | Deinove | Methods for isolating bacteria |
| EP2218773A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Deinove | Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass |
| EP2251414A1 (en) | 2009-05-14 | 2010-11-17 | Deinove | High performance metabolic bacteria |
| EP2251415A1 (en) * | 2009-05-14 | 2010-11-17 | Deinove | Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol |
| BR112012022197A8 (pt) | 2010-03-02 | 2018-01-02 | Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs E Univ Montpellier I | Bactéria e os usos desta |
| US8592695B2 (en) * | 2010-11-30 | 2013-11-26 | Jose Maria Las Navas Garcia | Stackable crucible, a system using a stackable crucible, and a method of using a stackable crucible |
| DE102011077705A1 (de) | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Evonik Degussa Gmbh | Mikrobielles Verfahren zur Herstellung niedermolekularer, organischer Verbindungen umfassend die Produktabsorption durch Isophoron |
| ES2396823B1 (es) * | 2011-08-18 | 2014-01-28 | Iden Biotechnology S.L. | Producción de biodiesel a partir de glicerina. |
| US9175316B2 (en) * | 2012-12-12 | 2015-11-03 | Ebio, Llc | Efficient production of biofuels from cells carrying a metabolic-bypass gene cassette |
| MX350802B (es) | 2011-12-23 | 2017-09-25 | Deinove Sa | Bacterias y usos de las mismas. |
| JP2015502168A (ja) * | 2011-12-23 | 2015-01-22 | ディノベＤｅｉｎｏｖｅ | 再構成された転写ユニットを有する細菌及びその使用 |
| WO2015092013A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Deinove | Is-targeting system for gene insertion and genetic engineering in deinococcus bacteria |
| TWI541353B (zh) | 2014-12-25 | 2016-07-11 | 財團法人工業技術研究院 | 產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之胞外蛋白的方法 |
| ES2843632T3 (es) | 2015-02-16 | 2021-07-19 | Deinove Sa | Vía de asimilación de la L-arabinosa y sus usos |
| EP3348646A1 (de) | 2017-01-17 | 2018-07-18 | Evonik Degussa GmbH | Mikrobielles verfahren zur herstellung von aceton, isopropanol, butanol und/oder ethanol umfassend die produktabsorption durch wasser |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2102690A (en) * | 1936-05-21 | 1937-12-21 | Albert T Fischer | Article holder |
| US5482846A (en) * | 1988-08-31 | 1996-01-09 | University Of Florida | Ethanol production in Gram-positive microbes |
| US5000000A (en) * | 1988-08-31 | 1991-03-19 | University Of Florida | Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes |
| WO1997010352A1 (en) | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Processing of cellulosic materials by cellulase producing bacteria |
| US6102690A (en) * | 1997-04-07 | 2000-08-15 | Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant organisms capable of fermenting cellobiose |
| WO2001023526A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | The Henry M. Jackson Foundation | Engineered radiation resistant bioremediating bacteria |
| CA2424890C (en) | 2000-10-06 | 2014-06-03 | Elsworth Biotechnology Limited | Ethanol production in gram-positive bacteria with a stabilized mutation in lactate dehydrogenase |
| AU2002225323A1 (en) | 2001-01-26 | 2002-08-06 | Prokaria Ehf. | Accessing microbial diversity by ecological methods |
| JP3845697B2 (ja) | 2002-02-22 | 2006-11-15 | 独立行政法人 日本原子力研究開発機構 | 放射線抵抗性細菌／大腸菌シャトルベクター |
| JP4294373B2 (ja) * | 2003-05-23 | 2009-07-08 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | エタノールの新規製造方法 |
| GB0511602D0 (en) * | 2005-06-07 | 2005-07-13 | Tmo Biotec Ltd | Microorganisms |
| WO2007128338A1 (en) * | 2006-05-10 | 2007-11-15 | Deinove | Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system |
| KR100836093B1 (ko) | 2007-02-01 | 2008-06-09 | 한국생명공학연구원 | 신규한 데이노코커스 종 ａ2 및 이를 이용하여아스타잔틴을 생산하는 방법 |
| FR2923491B1 (fr) * | 2007-11-14 | 2012-12-14 | Deinove Sa | Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie |
| EP2210935A1 (en) | 2009-01-19 | 2010-07-28 | Deinove | Methods for isolating bacteria |
| EP2218773A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Deinove | Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass |
| EP2251414A1 (en) | 2009-05-14 | 2010-11-17 | Deinove | High performance metabolic bacteria |
| EP2251415A1 (en) * | 2009-05-14 | 2010-11-17 | Deinove | Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol |
| BR112012022197A8 (pt) | 2010-03-02 | 2018-01-02 | Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs E Univ Montpellier I | Bactéria e os usos desta |
-
2009
- 2009-05-14 EP EP09160284A patent/EP2251415A1/en not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-05-12 BR BRPI1010810A patent/BRPI1010810A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-05-12 JP JP2012510305A patent/JP5766181B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-12 ES ES10718614.0T patent/ES2642795T3/es active Active
- 2010-05-12 CA CA2760727A patent/CA2760727A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-12 US US13/319,526 patent/US9034619B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-05-12 AU AU2010247330A patent/AU2010247330B2/en not_active Ceased
- 2010-05-12 DK DK10718614.0T patent/DK2430150T3/en active
- 2010-05-12 EP EP10718614.0A patent/EP2430150B1/en not_active Not-in-force
- 2010-05-12 WO PCT/EP2010/056592 patent/WO2010130806A1/en active Application Filing
- 2010-05-12 EA EA201101627A patent/EA024979B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-05-12 CN CN201080020915.9A patent/CN102421890B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-05 UA UAA201114836A patent/UA104467C2/uk unknown
-
2011
- 2011-11-11 ZA ZA2011/08288A patent/ZA201108288B/en unknown
-
2015
- 2015-05-15 US US14/713,248 patent/US9725741B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9034619B2 (en) | 2015-05-19 |
| CN102421890B (zh) | 2015-11-25 |
| US20120058533A1 (en) | 2012-03-08 |
| BRPI1010810A2 (pt) | 2015-09-08 |
| EA024979B1 (ru) | 2016-11-30 |
| AU2010247330B2 (en) | 2016-01-28 |
| EP2430150A1 (en) | 2012-03-21 |
| AU2010247330A1 (en) | 2011-12-01 |
| DK2430150T3 (en) | 2017-10-30 |
| EP2251415A1 (en) | 2010-11-17 |
| US9725741B2 (en) | 2017-08-08 |
| WO2010130806A1 (en) | 2010-11-18 |
| ZA201108288B (en) | 2012-08-29 |
| EA201101627A1 (ru) | 2012-04-30 |
| ES2642795T3 (es) | 2017-11-20 |
| CN102421890A (zh) | 2012-04-18 |
| JP2012526537A (ja) | 2012-11-01 |
| CA2760727A1 (en) | 2010-11-18 |
| JP5766181B2 (ja) | 2015-08-19 |
| EP2430150B1 (en) | 2017-07-19 |
| US20150247167A1 (en) | 2015-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA104467C2 (uk) | Рекомбінантна бактерія deіnococcus та її застосування для одержання етанолу | |
| Ko et al. | Tools and strategies of systems metabolic engineering for the development of microbial cell factories for chemical production | |
| Riley et al. | Approaches to genetic tool development for rapid domestication of non-model microorganisms | |
| EP3387571B1 (en) | Microbial strain improvement by a htp genomic engineering platform | |
| Choi et al. | CRISPRi-dCas12a: a dCas12a-mediated CRISPR interference for repression of multiple genes and metabolic engineering in cyanobacteria | |
| JP4801151B2 (ja) | 不活性化された乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する改変微生物 | |
| US11549096B2 (en) | Genetic perturbation of the RNA degradosome protein complex | |
| KR102345899B1 (ko) | 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 | |
| WO2018226893A2 (en) | A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa | |
| US20210254080A1 (en) | Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production | |
| WO2008024129A2 (en) | Synthetic genomes | |
| KR102345898B1 (ko) | 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 | |
| JP2008539710A (ja) | エタノール生産用の不活性化乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を有する好熱性微生物 | |
| Susanti et al. | A genetic system for Methanocaldococcus jannaschii: an evolutionary deeply rooted hyperthermophilic methanarchaeon | |
| US20200102554A1 (en) | High throughput transposon mutagenesis | |
| JP2022528894A (ja) | 第二世代の糖から化学物質を生成するためのキシロースおよびグルコースの同時消費のための代謝工学 | |
| Pembroke et al. | Metabolic engineering of the model photoautotrophic cyanobacterium synechocystis for ethanol production: Optimization strategies and challenges | |
| US9506072B2 (en) | Regulated gene expression systems and constructs thereof | |
| JPH08507931A (ja) | ストレプトミセス・アベルミティリスからの分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子 | |
| Pembroke et al. | Cyanobacterial biofuel production: current development, challenges and future needs | |
| Møldrup et al. | Engineering of glucosinolate biosynthesis: candidate gene identification and validation | |
| Shochatovitz | The Role of a MYB2 Gene in Mimulus Cupreus Petal Lobe Anthocyanin Biosynthesis: Design and Construction of a Polycistronic TRNA-gRNA CRISPR/Cas9 MYB2 Knockout Transgene | |
| Nazir | Clostridium Beijerinckii Stress Response to Oxygen: Role of an Active Heterologous Catalase on Solvent Generation | |
| Fink | Establishment of tools for genetic modification of the thermophilic methanogenic archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus deltaH | |
| US20030175854A1 (en) | System and method for gene expression in thermus strains |