TWI834114B - 聚合酶鏈反應之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種聚合酶鏈反應之方法。此方法使用特定波長之電磁波照射於紅外光區具有特定的透過率之氧化鎢奈米粒子，以使低濃度的氧化鎢奈米粒子可快速加熱反應溶液，從而縮短升溫時間，且提升聚合酶鏈反應的效率。
Description
本發明係有關於一種聚合酶鏈反應之方法，且特別是有關於一種使用氧化鎢奈米粒子之聚合酶鏈反應之方法。
習知的聚合酶鏈反應(PCR)係利用加熱將核酸片段(通稱為模板DNA)互補的雙股分開(即變性步驟)，再以引子對(即正向引子及反向引子)標的至核酸片段中之與個別引子的序列互補的核酸序列(即黏合步驟)，然後聚合酶依據核酸片段的核酸序列透過引子引導延伸複製出新的核酸產物(通稱為擴增子)[即延展(extension)步驟]。依序經歷前述之三個步驟(變性步驟、黏合步驟及延長步驟)稱為一個循環。進行一個循環後，接續回到前述之變性步驟，以進行下一個循環，直至核酸產物的數量達到預定的目標為止。
舉例而言，在PCR中，先於95℃持續15秒至30秒，以進行變性步驟，再降溫至適當的黏合溫度，持續30秒至60秒，以進行黏合步驟。然後，於70℃至75℃進行延展步驟，此步驟的時間依據待增幅之核酸片段的長度決定，通常為30秒至60秒。前述之變性步驟的變性可在瞬間就完成，且延展步驟之延展也能夠藉由精準地控制反應溶液的升溫，而提高聚合酶的聚合效率。然而，傳統的聚合酶連鎖反應儀器係使用金屬加溫組件或水達成熱平衡，其加熱速率無法應對變性步驟及延展步驟之溫度變化的需求，進而導致加熱時間冗長且耗能。
有鑑於此，亟需發展一種新的聚合酶鏈反應之方法，以改善習知的聚合酶鏈反應的上述缺點。
有鑑於上述之問題，本發明之一態樣是在提供一種聚合酶鏈反應之方法。此方法使用特定波長之電磁波照射於紅外光區具有特定的透過率之氧化鎢奈米粒子，以使低濃度的氧化鎢奈米粒子能快速加熱反應溶液，從而縮短升溫時間。
根據本發明之一態樣，提出一種聚合酶鏈反應之方法。於此方法中，混合複數個氧化鎢奈米粒子、核酸片段及反應試劑，以形成反應溶液，其中混合後此些氧化鎢奈米粒子之濃度為50ppm至1000ppm，且此些氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於2000nm之波長範圍的透過率為小於98%。然後，對反應溶液進行聚合酶鏈反應，以增幅核酸片段的一部分序列，其中聚合酶鏈反應使用電磁波照射反應溶液，以進行變性步驟及延展步驟，且電磁波之波長為400nm至2000nm。
依據本發明之一實施例，此些氧化鎢奈米粒子於380nm至780nm之波長範圍的透過率為大於40%。
依據本發明之另一實施例，此些氧化鎢奈米粒子於400nm至600nm之波長範圍的透過率為不小於50%。
依據本發明之另一實施例，此些氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於1100nm之波長範圍的透過率為不大於95%。
依據本發明之又一實施例，此些氧化鎢奈米粒子包含複數個氧化鎢奈米棒，此些氧化鎢奈米棒具有平均長度及平均直徑，且平均長度與平均直徑之比值為5至25。
依據本發明之又一實施例，此些氧化鎢奈米粒子具有通式(I)W
aO
b，於通式(I)中，W代表鎢，O代表氧，且b與a之比值(b/a)為1至3。
依據本發明之又一實施例，此些氧化鎢奈米粒子具有通式(II)W
aO
bM
c，於通式(II)中，W代表鎢，O代表氧，M代表鎳、鈀、鉑或其組合之金屬，且b與a及c的總合之比值[b/(a+c)]為1至3。
依據本發明之又一實施例，變性步驟及延展步驟之平均加熱速率為2℃/sec至23℃/sec。
依據本發明之又一實施例，變性步驟及延展步驟之升溫時間不大於15秒。
依據本發明之又一實施例，電磁波之功率為0.1W至2W。
應用本發明之聚合酶鏈反應之方法，其中藉由以特定波長之電磁波照射於紅外光區具有特定的透過率之氧化鎢奈米粒子，以使低濃度的氧化鎢奈米粒子可快速加熱反應溶液，從而縮短升溫時間，且提升聚合酶鏈反應的效率。
以下仔細討論本發明實施例之製造和使用。然而，可以理解的是，實施例提供許多可應用的發明概念，其可實施於各式各樣的特定內容中。所討論之特定實施例僅供說明，並非用以限定本發明之範圍。
本發明之聚合酶鏈反應之方法係利用特定波長之電磁波照射於紅外光區具有特定的透過率之氧化鎢奈米粒子，以使低濃度的氧化鎢奈米粒子能夠快速加熱反應溶液，從而縮短升溫時間，且提升聚合酶鏈反應的效率。此外，此些氧化鎢奈米粒子於可見光區具有高的透過率，以降低對於反應試劑中之螢光劑的激發光及放射光的吸收，從而降低聚合酶鏈反應的背景干擾。
請參閱圖1，聚合酶鏈反應之方法100係先混合複數個氧化鎢奈米粒子、核酸片段及反應試劑，以形成反應溶液，如操作110所示。此些氧化鎢奈米粒子具備光熱轉換的能力，故能將吸收的電磁波轉換成熱能，以加熱反應溶液。
氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於2000nm之波長範圍的透過率為小於98%。相當於，氧化鎢奈米粒子於紅外光區的吸收度為不小於2%。倘若氧化鎢奈米粒子於紅外光區的吸收度小於2%，氧化鎢奈米粒子不能有效地吸收電磁波以轉換成熱能，故不能有效地加熱反應溶液。較佳地，氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於1100nm之波長範圍的透過率為不大於95%。
進一步，聚合酶鏈反應之方法100使用之反應溶液含有螢光劑，此螢光劑遭受激發光照射後而放射螢光，此螢光用於偵測核酸產物的數量，從而做為定量原始的核酸片段含量的依據。添加的氧化鎢奈米粒子對於螢光劑吸收激發光及放射螢光愈不干擾，則可提高聚合酶鏈反應之方法後續之定量的準確性及/或靈敏度。
再者，通常螢光劑之激發光與放射光的波長位於可見光區，故可藉由控制氧化鎢奈米粒子於可見光區之透過率來提高聚合酶鏈反應之方法後續之定量的準確性及/或靈敏度。在一些實施例中，氧化鎢奈米粒子於380nm至780nm之波長範圍(相當於可見光區)的透過率為大於40%。較佳地，氧化鎢奈米粒子於400nm至600nm之波長範圍的透過率為不小於50%。在一些具體例中，氧化鎢奈米粒子於可見光區之波長範圍的一部分波長之透過率為大於40%，例如450nm、500nm、550nm及其組合(如450nm至550nm或500nm至550nm)。然而，在另一些實施例中，氧化鎢奈米粒子於可見光區可具有吸收度，而僅於激發光及螢光的波長範圍不具吸收度，或者其吸收度很低，而不會產生干擾，例如吸收度小於28%，較佳小於20%，且更佳小於10%。再者，前述之氧化鎢奈米粒子亦可將所吸收之可見光轉換成熱能，以加熱反應溶液。
據此，在上述之實施例中，本發明之聚合酶鏈反應之方法100可排除膠電泳步驟，而無需藉由膠電泳移除氧化鎢奈米粒子，從而簡化後續定量核酸片段含量的步驟。然而，在另一些實施例中，聚合酶鏈反應之方法可選擇性進行膠電泳步驟，以移除氧化鎢奈米粒子後，再進行後續定量核酸片段含量的步驟，以更提高定量的準確性及/或靈敏度。
氧化鎢奈米粒子可具有各種形狀，例如球狀、棒狀、線狀或柱狀。在一些實施例中，氧化鎢奈米粒子可為但不限於氧化鎢奈米棒。氧化鎢奈米棒可具有平均長度及平均直徑，其中平均長度可為250nm至550nm，且平均直徑可為20nm至50nm。若以穿過奈米棒之長軸的剖面觀之，前述之平均直徑亦可稱作平均寬度。
在一些具體例中，平均長度與平均直徑之比值可為5至25。前述之平均長度與平均直徑之比值亦稱為縱橫比。較佳地，縱橫比可為6至23。當縱橫比為前述之範圍時，氧化鎢奈米粒子的吸收峰往短波長(如移至紅外光區)移動，從而降低或消除於可見光區的吸收，故減少對螢光劑放射螢光的干擾。
在一些實施例中，氧化鎢奈米粒子具有通式(I)W
aO
b，於通式(I)中，W代表鎢，O代表氧，且b與a之比值(b/a)為1至3。當氧化鎢奈米粒子具有通式(I)時，氧化鎢奈米粒子於紅外光區具有吸收度，以提升氧化鎢奈米粒子之光熱轉換的能力。b與a之比值較佳可為大於2且小於3，其中氧化鎢奈米粒子的氧原子不足而存在自由電子，故增強氧化鎢奈米粒子吸收紅外光，從而更提升氧化鎢奈米粒子之光熱轉換的能力。
除了氧及鎢之外，氧化鎢奈米粒子之組成元素可選擇性包含第Ⅷ族的過渡金屬元素。換句話說，氧化鎢奈米粒子之材料包含未經摻雜的及經摻雜的氧化鎢，此些摻雜的過渡金屬元素可增強氧化鎢奈米粒子的紅外光吸收，從而提升此些奈米粒子之光熱轉換的能力。
舉例而言，在一些實施例中，氧化鎢奈米粒子具有通式(II)W
aO
bM
c，於通式(II)中，W代表鎢，O代表氧，M代表鎳、鈀、鉑及其組合之金屬，且b與a及c的總合之比值[b/(a+c)]為1至3。當b與a及c的總合之比值為前述之範圍時，更增強氧化鎢奈米粒子的紅外光吸收，從而更提升此些奈米粒子之光熱轉換的能力。
此外，前述之核酸片段做為模板DNA。本發明之核酸片段沒有特別限制，且可為本發明技術領域中具有通常知識者所習知者。舉例而言，核酸片段可包含感染性微生物之核酸，如細菌、病毒、真菌及寄生蟲等。
再者，前述之反應試劑可包含聚合酶、引子對、核苷酸鹼基、螢光劑及緩衝溶液，其皆可為本發明技術領域中具有通常知識者所習知者。如具有通常知識者所理解的，引子對之設計必需依據前述之核酸片段的序列，以使引子黏合至核酸片段的單股上，進而實現聚合酶鏈反應之目的。
在氧化鎢奈米粒子、核酸片段及反應試劑形成之反應溶液中，氧化鎢奈米粒子之濃度為50ppm至1000ppm。倘若氧化鎢奈米粒子之濃度小於50ppm，過少的氧化鎢奈米粒子對於反應溶液之加熱效果不佳，而不能達成縮短升溫時間。反之，倘若氧化鎢奈米粒子之濃度大於1000ppm，過多的氧化鎢奈米粒子大幅降低可見光區的透過率，而干擾螢光劑放射螢光，故無法定量核酸片段的含量。進一步，氧化鎢奈米粒子之濃度較佳可為50ppm至500ppm，更佳可為300ppm至350ppm。
於操作110後，聚合酶鏈反應之方法100對反應溶液進行聚合酶鏈反應，以增幅核酸片段的部分序列，如操作120所示。前述之聚合酶鏈反應係使用電磁波照射反應溶液，以進行變性步驟及延展步驟。於變性步驟及延展步驟中，電磁波照射反應溶液中之氧化鎢奈米粒子，其吸收電磁波後產生熱能，此熱能加熱反應溶液。
電磁波之波長為400nm至2000nm，相當於電磁波之頻率為150THz至750THz。換句話說，電磁波包含可見光、近紅外線及遠紅外線。由於電磁波被氧化鎢奈米粒子所吸收，所以氧化鎢奈米粒子的吸收特性決定電磁波的波長。如前所述，氧化鎢奈米粒子的吸收特性可受形狀及摻雜物之影響。舉例而言，在一些實施例中，電磁波之波長可為780nm至2000nm，以使吸收近紅外線之氧化鎢奈米棒產生熱能，進而加熱反應溶液。相同地，吸收可見光之氧化鎢奈米粒子亦可於可見光照射下，加熱反應溶液。
此外，電磁波之功率會影響氧化鎢奈米粒子對於反應溶液之加熱速率，其中功率愈大，加熱速率愈大，且反之則相反。在一些實施例中，電磁波之功率可為0.1W至2W。當電磁波之功率為前述之範圍時，具有此功率的電磁波能夠使氧化鎢奈米粒子快速產生足夠的熱能，以使平均加熱速率達到變性步驟及延展步驟之溫度變化的需求，從而縮短升溫時間，且藉由精準控制反應溶液的升溫，而提高聚合酶的聚合效率。
在一些實施例中，變性步驟及延展步驟之平均加熱速率為2℃/sec至23℃/sec。當平均加熱速率為前述之範圍時，其可對應於變性步驟之快速升溫的需求，以縮短升溫時間，且精準控制延展步驟之升溫，而提高聚合酶的聚合效率，故提升聚合酶鏈反應的效率。在一些具體例中，變性步驟及延展步驟之升溫時間不大於15秒。較佳地，變性步驟及延展步驟之升溫時間可分別為5秒至15秒及1秒至4秒。當升溫時間為前述之範圍時，可更縮短升溫時間，從而提升聚合酶鏈反應的效率。較佳地，變性步驟及延展步驟之升溫時間不大於10秒。
以下利用實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
奈米粒子之製造
實施例1
實施例1之氧化鎢奈米棒係利用水熱法製得，其中混合1mg至300mg之鎢的鹵化物、1mL至20mL之0.1M至1.5M的鹽酸及1mL至20mL的油墨[包含聚乙二醇(PEG)、乙二醇(EG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及甘油之水溶液]後獲得混合物，再以0.01mL至1mL的N
2H
4進行還原，以獲得實施例1之氧化鎢奈米棒。然後，以後述之評價方式進行評價。
實施例2至3及比較例1
實施例2至3之經摻雜的氧化鎢奈米棒及比較例1之氧化鐵奈米粒子均以與實施例1相似的方法製造。不同的是，實施例2至3減少鎢的鹵化物，且實施例2添加0.1mg至80mg之鉑的鹵化物，而實施例3添加0.1mg至80mg之鈀的鹵化物。此外，比較例1使用鐵的鹵化物取代鎢的鹵化物。前述實施例1至3及比較例1之評價結果如下表1所示。
評價方式
1.氧化鎢奈米粒子的透過率之試驗
透過率之試驗係使用光譜儀量測氧化鎢奈米粒子的光譜，光譜包含可見光區及紅外光區，其中試驗條件為具有通常知識者所慣用者。
2.氧化鎢奈米粒子的尺寸之試驗
尺寸之試驗係使用電子顯微鏡量測氧化鎢奈米粒子的尺寸，如粒徑，其中試驗條件為具有通常知識者所慣用者。當氧化鎢奈米粒子為氧化鎢奈米棒時，尺寸包含平均長度及平均直徑，並求得平均長度與平均直徑之比值(亦稱作縱橫比，且以四捨五入計)。
3.氧化鎢奈米粒子的元素含量之試驗
元素含量之試驗係使用化學元素分析儀進行，並藉由測得之元素含量計算出氧化鎢奈米粒子的組成通式，其中試驗條件為具有通常知識者所慣用者。
4.不同奈米粒子之加熱速率的比較試驗
加熱速率的比較試驗係分別添加實施例1至3及比較例1所製得之奈米粒子至體積為20μL之反應試劑，再以波長為808nm且功率為1W之電磁波照射含有奈米粒子之此些反應試劑，以進行加熱，並紀錄此些反應試劑之溫度變化曲線，如圖2及圖3所示，並以由28℃升溫至60℃之溫度差值(即32℃)除以所需之時間區間求得平均加熱速率，結果顯示於表1。
5.干擾之試驗
5.1增幅反應之干擾試驗
增幅反應之干擾試驗係以與後續應用例1相似及相同的聚合酶鏈反應進行，其中相同者為使用氧化鎢奈米棒且照射電磁波，而相似者之差異處在於，未使用氧化鎢奈米棒或未照射電磁波，以確認氧化鎢奈米棒可藉由照射電磁波來加熱反應溶液，且經加熱之反應溶液的升溫情況可使聚合酶進行聚合酶鏈反應。此外，亦可確認此些氧化鎢奈米棒不影響聚合酶進行核酸增幅反應。
詳述之，使用濃度分別為660ppm及330ppm的氧化鎢奈米棒，並以程式控制波長為8.08×10
2nm之電磁波照射反應溶液的條件，以對反應溶液進行聚合酶鏈反應。開啟功率為1W的電磁波，從25℃以5℃/sec至10℃/sec的平均加熱速率加熱反應溶液至95℃(升溫時間為7至15秒)；降低電磁波的功率後，持溫1秒至30秒，進行變性步驟；關閉電磁波並開啟風扇，以降溫至56℃，持溫1秒至30秒，進行黏合步驟；然後開啟功率為1W的電磁波，以5℃/sec至10℃/sec的平均加熱速率加熱反應溶液至72℃(升溫時間為1.6至3.2秒)，持續1秒至30秒，以進行延展步驟。依序進行前述之三個步驟稱作一個循環，且重複循環40次後終止，即完成增幅核酸片段的一部分序列，從而獲得核酸產物，再對獲得之核酸產物進行膠電泳，並以電泳的結果確認藉由電磁波照射氧化鎢奈米棒可控制反應溶液的升溫情況，以使聚合酶進行聚合酶鏈反應，且此些氧化鎢奈米棒可不影響聚合酶進行核酸增幅反應，其結果如圖4所示。
5.2不同奈米粒子之背景干擾的比較試驗
背景干擾的比較試驗係分別添加實施例1及比較例1所製得之奈米粒子至體積為20μL之反應試劑中，以波長為488nm之激發光照射含有奈米粒子之反應試劑，並量測其所放射之波長為520nm之螢光的強度，結果如表1及圖5所示，其中使用未添加奈米粒子的反應試劑測得之螢光強度做為100%的基準，以求得添加奈米粒子的反應試劑之螢光強度。
表1
備註：「N/A」表示未進行此項試驗。
| 實施例 | 比較例 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | |||
| 材料 | 奈米粒子 | 氧化鎢奈米棒 | 摻雜鉑的氧化鎢奈米棒 | 摻雜鈀的氧化鎢奈米棒 | 氧化鐵奈米粒子 | |
| 評價 結果 | 透過率(%) | 450nm | 75 | 72 | 94 | 69 |
| 500nm | 85 | 82 | 95 | 79 | ||
| 550nm | 92 | 87 | 95 | 85 | ||
| 800nm | 92 | 96 | 97 | 99 | ||
| 900nm | 91 | 96 | 97 | 99 | ||
| 1000nm | 90 | 93 | 97 | 99 | ||
| 1100nm | 87 | 93 | 97 | 99 | ||
| 尺寸 | 平均長度(nm) | 297~507 | 297~507 | 297~507 | 球狀 (60~150) | |
| 平均直徑(nm) | 25~47 | 25~47 | 25~47 | |||
| 縱橫比 | 6~20 | 6~20 | 6~20 | |||
| 元素含量 | 通式 | W aO bb/a=1~3 | W aO bPt cb/(a+c)=1~3 | W aO bPd cb/(a+c)=1~3 | ||
| 平均加熱速率(℃/sec) | 1000ppm | 21.3 | N/A | N/A | 6.1 | |
| 330ppm | 6.4 | 6.4 | 5.3 | N/A | ||
| 背景干擾(%) | 250ppm | 5 | N/A | N/A | 34 | |
| 500ppm | 2.5 | N/A | N/A | 37 | ||
| 1000ppm | 1.3 | N/A | N/A | 36 |
聚合酶鏈反應的方法
應用例1
應用例1係使用前述之實施例1所製得之氧化鎢奈米棒進行聚合酶鏈反應，其中混合氧化鎢奈米棒、核酸片段及反應試劑，以形成體積為20μL之反應溶液。詳述之，反應試劑包含聚合酶、引子對、核苷酸鹼基、螢光劑及緩衝溶液，其中聚合酶、核苷酸鹼基、螢光劑及緩衝溶液係使用由羅氏公司製造之試劑(商品名為KAPA SYBR FAST qPCR套件)，且依據此商品使用說明書添加反應試劑。再者，以基因轉殖之大腸桿菌的核酸萃取物為例子，核酸片段的濃度為0.1μg/mL，其添加體積為1μL，且引子對之正向引子為如SEQ ID NO:1所示之序列，反向引子為如SEQ ID NO:2所示之序列。
然後，使用即時偵測聚合酶鏈反應機器進行聚合酶鏈反應。使用與前述之增幅反應之干擾試驗相同的反應溫度及時間之條件，重複至預定的循環次數(如圖6所示)後終止，即完成增幅核酸片段的一部分序列，從而獲得核酸產物。每次循環結束即偵測所擴增核酸產物的螢光訊號，並計算增加的訊號差值ΔRn，所得到的螢光訊號增幅曲線如圖6所示。此外，需說明的是，應用例1之聚合酶鏈反應的降溫步驟係使用與習知的PCR儀器相同的風扇進行降溫，且其條件可與習知的PCR儀器相同，故不再贅述。
比較應用例1
比較應用例1係以與應用例1相似的方法進行。不同的是，比較應用例1使用氧化鐵奈米粒子取代氧化鎢奈米棒，其中增幅曲線如圖7所示。
根據表1之透過率與平均加熱速率之結果，以及圖2至圖3，實施例1至3之氧化鎢奈米材料於800nm至1100nm的透過率相較於比較例1之氧化鐵奈米粒子更低，故實施例1至3之奈米材料可吸收波長為800nm至1100nm之電磁波(例如紅外光)，並轉換成熱能，以加熱反應溶液，從而提高平均加熱速率。據此，實施例1至3之奈米材料能夠更快速地加熱反應溶液，以利於更有效地控制變性步驟及延展步驟之反應溶液的溫度，如縮短升溫的時間，從而提升聚合酶鏈反應之效率。
其次，參照表1之元素含量之結果，實施例2之摻雜鉑的氧化鎢奈米棒及實施例3之摻雜鈀的氧化鎢奈米棒皆可藉由摻雜的過渡金屬提高氧空缺，而增加自由電子，此自由電子可提升奈米材料於紅外光區之吸收度(也就是降低紅外光區之透過率)，故提升奈米材的光熱轉換率。
進一步，根據表1之尺寸及平均加熱速率之結果，以及圖2至圖3，相較於球狀之比較例1之氧化鐵奈米粒子，實施例1至3之奈米材料均為棒狀，其具有縱橫比。藉由5至25之縱橫比，奈米棒可更提升奈米材的光熱轉換率，故可更有效地控制變性步驟及延展步驟之反應溶液的溫度。
此外，根據圖4，「M」代表標準品，「C」代表未使用奈米粒子之聚合酶鏈反應方法所獲得之核酸產物，「A1」代表使用660ppm之氧化鎢奈米棒且照射808nm的電磁波之聚合酶鏈反應方法所獲得之核酸產物，「A2」代表使用330ppm之氧化鎢奈米棒且照射808nm的電磁波之聚合酶鏈反應方法所獲得之核酸產物，「B1」代表使用660ppm之氧化鎢奈米棒且未照射電磁波之聚合酶鏈反應方法所獲得之核酸產物，「B2」代表使用330ppm之氧化鎢奈米棒且未照射電磁波之聚合酶鏈反應方法所獲得之核酸產物。
詳述之，使用濃度為660ppm及330ppm之實施例1的氧化鎢奈米棒進行聚合酶鏈反應方法，由其所獲得之核酸產物與未使用奈米材進行的方法所獲得之核酸產物相同，即二者的鹼基對長度均為100bp。其次，經由電泳膠片影像的分析，使用330ppm之氧化鎢奈米棒所獲得之核酸產物的亮度與使用660ppm之氧化鎢奈米棒所獲得之核酸產物的亮度一致。據此，添加的氧化鎢奈米棒不會影響聚合酶進行核酸增幅反應。
進一步，根據表1之透過率與背景干擾之結果，以及圖5，實施例1至3之氧化鎢奈米材料於450nm至550nm的透過率相較於比較例1之氧化鐵奈米粒子更高，故實施例1至3之奈米材料對於波長為450nm至550nm之電磁波(例如可見光)之吸收較低，以降低對於反應試劑中之螢光劑的激發光及放射光的吸收，從而降低背景干擾。進一步，根據背景干擾之結果，經計算後(以四捨五入計)，比較例1之氧化鐵奈米粒子產生之背景干擾為實施例1之氧化鎢奈米棒產生之背景干擾的7至28倍。
接續，根據圖6及圖7，「ΔRn」代表含有奈米材料之反應溶液於核酸增幅反應前與後之螢光強度的差值。使用82.5ppm至660ppm的實施例1之氧化鎢奈米棒均可進行PCR反應。然而，必需低至125ppm的比較例1之氧化鐵奈米粒子才能達到與660ppm氧化鎢相近的ΔRn螢光強度差值(約25000)。據此，氧化鎢奈米棒具有較佳的透光率，故可降低氧化鎢奈米棒對偵測核酸產物螢光的干擾。進一步，當氧化鎢奈米棒的濃度為660ppm時，最大的ΔRn為25000，然而當氧化鐵奈米粒子的濃度為125ppm時，其最大的ΔRn為24000。若視二者ΔRn相當，二者之濃度的比值為5.28倍(660/125=5.68)，此亦可看出，使用實施例1之氧化鎢奈米棒的方法具有較低的干擾。
綜上所述，本發明之聚合酶鏈反應之方法係利用特定波長之電磁波照射於紅外光區具有特定的透過率之氧化鎢奈米粒子，以使低濃度的氧化鎢奈米粒子能夠快速加熱反應溶液，從而縮短升溫時間，且提升聚合酶鏈反應的效率。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100:方法
110,120:操作
為了對本發明之實施例及其優點有更完整之理解，現請參照以下之說明並配合相應之圖式。必須強調的是，各種特徵並非依比例描繪且僅係為了圖解目的。相關圖式內容說明如下：
圖1係繪示根據本發明之一實施例的聚合酶鏈反應之方法的流程圖。
圖2係繪示分別使用本發明之實施例1及比較例1之奈米粒子進行加熱反應試劑時之溫度變化曲線。
圖3係繪示分別使用本發明之實施例1至實施例3之奈米粒子進行加熱反應試劑時之溫度變化曲線。
圖4係繪示分別使用本發明之實施例1之奈米粒子進行傳統的聚合酶鏈反應(未使用電磁波之聚合酶鏈反應)與使用電磁波之聚合酶鏈反應之干擾比較試驗的電泳膠片影像。
圖5係繪示分別使用本發明之實施例1及比較例1之奈米粒子進行背景干擾的比較試驗的結果圖。
圖6係繪示根據本發明之應用例1之聚合酶鏈反應之方法的增幅曲線。
圖7係繪示根據本發明之比較應用例1之聚合酶鏈反應之方法的增幅曲線。
100:方法
110,120:操作
Claims (10)
- 一種聚合酶鏈反應之方法，包含：混合複數個氧化鎢奈米粒子、一核酸片段及一反應試劑，以形成一反應溶液，其中混合後該些氧化鎢奈米粒子之一濃度為50ppm至1000ppm，該些氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於2000nm之一第一波長範圍的一第一透過率為小於98%，該些氧化鎢奈米粒子包含複數個氧化鎢奈米棒，且該些氧化鎢奈米粒子之一材料包含未經摻雜的氧化鎢及/或經摻雜的氧化鎢；以及對該反應溶液進行該聚合酶鏈反應，以增幅該核酸片段的一部分序列，其中該聚合酶鏈反應使用一電磁波照射該反應溶液，以進行一變性步驟及一延展步驟，且該電磁波之一波長為400nm至2000nm。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米粒子於380nm至780nm之一第二波長範圍的一第二透過率為大於40%。
- 如請求項2所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米粒子於400nm至600nm之一第三波長範圍的一第三透過率為不小於50%。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米粒子在大於780nm且不大於1100nm 之一第四波長範圍的一第四透過率為不大於95%。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米棒具有一平均長度及一平均直徑，且該平均長度與該平均直徑之一比值為5至25。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米粒子具有一通式(I)WaOb，於該通式(I)中，W代表鎢，O代表氧，且b與a之一比值(b/a)為1至3。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該些氧化鎢奈米粒子具有一通式(II)WaObMc，於該通式(II)中，W代表鎢，O代表氧，M代表鎳、鈀、鉑或其組合之金屬，且b與a及c的總合之一比值[b/(a+c)]為1至3。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該變性步驟及該延展步驟之一平均加熱速率為2℃/sec至23℃/sec。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該變性步驟及該延展步驟之一升溫時間不大於15秒。
- 如請求項1所述之聚合酶鏈反應之方法，其中該電磁波之一功率為0.1W至2W。
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