TWI820875B - 優化細胞移植物、其製備方法、及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於一種優化細胞移植物,該優化細胞移植物係將間質幹細胞以小分子及蛋白質組合物進行基因誘導改質而成,細胞經培養後即可同步增加CD200基因、Galectin-9基因、以及VISTA基因之表現量,細胞製備過程不須載體病毒感染及質體轉染,細胞生物安全性高,極具臨床應用價值;該優化細胞移植物適用於間質幹細胞用於細胞移植治療的技術領域,且其治療效果較未改質的間質幹細胞更為優異。
Description
本發明係關於細胞治療領域,特別地是關於一種優化細胞移植物、其製備方法、及其用途。
細胞治療是指將自己的細胞(自體)或他人的細胞(異體)透過體外培養增殖或加工程序後再將細胞引進患者體內使用,以達到治療或預防疾病的目的。多起研究已經證實間質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能有效治療多項疾病,譬如肝功能損傷、腎功能損傷、膝骨關節炎、腦中風、糖尿病等等多項目前尚無特效藥根治的疾病,顯見間質幹細胞治療具有滿足醫療需求之潛力。
然而進行細胞移植過程中,多項因素會影響治療的效果,其中細胞移植到接受者體內的存活率將左右治療成效,尤其異體細胞移植時細胞容易因接受者體內自身免疫細胞的毒殺以及吞噬作用而影響細胞存活率進而降低治療效果,因此只能透過移植後服用免疫抑制劑來降低宿主免疫攻擊來延長移植細胞的存活率,而長期服用免疫抑制劑又會增加感染、惡性腫瘤、心血管疾病及骨髓抑制等風險。
現已有研究指出移植細胞若能高度表現CD200基因,有降低宿主巨噬細胞吞噬的能力,增加移植細胞存活率,另外高度表現Galectin-9或VISTA基因有降低宿主T細胞毒殺的能力,增加移植細胞存活率並降低免疫浸潤反應,提升移植細胞的治療效果,然而欲達到上述效果,現行方法須將細胞進行gene overexpression方式藉以增加特定基因之表現,但基因編輯必須以載體病毒感染或質體轉染方式進行,因此容易因病毒或質體***宿主DNA而產生突變;再者,若要在同一個細胞同時進行不同基因的改變,則需要進行多個病毒載體的感染或質體轉染,大大降低臨床應用效率及安全性,這些問題皆是目前急需釐清及克服的課題。
因此,申請人提供一種優化細胞移植物及其製備方法來解決上述問題且能夠進一步提升細胞移植物在生物體內的治療能力。
意即,本發明可以提供一種優化細胞移植物的製備方法,其係用於製備一高存活率且兼具多基因同時高度表現的優化細胞移植物,該製備方法包含以下步驟:細胞改質培養步驟:將間質幹細胞以6,000~15,000個細胞/cm
2的細胞密度在一第一培養基中進行培養,且所使用的培養皿表面帶有含氧官能基團,具有帶負電且親水之性質;經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到一改質細胞中間體;細胞優化培養步驟:將該改質細胞中間體在一第二培養基中進行培養,經過一第二培養時間後移除該第二培養基而獲得一優化細胞移植物。
在本發明之一實施例中,該間質幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、周邊血幹細胞、及臍帶血幹細胞中之任一種。
在本發明之一實施例中,該第一培養時間為在1~3天之間;該第二培養時間為在7~10天之間。
在本發明之一實施例中,該優化細胞移植物的存活率為在90%以上。
在本發明之一實施例中,該第一培養基為含有TGF-b1、FGF-2、氫羥腎上腺皮質素、人類血清白蛋白、L-谷氨酰胺、白胺酸胺肽酶、HEPES緩衝劑、脂質之無血清DMEM/F12培養基。
在本發明之一實施例中,該第二培養基為含有菸鹼醯胺、胰高血糖素樣肽-4、五肽胃泌素、B-27無血清補充劑、及N-2補充劑之無血清DMEM/F12培養基。
另外,本發明還可以提供一種優化細胞移植物,是利用前述製備方法對於間質幹細胞進行基因改質培養而得,且該優化細胞移植物之CD200、Galectin-9、及VISTA基因的表現量皆高於該間質幹細胞的至少2倍以上。
在本發明之一實施例中,本發明還可以提供一種間質幹細胞治療疾病之效能提升方法,其係將前述製備方法對於間質幹細胞進行基因改質培養而得的優化細胞移植物再移植至病患體內進行治療。
在本發明之一實施例中,該疾病為心血管疾病、創傷疾病、肺部疾病、神經系統疾病、免疫疾病、肝臟疾病、內分泌疾病、皮膚疾病、腸胃道疾病、腎臟疾病、血液性疾病、癌症腫瘤疾病、婦科疾病、精神疾病、泌尿系統疾病、眼科疾病、牙科疾病中之任一種。
為了使本發明的目的、技術特徵及優點,能更為相關技術領域人員所瞭解,並得以實施本發明,在此配合所附的圖式、具體闡明本發明的技術特徵與實施方式,並列舉較佳實施例進步說明。以下文中所對照的圖式,為表達與本發明特徵有關的示意,並未亦不需要依據實際情形完整繪製。
本文中,本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解的相同的含義。此外,除非另外明確地與上下文相矛盾,否則本文所使用之單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值,此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對本發明實施態樣與具體實施例提出說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
首先,說明本發明之優化細胞移植物的製備方法,包含有以下步驟:
細胞改質培養步驟:將間質幹細胞以6,000~15,000個細胞/cm
2的細胞密度在一第一培養基中進行培養,經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到一改質細胞中間體。
細胞優化培養步驟:將該改質細胞中間體在一第二培養基中進行培養,經過一第二培養時間後移除該第二培養基而獲得一優化細胞移植物。
在前述細胞改質培養步驟中,間質幹細胞較佳是以貼壁的方式培養,在接種於培養皿中的間質幹細胞之細胞密度一般為6,000~15,000個細胞/cm
2;較佳為6,000~12,000個細胞/cm
2;更佳為6,000~10,000個細胞/cm
2;最佳為6,000~8,000個細胞/cm
2。又,該第一培養時間一般為在1~10天之間,較佳為在1~8天之間,更佳為在1~5天之間,最佳為在1~3天之間。
除此之外,用於承載間質幹細胞和第一培養基的培養皿表面帶有含氧官能基團,具有帶負電且親水之性質。
根據本發明的技術思想,該第一培養基為包含有TGF-b1、FGF-2、氫羥腎上腺皮質素(Hydrocortisone)、人類血清白蛋白(HSA)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、白胺酸胺肽酶(LAP)、HEPES緩衝劑、以及脂質(Lipid)之無血清DMEM/F12培養基。
承上,在該第一培養基中之TGF-b1的濃度一般為在1pM~1nM之間,較佳為在10pM~1nM之間,更佳為在10pM~700pM之間,最佳為在10pM~400pM之間。
在該第一培養基中之FGF-2的濃度一般為在1pM~1nM之間,較佳為在10pM~1nM之間,更佳為在10pM~700pM之間,最佳為在10pM~400pM之間。
在該第一培養基中之氫羥腎上腺皮質素(Hydrocortisone)的濃度一般為在1nM~1µM之間,較佳為在10nM~1µM之間,更佳為在10nM~700nM之間,最佳為在10nM~400nM之間。
在該第一培養基中之人類血清白蛋白(HSA)的濃度一般為在1µM~1mM之間,較佳為在1µM~700µM之間,更佳為在10µM~400µM之間,最佳為在1µM~100µM之間。
在該第一培養基中之L-谷氨酰胺(L-Glutamine)的濃度一般為在1mM~100mM之間,較佳為在1mM~80mM之間,更佳為在1mM~60mM之間,最佳為在1mM~40mM之間。
在該第一培養基中之白胺酸胺肽酶(LAP)的濃度一般為在1µM~1mM之間,較佳為在100µM~800µM之間,更佳為在100µM~600µM之間,最佳為在100µM~400µM之間。
在該第一培養基中之HEPES緩衝劑的濃度一般為在1mM~100mM之間,較佳為在1mM~80mM之間,更佳為在1mM~60mM之間,最佳為在1mM~40mM之間。
在該第一培養基中之脂質(Lipid)的濃度一般為在0.05~10wt%之間,較佳為在0.05~8wt%之間,更佳為在0.05~6wt%之間,最佳為在0.05~4wt%之間。
當完成第一培養步驟後,須將培養瓶中的第一培養基移除以利進行第二培養步驟,為避免第一培養基殘留在瓶中,可利用PBS多次清洗。又,該第二培養時間一般為在7~28天之間,較佳為在7~20天之間,更佳為在7~15天之間,最佳為在7~10天之間。
又,根據本發明的創作思想,在前述細胞優化培養步驟中,第二培養基為含有、菸鹼醯胺、胰高血糖素樣肽-4、五肽胃泌素、B-27無血清補充劑及N-2補充劑之無血清DMEM/F12培養基。
在該第二培養基中之菸鹼醯胺的濃度一般為在100µM~100mM之間,較佳為在500µM~80mM之間,更佳為在500µM~60mM之間,最佳為在500µM~40mM之間。
在該第二培養基中之胰高血糖素樣肽-4的濃度一般為在1nM~1µM之間,較佳為在1nM~700nM之間,更佳為在1nM~400nM之間,最佳為在1nM~100nM之間。
在該第二培養基中之五肽胃泌素的濃度一般為在1nM~1µM之間,較佳為在1nM~700nM之間,更佳為在1nM~400nM之間,最佳為在1nM~100nM之間。
在該第二培養基中之B-27無血清補充劑的濃度一般為在0.05~10wt%之間,較佳為在0.05~8wt%之間,更佳為在0.05~6wt%之間,最佳為在0.05~4wt%之間。
在該第二培養基中之N-2補充劑的濃度一般為在0.05~10wt%之間,較佳為在0.05~8wt%之間,更佳為在0.05~6wt%之間,最佳為在0.05~4wt%之間。
經由細胞改質培養步驟和細胞優化培養步驟所獲得的優化細胞移植物除了具有與間質幹細胞相同的特性以外,相對於未改質的間質幹細胞還能高度表達CD200基因、Galectin-9基因、以及VISTA基因,能夠通用於間質幹細胞在細胞移植治療的技術領域。
接著,以下以具體實施例來說明本發明
《細胞培養》
在本實施例中所使用之間質幹細胞係人類脂肪間質幹細胞 (Human Adipose-derived Stem Cells, hADSC),各組培養方式如下:
第一組 (對照組):將間質幹細胞以包含有5-20wt%之胎牛血清(fetal bovine serum)、1-100 mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、0.05-50 mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate)的Keratinocyte-SFM培養基進行細胞培養10天,培養環境為溫度控制在 36.5-38.5℃,且含有 5%二氧化碳之細胞培養箱中,培養完成的間質幹細胞簡稱為MSCs。
第二組(本發明):分別使用培養皿A及培養皿B將間質幹細胞進行細胞分化培養。培養皿A的聚苯乙烯表面結合了含氧官能基團,因此具有帶負電且親水的性質,與一般標準TC(Tissue culturetreated)處理的培養皿相比具有更強的親水性及潤濕性,能夠促進細胞附著和擴散;培養皿B的聚苯乙烯表面與親水的、帶中性電荷的水凝膠塗層共價結合,該水凝膠塗層抑制特異性和非特異性固定,迫使細胞進入懸浮狀態而成為3D的球體結構。
經分化培養後,利用培養皿A分化所得的細胞外觀呈現細長狀,而利用培養皿B分化所得細胞呈現細胞大小不一的球型,而且利用培養皿A分化所得的細胞存活率為利用培養皿B分化所得的細胞存活率的2倍以上,因此本發明採用培養皿A進行細胞分化培養。
將間質幹細胞以第一培養基進行細胞培養1~3天,觀察到細胞完全貼附於培養皿後移除第一培養基,並以PBS清洗2次,接著再以第二培養基進行細胞培養7~10天,並觀察到細胞型態變成細長狀,培養環境為溫度控制在36.5-38.5℃,且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中,培養完成的優化細胞移植物稱為MSCs-plus。如圖1所示,MSCs-plus細胞外觀呈現細長狀。
第一培養基與第二培養基的構成分比例分別如表1和表2所示。
表1
組分 | 濃度 |
無血清DMEM/F12培養基 (serum-free DMEM/F12 medium) | - |
TGF-b1 | 10pM~400pM |
FGF-2 | 10pM~400pM |
氫羥腎上腺皮質素 (Hydrocortisone) | 10nM~400nM |
人類血清白蛋白(HAS) | 1µM~100µM |
L-谷氨酰胺 (L-Glutamine) | 1mM~40mM |
白胺酸胺肽酶 (LAP) | 100µM~400µM |
HEPES緩衝劑 | 1mM~40mM |
脂質 (Lipid) | 0.05~4wt% |
表2
組分 | 濃度 |
無血清DMEM/F12培養基 (serum-free DMEM/F12 medium) | - |
菸鹼醯胺(nicotinamide) | 500µM~40mM |
胰高血糖素樣肽-4 (exendin-4) | 1nM~100nM |
五肽胃泌素 (pentagastrin) | 1nM~100nM |
B-27無血清補充劑(B-27 serum-free supplement) | 0.05~4wt% |
N-2補充劑(N-2 Supplement) | 0.05~4wt% |
培養完成後分別收集MSCs及MSCs-plus細胞,進行細胞存活率、基因表達偵測、以及動物實驗及血清生化分析。
《細胞存活率分析》
分別收集第一組及第二組培養完成的細胞後,利用ADAM-MC儀器計數細胞存活率,可知第一組的MSCs細胞的存活率為93.67±0.58%,第二組的MSCs-plus細胞的存活率96.67±1.15%,兩組皆維持在90%以上的高細胞存活率,其中又以第二組的MSCs-plus細胞之存活率較高。
《基因表達偵測分析》
收集 MSCs及MSCs-plus 細胞,並利用RNA抽取套組 (Quick-RNA™ MiniPrep, ZYMO RESEARCH) 進行 RNA萃取,再將檢體委託生技公司進行Gene Expression Array實驗,實驗方法如下:
在體外轉錄過程中,通過 Low Input Quick-Amp Labeling 試劑盒(Agilent Technologies,USA)擴增 0.2μg 的總 RNA,並用 Cy3(CyDye,Agilent Technologies,USA)標記。接著,在60℃的溫度條件下,將 0.6μg 的Cy3-labled cRNA以fragmentation buffer進行培養30 分鐘,獲得平均大小約 50-100 個核苷酸的短片段。
然後將相應片段化的labeled cRNA匯集並在65℃的溫度環境中以Agilent SurePrint 微陣列 (Agilent Technologies, USA)進行雜交 17 小時。用氮***吹洗和乾燥後,用安捷倫微陣列掃描儀(Agilent Technologies,USA)以波長為 535 nm的條件掃描微陣列以偵測Cy3。
經掃描而得的圖像通過 Feature extract10.7.3.1 軟件(Agilent Technologies,USA)進行分析,並利用圖像分析和歸一化軟件去量化每個特徵的信號和背景強度。原始信號數據通過分位數歸一化(quantile normalization)進行歸一化,以發現差異表達的基因。
各個特定基因所使用的陣列探針設計如下表3所示。
表3
基因 | 探針序列 |
CD200 | CTGCTTACTGCTTTGCTAATAGCTGGCCTTGCTAGAATCCTTGGTTTCACT GCTGTTCTT |
Galectin-9 | TGACCAGAGTGTTCTCTTCAGGGGACTGGCTCCTTTCCCAGTGTCCTTAAA ATAAAGAAA |
VISTA | AGATCTGTCAACAGGTTAAGTCAATCTGGGGCTTCCACTGCCTGCATTCC AGTCCCCAGA |
然後,分析MSCs-plus 細胞相對於MSCs細胞的基因表現量且記錄在表4中。
表4
基因表現量 | ||
MSCs細胞 | MSCs-plus 細胞 | |
CD200 | 1 | 8.45 |
Galectin-9 | 1 | 2.09 |
VISTA | 1 | 2.37 |
如表4所示,MSCs-plus 細胞中之CD200基因、Galectin-9基因、以及VISTA基因之表現量依序為MSCs細胞的8.45倍、2.09倍、以及2.37倍。
如前述先前技術中所提,CD200基因有降低宿主巨噬細胞吞噬的能力,增加移植細胞存活率,另外高度表現Galectin-9和 VISTA
基因有降低宿主 T 細胞毒殺的能力,這意謂著將本發明之MSCs-plus 細胞在移植至人體內部時可避免被體內之巨噬細胞或T 細胞破壞,能夠增加移植細胞存活率並降低免疫浸潤反應,提升移植細胞的治療效果。
《動物實驗及血清生化分析》
1.腎臟及肝臟損傷治療效果
已知鏈脲佐菌素(Streptozocin, STZ)是一種眾所周知的基因毒劑,已被證實可誘導老鼠體內 DNA 損傷導致氧化壓力進而誘導老鼠肝臟損傷及腎損傷。
在本實施例中使用 4-5 週雄性 wistar大鼠,以腹腔注射 (intraperitoneal injection) 方式連續施打鏈脲佐菌素(50 mg/kg in citrate buffer, pH 4.5) 3 天藉此建立肝、腎損傷動物模式。
鏈脲佐菌素施打後兩個禮拜,將大鼠分組並以尾靜脈方式進行間質幹細胞移植,組別如下:第一組(Group 1):Control(未施打脲佐菌素)、Group 2:STZ+ Normal Saline(生理食鹽水)、Group 3:STZ+MSCs、Group 4:STZ+MSCs-plus。每組至少3隻老鼠,細胞移植數目為每隻3×10
6/200µl生理食鹽水。治療一次(注射一劑)且經過三個禮拜後抽血進行AST、ALT以及BUN血清生化分析,並將所得結果記錄於表5中。
表5
血清生化分析 | |||
組別 | AST (U/L) | ALT (U/L) | BUN (mg/dL) |
Group 1 | 91.00 ± 14.21 | 57.50 ± 5.82 | 21.74 ± 1.56 |
Group 2 | 366.43 ± 99.56 | 232.00 ± 32.08 | 56.03 ± 10.09 |
Group 3 | 200.10 ± 43.64 | 149.20 ± 50.74 | 39.58 ± 8.61 |
Group 4 | 145.38 ± 33.50 | 92.80 ± 28.13 | 27.77 ± 7.24 |
在以間質幹細胞治療肝功能障礙的效果為例時,從上述表5、圖2A及圖2B所示的結果可知,老鼠分別以MSCs細胞和MSCs–plus細胞治療21天後,數據顯示MSCs細胞和MSCs–plus細胞皆能顯著降低肝指數AST和ALT,而其中又以MSCs–plus細胞能夠展現更佳的治療效果。
又,在以間質幹細胞治療腎功能障礙的效果為例時,從上述表5、圖2C所示的結果可知,老鼠分別以MSCs細胞和MSCs –plus細胞治療21天後,數據顯示MSCs細胞和MSCs–plus細胞皆能顯著降低腎指數BUN,而其中又以MSCs–plus細胞能夠展現更佳的治療效果。
2. 糖尿病治療效果
鏈脲佐菌素 (Streptozocin, STZ) 亦是一種眾所周知對哺乳動物胰臟中產生胰島素的胰島β細胞具有特異毒性的化合物,該化合物會破壞胰島β細胞,使動物血糖上升,在醫學研究中已被廣泛用來建立糖尿病的動物模型。
在本實施例中使用 4-5 週雄性 wistar大鼠,以腹腔注射 (intraperitoneal injection) 方式連續施打鏈脲佐菌素(50 mg/kg in citrate buffer, pH 4.5) 3 天藉此建立糖尿病動物模式。
鏈脲佐菌素施打後兩個禮拜,將大鼠分組並以尾靜脈方式進行間質幹細胞移植,組別如下:Group 1:Control(未施打脲佐菌素)、Group 2:STZ+ Normal Saline(生理食鹽水)、Group 3:STZ+MSCs、Group 4:STZ+MSCs-plus。每組至少3隻老鼠,細胞移植數目為每隻3×10
6/200µl生理食鹽水。治療一次(注射一劑)後,分別於注射當天(第0天)、第1、3、5和7天進行抽血檢測血糖濃度並將所得結果記錄於表6中。
表6
組別 | 血糖濃度(mg/dL) | ||||
第0天 | 第1天 | 第3天 | 第5天 | 第7天 | |
Group 1 | 140.17 ± 19.99 | 122.33 ± 15.71 | 142.67 ± 14.22 | 127.50 ± 34.02 | 148.17 ± 21.95 |
Group 2 | 591.67 ± 14.98 | 563.83 ± 35.05 | 589.33 ± 21.20 | 566.83 ± 38.33 | 573.17 ± 23.44 |
Group 3 | 589.33 ± 16.15 | 507.50 ± 34.03 | 572.83 ± 36.21 | 533.17 ± 74.51 | 558.83 ± 48.74 |
Group 4 | 589.50 ± 25.72 | 502.83 ± 60.44 | 486.83 ± 49.03 | 510.00 ± 57.55 | 503.50 ± 46.72 |
在以間質幹細胞治療糖尿病的效果為例時,從上述表6、圖3所示的結果可知,在分別移植MSCs細胞和MSCs–plus細胞後,第一天都能顯著降低糖尿病鼠的血糖,而MSCs -plus細胞能夠維持長達七天的降血糖能力,顯見利用本發明之方法所獲得的MSCs -plus細胞擁有更佳的治療效果
又,雖然在實施例中是以腎臟及肝臟損傷治療以及糖尿病治療來說明本發明之優化細胞移植物的效果,但並不以此為限,能夠使用間質幹細胞所治療的疾病皆可利用本發明之優化細胞移植物進行治療;舉例來說,可以是心血管疾病、創傷疾病、肺部疾病、神經系統疾病、免疫疾病、肝臟疾病、內分泌疾病、皮膚疾病、腸胃道疾病、腎臟疾病、血液性疾病、癌症腫瘤疾病、婦科疾病、精神疾病、泌尿系統疾病、眼科疾病、牙科疾病中之任一種,在此不加以贅述。
經由上述實施例可知,本發明提供了一種優化細胞移植物及其製備方法,是以小分子及蛋白質組合物進行基因誘導,細胞經培養後即可同步增加CD200基因、Galectin-9基因、以及VISTA基因之表現量,細胞製備過程不須載體病毒感染及質體轉染,細胞生物安全性高,極具臨床應用價值。
綜上所述,本發明之內容已以如上之實施例舉例說明了,然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可再進行各種之更動與修飾;例如,將前述實施例中所例示之各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式,此等實施方式亦當然視為本發明所屬內容之一。因此,本案所欲保護之範圍亦包括後述之申請專利範圍及其所界定之範圍。
無
圖1為本發明之優化細胞移植物的外觀示意圖(放大倍率為40X)。
圖2A為顯示在動物實驗及血清生化分析中,MSCs細胞及MSCs-plus細胞對於降低肝指數AST的比較示意圖。
圖2B為顯示在動物實驗及血清生化分析中,MSCs細胞及MSCs-plus細胞對於降低肝指數ALT的比較示意圖。
圖2C為顯示在動物實驗及血清生化分析中,MSCs細胞及MSCs-plus細胞對於降低腎功能指數BUN的比較示意圖。
圖3為顯示在動物實驗及血清生化分析中,MSCs細胞及MSCs-plus細胞對於降低血糖濃度的比較示意圖。
Claims (7)
- 一種優化細胞移植物的製備方法,其係用於製備一高存活率且兼具多基因同時高度表現的優化細胞移植物,該製備方法包含以下步驟:細胞改質培養步驟:將間質幹細胞以6,000~15,000個細胞/cm2的細胞密度在一第一培養基中進行培養,所使用的培養皿表面帶有含氧官能基團,具有帶負電且親水之性質;經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到一改質細胞中間體;細胞優化培養步驟:將該改質細胞中間體在一第二培養基中進行培養,經過一第二培養時間後移除該第二培養基而獲得一優化細胞移植物;其中該間質幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、周邊血幹細胞、及臍帶血幹細胞中之任一種;該第一培養時間為在1~10天之間;該第二培養時間為在7~28天之間;該第一培養基為含有TGF-b1、FGF-2、氫羥腎上腺皮質素、人類血清白蛋白、L-谷氨酰胺、白胺酸胺肽酶、HEPES緩衝劑、脂質之無血清DMEM/F12培養基;該第二培養基為含有菸鹼醯胺、胰高血糖素樣肽-4、五肽胃泌素、B-27無血清補充劑、及N-2補充劑之無血清DMEM/F12培養基;該優化細胞移植物具有能夠同時高度表現的CD200、Galectin-9、及VISTA基因;且該優化細胞移植物之CD200、Galectin-9、及VISTA基因的表現量皆高於該間質幹細胞的至少2倍。
- 如請求項1所述之優化細胞移植物的製備方法,其中該優化細胞移植物的CD200基因表現量為該間質幹細胞之至少8倍。
- 如請求項1所述之優化細胞移植物的製備方法,其中該優化細胞移植物的Galectin-9基因表現量為該間質幹細胞之至少2倍。
- 如請求項1所述之優化細胞移植物的製備方法,其中該優化細胞移植物的VISTA基因表現量為該間質幹細胞之至少2倍。
- 如請求項1所述之優化細胞移植物的製備方法,其中該細胞移植物的存活率為在90%以上。
- 一種優化細胞移植物,其係利用如請求項1至5中之任一項所述的製備方法對於間質幹細胞基因進行改質培養而得,且該優化細胞移植物之CD200、Galectin-9、及VISTA基因的表現量皆高於該間質幹細胞至少2倍。
- 一種如請求項6所述之優化細胞移植物的用途,其係用於製備治療心血管疾病、創傷疾病、肺部疾病、神經系統疾病、免疫疾病、肝臟疾病、內分泌疾病、皮膚疾病、腸胃道疾病、腎臟疾病、血液性疾病、癌症腫瘤疾病、婦科疾病、精神疾病、泌尿系統疾病、眼科疾病、牙科疾病中之任一種疾病的藥物。
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Non-Patent Citations (1)
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期刊 Hsin-Shui Chen et al; Human Adipose-Derived Stem Cells Accelerate the Restoration of Tensile Strength of Tendon and Alleviate the Progression of Rotator Cuff Injury in a Rat Model. Cell Transplantation, Vol. 24, pp. 509–520, 2015. * |
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