TWI836069B

TWI836069B - 抗-sema3a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途

Info

Publication number: TWI836069B
Application number: TW109115394A
Authority: TW
Inventors: 里歐湯瑪斯; 瑞秋貝卡貝瑞特; 克里斯汀勞拉波瓦特; 哈庫瑪甘奈森; 普利彥卡古塔; 菲韓; 冬玫劉; 吉爾金皮斯德; 山加亞幸; 莎雅戴威文卡塔亞曼尼; 海倫海霞吳; 妮娜吉波
Original assignee: 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2024-03-21
Also published as: CO2021014768A2; US20200385446A1; CL2021002795A1; IL287758A; SA521430793B1; SG11202110842QA; TW202108621A; JP7314310B2; JP2022531698A; MX2021013671A; JP2023130473A; DOP2021000226A; BR112021019854A2; CA3137377A1; CN113795509A; PE20220287A1; US20220144929A1; MA55872A; AR122266A1; WO2020225400A1

Abstract

本發明係關於靶向信號素3A (semaphorin 3A，Sema3A)之抗體及其片段。更特定而言，揭示抗-Sema3A抗體及用於治療各種疾病或病症之方法。

Description

抗-SEMA3A抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途

本發明概言之係關於靶向信號素3A (semaphorin 3A，Sema3A)之抗體及其片段。更特定而言，揭示抗-Sema3A抗體及用於治療各種疾病或病症之使用方法。亦揭示包含抗-Sema3A抗體之醫藥組合物及套組。

缺血性視網膜病變之特徵在於視網膜血管系統之損失或功能障礙，其導致血流減少及低氧症。視網膜缺血導致促進視網膜新血管形成之促血管生成生長因子之上調，此可導致失明。然而，當存在進入玻璃體(即眼睛之通常無血管之區)之強健病理性新血管形成時，不發生缺血性視網膜之血管重建。

該等異常新血管之生長產生對視力之大部分威脅，此乃因其可滲漏、導致出血或導致瘢痕形成，此可最終導致視網膜剝離。當前對於缺血性視網膜病變之治療試圖停止病理學血管之生長，但不解決驅動其生長之潛在缺血。此外，對於糖尿病性視網膜病變之標準治療涉及用雷射破壞視網膜之一部分以試圖停止新血管生長並保存中央視力。然而，該等治療在某種程度上係低效的。儘管一些患者可維持穩定視力許多年，但高百分比之遭受視網膜病變之患者最終遭受完全視力喪失。

因此，仍然存在對有效治療眼或視網膜疾病之新治療方法的未滿足之需求。

Sema3A係屬3類信號素家族(Sema3)之內源性分泌蛋白，其最初被鑑別為軸突導向分子並涉及血管路徑形成及網路形成。神經週期蛋白1及2 (Nrp1及Nrp2)及A/D型神經叢蛋白(Plxn)在內皮細胞(EC)表面上用作Sema3受體複合物之配體結合及信號轉導亞單位。作為Sema3家族之特殊成員，Sema3A首先排他地結合至Nrp1，且然後與神經叢蛋白A1-4組合為複合物(Nrp1/PlexA1-4)。在此受體複合物中，Nrp1用作結合元件，而PlexA1-4用作信號轉導元件。

人信號素3A係如SEQ ID NO: 22中所揭示且可以NCBI參照序列NP_006071.1獲得之蛋白質。此外，人Sema3A由基因ID: 10371 (NCBI)編碼。

Sema3A在腫瘤血管生成及轉移中已經研究了多年，但其對視網膜新血管形成之效應仍不清楚。本發明者已例證信號素3A由低氧視網膜神經節細胞分泌，並用作血管推斥提示。Sema3A藉由誘導該等細胞中之細胞骨架塌陷推斥新血管遠離缺血區。不期望受限於理論，本發明者已假設此將解釋為何不發生缺血區之血管重建，且相反Sema3A之上調導致病理性新血管形成進入玻璃體區中。

信號素3A由缺血/無血管視網膜中之低氧神經元分泌，藉此抑制視網膜之血管再生並增強病理性視網膜前新血管形成。

本發明者藉由研發靶向Sema3A之抗體解決此病理情況。因此，本發明提供特異性結合至Sema3A、較佳人Sema3A之單株抗體。

在第一態樣中 ，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(H-CDR2)、及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(H-CDR3)；及 - 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(L-CDR3)。

在另一實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；其中： - 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(H-CDR3)；且 - 輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(L-CDR3)。

在另一實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10之胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 分別包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈； b. 分別包含SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈； c. 分別包含SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈；或 d. 分別包含SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。

在另一實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈，其包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列、較佳由其組成；及 - 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20之胺基酸序列、較佳由其組成。

在特定實施例中，本發明係關於抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈； b. 包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈； c. 包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之輕鏈；或 d. 包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之輕鏈。

在尤佳實施例中，抗-Sema3A抗體係人類化抗-Sema3A抗體。

在第二態樣中 ，本發明提供結合至如SEQ ID NO: 22中所繪示之人Sema3A之胺基酸區370-382內之至少一個胺基酸殘基的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在一個實施例中，本發明提供結合至如SEQ ID NO: 21 (DSTKDLPDDVITF)中所述之胺基酸區內之至少一個胺基酸殘基的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。在較佳實施例中，本發明提供結合如SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸區的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在第三態樣中 ，本發明提供用作藥劑之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在一個實施例中，本發明提供用於抑制SemaA之血管抑制效應(vasorepressive effect)及/或用於改良視網膜之血管重建的抗-Sema3A或抗原結合片段。

在一個實施例中，本發明提供用於治療或預防視網膜或眼疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在第四態樣中 ，本發明提供用於治療或預防選自由以下組成之群之疾病的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段：視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養性萎縮、近視性變性、視網膜動脈阻塞、眼內炎、葡萄膜炎、囊樣黃斑水腫、由任何視網膜疾病繼發之脈絡膜新生血管膜、視神經疾病、青光眼、視網膜剝離、毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、創傷性視網膜病變、藥物誘導之視網膜血管病變、視網膜新血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、福斯氏營養性萎縮(Fuch's dystrophy)、黃斑毛細血管擴張症、尤塞氏症候群(usher syndrome)及斯特格氏病(Stargardt disease)。

在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防選自由以下組成之群之疾病的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段：糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、缺血性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑水腫、視網膜新血管形成、青光眼及脈絡膜新血管形成。較佳地，該疾病係糖尿病黃斑水腫及/或糖尿病黃斑缺血。

在較佳實施例中，本發明提供藉由促進缺血性視網膜內血管再生(血管重建)及預防眼之玻璃體區之病理性新血管形成用於治療糖尿病黃斑缺血的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在另一較佳實施例中，本發明提供藉由降低血液視網膜屏障之滲透性用於治療糖尿病黃斑水腫的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在另一較佳實施例中，本發明提供用於抑制Sema3A誘導之血液視網膜屏障滲透性及/或Sema3A誘導之缺血性區域之血管消退的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在第五態樣中 ，本發明提供包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。

在一個實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段或包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸投與途徑、靜脈內投與途徑、玻璃體內投與途徑或皮下投與途徑、較佳藉由玻璃體內途徑來投與。

在第六態樣中 ，本發明提供一或多種分離之聚核苷酸，其包含： - 編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及 - 編碼如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列。

在一個實施例中，本發明提供包含一或多種分離之聚核苷酸的表現載體，該一或多種分離之聚核苷酸包含編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列。

在一個實施例中，本發明提供包含一或多種分離之聚核苷酸的病毒載體，該一或多種分離之聚核苷酸包含編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列。

在一個實施例中，本發明提供包含表現載體或一或多種分離之聚核苷酸的宿主細胞，該表現載體或一或多種分離之聚核苷酸包含編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列。

在一個實施例中，本發明提供產生抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之方法，其包含獲得包含表現載體或一或多種分離之聚核苷酸的宿主細胞，該表現載體或一或多種分離之聚核苷酸包含編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列；及培養該宿主細胞。

在一個實施例中，產生抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之方法進一步包含回收及純化該抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

定義

抗體或免疫球蛋白之一般結構為熟習此項技術者熟知，該等分子係異四聚體醣蛋白，通常約150,000道爾頓，由兩條相同之輕(L)鏈及兩條相同之重(H)鏈構成。每條輕鏈藉由一個二硫鍵與重鏈共價連接以形成異二聚體，且異三聚體分子經由異二聚體之兩條相同重鏈之間之共價二硫鍵形成。儘管輕鏈及重鏈藉由一個二硫鍵連接在一起，但兩條重鏈之間之二硫鍵之數目根據免疫球蛋白同型而變化。每條重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫鍵。每條重鏈在胺基末端具有可變結構域(V_H = 可變重鏈)，之後係三個或四個恆定結構域(C_H1 、C_H2 、C_H3 及C_H4 )，以及C_H1 與C_H2 之間之鉸鏈區。每條輕鏈具有兩個結構域，即胺基末端可變結構域(V_L = 可變輕鏈)及羧基末端恆定結構域(C_L )。V_L 結構域與V_H 結構域非共價締合，而C_L 結構域通常經由二硫鍵與C_H1 結構域共價連接。據信特定胺基酸殘基在輕鏈及重鏈可變結構域之間形成界面(Chothia等人，1985, J. Mol. Biol. 186:651-663)。

可變結構域內之某些結構域在不同抗體之間廣泛地不同，即係「超變的」。該等超變結構域含有直接參與每一特定抗體對其特異性抗原決定子之結合及特異性的殘基。輕鏈及重鏈可變結構域二者中之超變性集中在三個稱為互補決定區(CDR)或超變環(HVL)之區段中。CDR係藉由Kabat等人，1991於以下中之序列比較來定義：Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版^， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.，而HVL係根據如Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917所述之可變結構域之三維結構在結構上定義。在該兩種方法導致CDR之鑑別略微不同的情況下，結構定義較佳。如Kabat所定義，CDR-L1位於輕鏈可變結構域中約殘基24-34處，CDR-L2位於約殘基50-56處，且CDR-L3位於約殘基89-97處；CDR-H1位於重鏈可變結構域中約殘基31-35處，CDR-H2位於約殘基50-65處，且CDR-H3位於約殘基95-102處。因此，重鏈及輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3定義對給定抗體特異之獨特及功能性質。

重鏈及輕鏈中之每一者內之三個CDR由框架區(FR)分開，該等框架區含有傾向於較少變化之序列。自重鏈及輕鏈可變結構域之胺基末端至羧基末端，FR及CDR按以下順序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR之大部分β-片構形使每條鏈內之CDR彼此緊密接近，以及與來自其他鏈之CDR緊密接近。所得構形有助於抗原結合位點(參見Kabat等人，1991, NIH Publ.第91-3242號，第I卷，第647-669頁)，但並非所有CDR殘基皆一定直接參與抗原結合。

FR殘基及Ig恆定結構域不直接參與抗原結合，但有助於抗原結合及/或介導抗體效應物功能。一些FR殘基被認為以至少三種方式對抗原結合具有顯著影響：藉由非共價直接結合至表位、藉由與一或多個CDR殘基相互作用及藉由影響重鏈與輕鏈之間之界面。恆定結構域不直接參與抗原結合，但介導各種Ig效應物功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。

基於恆定結構域之胺基酸序列，將脊椎動物免疫球蛋白之輕鏈分配為兩種明顯不同之類別卡帕(kappa,κ)及蘭姆達(lambda，λ)之一。藉由比較，根據恆定結構域之序列，將哺乳動物免疫球蛋白之重鏈分配為五大類之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA進一步分成亞類(同型)，例如分別為IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。天然免疫球蛋白類別之亞單元結構及三維構形係眾所周知的。

術語「抗體」、「抗-Sema3A抗體」、「人類化抗-Sema3A抗體」及「變體人類化抗-Sema3A抗體」在本文以最廣泛意義使用，且具體而言包括單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，例如可變結構域及抗體中展現期望生物學活性(例如結合Sema3A)之其他部分。

術語「單株抗體」 (mAb)係指實質上同源之抗體群體的抗體；即，除了可以微量存在之天然存在之突變外，該群體中之個別抗體相同。單株抗體係高度特異性的，針對單一抗原決定子，即「表位」。因此，修飾語「單株」指示針對相同表位之抗體之實質上同源之群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。應理解，單株抗體可藉由業內已知之任何技術或方法製得；包括例如雜交瘤方法(Kohler等人，1975, Nature 256:495)、或業內已知之重組DNA方法(例如，參見美國專利第4,816,567號)、或使用噬菌體抗體文庫重組產生之單株、使用Clackson等人，1991, Nature 352: 624-628及Marks等人，1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597中所述之技術之分離方法。

嵌合抗體由來自一個物種(例如，非人哺乳動物，例如小鼠)之抗體之重鏈及輕鏈可變區以及另一物種(例如人)抗體之重鏈及輕鏈恆定區組成，且可藉由將編碼來自第一物種(例如小鼠)之抗體之可變區之DNA序列與來自第二(例如人)物種之抗體之恆定區之DNA序列連接並用含有連接序列之表現載體轉變宿主以使其產生嵌合抗體來獲得。或者，嵌合抗體亦可為其中重鏈及/或輕鏈之一或多個區或結構域與來自另一免疫球蛋白類別或同型或來自共有序列或種系序列之單株抗體中之相應序列相同、同源或為其變體的抗體。嵌合抗體可包括此類抗體之片段，條件係抗體片段展現其親代抗體之期望生物學活性，例如結合至相同表位(例如，參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。

術語「抗體片段」、「抗原結合片段」、「抗-Sema3A抗體片段」、「人類化抗-Sema3A抗體片段」、「變體人類化抗-Sema3A抗體片段」係指全長抗-Sema3A抗體之一部分，其中保留可變區或功能能力，例如特異性Sema3A表位結合。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體、微小抗體、自抗體片段形成之雙價抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。

可用諸如木瓜酶或胃蛋白酶等酶處理全長抗體以產生有用之抗體片段。木瓜酶消解用於產生兩個相同之抗原結合抗體片段，稱為「Fab」片段(各自具有單一抗原結合位點)及殘餘「Fc」片段。Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之C_H1 結構域。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能交聯抗原之F(ab')₂ 片段。

Fab'片段與Fab片段之區別在於存在額外殘基，包括C_H1 結構域之C-末端處抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。F(ab')₂ 抗體片段係由鉸鏈區中之半胱胺酸殘基連接之Fab'片段對。抗體片段之其他化學偶合亦係已知的。

「Fv」片段含有完整之抗原識別及結合位點，其由緊密、非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變結構域之二聚體組成。在此構形中，每一可變結構域之三個CDR相互作用以界定V_H -V_L 二聚體表面上之抗原結合位點。六個CDR共同賦予抗體抗原結合特異性。

「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段係包含抗體之V_H 及V_L 結構域之單鏈Fv變體，其中結構域存在於單一多肽鏈中。單鏈Fv能夠識別及結合抗原。scFv多肽亦可視情況含有位於V_H 及V_L 結構域之間之多肽連接體，以促進形成scFv結合抗原期望之三維結構(參見例如Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編輯, Springer-Verlag, New York,第269-315頁)。

其他識別之抗體片段包括包含一對串聯Fd區段(V_H -C_H1 -V_H -C_H1 )以形成一對抗原結合區之彼等抗體片段。該等「線性抗體」可為雙特異性或單特異性的，如例如Zapata等人 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062中所述。

人類化抗體或人類化抗體片段係一種特定類型之嵌合抗體(其包括免疫球蛋白胺基酸序列變體)或其片段，其能夠結合至預定抗原，且其包含一或多個實質上具有人免疫球蛋白之胺基酸序列之FR及一或多個實質上具有非人免疫球蛋白之胺基酸序列之CDR。此通常稱為「輸入」序列之非人胺基酸序列通常取自「輸入」抗體結構域、特定而言可變結構域。一般而言，人類化抗體至少包括非人抗體之CDR或HVL，其***人重鏈或輕鏈可變結構域之FR之間。

本發明闡述特異性人類化抗-Sema3A抗體，其含有源自***人種系序列重鏈及輕鏈可變區FR之間之鼠類或嵌合抗體的CDR。應理解，某些鼠類FR殘基對於人類化抗體之功能可為重要的，且因此某些人種系序列重鏈及輕鏈可變結構域殘基經修飾為與相應鼠類序列之彼等相同。

本文所用之表達「本發明之抗體」及「本發明之抗-Sema3A抗體」係指本文所述之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。較佳地，該表達係指包含以下之任何抗體：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(H-CDR3)；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(L-CDR3)。

在一態樣中，人類化抗-Sema3A抗體包括至少一個、且通常兩個可變結構域(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中所含有之可變結構域)之實質上全部，其中全部或實質上全部CDR對應於非人免疫球蛋白之彼等CDR，且在本文中具體地，CDR係鼠類序列，且FR係人免疫球蛋白共有序列或種系序列之彼等FR。在另一態樣中，人類化抗-Sema3A抗體亦包括通常係人免疫球蛋白之免疫球蛋白Fc區之至少一部分。通常，抗體將含有輕鏈以及至少重鏈之可變結構域。若適當，抗體亦可包括重鏈之C_H1 、鉸鏈、C_H2 、C_H3 及/或C_H4 區中之一或多者。

人類化抗-Sema3A抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同型，包括IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。舉例而言，恆定結構域可為補體固定恆定結構域，其中期望人類化抗體展現細胞毒性活性，且同型通常係IgG₁ 。在不期望該細胞毒性活性之情況下，恆定結構域可為另一同型，例如IgG₂ 。替代人類化抗-Sema3A抗體可包含來自一種以上免疫球蛋白類別或同型之序列，且選擇特定恆定結構域以最佳化期望效應物功能在業內之普通技術範圍內。在具體實施例中，本發明提供抗體，其為IgG1抗體，更特定而言為特徵在於降低之效應物功能之IgG1抗體。

較佳地，本發明之抗-Sema3A抗體係格式化為IgG1KO之人類化抗體。

人類化抗-Sema3A抗體之FR及CDR或HVL無需精確對應於親代序列。舉例而言，可藉由取代、***或缺失改變(例如誘變)輸入CDR或HVL或共有序列或種系FR序列中之一或多個殘基，使得所得胺基酸殘基不再與任一親親序列中相應位置中之原始殘基相同，但抗體仍保留與Sema3A結合之功能。該改變通常並非廣泛的，且將為保守改變。通常，至少75%、更通常至少90%、且最經常大於95%、或大於98%或大於99%之人類化抗體殘基將對應於親代共有序列或種系FR及輸入CDR序列之彼等。

影響重鏈及輕鏈可變區之間之界面(「V_L -V_H 界面」)之免疫球蛋白殘基係影響兩條鏈相互之間之接近或取向之彼等。可參與鏈間相互作用之某些殘基包括V_L 殘基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及V_H 殘基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103 (利用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)中所述之編號系統)。美國專利第6,407,213號亦論述諸如V_L 殘基43及85及V_H 殘基43及60等殘基亦可參與此相互作用。儘管該等殘基僅適用於人IgG，但其跨物種亦適用。選擇合理預期參與鏈間相互作用之重要抗體殘基用於取代至共有序列中。

術語「共有序列」及「共有抗體」係指包含在任何特定類別、同型或亞單元結構之所有免疫球蛋白中之每一位置最頻繁出現之胺基酸殘基的胺基酸序列，例如人免疫球蛋白可變結構域。共有序列可基於特定物種或許多物種之免疫球蛋白。「共有」序列、結構或抗體應理解為涵蓋如某些實施例中所述之共有人序列，且係指包含在任何特定類別、同型或亞單元結構之所有人免疫球蛋白中之每一位置最頻繁出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。因此，共有序列含有在每一位置具有存在於一或多種已知免疫球蛋白中之胺基酸的胺基酸序列，但其可不與任何單一免疫球蛋白之整個胺基酸序列完全重複。可變區共有序列並非自任何天然產生之抗體或免疫球蛋白獲得。Kabat等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.及其變體。重鏈及輕鏈共有序列之FR及其變體提供製備人類化抗-Sema3A抗體之有用序列。參見例如美國專利第6,037,454號及第6,054,297號。

人種系序列天然存在於人群體中。彼等種系基因之組合產生抗體多樣性。抗體之輕鏈之種系抗體序列來自保守之人種系κ或λ V基因及j基因。類似地，重鏈序列來自種系v-、d-及j-基因(LeFranc, M-P及LeFranc, G, 「The Immunoglobulin Facts Book」 Academic Press, 2001)。

「分離之」抗體係已經自其天然環境之組分中鑑別及分離及/或回收之抗體。抗體之天然環境之污染組分係可干擾抗體之診斷或治療用途之彼等物質，且可為酶、激素或其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一態樣中，抗體將純化至按抗體重量計至少大於95%分離。

術語「抗體性能」係指有助於抗體識別抗原或抗體在活體內有效性之因素/性質。在較佳實施例中，其係指抗體防止視網膜細胞中細胞骨架塌陷之能力。抗體之胺基酸序列之變化可影響抗體性質(例如摺疊)，且可影響物理因素，例如抗體與抗原結合之初始速率(k_a )、抗體自抗原之解離常數(k_d )、抗體對抗原之親和常數(Kd)、抗體之構形、蛋白質穩定性及抗體之半衰期。

如本文所用，在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致」或「一致性百分比」係指當為了最大對應性進行比較及比對時，相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基的兩個或更多個序列或子序列。為了確定一致性百分比，將序列比對以用於最佳比較目的(例如，可在第一胺基酸或核酸之序列中引入缺口以用於與第二胺基酸序列或第二核酸序列進行最佳比對)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性百分比係該等序列所共享之一致位置數之函數(即，一致性% =一致位置數/總位置數(例如重疊位置) × 100)。在一些實施例中，若適當(例如，排除延伸超出所比較之序列之額外序列)，在序列內引入缺口後，經比較之兩個序列具有相同長度。舉例而言，當比較可變區序列時，不考慮前導及/或恆定結構域序列。對於兩個序列之間之序列比較，「相應」 CDR係指兩個序列中相同位置中之CDR (例如，每一序列之CDR-H1)。

兩個序列之間之一致性百分比或相似性百分比之測定可使用數學算法來完成。用於比較兩個序列之數學算法之較佳非限制性實例係Karlin及Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268之算法，如Karlin及Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中所修飾。該算法納入Altschul等人，1990, J. Mol. Biol. 215:403-410之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程式(評分=100，字長=12)實施，以獲得與編碼所關注蛋白質之核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)實施，以獲得與所關注蛋白質同源D胺基酸序列。為了獲得用於比較目的之缺口比對，可如Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所述利用缺口BLAST。或者，可使用PSI-Blast以實施檢測分子之間之遠端關係之迭代搜索(同上)。當利用BLAST、缺口BLAST及PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之缺省參數。用於比較序列之數學算法之另一較佳非限制性實例係Myers及Miller，CABIOS (1989)之算法。將該算法納入ALIGN程式(2.0版)，該程式係GCG序列比對軟體包之一部分。當利用ALIGN程式比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、12之空位長度罰分及4之空位罰分。用於序列分析之額外算法為業內已知且包括如Torellis及Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中所述之ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8中所述之FASTA。在FASTA內，ktup係設定搜索之靈敏度及速度之控制選項。若ktup =2，則藉由觀察比對殘基對發現所比較之兩個序列中之相似區；若ktup =1，則檢查單一比對胺基酸。ktup對於蛋白質序列可設定為2或1，或對於DNA序列可設定為1至6。若ktup未指定，則缺省值對於蛋白質為2且對於DNA為6。或者，可使用如Higgins等人, 1996, Methods Enzymol. 266:383-402所述之CLUSTAL W算法實施蛋白質序列比對。

本文所用表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包括其後代。因此，「轉變體」及「轉變細胞」包括原代個體細胞及自其衍生之培養物，而不考慮轉移之次數。

出於治療目的，術語「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人、家畜及農場動物，以及動物園動物、運動動物或寵物動物，例如狗、馬、貓、牛及諸如此類。較佳地，哺乳動物係人。

本文所用之「疾病」或「病症」係任何會受益於本文所述人類化抗-Sema3A抗體治療的病況。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論病症之彼等病理狀況。

術語「玻璃體內注射」具有其在業內之正常含義，且係指將抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段引入患者之玻璃體中。

術語「皮下投與」係指藉由自藥物容器相對緩慢、持續遞送，在動物或人患者之皮膚下、較佳在皮膚與下伏組織之間之囊內引入抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。將皮膚捏起或拉起並遠離下伏組織可產生囊。

術語「皮下輸注」係指藉由自藥物容器相對緩慢、持續遞送一段時間(包括但不限於30分鐘或更短、或90分鐘或更短)，在動物或人患者之皮膚下、較佳在皮膚與下伏組織之間之囊內引入藥物。視情況，輸注可藉由皮下植入藥物遞送幫浦來進行，該藥物遞送幫浦植入動物或人患者之皮膚下，其中幫浦在預定之時間段(例如30分鐘、90分鐘或跨越治療方案之長度之時間段)內遞送預定量之藥物。

術語「皮下推注」係指在動物或人患者之皮膚下之藥物投與，其中推注藥物遞送少於大約15分鐘，在另一態樣中少於5分鐘，且在又一態樣中少於60秒。在又一態樣中，投與係在皮膚與下伏組織之間之囊內，其中囊可藉由將皮膚捏起或拉起並遠離下伏組織而產生。

術語「治療有效量」用於指減輕或改善所治療病症之一或多種症狀之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段的量。在減輕或改善所治療病症之一或多種症狀時，其係具有有益之患者結果的量。根據欲治療之病況，可以習用方式量測效能。舉例而言，在特徵在於表現Sema3A之細胞之眼/視網膜疾病或病症中，可藉由測定反應率，例如視力恢復或藉由評價直至疾病進展之延遲時間來量測效能。

本文所用術語「治療」及「療法」及諸如此類意指包括對疾病或病症之治療性以及預防性或抑制性措施，其導致任何臨床上期望或有益之效應，包括(但不限於)一或多種症狀之緩和或緩解、使疾病或病症消退、減緩或停止疾病或病症之進展。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症之症狀發作之前或之後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，藉此預防或去除疾病或病症之一或多種體徵。作為另一實例，該術語包括在疾病臨床表現後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段以對抗疾病之症狀。此外，在發作後及臨床症狀已發展後投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段(其中無論該治療是否導致改善疾病，該投藥法仍會影響疾病或病症之臨床參數)包括本文使用之「治療」或「療法」。此外，與不使用抗-Sema3A抗體組合物或其抗原結合片段時之症狀相比，只要本發明之組合物單獨或與另一治療劑之組合可以緩和或改善所治療病症之至少一種症狀，即應認為該結果係有效治療該根本病症，不論該病症之所有症狀是否緩和。

術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、投與、禁忌症及/或關於使用該等治療產品之警告的資訊。

本發明之抗體

在第一態樣中 ，本發明係關於抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。較佳地，該抗體係人類化抗-Sema3A抗體、更佳人類化單株抗-Sema3A抗體。

在初始表徵中，藉由將鼠類抗體之CDR放置於人共有重鏈及輕鏈可變結構域之FR中且進一步藉由工程化具有不同改變之FR，產生靶向Sema3A變體之抗體文庫。

此產生針對Sema3A之人類化抗體，其具有如本文揭示之增強性質。本發明之抗體之序列示於下表1中。

表 1 ：

名稱	胺基酸序列	SEQ ID NO
HCDR1	SYYMS	SEQ ID NO: 1
HCDR2	TIIKSGGYAY YPDSVKD	SEQ ID NO: 2
HCDR3	GGQGAMDY	SEQ ID NO: 3
LCDR1	RASQSIGDYL H	SEQ ID NO: 4
LCDR2	YASQSIS	SEQ ID NO: 5
LCDR3	QQGYSFPYT	SEQ ID NO: 6
VH - 變體1	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMSSLRAED TAVYYCVRGG QGAMDYWGQG TTVTVSS	SEQ ID NO: 7
VH - 變體2	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFPFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMSSLRAED TAVYYCVRGG QGAMDYWGQG TTVTVSS	SEQ ID NO: 8
VH - 變體3	EVQLVESGGG LVQLGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCVKGG QGAMDYWGQG TTVTVSS	SEQ ID NO: 9
VH- 變體4	EVQLVESGGG LLQLGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLN LQMNSLRAED TAVYYCVKGG QGAMDYWGQG TTVTVSS	SEQ ID NO: 10
VL - 變體a	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIKY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTITSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIK	SEQ ID NO: 11
VL - 變體b	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIYY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIK	SEQ ID NO: 12
VL- 變體c	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIKY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIK	SEQ ID NO: 13
重鏈- 純系I	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMSSLRAED TAVYYCVRGG QGAMDYWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG	SEQ ID NO: 14
輕鏈- 純系I	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIKY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTITSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC	SEQ ID NO: 15
重鏈- 純系II	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFPFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMSSLRAED TAVYYCVRGG QGAMDYWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG	SEQ ID NO: 16
重鏈- 純系III	EVQLVESGGG LVQLGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCVKGG QGAMDYWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG	SEQ ID NO: 17
輕鏈 - 純系III	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIYY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC	SEQ ID NO: 18
重鏈- 純系IV	EVQLVESGGG LLQLGGSLRL SCAASGFTFS SYYMSWVRQA PGKGLEWVST IIKSGGYAYY PDSVKDRFTI SRDNSKNTLN LQMNSLRAED TAVYYCVKGG QGAMDYWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG	SEQ ID NO: 19
輕鏈 - 純系IV	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIG DYLHWYQQKP GQAPRLLIKY ASQSISGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ GYSFPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC	SEQ ID NO: 20

在一個實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(H-CDR2)、及SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(H-CDR3)；及 - 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列(L-CDR3)的輕鏈可變區。

在較佳實施例中，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： - 分別包含SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈； - 分別包含SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈； - 分別包含SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈；或 - 分別包含SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。

在特定實施例中，本發明係關於抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱作「純系I」； b. 包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱作「純系II」； c. 包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱作「純系III」；或 d. 包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之輕鏈，該抗體稱作「純系IV」。

藉由在Fc區中引入突變製備IgG1-KO突變體。用以降低或抑制效應物功能之突變為熟習此項技術者所熟知，且充分揭示於先前技術中，例如於Wang等人，Protein Cell 2018, 9(1):63-73及Stewart等人 Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:29中。通常，為了降低Fc之效應物功能而在IgG1 Fc區中引入之突變之非限制性清單包含：- L234A及L235A；- L234A、L235A及N297Q；- L234A、L235A及P329G；或- L234A、L235A及D265A；其中殘基根據Kabat之EU索引編號。

在較佳實施例中，本發明之抗體包含Fc區中之兩個突變L234A及L235A以降低效應物功能。

本文揭示及SEQ ID NO: 1至6中繪示之CDR根據Kabat編號呈現，且在下表2中用Kabat位置概述。

表 2 ：

CDR	Kabat 序列	Kabat 位置	SEQ ID NO:
HCDR1	SYYMS	31-35	1
HCDR2	TIIKSGGYAYYPDSVKD	50-66	2
HCDR3	GGQGAMDY	99-106	3
LCDR1	RASQSIGDYLH	24-34	4
LCDR2	YASQSIS	50-56	5
LCDR3	QQGYSFPYT	89-97	6

本發明之抗-Sema3A抗體以高親和性結合至人Sema3A。在關於此態樣之實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以K_D ＜ 50 pM結合至人Sema3A。在另一實施例中，如實例4中所例示，本發明之抗-Sema3A抗體以K_D ＜ 35 pM結合至人Sema3A。在較佳實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以K_D ＜ 30 pM結合至人Sema3A。

本發明之抗-Sema3A抗體亦結合至cyno-Sema3A、小鼠Sema3A、大鼠Sema3A及兔Sema3A。

本發明之抗-Sema3A抗體以小於100 pM、較佳小於80 pM、更佳小於70 pM之功能功效預防視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷。在較佳實施例中，本發明之抗-Sema3A抗體以69 pM之功能功效預防視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷，如實例4中所例示。

在另一態樣中，如實例5中所述，證明本發明之抗-Sema3A抗體具有低免疫原性風險。此依賴於電腦預測抗體之免疫原性。免疫原性風險通常藉由各種眾所周知之方法來評價，例如藉由用於預測T細胞表位之電腦算法，該等T細胞表位係主要之免疫原性影響因素。

實際上已報導，藉由使用基於計算矩陣方法(可以名稱EpiMatrix (由EpiVax生產)獲得)之算法可預測所關注蛋白質中存在之含有T細胞表位之序列。熟習此項技術者可參考Van Walle等人，Expert Opin Biol Ther. 2007年3月；7(3): 405-18及Jawa等人，Clin Immunol.2013年12月；149(3):534-55。

本發明者已顯示，本發明之抗體比先前技術中提及及本文闡述之靶向Sema3A之其他抗體或片段顯示更有利之性質。

本發明者比較WO2014123186 (Chiome Bioscience)中揭示之靶向Sema3A之抗體之結合親和性與本發明之抗體之親和性。揭示WO2014123186之抗體，其用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。本實例8顯示本發明之抗體證明比Chiome Bioscience揭示之先前技術抗體對人Sema3A具有更高之結合親和性。

本發明者亦比較本發明之抗體之性質與WO2017074013 (Samsung)中揭示之ScFv片段。揭示該等片段，其用於治療各種癌症。實例9顯示本發明之抗體證明比WO2017074013揭示之先前技術抗體片段對人Sema3A具有更高之結合親和性。

更高之結合親和性延長玻璃體內注射抗體後Sema3A之中和之時間，且允許降低之注射頻率。更高之結合親和性進一步允許投與更低之劑量，從而限制潛在副作用。因此，本發明之抗體提供優於先前技術抗體之技術優勢。改良之結合親和性及降低之注射頻率顯著改善有需要之患者之治療效能。其亦為患者提供有價值之益處，尤其改良之藥物依從性及順從性。

本發明者亦比較本發明之抗體及如實例11中所述之靶向Sema3A之市售抗體的功能功效。本發明者已顯示，在相同條件下，本發明之抗體預防視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷(實例3)，而市售抗體則不能(實例11)。

人類化及胺基酸序列變體

基於SEQ ID NO: 1至6中繪示之序列下鑑別之CDR組，可改造其他變體抗-Sema3A抗體及抗體片段。應理解，在該等變體抗-Sema3A抗體及抗體片段中，CDR之胺基酸序列保持不變，但周圍區域(例如FR區)可經改造。抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當之核苷酸改變引入抗-Sema3A抗體DNA、或藉由肽合成來製備。該等變體包括(例如)本文實例之抗-Sema3A抗體之胺基酸序列內殘基的缺失、及/或***及/或取代。進行缺失、***及取代之任何組合以獲得最終構築體，條件係最終構築體具有期望特徵。胺基酸改變亦可改變人類化或變體抗-Sema3A抗體之轉譯後過程，例如改變醣基化位點之數目或位置。

抗體之另一類型之胺基酸變體涉及改變抗體之原始醣基化模式。術語「改變」在此上下文中意指缺失抗體中發現之一或多個碳水化合物部分、及/或添加抗體中先前不存在之一或多個醣基化位點。

在一些態樣中，本發明包括編碼本文所述抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變體的核酸分子。編碼抗-Sema3A抗體之胺基酸序列變體之核酸分子係藉由業內已知之各種方法製備。該等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變體之情形下)或藉由先前製備之抗-Sema3A抗體之變體或非變體形式的寡核苷酸介導之(或定點)誘變、PCR誘變及盒式誘變來製備。

在某些實施例中，抗-Sema3A抗體係抗體片段。已研發用於產生抗體片段之技術。片段可經由完整抗體之蛋白水解消解而衍生(參見例如Morimoto等人, 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人, 1985, Science 229:81)。或者，片段可直接在重組宿主細胞中產生。舉例而言，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌回收且化學偶合以形成F(ab')₂ 片段(例如，參見Carter等人，1992, Bio/Technology 10:163-167)。藉由另一種方法，可直接自重組宿主細胞培養物分離F(ab')₂ 片段。用於產生抗體片段之其他技術對於熟練從業者將係顯而易見的。

抗-Sema3A抗體及其抗原結合片段可包括修飾。

在某些實施例中，可期望使用抗-Sema3A抗體片段而非完整抗體。可期望修飾抗體片段以增加其血清半衰期。此可藉由(例如)將補救受體結合表位納入抗體片段中來達成。在一種方法中，可改變(例如突變)抗體片段之適當區，或者可將表位納入肽標籤中，然後例如藉由DNA或肽合成將肽標籤在任一末端或中間融合至抗體片段。例如，參見WO 96/32478。

在其他實施例中，本發明包括抗-Sema3A抗體之共價修飾。共價修飾包括半胱胺醯基殘基、組胺醯基殘基、離胺醯基及胺基末端殘基、精胺醯基殘基、酪胺醯基殘基、羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)、麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基、或絲胺醯基、或蘇胺醯基殘基之修飾。另一種類型之共價修飾涉及將醣苷化學或酶促偶合至抗體。若適用，可藉由化學合成或藉由抗體之酶促或化學裂解進行該等修飾。藉由使抗體之靶向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或胺基或羧基末端殘基反應之有機衍生劑反應，可將抗體之其他類型之共價修飾引入分子中。

可以化學或酶促方式完成抗體上存在之任何碳水化合物部分之去除。化學去醣基化由Hakimuddin等人，1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人，1981, Anal. Biochem., 118:131闡述。抗體上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用各種內切及外切醣苷酶來達成，如Thotakura等人，1987, Meth. Enzymol 138:350中所述。

另一種類型之有用之共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、美國專利第4,496,689號、美國專利第4,301,144號、美國專利第4,670,417號、美國專利第4,791,192號及美國專利第4,179,337號中之一或多者中所述之方式將抗體與多種非蛋白質聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)之一連接。

表位結合

在第二態樣中 ，本發明係關於識別特異性「Sema3A抗原表位」及「Sema3A表位」之抗體。具體而言，本發明之抗體結合至具有SEQ ID NO: 22之人Sema3A之表位。

在一態樣中，本發明係關於結合至如SEQ ID NO: 22中所述之人Sema3A之胺基酸區370-382內之至少一個胺基酸殘基的抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

在另一態樣中，本發明係關於結合至SEQ ID NO: 21之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。

序列SEQ ID NO: 21及22繪示於下表5中。

表 5

名稱	序列	SEQ ID NO:
Sema3A表位	DSTKDLPDDV ITF	21
人Sema3A	NYQNGKNNVPRLKLSYKEMLESNNVITFNGLANSSSYHTFLLDEERSRLYVGAKDHIFSFDLVNIKDFQKIVWPVSYTRRDECKWAGKDILKECANFIKVLKAYNQTHLYACGTGAFHPICTYIEIGHHPEDNIFKLENSHFENGRGKSPYDPKLLTASLLIDGELYSGTAADFMGRDFAIFRTLGHHHPIRTEQHDSRWLNDPKFISAHLISESDNPEDDKVYFFFRENAIDGEHSGKATHARIGQICKNDFGGHRSLVNKWTTFLKARLICSVPGPNGIDTHFDELQDVFLMNFKDPKNPVVYGVFTTSSNIFKGSAVCMYSMSDVRRVFLGPYAHRDGPNYQWVPYQGRVPYPRPGTCPSKTFGGFDSTKDLPDDVITFARSHPAMYNPVFPMNNRPIVIKTDVNYQFTQIVVDRVDAEDGQYDVMFIGTDVGTVLKVVSIPKETWYDLEEVLLEEMTVFREPTAISAMELSTKQQQLYIGSTAGVAQLPLHRCDIYGKACAECCLARDPYCAWDGSACSRYFPTAKRRTRRQDIRNGDPLTHCSDLHHDNHHGHSPEERIIYGVENSSTFLECSPKSQRALVYWQFQRRNEERKEEIRVDDHIIRTDQGLLLRSLQQKDSGNYLCHAVEHGFIQTLLKVTLEVIDTEHLEELLHKDDDGDGSKTKEMSNSMTPSQKVWYRDFMQLINHPNLNTMDEFCEQVWKRDRKQRRQRPGHTPGNSNKWKHLQENKKGRNRRTHEFERAPRSV	22

本文所用術語「Sema3A抗原表位」及「Sema3A表位」係指能夠結合至抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之分子(例如肽)或分子之片段。該等術語進一步包括(例如)由本發明之任何抗體或抗體片段識別之Sema3A抗原決定子，其具有選自SEQ ID NO: 1-3之重鏈CDR及SEQ ID NO: 4至6之輕鏈CDR的輕鏈及重鏈CDR組合。

Sema3A抗原表位可包括於蛋白質、蛋白質片段、肽或諸如此類中。表位係最常見之蛋白質、短寡肽、寡肽模擬物(即模擬Sema3A抗原之抗體結合性質之有機化合物)或其組合。

已發現，本發明之抗體或抗體片段結合至人Sema3A之獨特表位。較佳地，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至具有SEQ ID NO: 22之人Sema3A之細胞外結構域之胺基酸區370-382內的至少一個胺基酸殘基。此表位位於Sema3A及神經叢蛋白A受體受體之界面附近。抗體與此表位之結合抑制配體Sema3A、受體神經叢蛋白A及輔受體Nrp1之信號傳導完整全受體(holoreceptor)複合物之形成，從而導致干擾該信號傳導之生物學效應。

在表位結合之上下文中，片語「在胺基酸區X-Y…內結合」意指抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至序列中指示之胺基酸區內之至少一個、較佳所有胺基酸殘基。

在另一態樣中，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%之SEQ ID NO: 22中繪示之胺基酸序列。較佳地，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO: 22。

治療用途

在第三態樣中 ，本發明係關於抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。

在一個實施例中，本發明提供抗-Sema3A或抗原結合片段，其用於抑制SemaA之血管抑制效應及/或用於改良視網膜之血管重建。

較佳地，本發明提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防視網膜或眼疾病。實際上，本發明者已研發靶向Sema3A之抗體，其對以下方面極為有幫助： - 將血管生成重新定向至缺血性區，以改良視網膜之血管重建；- 預防玻璃體區之病理性新血管生成；以及- 防止血液視網膜屏障破壞。

如先前所提及，Sema3A係由低氧視網膜神經節細胞分泌之血管推斥提示。藉由結合至神經週期蛋白-1，其活化內皮細胞上神經叢蛋白受體之細胞內信號傳導，從而導致肌動蛋白纖維之解裝配。此導致尖端細胞之絲狀偽足中之細胞骨架塌陷，該等尖端細胞係指導新血管生長並阻止視網膜中缺血性區之血管再生的專門內皮細胞。本發明者已顯示，用中和Sema3A-抗體調節血管推斥作用將增加TIP細胞之數量，並將血管生成重新定向至缺血性區，例如患有糖尿病黃斑缺血之人中之病理性擴大之中心凹無血管區。

因此，在第四態樣中 ，本發明係關於用於治療或預防選自由以下組成之群之疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段：視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養性萎縮、近視性變性、視網膜動脈阻塞、眼內炎、葡萄膜炎、囊樣黃斑水腫、由任何視網膜疾病繼發之脈絡膜新生血管膜、視神經疾病、青光眼、視網膜剝離、毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、創傷性視網膜病變、藥物誘導之視網膜血管病變、視網膜新血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、福斯氏營養性萎縮、黃斑毛細血管擴張症、尤塞氏症候群及斯特格氏病。

本發明之抗-Sema3A抗體尤其可用於治療或預防糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、缺血性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑水腫、視網膜新血管形成及脈絡膜新血管形成。

在較佳實施例中，該疾病係糖尿病黃斑缺血且本發明之抗體促進缺血性視網膜內之血管再生(血管重建)且預防眼之玻璃體區之病理性新血管形成。

在另一較佳實施例中，該疾病係糖尿病黃斑水腫且本發明之抗體降低血液視網膜屏障之滲透性。

在較佳態樣中，本發明之抗體可用於治療糖尿病黃斑水腫(DME)及/或糖尿病黃斑缺血(DMI)。在較佳實施例中，本發明之抗體可用於治療患有DME及DMI之患者。較佳地，本發明之抗體用於治療由超過15%、20%、25%及更佳30%之中心凹無血管區(FAZ)擴大所定義的DMI。

抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段係藉由任何適宜方式(包括玻璃體內、經口、非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內)投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。此外，藉由脈衝輸注、具體而言利用降低劑量之抗體適宜地投與抗-Sema3A抗體。在一個態樣中，藉由注射、最佳靜脈內或皮下注射給予劑量，此部分地端視投與時間長短而定。較佳地，抗-Sema3A抗體係經由玻璃體內注射至眼中來給予。

為了預防或治療疾病，抗體之適當劑量將取決於多種因素，例如如上文所定義之欲治療疾病之類型、疾病之嚴重程度及進程、投與抗體係用於預防目的亦係治療目的、先前療法、患者之臨床史及對抗體之反應、以及主治醫師之判斷。將抗體適宜地一次性或經一系列治療投與給患者。

在較佳實施例中，本發明之抗體每次注射可適用之劑量範圍通常為1 mg/眼至10 mg/眼，較佳介於1.5 mg/眼與5 mg/眼之間，更佳介於2 mg/眼與3 mg/眼之間，且甚至更佳為約2.5 mg/眼。

術語「抑制」在本文中與「改善」及「減輕」在相同之上下文中使用，以意指減輕或減少疾病之一或多種特徵。

抗體組合物將以與良好醫療實踐一致之方式調配、投藥及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床狀況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。欲投與之抗體之「治療有效量」將由該等考慮因素決定，且係預防、改善或治療由本發明之抗體解決之眼或視網膜疾病所必需之最小量。

抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗-Sema3A抗體之量、病症或治療之類型以及上文所討論之其他因素而定。該等其他藥劑通常以與上文所用相同之劑量及投與途徑來使用或係上文所用劑量之約1%至99%。

在另一態樣，本發明亦係關於抗-Sema3A抗體或抗原結合片段，其用於治療或預防非眼科疾病，例如自體免疫性關節炎、神經病性疼痛、骨質疏鬆症及癌症。

治療方法

在另一態樣中，本發明亦涵蓋治療或預防有需要之患者之眼或眼部疾病的任何方法，該方法包含投與本發明之抗-Sema3A抗體。

較佳地，本發明係關於使用本發明之抗體抑制SemaA3之血管抑制效應的方法。更佳地，本發明係關於用於改良視網膜之血管重建之該方法。

較佳地，本發明係關於治療或預防眼或視網膜疾病之方法，其包含向有需要之患者投與醫藥有效量之本發明之抗體。較佳地，該疾病選自由以下組成之群：視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養性萎縮、近視性變性、視網膜動脈阻塞、眼內炎、葡萄膜炎、囊樣黃斑水腫、由任何視網膜疾病繼發之脈絡膜新生血管膜、視神經疾病、青光眼、視網膜剝離、毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、創傷性視網膜病變、藥物誘導之視網膜血管病變、視網膜新血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、福斯氏營養性萎縮、黃斑毛細血管擴張症、尤塞氏症候群及斯特格氏病。更佳地，該疾病選自由以下組成之群：糖尿病視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變)、缺血性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑水腫、視網膜新血管形成、青光眼及脈絡膜新血管形成。在又一較佳實施例中，該疾病係糖尿病黃斑水腫及/或糖尿病黃斑缺血。

本文所述之所有揭示之技術特徵皆適用於該治療方法。

醫藥組合物及其投與

可將包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之組合物投與患有眼或視網膜疾病或處於患有眼或視網膜疾病之風險下的個體。本發明進一步提供抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用於預防或治療眼或視網膜疾病或Sema3A疾病之藥劑。本文所述之所有揭示之技術特徵皆適用於抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段在製造藥劑中之該用途。本文所用術語「個體」意指可投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之任何哺乳動物患者，包括(例如)人及非人哺乳動物，例如靈長類動物、齧齒類動物及狗。特別意欲使用本文所述方法治療之個體包括人。抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段可單獨或與其他組合物組合投與。

已知各種遞送系統，且其可用於投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。引入方法包括(但不限於)玻璃體內、眼藥水、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段可藉由(例如)輸注、濃注或注射投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身或局部投與。在較佳實施例中，投與係藉由玻璃體內注射。用於該等注射之調配物可在(例如)預填充之注射器中製備。

抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段可作為醫藥組合物投與，該等醫藥組合物包含治療有效量之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段及一或多種醫藥上相容之成分。

在典型實施例中，根據常規程序將醫藥組合物調配成適於靜脈內或皮下投與給人之醫藥組合物。通常，用於藉由注射投與之組合物係無菌等滲水性緩衝劑中之溶液。若需要，醫藥組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lignocaine))以減輕注射位點之疼痛。通常，各成分係單獨供應或以單位劑型混合在一起，例如，作為於指示活性劑之量之氣密性密封容器(例如安瓿或小藥囊)中之乾燥凍乾粉劑或無水濃縮物。在醫藥組合物欲藉由輸注來投與之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶來分配。在醫藥組合物係藉由注射來投與之情況下，可提供注射用無菌水或鹽水之安瓿，以便在投與之前混合各成分。

此外，醫藥組合物可以醫藥套組形式來提供，該醫藥套組包含(a) 容器，其含有呈凍乾形式之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段；及(b) 第二容器，其含有醫藥上可接受之注射用稀釋劑(例如無菌水)。醫藥上可接受之稀釋劑可用於重構或稀釋凍乾之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。視情況，該等容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告反映製造、使用或銷售機構批准人投與。

有效治療或預防眼或視網膜疾病之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段的量可藉由標準臨床技術測定。另外，可視情況採用活體外分析來幫助鑑別最佳劑量範圍。欲用於調配物中之精確劑量亦將取決於投與途徑及病況之階段，且應根據從業醫師之判斷及每一患者之情況來決定。可根據自活體外或動物模型測試系統衍生之劑量反應曲線來推斷有效劑量。

舉例而言，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之毒性及治療效能可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，用於測定ED₅₀ (在50%群體中治療有效之劑量)。展現大治療指數之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段較佳。

可使用自該等細胞培養分析及動物研究獲得之數據來調配用於人之劑量範圍。抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之劑量通常在循環濃度範圍內，其包括ED₅₀ ，具有很小毒性或無毒性。該劑量可端視所用劑型及所用投與途徑在此範圍內變化。對於該方法中使用之任何抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，可最初從細胞培養分析估計治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達成循環血漿濃度範圍(包括IC₅₀ ，即達成症狀之半數最大抑制之測試化合物之濃度)，如在細胞培養物中所測定。該資訊可用於更準確地測定人中有用之劑量。可藉由(例如)高效液相層析、ELISA及諸如此類量測血漿中之含量。

對於抗-Sema3A抗體之玻璃體內注射，通常治療之間之較長間隔較佳。由於其改良之結合親和性及功效，本發明之抗-Sema3A抗體可以更長之間隔投與。

在一個實施例中，每6週、較佳每7週、較佳每8週、較佳每9週、較佳每10週、較佳每11週且更佳每12週投與抗-Sema3A抗體。在又一較佳實施例中，每3個月投與一次本發明之抗-Sema3A抗體。

由於可投與眼之體積嚴格受限，故抗-Sema3A抗體可調配成高濃度係極為重要的。此外，抗-Sema3A抗體之功效係極為重要，此乃因強效抗體可在甚至更低之劑量下發揮其效應，且藉此延長活性亦及治療之間之間隔。

本發明之抗體可調配成極高劑量，包括但不限於20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml或100 mg/ml。較佳地，本發明之抗體可調配於約50 mg/ml之液體調配物中。

可投與患者之典型劑量為約2.5 mg/眼。可用於該調配物之典型緩衝劑組分包含(例如)乙酸鈉、PS20及海藻糖二水合物。

在一個實施例中，用10 mM組胺酸緩衝劑、240 mM蔗糖、0.02 w/v %聚山梨醇酯20於pH 5.5下調配抗-Sema3A抗體，最終蛋白質濃度為60 mg/mL。

在一些實施例中，包含抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物可進一步包含與結合劑偶聯或未偶聯之治療劑。

關於組合投與之治療方案，在具體實施例中，抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段與治療劑同時投與。在另一具體實施例中，在投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之前或之後，在投與抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之前或之後至少一小時且高達若干個月、例如至少1小時、5小時、12小時、一天、一週、一個月或三個月，投與治療劑。

聚核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法

在第六態樣中 ，本發明涵蓋包含編碼抗-Sema3A抗體之序列的分離之聚核苷酸、包含該等聚核苷酸之載體及宿主細胞、及用於產生抗體之重組技術。分離之聚核苷酸可編碼任何期望形式之抗-Sema3A抗體，包括(例如)全長單株抗體、Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。

包含編碼抗-Sema3A抗體或其片段或鏈之序列的聚核苷酸可與一或多個調控或控制序列融合，如業內已知，且可包含於適宜表現載體或宿主細胞中，如業內已知。編碼重鏈或輕鏈可變結構域之聚核苷酸分子中之每一者可獨立地融合至編碼恆定結構域例(例如人恆定結構域)之聚核苷酸序列，使得能夠產生完整抗體。或者，聚核苷酸或其部分可融合在一起，從而提供用於產生單鏈抗體之模板。

為了重組產生，將編碼抗體之聚核苷酸***可複製之載體中，用於選殖(DNA之擴增)或表現。有許多用於表現重組抗體之適宜載體可以利用。載體組分通常包括(但不限於)以下一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記物基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。

抗-Sema3A抗體亦可呈融合多肽產生，其中抗體與異源多肽(例如信號序列或在成熟蛋白質或多肽之胺基末端具有特異性裂解位點之其他多肽)融合。所選異源信號序列通常係會被宿主細胞識別及處理(即，由信號肽酶裂解)之序列。對於不會識別及處理抗-Sema3A抗體信號序列之原核宿主細胞，可由原核信號序列取代該信號序列。信號序列可為(例如)鹼性磷酸酶、青黴素酶、脂蛋白、熱穩定腸毒素II前導序列及諸如此類。對於酵母分泌，天然信號序列可經(例如)自酵母轉化酶α-因子(包括酵母屬(Saccharomyces)及克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α-因子前導序列)、酸性磷酸酶、白色念珠菌(C. albicans)葡萄糖澱粉酶獲得之前導序列或WO90/13646中闡述之信號取代。在哺乳動物細胞中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。該前體區之DNA在閱讀框連接至編碼人類化抗-Sema3A抗體之DNA。

表現及選殖載體含有能使載體在一或多個所選宿主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列係使載體能夠獨立於宿主染色體DNA進行複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。對於多種細菌、酵母及病毒，該等序列係眾所周知。質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性(Gram-negative)細菌，2-υ.質體起點適用於酵母，且各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)可用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，哺乳動物表現載體無需複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，此乃因其含有早期啟動子)。

表現及選殖載體可含有編碼可選標記物以促進表現之鑑別的基因。典型可選標記物基因編碼賦予對抗生素或其他毒素(例如胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、胺甲喋呤(methotrexate)或四環素)之抗性的蛋白質，或另一選擇為，係補體營養缺陷型缺陷之蛋白質，或在其他替代方案中供應複合培養基中不存在之特定營養物，例如編碼芽孢桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶的基因。

選擇方案之一個實例利用藥物來阻止宿主細胞之生長。彼等成功地用異源基因轉變之細胞產生賦予抗藥性之蛋白質，且因此在選擇方案中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。哺乳動物細胞之常見可選標記物係能夠鑑別勝任攝取編碼人類化抗-Sema3A抗體之核酸之細胞的彼等，例如DHFR (二氫葉酸還原酶)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II (例如靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶及諸如此類。首先藉由在含有胺甲喋呤(Mtx) (DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉變體來鑑別經DHFR選擇基因轉變之細胞。當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞係DHFR活性缺陷之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如DG44)。

或者，經編碼抗-Sema3A抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選標記物(例如胺基醣苷3'-磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉變或共轉變之宿主細胞(特定而言含有內源性DHFR之野生型宿主)可藉由使細胞在含有可選標記物之選擇劑(例如胺基醣苷抗生素，例如康黴素、新黴素或G418)之培養基中生長來選擇。例如，參見美國專利第4,965,199號。

當在作為宿主細胞之酵母細胞中實施重組產生的情況下，可使用酵母質體YRp7中存在之TRP1基因(Stinchcomb等人，1979, Nature 282: 39)作為可選標記物。TRP1基因為缺乏在色胺酸中生長之能力之酵母突變株提供選擇標記物，例如ATCC號44076或PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12)。酵母宿主細胞基因組中存在trp1病灶則提供藉由在色胺酸不存在下生長來檢測轉變之有效環境。類似地，Leu2p-缺陷型酵母菌株(例如ATCC 20,622及38,626)由具有LEU2基因之已知質體補充。

此外，衍生自1.6 μm環狀質體pKD1之載體可用於克魯維酵母屬酵母之轉變。或者，報導用於乳酸克魯維酵母之大規模產生重組小牛凝乳酶的表現系統(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135)。亦已揭示用於克魯維酵母屬之工業菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩定多拷貝表現載體(Fleer等人，1991, Bio/Technology 9:968-975)。

表現及選殖載體通常含有啟動子，該啟動子由宿主生物體識別，並與編碼抗-Sema3A抗體或其多肽鏈之核酸分子可操作地連接。適合用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統以及雜合啟動子(例如tac啟動子)。其他已知細菌啟動子亦係適宜。用於細菌系統之啟動子亦含有與編碼人類化抗-Sema3A抗體之DNA可操作連接之Shine-Dalgamo (S.D.)序列。

許多真核啟動子序列係已知的。實際上，所有真核基因皆具有位於轉錄起始之位點上游約25-30個鹼基的富含AT之區。在許多基因之轉錄起始上游70-80個鹼基處發現之另一序列係CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因之3'端係AATAAA序列，其可為將多A尾添加至編碼序列之3'端的信號。所有該等序列皆適宜地***真核表現載體中。

與酵母宿主一起使用適宜啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸鹽激酶或其他糖酵解酶(例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、己醣激酶、丙酮酸鹽去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、3-磷酸甘油酸鹽變位酶、丙酮酸鹽激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激酶)之啟動子。

誘導型啟動子具有由生長條件控制轉錄之額外優點。該等啟動子包括醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之衍生酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸鹽去氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的酵母啟動子區。用於酵母表現之適宜載體及啟動子進一步闡述於EP73,657中。酵母增強子亦有利地與酵母啟動子一起使用。

抗-Sema3A抗體自哺乳動物宿主細胞中之載體之轉錄受以下啟動子控制：例如自病毒(例如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40 (SV40))之基因體獲得之啟動子；來自異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，或來自熱休克啟動子，條件係該等啟動子與宿主細胞系統相容。

SV40病毒之早期及晚期啟動子方便捷地作為SV40限制性片段獲得，該限制性片段亦含有SV40病毒複製起點。人巨細胞病毒之立即早期啟動子便捷地作為HindIII E限制性片段獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修飾闡述於美國專利第4,601,978號中。亦參見Reyes等人，1982, Nature 297:598-601，其揭示在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下小鼠細胞中人p-干擾素cDNA之表現。或者，勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma)長末端重複序列可用作啟動子。

可用於重組表現載體之另一有用元件係增強子序列，其用於增加高等真核生物對編碼抗-Sema3A抗體之DNA的轉錄。現在已知許多來自哺乳動物基因(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)之增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點之晚期側上之SV40增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、病毒複製起點之晚期側上之多瘤增強子及腺病毒增強子。關於用於活化真核啟動子之增強元件之說明，亦參見Yaniv, 1982, Nature 297:17-18。增強子可在抗-Sema3A抗體編碼序列之5'或3'位剪接至載體中，但較佳位於啟動子之5'位點。

用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中之表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'非轉譯區獲得。該等區含有轉錄為編碼抗-Sema3A抗體之mRNA之非轉譯部分中的多腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種有用之轉錄終止組分係牛生長激素多腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中揭示之表現載體。在一些實施例中，抗-Sema3A抗體可使用CHEF系統表現。(參見例如美國專利5,888,809；其揭示內容以引用方式併入本文中)。

用於選殖或表現本文載體中之DNA之適宜宿主細胞係上述原核生物、酵母或高等真核生物細胞。用於此目的之適宜原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門桿菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志賀桿菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)(如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis) (例如揭示於1989年4月12出版之DD 266,710中之地衣芽孢桿菌41 P))，假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa))及鏈黴菌屬(Streptomyces)。一種較佳之大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294 (ATCC 31,446)，但其他菌株(例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110 (ATCC 27,325))亦適宜。該等實例係闡釋性的而非限制性的。

除了原核生物之外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)係編碼抗-Sema3A抗體之載體的適宜選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 或常見焙用酵母在低等真核宿主微生物中最常用。然而，許多其他屬、種及菌株通常可獲得且可用於本文，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬宿主，例如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(K. fragilis ) (ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus ) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii ) (ATCC 24,178)、沃爾特克魯維酵母(K. waltii ) (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum ) (ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K. marxianus )；耶羅威亞酵母(yarrowia ) (EP 402,226)；畢赤酵母屬酵母(Pichia pastors ) (EP 183,070)；念珠菌屬(Candida )；裡氏木黴菌(Trichoderma reesia ) (EP 244,234)；紅麵包黴菌(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyce )，例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，例如紅黴菌屬(Neurospora )、青黴菌屬(Penicillium )、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麯黴屬(Aspergillus )宿主，例如構巢麯黴(A. nidulans )及黑麯黴(A. niger )。

用於表現醣基化抗-Sema3A抗體之適宜宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞，包括(例如)來自宿主之多種桿狀病毒株及變體以及相應之允許性昆蟲宿主細胞，該等宿主例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda ) (鱗翅目幼蟲)、埃及斑蚊(Aedes aegypti ) (蚊子)、白線斑蚊(Aedes albopictus ) (蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ) (果蠅)及家蠶(Bombyx mori ) (蠶)。用於轉染之多種病毒株係可公開獲得的，例如加州苜蓿夜蛾(Autographa californica )NPV 之L-1變體及家蠶 NPV 之Bm-5株，且該等病毒尤其可用於草地貪夜蛾細胞之轉染。

棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物亦可用作宿主。

本發明之抗-Sema3A抗體亦可納入病毒載體中，即將編碼抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸引入病毒載體中，且然後在感染病毒後在患者體內表現。

在另一態樣中，抗-Sema3A抗體之表現在脊椎動物細胞中實施。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中之繁殖已經成為廣泛可用之常規程序及技術。有用之哺乳動物宿主細胞系之實例係由SV40轉變猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎腎細胞系(經亞選殖以在懸浮培養中生長之293或293細胞，Graham等人，1977，J. Gen Virol. 36: 59)、幼小倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR1 (CHO, Urlaub等人，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例如DG44)、小鼠賽特利細胞(sertoli cell) (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251)、猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)、人子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)、水牛鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)、人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)、人肝細胞(Hep G2, HB 8065)、小鼠***腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)、TR1細胞(Mather等人，1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68)、MRC 5細胞、FS4細胞及人肝細胞瘤細胞系(Hep G2)。

用上述用於抗-Sema3A抗體產生之表現或選殖載體轉變宿主細胞，並在習用營養培養基中培養，若適當，該培養基經修飾以用於誘導啟動子、選擇轉變體或擴增編碼期望序列之基因。

可在多種培養基中培養用於產生本文所述抗-Sema3A抗體之宿主細胞。市售培養基(例如Ham氏F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.)、最小必需培養基((MEM), (Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.)及杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.))適於培養宿主細胞。另外，Ham等人，1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes等人，1980, Anal. Biochem. 102: 255、美國專利第4,767,704號、美國專利第4,657,866號、美國專利第4,927,762號、美國專利第4,560,655號、美國專利第5,122,469號、WO 90/103430及WO 87/00195中之一或多者中所述之培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基。若需要，該等培養基中之任一者可補充有激素及/或其他生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(例如慶大黴素(gentamicin))、痕量元素(定義為通常以在微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括其他補充物。培養條件(例如溫度、pH及諸如此類)係先前用於選擇表現之宿主細胞之彼等條件，且對於普通熟習此項技術者係顯而易見的。

當使用重組技術時，抗體可在細胞內、在周質空間中產生，或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，可破壞細胞以釋放蛋白質作為第一步驟。可(例如)藉由離心或超濾去除微粒碎片，即宿主細胞或溶解之片段。Carter等人，1992, Bio/Technology 10:163-167闡述分離分泌至大腸桿菌之周質空間之抗體的方法。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下在約30分鐘內解凍細胞糊。可藉由離心去除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自該等表現系統之上清液。在任一前述步驟中可包括諸如PMSF等蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。可使用多種方法自宿主細胞分離抗體。

自細胞製備之抗體組合物可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析係典型純化技術。蛋白A作為親和配體之適合性取決於抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc結構域之種類及同型。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(例如，參見Lindmark等人，1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13)。建議蛋白G用於所有小鼠同型及人γ3 (例如，參見Guss等人，1986 EMBO J. 5:1567-1575)。親和配體所附接之基質最經常為瓊脂糖，但可使用其他基質。機械上穩定之基質(例如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使得可達成較使用瓊脂糖更快之流速及更短之處理時間。在抗體包含C_H3 結構域之情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)可用於純化。端視欲回收之抗體而定，亦可使用其他蛋白質純化技術，例如離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠上層析、肝素SEPHAROSE™上層析、陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸管柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。

在任何初步純化步驟之後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物經受使用pH介於約2.5-4.5之溶析緩衝液的低pH疏水相互作用層析，通常在低鹽濃度(例如，約0-0.25 M之鹽)下實施。

亦包括如本文定義之在低、中及高嚴格條件下與編碼Sema3A-抗體或抗體片段之分離之聚核苷酸序列代表之核苷酸序列之全部或部分(例如編碼可變區之部分)雜交的核酸。雜交核酸之雜交部分之長度通常為至少15 (例如20、25、30或50)個核苷酸。雜交核酸之雜交部分與編碼抗-Sema3A多肽(例如重鏈或輕鏈可變區)之核酸或其補體之一部分或全部至少80%、例如至少90%、至少95%或至少98%一致。本文所述類型之雜交核酸可用作(例如)選殖探針、引子(例如PCR引子)或診斷探針。

在一個實施例中，本發明係關於一或多種分離之聚核苷酸，其包含編碼如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19中所示之重鏈或如SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13中所示之輕鏈可變區的序列。

應理解，在該等抗-Sema3A抗體及抗體片段中，編碼CDR之核酸序列保持不變(就其編碼之胺基酸而言，不變，由於密碼子之簡併性，DNA序列之等效形式係可能的)，但周圍區(例如FR區)可經改造。

製品

在另一態樣中，包括含有用於治療上述病症之材料的製品。該製品包含容器及標籤。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器容納有效治療病況之組合物，且可具有無菌輸液埠。例如，容器可為靜脈溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶。組合物中之活性劑係抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段。容器上或與容器相關之標籤指示組合物用於治療選擇之病況。製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥上可接受之緩衝液，例如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看合意之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明書之包裝插頁。

本發明進一步闡述於以下實例中，該等實例並不意欲限制本發明之範疇。實例

實例 1 ： DME 及 PDR 患者之玻璃體中 Sema3A 之上調

藉由免疫組織化學研究來自具有糖尿病視網膜病變史之人供體之樣品之視網膜中的Sema3A之表現。免疫染色方案如下： 1. 解凍載玻片並使樣品在室溫(RT)下風乾30 min； 2. 用pap筆盒繪製並使其乾燥； 3. 抗原於RT下在1% SDS中修復5 min； 4. 將載玻片在PBS中洗滌3次，持續5 min； 5. 於RT下在1% BSA/0.3% Triton X100/PBS溶液(封閉溶液)中將切片封閉30 min； 6. 在封閉溶液中1:200稀釋兔抗-Sema3a (abcam，ab23393) 第1抗體。將載玻片上之切片於RT下培育過夜； 7. 將載玻片在PBS中沖洗3次，持續5 min； 8. 將第2抗體與在DAPI/0.3% Triton X100/ PBS溶液中以1:400稀釋之驢抗兔Alexa fluor546 (invitrogen, A10040)一起培育。將載玻片上之切片於RT下培育3小時； 9. 將載玻片在PBS中沖洗3-5次，持續5 min； 10. 用Aquamount對切片加蓋玻片，且風乾； 11. 影像切片及40x放大之等級強度。

對每個人供體三個切片之組進行Sema3A免疫染色。Sema3A標記係由先前針對此特定任務訓練之觀察者使用5點分級方案(0=無檢測，1=低強度，少量斑點，2=中等強度，若干斑點，3=明亮強度，廣泛染色，及4=非常明亮強度，豐富檢測)在該等區中之每一者中獨立地評價。觀察者不知道眼供體之健康狀況。在視網膜內，Sema3A與視網膜血管之血管系統壁相關。與無眼部病狀之糖尿病患者相比，在患有糖尿病黃斑水腫之患者中，視網膜血管系統及視網膜實質中Sema3A之表現增加(圖1)。

實例 2 ：細胞滲透性分析中之效能

藉由FITC-聚葡萄糖在人視網膜微血管內皮細胞(HRMEC)之單層中之滲透來量測跨細胞滲透性。

簡言之，使用Millipore套組(「活體外血管滲透性分析」目錄號ECM642)及人視網膜微血管內皮細胞(HRMEC)量測活體外內皮滲透性。該分析套組提供具有細胞培養***物之96孔接收器板。***物含有1 μm孔，並用I型大鼠尾膠原塗覆。HRMEC以25000個細胞/孔之密度接種至***物中，並使細胞生長為單層達3天。用重組VEGF-A、Sema3A以及抗體處理細胞過夜。將套組中提供之高分子量FITC-聚葡萄糖溶液添加至***物中，從而使螢光分子通過內皮細胞單層。藉由量測接接受器板孔溶液在485nM/535nM (激發及吸收)下之螢光來測定活體外滲透性。

本發明者測試根據本發明之實例性抗體：純系I。該抗體包括包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之輕鏈。

本發明之抗-Sema3A抗體完全抑制由Sema3A誘導之滲透性，但不抑制由VEGF-A誘導之滲透性(圖 2 )。重要的是，Sema3A之滲透性獨立於VEGF-A。使用針對TNP之對照抗體證實此效應係由於本發明之抗體對Sema3A之特異性靶所致。

實例 3 ：細胞分析中細胞骨架塌陷之量測

藉由使用XCELLigence系統(如由ACEA Biosciences銷售之Real Time Cell Analysis Instruments)量測人視網膜微血管內皮細胞(HRMEC)中之細胞骨架塌陷來評價本發明之實例性抗體(純系I)之細胞活性。該系統經由細胞阻抗量測細胞附著及鋪滿。HRMEC內源性表現神經週期蛋白-1 (Nrp1)及神經叢蛋白，其係3類信號素完整全受體之組分。藉由結合至此受體複合物，信號素誘導內皮中F-肌動蛋白纖維之塌陷。在此功能分析中，將重組Sema3A蛋白添加至人視網膜微血管內皮細胞之匯合層，降低了細胞阻抗，此係由於細胞骨架塌陷及隨後之細胞收縮，以細胞阻抗之降低來量測。

簡言之，用Attachment Factor塗覆E-Plates View。以20000個細胞/孔之密度接種細胞，且然後在XCELLigence裝置中在其正常生長條件下過夜使其生長為單層。

在3mM CaCl2存在下，添加Sema3A (或其他3類信號素)具有及不具有本發明之抗-Sema3A抗體之組合。將細胞指數相對於添加物質之前之時間點正規化。刺激5h後進行計算。

本發明之抗-Sema3A抗體可完全防止Sema3A誘導之細胞骨架塌陷。本發明之抗-Sema3A抗體不能預防由其他測試信號素(B、C、E及F)誘導之細胞骨架塌陷，證實本發明之抗體對Sema3A之特異性(圖 3 )。

實例 4 ：親和性及細胞功效

A) 親和性

用於此實驗之運行緩衝液及所有稀釋液(除所述之外)在具有0.01% Tween20之PBS-T-EDTA中進行[將100 μL 100% Tween20添加至2L PBS-T-EDTA中以使最終Tween 20濃度為0.01%]。根據製造商之建議，將GLM感測器晶片正規化並預處理。將感測器晶片用EDC/s-NHS之相等混合物在水平方向上以30 μl/min之流速活化300 sec，並在水平方向上以30 μl/min之流速用人Fab黏合劑(10 μg/ml，於10 mM乙酸鹽中，pH 5.0中)固定300 sec，從而在表面上產生約6739-7414 RU之人Fab黏合劑。將感測器晶片用1M乙醇胺HCl在水平方向上以30 μl/min之流速不活化300 sec。將感測器晶片用18 sec之10 mM甘胺酸(pH 2.1)以100 μl/min之流速水平穩定1次及垂直穩定1次。

本發明者測試根據本發明之實例性抗體(純系I)。以25 μL/min之流速將該抗體(0.5 μg/ml)垂直捕獲於人Fab黏合劑表面上300 sec，從而產生約180 RU之捕獲含量。藉由以40 μl/min之流速水平注射PBS-T-EDTA達60 sec來穩定基線。將分析物以40 μL/min之流速水平注射於捕獲之抗體上600 sec且解離7200 sec。分析物之濃度為0 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM及10 nM。藉由以100 μl/min之流速水平一次及垂直一次注射10 mM甘胺酸(pH 2.1)達18秒再生表面。以25 μl/min之流速垂直注射PBS-T-EDTA達60 sec一次。自原始數據中減去中間點(interspot) (與感測器表面之相互作用)及空白(具有0.01% Tween20或0 nM分析物之PBS-T-EDTA)。然後將感測圖整體擬合至1:1朗繆爾結合(Langmuir binding)，以提供結合速率(ka)、解離速率(KD)及親和性(K_D )值。

B) 細胞功效

為了在細胞骨架塌陷分析中測定功能功效，將Sema3A濃度反應曲線增加濃度之抗體組合作為IC₅₀ 轉換實驗。實施Gaddum Schild圖以計算pA2值(將Sema3A濃度反應曲線轉換2倍所需之抗體濃度的負對數)。功效(以pM表示)自pA2值計算為=功效(10；-X)。

結果概述於下表6中。

表 6 ：

分子	親和性 (K_d ) [pM]	細胞骨架塌陷分析 (A₂ ) 中之功能拮抗 [pM]
人	Cyno	小鼠	大鼠	兔	人
本發明之抗體 ( 純系 I)	29	28	27	27	42	69

實例 5 ：本發明之抗體之免疫原性的評價

本發明者評價根據本發明之實例性抗體純系I之預測之免疫原性。該抗體包含分別包含SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。

出於此目的，其使用用於預測T細胞表位之電腦工具(由EpiVax研發之EpiMatrix)。

藉由篩選許多人抗體分離株之序列，EpiVax已鑑別若干被認為具有調控潛力的高度保守之HLA配體。實驗證據表明，該等肽中之許多實際上在大多數個體中係主動致耐受性的。該等高度保守、調控及混雜之T細胞表位現在稱為Tregitope (De Groot等人Blood. 2008 Oct 15；112(8):3303-11)。在存在大量Tregitope下，可有效地控制人類化抗體中含有之新表位之免疫原性潛力。

出於抗體免疫原性分析之目的，EpiVax已研發Tregitope調整之EpiMatrix評分及抗治療性抗體反應之相應預測。為了計算Tregitope調整之EpiMatrix評分，自EpiMatrix蛋白評分中扣除Tregitope之評分。已顯示Tregitope調整之評分與23種商業抗體之組之觀察到之臨床免疫反應充分相關(De Groot等人 Clin Immunol. 2009年5月；131(2):189-201)。

在EpiMatrix量表上之結果概述於下表7中。

表 7 ：

分子	重鏈 ( 人 %)	Epivax (VH)	Epivax (V κ )	輕鏈 ( 人 %)
	FR	V- 基因			FR	V- 基因
本發明之抗體 (純系I)	97	91	-27.27	-21.79	98	88

本發明之抗體之序列的評分在EpiMatrix量表之低端，指示本發明之抗體具有強烈有限之免疫原性潛力。該EpiMatrix量表為熟習此項技術者熟知，且尤其可參見出版物Mufarrege等人 Clin Immunol. 2017年3月；176:31-41之圖2。

實例 6 ：對活體內尖端細胞密度及無血管區之效能 ( 氧誘導之視網膜病變 OIR 模型 )

在氧誘導之視網膜病變(OIR)之小鼠模型中研究本發明之實例性抗體(純系I)對缺血性無血管區域之血管重建的效應。從出生後第7天至出生後第12天，將一窩C57Bl/6J小鼠暴露於75%氧氣之氣氛。此導致中央視網膜中血管之退化及無血管區域之形成。在返回至正常含氧條件後，此區域變得缺血。幼崽在出生後第12天在用異氟烷麻醉下在每隻眼中接受0.5 μl溶液中之10 μg抗體的單次玻璃體內注射。在出生後第17天，處死動物並摘出眼。將眼固定於福馬林(formalin)中，且製備視網膜平鋪片，其中用同工凝集素B4染色視網膜血管。在沿整個視網膜之無血管前端(視網膜之血管化外周區域及無血管中心區域之間之邊界)對尖端細胞(起始新血管形成之專門內皮細胞)之數目進行計數。

藉由顯示絲狀偽足延伸之其特殊形態鑑別尖端細胞。為了分析，將尖端細胞之數目正規化為無血管前端之長度。使用共焦顯微鏡及影像分析軟體測定無血管區域之大小。

本發明之抗-Sema3A抗體在小鼠OIR模型中增加尖端細胞密度(圖 4 )。此外，其顯示無血管區域之減少。尖端細胞密度與無血管區域之大小之間存在負相關，指示兩個參數之機械依賴性。使用針對TNP之對照抗體確認此效應係由於本發明之抗體對Sema3A之特異性靶。

總之，抗-Sema3A抗體在氧誘導之視網膜病變之動物模型中減小缺血性無血管區域之大小，指示對糖尿病黃斑缺血之有益效應。

實例 7 ：兔眼中抗 -Sema3A 及癌思停 (Avastin) t_1/2 之比較

結果概述於下表8中。

表 8 ：

計算之 t1/2 ( 天 )
	本發明之抗體 ( 純系 I)	癌思停
0-14 天	全部
玻璃體	5.1	3.9	4.4
視網膜	6.1	4.1	4.8
房水	4.7	3.3	4.5

玻璃體、視網膜及房水中之計算之半衰期分別為3.9、4.1及3.3天。該等半衰期與文獻中報導之臨床使用之重組人類化單株IgG1抗體癌思停(抗VEGF，貝伐珠單抗(bevacizumab)，Bakri等人，Opthalmology, 2007)之半衰期相似，其亦在內部實驗中得到證實。該等結果如預期，此乃因全長IgG之玻璃體內清除率主要取決於其分子大小，此與本發明之抗體及癌思停相似。因此，預期人PK (包括本發明之抗體及癌思停之眼部半衰期)係相似的。報導之癌思停之人眼部半衰期為9.73 ± 1.48天(Hutton-Smith, 2016)。

實例 8 ：本發明之抗體與 Chiome 抗體之間之結合親和性的比較

出於比較目的，本發明者研發針對WO2014123186 (Chiome Bioscience)中揭示之Sema3A之人類化抗體，其具有以下特徵： - 重鏈係如WO2014123186中之SEQ ID NO: 11中所示，且 - 輕鏈係如WO2014123186中之SEQ ID NO: 12中所示。本發明者已研發該抗體之2種形式： - 一種在IgG1KO Fc上格式化，在下文中稱為「Chiome抗體A」及 - 一種在裸IgG1KO-FcRn上格式化，在下文中稱為「Chiome抗體B」。

根據BioRad製造商手冊，經由6個水平通道上之直接胺偶合，將高表面密度之抗人Fab抗體(GE Healthcare)固定在GLM晶片(BioRad)上。

在6個垂直通道中之5個上以最小表面密度將本發明之抗體(純系I)及Chiome抗體捕獲於抗人Fab抗體表面上用於動力學結合分析。在PBS-T-EDTA緩衝液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0 nM之濃度製備人Sema3A。PBS-T-EDTA緩衝液注射液用作動力學數據分析之雙重參照。將人Sema3A溶液及PBS-T-EDTA緩衝液中之每一者以40 μL/min之流速在6個水平通道上同時注射10 min，隨後係2 hr解離期。藉由以100 µL/min之流速注射18 sec 10 mM pH2.1甘胺酸HCl (GE Healthcare)、之後以25 µL/min之流速注射60 sec PBS-T-EDTA來再生表面。將結合感測圖擬合至1:1朗繆爾模型以計算結合速率、解離速率及親和性。

本發明之抗體及Chiome抗體與人Sema3A結合之之動力學及親和性數據列於下表9中。

表 9 ：

樣品名稱	至 HuSema3A 之 KD
Chiome抗體A	56.4 nM
Chiome抗體B	55.9 nM
本發明之抗體(純系I)	32.0 pM

結論結果顯示，證明本發明之抗體比Chiome Bioscience揭示之先前技術抗體對人Sema3A具有更優異之結合親和性。

實例 9 ：本發明之抗體與 Samsung scFv 之間之結合親和性之比較

已對如WO2017074013 (Samsung)中揭示之scFv片段進行比較。

出於比較目的，本發明者已研發具有下表10中揭示之特徵之3個揭示之片段。

表 10 ：

抗體之名稱	序列	如 WO2017074013 中所述之 SEQ ID NO
Samsung scFv 1	重鏈	19
輕鏈	20
Samsung scFv 2	重鏈	21
輕鏈	22
Samsung scFv 3	重鏈	23
輕鏈	24

根據BioRad製造商手冊，經由6個水平通道上之直接胺偶合，將高表面密度之抗His抗體(GE Healthcare)固定在GLM晶片(BioRad)上。在6個垂直通道中之5個上以最小表面密度將Samsung ScFv抗體捕獲於抗His抗體表面上用於動力學結合分析。在PBS-T-EDTA緩衝液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0 nM之濃度製備人Sema3A。PBS-T-EDTA緩衝液注射液用作動力學數據分析之雙重參照。將人Sema3A溶液及PBS-T-EDTA緩衝液中之每一者以40 μL/min之流速在6個水平通道上同時注射10 min，隨後係1 hr解離期。藉由以100 µL/min之流速注射18 sec 10 mM pH2.1甘胺酸HCl (GE Healthcare)、之後以25 µL/min之流速注射60 sec PBS-T-EDTA來再生表面。將結合感測圖擬合至1:1朗繆爾模型以計算結合速率、解離速率及親和性。

使用相似方法進行本發明之抗體與人Sema3A (純系I)之結合，但使用山羊抗人IgG (Invitrogen)來捕獲本發明之抗體。本發明之抗體及Samsung ScFv與食蟹猴、小鼠、大鼠或兔Sema3A之結合亦使用相同方法進行。

本發明之抗體及Samsung scFv之動力學及親和性數據列於下表11中。

表 11 ：

抗體之名稱	至 HuSema3A 之 K_D (pM)	至 CynoSema3A 之 K_D (pM)	至小鼠 Sema3A 之 K_D (pM)	至大鼠 Sema3A 之 K_D (pM)	至兔 Sema3A 之 K_D (pM)
Samsung scFv 1	359	89.0	105	＜ 20	112
Samsung scFv 2	359	118	117	＜ 20	122
Samsung scFv 3	296	68.0	88.8	＜ 20	59.5
本發明之抗體(純系I)	34.7	35.0	35.0	23.5	40.1

結論

本發明之抗體對人、食蟹猴、小鼠或兔Sema3A之結合親和性高於如WO2017074013中揭示之3個Samsung scFv。

實例 10 ：根據本發明之兩種抗體之親和性的比較

本發明者已研發兩種具有如SEQ ID NO: 1至6中所繪示CDR的抗體。兩種抗體在Fc區中之差異在於：　一種抗體包含L234A及L235A之組合(抗體A)，且　另一抗體包含突變H435A (抗體B)，殘基係根據Kabat之EU索引編號。

在兩種抗體對具有如SEQ ID NO: 1至6中所繪示之CDR之人Sema3A的結合親和性方面未顯示統計學差異。因此，在本發明之針對Sema3A之抗體中維持對人Sema3A之親和性。

實例 11 ：針對 Sema3A 之市售抗體之功效

為了比較，本發明者測試靶向Sema3A之市售抗體之細胞活性。該抗體係由Creative Biolabs以參考「Anti-Human SEMA3A Therapeutic Antibody, Humanized (CAT#: TAB-556CL) 」商品化。該市售抗體在下文中稱為「Creative Biolabs抗體」。

藉由用實例3中揭示之相同方案量測人視網膜微血管內皮細胞(HRMEC)中之細胞骨架塌陷來評價Creative Biolabs抗體之細胞活性。刺激後5h進行功效之計算及測定。

在該等條件下，Creative Biolabs抗體對Sema3A誘導之細胞骨架塌陷不顯示任何活性。Creative Biolabs抗體實際上不能預防Sema3A誘導之細胞骨架塌陷。

因此，證明Creative Biolabs抗體不能預防視網膜細胞中Sema3A誘導之細胞骨架塌陷，而在相同條件下，本發明之抗體則能預防。此確認本發明之抗體之令人驚訝及出乎意料之效應。

圖 1 ： Sema3A於人眼中之定位. 此圖顯示與年齡匹配對照(年齡ctrl)及患有糖尿病但無眼部病狀之個體(DM ctrl)相比，在來自具有糖尿病視網膜病變或原發性開角型青光眼(POAG)病史之人供體之預先指定之視網膜樣品中，Sema3A在人眼中之定位。在視網膜血管之血管系統壁中發現Sema3A。另外，在視網膜神經節細胞層中觀察到未鑑別但獨特之Sema3A螢光物體。

圖 2 ：細胞滲透性分析中之效能. 在transwell分析中量測FITC-聚葡萄糖在人視網膜微血管內皮細胞中之滲透。抗TNP係對抗三硝基苯酚之對照抗體。抗-Sema3A係本發明之抗體(純系I)。顯示相對於重組人Sema3A之顯著性。

圖 3 ：HRMEC (Xcelligence)中之細胞骨架塌陷. Sema3A-F在人視網膜內皮細胞中均誘導細胞骨架塌陷。本發明之抗體(純系I)對Sema3A具有特異性，且僅預防Sema3A誘導之塌陷。

圖 4 ：對活體內尖端細胞密度及無血管區域之效能.(A) 及 (C) 在小鼠幼崽中氧誘導之視網膜病變之模型中研究尖端細胞密度及無血管區域。將動物自P7至P12暴露於75%氧氣，且在P12恢復至含氧量正常後，接受單次玻璃體內注射抗體。抗TNP係對抗三硝基苯酚之對照抗體。抗-Sema3A係本發明之抗體(純系I)。在P17，製備視網膜平鋪片，用同工凝集素B4染色並對尖端細胞進行計數及測定視網膜無血管區域之大小。(B) 顯示尖端細胞密度與無血管區域之間之相關性。

Claims

一種抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO：2之胺基酸序列(H-CDR2)、及SEQ ID NO：3之胺基酸序列(H-CDR3)；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO：5之胺基酸序列(L-CDR2)、及SEQ ID NO：6之胺基酸序列(L-CDR3)。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少80%、至少90%、至少95%、至少 98%或至少99%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；其中：該重鏈可變區包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO：2之胺基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO：3之胺基酸序列(H-CDR3)；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO：5之胺基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO：6之胺基酸序列(L-CDR3)。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.分別包含SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈； b.分別包含SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：11之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈；c.分別包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：12之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈；或d.分別包含SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：13之胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及輕鏈，其包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
如請求項1之抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之輕鏈；b.包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之輕鏈；c.包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之輕鏈；或d.包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之輕鏈。
一種如請求項1至7中任一項所定義之抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備藥劑。
一種如請求項1至7中任一項所定義之抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備用於抑制Sema3A之血管抑制效應(vasorepressive effect)之藥劑。
一種如請求項1至7中任一項所定義之抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備用於改良視網膜之血管重建之藥劑。
一種如請求項1至7中任一項所定義之抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製備用於治療或預防眼或視網膜疾病之藥劑。
如請求項11之用途，其中該疾病選自由以下組成之群：視網膜病變、缺血性視網膜病變；糖尿病視網膜病變，包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變；糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養性萎縮、近視性變性、視網膜動脈阻塞、眼內炎、葡萄膜炎、囊樣黃斑水腫、由任何視網膜疾病繼發之脈絡膜新生血管膜、視神經疾病、青光眼、視網膜剝離、毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、創傷性視網膜病變、藥物誘導之視網膜血管病變、視網膜新血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、福斯氏營養性萎縮(Fuch's dystrophy)、黃斑毛細血管擴張症、尤塞氏症候群(usher syndrome)及斯特格氏病(Stargardt disease)。
如請求項11之用途，其中該疾病選自由以下組成之群：糖尿病視網膜病變，包括增殖性糖尿病視網膜病變及非增殖性糖尿病視網膜病變；缺血性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、糖尿病黃斑缺血、年齡相關性黃斑水腫、視網膜新血管形成、青光眼及脈絡膜新血管形成。
如請求項11之用途，其中該疾病係糖尿病黃斑水腫及/或糖尿病黃斑缺血。
如請求項11至13中任一項之用途，其中該疾病係非增殖性糖尿病視網膜病變。
如請求項11至13中任一項之用途，其中該疾病係增殖性糖尿病視網膜病變。
如請求項11之用途，其中：該疾病係糖尿病黃斑缺血，且該抗體或抗原結合片段促進缺血性視網膜內之血管再生(血管重建)且預防眼之玻璃體區之病理性新血管形成。
如請求項11之用途，其中：該疾病係糖尿病黃斑水腫，且該抗體或抗原結合片段降低血液視網膜屏障之滲透性。
如請求項18之用途，其中該抗體或抗原結合片段抑制Sema3A誘導之該血液視網膜屏障之滲透性及/或Sema3A誘導之缺血性區域之血管消退。
如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸投與途徑、靜脈內投與途徑、玻璃體內投與途徑或皮下投與途徑來投與。
如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由玻璃體內途徑投與。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
如請求項22之醫藥組合物，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由非經腸投與途徑、靜脈內投與途徑、玻璃體內投與途徑或皮下投與途徑來投與。
如請求項22或23之醫藥組合物，其中該抗體或其抗原結合片段係藉由玻璃體內途徑來投與。
一或多種分離之聚核苷酸，其包含：編碼如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示之重鏈或如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示之重鏈可變區的序列；及編碼如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20中所示之輕鏈或如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中所示之輕鏈可變區的序列。
一種表現載體，其包含如請求項25之一或多種分離之聚核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項25之一或多種分離之聚核苷酸或如請求項26之表現載體。
一種產生抗-Sema3A抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：a.獲得如請求項27之宿主細胞；及b.培養該宿主細胞。
如請求項28之方法，其進一步包含回收及純化該抗體或其抗原結合片段。