TWI824976B - 包含多孔微球的靜相媒質的製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種用於吸附層析術的靜相媒質，其呈現適合被填充於層析管柱的多孔微球的形式。這些多孔微球由交聯高分子材料製成，而且形成有許多相互連接的巨孔以構成一多孔網絡。本案多孔微球具有特定的內部多孔網絡直徑相對於微球粒徑的比例，而且該多孔網絡透過多個開口與外界連通，以容許分子以對流方式傳輸通過位於微球內部的多孔網絡，以便在流動相的高流速下達到低背壓值，並且對於分子有較高吸附載量且於流速提升時仍能維持一致。

Description

包含多孔微球的靜相媒質的製造方法
本發明關於一種用於吸附層析術的靜相媒質，尤其是關於一種被製作成高分子多孔微球形式的靜相媒質，其適合被填充於層析管柱，而以高通量、高效率和低背壓來分離分子。
近幾年的新冠病毒Covid-19全球大流行，疫苗開發及生產上對於使用吸附層析術來純化生物分子的需求急遽地升高。吸附層析術是流體層析的一種類型，其藉由使一混合物中之某成份從移動相選擇性地吸附至固態靜相而分離出該成份。多孔樹脂珠已經被廣泛地用來作為吸附層析術中的靜相。典型的樹脂珠形成有直徑為數奈米至數十奈米的曲折微孔網絡，容許存在於移動相中的低分子量溶質擴散進出微孔。如圖1所示，這些微孔通常位於靠近樹脂珠的外表面處，而且彼此不相連。大多數的吸附表面位於樹脂珠內部，只能夠透過擴散作用抵達。雖然習用樹脂珠已被證實在分離小分子上非常有用，但它們在分離大分子上的表現不佳，因為大分子無法進入小尺寸的微孔。換句話說，大分子只能結合於樹脂珠的表面，造成吸附載量低下。對於容易受到酵素降解或其他破壞性狀況影響的生物分子而言，分離速率低下尤其有害。以樹脂作為基礎的層析術還具有其他缺 點，由於珠粒內的擴散作用乃是吸附過程中的速率決定步驟，所以解析度會隨著流速的上升而降低，而樹脂珠之間的對流流動不足則導致跨越整個層析管柱的高壓降。所有的這些缺點都造成了分離效率的降低和令人無法滿意的分子生產率。一般而言，運用傳統樹脂珠作為靜相媒質的層析過程需要數日才能完成，因而非常耗時且成本也高。
圖2顯示一種習用的吸附層析管柱，其包含一中空長形管體，上、下兩端開口各設有蓋體，容許液體流動相由上而下流經管柱。管柱內部充填有多孔性材料，此材料可以是具多孔結構的塊狀整體柱材料(block-shaped porous monoliths)、微粒(micro particulates)或微球(microspheres)。管柱內部填充的多孔性材料對於一或多種物質具有吸附效果，並且有其吸附量的上限，吸附達飽和時則無法再吸附。這些多孔性材料對於某特定樣品在單位體積的填充材料中吸附達飽和所需的量，稱為吸附載量(binding capacity，以mg/mL表示)。量測吸附載量時，通常是將溶有該特定樣品的流動相由上方開孔流經管柱，使樣品在管柱內受到填充材料表面官能基的吸附。從管柱下方流出的流動相經由UV偵檢器檢測。一開始流出的流動相，因樣品被填充材料吸附，所以只會在出口處觀察到很低的吸收值對應到低的樣品濃度。當吸附量達上限時，則會觀察到樣品的吸收訊號開始上升，說明管柱內部填充材料已達吸附量上限，因此出口處的流動相內樣品濃度開始提升。當吸附量達上限後，其樣品的UV吸收值最後會達到最大值(QB100)。通過上升曲線，計算出口處的UV吸收值達最大值的10%時(QB10)所注入的樣品量，稱做動態吸附載量 (dynamic binding capacity，DBC；以mg/mL表示)。液體流動相以固定或是隨時間變化的流速(v，通常以公分/小時表示)流經管柱，流動過程在管柱上下開口間所產生的壓力差稱做背壓(△p，通常以MPa表示)。
在層析純化的應用中存在有兩個重要需求：第一，希望純化過程中產生的背壓較低，或是內部填充材料的機械強度夠高以承受高背壓，低背壓可以避免超出層析管柱裝置或是內部填充材料的承受壓力之上限，進而提升操作流速以及提升應用端製程純化的效率。第二，希望在層析管柱的純化應用中，填充材料的DBC不會隨著流動相的流速提升而降低，在提升流速的同時仍能維持其吸附載量。
業界已經付出了許多努力來因應上述需求。圖3A顯示兩種代表性的習用陰離子交換管柱的背壓數據，其中CIMmultusTM QA管柱(購自於BIA Separations，斯洛維尼亞)填充有一種以聚甲基丙烯酸甲酯為主且具有2微米孔徑的整體柱，而CaptoTM Q管柱(購自於Danaher Corporation，美國)填充有多孔瓊脂膠體(agarose)微球，其表面具有許多直徑約20-50奈米、單端開口且互不相通的擴散微孔。圖3A顯示填充有塊狀整體柱材料的CIMmultusTM QA管柱(以符號◆標示)在流動相通過管柱內的整體柱材料時會產生巨大的背壓，且背壓隨著流速提升而線性增加(斜率為1.27×10-3MPa hr cm-1)，不利於產品使用的穩定性。另一方面，填充有多孔瓊脂膠體微球的CaptoTM Q管柱(以符號▲標示)，其所得到的背壓隨流速提高上升較慢(斜率為8.3×10-5MPa hr cm-1)，體現較佳的產品穩定性。然而，多孔瓊脂膠體微球受限於其結構強度較弱，會因為壓力上升而 造成結構變形、孔洞塌陷，進而造成管柱阻塞的現象。如圖3A所示，當流速超過500cm/hr後，CaptoTM Q管柱的背壓會快速上升(請參見例如Nweke,M.C.et al.,Mechanical characterisation of agarose-based chromatography resins for biopharmaceutical manufacture,J.Chromatogr.A,(2017),1530：129-137)，大大的限制了該管柱的使用範圍及效率。由於上述的習用層析管柱皆會因為背壓提升而導致不可逆的損壞，所以在其產品說明中皆建議操作流速必須少於其建議值(600cm/hr)。
圖3B顯示前述兩種代表性的習用陰離子交換管柱用於分離分子時的動態吸附載量(DBC)數據，其中以甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，TGY)作為代表性分子。就填充有多孔瓊脂膠體微球的CaptoTM Q管柱而言(以符號▲標示)，帶有TGY的流動相流過管柱內的微球時，流動相中的TGY主要是以擴散(diffusion)的方式進行物質傳輸(mass transfer)，亦即，TGY是從微球表面的多孔結構擴散進去後被吸附。由於TGY的分子尺寸比微球表面的擴散孔更大，其擴散進入微孔結構的效率顯著降低(對於TGY的DBC為1-2mg/mL)。因此，這類管柱不適用在生物分子的純化應用上。另一方面，就填充有塊狀整體柱材料的CIMmultusTM QA管柱而言(以符號◆標示)，其內部孔洞較大(直徑約2微米)，又因其為整體柱結構，流動相完全在結構內部流動，所以TGY是以對流(convection)方式傳輸並被整體柱的內部表面所吸附，比起擴散可以更有效率的直接接觸到整體柱結構內部的表面而被吸附，因此對於分子的吸附載量遠比微球型產品更佳(對於TGY的DBC為22mg/mL)。
因此，相關業界仍需要一種靜相媒質，其被製作成適合被填充於層析管柱的高分子多孔粒子的形式，於流動相的高操作流速下具有低背壓及/或結構不會遭到破壞，而且其DBC不會隨著流動相的流速提升而降低，在高操作流速下仍能對於分子維持良好的吸附載量。
為了克服前述缺點，本發明提供了一種用於吸附層析術的靜相媒質，其呈現一群適合被填充於層析管柱的多孔微球的形式。各個多孔微球由交聯高分子材料製成，而且形成有許多相互連接的巨孔以構成一多孔網絡。該多孔網絡提供一個極大的比表面積作為吸附表面，使分子容易接近並且附著。更重要的是，本案多孔微球具有特定的內部多孔網絡直徑相對於微球粒徑的比例，而且該多孔網絡透過多個開口與外界連通，以容許分子以對流方式傳輸通過位於微球內部的多孔網絡，以便在流動相的高流速下達到低背壓值，並且對於分子有較高吸附載量且於流速提升時仍能維持一致，從而克服相關技術領域中長久存在的產業問題。
因此，本案第一態樣提供一種用於吸附層析術的靜相媒質，其特別適合用於分離分子。該靜相媒質包含：多個多孔微球，各個微球內形成有許多球狀巨孔，所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一開放性多孔網絡(open porous network)，該多孔網絡透過位於該微球外表面的多個開口與外界呈流體連通；其中所述各個多孔微球滿足於下式(1)： d 孔洞 /d 微球 ≧(0.45/n)..................(1)
其中d 孔洞 為該多孔網絡的等效直徑，d 微球 為多孔微球的粒徑，而n為微球中多孔網絡連通外表面的開口的數目，且n≧2，n為整數。
本案第二態樣提供一種用於製造前述靜相媒質的方法，其包含下列步驟：A)在一聚合起始劑和一乳化安定劑的存在下，將一包含至少一種單體和一交聯劑的連續相組成物，與一包含一溶劑的分散相組成物加以乳化，以得到一包含有一連續相和一被分散於該連續相內的分散相的第一乳液；B)將該第一乳液以及一不與該第一乳液相混溶的第三相加以混合並以剪切裝置施予剪切力將其製備成分散於該第三相的第一巨滴乳液，隨後透過一微滴裝置將該第一巨滴乳液更進一步微滴化地均勻分散於該第三相，以得到一包含有該第三相和被分散於該第三相內的單分散性高內相乳液微滴的第二乳液；以及C)固化該連續相，並且去除該分散相和該第三相，以獲得呈多孔微球狀的靜相媒質。
在一較佳具體例中，所述多孔微球的d 孔洞 大於150奈米，更佳為大於300奈米，又更佳為大於500奈米。
在一較佳具體例中，所述多孔微球的d 微球 小於500微米，更佳為小於300微米，又更佳為小於200微米。
在一較佳具體例中，該靜相媒質經過表面改質而具有離子交換官能基。在一更佳具體例中，該離子交換官能基選自於由四級銨、二乙基胺乙基、磺醯基和羧甲基所組成的群組。
在較佳的具體例中，前述多孔微球由交聯高分子材料製成。在更佳的具體例中，該交聯高分子材料選自於由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚吡咯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚矽氧所組成的群組。在更佳的具體例中，該交聯高分子材料選自於聚甲基丙烯酸酯。
在更佳的具體例中，前述多孔微球具有單分散性，而且具有70%至90%的孔隙率(porosity)。
本案第三態樣提供一種由前述方法所製成的靜相媒質。
本案第四態樣提供一種層析管柱，其包含一填充有前述靜相媒質的中空長形管體。
10:管柱
12:流體輸入端
14:流體輸出端
20:靜相
30:移動相
40:多孔微球
41:球狀巨孔
42:開放性多孔網路
43:開口
本發明的上述與其他目的、特徵與功效在參照下列較佳具體例的說明連同隨附圖式將變得顯明，其中：圖1是一個習用樹脂珠的示意圖；圖2是習用吸附層析管柱的示意圖；圖3A是兩種代表性習用陰離子交換管柱在不同線性流速下的背壓曲線；以及圖3B是兩種代表性習用陰離子交換管柱在不同線性流速下的動態吸附載量曲線； 圖4是依據本發明一具體例之吸附層析管柱的示意圖；圖5A-5C是依據本發明一具體例的多孔粒子的掃描式電顯影像；圖6是一示意圖，顯示通過依據本發明一具體例的多孔粒子的物質傳輸；圖7顯示依據本發明的多孔粒子的製造方法流程圖；圖8顯示依據本發明數個具體例的層析管柱在不同線性流速下的動態吸附載量曲線；以及圖9顯示依據本發明數個具體例的層析管柱在不同線性流速下的背壓曲線。
除非另外說明，否則本申請說明書和申請專利範圍中所使用的下列用語具有下文給予的定義。請注意，本申請說明書和申請專利範圍中所使用的單數形用語“一”意欲涵蓋在一個以及一個以上的所載事項，例如至少一個、至少二個或至少三個，而非意味著僅僅具有單一個所載事項。此外，申請專利範圍中使用的“包含”、“具有”等開放式連接詞是表示請求項中所記載的元件或成分的組合中，不排除請求項未載明的其他組件或成分。亦應注意到用語“或”在意義上一般也包括“及/或”，除非內容另有清楚表明。本申請說明書和申請專利範圍中所使用的用語“約”或“實質上”，是用以修飾任何可些微變化的誤差，但這種些微變化並不會改變其本質。
圖4顯示本發明的一個實施例為吸附層析管柱10，該層析管柱10包含一中空長形管體，具有至少一流體輸入端12及至少一流體輸出端14。 在一具體例中，該管體是由選自於不鏽鋼、鈦、石英、玻璃和例如聚丙烯等硬質塑膠所組成的群組中的材料製成，並且被製作成圓柱形、矩形或多邊形管體的形式，其中管柱10內填充了一種固態靜相20。當流體移動相30流經該管柱時，藉由各種流體分子與靜相20的吸附***互作用來分離分子。所述吸附層析術可以是相關技術領域所知悉的類型，其包括但不限於離子交換層析術、疏水***互作用層析術、親和層析術和逆相層析術，當然流體也包括了液體或氣體。本案所使用的術語“靜相”可以指稱一種固著化的固相載體，在層析過程中容許移動相30流過其中，以使得分子能夠被靜相20所滯留。於此，靜相20包含被填充於層析管柱10內的一群多孔微球40。本案所使用的術語“靜相媒質”希望涵蓋處於被填充狀態或非填充狀態下的多孔微球40。移動相30由管柱10頂部饋入，使其向下流動至管柱10底部。如圖4所示，比較容易被靜相20吸引的分子會在管柱10中滯留較長時間，而比較不容易被靜相20吸附的分子則較快流動至管柱10底部離開。結果是，可以藉此分別收集具有不同吸附特性的分子。本案吸附層析術可以結合-洗提模式進行(bind-and-elute mode)，其中標的分子被留滯於靜相媒質上，隨後再以適當洗提液洗提出來，抑或是以流經模式進行(flow-through mode)，其中不需要的分子和雜質被靜相媒質所吸附，而容許標的分子流出。
圖5A-5C為依據本發明的多孔微球的電子顯微鏡影像。明顯可見這些多孔微球實質呈圓球狀，並且可以藉由製造參數控制來製造具有大致均一的粒徑的單分散性(狹隘分佈的尺寸)，而後文中d 微球 定義為分佈的 中位數直徑。多孔微球的尺寸分布可以運用傳統的雷射散射或繞射技術進行測量，例如運用一具雷射繞射式粒徑分析儀使雷射光入射懸浮於液相中之微球來進行測量。這些多孔微球的內部各形成有許多相互堆疊的球狀巨孔，如圖5C中實線圓圈所標示。這些巨孔經由連接孔而相互連接且呈流體連通，連接孔如圖5C中虛線圓圈所標示。在個別的多孔微球中，這些相互連接的巨孔、與其相連的連接孔，以及位於微球表面的許多開口(如圖5C中箭頭所標示)，共同構成了一個連續的三維多孔網絡，而該多孔網絡透過這些開口對外界開放且呈流體連通。換句話說，該多孔網絡透過n個開口與外界連通，且n≧2。藉此，本案多孔微球容許分子由一開口進入微球內部，而由另一開口離開微球，如示意圖6所示。該多孔網絡的等效直徑，後文簡稱為d 孔洞 ，可以透過常用的測孔法測得，其包括但不限於例如壓汞法(mercury intrusion porosimetry)、毛細管流動測孔法(capillary flow porometry)和電子顯微鏡技術(electron microscopy)。如後文所述，多孔微球的尺寸，以及多孔網絡的直徑，都可以透過控制多孔微球製造方法的參數和條件來進行調整。
由於本案多孔微球具有單分散性，所以當它們被填充於層析管柱內時，將會傾向於以最密堆積的形式堆疊，亦即相鄰的微球彼此相切，任三個兩兩相切的微球的球心構成一個等邊三角形，每個微球的配位數皆為12，而微球與微球間留下了多個近似三角形的空隙(voids)。較佳為層析管柱中有至少50%的多孔微球，更佳為有至少60%的多孔微球，例如有至少75%的多孔微球，是以最密堆積的形式排列。所述最密堆積包括但不限 於三維六方最密堆積(hexagonal closest packing；hcp)、三維面心立方堆積(face centered cubic packing；fcc)或它們的組合。由最密堆積的微球所組成的填充床，其孔洞系統主要包括微球與微球堆疊所產生的空隙(voids)，以及位於微球內部的三維多孔網絡。在本文中，空隙的直徑簡稱為d 空隙 ，其與微球粒徑(d 微球 )之間存在有下列關係：d 空隙 =0.225d 微球 ...............(2)故d 空隙 可藉由d 微球 來表示。另根據沃什伯恩方程式(Washburn's equation)：Pd=-4γ cosθ...............(3)其中P=壓力；d=孔洞直徑；γ=表面張力；θ=接觸角。在流動相與多孔微球的種類不變的情況下，γ、θ為常數，此時d與P成反比，而d由d 孔洞 和d 微球 貢獻。此說明填充於管柱內的多孔微球的粒徑(d 微球 )愈大，抑或是多孔網絡的等效直徑(d 孔洞 )愈大，都可以使多孔微球在管柱內造成的背壓降低。本案透過賦予多孔微球特定的d 孔洞 /d 微球 尺寸比例，以便在流動相的高流速下達到低背壓值，並且對於大型生物分子有較高吸附載量且於流速提升時仍能維持一致。
填充材料中的質量傳輸(mass transfer)機制，大致可分為擴散(diffusion)及對流(convection)兩種。如圖1所示，當多孔微球的孔洞較小或是內部孔洞不相通時，流動相只會走微球外側，而流動相中的物質僅能以擴散的方式進到微球內部進行吸附。隨著流動相的流速增加，將會使得物質不易擴散進入多孔微球的內部結構，導致物質所能接觸到的微球表面降低，從而導致吸附量下降。相對而言，當多孔微球內部孔洞較大且 彼此相連通時，流動相會傾向以對流方式流經微球，物質藉由流動相直接進到微球內部，有較好的吸附效率。如圖6所示，在層析管柱中填充本案多孔微球40，各個微球40內形成有許多球狀巨孔41，所述球狀巨孔41經由連接孔而相互連接，從而構成一開放性多孔網路42，該多孔網路42透過位於微球40外表面的多個開口43與外界呈流體連通，流動相可以流經微球40之間的空隙以及位於微球40內部的三維多孔網絡42。
根據用於描述液體流過多孔媒質的達西定律(Darcy’s law)：
Figure 112119389-A0305-02-0014-1
 其中η：流動相黏度；△p：背壓；Q：流量；A：流道截面積；△L：流道長度。在管柱、填充材料與流動相不變的情況下，流道截面積A與流量Q成正比。又假設多孔媒質的孔洞為圓形，則A=πr2。根據前述d 孔洞 的定義，則r
Figure 112119389-A0305-02-0014-3
0.5d 孔洞 。因此流量會與d 孔洞 成正比關係。在本發明中，流動相流經一填充有多孔微球的管柱，其總流量為流經微球之間的空隙與微球內部的多孔網絡的總和，即Q總合=Q空隙+Q孔洞，而流量與孔洞大小成正比。又依據式(2)，d 空隙 =0.225d 微球 ，則當尺寸比例d 孔洞 /d 微球 下降時，Q空隙將會上升，使得物質傳輸傾向以擴散方式進行吸附。在此情況下，隨著流動相的流速提高，多孔微球的吸附量將會降低。反之，當尺寸比例d 孔洞 /d 微球 上升時，Q孔洞將會上升，使得物質傳輸傾向以對流方式進行吸附。在此情況下，隨著流動相的流速提高，多孔微球的吸附量不會實質降低。又如前所述，本案個別微球的多孔網絡可以透過n個開口與外界連通，且n≧2，其中n為整 數。換言之，n為微球中多孔網絡連通外表面的開口的數目，其可透過掃描式電子顯微鏡拍攝多孔微球的影像，加以計算。因此，假設具有n/2個開口位於流動相的流入方向，另外n/2個開口位於流動相的流出方向，則(n/2)d 孔洞 ≧d 空隙 ，即d 孔洞 ≧(0.45/n)d 微球 。改以尺寸比例d 孔洞 /d 微球 表示：d 孔洞 /d 微球 ≧(0.45/n)..................(1)。本案多孔微粒滿足上式(1)，因而可以促使流動相以對流方式流經位於微球內部的多孔網絡，而減少流經微球之間的空隙，以達到高流速低背壓，而且具有高且穩定的吸附量。
在較佳的具體例中，本案多孔微球的d 孔洞 可以大於150奈米，更佳為大於300奈米，例如大於500奈米。在較佳的具體例中，本案多孔微球的d 微球 可以小於500微米，更佳為小於300微米，例如小於200微米，以便降低d 空隙 的數值。
本案揭露的微球具有高孔隙率，且巨孔均勻地分佈於微球中。多孔微球的孔隙率(porosity)被定義為孔洞體積相對於微球總體積的百分比，其可以透過下式計算出來：1-[(多孔微球的重量/連續相的密度)/多孔微球的外觀體積]也可以透過掃描式電子顯微鏡拍攝多孔微球的截面影像，再經由ImageJ軟體(美國國家科學院，美國馬里蘭州Bethesda市)計算出孔隙率。在一具體例中，這些微球所具有的孔隙率至少大於50%，或者是大於70%，但是為了維持微球的強度，該孔隙率則不超過90%。
本案多孔微球由交聯高分子材料製成。適用於本發明的高分子材料包括但不限於聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚吡咯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚矽氧。在一較佳具體例中，所述多孔微球由聚甲基丙烯酸酯製成。
憑藉著快速的動力學表現、高孔隙率、高機械性質和低背壓，本案靜相媒質可供用於分離具有較大尺寸的分子，包括尺寸超過15奈米的分子，它們包括但不限於蛋白質(例如甲狀腺球蛋白(尺寸約17奈米)、核酸(mRNA，100奈米；DNA質體，80-200奈米)、類病毒(viroids)、病毒(例如腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV，20奈米；慢病毒，80-100奈米)、病毒載體、病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)、胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)(例如外泌體(exosomes)，30-100奈米)和微脂體。
在一些具體例中，靜相媒質經過化學改質而帶有用於吸附分子的官能基或配體。舉例來說，在靜相媒質被使用作為離子交換劑的具體例中，多孔微球，包括其中所形成的多孔網絡，經過表面改質而具有離子交換官能基，例如以四級銨作為強陰離子交換劑、以二乙基胺乙基(DEAE)作為弱陰離子交換劑、以磺醯基作為強陽離子交換劑，以及以羧甲基作為弱陽離子交換劑。
本發明的靜相媒質的製造涉及在將不相混溶的兩相加以乳化而得到第一乳液後，使第一乳液通過設有孔洞的篩板而分散於第三相，以得到懸浮於第三相中且尺寸均一的微球狀高內相乳液微滴，再將這些乳液微滴 加以固化，藉此製造出呈多孔微球狀的靜相媒質。圖7顯示依據本發明的靜相媒質的製造方法流程圖，該方法包含步驟A：製備第一乳液；步驟B：將第一乳液分散於第三相，得到含有單分散性高內相乳液微滴的第二乳液；以及步驟C：固化高內相乳液微滴而得到多孔微球。
步驟A涉及製備出第一乳液。本發明所使用的術語“乳液”意指一種由一連續相(或稱外相)以及一與該連續相不相混溶的分散相(或稱內相)所組成的混合物。本發明所稱“連續相”是指由同一組成物所構成之相互連接的一相，而“分散相”是由分佈於前述連續相中的許多相互隔離的組成物單元共同構成的一相，分散相中的每一隔離單元都被連續相包圍。依據本發明，連續相通常是發生聚合反應的相，其可以包含至少一種單體和交聯劑，且選擇性含有起始劑和乳化安定劑，而分散相則可以包括溶劑和電解質。在較佳的具體例中，第一乳液為一油包水乳液。
所述至少一種單體意欲涵蓋任何可透過聚合反應而形成高分子的單體(monomers)和寡聚體(oligomers)。在一較佳具體例中，所述至少一種單體包含至少一種適於進行自由基聚合反應的烯屬不飽和單體(ethylenically unsaturated monomer)或炔屬不飽和單體(acetylenically unsaturated monomer)，亦即具有碳-碳雙鍵或參鍵的有機單體，其包括但不限於丙烯酸及其酯類，例如丙烯酸羥乙酯；甲基丙烯酸及其酯類，例如甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)；丙烯醯胺類；甲基丙烯醯胺類；苯乙烯及其衍生物， 例如氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯(DVB)、苯乙烯磺酸鹽；矽烷類，例如二氯二甲基矽烷；吡咯類；乙烯基吡啶，以及彼等之組合。
本案所使用的術語“交聯劑”意指在前述至少一種單體經過聚合反應所形成的高分子主鏈之間形成化學性橋接的試劑。在較佳的具體例中，“交聯劑”是一種交聯單體，其可以與前述至少一種單體共溶於連續相中，通常具有多個官能基，以便在前述至少一種單體經聚合而成的高分子主鏈之間形成共價鍵結。適用的交聯劑為本發明所屬技術領域所熟知，而且可以視所述至少一種單體的類型來選用，其包括但不限於油溶***聯劑，例如二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEGDMA)、二丙烯酸乙二醇酯(EGDA)、二丙烯酸三乙二醇酯(TriEGDA)、二乙烯基苯(DVB)；以及水溶***聯劑，例如N,N-二烯丙基丙烯醯胺、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAA)。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，交聯劑的用量與所製成的多孔整體柱的機械強度成正相關，亦即交聯程度愈高，多孔整體柱的機械強度就愈高。較佳為交聯劑在連續相中佔有約5至50重量%的含量，例如佔有約5至25重量%的含量。
除了單體和交聯劑以外，連續相還可以選擇性地包含其他物質，以改變所製成的多孔微結構的物理及/或化學性質。這些物質的實例包括但不限於磁性金屬微粒，例如Fe3O4微粒；多醣類，例如纖維素、環糊精(dextran)、瓊脂糖、洋菜膠、藻酸鹽；無機材料，例如氧化矽；以及石 墨烯。舉例而言，添加Fe3O4微粒可以增進多孔微結構的機械強度，並且賦予其鐵磁性。
本案所使用的術語“乳化安定劑”意指一種界面活性劑，其適用於安定高內相乳液，避免乳液中被連續相所隔離的分散相單元彼此合併。乳化安定劑可以在調製乳液前添加於連續相組成物或分散相組成物中。適用於本發明的乳化安定劑可以是非離子界面活性劑，或是陰離子或陽離子界面活性劑。在高內相乳液為油包水乳液的具體例中，乳化安定劑較佳為具有3至14的親水親油平衡值(hydrophilic-lipophilic balance；HLB)，更佳為具有4至6的HLB值。在較佳的具體例中，本發明使用非離子界面活性劑做為乳化安定劑，適用的類型包括但不限於聚氧乙烯化烷酚類、聚氧乙烯化直鏈烷醇類、聚氧乙烯化聚丙二醇類、聚氧乙烯化硫醇類、長鏈羧酸酯類、鏈烷醇胺縮合物、四級炔屬二醇類、聚氧乙烯聚矽氧烷類、N-烷基吡咯烷酮類、含氟碳化物液體，以及烷基聚糖苷。乳化安定劑的特定實例包括但不限於失水山梨醇單月桂酸酯(商品名Span® 20)、失水山梨醇三硬脂酸酯(商品名Span® 65)、失水山梨醇單油酸酯(商品名Span® 80)、單油酸甘油酯、聚乙二醇200雙油酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(例如Pluronic® F-68、Pluronic® F-127、Pluronic® L-121、Pluronic® P-123)、蓖麻油、單蓖麻油酸甘油酯、二硬脂基二甲基氯化銨，以及二油基二甲基氯化銨。
“起始劑”意指能夠引發前述至少一種單體及/或交聯劑發生聚合反應及/或交聯反應的試劑。較佳為本發明所使用的起始劑為熱起始劑， 亦即受熱後能夠引發前述聚合反應及/或交聯反應的起始劑。起始劑可以在調製高內相乳液前添加於連續相組成物或是分散相組成物中。依據本發明，適合添加於連續相組成物的起始劑包括但不限於偶氮二異丁腈(AIBN)、偶氮二異庚腈(ABVN)、偶氮二異戊腈、2,2-二[4,4-二(叔丁基過氧基)環己基]丙烷(BPO)，和過氧化月桂醯基(LPO)，而適合添加於分散相組成物的起始劑包括但不限於過硫酸鹽，例如過硫酸銨和過硫酸鉀。本案高內相乳液也可以另包含藉由紫外光或可見光活化的光起始劑，來引發前述聚合反應及/或交聯反應，甚至可以適當的光起始劑來取代前述熱起始劑。
分散相主要包含溶劑。所述溶劑可以是任何與該連續相不相混溶的液體。在連續相具有高疏水性的具體例中，所述溶劑包括但不限於水、氟碳化物液體(fluorocarbon liquids)和其他與連續相不相混溶的有機溶劑。較佳為所述溶劑是水。在此例中，分散相可以另包含一電解質，其在溶劑中可以實質解離出自由離子，包括可溶解於該溶劑的鹽、酸和鹼。較佳為該電解質包含鹼金屬的硫酸鹽，例如硫酸鉀，以及鹼金屬和鹼土金屬的氯鹽，例如氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂。
高內相乳液可以添加聚合反應促進劑。“促進劑”意指能夠加速所述至少一種單體及/或交聯劑發生聚合反應及/或交聯反應的試劑。促進劑的典型實例包括但不限於N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、N,N,N’,N”,N”-五甲基二亞乙基三胺(PMDTA)、三(2-二甲基胺基)乙胺、1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺、1,4,8,11-四甲基-1,4,8,11-四氮雜 環十四烷，其促使例如過硫酸銨等起始劑分解成為自由基，從而加速前述聚合反應及/或交聯反應。促進劑的添加量較佳為起始劑之添加量的10-100莫耳%。
透過乳化作用來獲得第一乳液的過程為先將單體和交聯劑等成份均勻混合而成連續相組成物，並且將溶劑和電解質等成份均勻混合而成分散相組成物。隨後將預定比例的連續相組成物和分散相組成物加以混合，例如將連續相組成物和分散相組成物以5：95至40：60的體積比加以混合，並且施以擾動，使分散相均勻分散於連續相中。在一具體例中，可以將分散相組成物緩慢地逐滴加入於連續相組成物中，同時施以劇烈擾動而製成乳液。在另一且較佳的具體例中，可以將整批分散相組成物一次直接加入連續相組成物中，同時施以劇烈擾動而製成乳液。在整批添加分散相組成物的較佳具體例中，可以應用高轉速的均質機進行劇烈攪拌，對乳液施加高剪切力，從而使各個隔離單元的分散相尺寸均一。如相關技術領域中具有通常知識者所熟知，可以透過改變乳液中分散相相對於連續相的體積比、分散相組成物的添加速率、乳化安定劑的種類和濃度，以及擾動的速率和溫度等參數，來調整分散相中的各個隔離單元的尺寸和均一度。
在一具體例中，經過前述乳化所得到的第一乳液是高內相乳液。本發明所使用的術語“高內相乳液”或簡稱為“HIPE”意指一乳液中內相的體積分率超過74.05%。依據本發明，可以於步驟B透過將第一乳液混合於第三相後，再通過一微滴裝置，使第一乳液均勻分散於第三相，而得到一包含有第三相和被分散於第三相內的單分散性高內相乳液微滴的第二乳液。
本發明所稱“第三相”是指可以將高內相乳液穩定分散且與高內相乳液之連續相不混溶的相。第三相主要包含溶劑，所述溶劑包括但不限於水、氟碳化物液體和其他與連續相不相混溶的有機溶劑。較佳為所述溶劑是水。在較佳的具體例中，第二乳液為一水包油包水乳液。第三相可以另包含一電解質，其在溶劑中可以實質解離出自由離子，包括可溶解於該溶劑的鹽、酸和鹼。較佳為該電解質包含鹼金屬的硫酸鹽，例如硫酸鉀，以及鹼金屬和鹼土金屬的氯鹽，例如氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂。第三相也可以另包含前文所敘述的乳化安定劑。
在較佳的具體例中，可以先將第一乳液加入第三相，隨後以剪切裝置施予剪切力將其製備成分散於該第三相的第一巨滴乳液，該剪切力裝置可以是機械式攪拌裝置或者是孔隙排列3D結構。隨後透過一微滴裝置將該第一巨滴乳液更進一步微滴化地均勻分散於該第三相，以得到一包含有該第三相和被分散於該第三相內的單分散性高內相乳液微滴的第二乳液。該微滴裝置可以是具有複數細小孔道(channel)的篩板結構(該孔道不限於直線、近似直線、平滑曲線、近似平滑曲線)，抑或者該微滴裝置可以是孔隙排列3D結構，用於產生大量單分散性高內相乳液微滴。所述設有孔道的篩板可以由任何不會與第一、第二乳液產生物理和化學反應的惰性材料所製成，例如碳纖維、陶瓷、玻璃、石英、矽晶圓或是聚氯乙烯(PVC)、聚甲醛(POM)、聚碳酸酯(PC)、聚苯醚(PPO)、PA6/66尼龍塑膠、聚碳酸酯/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(PC/ABS)複合塑膠、聚對苯二甲酸酯(PET)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚甲基丙烯酸 甲酯(PMMA)、聚苯硫醚(PPS)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、乙烯/醋酸乙烯酯共聚物(EVA)等塑膠材料，抑或是不銹鋼、鈦、鋁、鋁鎂合金等金屬材料。
分散於第三相的高內相乳液微滴會因為本身的內聚力而自發性地成形為實質圓球狀。高內相乳液微滴的尺寸可經由選擇微滴裝置的孔道尺寸來調整。
在步驟C中，可以使高內相乳液微滴進一步受熱及/或接受適當波長的光照，抑或是進一步添加促進劑，以容許前述至少一種單體及/或交聯劑完成聚合反應及/或交聯反應，從而固化成形。此處所稱“固化”意指將高內相乳液轉化成為一具有安定自立構形(stable free-standing configuration)的結構體的過程。隨後由固化完成的高內相乳液微滴中去除分散相和第三相，從而製成呈多孔微球形式的靜相媒質。在第一乳液為油包水乳液的具體例中，可以直接將固化完成的高內相乳液微滴加以乾燥，較佳為在真空下進行乾燥，有助於使分散相中的隔離單元破裂而生成連通孔。多孔微球中巨孔的尺寸和均一度可以在第一乳液的製備過程中透過改變攪拌速率及/或攪拌溫度來調整，而連接孔的尺寸，以及多孔微球中所形成的多孔網絡的等效直徑，則可以透過改變分散相對於連續相的體積比來進行調整。
在一較佳具體例中，步驟C所得到的多孔微球經過步驟D使用泰勒式篩網進行篩分，以排除過大、過小或破碎的微球，以便收集位於所希望的尺寸範圍內的微球。
表1為藉由前述製造方法及滿足公式(1)所製造出來的多孔微球結構，其有A、B、C、D四種尺寸。
Figure 112119389-A0305-02-0024-2
將表1所製得的多孔微球A、B、C和D分別加入四亞乙基五胺的1%水溶液中，並且在70℃下加熱至少5小時。將多孔微球濾出，再加入氯化縮水甘油基三甲基銨的1%水溶液中，並且在70℃下加熱至少5小時。以水洗滌多孔微球，得到以多孔微球A、B、C和D為基質的四種強陰離子交換劑。
將1mL強陰離子交換劑分別填充於一個內徑7.4毫米高度3毫米的聚丙烯層析管柱中。
試驗結果1：動態吸附載量(Dynamic Binding Capacity)
測試前述A、B、C和D微球所製作的層析管柱對於甲狀腺球蛋白(TGY)的動態吸附載量。本實例中所使用的移動相為50mM Tris-HCl,pH 8.5，並且將1mg/mL TGY添加於移動相以作為分析物。透過一具ÄKTATM Pure層析系統(Cytiva Sweden AB，烏普薩拉，瑞典)來檢測動態吸附載量。結果顯示於圖8。
由圖8可見，在多孔微球A、B、C和D具有實質相同的粒徑(d 微球 )的前提下，具有最小的多孔網絡直徑的多孔微球A(d 孔洞 =1.0微米)所具有的吸附載量為5-7mg/mL，且其吸附載量隨著流動相的流速提升而有明顯的下降趨勢。這說明了當微球的尺寸比例d 孔洞 /d 微球 較小時，TGY傾向以擴散方式進行吸附。至於多孔網絡直徑相對較大的多孔微球B(d 孔洞 =1.4微米)、C(d 孔洞 =1.8微米)及D(d 孔洞 =2.2微米)，它們的吸附載量分別為6-8mg/mL、9-11mg/mL及14-15mg/mL，其吸附載量隨流動相的流速提升下降趨勢減緩，並且在更高流速下仍能維持其吸附載量的趨勢。藉此，藉由調整多孔微球的尺寸比例d 孔洞 /d 微球 可以調整層析管柱中的物質傳輸模式。亦即，提高微球的尺寸比例d 孔洞 /d 微球 ，可以使物質在流動相間傾向以對流方式傳輸，使其吸附行為較不受流量所影響。
試驗結果2：背壓測驗
圖9為A、B、C和D微球所製作的四種層析管柱在不同線性流速下的背壓曲線。其結果顯示，四種層析管柱於流動相的高操作流速下皆具有低背壓，而且它們在高流速下(>600cm/hr)所展現的背壓數值，也是遠小於圖3A中習知技術的流速對背壓值的效果，在本實施例中，即使是A樣品，其背壓/流速的斜率7.5x10-5MPa cm hr-1也遠小於習知技術的130或62 x10-5MPa cm hr-1，完全凸顯出使用本發明實施例微球所製作的層析管柱的優點，因此本發明更包括一種層析管柱，其為中空管柱且其中充填有前述複數個多孔微球，該管柱具有至少一流體輸入端及至少一流體輸出 端，其具有流體背壓相對流體流速的斜率值小於等於50 x10-5MPa cm hr-1或者小於等於30 x10-5MPa cm hr-1或者小於等於10 x10-5MPa cm hr-1。
儘管本發明已參照以上較佳具體例說明，應認知到較佳具體例僅為例示目的給予而非意圖限制本發明之範圍，可進行對熟習相關技藝者而言極為明顯的各種更動與改變，而不會逸離本發明精神與範圍。

Claims (4)

  1. 一種用於製造靜相媒質的方法，其包含下列步驟：A)在一聚合起始劑和一乳化安定劑的存在下，將一包含至少一種單體和一交聯劑的連續相組成物，與一包含一溶劑的分散相組成物加以乳化，以得到一包含有一連續相和一被分散於該連續相內的分散相的第一乳液；B)將該第一乳液以及一不與該第一乳液相混溶的第三相加以混合並以剪切裝置施予剪切力將其製備成分散於該第三相的第一巨滴乳液，隨後透過一微滴裝置將該第一巨滴乳液更進一步微滴化地均勻分散於該第三相，以得到一包含有該第三相和被分散於該第三相內的單分散性高內相乳液微滴的第二乳液；以及C)固化該第二乳液的連續相，並且去除該分散相和該第三相，以獲得呈多孔微球組成的靜相媒質；其中各個多孔微球內形成有許多球狀巨孔，所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一開放性多孔網絡(open porous network)，該多孔網絡透過位於該微球外表面的多個開口與外界呈流體連通；所述各個多孔微球滿足於下式(1)：d 孔洞 /d 微球 ≧(0.45/n)..................(1)其中d 孔洞 為該多孔網絡的等效直徑，d 微球 為多孔微球的粒徑，而n為微球中多孔網絡連通外表面的開口的數目，且n≧2，n為整數。
  2. 如請求項1所述的方法，其中製備成分散於該第三相的第一巨滴乳液的方法包括以機械式攪拌裝置或者是孔隙排列3D結構以提供剪切力。
  3. 如請求項1所述的方法，其中該微滴裝置可以是具有複數細小孔道(channel)的篩板結構抑或者該微滴裝置可以是孔隙排列3D結構。
  4. 如請求項1所述的方法，其中在該步驟C後更包含一步驟D，使步驟C所得到的多孔微球經過泰勒式篩網進行篩分，以排除過大、過小或破碎的微球。
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