TWI820318B - 胎兒組織提取物、其生產方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了能夠有效預防或治療肌肉病症或疾病的胎兒組織提取物。

Description

胎兒組織提取物、其生產方法及其用途
本公開總體上涉及醫療產品、其生產方法及其用途。本公開更具體地但非排他性地涉及用於預防或治療肌肉損傷或衰老相關的肌肉病症或疾病的來自胎兒或新生動物的提取物。
肌肉系統是人體內最大的蛋白質儲庫，占總體重的高達45%，並有助於維持基本的代謝和功能活性。在人體中有三種肌肉：骨骼肌、心肌和平滑肌。肌肉病症或疾病包括但不限於肌病、肌肉損傷、纖維肌痛、慢性疲勞症候群、多肌炎、慢性間隔症候群、以撒氏症候群、橫紋肌溶解、肌營養不良、甘迺迪氏病，將負面影響人類健康。衰老相關的肌肉病症或疾病在公眾中，特別是在老年人中引起更多的關注。衰老相關的肌肉病症或疾病之一是肌肉減少症，其是衰老的內在“肌病”。
根據聯合國報告的世界人口老齡化2015(World Population Ageing 2015)，世界人口正在老齡化。全球老齡的人口，年齡在60歲或以上，在規模上到2050年將達到兩倍以上，達到21億的驚人數量。衰老過程與身體組成的許多變化相關。從25歲到80歲，肌纖維的尺寸和數量逐漸減少30%(1)。由Irwin Rosenberg第一次引入的肌肉減少症是普遍衰老相關的肌肉質量、力量和功能下降，其影響10%的男性(95% CI：8-12%)和女性(95% CI：8-13%)。Meta分析表明肌肉減少症與較高的死亡率、肌肉功能下降、較高的跌倒率和較高的住院發生率相關(2)。流行病學研究表明肌肉衰老與許多退行性病症相關(3，4)。對開發有效方法以對抗肌肉減少症的影響以便維持功能獨立性或“積極老齡化”的科學和公眾關注在不斷增長。
本領域中第一次發現來源於胎兒組織的提取物可有效預防或治療衰老相關的肌肉病症或疾病。
因此，在第一方面，本公開涉及胎兒組織提取物、通過將胎兒組織提取物給予有需要的個體而用於預防或治療肌肉病症或疾病的方法以及胎兒組織提取物的用途。
在本公開的第二方面，其涉及用作藥物(例如用於肌生成)的胎兒組織提取物。
在本公開的第三方面，其涉及從胎兒或新生動物的一種或多種組織獲得的提取物，其用作預防或治療肌肉病症 或疾病的藥物。
在本公開的第四方面，其涉及包含所述提取物的植入物。
在本公開的第五方面，其涉及包含所述提取物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
在本公開的第六方面，其涉及生產提取物的方法，其包括以下步驟：a.從所定義的胎兒或新生動物收集組織；b.使收集的組織均質化，以獲得勻漿；c.過濾和/或離心勻漿以獲得上清液流體(下文中也稱為“濾液”)；以及d.進一步純化/處理濾液以獲得胎兒組織提取物的最終產物。
在本公開的第七方面，其涉及通過給予提取物、植入物或藥物組合物來預防或治療肌肉病症或疾病的方法。
在本公開的第八方面，其涉及提取物、植入物或藥物組合物在製造預防或治療肌肉病症或疾病的藥物中的用途。
在本公開的第九方面，其涉及提取物、植入物或藥物組合物在製造預防或治療肌肉病症或疾病的保健產品中的用途。
前述是概述，並因此必然包含細節的簡化、概括和省略；因此，本領域技術人員將理解，本概述僅是說明性的，而不旨在以任何方式進行限制。本文所述的方法、組 合物和/或裝置和/或其他標的物的其他方面、特徵和優點將在本文所述的教導中變得顯而易見。提供本概述以便以簡化的形式介紹概念彙集，其將在下面的詳細描述中進一步描述。本概述不旨在確定所請標的物的主題的關鍵特徵或必要特徵，也不旨在用於說明確定所請標的物的範圍。此外，本申請中引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容通過引用以其整體併入本文。
[圖1]顯示通過MTT試驗FSME對C2C12細胞成活力的影響。
[圖2A]顯示D-Gal對C2C12細胞成活力的影響，以及[圖2B]顯示FSME對D-Gal處理的C2C12細胞的影響。
[圖3]顯示FSME對HSMM細胞成活力的影響。
[圖4A]顯示FSME對生肌前體標誌物表現的影響，以及[圖4B]顯示FSME對骨骼肌標誌物表現的影響。
[圖5]顯示FSME對HSMM細胞的生肌前體標誌物的影響。
[圖6]顯示FSME對C57小鼠中肌肉再生的影響，其通過氯化鋇誘導的脛骨前肌肌肉損傷後幼年C57小鼠的總握力來證明。
[圖7A]顯示FSME對C57小鼠中生肌前體標誌物表現的影響，以及[圖7B]顯示FSME對氯化鋇誘導的肌肉損傷後幼年C57小鼠的骨骼肌標誌物表現的影響。
[圖8]顯示FSME對C57小鼠中肌肉再生的影響，其通過氯化鋇誘導的脛骨前肌和腓腸肌兩者的肌肉損傷後幼年C57小鼠的總握力來證明。
[圖9]顯示FSME對C57小鼠中肌肉再生的影響，其通過光學顯微術測量。
[圖10]顯示FSME對老齡C57小鼠中肌肉再生的影響，其通過總握力測試證實。
[圖11A]顯示FSME對老齡C57小鼠中生肌前體標誌物表現的影響，以及[圖11B]顯示FSME對老齡C57小鼠中骨骼肌標誌物表現的影響。
發明的詳細描述
在描述本發明之前，應理解本發明不限於所述的特定方法(下文中也稱為“方法(process)”)和實驗條件，因為這樣的方法和條件可以變化。還應理解，本文所用的術語僅用於描述特定實施方案的目的，而不是旨在限制，因為本發明的範圍僅將被所附申請專利範圍限制。
除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。如本文所用，術語“約”當用於提及具體列舉的數值時，是指該值可與列舉的值變化不超過10%。
雖然與本文所述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用於本公開的實踐中，但現在描述優選的方法和 材料。本文提及的所有出版物均通過引用以其整體併入。通過閱讀隨後的詳細描述，其他實施方案將變得顯而易見。
為了可以完全理解本文所述的發明，提出了以下詳細描述。
本公開涉及胎兒組織提取物、含有該提取物的植入物、含有該提取物的藥物組合物、生產該提取物的方法以及該提取物、植入物和藥物組合物的醫療用途。
胎兒或新生動物
組織的來源或供體動物是指從其獲得胎兒組織的動物。所述來源或供體動物優選是哺乳動物，更優選綿羊、山羊、豬、大鼠或小鼠。
在本公開的上下文中，動物是胎兒或新生動物。
如本文所用，胎兒是胎生生物體產前發育的階段。“胎兒”對不同動物指的是不同時間段。例如，對於綿羊，胎兒階段在受精後四周開始時開始。在一個實施方案中，動物是12-18周胎兒綿羊，例如16周胎兒綿羊。例如，“16周胎兒綿羊”是指妊娠的16周綿羊。優選地，綿羊不含特定的一種或多種病原體。
提取物的接受者是指接受細胞或提取物的動物。接受者優選是哺乳動物。該動物可以是適於接受細胞或提取物或需要接受或提取物的任何動物。
在一個實施方案中，接受者是綿羊、山羊、豬、大鼠 或小鼠。
在另一個實施方案中，接受者是人。
在又一個實施方案中，接受者對於供體動物是同種異體的或異種的。在具體的實施方案中，接受者對於供體動物是異種的。
來自胎兒或新生動物的一種或多種組織的提取物
本公開還涉及來自胎兒或新生動物的一種或多種組織的提取物。
在具體的實施方案中，提取物是肌肉提取物，例如，綿羊肌肉提取物，更具體地，胎兒綿羊肌肉提取物(“FSME”)。
“提取物”、“分離物”或“組織提取物”在本文中可互換使用，是指通過提取胎兒或新生動物的部分組織或全部組織而獲得的複合物。通常使用的提取溶劑包括水或生理鹽水，例如PBS。在本公開的一個實施方案中，溶劑是PBS。在一些實施方案中，提取物不含細胞或者基本上不含細胞。
“組織”可以包括但不限於肌肉組織或肌肉骨骼組織。在一些實施方案中，來自胎盤的組織不包括在本公開的上下文中。
在一些實施方案中，所述組織是肌肉。肌肉是在大多數動物中發現的軟組織，並且發揮產生力和運動的功能。它們主要負責維持和改變姿態、運動以及器官的移動。
在一些實施方案中，所述組織是骨骼肌、心肌或平滑肌。在具體的實施方案中，所述組織是骨骼肌。
該提取物可通過以下方法生產，其包含以下步驟：a.從胎兒或新生動物收集組織；b.使收集並切割的組織均質化，以獲得勻漿；c.任選地，過濾和/或離心勻漿以獲得濾液；以及d.任選地，進一步純化/處理濾液以獲得由胎兒組織提取物組成的最終產物。
在一個實施方案中，步驟(c)中的“過濾”可以使用具有所需孔徑的無菌篩檢程式進行。例如，步驟(c)中的“過濾”可以使用能夠去除碎片的篩檢程式(例如，細胞濾網)進行。例如，篩檢程式的孔徑為約60-80μm。
在一個實施方案中，步驟(d)中的“純化”可以使用能夠去除活細胞並保留生物活性組分的篩檢程式進行。例如，篩檢程式可以是滅菌篩檢程式，其孔徑為約<=0.22μm。
在一個實施方案中，組織是從剖腹產術後的新生動物中立即收集的。
在另一個實施方案中，勻漿是使用磷酸鹽緩衝鹽水製備的。
在又一個實施方案中，離心在4℃下以5000g進行15分鐘。
在又一個實施方案中，使用細胞濾網進行過濾。在還進一步的實施方案中，將提取物保持在液氮中直至使用。
在具體的實施方案中，生產提取物的方法包括以下步 驟：a.從所定義的胎兒或新生動物收集組織；b.使收集的組織均質化，以獲得勻漿；c.通過70μm篩檢程式(下文也稱為“細胞濾網”)過濾以去除碎片和/或離心勻漿以獲得濾液；以及d.將濾液進一步通過0.22μm滅菌篩檢程式純化/處理以去除活細胞和細菌，以獲得提取物。
本公開的提取物至少在以下方面是有效的：-促進成肌細胞增殖；-減輕成肌細胞老化；-促進成肌分化；以及-改善肌肉力量。
生產提取物的典型程式
生產目標提取物的典型方法可以包括以下程式：-動物收穫；-組織收集；-組織處理；以及-任選地，產物測試。
該程式可以進行改變/修正以進行優化，這取決於未來研究的目的。
當供體動物是沒有特定病原體的胎兒綿羊(SPF綿羊)時，“動物收穫”可包括：-SPF懷孕綿羊從SPF農場運輸到cGMP生產區域； -得到許可的獸醫麻醉懷孕綿羊；-得到許可的獸醫在無菌條件的動物手術室中通過剖腹產獲得綿羊胎兒。
“組織收集”可包括：-由操作人員收集胎兒，立即清潔並運送到B類生產區域；-解剖綿羊胎兒以獲得相應的組織；-清洗組織並將組織運送到A類層流；-在置於冰/冰墊上的玻璃培養皿上將組織切割/過篩/研磨成<0.5cm3的塊。
“組織處理”可包括：
-將組織通過Glas-Col機動化勻漿器在1600rpm下進行均質化30-120s；
-使勻漿通過紗布篩檢程式；
-濾液收集，用於細胞計數/成活力測量
-產品製劑
-顯微鏡下產品檢查
-樣品存檔，用於將來分析。
植入物
本文可互換使用的“植入物”或“胎兒組織植入物”被植入接受者的目標區，以改善接受者的病理生理狀態。具體地，植入物能夠預防或治療接受者的肌肉病症或疾病。
在一個實施方案中，植入物是同種異體的或異種的植 入物，優選是異種的植入物。
藥物組合物
藥物組合物可包含本公開的胎兒組織提取物，以及任選地藥學上可接受的賦形劑。
製劑中包含的賦形劑根據不同的目的(例如給藥模式)進行選擇。通常使用的賦形劑的實例包括而不限於：鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及其組合、穩定劑、增溶劑和表面活性劑、緩衝劑和防腐劑、張度劑、填充劑和潤滑劑。
引起治療效果的提取物的量可以由本領域技術人員根據多種因素通過實驗確定，所述因素包括個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食(包括例如個體是處於禁食狀態還是進食狀態)、給藥時間、***率、藥物組合和給藥形式。通常可以滴定治療劑量以優化安全性和功效。通常，來自體外和/或體內測試的劑量-效應關係最初可提供關於個體給藥的適當劑量的有用指導。
在一些實施方案中，可以根據已知方法將藥物組合物給予個體，例如靜脈內給藥，例如作為推注或通過在一段時間內連續輸注，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。在具體的實施方案中，藥物組合物經肌肉內給予。
在本公開的另一個實施方案中，本公開的藥物組合物是固體劑型的形式，例如片劑(包括但不限於可吞咽片 劑、可咀嚼片劑、懸浮片劑等)、膠囊、囊片、錠劑、糖錠劑、散劑、顆粒劑等。
病況、病症和疾病
本公開的來自胎兒或新生動物的提取物可用於預防或治療肌肉病症或疾病，和/或增強肌生成。
肌肉病症或疾病包括但不限於肌病、肌肉損傷、纖維肌痛、慢性疲勞症候群、多肌炎、慢性間隔症候群、以撒氏症候群、橫紋肌溶解、肌營養不良、甘迺迪氏病等。
肌病通常指多種類型的骨骼肌疾病。衰老相關的肌肉病症或疾病之一是肌肉減少症，其是衰老的內在“肌病”。在一些實施方案中，肌肉病症或疾病是肌肉減少症。
肌肉減少症是以骨骼肌質量和功能的損失為特徵的病況。儘管它主要是老年人的疾病，但它的發展可能與不是專門在老年人中見到的病況相關。肌肉減少症是以骨骼肌質量和力量的進行性和全身性損失為特徵的症候群，並且它與身體殘疾、差的生活品質和死亡嚴格相關。肌肉減少症的危險因素包括年齡、性別和身體活動水準(5)。
肌肉損傷或肌肉損害可涉及肌肉、肌纖維或其附著的腱通過肌肉勞損、牽拉或撕裂而造成的損害。肌肉損傷的症狀包括：(1)由於損傷引起的腫脹、挫傷或發紅；(2)休息時的疼痛，(3)當使用特定肌肉或與該肌肉相關的關節時的疼痛；(4)肌肉或腱無力；(5)根本不能使用肌肉。在一些實施方案中，肌肉損傷是骨骼肌損傷。損傷可以是化 學損傷或物理損傷。在某些實施方案中，肌肉損傷是對骨骼肌的化學損傷(例如BaCl2誘導的損傷)。在一個具體的實施方案中，肌肉損傷是對脛骨前肌的化學損傷(例如BaCl2誘導的損傷)。在又一個具體的實施方案中，肌肉損傷是對脛骨前肌和腓腸肌的化學損傷(例如BaCl2誘導的損傷)。
肌生成是肌肉組織的形成，特別是肌纖維的形成。肌纖維通常形成成肌細胞至稱為肌管的多核纖維的融合。在一些實施方案中，本公開的來自胎兒或新生動物的提取物可用於肌生成。
實施例
提出以下實施例以便為本領域普通技術人員提供如何生產和使用本發明的完整公開和描述，並且不旨在限制發明人認為其發明的範圍，其也不旨在表示以下實驗是所進行的所有或唯有的實驗。
實施例1：胎兒綿羊組織提取物(“FSME”)的製備
動物。在本實施例中，胎兒動物是16-18孕周胎兒綿羊。將胎兒綿羊肌肉用於FSME的製備。
肌肉組織的收集和處理。骨骼肌組織是在剖腹產術後立即從胎兒收集的。稱重肌肉組織並在4℃下儲存直至處理。在製備室中，在去除脂肪和結締組織後，在冰浴上將肌肉組織切成小塊，並隨後用於FSME的製備。
FSME的製備。然後用勻漿器使用磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS)從肌肉組織製備勻漿。將勻漿通過無菌紗布拭子過濾，並在4℃下以5000g離心15分鐘，接著通過無菌的70μm和0.22μm篩檢程式過濾以去除碎片/污染物並用於滅菌。粗製的和過濾的FSME中的蛋白質含量使用BCA試劑盒根據製造商的說明進行測量。FSME保持在-20℃直到進一步使用。
體外和體內實驗的FSME的稀釋。對於細胞實驗(體外實驗，實施例2-6)，在使用前將0.5mg/ml的無菌FSME(1)稀釋100倍至5000ng/ml的工作濃度。而對於動物研究(體內實驗，實施例7)，使用5mg/ml的工作濃度(每肢100μl)並用無菌PBS稀釋。
實施例2：FSME對C2C12細胞成活力的影響
C2C12細胞。從ATCC獲得鼠成肌細胞細胞系(ATCC CRL-1772)並將其用作C2C12細胞。
細胞培養。將C2C12細胞在補充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培養基中進行培養，並在37℃下在5% CO2中孵育。當匯合達到80%時，通過使用0.05%胰蛋白酶溶液進行傳代培養。
MTT試驗
FSME對C2C12細胞的細胞毒性影響通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)試驗來確定。MTT基於細胞中的氧化磷酸化(“oxphos”)過程而起作用。 如果細胞是活的且有活性的，它們的線粒體，即細胞內“動力室”，是有活性的，其將通過一系列氧化和磷酸化過程向細胞提供能量。換句話說，細胞增殖/成活力越大，顏色越深，並且吸光度越高。
如通過琥珀酸脫氫酶活性所反映的，通過MTT試驗確定細胞成活力。將C2C12細胞(1×103/孔)接種在96孔微板中。用FSME孵育24小時、48小時或72小時後，向每個孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT，100μl，0.5mg/ml)，並將板在37℃孵育3小時。去除用於細胞培養的Dulbecco改良的Eagle培養基，並用100μl MTT增溶溶液、10% Triton X-100、加0.1N HCl/無水異丙醇代替，以溶解甲臢晶體。使用微板閱讀器通過測量570nm處的吸光度，經由分光光度計定量細胞成活力。
結果：濃度在0.976ng/mL到1000ng/mL之間的FSME能夠促進C2C12細胞增殖和成活力(圖1)。
實施例3：FSME對D-Gal處理的C2C12細胞的影響
已知用D-半乳糖(“D-Gal”)處理細胞在體內小鼠和大鼠模型中生產活性氧物類，並且這些模型用於類比衰老表型。在本實施例中，使用D-Gal建立了C2C12成肌細胞老化模型。通過MTT試驗確定C2C12成活力。
C2C12細胞。從ATCC獲得鼠成肌細胞細胞系(ATCC CRL-1772)並將其用作C2C12細胞。
細胞培養。將C2C12細胞在補充有10%(v/v)胎牛血清 (FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培養基中進行培養，並在37℃下在5% CO2中孵育。當匯合達到80%時，通過使用0.05%胰蛋白酶溶液進行傳代培養。
MTT試驗
如通過琥珀酸脫氫酶活性所反映的，通過MTT試驗確定細胞成活力。
使用D-Gal建立C2C12成肌細胞老化模型。將C2C12細胞(1×103/孔)接種在96孔微板中。用D-Gal孵育24小時、48小時或72小時後，向每個孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT，100μl，0.5mg/ml)，並將板在37℃孵育3小時。去除用於細胞培養的Dulbecco改良的Eagle培養基(“DMEM”)，並用100μl MTT增溶溶液、10% Triton X-100、加0.1N HCl/無水異丙醇代替，以溶解甲臢晶體。使用微板閱讀器通過測量570nm處的吸光度，經由分光光度計定量細胞成活力。
結果：使用D-Gal建立了C2C12成肌細胞老化模型。濃度為25mM、50mM和100mM的D-gal能顯著降低C2C12成活力(圖2A)。
FSME對D-Gal處理的C2C12細胞的影響。將1000個C2C12細胞接種到96孔板的每個孔中，並在有5% CO2的37℃加濕孵育箱中，在補充10%(v/v)FBS的高葡萄糖DMEM中培養。一旦細胞附著，將含有特定濃度的D-gal和FSME的培養基添加到C2C12細胞。每24h用含有D-gal和 FSME的新鮮培養基代替培養基。通過將細胞與添加到有細胞的培養基中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓鹽溶液孵育3小時，直至通過吸收波長設定在570nm和690nm的分光光度計分析，確定細胞成活力。
結果：FSME能夠減輕D-gal誘導的C2C12老化。通過MTT試驗確定了C2C12成活力。濃度在62.5ng/mL-1000ng/mL之間的FSME能夠減輕C2C12老化(圖2B)。
實施例4：FSME對HSMM細胞成活力的影響
HSMM細胞。從Lonza(LONZA,CC-2580)獲得人骨骼肌成肌細胞(“HSMM”)。
細胞培養。將細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)的SKGMTM-2骨骼肌細胞生長培養基-2 BulletKitTM中進行培養，並在37℃下在5% CO2中孵育。當匯合達到80%時，通過使用0.05%胰蛋白酶溶液進行傳代培養。
MTT試驗
如通過琥珀酸脫氫酶活性所反映的，通過MTT試驗確定細胞成活力。
將HSMM(1×104/孔)接種在96孔微板中。用FSME孵育後，向每個孔中添加3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT，100μl，0.5mg/ml)，並將板在37℃孵育3小時。去除用於細胞培養的培養基，並用100μl MTT增溶溶液、10% Triton X-100、加0.1N HCl/無水異丙醇代 替，以溶解甲臢晶體。使用微板閱讀器通過測量570nm處的吸光度，通過分光光度計定量細胞成活力。沒有FSME處理的細胞作為對照。
結果：FSME能夠促進HSMM成活力和增殖。如通過MTT試驗所評估的，濃度在0.975ng/mL到1000ng/mL之間的FSME能夠促進HSMM成活力和增殖(圖3)。
實施例5：FSME對C2C12細胞成肌分化的影響
C2C12細胞。從ATCC獲得鼠成肌細胞細胞系(ATCC CRL-1772)並將其用作C2C12細胞。
細胞培養。將C2C12細胞在補充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培養基中進行培養，並在37℃下在5% CO2中孵育。對於C2C12分化，將3×104個細胞接種在6孔板中，並在生長培養基中培養至達到70-80%的匯合(第0天)。然後用補充有2%(v/v)馬血清的具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培養基代替培養基。將細胞保持在分化培養基中直到試驗結束，通常在5天和7天之間。
FSME對C2C12細胞成肌分化的影響。每兩天監測肌管形成。監測的時間點分別為0小時、24小時、3天(“3D”)、5D和7D。收集細胞，通過Trizol試劑分離總RNA，並隨後進行即時PCR。用RT-qPCR確定生肌前體標誌物(Pax3、Pax7和FABP3)和骨骼肌標誌物(MyoD、MyoG和MyoS)的表現水準。
結果：如圖4A中所示，FSME促進了C2C12細胞中的生肌前體標誌物FABP3和PAX7的表現。10ng/mL-1000ng/mL的FSME能夠顯著上調生肌前體標誌物。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。此外，如圖4B中所示，FSME促進了C2C12細胞中骨骼肌標誌物MyoD(圖4B中的“MYOD”)、MyoG(圖4B中的“MYOG”)和MyoS(圖4B中的“MYOS”)的表現。10ng/mL-1000ng/mL的FSME能夠顯著上調生肌前體標誌物。**表示p<0.01，***表示p<0.001。
這些結果表明FSME在促進C2C12細胞的成肌分化中是有效的。
實施例6：FSME對HSMM細胞成肌分化的影響
HSMM細胞。從Lonza(LONZA,CC-2580)獲得人骨骼肌成肌細胞(“HSMM”)。
細胞培養。在37℃下，在5% CO2中，將HSMM細胞在補充有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的SKGMTM-2骨骼肌細胞生長培養基-2 BulletKitTM中進行培養。對於HSMM分化，將6×104個細胞接種在6孔板中，並在生長培養基中培養至達到70-80%的匯合(第0天)。然後用補充有2%(v/v)馬血清的Dulbecco改良的Eagle培養基F-12代替用於細胞培養的培養基。將細胞保持在分化培養基中直到試驗結束，通常在3天和5天之間。
FSME對HSMM細胞成肌分化的影響。每兩天監測肌 管形成。時間點為0h、24h、3D和5D。收集細胞，通過Trizol試劑分離總RNA，並隨後進行即時PCR。用RT-qPCR確定生肌前體標誌物(Pax3、Pax7和FABP3)的表現水準。
結果：如圖5中所示，FSME促進了HSMM細胞中的生肌前體標誌物FABP3、PAX7和PAX3的表現。10ng/mL-1000ng/mL的FSME能夠顯著上調生肌前體標誌物。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
這些結果表明FSME在促進HSMM細胞的成肌分化中是有效的。
實施例7：FSME對C57小鼠中肌肉再生的影響
在該實驗中，進行了四批實驗(批次001、002、003和004)。在本實驗中使用C57小鼠作為動物模型。小鼠由CUHK的Laboratory Animal Services Centre提供。
對肌肉損傷的小鼠，特別是肌肉損傷的“幼年小鼠”(三月齡，雄性C57/6J小鼠，下文也稱為“幼年C57小鼠”)進行實驗的批次001和002。通過肌肉內注射氯化鋇(BaCl2)，然後通過腹膜內(FSME IP組)或肌肉內(FSME IM組)注射的FSME治療(“Tx”)，建立肌肉損傷模型。
對“衰老小鼠”或“老齡小鼠”(十月齡，雄性C57/6J小鼠)進行實驗的批次003和004。
7.1 批次001 動物
在這批實驗中使用了三月齡的雄性C57/6J小鼠(n=10)。
化學損傷動物模型
在脛骨前肌(也稱為“TA”)中使用肌肉內注射50μl氯化鋇(0.12%，在無菌PBS中)進行化學損傷。
動物的治療
將所有小鼠平均隨機分成三組：(1)PBS對照組(n=2)；(2)治療組1，FSME IM組(n=4)；和(3)治療組2，FSME IP組(n=4)。用異氟烷麻醉小鼠，以及兩個治療組在第2天接受腹膜內(i.p.)或TA肌肉內(i.m.)單劑量注射FSME(100μl,5mg/ml)，而囊泡組注射100μl無菌PBS。在實驗終點之前的任何時間沒有動物變得嚴重患病或死亡。
全身和前肢握力測試
使用握力計測量全身和前肢的握力。當小鼠抓住抓取網格時，在數位力感測器上記錄以牛頓計的峰值張力。穩定後將計量器重新設定為0N，並將小鼠的尾巴緩慢向後拉。在小鼠從網格釋放其整個身體的四肢或前肢時，通過計量器記錄張力。每兩天進行五次測量。
圖6中顯示了握力測試的結果。可以看出通過腹膜內或肌肉內途徑給予FSME不會引起肌肉性能的差異。
FSME對肌肉損傷的幼年小鼠中成肌分化的影響
通過解剖從幼年C57小鼠中分離脛骨前肌和腓腸肌肌肉。將分離的肌肉組織在液氮中速凍並在Trizol(Invitrogen)中均質化，並根據製造商的說明分離RNA。分離的RNA樣品用takara反轉錄試劑盒根據製造商的說明反轉錄成cDNA。使用Power SYBR Green PCR試劑盒(Invitrogen)和Applied Biosystem QuantStudio 12K Flexi 384 QPCR系統進行即時定量PCR(RT-qPCR)。用RT-qPCR確定生肌前體標誌物(Pax3、Pax7和FABP3)和骨骼肌標誌物(MyoD、MyoG和MyoS)的表現水準。
結果提供在圖7A和7B中。
如圖7A中所示，在幼年小鼠中，與腹膜內給藥相比，通過肌肉內途徑的單劑量FSME給藥顯著增加了生肌前體標誌物Myf5(圖7A中的“MYF5”)、Pax3和Pax7。通過RT-qPCR確定基因表現。**表示p<0.01。
如圖7B中所示，在幼年小鼠中，與腹膜內給藥相比，通過肌肉內途徑的單劑量FSME給藥顯著增加了骨骼肌標誌物MyoD、MyoG和MyoS。通過RT-qPCR確定基因表現。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
7.2 批次002 動物
在這批實驗中使用了三月齡的雄性C57/6J小鼠(n=9)。
化學損傷動物模型
在TA和腓腸肌兩者中使用肌肉內注射50μl氯化鋇(0.12%，在無菌PBS中)進行化學損傷。
動物的治療
將所有小鼠平均隨機分成兩組：(1)囊泡組，即PBS對照組(n=4)；(2)治療組，即FSME IM組(n=5)。用異氟烷麻醉小鼠，以及治療組在第2天接受在TA和腓腸肌兩者的肌肉內(i.m.)每週兩次注射FSME(50μl,5mg/ml)，而囊泡組用無菌PBS代替。在實驗終點之前的任何時間沒有動物變得嚴重患病或死亡。
全身和前肢握力測試
使用握力計測量全身和前肢的握力。當小鼠抓住抓取網格時，在數位力感測器上記錄以牛頓計的峰值張力。穩定後將計量器重新設定為0N，並將小鼠的尾巴緩慢向後拉。在小鼠從網格釋放其整個身體的四肢或前肢時，通過計量器記錄張力。每兩天進行五次測量。
圖8中顯示了握力測試的結果。可以看出通過肌肉內途徑每週兩次給予FSME顯著地改善BaCl2誘導的肌肉損傷後幼年小鼠的握力。*表示p<0.05。
光學顯微術觀察
通過解剖分離幼年C57小鼠腓腸肌肌肉。將分離的肌肉包埋於OCT包埋劑(Invitrogen)中並在-80℃冷凍直至切片。使用低溫切片機將包埋的腓腸肌肌肉樣品進行切片(橫切面)，厚度為10μm，並將切片固定在superfrost載玻片(Invitrogen)上。在蘇木精和伊紅(H&E)染色之前，通過將載玻片浸入PBS中5分鐘，洗掉OCT基質，隨後用H&E染色。首先將樣品用Harris蘇木精染色2分鐘，並通過將載玻片浸入水和酸性乙醇中去除過量的蘇木精。通過將切片浸入Scott自來水中1分鐘來分化蘇木精染色的細胞核。接著，使用1%伊紅溶液複染切片3分鐘，並通過將樣品浸入水中去除過量的伊紅。最後，通過浸入到逐漸增加濃度的醇溶液中使切片脫水，隨後使用DPX封片劑進行封片。使用Leica顯微鏡進行光學顯微術分析，並使用Image J分析進行肌纖維的周圍細胞核的定量。
結果：如圖9中所示，在BaCl2誘導肌肉損傷後，通過肌肉內途徑每週兩次給予FSME顯著誘導肌肉修復。BaCl2誘導肌纖維損傷，而FSME給藥誘導肌肉修復以及細胞侵潤到肌肉周圍。點狀圖表示PBS處理和FSME治療的肌肉中肌肉周圍的細胞核的平均數量。**表示p<0.01。
7.3 批次003和004 動物
在這批實驗中使用了十月齡的雄性C57/6J小鼠(n=20)，其作為“衰老小鼠”或“老齡小鼠”。
動物的治療
將所有小鼠平均隨機分成兩組：(1)囊泡組，即PBS對照組(n=9)；以及(2)治療組，即FSME IM組(n=11)。用異氟烷麻醉小鼠，以及治療組在第0天接受在腓腸肌的肌肉內(i.m.)FSME(100μl,5mg/ml)注射，而囊泡組用無菌PBS代替。來自PBS組的四隻動物和來自治療組的一隻動物在實驗終點之前死亡。
全身和前肢握力測試
使用握力計測量全身和前肢的握力。當小鼠抓住抓取網格時，在數位力感測器上記錄以牛頓計的峰值張力。穩定後將計量器重新設定為0N，並將小鼠的尾巴緩慢向後拉。在小鼠從網格釋放其整個身體的四肢或前肢時，通過計量器記錄張力。每兩天進行五次測量。
結果。如圖10中所示，通過肌肉內途徑每週兩次給予FSME持續2周的時間，顯著改善了老齡小鼠的握力。*表示p<0.05。
FSME對衰老小鼠中成肌分化的影響
通過解剖從老齡C57小鼠分離衰老小鼠的腓腸肌肌肉。將分離的肌肉組織在液氮中速凍並在Trizol(Invitrogen)中均質化，並根據製造商的說明分離RNA。分離的RNA樣品用takara反轉錄試劑盒根據製造商的說明反 轉錄成cDNA。使用Power SYBR Green PCR試劑盒(Invitrogen)和Applied Biosystem QuantStudio 12K Flexi 384 QPCR系統進行即時定量PCR(RT-qPCR)。
用RT-qPCR確定生肌前體標誌物(Pax3、Myf5和FABP3)和骨骼肌標誌物(MyoD、MyoG和MyoS)的表現水準。
結果提供在圖11A和11B中。
如圖11A中所示，在老齡小鼠中，與溶媒組相比，通過肌肉內途徑(FSME IM組)每週兩次給予FSME顯著增加了生肌前體標誌物Fabp3、Myf5和Pax3的表現。通過RT-qPCR確定基因表現。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
如圖11B中所示，在老齡小鼠中，與溶媒組相比，通過肌肉內途徑(FSME IM組)每週兩次給予FSME顯著增加了骨骼肌標誌物MyoD和MyoG的表現。通過RT-qPCR確定基因表現。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
從上述結果可以看出，FSME在預防或治療肌肉病症或疾病或增強肌生成中是有效的。
具體地，FSME至少在以下方面是有效的：-促進成肌細胞增殖；-減輕由D-gal誘導的成肌細胞老化(潛在的體外老化模型)；-促進BaCl2誘導的肌肉損傷小鼠中的成肌分化；以及-改善BaCl2損傷的小鼠和衰老小鼠兩者的肌肉力量。
儘管已經參考本發明的具體實施方案描述了本發明， 但是本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的真實精神和範圍的情況下，可以進行各種改變並且可以代替等同物。此外，可以進行許多修改以使特定的情況、材料、物質組成、方法、一個或多個方法步驟適應本發明的目的、精神和範圍。旨在所有這樣的修改都在所附申請專利範圍的範圍內。
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  1. 一種從胎兒或新生綿羊的肌肉組織獲得的提取物之用途，其係用於製造供預防或治療人的肌肉病症或疾病或增強人的肌生成的藥物，其中該肌肉組織是骨骼肌，其中該提取物不含細胞，其中該提取物是藉由下列步驟所生產：a.使收集的該等組織均質化，以獲得勻漿；b.過濾和/或離心該等勻漿以獲得濾液；以及c.進一步純化/處理所述濾液以獲得由胎兒組織提取物組成的最終產物。
  2. 如請求項1之用途，其中該綿羊是胎兒綿羊。
  3. 如請求項1之用途，其中該綿羊是12-18孕周胎兒綿羊。
  4. 如請求項1之用途，其中該肌肉病症或疾病是衰老相關的肌肉病症或疾病。
  5. 如請求項1之用途，其中該肌肉病症或疾病是肌肉減少症。
  6. 如請求項1之用途，其中該肌肉病症或疾病是肌肉損傷。
  7. 如請求項1之用途，其中該肌肉病症或疾病是化學損傷。
  8. 如請求項1之用途，其中該提取物具有以下性質中的一種或多種： -促進成肌細胞增殖；-減輕成肌細胞老化；-促進成肌分化；以及-改善肌肉力量。
  9. 如請求項1之用途，其中該藥物為選自注射流體、膠囊、囊片、錠劑、糖錠劑、散劑或顆粒劑的形式。
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