TWI804560B - 微流體細胞裝置及其使用的方法 - Google Patents

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Abstract

提出使用微流體裝置來濃縮細胞、進行緩衝液更換、基於尺寸分選細胞和/或以快速方式分離特定類型細胞的系統和方法。細胞流入柱體矩陣，其中柱體沿腔室中的對角線分佈。細胞以橫向方式朝向腔室的一側偏轉，並在離開腔室時被收集。

Description

微流體細胞裝置及其使用的方法
提供微流體裝置，特別是有用於依據尺寸和形變能力來濃縮細胞和/或分離細胞。
背景敘述包括可有用於理解本文所述系統與方法的資訊。這並非承認本文所述任何資訊為先前技術，或並非承認被具體地或隱含地引用的任何出版物是先前技術。
從患者獲得的生物樣本在相對大量的流體中含有多種不同類型的細胞。為了要進行各種生物試驗或在其他方面研究細胞，通常需要濃縮細胞、更換緩衝液、或濃縮特定類型的細胞。然而，進行這些類型流程的現有技術通常依賴於重型設備例如離心機、利用透析或離子交換等耗時的試驗、需要多步驟的複雜流程、或使細胞於下游生物試驗中失去功能。此外，這些方法往往需要相對較大的樣本量和具有低細胞回收率。
在一些情況下，樣本可能包括多種細胞類型，包括但不限於紅血球細胞、白血球細胞、和各種其他細胞成分(例如循環腫瘤細胞(CTCs)、轉移細胞、正常細胞等)。要分離出特定的細胞類型例如CTCs是 困難的，特別是當這些細胞相對於其他更豐富的細胞類型以較低的頻率出現時。舉例而言，血液樣本中每十億個正常或血球細胞估計存在大約一個CTC。
從血液樣本中分離出細胞群的現有方法可包括螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting)、磁活化細胞分選(magnetic activated cell sorting)、或免疫磁膠體分選(immunomagnetic colloid sorting)等技術。這些方法費力且需要操作員專業能力，可能導致顯著的細胞損失(恢復差)和/或執行起來很昂貴。分離出細胞群的其他技術缺乏分離特異性，例如電荷流分離。需要新的技術來快速和容易地濃縮細胞，並基於尺寸分離出細胞。
本文提供使用微流體裝置操縱細胞的各種系統和方法。本技術允許細胞的快速濃縮，用於基於尺寸或尺寸範圍分離出細胞、用於緩衝液交換、用於添加標記等，以及這些技術可集成到其他工作流程中。本方法提供了更換緩衝液和實現高細胞回收率的新技術。當細胞在溶液中以低頻率存在時，這些技術允許濃縮細胞，以及從非均勻尺寸細胞的樣本中分離出特定尺寸或尺寸範圍的細胞。舉例而言，用於從樣本中濃縮細胞的系統和方法可用以從血液樣本中分離出腫瘤細胞，而用於基於尺寸分離出細胞的系統和方法可用以從未活化的T細胞中分離出活化的T細胞。在一些方面，設備是可手動操作的。在其他方面，裝置是自動化的或部分自動化的。
在一方面，提供一種微流體裝置，包括：一輸入機構，用以引入包括複數個細胞的一溶液；一微流體腔室，流體連接此輸入機構，其中此微流體腔室包括複數個柱體排，其中每個排包括複數個柱體，此些柱體沿著具有一斜率的一線分佈，其中此斜率係取決於此微流體腔室的一側；以及至少兩個輸出機構，流體連接此微流體腔室。一般而言，第一輸出機構相對於第二輸出機構具有一較大的橫截面積。
又提供方法用以藉由一輸入機構引入包括複數個細胞的一溶液於一微流體腔室中，其中此腔室流體連接此輸入機構；施加壓力以使此些細胞流經微流體腔室，其中此微流體腔室包括多個柱體排，其中每個排包括複數個柱體，此些柱體沿著具有一斜率的一線分佈，以及其中此斜率係取決於此微流體腔室的一側；藉由此些柱體排使細胞偏離此腔室的一側，以耗盡細胞於從第一輸出機構離開的溶液和濃集細胞於從第二輸出機構離開的溶液，其中第二輸出機構相對於第一輸出機構具有一較小的橫截面積。
因此，在一方面，施加壓力以使細胞流經柱體矩陣和被側向地偏離此腔室的一側，導致細胞濃度局部增加。收集通過輸出機構離開腔室之濃縮的細胞。在另一方面，施加壓力以使細胞流經柱體矩陣，其中大於一截切尺寸的細胞保留於一路徑而小於一截切尺寸的細胞藉由柱體之間的間隙通過進入鄰近的排。較大尺寸的細胞通過輸出機構離開腔室並被收集；較小尺寸的細胞通過另一個輸出機構離開腔室並且也可被收集。
本實施例的優點包括高通量、濃縮細胞的高產率、流速獨立性、藉由更換柱體之間的間隙和/或每個柱體的傾斜/旋轉和/或每個柱體 的形狀/幾何形狀、柱體的旋轉、以及柱體的間隔來濃縮或分離出不同尺寸細胞的可配置性、以及手動或自動化操作的兼容性。一般而言，微流體裝置在濃縮細胞方面和基於尺寸細胞分離方面的性能獨立於層流在正常條件下的流速。裝置性能在不同流速下相似，但可能取決於鞘對樣本(seath-to-sample)的流速比。因此，細胞將朝向腔室的一側橫向地偏轉，獨立於流體流過微流體的速度。其他優點包括以低成本製造微流體裝置的能力。於一些實施例中，可將包括細胞的溶液裝載於注射器中，且注射器可連接到微流體裝置的輸入機構。注射器的操作者手動地壓下柱塞(例如手動注射)以使含有細胞的溶液流過此裝置。此外，本文揭露的實施例不依賴於復雜技術(例如離心機、磁力等)以實現細胞濃縮。於一些實施例中，微流體裝置是單用途裝置。於其他實施例中，注射到微流體裝置中的溶液體積從1mL到10mL或更多。
從下述較佳實施例的詳細描述中，本申請專利標的之各種目的、特徵、方面和優點將更加明顯。
如本文所用，詞語「抗體」通常意旨免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分或片段，亦即含有抗原結合位置的分子，此抗原結合位置可免疫特異性結合抗原(例如在細胞的表面)。除非上下文另有所指，詞語「抗體」包括但不限於抗體的所有同種型和亞型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等)、任何類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類，以及其所有(具有免疫活性的)活性片段。又可理解，任何重鍊(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)可與任何輕鍊(例如如κ或λ形式)配對。
抗體還包括但不限於單株抗體、多株抗體、人類抗體(human antibodies)、擬人化抗體(humanized antibodies)、鼠源性抗體(murine antibodies)、複合體抗體(conjugated antibodies)(例如與化學治療劑、放射線核素、另一蛋白質等複合)、合成抗體(synthetic antibodies)、雙特異性抗體(bi-specific antibodies)、嵌合抗體(chimeric antibodies)、單鏈抗體(single chain antibodies)、Fab表達資料庫產生的抗體片段、以及mRNA展示或噬菌體展示產生的抗體片段。抗體還包括但不限於單價免疫球蛋白和例如F(ab’)2、Fab2、Fab’、Fab、Fv、單鍊Fv(scFv)、scFv-Fc、VhH、二硫鍵連結Fvs(sdFv)等的片段或任何其活性片段。
於一些實施例中，抗體用比色探針、螢光標記、化學發光標記或放射性標記，並與包含細胞的溶液一起培養。多種技術適用於檢測抗體與受體的結合(https：//www.rndsystems.com/resources/protocols/detection-visualization-antibody-binding)。這些技術，包括各種螢光標記、比色、化學發光、或放射性標記免疫試驗，是本領域技術人員所熟知的。
如本文所用，詞語「結合分子」意旨能夠特異性結合細胞的分子，例如藉由結合細胞表面上的標記物。「結合官能基(binding moiety)」包括但不限於抗體或其片段、適體(aptamers)、蛋白質支架(protein scaffolds)、黏合素(affimers)、小分子、胜肽、蛋白質，噬菌體展示scFv、mRNA展示胜肽或mRNA展示scFv等。
如本文所用，詞語「細胞」意旨生物體的最小結構和功能單位。人體細胞的尺寸(例如本文所提供的體積)約30μm3到約 4,000,000μm3。紅血球的典型細胞尺寸約100μm3以及巨核細胞(megakaryocyte)的典型細胞尺寸約30,000μm3。
如本文所用，「細胞溶液」包括具有複數個細胞的生物樣本。於一些情況下，細胞溶液可選擇性地包括額外成分，包括但不限於緩衝液、保存劑、稀釋劑以及其他分子，以藉由微流體裝置促進處理。舉例而言，血液樣本可包含多個紅血球細胞和白血球細胞，以及可包含例如CTCs、轉移細胞、和/或正常細胞之其他類型的細胞。
如本文所用，詞語「腔室」意旨具有相關長度、寬度和高度的一區域，例如包括一柱體矩陣的一矩形部件。柱體的矩陣(matrix of posts)意旨例如網格(grid)或網格狀(grid-like)的一配置，其中存在多個柱體排(rows of posts)，每一排(row)具有複數個柱體(posts)。因此，柱體可被描述為複數個排(rows)，每一排具有複數個柱體(如本文所用)。此外，柱體可被描述為複數個管體(columns)，每個管體具有複數個柱體。於一些方面，柱體的每一排或每一排的一部分設置成沿著具有斜率的線，其中使用數學的標準定義計算此斜率(例如m=(y2-y1)/(x2-x1)，且其中x、y座標是指柱體的位置)。在這方面，斜率係取決相對於具有零斜率之腔室的一側。因此，柱體不配製成平行於腔室側面。腔室具有一或更多個輸入機構(例如用以引入細胞、流體、結合試劑、緩衝液進入腔室等)以及一或更多個輸出機構(例如用以促進收集濃縮的細胞、用以促進收集尺寸分離的細胞、用以連接至另一個輸入機構、用以連接至另一個腔室以進行進一步處理等)。
如本文所用，詞語「路徑」或「通道」意旨細胞通過的兩相鄰柱體排之間的區域(參見第2A圖)。當裝置配置以濃縮細胞，細胞直到離開柱體矩陣前主要保留於特定路徑，並且通常不穿過柱體排而進入另一個路徑。於此處，細胞直到離開柱體矩陣前通常於特定路徑內流動。
當裝置配置成基於尺寸分離細胞，柱體設置成保留大於閾值的細胞並允許小於閾值的細胞穿過一或多個柱體排而進入兩個或更多個路徑。值得注意的是，本文所揭露的柱體的配置不同於採用微粒在兩個或更多個路徑之間來回曲折的配置的系統(例如路徑1到路徑2、路徑2到路徑1)。本技術採用可定向運動(例如路徑1到路徑2、路徑2到路徑3)，將細胞引導到腔室的一側以進行收集。因此，雖然微流體裝置可用於細胞濃縮和細胞分離(兩者皆使細胞橫向朝向腔室的一側偏轉)，但應理解的是，在細胞濃縮方面，細胞主要保留於單一路徑中，以及在細胞分離方面，高於尺寸閾值的細胞主要保留於單一路徑中。
如本文所用，詞語「濃度」意旨測量溶液中成分的量，例如在特定溶液體積中存在多少細胞、存在多少特定細胞類型的細胞等。
如本文所用，詞語「流速」意旨每單位時間內通過預定橫截面積的流體體積(例如包括細胞的溶液)。
如本文所用，詞語「流體連接(in fluid communication with)」或「流體耦接(fluidly coupled to/with)」意旨兩個空間區域配置以使液體在此兩個空間區域之間流動。於一些實施例中，此兩個空間區域流體連接至一或更多個閥門、限流器、混合器(mixers)或其他構件，配置以控制通過微流體裝置之含有細胞的溶液的流動。值得注意的是，即使流體 不能自由地流入與空間區域連接的空間區域，兩個空間區域也可流體連接。舉例而言，即使閥門存在以使流體僅在施加壓力時流入腔室，輸入機構可流體連接腔室。於其他實施例中，輸入機構可流體連接液體(例如包括細胞的溶液)可自由地流入的腔室。
如本文所用，詞語「線(linear)」意旨一直線(straight line)或實質上一直線。舉例而言，對於沿直線分佈的柱體，一些柱體可略高於此線(例如約10%、5%、2%、或1%偏差內)，以及其他柱體可略低於此線(約10%、5%、2%、或1%偏差內)。然而，整體而言，柱體實質上沿一直線分佈。於其他實施例中，柱體排可與一曲率(curvature)相關聯，以更有效地引導細胞到微流體裝置的一側。
如本文所用，詞語「輸入機構」意旨一通口或其他開口，流體連接包括柱體矩陣的腔室。可藉由輸入機構引入流體(例如包括細胞的溶液)到微流體裝置。於一些實施例中，可藉由導管連結注射器或幫浦(例如蠕動幫浦、真空幫浦、注射式幫浦、位移式幫浦)至輸入機構，例如藉由連接到微流體裝置的輸入機構之一扭轉螺帽(twist screw cap)。可施加壓力以驅動流體流過微流體裝置。於一些實施例中，輸入通口可流體連接一可選擇的輸入腔室(沒有柱體矩陣的區域)，此可選擇的輸入腔室係流體連接包括柱體矩陣的腔室。
如本文所用，詞語「間距(interval)」或「間隔(spacing)」意旨距離的單位。於上下文中，間距包括固定的間距(例如相同的距離)和變化的間距(例如變化的距離)。間距可以是指連續的柱體排之間的距離(如垂直測量)，也可以是指每一排中連續的柱體之間的距離(例如水平測量)。
如本文所用，詞語「微流體裝置」意旨一裝置，設計以控制通過3D結構之流體的少量體積的流動，以達成進行理想操作的目的。於特定實施例中，本文所揭露之微流體裝置包括用以濃縮細胞的柱體矩陣，以及可進行例如緩衝液更換和細胞類型分離的其他操作。於又其他實施例中，本文所揭露之微流體裝置可根據尺寸或尺寸範圍來分選細胞。
如本文所用，詞語「輸出機構」意旨一通口或其他開口，流體連接包括柱體矩陣的腔室。流體(例如包括已濃縮細胞的溶液)可藉由輸出機構離開微流體裝置而進入儲存區。於一些實施例中，可藉由導管連結儲存區至輸出機構，例如藉由連接到微流體裝置的輸出機構之一扭轉螺帽(twist screw cap)。於一些實施例中，輸出通口可流體連接一可選擇的輸出腔室(沒有柱體矩陣的區域)，此可選擇的輸出腔室係流體連接包括柱體矩陣的腔室。
如本文所用，詞語「柱體(post)」意旨一結構，此結構內的腔室具有相關平面內維度、平面外維度、旋轉角度、以及形狀。平面內維度(in-plane dimension)是指柱體的長度(l)和寬度(w)，而平面外維度(out-of-plane dimension)是指柱體的高度(h)。傾斜角度或旋轉角度(Φ)是指柱體相對於腔室的旋轉。形狀是指柱體的3-D表徵，例如圓柱形、圓錐形、方錐形、立方形、長方體等。一般而言，將柱體定位成使其軸(平面外維度)垂直於被固定的表面。於一些實施例中，腔室內所有柱體具有相同的維度。於其他實施例中，柱體的維度隨著空間函數而變化。一般而言，柱體可為任何形狀，並且不限於本文所提供之特定幾何形狀。如第2F圖所示，由軸向長度(l)和寬度(w)以及多個與曲率相關的半徑(r1~r2及r4~r12) 所表示之柱體形狀可為任意的，此柱體形狀沿軸向長度定位，例如在一個重複恆定間距或一個重複變量間距。可藉由多個半徑來描述任何數量的不同幾何形狀。此外，參照第2F及2G圖，柱體的一或多個側面可為直線形狀。因此，柱體可具有由曲線和/或直線所組成之任何合適形狀。
第2G圖示出柱體幾何形狀之另一實施例。於此實施例中，柱體配置成與柱體密集地(緊密地)堆疊在一起而以與尺寸無關的方式濃縮細胞。此外，增加了柱體之間重疊區域(例如藉由去除柱體頂端的一部分)以促進細胞流過通道，而不是在柱體之間困住細胞。於此實施例中，柱體之間的距離可約3μm，上方寬度可約6μm，以及下方寬度可約15μm。
未活化的T細胞具有約6~8μm的直徑且可藉由此配置而濃縮。發生於樣本中的低頻率之癌症細胞可藉由此配置與例如包括免疫細胞的相似尺寸或更大的細胞一起濃縮。此外，此配置係兼容緩衝液更換以及例如為本文前述之其他處理步驟。一般而言，此幾何配置類型具有增加的重疊區域、窄間隙，且此幾何配置類型是不對稱的。
如本文所用，詞語「規律間隔的間距(regularly spaced interval)」或「固定的間距(fixed interval)」意旨具有固定距離的間距。根據本文實施例，柱體可沿一線以固定間距的方式分佈，例如柱體可定位沿一直線或一實質上直線，例如以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等方式。
如本文所用，詞語「旋轉角度」意旨柱體相對於其在腔室中的位置之旋轉的度數。於一些實施例中，柱體具有比其寬度更大的長 度。於此實施例中，零的旋轉角度代表柱體長度對準垂直於腔室側面的軸向。為了描述不同的旋轉角度，柱體可順時針或逆時針旋轉。作為一範例，第2A-E圖中柱體以逆時針方向旋轉35度以達成這些圖式中所示之柱體的幾何形狀。
如本文所用，詞語「特異性結合(specifically binds)」典型地意旨目標物件(例如細胞表面上的標誌物)與結合劑之間的非共價相互作用，且通常意旨存在目標物件的特定結構特徵(例如抗原決定位)與結合劑之相互作用。如本領域技術人員所理解的，如果相互作用發生於存在其他替代互相作用的情況下，則認為此相互作用是特定的。
100:細胞
105、105(1)、105(2):腔室
110、110(1)、110(2):輸入機構
112:輸入機構
114:輸入機構
115、115(1)、115(2):柱體
120、120(1)、120(2):輸出機構
122、122(1)、122(2):輸出機構
126:輸出機構
128:輸出機構
130:偏轉點
150:頂板
152:腔室的部分
155:腔室的上部區域
160:底板
165:腔室的下部區域
200:雷射
210:腔室
dx:間距
dy:間距
l:長度
h:高度
p:路徑
r1、r2、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12:半徑
w:寬度
xo:偏移
θ:角度
Φ:旋轉角度
第1A-1B圖是根據本文實施例的示意圖，示出用以濃縮細胞的示意性微流體腔室。
第2A-2G圖是根據本文實施例的示意圖，示出腔室中柱體定位和幾何形狀的各種方面。
第3A-3B圖是根據本文實施例的示意圖與模擬圖，示出用以濃縮細胞的示意性微流體腔室。
第4圖示出根據本文實施例的示意圖，用以更換緩衝液的示意性微流體腔室。
第5圖是根據本文實施例的示意圖，示出用以使特定細胞類型與結合分子結合以及濃縮細胞類型的示意性微流體腔室。
第6圖是根據本文實施例的示意圖，具有兩個獨立腔室的示意性微流體裝置，其中一個腔室用於細胞濃縮以及另一個腔室用以緩衝液更換。
第7圖是根據本文實施例的一體化模組的示意圖，具有一或多個如本文所述之微流體腔室，用於細胞濃縮、緩衝液更換、以及被標記的細胞的除去。
第8A-8B圖示出根據本文實施例之使用微流體腔室基於尺寸分離出細胞的流程圖與示意圖。
第9A-9B圖示出使用本文所提供的裝置和方法之濃縮細胞的示意性微流體腔室的實驗資料。
第10A-10D圖示出使用本文所提供的裝置和方法之具有用以更換緩衝液的微流體腔室的實驗系統。
第11A-11D圖示出使用本文所提供的裝置和方法之活化T細胞和確定活化的T細胞的特徵等方面。
第12A-12D圖示出使用本文所提供的裝置和方法之柱體間不同間隙距離之微流體腔室中各種柱體配置的範例。
第13A-13F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之表徵活化的T細胞與未活化的T細胞的實驗結果。
第14圖是使用本文所提供的裝置和方法之統整各種細胞分選研究的表格。
第15A-15J圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選活化的T細胞的實驗結果。
第16A-16C圖示出使用本文所提供的裝置和方法之藉由更換柱體間距離來分選活化的T細胞的實驗結果。
第17A-17F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之藉由更換柱體間距離來分選活化的T細胞的細胞影像與直方圖。
第18圖示出使用本文所提供的裝置和方法之統整各種抗原刺激的細胞分選研究的表格。
第19A-19F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選未刺激的T細胞的實驗結果。
第20A-20F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選OKT3刺激的T細胞的實驗結果。
第21A-21F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選抗原刺激(pp65胜肽庫)的T細胞的實驗結果。
第22A-22F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選抗原刺激(pp65495-503)的T細胞的實驗結果。
第23A-23F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選抗原刺激(pp65胜肽庫)的T細胞的實驗結果。
第24A-24F圖示出使用本文所提供的裝置和方法之分選抗原刺激(pp65495-503)的T細胞的實驗結果。
第25圖示出使用本文所提供的裝置和方法之用以濃縮細胞的另一柱體幾何形狀配置。
本文所提供的範例並不是限制性的。應理解為這些範例的許多不同變型揭露於本申請中，以及所有實施例皆落入本文所揭露的實施例的範圍。
提供了從生物樣本(例如體液)中基於尺寸之濃縮細胞或分離細胞的系統和方法。體液可包括從患者上所獲得的各種細胞。體液包括但不限於血液、血清、血漿、唾液、尿液、淚液、汗液、間質液、淋巴液、腦脊液、黏膜分泌物、腹膜液或其他身體分泌物或滲出物。
於一些實施例中，體液在與微流體裝置接觸之前經過額外的處理。於其他實施例中，值得注意的是，本技術可直接與全血一起使用，或與稀釋的全血一起使用。處理步驟還可包括在體液中添加一種或多種附加成分(例如緩衝液、生理學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、安定劑、乳化劑、保存劑等)。此外，可添加一或多個其他成分，包括但不限於不會與細胞進行有害反應之抗氧化劑、抑菌劑、緩衝液、碳水化合物、例如EDTA或麩胱甘肽(glutathione)的螯合劑、例如牛血清白蛋白的阻隔劑、著色劑、香料和/或芳香物質、潤滑劑、pH緩衝液、用以影響滲透壓的鹽、多肽(例如甘氨酸)、蛋白質、增溶劑、潤濕劑、降低細胞黏附的物質等。緩衝液包括但不限於鹽水、中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等。碳水化合物包括但不限於聚葡萄醣、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖等。因此，包括提供給微流體裝置的細胞的溶液可包括從患者上所獲得之生物體液或經過額外處理的生物體液。據推測，通過微裝置的流體流(flow of fluid)主要發生在層流(laminar flow)中。
第1A圖是示意性微流體裝置的示意圖。於此範例中，包括細胞100的溶液在輸入機構110處進入腔室105。細胞以圓圈表示。細胞通過腔室105，此腔室105包括一柱體(115)矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞朝向輸出機構122橫向偏轉。腔室的一部分的側視圖示出於第1B圖中，其中腔室具有一底板160以及可選擇地具有一頂板150，其可與柱體115具有相同材料或不同材料。細胞(黑色圓圈)被示以流過柱體矩陣。應理解的是，柱體排也可以曲線方式配置，這也可導致細胞被引導朝向腔室的一側。
於此範例中，示出了用於腔室的兩個輸出機構。藉由輸出機構120離開腔室的溶液耗盡細胞，而藉由輸出機構122離開腔室的溶液富集細胞。耗盡(depletion)是指與在輸入機構110處進入腔室的溶液中的細胞濃度相比，藉由輸出機構120離開腔室的溶液中的細胞濃度減少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的狀態。富集(enrichment)或濃縮(concentration)是指與在輸入機構110處進入腔室的溶液中的細胞濃度相比，藉由輸出機構122離開腔室的溶液中的細胞濃度增加50%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多的狀態。為了引導細胞到輸出機構122，腔室的偏轉點130應定位成使得離開的細胞被自動指引到輸出機構122(而不是輸出機構120)。一般而言，輸出機構122配置以具有比輸出機構120更大的橫截面積。一般而言，輸出機構將具有足夠大的橫截面積以利本文所述流速的流體流動，而不會產生會損壞細胞或裝置的高壓。
於一些實施例中，輸出機構120的寬度大於輸出機構122的寬度。舉例而言，輸出機構120的寬度是輸出機構122的寬度的1.5倍、2倍、 2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍。於其他實施例中，輸出機構的橫截面積之總和可等於或大於輸入機構的橫截面積之總和。
於一些實施例中，微流體裝置配置成允許一標準幫浦或一注射器或其類似物連接到微流體裝置，以使包括細胞的溶液流過裝置。藉由裝置可影響溶液流動的參數包括腔室105的維度、柱體115的平面內和平面外尺寸、每一排內柱體的間隔(dx)、柱體的旋轉(Φ)，柱體排之間的距離(dy)、輸入機構的直徑和輸出機構的直徑(參見下面的第2A-2E圖)。於一些實施例中，選擇這些參數的尺寸以兼容來自注射器或標準幫浦(例如蠕動幫浦、隔膜幫浦、注射式幫浦、葉瓣幫浦等)的手動操作的施加壓力，其中此注射器或標準幫浦係驅動溶液流過設備。允許和提供一壓力範圍以使壓力不會損壞微流體裝置或細胞。
一般而言，細胞可以序列方式(一次一個並且進入特定路徑)或以多重方式(多個細胞流入多個路徑)流入微流體裝置。
第2A圖是腔室105的一部分的俯視示意圖，其中此部分包括每排具有七個柱體的兩排。細胞流(cellular flow)以沿著路徑(p)表示。此示意圖示出柱體115在微流體裝置的腔室的一部分中的定位。一般而言，柱體對準於沿著具有一斜率的線，此斜率由間隔間距(dx)的角度(θ)所定義，此間隔可為固定的或可變的，其變量不會導致細胞從路徑(p)於柱體之間脫離。
於一些實施例中，腔室的寬度為1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm、30mm、40mm、50mm、或更多、或在上述數值之間的任何尺寸。各個路徑(p)的寬度控制流線(streamlines)的表徵。根據腔室的寬度，可採用任何數量的路徑，例如1 個、2個、4個、8個、12個、16個、32個等、或在其之間的任何範圍。於其他實施例中，通過腔室的流體的流速可為1mL/hr、2mL/hr、3mL/hr、4mLhr、5mL/hr、6mL/hr、7mL/hr、8mL/hr、9mL/hr、10mL/hr、15mL/hr、20mL/hr、25mL/hr、30mL/hr、40mL/hr、50mL/hr等方式類推。腔室理想地為矩形，但也可為圓形、半圓形、V形、或任何其它合適的形狀。
角度(θ)是具有零斜率的水平軸與具有斜率的一線之間的角度，其中柱體係沿著此斜率分佈。(於此範例中，角度提供一柱體排的負斜率(tan(θ)=△y/△x)的測量。)於此範例中，應理解的是，柱體可具有正斜率或負斜率，因為每個柱體排係對角配置。於此處應理解的是，對角線可包括不平行或垂直於腔室的任何定向，例如1度和89度之間、91度和179度之間、181度和269度之間、或271度和359度之間的順時針或逆時針的角度。一般而言，在腔室中存在多個柱體排，且每一排具有與如角度(θ)所定義之相同的斜率或實質上相同的斜率。當細胞100進入微流體裝置的腔室105時，細胞以橫向方式流過柱體115之間的多個路徑(p)並朝向腔室105的一側，直到抵達腔室的一側。為了濃縮細胞，細胞通常不橫跨柱體排，而是細胞典型地沿著一特定路徑(p)行進。細胞之後藉由輸出機構122離開微流體室。於其他實施例中，柱體可具有沿著腔室105的長度的一曲線部件。
於一些實施例中，柱體沿著具有斜面的線以間距(dx)配置，其中間距規則地間隔或固定。例如可取決於待濃縮的細胞的尺寸以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95 μm、100μm等方式類推與包括這些範圍之間的任何數值的間距來設置柱體。
於其他實施例中，柱體沿著具有斜率的線分佈，使得間距不是固定的，而是在任何兩個連續柱體之間變化。允許和提供任何間距(dx)，使得間距足夠小以防止細胞從路徑(p)脫離。舉例而言，對於一可變間距，第一柱體可放置於特定位置，第二柱體可放置於距離第一柱體之5μm的位置，第三柱體可放置於距離第二柱體之4μm的位置，並以此類推。可基於細胞尺寸來選擇間距。
於一些實施例中，可選擇間距為足夠大以允許細胞的特定類型的濃縮，同時允許較小的細胞經由輸出機構120離開。舉例而言，血液樣本可包括相對小尺寸的多種不同細胞類型，包括紅血球，嗜中性球(neutrophils)(例如直徑12-14μm)，嗜酸性球(eosinophils)(例如直徑12-17μm)，嗜鹼性球(basophils)(例如直徑14-16μm)，淋巴細胞(lymphocytes)(例如直徑10-14μm)和單核細胞(monocytes)(例如直徑20μm)。人體中其他類型的細胞係大得多，例如從40μm到100μm之間的直徑或更大。在這種情況下，柱體可被間隔開以允許紅血球和白血球通過，同時濃縮較大的細胞(例如正常細胞、腫瘤細胞等)。(間隔的)柱體之配置係取決於被隔離的細胞的類型。不同的鞘對樣本的流速比可影響基於尺寸的分選性能。
每個柱體具有相關之又稱為平面內維度的長度(l)、寬度(w)，以及具有又稱為平面外維度(可參見第2B圖)的高度(h)。於一些實施例中，柱體的寬度可為5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、 35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等方式類推或為在上述數值之間的任何數值。柱體的長度可為5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm等方式類推或為在上述數值之間的任何數值。一般而言，柱體可為任何形狀(從俯視定向的視角，並且相對於維度w和l)，包括但不限於圓形、橢圓形、正方形、矩形等。
於本文提供的範例中，柱體具有橢圓形或矩形形狀。於一些實施例中，柱體的長度比柱體的寬度大1.1到10倍；比柱體的寬度大1.1到5倍；比柱體的寬度大2到4倍；比柱體的寬度大3到4倍；或比柱體的寬度大2到3倍。於仍一其他實施例中，矩陣中每個柱體的長度和寬度是相同的。於又一其他實施例中，如果柱體是圓形的，則矩陣中每個柱體的半徑是相同的。
附加特徵包括柱體的旋轉角度(Φ)，柱體的高度或平面外維度、排之間的間距(dy)、以及排的偏移(xo)，其另外詳細描述於第2B-2E圖中及整個本申請中。
參照第2B圖，每個柱體具有相關聯的高度(h)或平面外維度，使得柱體足夠高以防止細胞藉由流動於一上部路徑而從路徑(p)脫離(例如流過柱體頂部而進入一不同的路徑)。舉例而言，於一些實施例中，柱體將跨越微流體腔室的高度，以使柱體接觸腔室的底板160和腔室的頂板150。於其他實施例中，柱體的高度或平面外維度可跨越微流體裝置的總高度的一部分。舉例而言，柱體可具有1μm、3μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55 μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm的高度等方式類推或為在上述數值之間的任何數值。
參照第2C圖，如俯視圖所示，每個柱體具有相關聯的旋轉角度(Φ)或傾斜。在本範例中，確定柱體的旋轉；從一定向開始，此定向中柱體的長度係與垂直於腔室側面的第一軸對準，以及此定向中柱體的寬度係與平行於腔室側面的第二軸對準；藉由於逆時針方向旋轉柱體(例如於此範例中逆時針旋轉約35度)直到達成期望的旋轉。可使用促進細胞通過路徑(p)的流動之任何旋轉角度，且所有這樣的旋轉角度皆可考量於本文中。於一些實施例中，旋轉角度在1度和179度之間、1度和89度之間、5度和85度之間、10度和80度之間、15度和75度之間、20度和70度之間、25度和65度之間、30度和60度之間、35度和55度之間、40度和50度之間、30度和40度之間、32度和38度之間、34度和36度之間、或35度。於其他實施例中，旋轉角度可在91度和179度之間、95度和175度之間、100度和170度之間、105度和165度之間、110度和160度之間、115度和155度之間、120度和150度之間、125度和145度之間、130度和140度之間、或135度。
呈上所述，柱體沿著具有負斜率的線分佈。藉由沿著此線定向細胞，流過路徑(p)的細胞被橫向引導朝向腔室的一側，而細胞最初懸浮的溶液能夠以某種方式流動(例如接近水平地或水平地)而藉由輸出機構120離開微流體室。
參照第2D圖，於仍其他實施例中，柱體排以間距(dy)間隔開。於一些實施例中，柱體沿垂直線以間距(dy)配置，其中此間距係規則地間隔或固定。舉例而言，取決於待濃縮的細胞的尺寸，可以每5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μ m、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、85μm、90μm、95μm、100μm和以此類推的方式放置柱體，包括在其之間的任何數值。
於其他實施例中，柱體沿垂直線分佈，使得間距(dy)係不固定，而是在任何兩個連續的柱體排之間變化。舉例而言，對準相對於垂直線，第一柱體排可放置在特定位置，第二柱體排可放置於距離第一柱體排之5μm的位置，第三柱體排可放置於距離第二排柱之4μm的位置，並以此類推。可基於待濃縮的細胞的尺寸來選擇間距(dy)。允許和提供任何間距(dy)，使得間距足夠寬以允許溶液流過腔室而不需要會損壞微流體裝置的高壓。於一些實施例中，連續的柱體排可具有零偏移(xo)。
參照第2E圖，連續的柱體排可具有相對於間距(dx)的偏移(xo)。舉例而言，可於特定位置建立一排(r)(例如使用笛卡爾座標系x、y)。第(r+1)排可向右移位一量(xo)。第(r+2)排可向右移位一量(2xo)。第(r+3)排可向右移位一量(3xo)，並以此類推直到間距(dx)的量。可選擇地，偏移可為可變的方式，使得每個連續的排在相同方向上移位一可變的量(直到(dx)的量)。於其他實施例中，可以在交替方向上應用偏移，使得相對於排(r)之第(r+1)排在一方向上具有固定或可變的偏移，以及第(r+2)排在其相反方向上具有固定或可變的偏移(例如一偏移向右，下一個偏移則向左)。
柱體可由任何合適的材料製成，包括聚二甲基矽氧烷(PDMS)、玻璃、塑膠、彈性體、矽等。通常可將PDMS製造成具有亞微型分辨率(sub-micron resolution)(例如低於0.1μm的特徵)。於一些實施例中，腔室105和/或柱體115可由PDMS製成。於其他實施例中，腔室可由玻璃和/或矽和/或塑膠製成，以及柱體可使用PDMS製成(例如腔室的底部可 為玻璃或矽，以及腔室的頂部可為玻璃或塑料)。本領域熟知的微影技術(lithography)可用於製造如本文所述的腔室和柱體。具有與PDMS相似性質的材料也可用於構建本文所述的微流體裝置。
此外，特定實施例可包括許多附加特徵，包括閥門(例如在輸入機構和腔室之間、腔室和輸出機構之間、輸出機構和另一輸入機構或另一腔室之間等)、幫浦和混合器(mixers)。於一些實施例中，可在篩選期間將閥門放入PDMS中。
可採用各種技術來製造微流體裝置。微流體裝置可由以下材料中的一種或多種形成：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烴、矽氧烷(例如聚二甲基矽氧烷PDMS)、矽、及其組合。其他材料係熟知於本領域中。
使用本文所述材料製造具有柱體的腔室和微流體裝置的方法亦熟知於本領域中，包括但不限於壓花(embossing)、雷射微機械加工(laser micromachining)、銑削(milling)、模塑(molding)(例如熱塑性注塑(thermoplastic injection molding)或壓塑(compression molding))、光微影技術(photolithography)(例如立體光刻(stereolithography)或X射線光微影技術(x-ray photolithography))、矽微加工(silicon micromachining)、濕法或乾法化學蝕刻(wet or dry chemical etching)等。
使用光微影技術(photolithography)而後濕法(KOH)或乾法蝕刻(用氟或其他反應氣體的反應離子蝕刻)之矽製造技術可用於玻璃材料。舉例而言，玻璃母版可以通過常規光刻法形成，其用作模塑技術的主模板，以產生塑膠或基於PDMS的裝置。
微流體裝置可製造在一或多個層中，所述層例如藉由黏著劑、夾具、加熱、溶劑等接合在一起。可選擇地，微流體裝置可製造為一單件，例如使用立體平版印刷術(stereolithography)或其他3-D製造技術。
於一些實施例中，由於細胞的可形變性，相較於被濃縮的細胞的尺寸(例如直徑)，可選擇約5μm或更小的間隙距離。於其他實施例中，相較於被分選的細胞的尺寸(例如直徑)，可選擇約5μm或更大的間隙距離。對於具有與可形變的細胞相同或相似直徑之硬式細胞(rigid cells)或軟骨細胞(microspheres)，相較於相同直徑的可形變的細胞的間隙距離，間隙距離可不同(例如對於硬式細胞而言更大)。
第3A-3B圖示出用於細胞濃縮的示意性微流體裝置的示意圖(第3A圖)和模擬圖(第3B圖)，以表示腔室的一部分152表示。進行模擬(第3B圖)，其中柱體之間以約4μm間隔，以及柱體逆時針旋轉約35度。模擬圖示出細胞成功地穿過一路徑並使用此設計進行濃縮，從而證實此設計成功地濃縮細胞。
於一些實施例中，可進行另外的模擬以確認不同細胞的其他類型的配置。
第4圖是另一示意性微流體細胞濃縮裝置的示意圖。於此範例中，包括細胞100的第一溶液在第一輸入機構110處進入腔室105。細胞以圓圈表示。細胞通過腔室105，此腔室105包括一柱體(115)的矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞朝向腔室的一側橫向偏轉。相似於第1B圖，腔室具有一底板160(未示出)以及一可選擇的頂板150，其可與柱體115具有相同材料或不同材料。
於此範例中，第二輸入機構112存在於此系統中。第二溶液(例如緩衝液，不同於通過第一輸入機構110進入腔室的第一溶液)通過第二輸入機構112進入腔室。於一些實施例中，第一溶液和第二溶液實質上不混合，且因此腔室的上部區域155包括第一溶液以及如果有的話具有很少的第二溶液，而腔室的下部區域165包括第二溶液以及如果有的話具有很少的第一溶液。因此，當細胞橫向偏轉並通過輸出機構122離開腔室時，通過輸出機構122離開腔室的溶液處於第二溶液緩衝液中。
在一些方面，緩衝液更換可依順序進行(occur sequentially)於串接設計(cascade design)中，如第6圖所示。在其他方面，緩衝液更換可同時進行(occur in parallel)。舉例而言，可劃分流動路徑以使樣本流入多個腔室，其中每個腔室包括對於緩衝液的輸入機構。藉由此配置，可向每個平行腔室提供相同的緩衝器，使得細胞濃縮於相同的緩衝液中。可選擇地，可向每個平行腔室提供不同的緩衝液，使得細胞濃縮到不同的緩衝液中，例如用於不同的下游試驗。
一般而言，輸入機構可藉由注射式幫浦或藉由手動按壓注射器來驅動。在一些方面，對於多個入口，可使用一或多個注射式幫浦以自動方式驅動每個入口。在其他方面，對於多個入口，可使用手動按壓一或多個注射器來手動驅動每個入口。
第5圖是另一示意性微流體細胞濃縮裝置的示意圖。於此範例中，包括細胞100的第一溶液在第一輸入機構110處進入腔室105。細胞以圓圈表示。細胞通過腔室105，此腔室105包括一柱體(115)的矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細 胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞朝向腔室的一側橫向偏轉。相似於第1B圖，腔室具有一底板160(未示出)以及一可選擇的頂板150，其可與柱體115具有相同材料或不同材料。
於此範例中，第二輸入機構114存在於此系統中。第二溶液(例如其與第一溶液不同或可相同以及包括能夠結合第一溶液中細胞的細胞表面(結合官能基)的分子)在輸入機構114處進入腔室。於一些實施例中，結合官能基與細胞混合，並與細胞表面上具有合適標記的細胞結合。
此外，第三輸入機構112存在於此系統中。第三溶液(例如緩衝液，可不同於或可相同於通過第一輸入機構110進入腔室的第一溶液以及可不同於或可相同於通過第二輸入機構114進入腔室的第二溶液)通過第三輸入機構112進入腔室。於一些實施例中，第一/二溶液和第三溶液實質上不混合，且因此腔室的上部區域155包括第一/二溶液以及如果有的話具有很少的第三溶液，而腔室的下部區域165包括第三溶液以及如果有的話具有很少的第一/二溶液。因此，當細胞橫向偏轉並通過輸出機構122離開腔室時，通過輸出機構122離開腔室的溶液包括第三溶液的緩衝液，其富集與結合分子結合的細胞。
一般而言，輸入機構可藉由注射式幫浦或藉由手動按壓注射器來驅動。在一些方面，對於多個入口，可使用一或多個注射式幫浦以自動方式驅動每個輸入。在其他方面，對於多個入口，可使用手動按壓一或多個注射器來手動驅動每個入口。
第6圖是另一具有多個腔室的示意性微流體細胞濃縮裝置的示意圖。於此範例中，包括細胞100的第一溶液在第一輸入機構110(1)處進入第一腔室105(1)。細胞以圓圈表示。細胞通過腔室105(1)，此腔室 105(1)包括一柱體(115(1))的矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞係橫向偏轉。相似於第1B圖，腔室具有一底板160(未示出)以及一可選擇的頂板150，其可與柱體115具有相同材料或不同材料。(富集的)細胞通過出口122(1)離開腔室，此出口流進輸入機構110(2)，且第二輸入系統112進入系統。
第二溶液(例如緩衝液，可不同於通過第一輸入機構110(1)進入腔室的第一溶液)通過第二輸入機構112進入腔室。於一些實施例中，第一溶液和第二溶液實質上不混合，且因此腔室的上部區域155包括第一溶液以及如果有的話具有很少的第二溶液，而腔室的下部區域165包括第二溶液以及如果有的話具有很少的第一溶液。細胞(富集的並於來自輸入機構122的緩衝液中)通過輸出機構122(2)離開腔室105(2)。
第7圖示出另一示意性配置，此配置中系統進行緩衝液變更、細胞濃縮、被標記細胞的雷射殺傷、以及用以取得只有活細胞的介電電泳。於此範例中，包括細胞100的第一溶液在第一輸入機構110處進入第一腔室105(1)。細胞以圓圈表示。細胞中的一些係以一標誌物標記，例如選擇性結合至一特定類型細胞的表面的一結合分子。細胞通過腔室105(1)，此腔室105(1)包括一柱體(115)的矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞係橫向偏轉並從第一緩衝液(位於腔室的上部區域155)進入來自輸入機構112的第二緩衝液(位於腔室的下部區域165)。相似於第1B圖，腔室具有一底板160(未示出)以及一可選擇的頂板150，其可與 柱體115具有相同材料或不同材料。(現在富集的)被標記細胞通過出口122離開腔室，此出口流進第二腔室105(2)。
一旦進入第二腔室105(2)，藉由如本文所述之柱體115的矩陣濃縮細胞。只要離開第二腔室105(2)，細胞被引導到接觸雷射200的一區域，此區域中被標誌物結合到的細胞係藉由雷射(例如6mJ、45Hz、6ml/hr)照射而被殺傷。任何由雷射激活的合適標記(例如激活成能夠殺死細胞的形式的標記，例如熱生成、能量耗散、裂解成毒性形式等)可用於殺死被標記的細胞。於一實施例中，金(Au)奈米棒、奈米籠、或其他奈米顆粒被吸附到IgG抗體上，所述IgG抗體對溶液中的一類型的細胞是具有特異性的。一旦細胞被雷射照射，金(Au)顆粒就會升溫，並殺傷具有被金所標記之抗體的細胞。藉由使用介電電泳在腔室210中將死細胞從活細胞中分離出來(Pohl H.A.等人，Science(1966)，152(3722)：647)。死細胞在輸出機構(126)處離開，以及活細胞在輸出機構(128)處離開。
本文提供的技術可與其他方案組合以從生物樣本中分離出特定細胞。舉例而言，於一實施例中，取得血液樣本；與一或多種可識別特定細胞表面標誌物(例如CD2、CD14、CD19、CD45、CD61、CD66b、醣蛋白A等)的金標記抗體(gold labeled antibodies)混合。混合物可被注入於第7圖的系統中以進行處理。舉例而言，混合物可經歷緩衝液更換，進一步通過第二濃縮步驟，藉由雷射以殺傷抗體標記的(具有吸附的金(Au)奈米顆粒)細胞。活細胞可在輸出機構128處分離，輸出機構128可包括一或多種不同類型的腫瘤細胞(例如循環腫瘤細胞、轉移細胞等)。許多不同的配置是可能的，並且所有這些配置都落入本文所揭露的裝置的範圍內。
圖8A-8B示出根據本文提供的實施例之使用微流體腔室基於尺寸製備和分選細胞的流程圖和示意圖。本文提供的微流體裝置可用於基於尺寸分離細胞，例如藉由從較小的細胞中分離出較大的細胞。根據一範例，可根據第8圖所示的方案製備用於分離的細胞。於此處，周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)從冷凍保存中解凍。應理解的是，未冷凍的血液樣本也適合注射到微流體裝置中。可藉由磁性分選而取得CD8+T細胞。用於磁性分選的方案是本領域熟知的(Stanciu L.A.,Djukanovi
Figure 108101038-A0305-02-0030-89
R.(2000)Isolation of T-Cell Subsets by Magnetic Cell Sorting(MACS).In：Kearse K.P.(eds)T Cell Protocols.Methods in Molecular BiologyTM,vol 134.Humana Press)。一旦分離出T細胞，就用CD3/CD28刺激細胞，這導致細胞尺寸的增加。然後對細胞進行分選(基於尺寸來分離)，如第8B圖所示，其中較大的活化的T細胞朝向腔室的一側橫向偏轉，較小的未活化的性T細胞進入廢液收集。於一些實施例中，細胞可通過相同的腔室至少兩次，或通過兩個依序設置的腔室，使得分選以兩個步驟進行。
本文提供的技術也可與抗原刺激的細胞一起使用。抗原包括但不限於CMV pp65、OKT3等。本文提供的技術還可用於刺激後增加尺寸的任何細胞類型，例如藉由抗原，例如藉由過表達的蛋白質(overexpressed protein)、或其他生長/尺寸增強因子(growth/size enhancing factor)。
提供用於分離各種尺寸的細胞的表格示出間隙距離和流速的近似範圍。應理解的是，細胞直徑典型地在細胞群內變異。因此，類似於下面提供之數值的間隙距離也可用於分離預定尺寸的細胞。
Figure 108101038-A0305-02-0031-1
在另一方面，細胞分選和濃縮裝置可另外配置成在裝置的底板中具有腔室，此腔室位於分選機構和腔室出口之間。此配置捕獲細胞於裝置的底板。於其他實施例中，調節流速以捕獲柱體之間的間隙中的細胞，允許較小的細胞通過。對於被捕獲的細胞，可增加流速以去除被捕獲的細胞。
在本文提供的技術之又其他方面，腔室可用於濃縮出現於尿液中的細胞。舉例而言，膀胱癌細胞經常脫落，因此可能存在於尿液中。本文所述之腔室可濃縮這些細胞。
在其他方面，本文提供的技術可利用與柱體結合的捕獲抗體(capture antibodies)從樣本中去除特定細胞(例如CTCs)，或可用於去除將被排除在處理之外的細胞群。
應理解的是，此裝置可執行本文所述之任何功能，包括細胞濃度、細胞分選、緩衝液更換等。
在另一個方面，此裝置可用作一預處理步驟以選擇用於轉染(transfection)的細胞，例如用以提高轉染產量。於此實施例中，基於較大的尺寸，選擇例如正在進行細胞***之較大的活化的細胞，並且收集較大的細胞來用於轉染。
在另一方面，此裝置可用於辨識轉移細胞。一些轉移細胞變得比其非癌性對應物(non-cancerous counterparts)更柔軟，因此能夠形變而通過較小的間隙距離。藉由調節間隙距離和流速，可建立允許轉移細胞從正常細胞中分離出來的情況。不收集不能通過較小的間隙距離之較硬的正常細胞。
值得注意的是，其他類型的癌症，例如乳腺癌，可導致細胞硬度(cell stiffness)或黏彈性(viscoelasticity)的增加。在這種情況下，可建立流速以允許正常細胞形變而通過較小的間隙距離，而較硬的細胞則不能通過。
在又另一方面，本技術可用於收集細胞，並同時收穫上清液。例舉例而言，在大量的蛋白質生產過程中，可培養細胞以表達治療性單株抗體或其他生物製劑。本文所揭露之技術提供一種快速收集這些細胞的方法，同時收集具有已表達抗體的上清液，而無需離心或過濾步驟。
在其他方面，可配置一或多個微流體腔室來分離出具有一尺寸範圍的細胞。舉例而言，藉由配置兩個腔室為串聯定向，使得第一腔室具有8μm的截斷標的，並且第二腔室具有10μm的截斷標的，可針對具有此些範圍之間尺寸的細胞來收集。
在另一方面，可藉由產生機率截斷曲線來確定特定細胞類型的最佳截斷尺寸，如第17E圖及第17F圖所示。可改變間隙以找到適合各種細胞尺寸的合適的截斷值。
在另一方面，PDMS或實質上類似於PDMS的任何材料可用於建構如本文所述之腔室的部分或整體。
本文所述之方法可採用上述步驟中的僅一個或上述步驟中的任何組合，用以濃縮和/或分離細胞。本文所述之方法可回收樣本中期望細胞的至少75%、80%、90%、95%、98%、或99%。
在另一方面，本文所述之微流體腔室可用以分離、進行緩衝液更換、和/或濃縮比樣本中其他細胞類型大的癌細胞。於其他實施例中，本文所述之微流體腔室可用以濃縮或進行大約相同尺寸的非癌細胞群內的癌細胞的緩衝液更換。可在隨後的(第二次的)分選步驟中分離出癌細胞，例如使用癌細胞特異性染色(staining specific to cancer cells)、癌細胞特異性抗體(antibodies specific to cancer cells)等。
對於本領域技術人員而言，顯而易見的是，除了所述的那些之外，還有許多修改是可能的。本文所揭露之系統、方法和裝置係不受限制，除非在附加的請求項的範圍內。此外，在解釋說明書和請求項時，所有詞語都應以與上下文一致的最廣泛合理方式進行解釋。特別是，詞語「包括(comprises)」和「包括(comprising)」應被解釋為以非排他性方式引用元件、成分、或步驟，表示引用的元件、成分、或步驟可能存在，或表示引用的元件、成分、或步驟可被使用，或表示引用的元件、成分、或步驟可與未明確引用的其他元件、成分、或步驟相結合。其中說明書請求項指的是選自由A、B、C...和N所組成之群組中的至少一種，此內容應被解釋為只需要群組中的一個元件即可，而不是A加N、或B加N等。
範例 範例1：細胞的分離
細胞可取得自活體組織切片、外科手術切除、或抽血。細胞可根據本領域已知標準技術來收集和儲存。
於一些實施例中，使用尖銳的25號長針(例如來自Becton Dickinson)進行細針抽吸(fine needle aspiration)。基於患者體內腫瘤的位置選擇針的長度。針連接於可撓性塑膠管，此可撓性塑膠管與抽吸注射器相連。針尖***腫瘤，用抽吸法收集腫瘤細胞的樣本。這個過程是使用成像(imaging)例如超聲波影像(sonography)、或任何其他合適技術來監測的。
將每一份樣本放入管中或容器(flask)中，並加入用於哺乳動物細胞的合適細胞培養基(例如5%胎牛血清(FBS))；殺真菌劑和/或殺菌劑/抗生素)。細胞係作為單層培養，例如在6個孔板中培養；細胞係成長至群集，例如培養2週或直到達到合適細胞密度。培養的細胞係之後被收集，選擇性地進行清洗，並離心成沉澱物。將細胞重新懸浮並儲存在液態氮中，以備將來使用。
於其他實施例中，根據本領域已知技術，血液樣本可從患者上獲得，並與等張的鹽水溶液混合。
範例2：使用微影技術(lithography)來製造腔室
除非另有說明，否則使用本領域已知標準軟式微影技術(standard soft lithography techniques)來製造裝置。
可使用軟式微影技術來產生本文所述之聚二甲基矽氧烷(PDMS)結構。一般而言，使用光微影技術(photolithography)製造模具(母模)，其中模具代表微流體腔室的空的空間。於範例中，母模(master)對應 於流體將流動的區域是固體，以及對應於柱體存在的區域中是空的。例如光微影技術可於例如美國專利號8372579中找到。
PDMS是藉由含有氫化矽的成分與含有乙烯基的另一成分混合而形成。將這種混合物倒入母模(master mold)中，並允許固化，例如在70℃下固化一兩個小時。一旦固化，PDMS結構可從母模上剝離(同時保持完整)，並且可再次使用母模製作額外的PDMS模具。
從母模移除PDMS結構之後，以可逆或不可逆的方式將PDMS結構密封在例如玻璃、矽、或PDMS的另一表面上。於一些實施例中，黏著的矽(adhesive silicon)和/或玻璃紙膠帶(cellophane tape)可與PDMS結合使用以產生適於較低壓的可逆密封。較高的壓力可能需要不可逆的密封，此不可逆的密封係藉由將PDMS暴露在氧等離子(oxygen plasma)中而形成。此外，PDMS可藉助極性溶劑來進行密封，其中極性溶劑的薄膜置於PDMS層之間，然後加熱，蒸發溶劑並密封各層。
於其他實施例中，可藉由「夾層(sandwiching)」或堆疊多層PDMS來產生更複雜的結構。於這樣的實施例中，利用微級(micro-stages)來確保氧化後的完美對準。這些技術係已知於本領域中。
範例3：腔室的三維列印(Three Dimensional Printing)
此外，3D列印技術也可用於製造母模。此技術以附加方式(如CAD文件所示)將少量材料(例如矽等)列印為多個層以產生三維結構。
3D列印允許快速成型，並且可實現適合一些微流體裝置的分辨率。於此範例中，然後以前述範例的相同方式使用母模來產生PDMS腔室。
此外，可利用CAD文件來直接列印腔室結構(而不是反向結構)。然後可用PDMS塗覆此結構以具有期望的表面性質。(Waheed等人，Lab Chip(2016)16：1993-2013。)
這些範例純粹是作為示例性的，並不加以限制，因為可理解許多不同的實施例為落入本文所揭露之系統、方法、和設備的範圍內。
範例4：細胞濃縮
於一實施例中，獲得包括細胞的生物樣本。將樣本裝入注射器中，此注射器藉由管道連接到微流體裝置的輸入機構110(參見例如第3圖及第9A-9B圖)。一旦手動壓下注射器的柱塞，流體係藉由管道流入輸入機構，並通過包括柱體矩陣的腔室。細胞朝向微流體室的一側橫向偏轉，並藉由輸出機構122離開腔室。在出口收集現在濃縮的細胞。
第9A圖示出用於細胞濃縮的示意性微流體裝置的實驗結果。拍攝腔室115的不同截面影像，其中截面1示出最接近輸入機構的腔室部分以及截面5示出最接近輸出機構的腔室部分。實心箭頭顯示了流過腔室的細胞100的位置。當細胞通過腔室時，細胞被橫向引導，並離開柱體矩陣(截面5)。
第9B圖示出用於細胞濃縮的示例性微流體裝置的實驗結果，其中流速為20mL/hr且達成的細胞濃度為105/mL，比輸入濃度提高10倍到11倍。細胞通過輸出機構122離開腔室。
範例5：緩衝液更換
於另一實施例中，獲得生物樣本。將樣本裝入注射器中，此注射器藉由管道連接到微流體裝置的輸入機構(例如與腔室流體連接的 輸入通口)(參見例如第6圖及第10A-10D圖)。將含有緩衝液(不同於含有生物樣本的溶液)的第二溶液連接到第二輸入機構，並且手動注射器提供適當量的壓力以使第二溶液以恆定速率流過腔室。使用者手動按下注射器，以及流體從注射器流入包括柱體矩陣的腔室。細胞朝向微流體腔室的一側偏轉，並藉由輸出機構122離開。在出口收集現在濃縮且在新緩衝液(第二溶液)中的細胞。
第10A-10D圖示出用於細胞濃縮的示例性微流體裝置的實驗結果，包括緩衝液更換。第10A圖示出兩個輸入機構(在這種情況下，連接到管道)進入微流體裝置，此微流體裝置具有帶有兩個輸出機構(也連接到管道)的腔室。第10B圖示出阿洛拉紅AC(Allura Red AC)食用染料進入腔室，其中腔室的上部區域155從輸入機構110保有溶液，腔室的下部區域165從輸入機構112保有溶液。第10C圖示出輸出機構122。第10D圖示出用於細胞濃縮的示例性微流體裝置的實驗結果，其中流速為20mL/hr，以及達成的濃度為105/mL，比輸入濃度提高5倍到6倍。在此範例中，完整的緩衝液(介質)更換快速發生，並且沒有使用諸如離子擴散的耗時處理。於此實施例中，鞘之流速(Q鞘)為0.01ml/hr到100ml/hr，而樣本之流速(Q樣本)為0.01ml/hr到100ml/hr。
一般而言，輸入機構可藉由注射式幫浦或藉由手動按壓注射器來驅動。在一些方面，對於多個輸入，可使用一或多個注射式幫浦來驅動每個輸入。在其他方面，對於多個輸入，可使用手動按壓一或多個注射器來驅動每個輸入。
範例6：結合分子
於仍另一實施例中，從患者上獲得生物樣本(例如血液樣本)。將樣本用氯化鈉等張的鹽水稀釋並裝入注射器中，此注射器藉由管道連接到微流體裝置的輸入機構(例如與腔室流體連接的輸入通口)(參見第5圖)。使用者手動按壓注射器，以及流體從注射器流入包括柱體矩陣的腔室。含有結合分子(與細胞上特定類型標誌物結合的分子)的第二溶液與第二輸入機構連接，另一注射器提供適當量的壓力以使包括結合分子的溶液以恆定速度流過腔室。細胞與腔室中的結合分子混合，以及被標記的細胞朝向微流體腔室的一側偏轉。含有不同的緩衝液(165)的第三溶液與第三輸入機構連接，此緩衝液係不同於包括細胞的溶液和含有結合分子的溶液。細胞(包括已標記和未標記)朝向流體腔室的一側偏轉，並藉由輸出機構(122)離開。在出口收集現在濃縮且被標記(並在第三溶液中)的細胞。於其他實施例中，第三輸入是可選的，以及此處理可限於標記和濃縮細胞。
一般而言，輸入機構可藉由注射式幫浦或藉由手動按壓注射器來驅動。在一些方面，對於多個輸入，可使用一或多個注射式幫浦來驅動每個輸入。在其他方面，對於多個輸入，可使用手動按壓一或多個注射器來驅動每個輸入。
範例7：濃縮器與緩衝液轉換(Buffer Switch)
於另一實施例中，從患者上獲得生物樣本(例如血液樣品)。用氯化鈉等張的鹽水稀釋樣本並裝入注射器，此注射器藉由管道連接到微流體裝置的輸入機構(例如與腔室流體連接的輸入通口)(第6圖)。一旦手動壓下注射器，流體就從注射器流過輸入通口，然後進入包括柱體矩陣的腔室105(1)。細胞朝向微流體室的側面偏轉，並藉由輸出機構(122(1))離開。現在濃縮的細胞流入第二腔室，其中第二腔室也具有作為輸入，含有緩衝液的第二溶液(不同於含有血液樣本的第一溶液)藉由第二輸入機構110(2) 流入第二腔室105(2)。幫浦提供適當量的壓力以使第二溶液以恆定速率流過腔室。使用者手動按壓注射器，並且流體從注射器通過第一腔室流入包括柱體矩陣的第二腔室。細胞朝向微流體室的側面偏轉，並通過輸出機構(122(2))離開。在出口收集現在濃縮且在新緩衝液(第二溶液)中的細胞。
範例8：一體化(All in One)
於另一實施例中，從患者上獲得生物樣本(例如血液樣本)。用氯化鈉等張的鹽水稀釋樣本並裝入注射器，此注射器藉由管道連接到微流體裝置的輸入機構(例如與腔室流體連接的輸入通口)(第7圖)。此範例示出又另一示意性配置，其中系統進行緩衝液變更、細胞濃縮、被標記細胞的雷射殺傷、以及用以取得只有活細胞的介電電泳。於此範例中，包括細胞100的第一溶液在第一輸入機構110處進入第一腔室105(1)。細胞以圓圈表示。細胞中的一些係以一標誌物標記，例如選擇性結合至一特定類型細胞的表面的一結合分子。細胞通過腔室105(1)，此腔室105(1)包括一柱體(115)的矩陣，此柱體矩陣在這裡以沿著具有一斜率的多條線分佈之矩形結構來表示。當細胞在腔室中對角定向的柱體排之間通過時，細胞係橫向偏轉並從區域155的第一緩衝液進入來自輸入機構112的區域165的第二緩衝液。相似於第1B圖，腔室具有一底板160(未示出)以及一可選擇的頂板150，其可與柱體115具有相同材料或不同材料。(現在富集的)被標記細胞通過出口122離開腔室，此出口流進第二腔室105(2)。
一旦進入第二腔室105(2)，藉由如本文所述之柱體115的矩陣濃縮細胞。只要離開腔室105(2)，細胞被引導到接觸雷射200的一區域，此區域中被標誌物結合到的細胞係藉由雷射(例如6mJ、45Hz、6ml/hr)照射而被殺傷。任何由雷射激活的合適標記(例如激活成能夠殺死細胞的形式 的標記，例如熱生成、能量耗散、裂解成毒性形式等)可用於殺死被標記的細胞。於一實施例中，金(Au)奈米棒、奈米籠、或其他奈米顆粒被吸附到IgG抗體上，所述IgG抗體對溶液中的一類型的細胞是具有特異性的。一旦細胞被雷射照射，金(Au)顆粒就會升溫，並殺傷具有被金所標記之抗體的細胞。藉由使用介電電泳將死細胞從活細胞中分離出來(Pohl H.A.等人，Science(1966)，152(3722)：647)。死細胞在輸出機構(126)處離開，以及活細胞在輸出機構(128)處離開。
範例9：基於尺寸分選細胞
對於涉及藉由流式細胞儀(FACS)進行細胞分選的以下範例和圖式，可根據經驗決定邊界框(bounding boxes)(例如黑色多邊形)。
第11A-11D圖示出根據本文所提供的實施例之細胞分選和分離的影像和實驗結果。
根據本文所提供的方面，微流體裝置也可用於細胞分選，例如用以富集已活化的T細胞，此T細胞係藉由與特定抗原結合或藉由添加可使T細胞活化的物質來活化。第11A圖及第11B圖示出T細胞在活化時尺寸增加，以及此尺寸增加係在活化後約24小時(Guo等人，Nature Communication(2016)7：10307)。
在本研究中，如第11C圖及第11D圖所示，細胞活化係基於細胞尺寸來量化，如藉由正向散射(forward scatter)(FSC)的測量以及如CD25表達函數。未受刺激的細胞位於左下象限，並且具有減少的CD25表達的較小尺寸。在此研究中，示出早在刺激後兩天，並刺激後持續三天，觀察到具有更大尺寸和活化標誌物CD25表達增加的細胞群。
第12A-12D圖示出細胞分選裝置的各種配置。參照第12A圖，每個柱體具有相關的傾斜角度或旋轉(也參見第2C圖)和形狀。為了決定間隙距離，可繪製圓於一第一柱體的下部以及可繪製圓於一相鄰柱體的上部，並且可在兩個相鄰柱體之間形成連接每個圓的中心的線。如第12A圖所示，間隙距離是沿著此線的兩個相鄰柱體之間的最小距離，在這種情況下，其約為4μm。第12B圖及第12C圖示出6μm和9μm的間隙距離，而第12D圖示出HL-60細胞的實驗影像，此HL-60細胞在如本文所述之微流體腔室中經歷尺寸分離。HL-60細胞是癌細胞族系(cancer cell line)，尺寸範圍係約10至15μm，並且使用9μm間隙距離進行細胞分離。在這種情況下，收集直徑為約11μm的細胞，而較小的細胞流過腔室進入廢液收容器。因此，多種因素影響細胞分離，包括微流體裝置中柱體的間隙距離和傾斜/旋轉角度。
在一些方面，可基於細胞尺寸和黏彈性(viscoelastic nature)選擇間隙距離。一般而言，細胞是可形變的，而且每側可形變約2μm到3μm。因此，為了選擇在每側形變約2μm的8μm細胞，可使用4μm的間隙距離。這種相同趨勢可能適用於較大尺寸的細胞，例如6μm截面用於10μm細胞、9μm截面用於13μm細胞。在一些情況下，較大的細胞可形變通過較小的間隙，以及在這種情況下，可向上調節流速以減少這種情況。
在一些方面，柱體可塗覆試劑，此試劑可使細胞與柱體結合，例如抗體、抗原等。於此範例中，抗原或抗體抑制細胞通過腔室。可基於尺寸和遷移通過腔室的速度來分離。
範例10：以CD3和CD28mAbs來刺激和分選T細胞
對於涉及藉由流式細胞儀(FACS)進行細胞分選的以下範例和圖式，可根據經驗決定邊界框(bounding boxes)(例如第13A圖所示的黑色多邊形等)。
參考第13A-13F圖，使用CD3抗體和CD28抗體組合，以刺激來自周邊血液單核細胞(PBMC)混合物的細胞。此技術可用於廣泛地刺激T細胞，而且此技術不是抗原特異性的。第13A圖及第13D圖示出未受刺激細胞和受刺激細胞的側向散射(SSC-A)和前向散射(FSC-A)。示出受刺激的細胞尺寸增加。第13B-13F圖示出CD3抗體和CD28抗體對純度較高的細胞(90%CD8的T細胞和95% CD3的T細胞)的刺激係成功刺激大量細胞，此大量細胞出現在左上象限，反映出增加的尺寸以及增加的活化標誌物的表達。
第14圖示出基於改變間隙寬度(4μm、9μm和6μm)、細胞類型(CD4和CD8)、刺激時間、和一或兩輪的分選之細胞分選結果的表格。對於兩輪的分選而言，第一輪的輸出被供應回到細胞腔室以進行第二輪的分選。
於此範例中，在加入1~10%CD25+活化的T細胞後，包括CD25+細胞(活化的T細胞)的溶液被供應到腔室。最大的間隙(9μm間隙)在分選之後具有最高的富集百分比。對於9μm間隙而言，示出在一輪分選後富集百分比係為90%以及二輪分選後富集百分比係為94%。藉由定量表達活化標誌物CD25+的細胞百分比除以CD25+的初始混合物來確定富集因子。
參照第15A-15J圖，示出使用9μm間隙的細胞富集。對於加入1.1%在第一輪富集期間而言(第15D圖)，62.5%細胞表達活化標誌物CD25(第15E圖)，而僅有0.2%廢液區細胞表達CD25(第15F圖)。在第二輪 富集期間，71.8%細胞表達活化標誌物CD25(第15I圖)，而僅有0.3%廢液細胞表達CD25(第15J圖)。
第16A-16C圖示出通過不同間隙的柱體(又稱為柱(pillars))之細胞的散射圖。以4μm間隙分選，細胞群大部分在代表較小尺寸的左下象限中。以9μm間隙分選，細胞群更分散於多個象限中。
參照第17A-F圖，分選後拍攝細胞照片，並測量細胞直徑。第17A圖和第17B圖示出以4μm間隙進行分選之收集細胞和廢細胞的影像。對應直方圖如第17E圖所示，示出收集區細胞和廢液區細胞的細胞尺寸分佈。第17C圖和第17D圖示出以9μm間隙進行分選之收集區細胞和廢液區細胞的影像。對應直方圖如第17F所示，示出收集區細胞和廢液區細胞的細胞尺寸分佈。
範例11：以抗原來刺激和分選T細胞
於此系列範例中，T細胞在細胞分選之前以抗原特異性方式受到刺激。使用廣泛刺激T細胞的OKT3作為陽性對照組。使用pp65來進行抗原特異性刺激。於一些實施例中，使用pp65胜肽庫來刺激T細胞，此pp65胜肽庫例如包括跨越全長pp65蛋白序列的多個重疊胜肽。於其他實施例中，使用與pp65蛋白殘基495-503對應的特異性抗原pp65495-503來刺激T細胞。
一般而言，與pp65495-503抗原相比，pp65胜肽庫產生更高頻率的受刺激T細胞，因為pp65胜肽庫包括能夠刺激一T細胞範圍的多種不同抗原類型。相反地，單一抗原類型pp65495-503僅刺激對此抗原具有特異性的T細胞，導致較低頻率的受刺激T細胞。
PBMC細胞是T細胞、B細胞和單核細胞的混合物，係取得自與pp65抗原反應的供者(donor)。較佳地，解凍PBMC細胞，此PBMC細 胞例如來自HLA-A2、CMV-血清陽性供體LP381(正常反應)。細胞被分成包括約8x106個細胞的等分試樣(aliquots)。此些等分試樣係培養於各種條件下，包括：(1)僅在介質存在時(無刺激)；(2)在OKT3(刺激)存在時；(3)在pp65胜肽庫(刺激)存在時；以及(4)在pp65495-503(刺激)存在時。在刺激後的第三天，基於使用9μm間隙距離的尺寸、以及Q全部=10ml/hr、以及約1：1的樣本對鞘比率，分選來自每種條件的細胞。在刺激後的第四天，基於使用9μm間隙距離的尺寸、以及具有約1：1的樣本對鞘比率之Q全部=10ml/hr或是具有約4：1的樣本對鞘比率之Q全部=20ml/hr，分選第三和第四情況。分選後，藉由流式細胞儀(FACS)分析樣本，以記錄分選前、分選後(收集區)、以及分選後(廢液區)三個時間點之包括FSC、SSC、CD3、CD25、CMV的多聚體(dextramer)(pp65495-503)的細胞計數。
第18圖是統整在上述情況下收集CD25+T細胞的表格。
單核細胞和活化的T細胞(CD3+CD25+細胞)經常一起分離，因為單核細胞通常大於淋巴細胞(B細胞和T細胞)。當活化的T細胞(基於CD25+)在所有活細胞中被閘控(被分選)，由於單核細胞的存在，活化的T細胞的收集百分比(純度)較低。當活化的T細胞在CD3+細胞中被閘控時，活化的T細胞的收集百分比(純度)更高，在一些情況下，胜肽庫刺激達到大於90%。
計算活細胞(由包括T細胞(大多數)、B細胞、單核細胞、CD3-淋巴細胞等的所有活PBMC細胞組成)中CD25+活化的T細胞的百分比。還計算由CD3+細胞(例如CD3+CD25-和CD3+CD25+細胞)組成的T細胞中CD25+細胞的百分比。與在活細胞中閘控相比，僅在CD3+T細胞上閘控時CD25+細胞的百分比更高(排除其他細胞類型)。
富集因子是分選後CD25+百分比(%)的倍數增加，並藉由未分選的細胞除去收集的CD25+細胞的百分比來計算。舉例而言，並參照第24D圖，分選前的CD25+百分比為0.055/(0.055+47.4)=0.1%。分選後，CD25+百分比為0.16/(0.16+0.65)=19.7%。
第19A-24F圖示出各種細胞分選試驗及對照的結果。在一些方面，以流式細胞儀(FACs)分選之前，可對細胞進行染色以檢測CD25+和CD3+。於一些實施例中，活化的T細胞(CD3+CD25+)可包括約1%(或更少)之進行分選的全部PMBC細胞群。
本文提供的細胞分選試驗可與一或多種其他試驗組合，以分離目標細胞，例如使用染色、抗體等。分選後，抗原刺激的T細胞(CD25+CD3+)示出相對於其未分類對應物係更富集。
與活化的T細胞大約相同尺寸的單核細胞也可出現在收集的級分中，而例如CD3+CD25-細胞和CD3-淋巴細胞的較小細胞則通常被排除。
第19A-19C圖示出分選前和刺激後三天分選後(收集區和廢液區)之未受刺激細胞的FSC-A與SSC-A的關係。活細胞係位於黑色多邊形內。第19D-19F圖示出在分選前後(收集區和廢液區)之各種細胞群(CD3+CD25-細胞、單核細胞、CD3-淋巴細胞、和CD3+CD25+細胞)。
第20A-20C圖示出在分選前和在刺激後三天分選後(收集區和廢液區)之受刺激細胞(具有OKT3)的FSC-A與SSC-A的關係。活細胞係位於黑色多邊形內。第20D-20F圖示出在分選前後(收集區和廢液區)之各種細胞群(CD3+CD25-細胞、單核細胞、CD3-淋巴細胞和CD3+CD25+細胞)。在OKT3刺激的條件下，當在CD25+活細胞上閘控時觀察到約1倍的富集因子，以及當在CD25+CD3+細胞上閘控時觀察到約1倍的富集因子。
第21A-21C圖示出在分選前和刺激後三天分選後(收集區和廢液區)之受刺激細胞(具有pp65胜肽庫)的FSC-A與SSC-A的關係。活細胞係位於黑色多邊形內。第21D-21F圖示出在分選前後(收集區和廢液區)之各種細胞群(CD3+CD25-細胞、單核細胞、CD3-淋巴細胞和CD3+CD25+細胞)。在pp65胜肽庫刺激的條件下，當在CD25+活細胞上閘控時觀察到約11倍的富集因子，以及當在CD25+CD3+細胞上閘控時觀察到約40倍的富集因子。
第22A-22C圖示出在分選前和刺激後三天分選後(收集區和廢液區)之受刺激細胞(具有pp65495-503)的FSC-A與SSC-A的關係。活細胞係位於黑色多邊形內。第22D-22F圖示出在分選前後(收集區和廢液區)之各種細胞群(CD3+CD25-細胞、單核細胞、CD3-淋巴細胞和CD3+CD25+細胞)。在pp65495-503刺激的條件下，當在CD25+活細胞上閘控時觀察到約5倍的富集因子，並且當在CD25+CD3+細胞上閘控時觀察到約150倍的富集因子。
第23A-23F圖示出刺激後4天在不同流動條件下使用pp65胜肽庫的抗原特異性刺激。於一些實施例中，在恆定的間隙距離(例如9μm)，以較高流速(例如Q=20ml/hr，4：1)分選的細胞，相較於以較低流速分選的細胞(例如Q=10ml/hr，1：1)，產生相同或略微改善的純度。
參照第24A-24F圖，在刺激後4天以不同流動條件下使用pp65495-503進行抗原特異性刺激。在快速流動條件下(20ml/hr，4：1)，相較於慢速流動條件(10ml/hr，1：1)，活化的T細胞(CD3+CD25+)的回收率大致相同或更好。
第25圖示出微流體腔室的另一實施例，配置成以與尺寸無關的方式濃縮細胞(又參見第2G圖)。在此範例中，柱體密集地堆積在一 起。此外，柱體之間的重疊區域已經增加(例如藉由移除柱體尖端的一部分)以促進細胞流過通道，而不是在柱體之間捕獲細胞。
範例12：微流體通道的啟動
一般而言，可使用任何合適材料在微通道內形成柱體。較佳地，材料是透氣的，例如PDMS，以允許捕獲的氣體從微流體通道脫離出，並防止捕獲的氣泡影響微流體通道內的流動力學。微流體通道和相關的管道可填充合適的緩衝液並用過量的緩衝液沖洗，以允許截留的氣泡脫落並通過PDMS擴散出微流體通道或通過連接到微流體通道的管道離開。於一些實施例中，可將表面活性劑添加到緩衝液中以減少氣泡的發生。
100:細胞
105:腔室
110:輸入機構
115:柱體
120、122:輸出機構
130:偏轉點

Claims (54)

  1. 一種微流體裝置，包括：一輸入機構，用以引入包括複數個細胞的一溶液；一微流體腔室，流體連接該輸入機構，其中該微流體腔室包括複數個柱體排，其中每個柱體排包括複數個柱體，該些柱體沿著相對於該微流體腔室以一對角方式定向的一線分佈；其中，每個柱體配置在相對於該微流體腔室的一側的旋轉位置，使得每個柱體具有相對於該微流體腔室的一側的一旋轉角度(Φ)，該旋轉角度為1度和89度之間；以及至少兩個輸出機構，流體連接該微流體腔室。
  2. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該至少兩個輸出機構包括一第一輸出機構和一第二輸出機構，該第一輸出機構相對於該第二輸出機構具有一較大的橫截面積。
  3. 如請求項1所述之微流體裝置，其中，對於每個柱體排，該些柱體的每一者係沿著該線以一間距配置，以使該些細胞朝向該微流體腔室的一側橫向偏轉。
  4. 如請求項1所述之微流體裝置，其中，對於每個柱體排，該些柱體的每一者係沿著該線以一間距配置，以保留大於一特定尺寸的該些細胞於一路徑中。
  5. 如請求項1所述之微流體裝置，其中每個柱體具有一長度和一寬度，其中該長度大於該寬度。
  6. 如申請求項5所述之微流體裝置，其中，該旋轉角度係由相對於該微流體腔室的一側的逆時針方向所定義，其中該旋轉角度為：(a)15度和55度之間；(b)25度和45度之間；(c)30度和40度之間；或(d)35度。
  7. 如請求項1所述之微流體裝置，其中對於每個柱體排，該些柱體的每一者係沿著該線以一均勻間隔的間距設置。
  8. 如請求項1所述之微流體裝置，其中對於每個柱體排係沿垂直於該微流體腔室的一側的一軸線以一規則間隔的間距設置。
  9. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該些細胞在相鄰的該些柱體排之間的一路徑中流動。
  10. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該些柱體的形狀為矩形。
  11. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該些柱體的形狀為橢圓形。
  12. 如請求項1所述之微流體裝置，其中各該柱體的長度為：(a)大於各該柱體的寬度之1.1倍至10倍；(b)大於各該柱體的寬度之1.1倍至5倍；(c)大於各該柱體的寬度之2倍至4倍；或(d)大於各該柱體的寬度之3倍至4倍。
  13. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該輸入機構係藉由導管耦接一注射器，以及其中使用來自壓下該注射器的一柱塞的手動施加壓力來驅動包括該些細胞的該溶液通過該微流體裝置。
  14. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該輸入機構係藉由導管耦接一幫浦，以及其中使用來自該幫浦的施加壓力來驅動包括該些細胞的該溶液通過該微流體裝置。
  15. 如請求項1所述之微流體裝置，其中該溶液通過該微流體裝置的一流速達到10mL/hr、20mL/hr、30mL/hr、或40mL/hr。
  16. 如請求項2所述之微流體裝置，其中使用該第二輸出機構離開該微流體腔室的細胞濃度係大於通過該輸入機構進入該微流體腔室的細胞濃度之至少10倍。
  17. 如請求項2所述之微流體裝置，其中使用該第二輸出機構離開該微流體腔室的細胞濃度係大於或等於105個細胞/mL。
  18. 如請求項2所述之微流體裝置，更包括一第二輸入機構，用以引入一第二溶液進入該微流體裝置，以及其中該些細胞從該第二輸出機構離開並懸浮於該第二溶液中。
  19. 如請求項2所述之微流體裝置，更包括一第二輸入機構，用以引入一第二溶液中的複數個結合分子進入該微流體裝置，以及其中與該些結合分子結合的該些細胞係從該第二輸出機構離開。
  20. 如請求項2所述之微流體裝置，更包括一第二輸入機構，用以引入一第二溶液中的複數個結合分子進入該微流體裝置，以及更包括一第三輸入機構，用以引入不同於該第一溶液和該第二溶液的一第三溶液進入該微流體裝置，以及其中與該些結合分子結合的該些細胞係從該第二輸出機構離開並懸浮於該第三溶液中。
  21. 如請求項2所述之微流體裝置，其中從該第二輸出機構離開的該些細胞被送入一第二微流體腔室，其中與該第二微流體腔室流體連接的一第二輸入機構係配置成引入一第二溶液進入該第二微流體腔室。
  22. 一種微流體裝置，包括：一輸入機構，用以引入包括複數個細胞的一溶液；一微流體腔室，流體連接該輸入機構，其中該微流體腔室包括複數個柱體排，其中至少一柱體排包括複數個柱體，該些柱體沿著相對於該微流體腔室以一對角方式定向的一線分佈；其中，每個柱體配置在相對於該微流體腔室的一側的旋轉位置，使得每個柱體具有相對於該微流體腔室的一側的一旋轉角度(Φ)，該旋轉角度為1度和89度之間；以及至少兩個輸出機構，流體連接此微流體腔室。
  23. 如請求項22所述之微流體裝置，其中該至少兩個輸出機構包括一第一輸出機構和一第二輸出機構，該第一輸出機構相對於該第二輸出機構具有一較大的橫截面積。
  24. 如請求項22所述之微流體裝置，其中該至少一柱體排的該些柱體係沿著該線以一間距配置，以使該些細胞朝向該微流體腔室的一側橫向偏轉。
  25. 如請求項22所述之微流體裝置，其中該至少一柱體排的該些柱體係沿著該線以一間距配置，以保留大於一特定尺寸的該些細胞於一路徑中。
  26. 如請求項22所述之微流體裝置，其中每個柱體具有一長度和一寬度，其中該長度大於該寬度。
  27. 如請求項22所述之微流體裝置，其中，該旋轉角度係由相對於該微流體腔室的一側的逆時針方向所定義，其中該旋轉角度為：(a)15度和55度之間；(b)25度和45度之間；(c)30度和40度之間；或(d)35度。
  28. 如請求項22所述之微流體裝置，其中對於該至少一柱體排而言，該些柱體的每一者係沿著該線以一均勻間隔的間距設置。
  29. 如請求項22所述之微流體裝置，其中該些柱體的形狀為矩形。
  30. 一種使用一微流體裝置用以濃縮細胞的方法，包括：藉由一輸入機構引入包括複數個細胞的一溶液進入一微流體腔室，其中該微流體腔室流體連接該輸入機構； 施加壓力以使包括該些細胞的該溶液流過該微流體腔室，其中該微流體腔室包括複數個柱體排，其中每個柱體排包括複數個柱體，該些柱體沿著相對於該微流體腔室以一對角方式定向的一線分佈；其中，每個柱體配置在相對於該微流體腔室的一側的旋轉位置，使得每個柱體具有相對於該微流體腔室的一側的一旋轉角度(Φ)，該旋轉角度為1度和89度之間；以及藉由該些柱體排將該些細胞偏轉到該微流體腔室的一側，以耗盡該些細胞於從該第一輸出機構離開的該溶液中並富集該些細胞於從該第二輸出機構離開的該溶液中。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該第二輸出機構相對於該第一輸出機構具有一較小的橫截面積。
  32. 如請求項30所述之方法，其中每個柱體具有一長度和一寬度，其中該長度大於該寬度。
  33. 如請求項30所述之方法，其中，該旋轉角度係由相對於該微流體腔室的該側的逆時針方向所定義，其中該旋轉角度為：(a)15度和55度之間；(b)25度和45度之間；(c)30度和40度之間；或(d)35度。
  34. 如請求項30所述之方法，其中對於每個柱體排，該些柱體的每一者係沿著該線以一均勻間隔的間距設置。
  35. 如請求項30所述之方法，其中對於每個排係沿垂直於該微流體腔室的該側之一軸線以一規則間隔的間距設置。
  36. 如請求項30所述之方法，其中該些細胞係流動沿著相鄰的該些柱體排之間的一路徑。
  37. 如請求項30所述之方法，其中各該柱體的長度為：(a)大於各該柱體的寬度之1.1倍至10倍；(b)大於各該柱體的寬度之1.1倍至5倍；(c)大於各該柱體的寬度之2倍至4倍；或(d)大於各該柱體的寬度之3倍至4倍。
  38. 如請求項30所述之方法，藉由導管耦接該第一輸入機構於一注射器，以及使用來自該注射器的一柱塞的手動施加壓力來驅動包括細胞的該溶液通過該微流體裝置。
  39. 如請求項30所述之方法，藉由導管耦接該第一輸入機構於一幫浦，以及使用來自該幫浦的施加壓力來驅動包括該些細胞的該溶液通過該微流體裝置。
  40. 如請求項30所述之方法，更包括：藉由一第二輸入機構引入一第二溶液進入該微流體腔室；使用該些柱體排偏轉該些細胞進入該第二溶液；以及收集藉由該第二輸出機構離開該微流體腔室之懸浮於該第二溶液中的該些細胞。
  41. 如請求項30所述之方法，更包括：藉由一第二輸入機構引入一第二溶液中的複數個結合分子進入該微流體腔室；使用該些柱體排偏轉該些細胞朝向該些結合分子，其中該些結合分子貼附於該些細胞的表面上；以及收集藉由該第二輸出機構離開該微流體腔室之與該些結合分子結合的該些細胞。
  42. 如請求項30所述之方法，更包括：藉由一第二輸入機構引入一第二溶液中的複數個結合分子進入該微流體腔室；藉由一第三輸入機構引入一第三溶液進入該微流體腔室；使用該些柱體排偏轉細胞朝向該些結合分子，其中該些結合分子貼附於該些細胞的表面上；使用該些柱體排偏轉與該些結合分子貼附的該些細胞進入該第三溶液中；以及 收集藉由該第二輸出機構離開該微流體腔室之與該些結合分子結合並懸浮於該些第三溶液中的該些細胞。
  43. 如請求項30所述之方法，其中局部耗盡該些細胞之該溶液從該第一輸出機構離開，局部富集該些細胞之該溶液從該第二輸出機構離開。
  44. 如請求項43所述之方法，其中從該第二輸出機構離開之該溶液被送入一第二微流體腔室以進行額外的分選。
  45. 如請求項30所述之方法，其中相鄰的該些柱體之間的一間隙距離係配置成允許小於閾值的該些細胞通過以進入一相鄰的路徑以及保留大於閾值的該些細胞。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該間隙距離係配置成保留活化的複數個T細胞。
  47. 如請求項45所述之方法，其中該間隙距離係配置成保留活化的複數個細胞用以轉染。
  48. 如請求項46所述之方法，其中活化的該些T細胞係使用CD3和CD28特異性的抗體而活化的。
  49. 如請求項48所述之方法，其中活化的該些T細胞係藉由將該些T細胞暴露於CD3和CD28特異性的抗體之至少兩天的時間。
  50. 如請求項30所述之方法，其中相鄰的該些柱體之間的一間隙距離係配置成保留生產生物製劑的該些細胞，作為生產規模生物製程的一部分。
  51. 如請求項30所述之方法，其中可調整一流速和/或一間隙距離以保留具有一特定尺寸的該些細胞。
  52. 如請求項46所述之方法，其中活化的該些T細胞係藉由使用一病毒抗原或一腫瘤抗原來活化。
  53. 如請求項52所述之方法，其中該病毒抗原是CMV pp65。
  54. 如請求項52所述之方法，其中該腫瘤抗原是一新表位胜肽(neoepitope peptide)。
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